JP2000227556A - 顕微鏡 - Google Patents
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- JP2000227556A JP2000227556A JP11029408A JP2940899A JP2000227556A JP 2000227556 A JP2000227556 A JP 2000227556A JP 11029408 A JP11029408 A JP 11029408A JP 2940899 A JP2940899 A JP 2940899A JP 2000227556 A JP2000227556 A JP 2000227556A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】蛍光を用いて観察を行う顕微鏡において、観察
に使用することができる蛍光の光量を増加させる。 【解決手段】落射蛍光顕微鏡において、試料２１を挟ん
で、対物レンズと反対側の空間に、無限焦点系の対物レ
ンズ４２をおき、その焦点を対物レンズ２２の焦点に一
致させる。対物レンズ４２から出る光は平行光線となる
ので、この光線を平面鏡４４で反射して、対物レンズ２
２の光路に一致させる。このような構成とすることによ
り、試料２１から直接出る蛍光とともに平面鏡４４で反
射した蛍光を合わせて、対物レンズ２２により結像する
ことができる。その結果、接眼レンズ２５により蛍光強
度を増強した明るい蛍光像を観察することができる。
に使用することができる蛍光の光量を増加させる。 【解決手段】落射蛍光顕微鏡において、試料２１を挟ん
で、対物レンズと反対側の空間に、無限焦点系の対物レ
ンズ４２をおき、その焦点を対物レンズ２２の焦点に一
致させる。対物レンズ４２から出る光は平行光線となる
ので、この光線を平面鏡４４で反射して、対物レンズ２
２の光路に一致させる。このような構成とすることによ
り、試料２１から直接出る蛍光とともに平面鏡４４で反
射した蛍光を合わせて、対物レンズ２２により結像する
ことができる。その結果、接眼レンズ２５により蛍光強
度を増強した明るい蛍光像を観察することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料から発する蛍
光を観察するための顕微鏡、特に落射蛍光顕微鏡、共焦
点レーザ顕微鏡、多光子励起レーザ顕微鏡等に関するも
のである。
光を観察するための顕微鏡、特に落射蛍光顕微鏡、共焦
点レーザ顕微鏡、多光子励起レーザ顕微鏡等に関するも
のである。
【０００２】
【背景技術】細胞がいろいろな機能を発揮しているとき
の微細構造や分子の局在やその動きを知ることは、それ
らの仕組みを理解する上において不可欠である。これを
観察するのに用いられている顕微鏡として、蛍光顕微鏡
がある。蛍光顕微鏡では、標本内の注目する特定の分子
に特異的に結合する蛍光分子（これを蛍光プローブと呼
び、たとえば注目するタンパク質の抗体に蛍光分子を共
有結合させたものなどが使われる）を付けて、この分子
の分布や動きを観察する。
の微細構造や分子の局在やその動きを知ることは、それ
らの仕組みを理解する上において不可欠である。これを
観察するのに用いられている顕微鏡として、蛍光顕微鏡
がある。蛍光顕微鏡では、標本内の注目する特定の分子
に特異的に結合する蛍光分子（これを蛍光プローブと呼
び、たとえば注目するタンパク質の抗体に蛍光分子を共
有結合させたものなどが使われる）を付けて、この分子
の分布や動きを観察する。
【０００３】さて、よく用いられている落射蛍光顕微鏡
について説明する。落射照明とは、光源光を対物レンズ
を通して照射し、標本からの蛍光をその対物レンズを通
して観察する照明法で、照明光と観察光が対物レンズの
同じ光とを通ることになる。つまり対物レンズはコンデ
ンサを兼用している。
について説明する。落射照明とは、光源光を対物レンズ
を通して照射し、標本からの蛍光をその対物レンズを通
して観察する照明法で、照明光と観察光が対物レンズの
同じ光とを通ることになる。つまり対物レンズはコンデ
ンサを兼用している。
【０００４】この落射照明を用いた観察を実現する構成
を有する落射蛍光顕微鏡の構成を図１を用いて説明す
る。図１において、落射照明による観察を実現する構成
を達成するために、落射蛍光顕微鏡はダイクロイック・
ミラー（ＤＭ）２４を用いている。ダイクロイック・ミ
ラー２４は通常、ダイクロイック・キューブと呼ばれる
小さな箱に励起フィルタと吸収（バリア）フィルタとと
もにセットされている。光源の照射光３２はまず励起フ
ィルタ３４で余分な波長の光がカットされ、使用する蛍
光分子が吸収する波長の光のみ通している（図２参
照）。これによって観察を邪魔する背景光が減衰する。
この励起光は光軸に対して４５°に傾いたダイクロイッ
ク・ミラー（ＤＭ）２４で直角に反射されて対物レンズ
２２を通して試料２１に到達する。試料２１から発する
蛍光は、励起光と逆向きに進んで対物レンズを通してダ
イクロイック・ミラー（ＤＭ）２４に到着する。ダイク
ロイック・ミラー（ＤＭ）２４は、図２に示されている
ように、特定波長以下の光を反射して、それ以上長い波
長の光を透過する性質を持つので、蛍光はこのミラーを
素通りする。素通りした後に、吸収フィルタ３６によ
