ITTO20111076A1 - Procedimento per effettuare rapidamente lo screening di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica - Google Patents
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Description
“Procedimento per effettuare rapidamente lo screening di enzimi e miscele di enzimi per l’idrolisi di biomassa lignocellulosica†,
DESCRIZIONE SFONDO
Il test attuale per lo screening di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica à ̈ il test FPU in piccola scala. Tuttavia, il test FPU à ̈ limitato ad un prodotto simile alla cellulosa e fornisce un suggerimento globale limitato dell'applicabilità della miscela enzimatica ad un materiale lignocellulosico. Un test attuale per un materiale lignocellulosico reale à ̈ un test in reattore sotto agitazione in grande scala (3,5 l) che richiede quantità significative di enzima e tempo. Esiste quindi la necessità di un procedimento per valutare enzimi e miscele di enzimi in modo più rapido ed efficiente.
SOMMARIO
La presente descrizione descrive un procedimento per valutare la conversione per idrolisi di un enzima oppure di una miscela di enzimi rispetto ad una biomassa lignocellulosica specifica. Il procedimento descritto in questa descrizione comprende le fasi di: a) preparare una sospensione di biomassa lignocellulosica pretrattata, una soluzione tampone ed una soluzione di enzima oppure miscela di enzimi, b) disperdere una porzione della sospensione lignocellulosica pretrattata e della soluzione tampone in almeno due fiale di test di una pluralità di fiale di test, c) aggiungere una porzione della soluzione di enzima o miscela di enzimi all’almeno una fiala di test contenente la biomassa lignocellulosica pretrattata, lasciando almeno una fiala di test priva di soluzione di enzima o miscela di enzimi, d) disperdere la soluzione tampone in almeno una fiala di test che à ̈ priva e rimarrà priva di soluzione di enzima oppure miscela di enzimi e di sospensione di biomassa lignocellulosica, e) analizzare l’almeno una fiala di test che à ̈ priva di soluzione di enzima oppure miscela di enzimi, ma contiene biomassa lignocellulosica pretrattata e tampone per gli zuccheri solubili prima dell'incubazione delle fiale di test, f) incubare le fiale di test per un primo tempo ad una prima temperatura e analizzare almeno una delle fiale di test contenente la soluzione di enzima o miscela di enzimi per zuccheri solubili al primo tempo, g) incubare le fiale di test rimanenti per un secondo tempo e analizzare almeno una delle fiale di test rimanenti contenenti la soluzione di enzima o miscela di enzimi per gli zuccheri solubili, h) e incubare le fiale di test rimanenti ed analizzare almeno una fiala di test a ciascuno di diversi tempi di incubazione predeterminati, per gli zuccheri disciolti per determinare la velocità di reazione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Nella descrizione viene descritto un metodo per valutare la conversione per idrolisi di un enzima oppure una miscela di enzimi rispetto ad una biomassa lignocellulosica specifica. Il procedimento descritto à ̈ utile per la valutazione rapida ed efficiente di enzimi e miscele di enzimi per la conversione per idrolisi di una composizione rispetto ad una biomassa lignocellulosica specifica.
Il procedimento segue le fasi di: a) preparare una sospensione di biomassa lignocellulosica pretrattata, una soluzione tampone ed una soluzione di enzima o miscela di enzimi, b) disperdere una porzione della sospensione lignocellulosica pretrattata e della soluzione tampone in almeno due fiale di test di una pluralità di fiale di test, c) aggiungere una porzione della soluzione di enzima o miscela di enzimi ad almeno una fiala di test contenente la biomassa lignocellulosica pretrattata, lasciando almeno una fiala di test priva di soluzione di enzima o miscela di enzimi, d) disperdere la soluzione tampone in almeno una fiala di test che à ̈ priva e rimarrà priva della soluzione di enzimi o miscela di enzimi e della sospensione di biomassa lignocellulosica, e) analizzare l’almeno una fiala di test che à ̈ priva di soluzione di enzima o miscela di enzimi, ma contiene biomassa lignocellulosica pretrattata e tampone, per zuccheri solubili prima dell'incubazione delle fiale di test, f) incubare le fiale di test per un primo tempo ad una prima temperatura ed analizzare almeno una delle fiale di test contenente la soluzione di enzima o miscela di enzimi per gli zuccheri solubili al primo tempo, g) incubare le fiale di test rimanenti per un secondo tempo e analizzare almeno una delle fiale di test rimanenti contenenti la soluzione di enzima o miscela di enzimi per gli zuccheri solubili, h) e incubare le fiale di test rimanenti ed analizzare almeno una fiala di test a ciascuno di diversi tempi di incubazione predeterminati per gli zuccheri disciolti, per determinare la velocità di reazione.
Le fiale di test sono caratterizzate come qualsiasi fiala che sia in grado di contenere un liquido, come una provetta, una provetta Eppendorf oppure un pallone.
La preparazione della sospensione di biomassa lignocellulosica pretrattata può seguire le fasi delineate in WO-2010/113129.
