JP2000050873A

JP2000050873A - ペチュニアの転写因子ＰｅｔＳＰＬ２の遺伝子の導入によって花序の節間を短縮させる方法

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Publication number: JP2000050873A
Application number: JP10224852A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Takatsuji; 博志高辻; Hitoshi Nakagawa; 仁中川
Original assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES
Current assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2000-02-22
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: CN1154728C; CA2244234A1; KR20000015750A; CA2363505A1; USRE39685E1; JP3357907B2; CN1244585A; US6215043B1; KR100360305B1; AU716115B1; EP0979873A1

Abstract

(57)【要約】【課題】植物の形質、特に植物の高さおよび節間の長さ
を変化させ得る転写因子をコードする遺伝子、当該遺伝
子の導入により植物の形質が変化した植物を作出する方
法、および当該方法により作出された植物を提供する。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む遺
伝子：（ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
位から第８０７位までの塩基配列を有するDNA；または
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードする遺伝子およびその利用に
関する。本発明は、特に、ペチュニア由来の新規遺伝子
であるPetSPL2遺伝子、およびその関連遺伝子、ならび
にそれらの利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の形質、例えば、花の形態形成の制
御機構を解明するため、シロイヌナズナ(Arabidopsis t
haliana)、キンギョソウ(Antirrhinum majus)、および
ペチュニア(Petunia hybrida)などを用いて、分子生物
学的および分子遺伝学的に研究が行われている。特に、
ペチュニアは、研究材料として好んで使用されている。
その理由として、ペチュニアは、園芸植物として価値が
高く多種多様な品種が存在すること、形質転換し易いこ
と、花が大きくて見やすいこと、および遺伝学的な知見
の蓄積が豊富であることが挙げられる（高辻博志、「植
物の形を決める分子機構」、細胞工学、植物細胞工学シ
リーズ（秀潤社）、96〜106頁）。

【０００３】上記の植物の花の器官が変化した突然変異
体から、その変異の原因となる遺伝子が単離されてい
る。その結果、花の分化および形態形成の制御には、転
写因子が重要な役割を果たしていることが明らかになっ
てきた。例えば、シロイヌナズナのSUPERMANは、DNA結
合ドメインとしてジンクフィンガーモチーフを有する転
写因子である。その遺伝子に変異が生じているSUPERMAN
変異体では、雄しべの数が著しく増加し、雌しべが退化
することが知られている(遺伝、1997年４月号(51巻４
号）、34〜38頁)。

【０００４】植物の形質の制御に関与する新規な転写因
子を同定することは、その制御の機構を理解するために
重要である。遺伝子工学的手法を用いれば、花の形態形
成などを制御する転写因子の遺伝子を植物に導入するこ
とができる。遺伝子導入により、従来の交配による手法
では得られないか、または得ることが困難である新規な
形質を花を有する植物に付与できる可能性がある。この
ような新規な形質を有する植物は、園芸上の価値が高い
と考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題の
解決を意図するものである。本発明の目的は、植物の形
質、特に植物の高さおよび節間の長さを変化させ得る転
写因子をコードする遺伝子を提供することにある。本発
明の他の目的は、遺伝子の導入により植物の形質が変化
した植物を作出する方法を提供することにある。本発明
のさらなる目的は、植物の形質が変化した植物を提供す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の（ａ）
または（ｂ）のDNAを含む遺伝子に関する：（ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
位から第８０７位までの塩基配列を有するDNA；または
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。

【０００７】本発明はまた、以下の（i）または（ii）
の転写因子をコードする遺伝子に関する：（i）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２０６位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
または（ii）アミノ酸配列（i）において、１またはそ
れ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因
子。

【０００８】１つの実施態様においては、上記の植物の
形質は、植物の高さおよび節間の長さからなる群より選
択される。

【０００９】本発明はさらに、上記の遺伝子のいずれか
を植物細胞に導入する工程、およびこの遺伝子が導入さ
れた植物細胞を植物体に再生する工程を含む、植物の形
質が変化した植物を作出する方法に関する。

