JP2000189189A - Method and apparatus for evaluation test using cell - Google Patents
Method and apparatus for evaluation test using cellInfo
- Publication number
- JP2000189189A JP2000189189A JP10366488A JP36648898A JP2000189189A JP 2000189189 A JP2000189189 A JP 2000189189A JP 10366488 A JP10366488 A JP 10366488A JP 36648898 A JP36648898 A JP 36648898A JP 2000189189 A JP2000189189 A JP 2000189189A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hepatocytes
- test substance
- test
- cells
- hollow fiber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、従来動物で行われ
ている化学物質や薬剤等の安全性、毒性等の評価試験を
肝細胞によって、容易に且つ安価に行う方法とそのため
の装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and an apparatus for easily and inexpensively evaluating the safety and toxicity of chemical substances and drugs conventionally performed on animals by using hepatocytes.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来より化学物質や薬剤などの毒性試験
や安全性評価を行うために、様々な種による動物実験が
行われてきた。しかし、動物実験では、ヒトと動物種の
差や動物の個体差を考慮しなくてはならず、それらの要
因による影響を差引くための多くの実験を繰り返すこと
でデータの蓄積をしさらに統計処理が必要である。しか
し、統計処理を行うには実験系が要求する最低限の固体
数が必要となり、一般的に多数の実験動物を使わなけれ
ばならないことが多い。上記のように、動物実験は人体
への化学物質や薬剤等の安全性評価を行うために、古く
から実施され確立された方法であるが、多数の動物を確
保するために少なからぬ費用と、動物の飼育に要する手
間と場所が必要であるというデメリットを有する。薬物
代謝系がヒトに近いブタなどの大動物を用いることは実
質的に不可能である。上記の理由に加え動物愛護の観点
から、最近では培養細胞を使用した評価試験方法が検討
されている。2. Description of the Related Art Conventionally, animal experiments with various species have been conducted in order to conduct toxicity tests and safety evaluations of chemical substances and drugs. However, in animal experiments, it is necessary to consider differences between humans and animal species and individual differences between animals, and accumulate data by repeating many experiments to subtract the effects of those factors, and further statistically Action is required. However, the statistical processing requires the minimum number of individuals required by the experimental system, and generally requires a large number of experimental animals. As described above, animal experiments are a long-established and established method for assessing the safety of chemicals and drugs on the human body, but with considerable costs to secure a large number of animals, It has the disadvantage of requiring time and space for breeding animals. It is virtually impossible to use large animals such as pigs whose drug metabolizing system is close to humans. In addition to the above reasons, from the viewpoint of animal welfare, recently, an evaluation test method using cultured cells has been studied.
【０００３】肝臓は、生体において毒物の代謝機能のほ
とんどを担っている臓器であるため、肝細胞を化学物質
や薬剤等の代謝や安全性を調べる用途に使用することが
考えられてきた。しかし、正常な肝細胞は長期間培養す
ることが困難であり、また生体から取り出された肝細胞
は短期間でその有用な機能を失うことが知られている。
そして、長期間培養可能となった細胞株（セルライン）
においても、ほとんどの場合に、肝機能に関連する遺伝
子に染色体の脱落や異常が起こったり、蛋白質修飾の際
の異常が起きて、正常肝細胞の多くの有用な機能（酵素
活性や有用な蛋白、液性因子の産生能等）が失われてい
る。そのため、培養肝細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ
での化学物質の安全性評価試験の結果は、生体内におけ
る代謝や安全性をそのまま再現したものとは言い難く、
生体における安全性評価のスクリーニング試験として妥
当であるか、否かについては、疑問のあるところであ
る。[0003] Since the liver is an organ that plays a major role in the metabolism of toxic substances in living organisms, it has been considered to use hepatocytes for the purpose of examining the metabolism and safety of chemical substances and drugs. However, it is known that normal hepatocytes are difficult to culture for a long period of time, and that hepatocytes removed from a living body lose their useful functions in a short period of time.
And cell lines (cell lines) that can be cultured for a long time
In most cases, chromosomal loss or abnormalities occur in genes related to liver function, or abnormalities occur during protein modification, resulting in many useful functions of normal hepatocytes (enzyme activity and useful proteins). , Humoral factor production ability, etc.). Therefore, in vitro using cultured hepatocytes
It is difficult to say that the results of the safety evaluation test of chemical substances in Japan exactly reproduced the metabolism and safety in vivo.
It is questionable whether it is appropriate as a screening test for safety evaluation in living organisms.
【０００４】例えば、特開平６−３１９５３５号公報に
は、細胞融合によって高い薬物代謝活性を有する株化肝
細胞とその細胞株を利用した薬物代謝試験、毒性・発癌
性試験方法が開示されているが、細胞融合・クローニン
グのためのテクニックや手間、期間が必要である上、目
的とする細胞株を得るのは容易でないと考えられる。[0004] For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-319535 discloses a established hepatocyte having a high drug metabolizing activity by cell fusion, a drug metabolism test and a toxicity / carcinogenicity test method using the cell line. However, techniques, labor and time for cell fusion / cloning are required, and it is considered that it is not easy to obtain a target cell line.
【０００５】また、肝細胞や株化肝細胞を利用した化学
物質の毒性試験方法を開示したものとして、上記の公開
公報以外に特許公報第２５３１４５５号、特開平８−１
６３９９６号公報等が公知である。上記の公報に開示さ
れた毒性試験評価方法は、プラスチック製の培養皿や試
験管の中で、細胞に被験すべき化学物質を添加して培養
し、所定期間後に細胞のパターンや蛋白合成、酵素活性
を測定するものである。[0005] In addition to the above publications, Japanese Patent Publication No. 2531455 and Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-1 disclose a method for testing the toxicity of chemical substances using hepatocytes or established hepatocytes.
No. 63996 is known. The toxicity test evaluation method disclosed in the above-mentioned publication is to add a chemical substance to be tested to cells in a culture dish or a test tube made of plastic and culture the cells. It measures activity.
【０００６】しかし、上記のように培養皿や試験管内で
細胞を培養する系では、細胞による被験物質の代謝を正
確に、且つ被験物質以外による影響を除いて評価するこ
とが困難である。即ち、従来の静置培養における薬物の
代謝では、目的とする薬物の代謝産物が培養液の中に蓄
積し、純粋に元の目的物質の代謝評価することが困難で
あることが多い。そのため、上記代謝産物が元の薬物の
代謝に影響を及ぼす場合、培養液が培養皿や試験管など
のモジュールを一回通過した後、培地を廃棄するような
システムを構成して、代謝を測定する必要がある。However, in the system for culturing cells in a culture dish or a test tube as described above, it is difficult to accurately evaluate the metabolism of the test substance by the cells and to remove the influence of other than the test substance. That is, in the conventional metabolism of drugs in static culture, metabolites of the target drug accumulate in the culture solution, and it is often difficult to evaluate the metabolism of the original target substance purely. Therefore, if the above metabolites affect the metabolism of the original drug, configure the system to discard the medium after the culture solution has passed through a module such as a culture dish or test tube once, and measure the metabolism. There is a need to.
