ITRM950343A1 - Metodologia per riprodurre in vitro le attivita' di rna polimerasi rna-dipendente e di nucleotidiltransferasi terminale codificate dal - Google Patents
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Abstract
Si tratta di un metodo per la riproduzione in vitro dell'attività di RNA polimerasi RNA-dipendente associata con il virus dell'epatite C. Il metodo è caratterizzato dal fatto che sequenze contenute in NS5B sono usate nella miscela di reazione. Usando questo metodo è anche possibile riprodurre l'attività di nucleotidiltransferasi terminale, un'ulteriore proprietà della proteina NS5B. Il metodo sfrutta il fatto che la proteina NS5B, purificata ad omogeneità apparente oppure presente in estratti di organismi che la sovraproducono, può catalizzare l'aggiunta di ribonucleotidi ai terminali 3' di molecole di RNA esogene o endogene.L'invenzione si riferisce anche ad una composizione di materia che comprende sequenze contenute in NS5B, ed all'uso di queste composizioni per la messa a punto di un saggio enzimatico capace di selezionare, a fini terapeutici, composti inibitori dell'attività enzimatica associata a NS5B.In figura 1 vengono mostrati i plasmidi usati nel metodo per produrre, in cellule eucariotiche in cultura, RNA polimerasi RNA-dipendente e nucleotidiltransferasi terminale del virus dell'epatite C.
Description
"METODOLOGIA PER RIPRODURRE IN VITRO LE ATTIVITÀ' DI RNA POLIMERASI RNA-DIPENDENTE E DI NUCLEOTIDILTRANSFERASI TERMINALE CODIFICATE DAL VIRUS DELL EPATITE C (HCV) "
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce alla biologia molecolare ed alla virologia del virus dell'epatite C (HCV). Più in particolare, l'invenzione ha per oggetto le attività di RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) e di nucleotidiltransferasi terminale (TNTasi) prodotte da HCV, i metodi di espressione delle RdRp e TNTasi di HCV, i metodi per saggiare in vitro le attività di RdRp e TNTasi codificate da HCV al fine di identificare, per finalità terapeutiche, composti che inibiscono queste attività enzimatiche e pertanto protrebbero interferire con la replicazione del virus HCV.
Come è noto, il virus dell'epatite C {HCV) è il principale agente eziologico dell'epatite C (HCV) e il principale agente eziologico dell'epatite non-A, non-B (NANB). Si stima che HCV causi almeno il 90 % delle epatiti virali NANB post-trasfusionali e il 50 % delle epatiti NANB sporadiche. Sebbene ci siano stati notevoli progressi nella selezione di donatori di sangue e nella caratterizzazione immunologica di sangue per trasfusione, esiste tuttora una elevata incidenza di infezioni acute di HCV tra le persone che ricevono trasfusioni di sangue (un milione o più di persone ogni anno in tutto il mondo). Circa il 50% degli individui infettati da HCV sviluppano cirrosi epatica in un periodo che può variare da 5 a 40 anni. Inoltre, recenti studi clinici hanno suggerito che esiste una correlazione tra l'infezione cronica di HCV e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare.
HCV è un virus con membrana che contiene un genoma a RNA positivo di circa 9,4 kb. Questo virus è un membro della famiglia dei Flaviviridae, di cui i pestivirus ed i flavivirus sono gli altri membri. Il genoma a RNA di HCV è stato recentemente sequenziato. Confrontando sequenze del genoma di HCV isolate in diverse parti del mondo, si è visto che queste sequenze possono essere estremamente eterogenee. La maggior parte del genoma di HCV è occupata da uno schema di lettura aperto {ORF) variabile tra 9030 e 9099 nucleotidi. Questo ORF codifica per una singola poliproteina virale, la cui lunghezza può ovviamente variare tra 3010 e 3033 amminoacidi. Durante il ciclo di infezione virale, la poliproteina è tagliata proteoliticamente nei prodotti genici individuali necessari per la replicazione del virus. I geni che codificano per le proteine strutturali di HCV sono localizzati all'estremità 5' dell ORF, mentre la regione che codifica per le proteine non-strutturali occupa il resto dellORF.
Le proteine strutturali consistono di C (core, 21 kDa), E1 (envelope, gp37) e E2 (NS1, gp61). C è una proteina non glicosilata di 21 kDa che probabilmente costituisce il nucleocapside virale. La proteina E1 è una glicoproteina di circa 37 kDa e si ritiene che sia una proteina strutturale dell'involucro virale esterno. E2, un'altra glicoproteina di membrana di 61 kDa, costituisce probabilmente una seconda proteina strutturale dell'involucro esterno del virus.
La regione non-strutturale comincia con NS2 (p24), una proteina idrofobica di 24 kDa la cui funzione non è nota. NS3, una proteina di 68 kDa che segue NS2 nella poliproteina, ha due domini funzionali: un dominio di serino-proteasi nei primi 200 amminoacidi ammino-terminali e un dominio di ATPasi RNA-dipendente al carbossiterminale. La regione genica corrispondente a NS4 codifica per NS4A (p6) e NS4B (p26), due proteine idrofobiche di 6 e 26 kDa, rispettivamente, la cui funzione non è stata fino ad oggi chiarita. Anche il gene corrispondente a NS5 codifica per due proteine NS5A(p56) e NS5B(p65} di 56 e 65 kDa rispettivamente .
Diversi studi di biologia molecolare hanno indicato che la peptidasi del segnale, una protessi associata al reticolo endoplasmatico della cellula ospite, è responsabile del processamente proteolitico della regione nonstrutturale, ovvero ai siti C/El, E1/E2 ed E2/NS2. Una seconda attività proteasica di HCV sembra essere responsabile del taglio tra NS2 ed NS3. Questa attività proteasica è contenuta in una regione che comprende sia parte di NS2 che la parte di NS3 che contiene il dominio di serinoproteasi, ma non utilizza lo stesso meccanismo catalitico di quest 'ultima. La serino-proteasi contenuta in NS3 è responsabile del taglio alle giunzioni tra NS3 ed NS4A, tra NS4A ed NS4B, tra NS4B e NS5A e tra NS5A e NS5B.