【００１０】１つの実施態様においては、上記の植物は
双子葉植物である。好ましくは、双子葉植物はナス科植
物であり、より好ましくは、ペチュニア属植物である。

【００１１】１つの実施態様においては、上記の遺伝子
は植物発現ベクターに組み込まれている。

【００１２】本発明はさらに、上記の方法のいずれか１
つに記載の方法により作出された、植物の形質が変化し
た植物に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。

【００１４】「転写因子」は、遺伝子の調節領域のDNA
に結合してmRNAの合成を制御するタンパク質をいう。あ
る種の転写因子は、そのDNA結合ドメインにジンクフィ
ンガーモチーフと呼ばれる保存性の高いアミノ酸配列を
有することが知られている。

【００１５】本発明の遺伝子は、植物の形質を変化させ
得る転写因子をコードする遺伝子である。この遺伝子
は、以下のDNAのいずれかを含み得る：（ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
位から第８０７位までの塩基配列を有するDNA；および
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。

【００１６】好ましくは、本発明の遺伝子は（ａ）のDN
Aを含み得る。

【００１７】本発明の遺伝子はまた、以下の転写因子の
いずれかをコードし得る：（i）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２０６位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
および（ii）アミノ酸配列（i）において、１またはそ
れ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因
子。

【００１８】好ましくは、上記の遺伝子は（i）の転写
因子をコードし得る。

【００１９】本発明において特に好ましい遺伝子は、Pe
tSPL2遺伝子である。この遺伝子のcDNA配列（配列番号
１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を図１に示
す。

【００２０】「植物の形質」の変化とは、植物の形態の
少なくとも１つについての任意の変化をいう。植物の形
態は、好ましくは植物の高さおよび節間の長さの少なく
とも一方であるが、これらに限定はされない。この変化
は、本発明の遺伝子を導入して得られた植物の形質を、
遺伝子導入前の植物（野生種または園芸品種）の形質と
比較することにより評価される。

【００２１】変化した植物の高さとしては、矮性および
半矮性などが挙げられるが、これらに限定はされない。
矮性は、好ましくは、遺伝子導入前の植物の標準的な高
さの約1/2以下、より好ましくは約1/3以下の高さをい
う。

【００２２】変化した節間の長さとしては、節間の短縮
が挙げられるが、これに限定はされない。節間の短縮に
は、生殖枝の節間（すなわち花序）および栄養枝の節間
（すなわち葉序）のいずれの短縮も含まれる。花序の短
縮は、特に好ましい変化の例である。節間の長さの変化
は、好ましくは、遺伝子導入前の植物の標準的な節間と
比較して約1/2以下、より好ましくは約1/5以下、さらに
より好ましくは約1/10以下の短縮である。

【００２３】変化した植物の形質は、より好ましくは矮
性と節間の短縮との組合せであり、さらに好ましくは矮
性と花序の短縮との組合せである。

【００２４】本発明の遺伝子は、例えば、公知の転写因
子の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の保存領域
に対応するデジェネレートプライマー対を用いて、植物
のゲノミックDNAを鋳型としてPCRを行い、その後、得ら
れた増幅DNA断片をプローブとして用いて同じ植物のゲ
ノミックライブラリーをスクリーニングすることにより
単離され得る。そのようなプライマー対の例として、5'
-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3'（配列番号３）または5'-YTNGG
NGGNCAYATGAAY-3'（配列番号４）と5'-ARNCKNARYTCNARR
TC-3'（配列番号５）との組合せが挙げられる。ここ
で、Nはイノシンであり、RはGまたはAであり、YはCまた
はTであり、そしてKはTまたはGである。

【００２５】PCRは、市販のキットおよび装置の製造者
の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い得
る。遺伝子ライブラリーの作製法、プローブとのハイブ
リダイゼーションに使用するストリンジェントな条件、
および遺伝子のクローニング法も当業者に周知である。
例えば、マニアティスらのMolecular Cloning, A Labor
atory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laborator
y Press, Cold SpringHarbor, New York（1989）を参照
のこと。

【００２６】得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で
公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自
動シーケンサーにより決定し得る。

【００２７】本発明の遺伝子は、天然から単離されたも
のに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合
成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のようにして配列
決定された遺伝子を、当業者に周知の手法によって改変
することにより入手し得る。