【０００７】また、生体内に入った薬物は、血液によっ
て肝臓へと運ばれるが、肝臓の薬物代謝速度は薬物の種
類によって異なる。即ち、薬物には、血流による肝臓へ
の搬入速度が律速になっているものから、肝細胞の酵素
による代謝が律速になっているものまで種々存在する。
ところが、培養皿や試験管内で細胞を培養する系では、
モジュールに負荷する薬物の流入速度を変化させること
ができない。[0007] Drugs that have entered the living body are transported to the liver by blood, and the rate of drug metabolism in the liver differs depending on the type of drug. That is, there are a variety of drugs, from those in which the rate of transport into the liver by blood flow is rate-limiting, to those in which metabolism by hepatocyte enzymes is rate-limiting.
However, in systems that culture cells in culture dishes or test tubes,
The inflow rate of the drug loaded on the module cannot be changed.
【０００８】また、培養皿や試験管内で細胞を培養する
系では、肝細胞や株化肝細胞では基材に単層の状態で接
着し易く、凝集体を形成し難い。生体肝臓内の肝細胞は
細胞が相互に接着し３次元の構造を形成している。肝細
胞の分化機能はその高次構造に大きく依存しているが、
単層培養された肝細胞は２次元的な構造であり、このよ
うな状態では肝細胞は正常細胞の有する有用な機能・活
性を急速に失うと報告されている。このため、培養皿や
試験管内で培養した肝細胞を用いたのでは、化学物質の
生体における代謝を正確に反映できない恐れがある。さ
らに、基材に単層付着した肝細胞と３次元構造に構築さ
れた肝細胞では、被験物質に対する被曝効率や被曝後の
影響が異なり、その点からも生体での肝細胞機能を反映
した試験結果を得ることができない恐れがある。In a system for culturing cells in a culture dish or a test tube, hepatocytes and established hepatocytes are easily adhered to a substrate in a monolayer state, and are hard to form aggregates. Hepatocytes in a living liver form a three-dimensional structure in which cells adhere to each other. The differentiation function of hepatocytes largely depends on their higher-order structure,
It is reported that hepatocytes cultured in a monolayer have a two-dimensional structure, and in such a state, hepatocytes rapidly lose useful functions and activities possessed by normal cells. Therefore, if hepatocytes cultured in a culture dish or a test tube are used, there is a possibility that the metabolism of a chemical substance in a living body may not be accurately reflected. In addition, the efficiency of exposure to test substances and the effects after exposure are different between hepatocytes attached to a substrate in a single layer and hepatocytes constructed in a three-dimensional structure. There may be no results.
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の第１
の目的は、被験物質の各種の試験評価を肝細胞等によっ
て、容易に且つ再現性良く行える方法を得ること、さら
にその評価方法のための装置・手段を提供することであ
る。具体的には、安全性・毒性等の評価項目において、
肝細胞等による代謝を正確に、且つ代謝産物等による他
の（被験物質単独によるもの以外の）影響を除いて評価
できる方法や手段を提供することである。Accordingly, the first aspect of the present invention is as follows.
An object of the present invention is to provide a method for easily and reproducibly performing various test evaluations of a test substance using hepatocytes and the like, and to provide an apparatus and means for the evaluation method. Specifically, in the evaluation items such as safety and toxicity,
An object of the present invention is to provide a method and means capable of accurately evaluating metabolism by hepatocytes and the like, and excluding other influences (other than the test substance alone) by metabolites and the like.
【００１０】本発明の第２の目的は、肝細胞等による被
験物質の代謝やその代謝速度を経時的に測定することの
できる評価方法や手段を提供することである。本発明の
第３の目的は、肝細胞等の生存率、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
を高め、細胞の機能や活性を長期間維持する評価方法や
手段を提供することにある。本発明の第４の目的は、生
体肝臓のある環境により類似した系で、被験物質の代謝
を評価できる方法や手段を提供することにある。A second object of the present invention is to provide an evaluation method and means capable of measuring the metabolism of a test substance by hepatocytes and the like and the metabolic rate thereof over time. A third object of the present invention is to determine the survival rate of hepatocytes and the like,
And to provide an evaluation method and means for maintaining cell function and activity for a long period of time. A fourth object of the present invention is to provide a method and means capable of evaluating the metabolism of a test substance in a system more similar to a certain environment of a living liver.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明では、多孔質の中
空糸内腔に肝細胞或いは株化肝細胞を内蔵した中空糸モ
ジュールを使用し、前記中空糸の外側に被験物質を混入
した灌流液を灌流することによって、前記細胞による被
験物質の代謝や前記細胞に与える被験物質の影響を調べ
ることを特徴とする細胞による評価試験方法によって、
上記課題を解決した。According to the present invention, a hollow fiber module having a built-in hepatocyte or established hepatocyte in a hollow hollow fiber lumen is used, and a perfusion mixture containing a test substance outside the hollow fiber is used. By perfusing the solution, by an evaluation test method with cells, which is characterized by examining the metabolism of the test substance by the cells and the effect of the test substance on the cells,
The above problem has been solved.
【００１２】また、多孔質の中空糸を充填した中空糸モ
ジュールを有する装置であって、中空糸内腔に肝細胞或
いは株化肝細胞を内蔵しており、中空糸の外側に被験物
質を混入した灌流液を灌流し、前記細胞による被験物質
の代謝や前記細胞に与える被験物質の影響を調べること
を特徴とする細胞による評価試験装置によって、上記課
題を解決した。An apparatus having a hollow fiber module filled with a porous hollow fiber, wherein a hepatocyte or an established hepatocyte is incorporated in the hollow fiber lumen, and a test substance is mixed outside the hollow fiber. The above problem was solved by a cell evaluation test apparatus characterized by perfusing the perfused solution and examining the metabolism of the test substance by the cells and the effect of the test substance on the cells.
【００１３】本発明の方法や装置の重要な特徴は、肝細
胞或いは株化肝細胞（以下、肝細胞等ともいう）を中空
糸内腔に充填し、中空糸外側に薬物等の被験物質を混入
した灌流液を流し、中空糸膜を介して灌流液（被験物
質）と肝細胞とを接触させることによって、被験物質の
肝細胞による代謝、被験物質による肝細胞の影響を評価
することである。その中空糸には、充填した肝細胞等が
通過しない程度の大きさの径の微少孔が多数存在してい
るため、細胞に必要な栄養物や低分子量の被験物質は自
由に通過できる。An important feature of the method and device of the present invention is that hepatocytes or established hepatocytes (hereinafter also referred to as hepatocytes) are filled in the hollow fiber lumen, and a test substance such as a drug is placed on the outside of the hollow fiber. To evaluate the metabolism of the test substance by the hepatocytes and the effect of the test substance on the hepatocytes by flowing the mixed perfusate and bringing the perfusate (test substance) into contact with hepatocytes via the hollow fiber membrane. . Since the hollow fiber has a large number of micropores having a diameter small enough to prevent the passage of the filled hepatocytes, nutrients necessary for the cells and low-molecular-weight test substances can freely pass therethrough.
