ITRM20120335A1 - NEW COMPOSITIONS FOR NEUROPATHIC PAIN TREATMENT. - Google Patents

Description

"NUOVE COMPOSIZIONI PER IL TRATTAMENTO DEL DOLORE NEUROPATICO" "NEW COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF NEUROPATHIC PAIN"

DESCRIZIONE DESCRIPTION

La presente invenzione si riferisce al campo delle composizioni per il trattamento del dolore neuropatico. Più in particolare, la presente invenzione si riferisce a composizioni che comprendono composti ottenuti da estratti vegetali per il trattamento del dolore neuropatico causato da chemioterapici. The present invention relates to the field of compositions for the treatment of neuropathic pain. More particularly, the present invention relates to compositions comprising compounds obtained from plant extracts for the treatment of neuropathic pain caused by chemotherapeutics.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE STATE OF THE PRIOR ART

Il dolore à ̈ stato definito dall’Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore (International Association for the Study of Pain - IASP) come “una spiacevole esperienza sensoriale ed emozionale associata ad un danno attuale o potenziale dei tessuti o descritta in termini di tale danno†. All’interno di questa definizione sta assumendo sempre più rilievo, per la significativa e crescente prevalenza a livello mondiale, una particolare tipologia di dolore, legato ad anomalie neurologiche e denominato dolore neuropatico, recentemente ridefinito dalla IASP Gruppo di Interesse Speciale per il dolore neuropatico (NeuPSIG) come un “dolore che insorge come diretta conseguenza di una lesione o una lesione o malattia che colpisce il sistema somatosensoriale†(Haanpää et al.2010). Pain has been defined by the International Association for the Study of Pain (IASP) as an unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential tissue damage or described in terms of such damageâ €. Within this definition, due to the significant and growing prevalence worldwide, a particular type of pain, linked to neurological anomalies and called neuropathic pain, is becoming increasingly important, recently redefined by the IASP Group of Special Interest for Neuropathic Pain (NeuPSIG) as a â € œpain that arises as a direct consequence of an injury or a lesion or disease affecting the somatosensory systemâ € (Haanpää et al. 2010).

Il NeuPSIG ha proposto anche un nuovo approccio per graduare il livello di certezza diagnostica del dolore neuropatico vista l’assenza di precisi criteri “gold standard†. Il processo diagnostico prevede: un’ipotesi diagnostica derivata dalla storia clinica del paziente, la presenza di anomalie somato-sensoriali all’esame neurologico e almeno un test di conferma. Al termine del processo diagnostico il dolore neuropatico potrà essere graduato secondo tre livelli: possibile, probabile e definito. The NeuPSIG also proposed a new approach to graduate the level of diagnostic certainty of neuropathic pain given the absence of precise â € œgold standardâ € criteria. The diagnostic process includes: a diagnostic hypothesis derived from the patient's clinical history, the presence of somato-sensory anomalies in the neurological examination and at least one confirmation test. At the end of the diagnostic process, neuropathic pain can be graded according to three levels: possible, probable and defined.

In ambito clinico à ̈ comune che il dolore neuropatico venga classificato anche sulla base dell’eziologia e dell’area anatomica interessata, oltre che della sua origine centrale o periferica. La differenziazione à ̈ importante perché le lesioni del sistema nervoso centrale e periferico sono distinte in termini di meccanismi fisiopatologici sottostanti, di manifestazioni cliniche e di trattamento richiesto (Haanpää et al, 2009). In the clinical setting, it is common that neuropathic pain is also classified on the basis of the etiology and the anatomical area concerned, as well as its central or peripheral origin. Differentiation is important because central and peripheral nervous system lesions are distinct in terms of underlying pathophysiological mechanisms, clinical manifestations and required treatment (Haanpää et al, 2009).

Allo stato attuale non sono disponibili strumenti diagnostici che permettano di definire una diagnosi inequivocabile di dolore neuropatico. At present there are no diagnostic tools available that allow to define an unequivocal diagnosis of neuropathic pain.

La sintomatologia caratteristica del dolore neuropatico permette di distinguerlo da altri tipi di dolore comunemente riportati in cui il sistema nervoso à ̈ inalterato, tra cui condizioni di cefalea, dolore alla schiena, e da altri tipi di dolore muscolo-scheletrico. The characteristic symptoms of neuropathic pain allow it to be distinguished from other commonly reported types of pain in which the nervous system is unaffected, including headache conditions, back pain, and other types of musculoskeletal pain.