【００２８】本発明の遺伝子は、当業者に周知の方法を
用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺
伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入
された遺伝子は、植物細胞中のDNAに組み込まれて存在
する。なお、植物細胞中のDNAとは、染色体のみなら
ず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミ
トコンドリア、葉緑体など）に含まれるDNAを含む。

【００２９】「植物」は、単子葉植物および双子葉植物
のいずれも含む。好ましい植物は、双子葉植物である。
双子葉植物は、離弁花亜綱および合弁花亜綱のいずれも
含む。好ましい亜綱は、合弁花亜綱である。合弁花亜綱
は、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバ
コ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツム
シソウ目、およびキク目のいずれも含む。好ましい目
は、ナス目である。ナス目は、ナス科、ハゼリソウ科、
ハナシノブ科、ネナシカズラ科、およびヒルガオ科のい
ずれも含む。好ましい科は、ナス科である。ナス科は、
ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、タバコ属、ナス
属、トマト属、トウガラシ属、ホオズキ属、およびクコ
属などを含む。好ましい属は、ペチュニア属、チョウセ
ンアサガオ属、およびタバコ属であり、より好ましく
は、ペチュニア属である。ペチュニア属は、P.hybrida
種、P.axillaris種、P.inflata種、およびP.violacea種
などを含む。好ましい種は、P.hybrida種である。「植
物」は、特に他で示さない限り、花および/または果実
を有する植物体および植物体から得られる種子を意味す
る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物
器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられ
る。

【００３０】「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子
の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメ
ントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されて
いる核酸配列をいう。好適には、植物遺伝子プロモータ
ー、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およびエンハン
サーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用され
る調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得
ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる
植物発現ベクターは、さらにT-DNA領域を有し得る。T-D
NA領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質
転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。

【００３１】「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発
現するプロモーターを意味する。構成的プロモーター、
および花を含む植物体の一部において選択的に発現する
プロモーターが好ましい。プロモーターの例としては、
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモータ
ー、およびノパリン合成酵素のプロモーターが挙げられ
るが、これらに限定されない。

【００３２】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、DNAがmRNAに転写
される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与
する配列である。ターミネーターは、mRNAの安定性に寄
与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知ら
れている。ターミネーターの例としては、CaMV35Sター
ミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネ
ーター（Tnos）が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００３３】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼII（NPTII)遺伝子、およびハイグロマイシ
ン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォト
ランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、
これらに限定されない。

【００３４】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエン
ハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植
物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。

【００３５】本発明における植物発現ベクターは、当業
者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植
物発現ベクターの構築には、例えば、pBI系のベクター
またはpUC系のベクターが好適に用いられるが、これら
に限定されない。

【００３６】植物細胞への植物発現ベクターの導入に
は、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウム
を介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いら
れ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例
えば、Nagelらの方法(Microbiol. Lett., 67, 325(199
0))が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベク
ターで（例えば、エレクトロポレーションによって）ア
グロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換され
たアグロバクテリウムをリーフディスク法等の周知の方
法により植物細胞に導入する方法である。植物発現ベク
ターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポ
レーション法、パーティクルガン、リン酸カルシウム
法、およびポリエチレングリコール法などがある。これ
らの方法は、当該分野において周知であり、形質転換す
る植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得
る。

【００３７】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。

【００３８】再生した植物体においては、当業者に周知
の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確
認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析
を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全RNAを
抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメン
ブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の
一部分と相補的な標識したRNAプローブをハイブリダイ
ズさせることにより、本発明の遺伝子のmRNAを検出し得
る。

【００３９】本発明の植物は、上記の手法によって作出
された、植物の形質が変化した形質転換植物である。変
化した植物の形質（すなわち、植物の高さおよび/また
は節間の長さ）は、公知の野生種または園芸品種には存
在しない形質であることが好ましい。また、変化した植
物の形質は、園芸上価値の高い形質であることが好まし
い。さらに、変化した植物の形質は、得られた植物の子
孫にわたって、安定に保持されることが好ましい。