Allo stesso modo di altri virus a filamento di RNA positivo, si pensa che la replicazione di HCV proceda mediante la sintesi iniziale di un filamento di RNA negativo, che serve, a sua volta, come stampo per la produzione di progenie di molecole di RNA a filamento positivo. Si è ipotizzato che una RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) sia coinvolta in entrambi questi stadi. Una sequenza amminoacidica presente in tutte le RNA polimerasi RNA-dipendenti può essere riconosciuta all'interno della regione NS5. Ciò suggerisce che la regione NS5 contenga componenti dell'apparato di replicazione virale. Le polimerasi codificate dal virus sono state tradizionalmente considerate importanti bersagli per l'inibizione mediante composti antivirali. Nel caso specifico di HCV la ricerca di tali sostanze è stata tuttavia ostacolata dalla mancanza di un modello adatto di infezione virale (ad esempio: infezione di cellule in coltura o un modello animale facile) come pure dalla mancanza di un saggio enzimatico, funzionale per la RdRp.
Si è ora inaspettatamente trovato che questa importante limitazione può essere superata adottando la metodologia secondo la presente invenzione, la quale offre inoltre altri vantaggi che risulteranno evidenti nel seguito.
La presente invenzione ha infatti per oggetto una metodologia per riprodurre in vitro l'attività di RNA polimerasi RNA-dipendente di HCV che fa uso di sequenze contenute nella proteina NS5B di HCV. Usando questo metodo può anche essere riprodotta l'attività di nucleotidiltransferasi terminale, una ulteriore proprietà della proteina NS5B. La metodologia sfrutta il fatto che le proteine che contengono sequenze di NS5B possono essere espresse in sistemi eterologhi sia eucariotici che procariotici; le proteine ricombinanti che contengono sequenze di NS5B, sia purificate ad omogeneità apparente che presenti in estratti di organismi che la sovraproducono, possono catalizzare l'addizione di ribonucleotidi al terminale 3' di molecole di RNA esogene sia in modo stampo-dipendente (RdRp) che in modo stampoindipendente {TNTasi).
L'invenzione si estende anche ad una nuova composizione di materia, caratterizzata dal fatto di comprendere proteine le cui sequenze sono descritte in SEQ ID N0:1 o sequenze in essa contenute o da essa derivate. E' inteso che queste sequenze possono variare in diversi isolati di HCV, perchè tutti i virus a RNA manifestano un elevato grado di variabilità. Questa nuova composizione di materia possiede l'attività di RdRp necessaria ad HCV per replicare il suo genoma.
La presente invenzione ha anche come oggetto l'uso di questa composizione di materia per la messa a punto di un saggio enzimatico capace di identificare, a fini terapeutici, composti inibitori delle attivtà enzimatiche associate a NS5B, inclusi inibitori di RdRp e TNTasi.
Si è data finora nella presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di sue specifiche forme di realizzazione, finalizzate a far meglio comprendere i suoi scopi, le sue caratteristiche, i suoi vantaggi e le sue modalità operative.
La figura 1 mostra i costrutti plasmidici usati per il trasferimento di HCV cDNA in un vettore d'espressione di baculovirus .
La figura 2 mostra i plasmidi usati per la sintesi in vitro del substrato D-RNA della RNA polimerasi RNA-dipendente [pT7-7 (DCoH)] , e per 1 <1 >espressione della RNA polimerasi RNA-dipendente in E.coli [pT7-7{NS5B] rispettivamente.
La figura 3 mostra un disegno schematico di filamenti (+) e {-) di D-RNA. Il trascritto contiene la regione codificante per mRNA di DCoH. Gli oligonucleotidi DNA a, b e c sono disegnati in modo da appaiarsi con l'RNA antisenso di nuova sintesi e 1 <1 >ibrido DNA/RNA è stato sottoposto a taglio con RNasi H. La parte inferiore dello schema rappresenta le dimensioni attese dei frammenti di RNA generati dalla digestione con RNasi dell'ibrido dell' RNA (-) con gli oligonucleotidi a, b e c rispettivamente.
DEPOSITI
Batteri E. Coli DH1, trasformati con i plasmidi pBac 5B, pBac 25, pT7.7 DCoH e pT7.7NS5B - che contengono rispettivamente SEQ ID N0:1; SEQ ID NO :2; il cDNA per la trascrizione di SEQ ID NO:12; e SEQ ID NO :1 sono stati depositati il 9 maggio 1995 presso The National Collections of Industriai and Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK. Con i numeri di accesso NCIMB 40727, 40728, 40729 e 40730 rispettivamente.
ESEMPIO 1
Metodo di espressione della RdRp/TNTasi di HCV in cellule in coltura del clone 9 di Spodontera frugioerda
Sistemi per l'espressione di geni estranei in cellule di insetti in coltura, come le cellule del clone 9 di Spodoptera frugiperda (Sf9) infettate con vettori di Baculovirus sono noti nel settore in esame {V.A. Luckow,, Baculovirus systems for thè expression of human gene products, (19931 Current Opinion in Biotechnology 4, pagg. 564-572) . I geni eterologhi vengono di solito posti sotto il controllo del promotore forte della poliedrina del virus della poliedrosi nucleare di Autographa californica oppure del virus della poliedrosi nucleare di Bombix mori. Sono anche noti nello specifico settore i metodi per l'introduzione di DNA eterologo nel sito desiderato nei vettori di Baculovirus per ricombinazione omologa (D.R. O'Reilly, L. K. Miller, V.A. Luckow, (1992), Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York).