【００１４】従って、中空糸内腔に肝細胞等を充填し、
調べようとする被験物質の溶液を、中空糸外側に流すこ
とによって、肝細胞による被験物質の代謝や、被験物質
による肝細胞の影響を評価することができる。この系で
は灌流液が移動しているため、従来の、細胞による毒性
試験方法のように、被験物質の肝細胞による代謝産物が
モジュールに滞留することはない。肝細胞等による代謝
産物は中空糸モジュールから流出するので、前記代謝産
物による肝細胞への影響を考慮する必要はなく、肝細胞
による被験物質の代謝を独立に調べることが出来る。Therefore, the hollow fiber lumen is filled with hepatocytes and the like,
By flowing the solution of the test substance to be examined outside the hollow fiber, the metabolism of the test substance by the hepatocytes and the effect of the test substance on the hepatocytes can be evaluated. In this system, since the perfusate is moving, the metabolite of the test substance by the hepatocytes does not stay in the module unlike the conventional cell toxicity test method. Since metabolites generated by hepatocytes and the like flow out of the hollow fiber module, it is not necessary to consider the effects of the metabolites on hepatocytes, and the metabolism of the test substance by the hepatocytes can be independently examined.
【００１５】評価方法としては色々考えられるが、肝細
胞と接触した灌流液中の被験物質の濃度やその代謝産物
の濃度を測定することによって、被験物質の代謝速度を
評価しても良いし、中空糸モジュール内の肝細胞の形態
変化、生存率や機能・活性を調べることによって、被験
物質による肝細胞への影響を評価することもできる。例
えば、前者の例では、灌流液の灌流速度を正確に制御で
きるような手段によって、被験物質の灌流液の濃度や灌
流速度をコントロールし、肝細胞への薬物負荷量や負荷
速度を変更することができる。そして、系を灌流したま
ま（オンラインで）、中空糸モジュールの下流側で灌流
液を採取し、灌流液中の被験物質の濃度を定期的に測定
することにより、被験物質の肝細胞による経時的な代謝
や代謝速度をより正確に把握することができる。Although there are various evaluation methods, the metabolic rate of the test substance may be evaluated by measuring the concentration of the test substance or its metabolite in the perfusate in contact with hepatocytes. By examining the morphological changes, survival rates, functions and activities of the hepatocytes in the hollow fiber module, the effect of the test substance on the hepatocytes can also be evaluated. For example, in the former case, the concentration and the perfusion rate of the test substance perfusate are controlled by means capable of accurately controlling the perfusion rate of the perfusate, and the drug load and the load rate on the hepatocytes are changed. Can be. Then, while the system is perfused (on-line), the perfusate is collected downstream of the hollow fiber module, and the concentration of the test substance in the perfusate is periodically measured, so that the time of the test substance by the hepatocytes over time is measured. The metabolism and metabolic rate can be grasped more accurately.
【００１６】本発明では培地を灌流することによって、
中空糸外側から栄養物が補給でき、また、中空糸内で細
胞が３次元的（細胞間接着を形成した状態）に充填され
ているため、肝細胞等の生存率が向上し、また（生体肝
細胞が本来有している）機能・活性を長期間維持させる
ことができる。我々の実験によれば、少なくとも７日間
亙ってほぼ一定のリドカイン、アンモニアとガラクトー
スの代謝能を有していた。In the present invention, by perfusing the medium,
Nutrients can be supplied from the outside of the hollow fiber, and cells are three-dimensionally (in a state where cell-cell adhesion is formed) in the hollow fiber, so that the survival rate of hepatocytes and the like is improved, and Function and activity that hepatocytes originally possess) can be maintained for a long time. According to our experiments, it had a nearly constant lidocaine, ammonia and galactose metabolism for at least 7 days.
【００１７】また、肝細胞の分化機能は培養状態に大き
く依存しており、肝細胞がバラバラに存在していては、
肝臓のような優れた性能を発揮できないので、肝細胞同
士がコミュニケートできるように中空糸内で肝細胞等を
集合させるのである。細胞を２次元的に培養する場合
と、３次元的に培養する場合では、肝細胞の遺伝子の発
現が異なることが判っている。Further, the differentiation function of hepatocytes greatly depends on the culture state, and if hepatocytes exist separately,
Since it cannot exhibit the excellent performance of the liver, hepatocytes and the like are aggregated in the hollow fiber so that hepatocytes can communicate with each other. It has been found that gene expression of hepatocytes differs between two-dimensional and three-dimensional cell culture.
【００１８】また、肝細胞等を中空糸内腔に封入するこ
とにより、細胞独自の高次構造が形成され易くなる。そ
して、肝臓に存在する他の細胞を肝細胞と共に中空糸内
に封入することによって、他の細胞も含んだ高次構造が
形成され、より生体肝臓に近いものとすることができ
る。Further, by encapsulating hepatocytes and the like in the hollow fiber lumen, a cell-specific high-order structure is easily formed. Then, by encapsulating other cells present in the liver together with the hepatocytes in the hollow fiber, a higher-order structure including the other cells is formed, and the liver can be made closer to a living liver.
【００１９】さらに上記したように、肝細胞（等）封入
体への被験物質の搬入および封入体からの代謝物の流
出、中空糸内での細胞間接着の形成等を含め、本発明の
方法や装置は生体肝臓により類似した環境を構成してい
るため、より生体に近いシミュレーション（生体への被
験物質の影響、或いは被験物質の代謝）を期待できる。Further, as described above, the method of the present invention includes transporting a test substance to and inclusion of a test substance into a hepatocyte (or the like) inclusion body, efflux of metabolites from the inclusion body, formation of intercellular adhesion in a hollow fiber, and the like. Since the device and the device constitute an environment more similar to the living liver, a simulation closer to the living body (effect of the test substance on the living body or metabolism of the test substance) can be expected.
【００２０】[0020]
【発明の実施の形態】さらに、本発明では上記の構成に
加え、以下のような実施態様を選択することにより、後
述するような種々の利点を有する。Further, in the present invention, in addition to the above-described structure, by selecting the following embodiments, there are various advantages as described later.