【００４０】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説
明する。この実施例で使用した制限酵素、プラスミドな
どは、商業的な供給源から入手可能である。

【００４１】（実施例１：PetSPL2遺伝子の単離）シロ
イヌナズナのSUPERMAN遺伝子にコードされるタンパク質
と、大豆の根粒に特異的に発現するGmN479遺伝子（河内
ら、私信）にコードされるタンパク質とを比較した。両
タンパク質に共通に存在するアミノ酸配列に基づいてPC
Rに用いるデジェネレート・プライマーを３種類作成し
た。遺伝子の５’側から３’側に向かう二つのプライマ
ーの塩基配列は、それぞれ5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3'
（プライマー１、アミノ酸配列QALGGHに対応する；配列
番号３）および5'-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3'（プライマー
２、アミノ酸配列LGGHMNに対応する；配列番号４）であ
り、３’側から５’側に向かうプライマーの塩基配列は
5'-ARNCKNARYTCNARRTC-3'（プライマー３、アミノ酸配
列DLELRLに対応する；配列番号５）である。ここで、N
はイノシンであり、YはCまたはTであり、RはGまたはAで
あり、そしてKはTまたはGである。

【００４２】Boutry,M. and Chua N.H.(1985) EMBO J.
4,2159-2165に記載の方法に従って抽出したペチュニア
（Petunia hybrida var.Mitchell）のゲノミックDNAを
鋳型とし、プライマー１およびプライマー３を用いて、
94℃／10分の後、94℃／30秒、50℃／30秒、72℃／60秒
を30サイクルした後、72℃／７分の条件で第一のPCRを
行った。さらに第一のPCR産物の一部を鋳型にし、プラ
イマー２およびプライマー３を用いて第２のPCRを行っ
た（反応条件は第一のPCRと同じ）。増幅されたDNA断片
をTAクローニングベクター（Invitrogen製）に挿入し、
常法に従って大腸菌に導入した。形質転換された大腸菌
からプラスミドを抽出し、DNA塩基配列を決定した。そ
の結果、得られたDNA断片においては、SUPERMANおよびG
mN479に共通に含まれるジンクフィンガーモチーフの一
部がコードされていることがわかった。このDNA断片が
由来した遺伝子を、PetSPL2遺伝子と名付けた。なお、
この実験において、PetSPL2と類似の塩基配列を含む３
つの他のDNA（PetSPL1、3および4遺伝子）の存在が示さ
れた。PetSPL3遺伝子については、同一出願人による特
願平10-65921を参照。

【００４３】PetSPL2遺伝子のcDNAをクローニングする
ために、上記のDNA断片およびGENETRAP cDNA selection
kit(BRL社製）を用いて、pSPORTプラスミドベクター(B
RL社製）中に作製されたペチュニア（Petunia hybrida
var.Mitchell）の花のつぼみのcDNAライブラリー（BRL
社製キットによる）をスクリーニングし、数個のクロー
ンを得た。このようにして、ペチュニア由来のPetSPL2
遺伝子のcDNAを単離した。

【００４４】（実施例２：PetSPL2遺伝子の塩基配列お
よびアミノ酸配列の解析）実施例１で得られたクローン
のうち最長のクローンに含まれる約1.0kbのPetSPL2遺伝
子cDNA断片のDNA塩基配列を決定した（配列番号１）。
得られたDNA塩基配列に含まれるオープンリーディング
フレームから、タンパク質アミノ酸配列を推定した（配
列番号２）。

【００４５】塩基配列の解析により、PetSPL2遺伝子
は、SUPERMAN遺伝子、PetSPL1遺伝子、およびPetSPL4遺
伝子に対して、それぞれ、58％、67％、および51％の塩
基配列相同性を示した。PetSPL2遺伝子とPetSPL3遺伝子
とは、25％の塩基配列相同性を示した。なお、塩基配列
の解析は、各遺伝子のコード領域のみで行った。

【００４６】アミノ酸配列解析の結果、PetSPL2は、SUP
ERMANと類似のTFIIIAタイプのジンクフィンガーモチー
フを１個含んでいた。このことから、PetSPL2は転写因
子であることが推定された。PetSPL2は、SUPERMANおよ
びPetSPL3に対して、全アミノ酸配列レベルで、それぞ
れ37％および23％の相同性を示した。