I vettori plasmidici pBac5B e pBac25 sono derivati da pBlueBacIII (Invitrogen) e sono stati costruiti per il trasferimento di geni che codificano per NS5B ed altre proteine di HCV non strutturali, in vettori di espressione di Baculovirus. I plasmidi vengono schematicamente illustrati in figura 1 e la loro costruzione viene descritta dettagliamente nell'esempio 8. Frammenti selezionati del cDNA corrispondente al genoma dell'isolato HCV-BK (HCV-BK; Takamizawa, A., Mori, C., Fuke, I., Manabe, S., Murakami, S., Fujita, J.., Onishi, E., Andoh, T., Yoshida, I.; e Okayama H., (1991) Structure and Organization of thè Hepatitis C Virus Genome Isolated from Human Carriera J. Virol., 65, 1105-1113) sono stati clonati sotto il promotore forte della poliedrina del virus della poliedrosi nucleare e sono stati affiancati da sequenze che permettono ricombinazione omologa in un vettore di Baculovirus .
Per costruire pBac5D, un prodotto da PCR contenente la regione cDNA che codifica per gli amminoacidi della poliproteina di HCV da 2420 a 3010 e corrispondente alla proteina NS5B (SEQ ID NO:1) è stato clonato tra i siti BamHI e HindiII di pBlue Bacili. L'oligonucleotide senso utilizzato in PCR contiene un segnale di inizio mentre il codone originale di terminazione di HCV serve per la terminazione della traduzione.
pBac25 è un derivato di pBlueBacIII (Invitrogen) in cui la regione di cDNA che codifica per gli amminoacidi della poliproteina HCV-BK dalla posizione 810 alla posizione 3010 (SEQ ID NO:2) è stata clonata tra i siti di restrizione di Ncol ed HindlII.
Cellule del clone 9 di Spodoptera frugiperda (Sf9) e i kit di ricombinazione di baculovirus sono stati fom iti da Invitrogen. Le cellule sono state fatte crescere su piastre o in sospensione a 27°C in mezzo completo per gli insetti di Grace (Gibco) contenente il 10% di siero di bovino fetale (Gibco). Trasfezione, ricombinazione e selezione dei costrutti di baculovirus sono state eseguite come raccomandato dal produttore. Sono stati isolati due baculovirus ricombinanti, Bac25 e Bac5B che contengono il desiderato HCV cDNA.
Per l'espressione della proteina, le cellule Sf9 sono state infettate con ognuno dei baculovirus ricombinanti Bac25 e Bac5B alla densità di 2 x 10<6 >cellule per mi in un rapporto di circa 5 particelle virali per cellula. Da 48 a 72 ore dopo l'infezione, le cellule Sf9 sono state raccolte per centrifugazione, lavate una volta con (PBS) (phosphate buffered saline) e sospese con attenzione (7,5 x 10<7 >cellule per mi) in tampone A (Tris/Cl 10 mM pH 8, MgCl2 1,5 mM, NaCl 10 mM) contenenti ditiotreitolo (DTT) 1 mM, fenilmetilsolfonilfluoruro 1 mM (PMSF, Sigma) e 4 mg/ml di leupeptina. Tutte le operazioni seguenti sono state eseguite fra 0°C e 4°C: dopo rigonfiamento per 30 minuti le cellule sono state distrutte con 20 colpi in un omogeneizzatore Dounce usando un pestello di tipo tight-fitting. Vengono poi aggiunti glicerolo, come pure i detergenti Nonidet P-40 (NP40) e 3-((3-colammidopropil)-dimetil-ammonio]-1-propansolfonato (CHAPS), fino ad una concentrazione, rispettivamente, di 10% (v/v), 1% (v/v) e 0,5% (w/v) e l'estratto cellulare viene incubato per un'altra ora in ghiaccio con agitazione occasionale. I nuclei sono raccolti per centrifugazione di 10 minuti a 1000 x g e il supernatante viene raccolto. Il centrifugato viene risospeso in tampone A contenente le suddette concentrazioni di glicerolo e detergenti (0,5 mi per 7,5 x 10<7 >nuclei) con 20 colpi dell'omogeneizzatore di Dounce e quindi incubato per un'ora su ghiaccio. Dopo ricentrifugazione dei nuclei, entrambi i supernanti vengono riuniti, centrifugati per 10 minuti a 8000 x g e il centrifugato viene scartato. L'estratto citoplasmico grezzo risultante viene usato direttamente per determinare l'attività di RdRp oppure purificato ulteriormente su gradiente di saccarosio (vedi esempio 5).
L'infezione di cellule di Sf9 con entrambi i baculovirus ricombinanti Bac25 o Bac5B porta all'espressione delle proteine di HCV attese. In vero, dopo infezione di cellule Sf9 con Bac25 si possono rivelare nei lisati cellulari le proteine correttamente processate HCV NS2 (24 kDa), NS3 (68 kDa), NS4B (26 kDa), NS4A (6 kDa), NS5A (56 kDa) e NS5B (65 kDa) mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e immunorivelazione . Procedendo all'infezione di cellule di Sf9 con BacSB, solo una proteina codificata da HCV corrispondente per dimensioni a NS5B autentica (65 kDa) viene rivelata mediante SDS-PAGE seguita da immunorivelazione oppure colorazione con Coomassic Blue.