【００２１】前記細胞に与える被験物質の影響として、
細胞毒性、変異原性、発癌性のいずれか、或いは上記の
組合せによる試験を行うことができる。また、肝細胞等
が長期間培養可能であると、慢性毒性試験やウイルス感
染試験等、従来ｉｎ ｖｉｔｒｏで行えなかった試験も
行うことができる。本発明では、被験物質の種類、灌流
液への混入方法、被験物質の測定や被験物質被曝後の肝
細胞の評価を選択することによって、上記の様々な試験
や組合せ試験を行うことができる。The effect of the test substance on the cells is as follows:
The test can be performed by any of cytotoxicity, mutagenicity, carcinogenicity, or a combination of the above. If hepatocytes and the like can be cultured for a long period of time, tests that could not be performed in vitro, such as a chronic toxicity test and a virus infection test, can be performed. In the present invention, the above-described various tests and combination tests can be performed by selecting the type of the test substance, the method of mixing the test substance into the perfusate, the measurement of the test substance, and the evaluation of hepatocytes after exposure to the test substance.
【００２２】また、実施態様の１つとして、本発明の評
価試験装置が、被験物質注入手段および灌流液の流量を
制御する流量制御手段、流路調節手段を有しており、こ
れらの各手段や前記中空糸モジュールが灌流路で連絡さ
れているものが挙げられる。この装置は、灌流液への被
験物質の注入方法や灌流液の流速を変更することがで
き、その結果、肝細胞への被験物質の搬入速度や注入方
法を変えて、被験物質の正確な代謝や代謝速度を測定す
ることができる。As one of the embodiments, the evaluation test apparatus of the present invention has a test substance injection means, a flow control means for controlling the flow rate of the perfusate, and a flow path adjustment means. And those in which the hollow fiber modules are connected via a perfusion channel. This device can change the method of injecting the test substance into the perfusate and change the flow rate of the perfusate. And metabolic rate can be measured.
【００２３】既述したように、生体による薬物代謝速度
はその薬物によって異なる。上記の装置では、薬物負荷
試験には単回投与法と定速持続注入法の２つの方法があ
り、前者は薬物を瞬時に与えて、その後の薬物の濃度変
化を追跡するものであり、後者は一定速度で薬物を注入
し、その平衡速度を調べるものである。上記の装置で
は、肝細胞への薬物の搬入速度が律速になる場合と肝細
胞の酵素反応が律速になる場合があるが、薬物投与法を
変えることにより、これらを区別して評価することがで
きる。また、流量制御手段としては、灌流速度を１．０
〜１００ｍｌ／ｍｉｎの範囲で正確に制御できるものが
好ましい。例えば、液体クロマトグラフィーで使用され
ているような高精度に制御できる液体ポンプ等で灌流液
の流速をコントロールするのが好ましい。As described above, the rate of metabolism of a drug by a living body differs depending on the drug. In the above device, there are two methods of drug loading test, a single dose method and a constant rate continuous infusion method. The former is to give a drug instantaneously and track the subsequent concentration change of the drug. Is to inject a drug at a constant rate and check its equilibrium rate. In the above device, there are cases where the rate of drug delivery to the hepatocytes is rate-limiting and cases where the rate of the enzyme reaction of the hepatocytes is rate-limiting. By changing the drug administration method, these can be distinguished and evaluated. . Further, as the flow control means, the perfusion rate is set to 1.0
Those which can be accurately controlled in the range of -100 ml / min are preferable. For example, it is preferable to control the flow rate of the perfusate with a liquid pump or the like that can be controlled with high precision as used in liquid chromatography.
【００２４】また、前記評価試験装置にサンプリング手
段、被験物質分析手段が組み込まれており、灌流液を灌
流しながら、灌流液（被験物質）の経時的な採取および
測定を自動的に行うものは、さらに好ましい。評価試験
装置に、上記の各手段を設けることによって、容易に且
つ所定の時間毎に間違うことなく、被験物質の採取が行
え、その代謝濃度の測定を正確に行うことができる。例
えば、図１に示すような、被験物質注入手段、貯液槽、
流量制御手段、酸素付加手段、中空糸モジュールが灌流
路で連絡された細胞の評価試験装置に、中空糸モジュー
ル下流側の灌流路にサンプリング手段、および該サンプ
リング手段によって採取された検体を分析する被験物質
分析手段が一体的に設けられていると、いわゆる全自動
オンライン分析が可能となる。Further, the above-mentioned evaluation test apparatus is provided with a sampling means and a test substance analyzing means, which automatically collects and measures the perfusion solution (test substance) with time while perfusing the perfusion solution. Is more preferable. By providing each of the above means in the evaluation test apparatus, the test substance can be collected easily and without error every predetermined time, and its metabolic concentration can be measured accurately. For example, as shown in FIG. 1, a test substance injection means, a storage tank,
A flow rate control means, an oxygenation means, a test apparatus for evaluating cells to which the hollow fiber module is connected in a perfusion path, a sampling means in a perfusion path downstream of the hollow fiber module, and a test for analyzing a sample collected by the sampling means. When the substance analysis means is provided integrally, so-called fully automatic online analysis becomes possible.
【００２５】前記流量制御手段および被験物質注入手段
が協同して、灌流の間、モジュール内における被験物質
の濃度を実質的に一定にする評価試験装置も肝細胞等の
状態変化を追跡するために、好ましい。肝細胞は自然に
も変化し、また被験物質によって種々の酵素が誘導さ
れ、或いは逆に酵素の働きが阻害されたりして、肝細胞
は時々刻々と変化する。そのため、上述した定速持続注
入法において、一定速度で薬物を注入し、肝細胞等に負
荷する薬物濃度をほぼ一定に保持することで、酵素の誘
導や阻害等の肝細胞自体の変化を考慮した評価試験を行
うことができる。The flow rate control means and the test substance injecting means cooperate with each other, so that the evaluation test apparatus for making the concentration of the test substance in the module substantially constant during the perfusion is also used for tracking changes in the state of hepatocytes and the like. ,preferable. Hepatocytes change spontaneously, and various enzymes are induced by test substances or, conversely, the action of enzymes is inhibited, and hepatocytes change every moment. Therefore, in the above-mentioned constant-rate continuous infusion method, by injecting the drug at a constant rate and keeping the drug concentration loaded on the hepatocytes almost constant, changes in the hepatocytes themselves such as induction and inhibition of enzymes are considered. Evaluation test can be performed.
【００２６】中空糸モジュールに封入する肝細胞或いは
株化肝細胞の数としては、１０００万〜１００億個程度
が好ましい。但し、好ましい細胞数は、負荷される被験
物質の量、中空糸モジュールの大きさ、そのモジュール
に収納される中空糸の本数等によって異なり、なるべく
少数の細胞で再現性良く評価する場合には、０．５〜２
億個の肝細胞等を封入するのが、好ましい。The number of hepatocytes or established hepatocytes encapsulated in the hollow fiber module is preferably about 10 to 10 billion. However, the preferred number of cells depends on the amount of the test substance to be loaded, the size of the hollow fiber module, the number of hollow fibers contained in the module, and the like. 0.5-2
It is preferable to enclose 100 million hepatocytes and the like.