La preparazione di un reagente può opzionalmente venire ottenuta preparando una soluzione di NaN32 N. La preparazione di una soluzione di NaN32 N può venire ottenuta disciogliendo 13,002 g di NaN3in acqua ultrapura fino a un volume finale di 100 ml.
La preparazione di un reagente può anche venire ottenuta preparando una soluzione di CaCl21 M. La preparazione di una soluzione di CaCl21 M può venire ottenuta disciogliendo 9,389 g di CaCl2in acqua ultrapura fino a un volume finale di 100 ml.
La preparazione di un reagente può anche venire ottenuta preparando una soluzione di ditiotreitolo (DTT) 1 M. La preparazione di una soluzione di DTT 1 M può venire ottenuta disciogliendo 69,41 g di ditiotreitolo in acqua distillata fino a un volume finale di 10 ml, preparando 0,5 ml di aliquote e conservandole a -20° C.
La preparazione della soluzione tampone può venire ottenuta preparando una soluzione di tampone citrato. Una soluzione di tampone citrato può venire preparata come soluzione base 1 N miscelando preferibilmente 210 g di acido citrico monoidrato con 750 ml di acqua ultrapura e aggiungendo fra 50 e 60 g di NaOH, la quantità di NaOH essendo determinata dalla quantità necessaria per ottenere un pH di 4,5. Una soluzione operativa 0,05 M viene quindi preparata miscelando 50 ml della soluzione base 1 N con 950 ml di acqua ultrapura e aggiungendo CaCl21 M (1 ml) e/oppure DTT 0,45 M (22 ml), a seconda delle caratteristiche dell’enzima, e regolando il pH al valore richiesto.
In ciascuna della pluralità di fiale di test à ̈ contenuta una sospensione lignocellulosica che può essere in forma di una soluzione di substrato. La preparazione di una soluzione di substrato può venire effettuata miscelando 2,200 g di materiale lignocellulosico pretrattato con 17,90 ml di acqua ultrapura, 70 Î1⁄4l di soluzione di NaN32 M e 1 ml di tampone citrato 1 N avente pH di 4,5. A seconda delle caratteristiche dell’enzima, la preparazione della soluzione di substrato può inoltre richiedere l'aggiunta di CaCl21 M (200 Î1⁄4l) e/oppure DTT 0,45 M (444 Î1⁄4l). La preparazione della soluzione di substrato richiede inoltre il mantenimento della sospensione di materiale in agitazione usando un agitatore magnetico. La preparazione della soluzione di substrato può inoltre richiedere la regolazione del pH al valore richiesto.
La preparazione della soluzione di enzima o miscela di enzimi viene effettuata secondo tecniche comuni di preparazione che dipendono dalla soluzione di enzima o miscela di enzimi. Tecniche comuni di preparazione sono note alle persone esperte nel settore.
Le fasi di aggiunta di una porzione della sospensione lignocellulosica pretrattata e/oppure della soluzione tampone, possono richiedere l'aggiunta dei componenti ad una fiala di test da 1,5 ml. La sospensione lignocellulosica pretrattata può venire aggiunta in forma di soluzione di substrato. La soluzione di substrato può venire aggiunta in quantità fino a 0,3 ml. La soluzione tampone può venire aggiunta in quantità che variano da 0,2 ml a 0,35 ml.
Quando lo scopo del procedimento consiste nello studiare le cinetiche della reazione della soluzione di enzima o miscela di enzimi, si preferisce preparare sei fiale di test per ciascuna soluzione di enzima o miscela di enzimi valutata. Quando lo scopo del procedimento consiste nel quantificare la resa finale della reazione enzimatica dopo un tempo fisso, si preferisce preparare tre fiale di test per ciascuna soluzione di enzima o miscela di enzimi valutata. In entrambi i casi, à ̈ necessario preparare due fiale di test addizionali contenenti sospensione lignocellulosica e/oppure soluzione tampone, ma non soluzione di enzima o miscela di enzimi. Prima di iniziare qualsiasi periodo di incubazione, la prima fiala di test addizionale deve venire analizzata secondo le procedure delineate di seguito per caratterizzare il campione scelto. Dopo un periodo di incubazione per un tempo di incubazione che à ̈ almeno lungo come il tempo di incubazione più lungo di una fiala di test contenente un enzima oppure una soluzione di enzima o una miscela di enzimi, la seconda fiala di test addizionale può venire analizzata secondo le procedure delineate di seguito per caratterizzare il campione scelto.