ESEMPIO 2
Metodo di saggio per RdRp ricombinante di HCV su uno stampo/substrato di RNA sintetico
Il saggio per RdRp è basato sulla rivelazione di nucleotidi marcati incorporati in nuovi prodotti di RNA. Il saggio in vitro per determinare l'attività di RdRp è stato eseguito in un volume totale di 40 μΐ contenenti 1-5 μΐ di estratto citoplasmatico di Sf9 oppure frazioni di proteina purificata. Possono essere usati come fonte di HCV RdRp estratti citoplasmici nonfrazionati o purificati di cellule di Sf9 infettate con Bac25 oppure Bac5D. Può essere usato come controllo negativo un estratto di cellule di Sf9 ottenuto da cellule infettate con un costrutto ricombinante di baculovirus che esprime una proteina non correlata ad HCV. Alla miscela di reazione vengono aggiunti i seguenti componenti addizionali (concentrazioni finali): Tris/Cl pH 7,5 20 mM, MgCl25 mM, DTT 1 mM, KCl 25 mM, EDTA 1 mM [32P] NTP 5-10 /iCi di una specie (a meno che non sia indicato diversamente è stato usato GTP, 3000 Ci/mmol, Amersham), ciascun NTP 0,5 mM (cioè CTP, UTP, ATP a meno che non è indicato diversamente) , RNasin 20 U (Promega), substrato di RNA 0,5 μg (circa 4 pmol; concentrazione finale 100 mM, attinomicina D (Sigma) 2 /xg. La reazione è stata incubata per 2 ore a temperatura ambiente, bloccata per aggiunta di un egual volume di tampone 2 x Proteinase K (PK, Boehringer Mannheim) (NaCl 300 mM, Tris/Cl pH 7,5100 mM, SDS 1% w/v) e seguita da una mezz'ora di trattamento con 50 μg di PK a 37°C. I prodotti di RNA sono stati estratti mediante PCA, precipitati con etanolo ed analizzati mediante elettroforesi su gel al 5% di poliacrilammide contenente urea 7M.
Il substrato di RNA che viene usato in questo caso per il saggio (D-RNA) che ha la sequenza riportata in SEQ ID NO:12 è ottenuto mediante trascrizione in vitro del plasmide pT7-7(DCoH) con polimerasi T7 come descritto qui di seguito.
Il plasmide pT7-7(DCoH) (figura 2) è stato linearizzato con il sito di restrizione unico di BglII contenuto alla fine della sequenza codificante DCoH e trascritto in vitro con polimerasi T7 (Stratagene) usando la procedura descritta dal produttore. La trascrizione viene bloccata mediante aggiunta di 5υ/10μ1 di DNasil (Promega) . La miscela viene incubata per altri 15 minuti ed estratta con fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (PCA). I nucleotidi non incorporati sono stati rimossi per gel-filtrazione attraverso una colonna di 1 mi di Sephadex G50. Dopo estrazione con PCA e precipitazione con etanolo l'RNA è stato raccolto, ridisciolto in acqua e la sua concentrazione è stata determinata mediante densità ottica a 260 nm.
Come risulterà chiaro dagli esperimenti descritti qui di seguito, nel saggio per l'attività di RdRp secondo l'invenzione può essere usata qualsiasi altra molecola di RNA, anche diversa da D-RNA.
Il saggio per HCV RdRp sopra descritto dà origine ad una serie caratteristica di prodotti di reazione marcati radioattivamente: in tutte le reazioni,incluso il controllo negativo, viene osservato un prodotto marcato che migra insieme con l'RNA substrato. Questa specie di RNA può essere visualizzata anche con colorazione all'argomento e si è pertanto pensato che corrisponda all 'RNA substrato, marcato molto probabilmente mediante attività nucleotidiltransferasi terminale presente in estratti citoplasmici di cellule Sf9 infettate con baculovirus. Nelle reazioni eseguite con estratti citoplasmatici di cellule Sf9 infettate con Bac25 oppure Bac5B, ma non di cellule infettate con un costrutto di Baculovirus ricombinante che esprime una proteina non correlata ad HCV, si è osservata una banda addizionale che migra più velocemente dell'RNA substrato. Si è trovato che quest'ultimo prodotto di reazione è marcato ad una attività specifica elevata, dato che può essere rivelato solo per autoradiografia e non per colorazione all'argento. Si è trovato che questo nuovo prodotto è derivato dallo stampo di RNA aggiunto dall'esterno, dato che è assente nelle reazioni di controllo in cui non è stato aggiunto RNA. E' interessante notare che la formazione di una specie marcata che migra più velocemente dell'RNA del substrato è stata osservata consistentemente con una varietà di molecole di RNA come stampo, che contengano o meno la regione non tradotta 3' di HCV. L'RNA messaggero del cofattore di trascrizione fegato-specifico DCoH(D-RNA) ha dimostrato a sua volta di essere un substrato efficacemente accettato nel saggio per RdRp in questione .
Al fine di definire la natura della specie generata nella reazione mediante gli estratti di cellule infettate con Bac25 o Bac5B, si è fatta la seguente serie di esperimenti: (i) la miscela prodotta è stata trattata con RNasi A oppure nucleasi PI. Dato che ciò ha per effetto la completa scomparsa della banda radioattiva, si è concluso che entrambi i prodotti marcati sono molecole di RNA. (ii) L'assenza dalle miscele di reazione di ognuno dei quattro nucleotidi trifosfato ha per effetto la marcatura del solo RNA substrato, suggerendo che la specie che migra più velocemente è un prodotto della reazione di polimerizzazione, (iii) L'assenza dal saggio di ioni Mg<2+ >causa un blocco completo della reazione: non si osserva nè sintesi di nuovo RNA nè marcatura del RNA substrato, (iv) quando il saggio viene eseguito con un RNA substrato marcato radioattivamente e con nucleotidi non marcati, il prodotto marcato che si ottiene non è distinguibile da quello ottenuto nelle condizioni standard. In base a questo risultato si è concluso che il nuovo RNA prodotto è generato dalla molecola di RNA substrato originale.
Presi insieme, questi dati dimostrano che gli estratti di cellule di Sf9 infettate con Bac25 o Bac5B contengono una nuova attività enzimatica magnesio-dipendente che catalizza la sintesi di RNA de novo. Si vede che questa attività dipende dalla presenza di RNA aggiunto, ma è indipedente dall'aggiunta di un primer o dall'origine della molecola di RNA substrato. Inoltre, dato che i prodotti generati dagli estratti di cellule Sf9 infettate con Bac25 o Bac5B sembrano essere identici, gli esperimenti appena descritti indicano che l'attività di RdRp osservata è dovuta alla proteina HCV NS5B.