り、注目する蛍光以外の波長をカットし、背景ができる
だけ暗くなるようにした後、経過光を接眼レンズ２５に
導く。上述の落射蛍光顕微鏡は、試料中のかなり厚みを
持った領域のステージ面に平行な情報（光強度の分布）
を伝えるが、光軸方向の情報は与えない。
を有する落射蛍光顕微鏡の構成を図１を用いて説明す
る。図１において、落射照明による観察を実現する構成
を達成するために、落射蛍光顕微鏡はダイクロイック・
ミラー（ＤＭ）２４を用いている。ダイクロイック・ミ
ラー２４は通常、ダイクロイック・キューブと呼ばれる
小さな箱に励起フィルタと吸収（バリア）フィルタとと
もにセットされている。光源の照射光３２はまず励起フ
ィルタ３４で余分な波長の光がカットされ、使用する蛍
光分子が吸収する波長の光のみ通している（図２参
照）。これによって観察を邪魔する背景光が減衰する。
この励起光は光軸に対して４５°に傾いたダイクロイッ
ク・ミラー（ＤＭ）２４で直角に反射されて対物レンズ
２２を通して試料２１に到達する。試料２１から発する
蛍光は、励起光と逆向きに進んで対物レンズを通してダ
イクロイック・ミラー（ＤＭ）２４に到着する。ダイク
ロイック・ミラー（ＤＭ）２４は、図２に示されている
ように、特定波長以下の光を反射して、それ以上長い波
長の光を透過する性質を持つので、蛍光はこのミラーを
素通りする。素通りした後に、吸収フィルタ３６によ
り、注目する蛍光以外の波長をカットし、背景ができる
だけ暗くなるようにした後、経過光を接眼レンズ２５に
導く。上述の落射蛍光顕微鏡は、試料中のかなり厚みを
持った領域のステージ面に平行な情報（光強度の分布）
を伝えるが、光軸方向の情報は与えない。
【０００５】この問題を解決するものが、共焦点レーザ
顕微鏡(Confocal Laser-Scanning Microscope:CLSM)
や、多光子励起レーザ顕微鏡（例えば、２光子励起レー
ザ顕微鏡(Tow-Photon Laser-Scanning Microscope:TP-L
SM)）である。いずれも、試料面をレーザで走査してそ
の焦点面の蛍光の空間分布を記録し、コンピュータで処
理を行うことで、その切片画像を再現する。
顕微鏡(Confocal Laser-Scanning Microscope:CLSM)
や、多光子励起レーザ顕微鏡（例えば、２光子励起レー
ザ顕微鏡(Tow-Photon Laser-Scanning Microscope:TP-L
SM)）である。いずれも、試料面をレーザで走査してそ
の焦点面の蛍光の空間分布を記録し、コンピュータで処
理を行うことで、その切片画像を再現する。
【０００６】図３および図４を用いて、共焦点レーザ顕
微鏡（ＣＬＳＭ）について説明する。共焦点レーザ顕微
鏡では、単光子励起を用いている。この単光子励起と
は、ひとつの蛍光分子に一つの光子を吸収させることに
より、その分子を励起させることをいう。これを図３で
示す単光子励起の場合で説明する。図３は、断熱ポテン
シャル曲線１０および１１を示しており、レーザからの
光子のエネルギー１２により、蛍光分子が励起状態の断
熱ポテンシャル曲線１１となる。そして、下の断熱ポテ
ンシャル曲線１０の状態になるとき（矢印１４）に蛍光
１５を発生する。
微鏡（ＣＬＳＭ）について説明する。共焦点レーザ顕微
鏡では、単光子励起を用いている。この単光子励起と
は、ひとつの蛍光分子に一つの光子を吸収させることに
より、その分子を励起させることをいう。これを図３で
示す単光子励起の場合で説明する。図３は、断熱ポテン
シャル曲線１０および１１を示しており、レーザからの
光子のエネルギー１２により、蛍光分子が励起状態の断
熱ポテンシャル曲線１１となる。そして、下の断熱ポテ
ンシャル曲線１０の状態になるとき（矢印１４）に蛍光
１５を発生する。
【０００７】この蛍光を用いる共焦点レーザ顕微鏡の基
本的構成を図４に示す。試料２１に対して、点光源であ
るレーザ光２３を、レーザ光の波長を反射するダイクロ
イック・ミラー（ＤＭ）２４で反射し、対物レンズ２２
により絞って照射する。このレーザ光２３により単光子
励起された蛍光分子からの蛍光は、蛍光の波長は通すＤ
Ｍ２４を介してレンズ２５で絞られるとともに、共焦点
ピンホール２７を通過して、光電子贈倍管等で構成され
ている検出器２６により受光される。このような基本的
な構成において、レーザ光２３をＸ−Ｙ走査ミラー（図
示せず）により２次元走査することにより、試料２１中
のレーザ光２３が照射される光路中の蛍光分子が励起さ
れる。励起された蛍光分子からの蛍光の内共焦点ピンホ
ール２７を通過した蛍光のみを検出器２６で受光してコ
ンピュータにより画像処理することにより、試料２１の
焦点面の断層蛍光像が得られる。焦点面を変化させて各
断層面の画像を得てさらに画像処理すると、試料の３次
元画像も得ることができる。
本的構成を図４に示す。試料２１に対して、点光源であ
るレーザ光２３を、レーザ光の波長を反射するダイクロ
イック・ミラー（ＤＭ）２４で反射し、対物レンズ２２
により絞って照射する。このレーザ光２３により単光子
励起された蛍光分子からの蛍光は、蛍光の波長は通すＤ
Ｍ２４を介してレンズ２５で絞られるとともに、共焦点
ピンホール２７を通過して、光電子贈倍管等で構成され
ている検出器２６により受光される。このような基本的