【００２７】また、前記モジュールに内蔵される細胞
が、肝細胞とそれ以外の生体肝臓内に存在する細胞とを
含む混合体であるのが好ましい。肝細胞は、生体肝臓内
のｋｕｐｆｆｅｒ細胞等の種々の細胞と相互作用するこ
とで、その分化機能を維持している。中空糸内に肝細胞
と共にｋｕｐｆｆｅｒ細胞等を封入することにより、肝
細胞の分化機能を高く長期間維持できるようになる。It is preferable that the cells contained in the module be a mixture containing hepatocytes and other cells existing in the living liver. Hepatocytes maintain their differentiation function by interacting with various cells such as kupfer cells in living liver. By encapsulating kupfer cells and the like together with hepatocytes in the hollow fiber, the differentiation function of hepatocytes can be maintained at a high level for a long period of time.
【００２８】中空糸モジュールに封入する細胞として
は、肝細胞がヒト由来であるのが望ましい。被験物質の
代謝や被験物質による細胞への影響は多分に種特異性を
有するためである。また、細胞が容易に得られまたその
代謝がヒト肝細胞に近いブタ肝細胞も用いることが出来
る。As the cells to be enclosed in the hollow fiber module, it is preferable that hepatocytes are derived from humans. This is probably because the metabolism of the test substance and the effect of the test substance on cells have species specificity. Porcine hepatocytes from which cells are easily obtained and whose metabolism is close to that of human hepatocytes can also be used.
【００２９】中空糸の灌流液への接触有効表面積は０．
１ 〜 ６．０ｍ2が望ましく、それより小さいと、被験
物質と細胞を充分接触することができず、それより大き
いと大量の被験物質や肝細胞等が必要となる。中空糸の
膜厚としては、１０〜１００μｍが好ましく、薄過ぎる
と中空糸膜が破損して肝細胞が流出する恐れがあり、厚
過ぎると、細胞と被験物質が充分接触しない恐れがあ
る。中空糸モジュールの中空糸の外形が１２０〜６００
μｍはであり、中空糸モジュールの中空糸の内形が１０
０〜４００μｍが望ましい。中空糸壁の孔径は１ｎｍ〜
１０μｍが好ましく、それより小さいと、被験物質を含
む灌流液の流通が阻害され、それより大きいと、肝細胞
等が中空糸から流出してしまう。The effective surface area of the hollow fiber in contact with the perfusate is 0.
1 to 6.0 m <2> is desirable, and if it is smaller than this, the test substance and the cells cannot be sufficiently contacted. The thickness of the hollow fiber is preferably from 10 to 100 μm. If the thickness is too small, the hollow fiber membrane may be broken and hepatocytes may flow out. If the thickness is too large, the cells and the test substance may not be sufficiently contacted. The outer shape of the hollow fiber of the hollow fiber module is 120 to 600
μm, and the inner shape of the hollow fiber of the hollow fiber module is 10 μm.
0 to 400 μm is desirable. Hole diameter of hollow fiber wall is 1nm ~
If it is smaller than 10 μm, the flow of the perfusate containing the test substance is hindered. If it is larger than 10 μm, hepatocytes and the like flow out of the hollow fibers.
【００３０】また、本発明の評価試験装置の１実施態様
として、標準物質の代謝と目的とする被験物質との代謝
との比較によって、被験物質の代謝性を相対的に評価す
るものも挙げられる。即ち、肝細胞は培養期間中に時々
刻々と性質が変化する。そのため、通常の細胞毒性試験
等に使用する肝細胞は採取後、２４時間以内に使用する
等の制限を設けてコントロールしている。また、使用す
る肝細胞の種や元々の肝臓の状態などによって、被験物
質を代謝する機能・活性は異なってくるので、上記のよ
うに、肝細胞の特定の経路で代謝されることが詳しく判
明している被験物質を加えて、肝細胞の機能・活性を規
定した後、その基準によって目的とする被験物質の代謝
を評価する方が好ましい。Further, as one embodiment of the evaluation test apparatus of the present invention, there is an apparatus for relatively evaluating the metabolic properties of a test substance by comparing the metabolism of a standard substance with the metabolism of a target test substance. . That is, the properties of hepatocytes change every moment during the culture period. For this reason, hepatocytes used in ordinary cytotoxicity tests and the like are controlled with restrictions such as use within 24 hours after collection. In addition, since the function and activity of metabolizing the test substance differ depending on the type of hepatocytes used and the state of the original liver, it has been found in detail that the metabolism is carried out by a specific pathway of hepatocytes as described above. It is preferable to add the test substance to be used, determine the function and activity of hepatocytes, and then evaluate the metabolism of the target test substance based on the criteria.
【００３１】以上は、本発明の評価試験装置について述
べたが、評価方法についても上記の構成に加え、以下に
述べるような実施態様を選択することにより、既述した
種々の利点を有する。Although the evaluation test apparatus of the present invention has been described above, the evaluation method has the above-described various configurations and the above-described various advantages by selecting the following embodiments.
【００３２】第１の実施態様は、前記中空糸モジュール
から流出した灌流液を採取し、採取した灌流液によって
被験物質の代謝を評価する方法である。中空糸に封入す
る細胞種としては、ヒト由来のものが好ましいが、特に
限定されるものではない。The first embodiment is a method of collecting perfusate flowing out of the hollow fiber module and evaluating the metabolism of a test substance using the collected perfusate. The cell type to be enclosed in the hollow fiber is preferably a human-derived cell type, but is not particularly limited.
【００３３】第２の実施態様は、前記灌流液の負荷薬物
濃度や灌流速度を変更することによって、前記細胞に対
する被験物質の負荷量を制御することによって、肝細胞
による被験物質の代謝速度や肝細胞の影響を評価する方
法である。In a second embodiment, the metabolic rate of the test substance by the hepatocytes, the hepatic metabolic rate, and the amount of the test substance to the cells are controlled by changing the drug concentration and the perfusion rate of the perfusate. This is a method for evaluating the effects of cells.
【００３４】第３の実施態様は、灌流の間、モジュール
内における被験物質の濃度を実質的に一定にして、前記
細胞の変化や影響を調べる評価方法である。The third embodiment is an evaluation method for examining the change or influence of the cells while maintaining the concentration of the test substance in the module substantially constant during the perfusion.
【００３５】第４の実施態様は、標準物質の代謝と目的
とする被験物質との代謝との比較によって、（肝細胞の
種や機能・活性に影響されないで、）被験物質の代謝性
を相対的に評価する方法である。In the fourth embodiment, the metabolism of the test substance is relatively determined (without being affected by the type, function, or activity of hepatocytes) by comparing the metabolism of the standard substance with the metabolism of the target test substance. It is a method to evaluate it.