ESEMPIO 3
Metodi per la caratterizzazione dell'RNA prodotto dalla RdRp di HCV
Per chiarire le caratteristiche strutturali dell'RNA di nuova sintesi, sono stati adottati i seguenti metodi. Nelle condizioni standard di elettroforesi qui utilizzate (poliacrilammide al 5%, urea 7M) il nuovo RNA prodotto sembra avere le dimensioni di circa 200 nucleotidi. Questo potrebbe essere dovuto a iniziazione interna della trascizione di RNA oppure a terminazione prematura. Queste possibilità, tuttavia, sembrano essere molto improbabili, dato che si è trovato che i prodotti derivati dai saggi per RdRp usando diversi substrati di RNA migrano in modo significativamente più veloce dei loro rispettivi stampi. L'aumento di temperatura durante l’elettroforesi e di concentrazione di acrilammide nel gel analitico portano ad un comportamento di migrazione molto diverso del prodotto della RdRp. In tal modo, usando ad esempio un sistema di gel contenente 10% di acrilammide e urea 7M, in cui la separazione viene fatta avvenire a temperatura più alta, il prodotto dell'attività di RdRp migra più lentamente dell'RNA substrato, fino ad una posizione che corrisponde ad almeno il doppio della lunghezza dell'RNA substrato . Un effetto similare si osserva quando agenti di denaturazione di RNA, quale metilidrossi-mercurio (CH3HgOH, 10 mM) vengono aggiunti al prodotto dell1attività di RdRp prima dell'elettroforesi su un gel a bassa percentuale/minore temperatura. Queste osservazioni suggeriscono che il prodotto dell'attività di RdRp possiede una struttura secondaria .
E' stata anche indagata la suscettibilità della molecola del prodotto ad una varietà di ribonucleasi con diversa specificità. Il prodotto viene completamente degradato per trattamento con RNasi A. D'altro canto, si è trovato che esso è sorprendentemente resistente alla nucleasi RNasi TI specifica per singolo filamento. L'RNA substrato viene completamente degradato dopo incubazione per 10 minuti con 60 U RNasi TI a 22°C e la colorazione all'argento dello stesso gel conferma che non solo il substrato, ma anche tutto l'altro RNA usualmente rivelabile negli estratti citoplasmici di cellule Sf9 viene completamente idrolizzato durante l'incubazione con RNasi TI. Al contrario, il prodotto dell'attività di RdRp rimane inalterato ed è digerito solo dopo prolungata incubazione con RNasi TI. Così, dopo 2 ore di trattamento con RNasi Tl, la molecola del prodotto marcato non può più essere rivelata nella sua posizione originaria sul gel. Invece, appare una nuova banda che ha una mobilità elettroforetica simile a quella dell'RNA substrato usato come stampo. Un effetto similare viene osservato quando si esegue digestione per un'ora con RNasi Tl, ma a diverse temperature: a 22°C il prodotto dell'attività di RdRp rimane largamente inalterato, mentre a 37°C viene convertito nel nuovo prodotto che migra insieme al substrato originario .
La spiegazione di queste osservazioni è che l RNA substrato serve come stampo per la RdRp di HCV : il 3' OH viene usato per innescare la sintesi del filamento complementare mediante un meccanismo "turn" oppure "copy-back" per dare origine ad una molecola a forcina consistente nel filamento senso (stampo) cui è covalentemente attaccato un filamento antisenso. Tale struttura spiega l'insolita mobilità elettroforetica del prodotto dell'attività di RdRp su gel di poliacrilammide come pure la sua elevata resistenza alle nucleasi specifiche per singoli filamenti. Le basi della molecola di RNA a forcina non dovrebbero essere appaiate e pertanto dovrebbero essere suscettibili alle nucleasi. Il trattamento con RNasi TI porta così all'idrolisi del legame covalente tra i filamenti senso ed antisenso per dare una molecola di RNA a doppio filamento. Durante l'elettroforesi su gel denaturante, i due filamenti si separano e il filamento antisenso di nuova sintesi, che dovrebbe essere di lunghezza simile allo stampo di RNA originale, resterebbe rilevabile. Questo meccanismo appare piuttosto probabile in vista del fatto che questo tipo di prodotto è generato da diverse altre RNA polimerasi in vitro.
Si è progettato il seguente esperimento per dimostrare che il prodotto di RNA marcato durante la reazione con polimerasi e apparentemente rilasciato nel trattamento con RNasi TI esibisce un orientamento antisenso rispetto allo stampo.
A questo scopo, si sono sintetizzati oligodeossiribonucleotidi corrispondenti a tre sequenze separate della molecola di input RNA stampo (figura 2) , oligonucleotide a corrispondente ai nucleotidi 170-195 di D-RNA (SEQ ID NO:3); oligonucleotide b, complementare ai nucleotidi 286-309 (SEQ ID NO:4); oligonucleotide c, complementare ai nucleotidi 331-354 (SEQ ID NO:5) . Questi sono stati usati per generare ìbridi di DNA/RNA con il prodotto della reazione con polimerasi, in modo che essi possano essere sottoposti a digestione con RNasi H. Inizialmente, viene usato nelle ibridizzazioni il prodotto RdRp completo. Tuttavia, dato che questa struttura è troppo termostabile, non si formano ibridi specifici. Pertanto, l'RNA a forcina viene pretrattato con RNasi Tl, denaturato per bollitura di 5 minuti e quindi lasciato raffreddare a temperatura ambiente in presenza dell'oligonucleoti.de rispettivo. Come ci si aspettava, l'esposizione degli ibridi a RNasi H porta a prodotti di scissione specifici. Il taglio degli oligonucleotidi a porta a prodotti di circa 170 e 220 nucleotidi di lunghezza, gli oligonucleotidi b portano a prodotti di circa 290 e 110 nucleotidi e gli oligonucleotidi c danno origine a frammenti di circa 330 e 65 nucleotidi. Dato che questi frammenti hanno le dimensioni attese (vedi figura 3), i risultati indicano che la sintesi di RNA mediata da HCV NS5B procede con un meccanismo "copy-back" che genera un duplex di RNA del tipo a forcina.