な構成において、レーザ光２３をＸ−Ｙ走査ミラー（図
示せず）により２次元走査することにより、試料２１中
のレーザ光２３が照射される光路中の蛍光分子が励起さ
れる。励起された蛍光分子からの蛍光の内共焦点ピンホ
ール２７を通過した蛍光のみを検出器２６で受光してコ
ンピュータにより画像処理することにより、試料２１の
焦点面の断層蛍光像が得られる。焦点面を変化させて各
断層面の画像を得てさらに画像処理すると、試料の３次
元画像も得ることができる。
【０００８】共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）では、光
軸方向の分解能が優れている。しかし、レーザは試料を
貫いて透過し、この領域の蛍光物質を励起するので、広
い領域の蛍光物質が励起され、多くの蛍光分子が褪色す
る。このことにより、画像を取得しない面の蛍光分子も
褐色する為に、試料中の蛍光分子の褐色は全体として速
くなる。また、細胞内の遊離の蛍光分子を使い同じ焦点
面の画像を繰返し取得する測定では、画像を取得しない
焦点面外の領域からの非褐色分子補充が十分で起こら
ず、褐色が速くなる。したがって、画像取得の最初と最
後では、蛍光像の明るさが異なることがある。さらに、
レーザ光は、複雑な構造の組織中を透過する際に散乱を
起こし、深い組織（５０μｍ以上）の画像の鮮明度は低
下、あるいは取得が不可能である。また、紫外励起蛍光
プローブの場合には、レーザ光やその照射により発生し
た活性酸素による細胞毒性の問題や、使える光学レンズ
に限界がある。
軸方向の分解能が優れている。しかし、レーザは試料を
貫いて透過し、この領域の蛍光物質を励起するので、広
い領域の蛍光物質が励起され、多くの蛍光分子が褪色す
る。このことにより、画像を取得しない面の蛍光分子も
褐色する為に、試料中の蛍光分子の褐色は全体として速
くなる。また、細胞内の遊離の蛍光分子を使い同じ焦点
面の画像を繰返し取得する測定では、画像を取得しない
焦点面外の領域からの非褐色分子補充が十分で起こら
ず、褐色が速くなる。したがって、画像取得の最初と最
後では、蛍光像の明るさが異なることがある。さらに、
レーザ光は、複雑な構造の組織中を透過する際に散乱を
起こし、深い組織（５０μｍ以上）の画像の鮮明度は低
下、あるいは取得が不可能である。また、紫外励起蛍光
プローブの場合には、レーザ光やその照射により発生し
た活性酸素による細胞毒性の問題や、使える光学レンズ
に限界がある。
【０００９】多光子励起レーザ顕微鏡では、多光子励起
を用いている。この多光子励起とは、ひとつの蛍光分子
に複数の光子をほぼ同時に吸収させることにより、複数
の光子エネルギーの和で、その分子を励起させることを
いう。これを図５で示す２光子励起の場合で説明する。
図５は、図３と同様に断熱ポテンシャル曲線１０および
１１を示しており、２つの光子のエネルギー１２および
１３により、蛍光分子が励起状態の断熱ポテンシャル曲
線１１となる。そして、下の断熱ポテンシャル曲線１０
の状態になるとき（矢印１４）に蛍光１５を発生する。
を用いている。この多光子励起とは、ひとつの蛍光分子
に複数の光子をほぼ同時に吸収させることにより、複数
の光子エネルギーの和で、その分子を励起させることを
いう。これを図５で示す２光子励起の場合で説明する。
図５は、図３と同様に断熱ポテンシャル曲線１０および
１１を示しており、２つの光子のエネルギー１２および
１３により、蛍光分子が励起状態の断熱ポテンシャル曲
線１１となる。そして、下の断熱ポテンシャル曲線１０
の状態になるとき（矢印１４）に蛍光１５を発生する。
【００１０】このように、２光子励起による励起波長
は、通常の単光子励起の場合の２倍となる。光子が蛍光
分子に吸収される確率は、光子密度に比例するので、２
光子吸収の確率は、光強度の２乗に比例する。従って、
試料中の焦点領域の蛍光分子のみが励起され、焦点領域
のみから蛍光が発することになる。２つの光子がひとつ
の分子に吸収されるためには光子の密度を上げる必要が
ある。このために、励起光のエネルギーを超短パルス・
レーザにより時間的に（＜１０-13sec）に、レンズによ
り空間的に集約する。このパルス・レーザにより組織を
走査し、蛍光の２次元画像を得、焦点面を変えることに
より３次元画像を得る。
は、通常の単光子励起の場合の２倍となる。光子が蛍光
分子に吸収される確率は、光子密度に比例するので、２
光子吸収の確率は、光強度の２乗に比例する。従って、
試料中の焦点領域の蛍光分子のみが励起され、焦点領域
のみから蛍光が発することになる。２つの光子がひとつ
の分子に吸収されるためには光子の密度を上げる必要が
ある。このために、励起光のエネルギーを超短パルス・
レーザにより時間的に（＜１０-13sec）に、レンズによ
り空間的に集約する。このパルス・レーザにより組織を
走査し、蛍光の２次元画像を得、焦点面を変えることに
より３次元画像を得る。
【００１１】この２光子励起レーザ顕微鏡（ＴＰ−ＬＳ
Ｍ）の基本的構成を図６に示す。試料２１に対して、点
光源であるレーザ光２３を、レーザ光の波長を反射する
ダイクロイック・ミラー（ＤＭ）２４で反射し、対物レ
ンズ２２により絞って照射する。このレーザ光２３によ
り２光子励起された蛍光分子からの蛍光は、蛍光の波長
は通すＤＭ２４を介してレンズ２５で絞られ、検出器２