【００３６】第５の実施態様は、中空糸モジュールの下
流側で灌流液を経時的に自動サンプリングすることによ
って、オンラインで被験物質の代謝速度を評価する方法
である。The fifth embodiment is a method for evaluating the metabolic rate of a test substance online by automatically sampling the perfusate with time downstream of the hollow fiber module.
【００３７】第６の実施態様は、前記被験物質を混入し
た灌流液を灌流した後に、灌流路から中空糸モジュール
を取り出し、中空糸内の細胞の生存率、増殖抑制を測定
する評価方法である。それによって、被験物質による肝
細胞等への影響が直接的に確認できる利点がある。或い
は、灌流後に中空糸モジュールから細胞を取り出し、さ
らに細胞を破壊した後チトクロームＰ４５０の酵素活性
を測定することもできる。The sixth embodiment is an evaluation method for measuring the survival rate and growth inhibition of the cells in the hollow fiber after removing the hollow fiber module from the perfusion channel after perfusing the perfusate mixed with the test substance. . This has the advantage that the effect of the test substance on hepatocytes and the like can be directly confirmed. Alternatively, the cells can be removed from the hollow fiber module after perfusion, and the cells can be disrupted, and then the enzyme activity of cytochrome P450 can be measured.
【００３８】[0038]
【実施例】図１に、本発明の評価試験装置の１実施態様
の概略図を示す。肝細胞による試験評価装置１は、薬物
注入ポンプ（被験物質注入手段）２、貯液槽３、液体ポ
ンプ（流量制御手段）４、酸素付加器５、肝細胞等を中
空糸に封入した中空糸モジュール６、サンプリングポン
プ（サンプリング手段）７、流路調節器８とが、培地や
被験物質の入った灌流液を灌流する灌流路９によって連
絡されている。また、サンプリングポンプ７によって、
灌流路や貯液槽３等から経時的に採取された検体は、液
体クロマトグラフィー１０、コンピューター１１等の被
験物質分析手段によって測定され、分析される。循環す
る方向は液体ポンプ→酸素付加器５→中空糸モジュール
６の通りであり、サンプリングを中空糸モジュール６下
流側で行う。或いは上述したように、貯液槽内３から直
接サンプリングする。貯液槽３の下方にはスターラー
（攪拌装置）１２が配置され、槽内に入れたスターラー
チップ（攪拌子）１３を回転させることによって、貯液
槽内の液が偏らないように混合している。貯液槽からの
液は導管を通って、サンプリングポンプ７近傍に設けた
三方コック１４を開放することによって、採取され分析
される。このシステムによって、被験物質の混入した灌
流液を灌流させながら、被験物質の代謝や代謝速度を経
時的に評価する、全自動オンライン分析ができる。FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of an evaluation test apparatus according to the present invention. The test evaluation apparatus 1 using hepatocytes comprises a drug infusion pump (test substance injecting means) 2, a reservoir 3, a liquid pump (flow rate controlling means) 4, an oxygenator 5, and a hollow fiber in which hepatocytes and the like are sealed in a hollow fiber. The module 6, the sampling pump (sampling means) 7, and the flow path regulator 8 are connected by a perfusion path 9 for perfusing a perfusion solution containing a medium and a test substance. Also, by the sampling pump 7,
Samples collected over time from the irrigation channel and the reservoir 3 are measured and analyzed by test substance analyzing means such as the liquid chromatography 10 and the computer 11. The direction of circulation is as follows: liquid pump → oxygenator 5 → hollow fiber module 6; sampling is performed on the downstream side of hollow fiber module 6. Alternatively, as described above, sampling is performed directly from the inside of the liquid storage tank 3. A stirrer (stirring device) 12 is arranged below the liquid storage tank 3, and by rotating a stirrer chip (stirrer) 13 placed in the tank, the liquid in the liquid storage tank is mixed so as not to be biased. I have. The liquid from the liquid storage tank is collected and analyzed by opening the three-way cock 14 provided near the sampling pump 7 through the conduit. This system enables full-automatic online analysis to evaluate metabolism and metabolic rate of a test substance over time while perfusing a perfusate containing the test substance.
【００３９】図２に示したのは、中空糸内腔にブタ由来
の肝細胞を充填し、中空糸外側に被験物質としてリドカ
インおよびアンモニアを添加した灌流液を灌流させた場
合の、各被験物質の経時的な解毒結果である。実験条件
を以下に示す。FIG. 2 shows each test substance obtained by filling the hollow fiber lumen with pig-derived hepatocytes and perfusing the outside of the hollow fiber with a perfusate containing lidocaine and ammonia as test substances. 7 shows the results of the detoxification over time. The experimental conditions are shown below.
【００４０】体重１０ｋｇの麻酔下の幼児ブタの肝門脈
から、エチレングリコール四酢酸を含む溶液とコラゲナ
ーゼを含む溶液とを連続的に肝臓内に灌流させ、肝細胞
の基質接着及び細胞接着を解離させることによって、ブ
タ肝細胞を採取した。次に氷冷したハンクス液による洗
浄と低速遠心分離を数回繰り返して肝細胞を精製・単離
した。単離された肝細胞の総数は２．２×１０10個であ
り、エリスロシン染色で測定した単離肝細胞の生存数は
８５％であった。得られた肝細胞を３５０ｒｐｍで３分
間遠心分離して遠心管の底に集めた。A solution containing ethylene glycol tetraacetic acid and a solution containing collagenase are continuously perfused into the liver from the hepatic portal vein of an anesthetized infant pig weighing 10 kg to dissociate the substrate adhesion and cell adhesion of hepatocytes. By doing so, pig hepatocytes were collected. Next, the hepatocytes were purified and isolated by repeating washing with ice-cold Hanks' solution and low-speed centrifugation several times. The total number of isolated hepatocytes was 2.2 × 10 10 , and the viability of the isolated hepatocytes measured by erythrosine staining was 85%. The obtained hepatocytes were centrifuged at 350 rpm for 3 minutes and collected at the bottom of the centrifuge tube.
【００４１】単離した肝細胞を１．０×１０8個／ｍｌ
になるように培養液に分散した後、この肝細胞分散液を
酢酸セルロース製の中空糸型血液透析器の中空糸内部に
１００ｍｌ注入した。その後、直ちにダルベッコ改変最
小培地とブタ全血とを１：１の比率で混合した液１００
０ｍｌを灌流液として、図１に示した灌流及び培養シス
テムを用いて培養を開始した。灌流液には１００単位／
ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ
シンを添加したものを使用した。灌流速度は２００ｍｌ
／ｍｉｎとした。モジュールの機能評価は、灌流液中に
１ｍＭのアンモニア、６．２５ｍｇ／ｍｌのガラクトー
ス、１０μｇ／ｍｌのリドカインを添加した負荷試験に
よって行った。経時的に培養液のサンプリングを行い、
灌流液中のアンモニア、ガラクトース、リドカイン、リ
ドカインの代謝産物であるモノエチルグリシンキシリダ
イド（ＭＥＧＸ）の定量を行った。The isolated hepatocytes were cultured at 1.0 × 10 8 cells / ml.