【００４７】表１は、SUPERMANおよび各PetSPLのジンク
フインガーモチーフにおけるアミノ酸配列を比較する。
ジンクフィンガーモチーフにおける、PetSPL2のSUPERMA
Nに対するアミノ酸配列相同性（約100％）は、PetSPL1
のSUPERMANに対する対応する相同性（約100％）と同じ
であり、PetSPL3のSUPERMANに対する対応する相同性
（約76％）と比較して高いことが示された（ここで、ジ
ンクフィンガーモチーフを表１の４番目のＣから24番目
のＨまでとして、アミノ酸配列相同性を計算した）。表
１はまた、SUPERMANおよび各PetSPLのＣ末端疎水性領域
の比較を示す。

【００４８】

【表１】上記の結果から、PetSPL2は、PetSPL3とは別のクラスに
属し、よりSUPERMANに類縁性の高い新規な転写因子であ
ることが推定される。

【００４９】（実施例３：PetSPL2をコードするポリヌ
クレオチドを含む植物発現ベクターの構築）プラスミド
pBI221（Clontechから購入）中のCaMV 35Sプロモーター
を含むDNA断片（HindIII-XbaI断片）およびNOSターミネ
ーターを含むDNA断片（SacI-EcoRI断片）を順次プラス
ミドpUCAP（van Engelen,F.A.ら、Transgenic Res.4:28
8-290(1995）)のマルチクローニングサイトに挿入し、p
UCAP35Sを作製した。一方、PetSPL2を含むpSPORT/PetSP
L2プラスミドをKpnIサイトおよびSacIサイト（ベクター
中のサイト）で切断し、pUCAP35SのKpnIおよびSacIサイ
トの間に挿入した。さらにこの組換えプラスミドをAscI
およびPacIで切断し、PetSPL2をコードするDNA断片を、
バイナリーベクターpBINPLUS（van Engelen,F.A.ら、(1
995）,前出)のAscIおよびPacIサイトに導入した。

【００５０】構築されたPetSPL2遺伝子高発現ベクター
(pBIN-35S-PetSPL2)は、図２に示されるように、CaMV 3
5Sプロモーター領域(P35S；0.9kb）、本発明のPetSPL2
をコードするポリヌクレオチド（PetSPL2；1.0kb）、お
よびノパリン合成酵素のターミネーター領域（Tnos；0.
3kb）を含んで構成されている。図２のPnosは、ノパリ
ン合成酵素のプロモーター領域、NPTIIはネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼII遺伝子を示す。LBおよびRB
は、それぞれT-DNA left borderおよびT-DNA right bor
derを示す。

【００５１】（実施例４：PetSPL2遺伝子のペチュニア
細胞への導入）（１）（アグロバクテリウム・チュメファシエンスの形
質転換）アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404株（C
lontechから購入）を250μg/mlのストレプトマイシンと
50μg/mlのリファンピシンを含むＬ培地中、28℃で培養
した。Nagelら（1990）（前出）の方法に従って、この
菌株の細胞懸濁液を調製した。実施例３で構築したPetS
PL2遺伝子高発現ベクターを、エレクトロポレーション
により、上記菌株に導入した。

【００５２】（２）（PetSPL2をコードするポリヌクレ
オチドのペチュニア細胞への導入）上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスLBA4404株を、YEB培地（D.M.Glover編、DNA Cl
oning,IPL PRESS,第２巻、78頁)で振とう培養（28℃，2
00rpm）した後、滅菌水で20倍に希釈した。この希釈液
中で、ペチュニア（Petunia hybrida var.Mitchell）の
葉片と共存培養した。２〜３日後、カルベニシリンを含
む培地で上記細菌を除去し、その後、この葉片を２週間
ごとに選択培地で継代培養した。上記PetSPL2遺伝子と
共に導入されたpBINPLUS由未のNPTII遺伝子発現による
カナマイシン抵抗性を指標として、形質転換されたペチ
ュニア細胞を選抜した。常法により、形質転換細胞から
カルスを誘導した後、植物体に再分化した。