６により受光される。このような基本的な構成におい
て、レーザ光２３をＸ−Ｙ走査ミラー（図示せず）によ
り２次元走査することにより、試料２１中のレーザ光２
３が照射される焦点面の蛍光分子のみが励起される。励
起された蛍光分子からの蛍光を光電子倍増管２６で受光
してコンピュータにより画像処理することにより、試料
２１の断層面の蛍光像が得られる。焦点面を変化させて
各断層面の画像を得てさらに画像処理すると、試料の３
次元画像も得ることができる。
Ｍ）の基本的構成を図６に示す。試料２１に対して、点
光源であるレーザ光２３を、レーザ光の波長を反射する
ダイクロイック・ミラー（ＤＭ）２４で反射し、対物レ
ンズ２２により絞って照射する。このレーザ光２３によ
り２光子励起された蛍光分子からの蛍光は、蛍光の波長
は通すＤＭ２４を介してレンズ２５で絞られ、検出器２
６により受光される。このような基本的な構成におい
て、レーザ光２３をＸ−Ｙ走査ミラー（図示せず）によ
り２次元走査することにより、試料２１中のレーザ光２
３が照射される焦点面の蛍光分子のみが励起される。励
起された蛍光分子からの蛍光を光電子倍増管２６で受光
してコンピュータにより画像処理することにより、試料
２１の断層面の蛍光像が得られる。焦点面を変化させて
各断層面の画像を得てさらに画像処理すると、試料の３
次元画像も得ることができる。
【００１２】細胞内遊離の蛍光分子による測定では、焦
点面のみの蛍光分子が励起されるために、上述の共焦点
レーザ顕微鏡の場合より遅い。焦点面の退色した蛍光分
子は、焦点外の退色していない蛍光分子により置換され
るため、同じ面の画像が繰返し退色なしに記録される。
さらに、試料中に固定された蛍光分子による記録の場合
でも、焦点外の蛍光分子は退色しないので、ほぼ退色な
しに３次元像を記録することができる。また、単光子励
起（共焦点レーザ顕微鏡の場合等）の約２倍の波長のレ
ーザを使用することにから、レーザの散乱が少なく、組
織内の深部にレーザ光が到達し、深い層の蛍光像が得ら
れる。また、紫外励起の蛍光物質を用いた場合でも、可
視光領域の光学系により測光可となり、細胞毒性も少な
い。図６の２光子励起レーザ顕微鏡の構成は、複数の光
子による励起を用いた多光子励起レーザの構成と共通で
ある。
点面のみの蛍光分子が励起されるために、上述の共焦点
レーザ顕微鏡の場合より遅い。焦点面の退色した蛍光分
子は、焦点外の退色していない蛍光分子により置換され
るため、同じ面の画像が繰返し退色なしに記録される。
さらに、試料中に固定された蛍光分子による記録の場合
でも、焦点外の蛍光分子は退色しないので、ほぼ退色な
しに３次元像を記録することができる。また、単光子励
起（共焦点レーザ顕微鏡の場合等）の約２倍の波長のレ
ーザを使用することにから、レーザの散乱が少なく、組
織内の深部にレーザ光が到達し、深い層の蛍光像が得ら
れる。また、紫外励起の蛍光物質を用いた場合でも、可
視光領域の光学系により測光可となり、細胞毒性も少な
い。図６の２光子励起レーザ顕微鏡の構成は、複数の光
子による励起を用いた多光子励起レーザの構成と共通で
ある。
【００１３】さて、上述した顕微鏡を用いて試料の観察
を行う場合、蛍光を用いているため、一般的に観察に用
いることができる光量が少ない。しかも、上述した顕微
鏡においては、試料からは全方位に対して発生している
蛍光のうち、対物レンズ２２の開口角内に入る蛍光のみ
を用いて、観察に利用している。
を行う場合、蛍光を用いているため、一般的に観察に用
いることができる光量が少ない。しかも、上述した顕微
鏡においては、試料からは全方位に対して発生している
蛍光のうち、対物レンズ２２の開口角内に入る蛍光のみ
を用いて、観察に利用している。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、蛍光
を用いて観察を行う顕微鏡において、試料が発生してい
る蛍光を十分に利用できるようにして、観察に使用する
ことができる蛍光の光量を増加させることである。
を用いて観察を行う顕微鏡において、試料が発生してい
る蛍光を十分に利用できるようにして、観察に使用する
ことができる蛍光の光量を増加させることである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために、試料の上側（又は、倒立顕微鏡では下
側）に向かう蛍光ばかりではなく、試料の下部（又は上
部）に漏れている蛍光をも利用できるような構成として
いる。具体的には、試料を、試料から発生する蛍光によ
り観察するための顕微鏡において、試料から発生する蛍
光を集光するための対物レンズと、前記対物レンズとは
試料を挟んだ反対側に、試料から発生する蛍光を反射す
る反射鏡とを備え、前記反射鏡からの反射による蛍光
と、直接の蛍光とにより試料を観察することを特徴とす
る。
成するために、試料の上側（又は、倒立顕微鏡では下
側）に向かう蛍光ばかりではなく、試料の下部（又は上
部）に漏れている蛍光をも利用できるような構成として
いる。具体的には、試料を、試料から発生する蛍光によ
り観察するための顕微鏡において、試料から発生する蛍
光を集光するための対物レンズと、前記対物レンズとは
試料を挟んだ反対側に、試料から発生する蛍光を反射す
る反射鏡とを備え、前記反射鏡からの反射による蛍光