ESEMPIO 4
Metodo di saggio per TNTasi ricombinante di HCV su substrato di RNA sintetico
Il saggio per TNTasi è basato sul rilevamento dell'incorporazione stampo-indipendente di nucleotidi marcati al gruppo 3 1 idrossile di substrati di RNA. Il substrato di DNA per il saggio (D-RNA) viene normalmente ottenuto mediante trascrizione in vitro del plasmide linearizzato pT7-7DCoH con T7 polimerasi come descritto nell'esempio 2. Tuttavia, può essere usata nel saggio per la TNTasi secondo l'invenzione ogni altra molecola di RNA diversa da D-RNA.
Il saggio in vitro per determinare l'attività di TNTasi viene eseguito in un volume totale di 40 μΐ contenente 1-5 μΐ di estratto citoplasmatico crudo di Sf9 oppure di una frazione di proteina purificata. Possono essere usati come sorgente di HCV TNTasi estratti citoplasmici non-frazionati o purificati di cellule di Sf9 infettate con Bac25 oppure BacSB. Può essere usato come controllo negativo un estratto di cellule di Sf9 infettate con un costrutto di Baculovirus ricombinante che esprime una proteina non correlata ad HCV. I seguenti componenti addizionali vengono aggiunti alla miscela di reazione (concentrazioni finali): Tris/Cl pH 7,520 mM, MgCl25 mM, DTT 1 mM, KCl 25 mM, EDTA 1 mM, 5-10 /xCi [<32>P] NTP di una specie (a meno che non venga indicato differentemente, viene usato UTP, 3000 Ci/mmol Amersham), 20 U RNasin (Promega), substrato di RNA 0,5 μg (circa 4 pmol; concentrazione finale 100 nM), 2 |ig di actinomicin D (Sigma). La reazione viene tenuta in incubazione per 2 ore a temperatura ambiente, bloccata per aggiunta di un egual volume di tampone 2 x Proteinasi K (PK, Boehringer Mannheim) (NaCl 300 mM, Tris/Cl pH 7,5100 mM, SDS 1% w/v) e seguita da una mezz'ora di trattamento con 50 μ% di PK a 37°C,. I prodotti di RNA vengono estratti con PCA, precipitati con etanolo ed analizzati mediante elettroforesi su gel al 5% di poliacrilammide contenente urea 7M.
ESEMPIO 5
Metodo per la purificazione di HCV RdRn/TNTasi mediante sedimentazione su gradiente di saccarosio Un gradiente lineare di saccarosio 0,3-1,5 M viene preparato in tampone A contenente detergenti (vedi esempio 1). Vengono caricati su 12 mi di gradiente fino a 2 mi di estratto di cellule Sf9 infettate con Bac5B oppure Bac25 (corrispondente a circa 8 x IO7 cellule). Viene eseguita una centrifugazione per 20 ore a 39000 x g usando un rotore Beckman SW40. Frazioni di 0,5 mi vengono raccolte e saggiate per l'attività. Si è trovato che la proteina NS5B, identificata mediante immunorivelazione, migra nei gradienti di densità con un coeffiente di sedimentazione inaspettatamente elevato. Si è trovato che la proteina virale e i ribosomi cosedimentano nelle stesse frazioni del gradiente. Questo comportamento permette di separare la proteina virale dalla massa delle proteine citoplasmatiche che rimangono alla sommità del gradiente. Il saggio di attività per la RdRp rivela che l'attività di RdRp cosedimenta con la proteina NS5B. In queste frazioni è anche presente l'attività di nucleotidiltransferasi terminale.