【００５３】（実施例５：PetSPL2形質転換植物におけ
るPetSPL2遺伝子の発現）実施例４で得られたPetSPL2形
質転換ペチュニア13個体の葉から、全RNAを抽出した。
抽出物10μgずつを変性アガロース電気泳動によって展
開し、常法に従ってGenescreen plusフィルター（Dupon
t製）にブロッティングした。DIG RNAラベリングキット
(Boeringer Mannheim製）を用いて標識したPetSPL2アン
チセンスRNAを用い、キットの指示に従ってハイブリダ
イゼーションおよびフィルターの洗浄を行った。洗浄
後、フィルターをXARフィルム（Kodak製）に常温で１時
間露光した。図３は、13個体からのPetSPL2遺伝子mRNA
を検出した変性アガロースゲル電気泳動像のフルオログ
ラムを示す。独立の形質転換ペチュニア13個体のうち、
４個体が高発現プロモーターによる制御によってPetSPL
2mRNAを高レベルに発現していることが示された。

【００５４】（実施例６：PetSPL2遺伝子を高レベルに
発現する形質転換ペチュニアの表現型）PetSPL2遺伝子
を高レベルに発現する４個体の独立の形質転換ペチュニ
アのうち、比較的発現レベルが低い１個体を除く３個体
において、以下のような共通した表現型が観察された。
植物体に見られる最も顕著な変化は、花序の節間の短縮
（節間伸長の抑制）およびそれに伴う矮化である（図
４、左はPetSPL2形質転換ペチュニア、右は野生型ペチ
ュニアを示す）。この変化は、栄養成長期よりも生殖成
長期（花序）においてより顕著に表れた。花序の節間の
長さは、野生型の十分の一以下になることが示された
（図５、左は野生型ペチュニアの節間、右はPetSPL2形
質転換ペチュニアの節間を示す）。その他、葉が丸みを
帯び、花が少し小さいなどの変化が見られた（図４）。

【００５５】花序の節間伸長の制御に関与する遺伝子と
してはシロイヌナズナのERECTA遺伝子が報告されている
（Toriiら、1996、Plant Cell，8:735）。しかし、EREC
TA遺伝子と本発明のPetSPL2遺伝子との間には、塩基配
列レベルでもアミノ酸配列レベルでも有意な相同性は認
められない。植物ホルモンの合成やその制御に関与する
遺伝子の中にも節間を短縮させる遺伝子（rolAなど）が
知られている。しかし、これらの植物ホルモン関連遺伝
子は、節間伸長の制御以外に多面的効果を示すことが知
られている（Dehioら、1993、Plant Mol.Bio.23:119
9）。

【００５６】上記の結果から、PetSPL2形質転換ペチュ
ニアは節間の短縮により矮性となる結果、野生型と比較
して花姿が大幅に変化することが示された。従って、Pe
tSPL2遺伝子の導入は、特に節間が伸長する傾向のある
花卉または園芸品種について有用であることが理解され
る。花姿の大幅な変化は、植物に新たな鑑賞価値をもた
らし得る。また、草丈の抑制は、植物に耐倒伏性を与え
る点で、大きな園芸上の価値を有し得る。さらに、PetS
PL2遺伝子を導入した果樹は、樹形がコンパクトになる
ことが期待される。これは、果実の収穫作業を効率化し
得る点で有意義である。

【００５７】

【発明の効果】本発明によれば、植物の形態を変化させ
得る転写因子をコードする遺伝子が提供される。この遺
伝子を利用することにより、植物の形質が変化した植物
を作出し得る。作出された植物には、野生種および園芸
品種には存在しないか極めてまれである形質が付与され
るため、園芸上有用である。

【００５８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】PetSPL2遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸
配列を示す。