と、直接の蛍光とにより試料を観察することを特徴とす
る。
【００１６】前記反射鏡は、平面反射鏡でありレンズと
ともに用いてもよいし、凹面反射鏡としてもよい。この
凹面反射鏡と試料との間には、水または油で満たしても
よい。また、前記反射鏡を、光路変更装置を介して光路
上に置いてもよい。適用する顕微鏡としては、落射蛍光
顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡、多光子励起レーザ顕微鏡
等である。
ともに用いてもよいし、凹面反射鏡としてもよい。この
凹面反射鏡と試料との間には、水または油で満たしても
よい。また、前記反射鏡を、光路変更装置を介して光路
上に置いてもよい。適用する顕微鏡としては、落射蛍光
顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡、多光子励起レーザ顕微鏡
等である。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明の実施形態を、図面を参照
して詳細に説明する。なお、各図面において、同様の構
成には、同じ参照番号を付している。本発明は、試料の
上側（または下側）に向かう蛍光ばかりではなく、試料
の下部（上部）に漏れている蛍光をも、試料の観察に利
用できるような構成としたことが特徴である。
して詳細に説明する。なお、各図面において、同様の構
成には、同じ参照番号を付している。本発明は、試料の
上側（または下側）に向かう蛍光ばかりではなく、試料
の下部（上部）に漏れている蛍光をも、試料の観察に利
用できるような構成としたことが特徴である。
【００１８】（実施形態１）本発明の実施形態１は、試
料の下部方向の蛍光を利用するために、平面鏡およびレ
ンズを用いている。その構成を図７ないし図９を用いて
詳しく説明する。図７は、落射蛍光顕微鏡における構成
を示している。図７において、図１に示した落射蛍光顕
微鏡と同様の構成についての説明を省略する。
料の下部方向の蛍光を利用するために、平面鏡およびレ
ンズを用いている。その構成を図７ないし図９を用いて
詳しく説明する。図７は、落射蛍光顕微鏡における構成
を示している。図７において、図１に示した落射蛍光顕
微鏡と同様の構成についての説明を省略する。
【００１９】さて、図７に示した落射蛍光顕微鏡では、
試料２１を挟んで、カバーグラス４０を介した反対側の
空間に、無限焦点系の対物レンズ４２をおき、その焦点
を対物レンズ２２の焦点に一致させる。対物レンズ４２
から出る光は平行光線となるので、この光線を平面鏡４
４で反射して、対物レンズ２２の光路に一致させる。こ
のような構成とすることにより、試料２１から直接出る
蛍光とともに平面鏡４４で反射した蛍光を合わせて、対
物レンズ２２により結像することができる。その結果、
接眼レンズ２５により蛍光強度を増強した明るい蛍光像
を観察することができる。
試料２１を挟んで、カバーグラス４０を介した反対側の
空間に、無限焦点系の対物レンズ４２をおき、その焦点
を対物レンズ２２の焦点に一致させる。対物レンズ４２
から出る光は平行光線となるので、この光線を平面鏡４
４で反射して、対物レンズ２２の光路に一致させる。こ
のような構成とすることにより、試料２１から直接出る
蛍光とともに平面鏡４４で反射した蛍光を合わせて、対
物レンズ２２により結像することができる。その結果、
接眼レンズ２５により蛍光強度を増強した明るい蛍光像
を観察することができる。
【００２０】このような平面鏡とレンズとを用いる構成
は、図３ないし図６で説明した共焦点レーザ顕微鏡およ
び多光子励起レーザ顕微鏡にも適用することが可能であ
る。それを図示したのが、図８および図９である。図８
は共焦点レーザ顕微鏡の構成を示し、図９は多光子励起
レーザ顕微鏡の構成を示している。図８および図９にお
いて、図４および図６に示したレーザ顕微鏡と同様の構
成についての説明を省略する。
は、図３ないし図６で説明した共焦点レーザ顕微鏡およ
び多光子励起レーザ顕微鏡にも適用することが可能であ
る。それを図示したのが、図８および図９である。図８
は共焦点レーザ顕微鏡の構成を示し、図９は多光子励起
レーザ顕微鏡の構成を示している。図８および図９にお
いて、図４および図６に示したレーザ顕微鏡と同様の構
成についての説明を省略する。
【００２１】図８および図９において、試料２１を挟ん
で、カバーグラス４０を介した反対側の空間に、無限焦
点系の対物レンズ４２をおき、その焦点を対物レンズ２
２の焦点に一致させる。対物レンズ４２から出る光は平
行光線となるので、この光線を平面鏡４４で反射して、
対物レンズ２２の光路に一致させる。このような構成と
することにより、試料２１から直接出る蛍光とともに平
面鏡４４で反射した蛍光を合わせて、対物レンズ２２を
介して、検出器２６により増強された蛍光を測定するこ
とができる。
で、カバーグラス４０を介した反対側の空間に、無限焦
点系の対物レンズ４２をおき、その焦点を対物レンズ２
２の焦点に一致させる。対物レンズ４２から出る光は平
行光線となるので、この光線を平面鏡４４で反射して、
対物レンズ２２の光路に一致させる。このような構成と
することにより、試料２１から直接出る蛍光とともに平
面鏡４４で反射した蛍光を合わせて、対物レンズ２２を