Then, 100 ml of the hepatocyte dispersion was injected into the hollow fiber of a hollow fiber hemodialyzer made of cellulose acetate. Immediately thereafter, a liquid 100 in which Dulbecco's modified minimal medium and porcine whole blood were mixed at a ratio of 1: 1.
The culture was started using the perfusion and culture system shown in FIG. 1 using 0 ml as the perfusate. 100 units / perfusion
A solution to which 100 ml of penicillin and 100 μg / ml of streptomycin was added was used. Perfusion rate 200ml
/ Min. The functional evaluation of the module was performed by a load test in which 1 mM ammonia, 6.25 mg / ml galactose, and 10 μg / ml lidocaine were added to the perfusate. Sampling of the culture solution over time,
Ammonia, galactose, lidocaine, and monoethylglycine xylidide (MEGX), a metabolite of lidocaine, in the perfusate were quantified.
【００４２】図２に灌流液中のリドカイン及びアンモニ
アの度変化を示す。２４時間にわたる灌流培養期間中に
３時間毎にアンモニアの負荷を行ったが、いずれも負荷
後２時間目までにアンモニア濃度は低値になった。ま
た、肝臓の解毒能の指標となるガラクトースの除去、リ
ドカインからのＭＥＧＸへの代謝を調べたが、同じくこ
れらの機能も良く維持されていた。FIG. 2 shows the changes in the concentrations of lidocaine and ammonia in the perfusate. Ammonia loading was performed every 3 hours during the 24 hour perfusion culture period, but the ammonia concentration was low by 2 hours after loading. In addition, the removal of galactose, which is an indicator of the detoxification ability of the liver, and the metabolism of lidocaine into MEGX were examined, and these functions were also well maintained.
【００４３】２４時間の灌流培養後、中空糸モジュール
の一端から注射器を用いて培養液を注入することによっ
て、中空糸内の肝細胞をシャーレへ押し出した。この押
し出された肝細胞は直径１００μｍの細胞凝集体を形成
していた。この細胞の生存をトリパンブルー染色によっ
て調べたところ、染色された細胞（死細胞である）が細
胞凝集体の周囲に僅かに存在したが、大部分の細胞はト
リパンブルーに染色されず、２４時間灌流後も肝細胞が
生きていたことを示した。After the perfusion culture for 24 hours, hepatocytes in the hollow fiber were extruded into a petri dish by injecting the culture solution from one end of the hollow fiber module using a syringe. The extruded hepatocytes formed a cell aggregate having a diameter of 100 μm. When the survival of the cells was examined by trypan blue staining, the stained cells (dead cells) were slightly present around the cell aggregates, but most of the cells were not stained with trypan blue and were not stained for 24 hours. This indicated that the hepatocytes were still alive after perfusion.
【００４４】[0044]
【発明の効果】本発明によれば、面倒で費用のかかる動
物実験を実施することなく、化学物質や薬剤等の被験物
質の評価試験を細胞によって、容易に且つ正確に再現性
良く、しかも安価に行うことができる。具体的には、本
発明の評価試験によれば、第１に肝細胞による代謝を正
確に、且つ代謝産物等（薬物単独による影響以外の）、
他の影響を除いて評価できる。第２に、肝細胞による薬
物代謝やその代謝速度を経時的に測定することができ
る。第３に、肝細胞の生存率、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙを高
め、細胞の機能や活性を長期間維持できるので、従来の
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは困難であった長期の評価試験が可
能となる。第４に、生体に近い擬似モデルを使用するこ
とによって、より生体の（代謝）メカニズムを再現した
試験評価が可能となり、生体をシミュレートした試験評
価ができる。According to the present invention, an evaluation test of a test substance such as a chemical substance or a drug can be easily and accurately performed with good reproducibility by a cell without performing a troublesome and costly animal experiment. Can be done. Specifically, according to the evaluation test of the present invention, firstly, metabolism by hepatocytes is accurately performed, and metabolites and the like (other than the effects of the drug alone)
Can be evaluated excluding other effects. Second, the metabolism of drugs by hepatocytes and the metabolic rate thereof can be measured over time. Third, since the survival rate and viability of hepatocytes can be increased and the function and activity of the cells can be maintained for a long period of time, long-term evaluation tests, which were difficult with conventional in vitro, can be performed. Fourth, by using a pseudo model close to a living body, it is possible to perform test evaluation that reproduces the (metabolism) mechanism of the living body more, and it is possible to perform test evaluation that simulates a living body.
【００４５】また、上記評価方法のための装置・手段
（測定キット等の）が市販品として提供できれば、細胞
による毒性試験を行っている場合でも、細胞培養の手間
や被験物質の経時的な負荷が省け、コストダウンでき
る。If a device / means (such as a measurement kit) for the above-described evaluation method can be provided as a commercial product, the time required for cell culture and the load with time of the test substance can be increased even when a toxicity test using cells is performed. Can be omitted and costs can be reduced.
【図１】本発明のオンライン分析の可能な評価試験装置
の１実施態様を示す概略図。FIG. 1 is a schematic diagram showing one embodiment of an evaluation test apparatus capable of online analysis according to the present invention.
【図２】本発明の評価試験装置を使用して、肝細胞の各
種被験物質の経時的代謝能を示すグラフ。FIG. 2 is a graph showing the time-dependent metabolic ability of various test substances in hepatocytes using the evaluation test apparatus of the present invention.
１．肝細胞による試験評価装置 ２．薬物注入ポンプ ３．貯液槽 ４．液体ポンプ ５．酸素付加器 ６．中空糸モジュール ７．サンプリングポンプ ８．流路調節器 ９．灌流路 １０．液体クロマトグラフィー １１．コンピューター １２．スターラー（攪拌装置） １３．スターラーチップ（攪拌子） １４．三方コック 1. Test evaluation device using hepatocytes 2. Drug infusion pump 3. Liquid storage tank 4. Liquid pump 5. Oxygenator 6. Hollow fiber module 7. Sampling pump 8. 8. Flow path regulator Perfusion channel 10. Liquid chromatography 11. Computer 12. 12. Stirrer (stirring device) Stirrer chip (stirrer) 14. Three-way cock
Claims (9)
ルを有する装置であって、中空糸内腔に肝細胞或いは株
化肝細胞を内蔵しており、中空糸の外側に被験物質を混
入した灌流液を灌流し、前記細胞による被験物質の代謝
や前記細胞に与える被験物質の影響を調べることを特徴
とする細胞による評価試験装置。An apparatus having a hollow fiber module filled with a porous hollow fiber, wherein a hepatocyte or an established hepatocyte is incorporated in the hollow fiber lumen, and a test substance is mixed outside the hollow fiber. An evaluation test device using cells, wherein the perfused solution is perfused to examine the metabolism of the test substance by the cells and the effect of the test substance on the cells.