【図２】PetSPL2遺伝子高発現ベクター(pBIN-35S-PetSP
L2)の概略を示す。

【図３】PetSPL2形質転換ペチュニアにおいてPetSPL2遺
伝子のmRNAを検出した変性アガロースゲル電気泳動像の
フルオログラムを示す。

【図４】（左）PetSPL2形質転換ペチュニアの植物体と
（右）野生型ペチュニアの植物体とを撮影した生物の形
態を示す写真を示す。

【図５】（左）野生型ペチュニアの節間と（右）PetSPL
2形質転換ペチュニアの節間を撮影した生物の形態を示
す写真を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１１年６月２５日（１９９９．６．２
５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項５】請求項１から４のいずれか１つに記載の
遺伝子を植物細胞に導入する工程、および該遺伝子が導
入された植物細胞を植物体に再生する工程を包含する、
植物の形質が変化した植物を作出する方法。

【請求項６】前記植物が双子葉植物である、請求項５
に記載の方法。

【請求項７】前記植物がナス科植物である、請求項６
に記載の方法。

【請求項８】前記植物がペチュニア属植物である、請
求項７に記載の方法。

【請求項９】前記遺伝子が植物発現ベクターに組み込
まれている、請求項５に記載の方法。

【請求項１０】請求項５から９のいずれか１つに記載
の方法により作出された、植物の形質が変化した植物。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Resoueces, Ministry of Agricu lture, Forestry and Fisheries <120> Method for Shorting Internode of Inflorescence by Introducing Gene for Petunia transcription factor PetSPL2 <130> J198412287 <140> JP <141> 1998-08-07 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 997 <212> DNA <213> Petunia hybrida var.Mitchell <220> <221> CDS <222> (190)..(807) <400> 1 cccagtgcca ttttttctct ctagtcaagc tctctatatc atcatcacta ttcccttggc 60 tgcagtaaca ctcctattta accctcacaa aaaaattacc agagggcagc aaaaaatgct 120 tgaacataat tattatactt actattaagc tagatttcct cttgatcttg ctaggtttga 180 ctggagaaa atg gca ggc atg gat aga aac agt ttc aac agt aag tac ttc 231 Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe 1 5 10 aaa aac aaa agc atc atg gca aga cag atg gag tac ttg aat aac aac 279 Lys Asn Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn 15 20 25 30 aat ggc gac aat aac aac aac aat aat gtt aca agc tca tta cga gat 327 Asn Gly Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp 35 40 45 aat tat gga aat gaa gat cat tta ctt ggt gga cta ttc tct tgg cct 375 Asn Tyr Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro 50 55 60 cca aga tct tat aca tgt agc ttt tgt aaa agg gaa ttt aga tct gct 423 Pro Arg Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala 65 70 75 caa gct ctt ggt gga cac atg aat gtt cat aga aga gat aga gcc att 471 Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile 80 85 90 ttg aga caa tca cca cct aga gat att aat agg tat tct ctt cta aac 519 Leu Arg Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn 95 100 105 110 ctt aat ctt gaa cca aac cct aac ttt tac cct agt cat aac cct agt 567 Leu Asn Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser 115 120 125 ttt tca aga aaa ttc cca cct ttt gaa atg agg aaa tta gga aaa gga 615 Phe Ser Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly 130 135 140 gtt gtt cca aac aat cac ttg aaa agt gcc aga ggg cgt ttt gga gtt 663 Val Val Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val 145 150 155 gag aaa att gac tct ttc atg caa gaa aaa gaa tgt act act aca gtg 711 Glu Lys Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val 160 165 170 atc aag aag tcc gag ttt cta aga ttg gac ttg gga att ggg ttg atc 759 Ile Lys Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile 175 180 185 190 agt gaa tca aag gaa gat tta gat ctt gaa ctt cga ctg gga tcc act 807 Ser Glu Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr 195 200 205 taactatatc taatttttac ggcattaagg tttgtaaatt gagtcgacag cttagtcaaa 867 actacttatg cactttaata tggcttcttg tgctatattt atttatttta catggctgta 927 tctaggtttg cattttaaga tttagtacct tgtcagatta aaagaaaacg aaagttaaat 987 taaaaaaaaa 997 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Petunia hybrida var.Mitchell <400> 2 Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe Lys Asn 1 5 10 15 Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn Asn Gly 20 25 30 Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp Asn Tyr 35 40 45 Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro Pro Arg 50 55 60 Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala Gln Ala 65 70 75 80 Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile Leu Arg 85 90 95 Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn Leu Asn 100 105 110 Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser Phe Ser 115 120 125 Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly Val Val 130 135 140 Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val Glu Lys 145 150 155 160 Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val Ile Lys 165 170 175 Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ser Glu 180 185 190 Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr 195 200 205 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <220> <221> modified base <222> (6) <223> i <220> <221> modified base <222> (9) <223> i <220> <221> modified base <222> (12) <223> i <220> 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Asp Asn Ser Ser Ser 10 15 20 gat gaa caa caa att tca att atc caa agc agc cat act act aaa tcc 209 Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser 25 30 35 40 tat gag tgc aac ttt tgt aaa aga ggt ttt tct aac gca caa gca ctt 257 Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu 45 50 55 ggt ggc cac atg aat atc cat cgt aag gac aag gcc aaa ctc aaa aaa 305 Gly Gly His Met Asn Ile His Arg Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys 60 65 70 caa aag cag cat caa cga caa caa aaa cct acc tcg gtt tcc aaa gaa 353 Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu 75 80 85 acc aac atg gct cac aat atc ttg cta gcg gat gat tct aac atc cct 401 Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro 90 95 100 acc aca atc ccc ttt ttt cct tct ctt aca tca cca aac aca tcc aac 449 Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn 105 110 115 120 cct tta ggg ttc gtg tct tct tgc act act gca gac acc gtc ggg caa 497 Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln 125 130 135 aga cag att caa gat cta aac tta gtc atg ggt tca act ctt aac gtt 545 Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val 140 145 150 ctc aga atg aat agt gtt gaa gcg ggt tct gtt gat tca cgt gaa aat 593 Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn 155 160 165 aga ttg ccg gct aga aat caa gaa act aca cca ttt tac gcg gaa ttg 641 Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu 170 175 180 gac ctt gag ctg cga tta ggt cat gag cct gca cct tcc acg gat ata 689 Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile 185 190 195 200 tca tca gct aat tcg ggt tta ggc aca aga aag ttc tta tgatttattg 738 Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly Thr Arg Lys Phe Leu 205 210 gtactattgc tgctaaatgc tttttctttt tactactgtt tagggttttt ttgtgactat 798 gatactactt ttgctacatc tgaattgtct tgaactcttt tattcagagt tcttggattt 858 tgctttgctt gttttaatct ggctctaga 887 <210> 7 <211> 213 <212> PRT <213> Petunia hybrida var.Mitchell <400> 7 Met Glu Thr Ser Lys Asn Gln Pro Ser Val Ser Glu Asn Val Asp Gln 1 5 10 15 Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile 20 25 30 Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg 35 40 45 Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Ile His Arg 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln 65 70 75 80 Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu 85 90 95 Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys 115 120 125 Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu 130 135 140 Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala 145 150 155 160 Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His 180 185 190 Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly 195 200 205 Thr Arg Lys Phe Leu 210