介して、検出器２６により増強された蛍光を測定するこ
とができる。
【００２２】なお、図７ないし図９に示した構成におい
て、平面鏡４４は、光軸調整用の角度変更装置に搭載さ
れており、光路の変更や光路より出し入れが可能となっ
ている。これにより、光路を変更して対物レンズ２２の
光路と一致させることができ、また、平面鏡４４を使用
しない場合は、光路からはずすことが可能となる。上述
の構成は、顕微鏡が正立型および倒立型のいずれであっ
ても適用することが可能である。倒立型顕微鏡において
は、上述の説明における上下が、試料に対して逆とな
る。
て、平面鏡４４は、光軸調整用の角度変更装置に搭載さ
れており、光路の変更や光路より出し入れが可能となっ
ている。これにより、光路を変更して対物レンズ２２の
光路と一致させることができ、また、平面鏡４４を使用
しない場合は、光路からはずすことが可能となる。上述
の構成は、顕微鏡が正立型および倒立型のいずれであっ
ても適用することが可能である。倒立型顕微鏡において
は、上述の説明における上下が、試料に対して逆とな
る。
【００２３】（実施形態２）本発明の実施形態２は、試
料の下部方向の蛍光を利用するために、凹面鏡を用いて
いる。その構成を図１０ないし図１２を用いて詳しく説
明する。図１０は、落射蛍光顕微鏡における構成を示し
ている。図１０において、図１および図７に示した落射
蛍光顕微鏡と同様の構成についての説明を省略する。
料の下部方向の蛍光を利用するために、凹面鏡を用いて
いる。その構成を図１０ないし図１２を用いて詳しく説
明する。図１０は、落射蛍光顕微鏡における構成を示し
ている。図１０において、図１および図７に示した落射
蛍光顕微鏡と同様の構成についての説明を省略する。
【００２４】さて、図１０に示した落射蛍光顕微鏡で
は、試料２１を挟んで、カバーグラス４０を介した反対
側の空間に凹面反射鏡４６をおき、その焦点を対物レン
ズ２２の焦点に一致させる。カバーグラス４０からの蛍
光を凹面反射鏡４６で反射して、対物レンズ２２の光路
に一致させる。このような構成とすることにより、試料
２１から直接出る蛍光とともに凹面反射鏡４６で反射し
た蛍光を合わせて、対物レンズ２２により結像すること
ができる。その結果、接眼レンズ２５により蛍光強度を
増強した明るい蛍光像を観察することができる。
は、試料２１を挟んで、カバーグラス４０を介した反対
側の空間に凹面反射鏡４６をおき、その焦点を対物レン
ズ２２の焦点に一致させる。カバーグラス４０からの蛍
光を凹面反射鏡４６で反射して、対物レンズ２２の光路
に一致させる。このような構成とすることにより、試料
２１から直接出る蛍光とともに凹面反射鏡４６で反射し
た蛍光を合わせて、対物レンズ２２により結像すること
ができる。その結果、接眼レンズ２５により蛍光強度を
増強した明るい蛍光像を観察することができる。
【００２５】このような凹面反射鏡を用いる構成は、図
３ないし図６で説明した共焦点レーザ顕微鏡および多光
子励起レーザ顕微鏡にも適用することが可能である。そ
れを図示したのが、図１１および図１２である。図１１
は共焦点レーザ顕微鏡の構成を示し、図１２は多光子励
起レーザ顕微鏡の構成を示している。図１１および図１
２において、図４および図６に示したレーザ走査型顕微
鏡と同様の構成についての説明を省略する。
３ないし図６で説明した共焦点レーザ顕微鏡および多光
子励起レーザ顕微鏡にも適用することが可能である。そ
れを図示したのが、図１１および図１２である。図１１
は共焦点レーザ顕微鏡の構成を示し、図１２は多光子励
起レーザ顕微鏡の構成を示している。図１１および図１
２において、図４および図６に示したレーザ走査型顕微
鏡と同様の構成についての説明を省略する。
【００２６】図１１および図１２において、試料２１を
挟んで、カバーグラス４０を介した反対側の空間に、凹
面反射鏡４６をおき、その焦点を対物レンズ２２の焦点
に一致させる。カバーグラス４０からの蛍光を凹面反射
鏡４６で反射して、対物レンズ２２の光路に一致させ
る。このような構成とすることにより、試料２１から直
接出る蛍光とともに凹面反射鏡４６で反射した蛍光を合
わせて、対物レンズ２２を介して、検出器２６により蛍
光を測定することができる。
挟んで、カバーグラス４０を介した反対側の空間に、凹
面反射鏡４６をおき、その焦点を対物レンズ２２の焦点
に一致させる。カバーグラス４０からの蛍光を凹面反射
鏡４６で反射して、対物レンズ２２の光路に一致させ
る。このような構成とすることにより、試料２１から直
接出る蛍光とともに凹面反射鏡４６で反射した蛍光を合
わせて、対物レンズ２２を介して、検出器２６により蛍
光を測定することができる。
【００２７】なお、図１０ないし図１２に示した構成に
おいて、凹面反射鏡４６とカバーグラス４０との間は水
浸または油浸とすることができる。この場合は、凹面反
射鏡４６の曲面は正半球面となり、対物レンズ２２の特
性によらない。正半球面の拡がりは、対物レンズ２２の
開口角に一致させる。凹面反射鏡４６とカバーグラス４
０との間を水浸または油浸としない場合、凹面反射鏡４
６は、対物レンズ２２やカバーグラス４０の厚み等に合
わせて、凹面反射鏡４６の曲面を変え、拡がりも対物レ
ンズ２２の拡がりに合わせる。
おいて、凹面反射鏡４６とカバーグラス４０との間は水