細胞毒性、変異原性、発癌性のいずれか、或いは上記の
組合せによる試験を行う請求項１記載の評価試験装置。2. The effect of a test substance on the cells,
The evaluation test device according to claim 1, wherein the test is performed by any of cytotoxicity, mutagenicity, carcinogenicity, or a combination thereof.
灌流液の流量を制御する流量制御手段、流路調節手段を
有しており、これらの各手段や前記中空糸モジュールが
灌流路で連絡されている請求項１または２のいずれかの
項に記載の評価試験装置。3. An evaluation test apparatus comprising: a test substance injection means;
3. The apparatus according to claim 1, further comprising a flow control unit configured to control a flow rate of the perfusate, and a flow path adjustment unit, wherein each of these units and the hollow fiber module are connected by a perfusion flow path. 4. Evaluation test equipment.
被験物質分析手段を有しており、灌流液を灌流しなが
ら、被験物質濃度またその代謝産物濃度の経時的な測定
を行う請求項１〜３のいずれかの項に記載の評価試験装
置。4. The evaluation test device, comprising:
The evaluation test device according to any one of claims 1 to 3, further comprising a test substance analysis means, wherein the concentration of the test substance or the metabolite thereof is measured over time while perfusing the perfusate.
注入することで、モジュール内における被験物質の濃度
を実質的に一定にするものである請求項３または４のい
ずれかの項に記載の評価試験装置。5. The method according to claim 3, wherein the concentration of the test substance in the module is made substantially constant by injecting the drug at a constant flow rate by the test substance injection means. Evaluation test equipment.
株化肝細胞が５０００万〜２００億個である請求項１〜
５のいずれかの項に記載の評価試験装置。6. The method according to claim 1, wherein the number of hepatocytes or hepatocytes established in the module is 50 to 20 billion.
5. The evaluation test device according to any one of items 5.
胞とそれ以外の生体肝臓内に存在する細胞とを含む混合
のものである請求項１〜６のいずれかの項に記載の評価
試験装置。7. The evaluation test according to claim 1, wherein the cells contained in the module are a mixture of hepatocytes and cells other than those present in the living liver. apparatus.
る請求項１〜７のいずれかの項に記載の評価試験装置。8. The evaluation test apparatus according to claim 1, wherein the hollow fiber has a pore size of 1 nm to 10 μm.
的とする被験物質との代謝との比較によって、被験物質
の代謝性を評価するものである請求項１〜８のいずれか
の項に記載の評価試験装置。9. The evaluation test device according to claim 1, wherein the metabolism of the test substance is evaluated by comparing the metabolism of the standard substance with the metabolism of the target test substance. An evaluation test apparatus according to item 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10366488A JP2000189189A (en) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Method and apparatus for evaluation test using cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10366488A JP2000189189A (en) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Method and apparatus for evaluation test using cell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000189189A true JP2000189189A (en) | 2000-07-11 |
Family
ID=18486911
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10366488A Pending JP2000189189A (en) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Method and apparatus for evaluation test using cell |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000189189A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009505662A (en) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ヘパホープ インコーポレイテッド | Chemotherapy sensitivity tester |
| CN104212713A (en) * | 2014-09-25 | 2014-12-17 | 北京伟恩斯技术有限公司 | Multifunctional plasma mutation apparatus |
| JPWO2017119512A1 (en) * | 2016-01-08 | 2018-11-15 | Cynity株式会社 | Method for producing hepatic stem / progenitor cells from mature hepatocytes by low molecular weight compounds |
-
1998
- 1998-12-24 JP JP10366488A patent/JP2000189189A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009505662A (en) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ヘパホープ インコーポレイテッド | Chemotherapy sensitivity tester |
| CN104212713A (en) * | 2014-09-25 | 2014-12-17 | 北京伟恩斯技术有限公司 | Multifunctional plasma mutation apparatus |
| JPWO2017119512A1 (en) * | 2016-01-08 | 2018-11-15 | Cynity株式会社 | Method for producing hepatic stem / progenitor cells from mature hepatocytes by low molecular weight compounds |
| JP7063624B2 (en) | 2016-01-08 | 2022-05-09 | エヴィア ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド | Method for producing liver stem / progenitor cells from mature hepatocytes using small molecule compounds |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chou et al. | On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology | |
| Pavlacky et al. | Technical feasibility and physiological relevance of hypoxic cell culture models | |
| Zeilinger et al. | Scaling down of a clinical three-dimensional perfusion multicompartment hollow fiber liver bioreactor developed for extracorporeal liver support to an analytical scale device useful for hepatic pharmacological in vitro studies | |
| Norrby | In vivo models of angiogenesis | |
| Freyer et al. | Selective dissociation and characterization of cells from different regions of multicell tumor spheroids | |
| EP0665713B1 (en) | Organ perfusion device | |
| Casciari et al. | Growth and chemotherapeutic response of cells in a hollow-fiber in vitro solid tumor model | |
| Williams et al. | Reduction of diffusion barriers in isolated rat islets improves survival, but not insulin secretion or transplantation outcome | |
| US4530907A (en) | Perfusion-cultivation of animal cells and equipment therefor | |
| US20140099717A1 (en) | Enhanced oxygen cell culture platforms | |
| US9243221B2 (en) | Compositions and methods of functionally enhanced in vitro cell culture system | |
| CN108779440A (en) | Improved adult liver progenitor prepared product | |
| US20210341462A1 (en) | Artificial human pulmonary airway and methods of preparation | |
| WO2003105663A2 (en) | Liver assist system based on hollow fiber cartridges or rotating bioreactor | |
| US20090023127A1 (en) | Tissue system and methods of use | |
| Liu et al. | Design and Fabrication of a Liver-on-a-chip Reconstructing Tissue-tissue Interfaces | |
| Mahfouzi et al. | Noninvasive real-time assessment of cell viability in a three-dimensional tissue | |
| Quistorff et al. | Preparation of isolated rat liver hepatocytes | |
| Poyck et al. | In vitro comparison of two bioartificial liver support systems: MELS CellModule and AMC-BAL | |
| US20180291325A1 (en) | In vitro pharmacokinetic-pharmacodynamic device | |
| JP2000189189A (en) | Method and apparatus for evaluation test using cell | |
| Rich | Potency, proliferation and engraftment potential of stem cell therapeutics: The relationship between potency and clinical outcome for hematopoietic stem cell products | |
| Hochleitner et al. | A novel bioartificial liver with culture of porcine hepatocyte aggregates under simulated microgravity | |
| Goines et al. | A xenograft model for venous malformation | |
| Chou et al. | Human bone marrow disorders recapitulated in vitro using organ chip technology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051206 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080804 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20081217 |