ESEMPIO 6
Metodo per la purificazione di HCV TNTasi/RdRp da cellule Sf9
Gli estratti interi cellulari sono ricavati da 1 g di cellule Sf9 infettate con baculovirus ricombinante Bac5B. Le cellule congelate sono scongelate su ghiaccio in 10 mi di tampone contenente Tris/HCl pH 7,520 mM, EDTA 1 mM, DTT 10 mM, glicerolo 50 % {tampone N) cui viene aggiunto PMSF 1 mM. Vengono poi aggiunti Triton X-100 ed NaCl fino ad una concentrazione finale del 2% e di 500 mM rispettivamente, al fine di favorire la rottura delle cellule. Dopo addizione di MgCl2 (10 mM) e DNasi I (15 μg/ml) si agita la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. L'estratto viene quindi chiarificato per ultracentrifugazione in centrifuga Beckman usando un rotore 90 Ti a 40000 gpm per 30 minuti a 4°C. L'estratto viene quindi diluito con un tampone contenente Tris/HCl pH 7,520 mM, EDTA ImM, DTT 10 mM, glicerolo al 20%, Triton X-100 allo 0,5% (tampone LG), per aggiustare la concentrazione di NaCl a 300 mM, e incubato con 5 mi di DEAE-Sepharose Fast Flow, equilibrato in tampone LG contenente NaCl 300 mM. La matrice viene quindi versata in una colonna e lavata con due volumi dello stesso tampone. Il "flow-through" e il primo lavaggio della colonna di DEAE-Sepharose Fast Flow viene diluito 1:3 con tampone LG ed applicato su una colonna di Heparin-Sepharose CL6B (10 mi) equilibrata con tampone LG contenente NaCl 100 mM. La colonna Heparin-Sepharose C16B viene lavata accuratamente e le proteine ad essa legate vengono eluite con un gradiente lineare di 100 mi da 100 mM ad 1M di NaCl in tampone LG. Le frazioni contenenti NS5B, come stabilito da colorazione con argento e immunorivelazione di SDS-PAGE, vengono raccolte insieme e diluite con tampone LG per aggiustare la concentrazione di NaCl a 50 mM. Le frazioni diluite vengono successivamente applicate ad una colonna Mono Q-FPLC (1 mi) equilibrata con tampone LG contenente NaCl 50 mM. Le proteine vengono eluite con un gradiente lineare (20 mi) di NaCl da 50 mM a 1M in tampone LG. Le frazioni che contengono NS5B, come stabilito da colorazione con argento e immunorivelazione di SDS-PAGE, vengono raccolte insieme e diluite con tampone LG per aggiustare la concentrazione di NaCl a 50 mM. Le frazioni contenente NS5B, come stabilito da colorazione con argento e immunorivelazione di SDS-PAGE, vengono raccolte insieme e dializzate contro tampone LG contenente NaCl 100 mM. Dopo dialisi prolungata, le frazioni raccolte insieme vengono caricate su POLI U-Sepharose CL6B (10 mi) equilibrato con tampone LG contenente NaCl 100 mM. La POLI U-Sepharose CL6B viene lavata accuratamente e le proteine legate vengono eluite con gradiente lineare di 100 mi di NaCl da 100 mM a 1M in tampone LG. Le frazioni contenenti NS5B, come determinato da colorazione con argento e da immunorivelazione di SDS-PAGE, vengono raccolte insieme, dializzate contro tampone LG contenente NaCl 100 mM e tenute in azoto liquido prima del saggio di attività.
Frazioni contenenti la proteina NS5B purificata vengono testate per la presenza di entrambe le attività. Le attività di RdRp e TNTasi vengono trovate nelle stesse frazioni. Questi risultati indicano che entrambe le attività, RNA polimerasi RNA-dipendente e ribonucleotidiltransferasi terminale, sono funzioni della proteina HCV NS5B.
La proteina NS5B purificata è stata saggiata per l'attività di nucleotidiltransferasi terminale con ciascuno dei quattro ribonucleotide trifosfati a concentrazioni di substrato non sature. I risultati mostrano chiaramente che UTP è il substrato preferito di TNTasi, seguito da ATP, CTP e GTP indipendentemente dall'origine dell'RNA accettore .
ESEMPIO 7
Metodo di espressione di HCV RdRp/TNTasi in in E. Coli
Il plasmide pT7-7(NS5B), descritto in figura 2 nell'esempio 8, è stato costruito per permettere l'espressione in E. coli del frammento di proteina di HCV che ha la sequenza indicata come SEQ ID NO 1. Questo frammento di proteina contiene la RdRp e la TNTasi di NS5B, come discusso in precedenza. Il frammento di HCV cDNA che codifica che la proteina NS5B è così clonato a valle del promotore del batteriofago T7 010 e in fase di lettura con il primo codone ATG della proteina del gene 10 del fago T7, usando metodi noti nella pratica della biologia molecolare e descritti in dettaglio nell'esempio 8. Il plasmide pT7-7(NS5B) contiene anche il gene per l'enzima β-lattamasi che può essere usato come marcatore di selezione di cellule di E. coli trasformate con il plasmide pT7-7 (NS5B).
Il plasmide pT7-7{NS5B) viene poi trasformato nel ceppo di E.coli BL21(DE53), che è normalmente usato per elevati livelli di espressione di geni clonati in vettori d'espressione che contengono il promotore T7. In questo ceppo di E.coli il gene di polimerasi T7 viene portato sul batteriofago Λ DE53, che è integrato nel cromosoma di cellule BL21 (Studier and Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, (1986), J. Mol. Biol.
189, p.. 113-130). L'espressione del gene che interessa è indotta dall'aggiuta di isopropiltiogalattoside (IPTG) al mezzo di crescita secondo una procedura che è stata descritta in precedenza (Studier e Moffatt, 1986). Il frammento ricombinante della proteina NS5B che contiene RdRp è così prodotto nei corpi di inclusione delle cellule ospite. La proteina ricombinante NS5B può essere purificata dalla frazione particellare degli estratti di E.coli BL21(DE53) e rinaturata secondo procedure che sono note nel settore specifico. {D.R. Thatcher and A. Hitchcock, Protein folding in biotechnology (1994) in "Mechanism of protein folding" R.H. Pain EDITOR, IRL PRESS, pagg. 229-255).
ESEMPIO 8
Costruzione dettagliata dei vettori ricombinanti che esprimono NS5B
Frammenti selezionati del cDNA corrispondente al genoma dell'isolato HCV-BK (HCVBK) vengono clonati sotto il promotore forte di poliedrina del virus della poliedrossi nucleare e affiancate da sequenze che permettono ricombinazione omologa in un vettore di baculovirus.
pBac5B contiene la sequenza HCV-BK compresa fra i nucleotidi 7590 e 9366, e codifica per la proteina NS5B riportata in SEQ ID NO: 1. Per ottenere questo plasmide, un frammento di cDNA viene generato mediante PCR usando oligonucleotidi sintetici che hanno la sequenza 5'-AAGGATCCATGTCAATGTCCTACACATGGAC -31 (SEQ ID NO: 6) e 5’-AATATTCGAATTCATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATG-31 (SEQ ID NO:7), rispettivamente. Il prodotto da PCR viene poi trattato con frammento di Klenow della DNA polimerasi digerito alla estremità 5' con BamHI e successivamente clonato tra i siti BamHI e Smal del vettore Bluescript SK(+). Successivamente il frammento di cDNA che interessa viene tagliato con gli enzimi di restrizione BamHI e HindlII ed inserito tra gli stessi siti del vettore pBlueBacIII (Invitrogen).