浸または油浸とすることができる。この場合は、凹面反
射鏡４６の曲面は正半球面となり、対物レンズ２２の特
性によらない。正半球面の拡がりは、対物レンズ２２の
開口角に一致させる。凹面反射鏡４６とカバーグラス４
０との間を水浸または油浸としない場合、凹面反射鏡４
６は、対物レンズ２２やカバーグラス４０の厚み等に合
わせて、凹面反射鏡４６の曲面を変え、拡がりも対物レ
ンズ２２の拡がりに合わせる。
【００２８】また、凹面反射鏡４６は、光軸調整用の角
度変更装置に搭載することも可能であり、光路の変更や
光路より出し入れが可能とすることができる。これによ
り、対物レンズ２２の光路と一致させることができ、ま
た、凹面反射鏡４６を使用しない場合は、光路からはず
すことが可能となる。上述の構成は、顕微鏡が正立型お
よび倒立型のいずれであっても適用することが可能であ
る。倒立型顕微鏡においては、上述の説明における上下
が、試料に対して逆となる。
度変更装置に搭載することも可能であり、光路の変更や
光路より出し入れが可能とすることができる。これによ
り、対物レンズ２２の光路と一致させることができ、ま
た、凹面反射鏡４６を使用しない場合は、光路からはず
すことが可能となる。上述の構成は、顕微鏡が正立型お
よび倒立型のいずれであっても適用することが可能であ
る。倒立型顕微鏡においては、上述の説明における上下
が、試料に対して逆となる。
【００２９】
【発明の効果】上記の説明のように、本発明は、試料の
上側（下側）に向かう蛍光ばかりではなく、試料の下部
（上部）に漏れている蛍光をも、試料の観察に利用でき
るような構成としている。このため、蛍光強度を増強し
た明るい蛍光像を観察することができる。
上側（下側）に向かう蛍光ばかりではなく、試料の下部
（上部）に漏れている蛍光をも、試料の観察に利用でき
るような構成としている。このため、蛍光強度を増強し
た明るい蛍光像を観察することができる。
【図１】落射蛍光顕微鏡の構成を説明する図である。
【図２】落射蛍光顕微鏡において、励起光と蛍光とを分
離するダイクロミック・ミラー、励起フィルタおよび吸
収フィルタを説明するためのグラフである。
離するダイクロミック・ミラー、励起フィルタおよび吸
収フィルタを説明するためのグラフである。
【図３】単光子励起を説明するための図である。
【図４】共焦点レーザ顕微鏡の構成を説明する図であ
る。
る。
【図５】２光子励起を説明するための図である。
【図６】２光子励起レーザ顕微鏡の構成を説明する図で
ある。
ある。
【図７】実施形態１の落射蛍光顕微鏡の構成を説明する
図である。
図である。
【図８】実施形態１の多光子励起レーザ顕微鏡の構成を
説明する図である。
説明する図である。
【図９】実施形態１の多光子励起レーザ顕微鏡の構成を
説明する図である。
説明する図である。
【図１０】実施形態２の落射蛍光顕微鏡の構成を説明す
る図である。
る図である。
【図１１】実施形態１の多光子励起レーザ顕微鏡の構成
を説明する図である。
を説明する図である。
【図１２】実施形態２の多光子励起レーザ顕微鏡の構成
を説明する図である。
を説明する図である。
１０ 断熱ポテンシャル曲線 １１ 断熱ポテンシャル曲線 ２１ 試料 ２２ 対物レンズ ２３ レーザ光 ２４ ダイクロイック・ミラー ２５ レンズ ２５ 接眼レンズ ２６ 検出器 ２７ 共焦点ピンホール ３２ 照射光 ３４ 励起フィルタ ３６ 吸収フィルタ ４０ カバーグラス ４２ 対物レンズ ４４ 平面鏡 ４６ 凹面反射鏡
Claims (8)
- 【請求項１】 試料を、試料から発生する蛍光により観
察するための顕微鏡において、 試料から発生する蛍光を集光するための対物レンズと、 前記対物レンズとは試料を挟んだ反対側に、試料から発
生する蛍光を反射する反射鏡とを備え、前記反射鏡から
の反射による蛍光と、直接の蛍光とにより試料を観察す
ることを特徴とする顕微鏡。 - 【請求項２】 請求項１記載の顕微鏡において、前記反
射鏡は平面反射鏡であり、レンズとともに用いられるこ
とを特徴とする顕微鏡。 - 【請求項３】 請求項１記載の顕微鏡において、前記反
射鏡は凹面反射鏡であることを特徴とする顕微鏡。 - 【請求項４】 請求項３記載の顕微鏡において、前記凹
面反射鏡と試料との間には、水または油で満たされてい
ることを特徴とする顕微鏡。 - 【請求項５】 請求項１〜３いずれか記載の顕微鏡にお
いて、前記反射鏡は光路変更装置に搭載されていること
を特徴とする顕微鏡。 - 【請求項６】 前記請求項１〜５いずれか記載の顕微鏡
は、落射蛍光顕微鏡であることを特徴とする顕微鏡。 - 【請求項７】 前記請求項１〜５いずれか記載の顕微鏡
は、共焦点レーザ顕微鏡であることを特徴とする顕微
鏡。 - 【請求項８】 前記請求項１〜５いずれか記載の顕微鏡
は、多光子励起レーザ顕微鏡であることを特徴とする顕
微鏡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11029408A JP2000227556A (ja) | 1999-02-05 | 1999-02-05 | 顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11029408A JP2000227556A (ja) | 1999-02-05 | 1999-02-05 | 顕微鏡 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000227556A true JP2000227556A (ja) | 2000-08-15 |