フロントページの続きＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD14 CA17 CA19 CB02 CD02 CD09 CD14 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA10 GA14 HA20 4B065 AA11X AA89X AA89Y AC10 BA03 CA24 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む
遺伝子：（ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
位から第８０７位までの塩基配列を有するDNA；または
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。
【請求項２】以下の（i）または（ii）の転写因子を
コードする遺伝子：（i）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２０６位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
または（ii）アミノ酸配列（i）において、１またはそ
れ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因
子。
【請求項３】前記植物の形質が、植物の高さおよび節
間の長さからなる群より選択される、請求項１または２
に記載の遺伝子。
【請求項４】請求項１から３のいずれか１つに記載の
遺伝子を植物細胞に導入する工程、および該遺伝子が導
入された植物細胞を植物体に再生する工程を包含する、
植物の形質が変化した植物を作出する方法。
【請求項５】前記植物が双子葉植物である、請求項４
に記載の方法。
【請求項６】前記植物がナス科植物である、請求項５
に記載の方法。
【請求項７】前記植物がペチュニア属植物である、請
求項６に記載の方法。
【請求項８】前記遺伝子が植物発現ベクターに組み込
まれている、請求項４に記載の方法。
【請求項９】請求項４から８のいずれか１つに記載の
方法により作出された、植物の形質が変化した植物。