pBac25 contiene la regione HCV-BK cDNA compresa fra i nucleotidi 2759 e 9416 e codifica per gli amminoacidi da 810 a 3010 della poliproteina HCV-BK (SEQ ID NO:2). Questo costrutto è stato ottenuto come segue: primo, il frammento di 820 paia di basi di cDNA che contiene la sequenza HCV-BK comprendente i nucleotidi 2759 e 3578 è stato ottenuto da pCD(38-9.4) (Tornei L., Failla, C., Santolini, E., De Francesco, R. e La Monica, N. (1993) NS3 is a Serine Protesse Requied for Processing of Hepatitis C Virus Polyprotein J. Virol, 67, 4017-4026) per digestione con Ncol e clonato nel sito Ncol del vettore pBlueBacIII (Invitrogen) con l'ottenimento di un plasmide chiamato pBacNCO. Il frammento di cDNA che contiene la sequenza HCV-BK comprendente i nucleotidi 1959 e 9416 è stata ottenuta da pCD(38-9.4) (Tornei ed altri, 1993) per digestione con Noti e XbaI e clonato negli stessi siti del vettore Bluescript SK{+) con ottenimento di un plasmide chiamato pBlsNX. Il frammento di cDNA che contiene la sequenza HCV-BK comprendente i nucleotidi 3304 e 9416 è stato ottenuto da pBlsNX per digestione con SacII e HindiII e clonato negli stessi siti del plasmide pBlsNX con l'ottenimento del plasmide pBac25.
pT7-7 (DCoH) contiene l'intera regione codificante (316 nucleotidi) del cofattore di dimerizazione del fattore la di epatocita di ratto (DCoH; Mendel, D.B., Khavari, P.A., Conley, P.B., Graves, M.K., Hansen, L.P., Admon, A. and Crabtree, G.R. (1991) Characterization of a Cofactor that Regulates Dimerization of a Mammalian Homeodomain Protein, Science 254, 1762-1767; GenBank accession number : M83740). Il frammento di cDNA che corrisponde alla sequenza codificante per DCoH di ratto è stato amplificato mediante PCR usando oligonucleotidi sintetici Dprl e Dpr2 che hanno la sequenza TGGCTGGCAAGGCACACAGGCT (SEQ ID NO: 8) e AGGCAGGGTAGATCTATGTC (SEQ ID NO:9) rispettivamente. Il frammento di cDNA così ottenuto viene clonato nel sito di restrizione Smal del vettore di espressione pT7-7 di E. coli.
Il vettore di espressione pT7-7 è un derivato di pBR322 che contiene, in aggiunta al gene di βlattamasi e all'origine di replicazione di ColEl il promotore 010 di T7 polimerasi ed il sito di inizio di traduzione per la proteina 10 del gene T7 (Tabor S. and Richerdoson C.C.(1985) A bacteriophage T/ RNA polymerase/promoter System for controlled exclusive expression of specific genes, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 1074-1078).
pT7-7 (NS5B) contiene la sequenza di HCV dal nucleotide 7590 al nucleotide 9366 e codifica per la proteine NS5B riportata in SEQ ID NO.-l. Per ottenere questo plasmide viene generato un frammento cDNA mediante PCR usando oligonucleotidi 5-TCAATGTCCTACACATGGGAC-3 1 (SEQ ID NO: 10) e 5'-GATCTCTAGATCATCGGTTGGGGGAGGAGGTAGATGCC-3 1 (SEQ ID NO:11) rispettivamente. Il prodotto da PCR viene poi trattato con frammento di Klenow della DNA polimerasi e successivamente ligato nel vettore di espressione pT7-7 di E.coli dopo linearizzazione di esso con EcoRI e trattamento delle sue estremità con frammento di Klenow della DNA polimerasi .
Claims (7)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodologia per riprodurre in vitro l'attività di RNA polimerasi RNA-dipendente oppure di nucleotidiltransferasi terminale codificate dal virus dell'epatite C (HCV), in cui si utilizzano nella miscela di reazione sequenze contenenti NS5B (SEQ ID NO:1).
- 2. Metodologia per riprodurre in vitro l'attività di RNA-polimerasi RNA-dipendente -codificata da HCV come da rivendicazione 1, in cui NS5B è incorporato nella miscela di reazione come precursore NS2-NS5B, questo precursore generando -mediante eventi proteolitici multipli i quali avvengono nell'organismo che la sovraproduce- una forma di NS5B enzimaticamente attiva.
- 3 . Metodologia per riprodurre in vitro la attività di nucleotidiltransferasi terminale codificata da HCV come da rivendicazione 1, in cui NS5B è incorporata nella miscela di reazione come precursore NS2-NS5B, questo precursore generando -mediante eventi proteolitici multipli che avvengono nell'organismo che la sovraproduce- una forma di NS5B enzimaticamente attiva.
- 4. Composizione di materia, caratterizzata dal fatto di contenere sequenze NS5B come da rivendicazioni da 1 a 3.
- 5. Composizione di materia come da rivendicazione 4, che comprende le proteine le cui sequenze sono descritte in SEQ ID NO:l, in sequenze in essa contenute o in sequenze da essa derivate.
- 6. Uso delle composizioni di materia come da rivendicazioni 4 e 5, per la messa a punto di un saggio enzimatico capace di selezionare, a fini terapeutici, composti inibitori dell'attività enzimatica associata a NS5B.
- 7. Metologia per riprodurre in vitro le attività di RNA polimerasi RNA-dipendente e di nucleotidiltransferasi terminale, composizioni di materia ed uso di queste composizioni di materia per la messa appunto di un saggio enzimatico capace di selezionare, a fini terapeutici, composti inibitori dell'attività enzimatica associata a NS5B, come precedentemente descritto, esemplificato e rivendicato.
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