Family
ID=12275317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11029408A Pending JP2000227556A (ja) | 1999-02-05 | 1999-02-05 | 顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000227556A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1598688A2 (en) * | 2004-05-21 | 2005-11-23 | Keyence Corporation | Fluorescence microscope |
| EP1598689A2 (en) * | 2004-05-21 | 2005-11-23 | Keyence Corporation | Fluorescence microscope |
| EP1666947A2 (en) * | 2004-12-03 | 2006-06-07 | Keyence Corporation | Fluorescence microscope |
| JP2007538238A (ja) * | 2004-05-17 | 2007-12-27 | ショット アクチエンゲゼルシャフト | デバイス上の局所構造体を測定する方法 |
| CN102621117A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-08-01 | 福建师范大学 | 一种活细胞激光扫描共聚焦显微成像*** |
| JP2012203193A (ja) * | 2011-03-25 | 2012-10-22 | Olympus Corp | 微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法 |
| US10401292B2 (en) | 2017-03-01 | 2019-09-03 | Olympus Corporation | Observation device |
| US11299701B2 (en) | 2019-03-19 | 2022-04-12 | Olympus Corporation | Culture-medium-monitoring apparatus |
-
1999
- 1999-02-05 JP JP11029408A patent/JP2000227556A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007538238A (ja) * | 2004-05-17 | 2007-12-27 | ショット アクチエンゲゼルシャフト | デバイス上の局所構造体を測定する方法 |
| EP1598689A3 (en) * | 2004-05-21 | 2006-10-04 | Keyence Corporation | Fluorescence microscope |
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| US7321462B2 (en) | 2004-12-03 | 2008-01-22 | Keyence Corporation | Fluorescence microscope |
| US7639420B2 (en) | 2004-12-03 | 2009-12-29 | Keyence Corporation | Fluorescence microscope |
| JP2012203193A (ja) * | 2011-03-25 | 2012-10-22 | Olympus Corp | 微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法 |
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| US10401292B2 (en) | 2017-03-01 | 2019-09-03 | Olympus Corporation | Observation device |
| US11299701B2 (en) | 2019-03-19 | 2022-04-12 | Olympus Corporation | Culture-medium-monitoring apparatus |
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|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060721 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060727 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070116 |