Dopo preparazione di ciascuna della pluralità di fiale di test con sospensione lignocellulosica e/oppure soluzione tampone, sono necessarie le procedure seguenti. Preferibilmente, la pluralità di provette viene posta in un termomiscelatore ad una temperatura scelta per adattarsi in modo ottimale all'enzima. Il termomiscelatore viene preferibilmente regolato a 900 giri/minuto. Preferibilmente, la temperatura delle fiale di test viene equilibrata nel termomiscelatore per almeno cinque minuti prima di aggiungere la soluzione di enzima o miscela di enzimi. La soluzione di enzima o miscela di enzimi può quindi venire aggiunta in quantità fino a 0,15 ml. Dopo aggiunta della soluzione di enzima o miscela di enzimi, à ̈ necessario incubare le fiale di test per un periodo di incubazione nel termomiscelatore ad una temperatura stabilita e un numero di giri/minuto stabilito. Preferibilmente, la temperatura stabilita durante il periodo di incubazione à ̈ almeno 50°C. Preferibilmente, il numero di giri/minuto stabilito durante il periodo di incubazione à ̈ almeno 900 giri/minuto.
Il periodo di incubazione può venire interrotto a tempi di incubazione differenti per ciascuna fiala di test, e i campioni analizzati per quantificare lo zucchero rilasciato. A scopo di esempio, ma non di limitazione, il tempo di incubazione per la prima fiala di test può essere almeno un'ora. A scopo di esempio, ma non di limitazione, il tempo di incubazione per la seconda fiala di test può essere almeno sei ore. A scopo di esempio, ma non di limitazione, il tempo di incubazione per la terza fiala di test può essere almeno ventidue ore. A scopo di esempio, ma non di limitazione, il tempo di incubazione per la quarta fiala di test può essere almeno ventinove ore. A scopo di esempio, ma non di limitazione, il tempo di incubazione per la quinta fiala di test può essere almeno quarantasei ore. A scopo di esempio, ma non di limitazione, il tempo di incubazione per la sesta fiala di test può essere almeno sessantasei ore.
Al termine del tempo di incubazione, la fiala di test scelta viene rimossa dal termomiscelatore, e incubata a 99°C per un tempo di sette minuti a 900 giri/minuto. La fiala di test scelta viene quindi trasferita ad un bagno di acqua ghiacciata per il raffreddamento per un tempo di almeno dieci minuti. Dopo il bagno di acqua ghiacciata, il campione scelto viene quindi centrifugato a 4°C a 12.000 giri/minuto per almeno quattro minuti. Dopo centrifugazione, la frazione liquida del campione scelto viene spostata ad una provetta per HPLC. In alcuni casi, la diluizione può essere utile per l'analisi.
Quando la frazione liquida del campione scelto viene spostata alla provetta per HPLC, essa può venire caratterizzata per il contenuto di zucchero e la composizione (per esempio monomeri ed oligosaccaridi) usando HPLC. Il procedimento di caratterizzazione della frazione liquida del campione scelto usando HPLC può venire eseguito dopo post-idrolisi al 4% di H2SO4a 121°C per un'ora. Preferibilmente, il procedimento di caratterizzazione della frazione liquida del campione scelto si verificherà prima e dopo esecuzione di post-idrolisi al 4% di H2SO4a 121°C per un'ora.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per valutare la conversione per idrolisi di un enzima o una miscela di enzimi rispetto ad una biomassa lignocellulosica specifica, il procedimento comprendendo le fasi di a. preparare una sospensione di biomassa lignocellulosica pretrattata, una soluzione tampone e una soluzione di enzima o miscela di enzimi, b. erogare una porzione della sospensione lignocellulosica pretrattata e della soluzione tampone in almeno due fiale di test di una pluralità di fiale di test, c. aggiungere una porzione della soluzione di enzima o miscela di enzimi ad almeno una fiala di test contenente la sospensione di biomassa lignocellulosica pretrattata, lasciando almeno una fiala di test priva di soluzione di enzima o miscela di enzimi, d. erogare la soluzione tampone in almeno una fiala di test che à ̈ priva e rimarrà priva della soluzione di enzima o miscela di enzimi e della sospensione di biomassa lignocellulosica pretrattata, e. analizzare l’almeno una fiala di test che à ̈ priva di soluzione di enzima o miscela di enzimi, ma contiene la sospensione di biomassa lignocellu losica pretrattata e soluzione tampone, per zuccheri solubili prima di incubare le fiale di test, f. incubare le fiale di test per un primo tempo ad una prima temperatura e analizzare almeno una delle fiale di test contenente la soluzione di enzima o miscela di enzimi, per zuccheri solubili al primo tempo, g. incubare le fiale di test rimanenti per un secondo tempo e analizzare almeno una delle fiale di test rimanenti contenenti la soluzione di enzima o miscela di enzimi, per zuccheri solubili, h. incubare le fiale di test rimanenti ed analizzare almeno una fiala di test a ciascuno di diversi tempi di incubazione predeterminati, per gli zuccheri disciolti per determinare la velocità di reazione.
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| KRISTENSEN JAN B ET AL: "Determining Yields in High Solids Enzymatic Hydrolysis of Biomass", APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 156, no. 1-3, May 2009 (2009-05-01), pages 557 - 562, XP002680129, ISSN: 0273-2289 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20140315230A1 (en) | 2014-10-23 |
| EP2783012A1 (en) | 2014-10-01 |
| BR112014012379A2 (pt) | 2017-05-30 |
| WO2013076698A1 (en) | 2013-05-30 |
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