Il dolore neuropatico comprende un gruppo eterogeneo di condizioni che non possono essere spiegate da un singolo meccanismo eziopatologico o da una particolare lesione anatomica. Neuropathic pain encompasses a heterogeneous group of conditions that cannot be explained by a single etiopathological mechanism or by a particular anatomical lesion.

Queste affezioni delle strutture del sistema nervoso centrale o periferico includono varie neuropatie (neuropatia diabetica, neuropatia post-erpetica, neuropatie infiammatorie, neuropatia da abuso di alcool, neuropatia associata all’infezione con HIV/AIDS) e possono derivare dall’azione dannosa di varie tossine (ad esempio, neurotossine, farmaci ad azione neurotossica), da traumi acuti (compresa la chirurgia), da trauma cronici (ad esempio, ripetitivi disturbi motori) come la sindrome del tunnel carpale, da malattie del sistema nervoso centrale (come ictus, sclerosi multipla, ischemie cerebrali, morbo di Parkinson, lesioni del midollo spinale traumi cranici). These disorders of the structures of the central or peripheral nervous system include various neuropathies (diabetic neuropathy, post-herpetic neuropathy, inflammatory neuropathy, alcohol abuse neuropathy, neuropathy associated with HIV / AIDS infection) and can result from the harmful action of various toxins (for example, neurotoxins, neurotoxic drugs), from acute trauma (including surgery), from chronic trauma (for example, repetitive motor disorders) such as carpal tunnel syndrome, from diseases of the central nervous system (such as stroke, multiple sclerosis, cerebral ischemia, Parkinson's disease, spinal cord injury, head trauma).

La diagnosi non à ̈ facile in quanto il nervo pur producendo scariche continue dolorose spesso à ̈ anatomicamente integro. Diagnosis is not easy as the nerve, while producing continuous painful discharges, is often anatomically intact.

Il dolore neuropatico à ̈ presente in vari stati patologici e si presenta con una varietà di sintomi, che sono accomunati dalle seguenti caratteristiche: il dolore à ̈ percepito in assenza di un processo o di lesione tissutale permanente ed identificabile; Neuropathic pain is present in various pathological states and presents with a variety of symptoms, which share the following characteristics: pain is perceived in the absence of a permanent and identifiable process or tissue lesion;

• sono presenti sensazioni sgradevoli, anormali o insolite (disestesie), frequentemente riferite come bruciore o scossa elettrica; â € ¢ There are unpleasant, abnormal or unusual sensations (dysesthesia), frequently referred to as burning or electric shock;

• sono presenti brevi episodi di dolore parossistico a carattere lancinante o trafittivo; â € ¢ there are short episodes of paroxysmal stabbing or stabbing pain;

• il dolore compare in ritardo rispetto alla lesione scatenante; â € ¢ pain appears later than the triggering lesion;

• il dolore à ̈ percepito in una regione di deficit sensitivo; â € ¢ pain is perceived in a region of sensory deficit;

• anche stimoli leggeri sono dolorosi (allodinia); â € ¢ even light stimuli are painful (allodynia);

• c’à ̈ sommazione marcata ed attività persistente dopo l’applicazione di stimoli ripetuti. â € ¢ there is marked summation and persistent activity after the application of repeated stimuli.

Si stima che il dolore neuropatico, arrivi a colpire fino al 3% della popolazione e che circa da 1 a 5 europei adulti su 100 siano soggetti a dolore cronico. It is estimated that neuropathic pain affects up to 3% of the population and that approximately 1 to 5 European adults in 100 suffer from chronic pain.

La letteratura riporta che negli Stati Uniti, il dolore neuropatico rappresenta un problema potenzialmente gravoso anche per i sistemi di assistenza nazionale, con una prevalenza dell’1,5%. The literature reports that in the United States, neuropathic pain represents a potentially burdensome problem also for national care systems, with a prevalence of 1.5%.

L’80% dei pazienti neoplastici in fase avanzata manifesta sintomi di colore neuropatico. Inoltre gli agenti antineoplastici rappresentano la principale categoria di farmaci neurotossici ad avere importanti problemi clinici, sia per il loro uso diffuso, sia per la potenziale gravità della loro tossicità. Infatti, la neurotossicità periferica di farmaci antineoplastici costituisce la principale causa di sospensione o riduzione della dose del trattamento. Inoltre anche se la neurotossicità non risulta così grave da limitare la dose di trattamento, la sua insorgenza può gravemente influenzare la qualità della vita dei pazienti affetti da tumore e provocare disagio cronico. 80% of advanced cancer patients show symptoms of neuropathic color. Furthermore, antineoplastic agents represent the main category of neurotoxic drugs to have important clinical problems, both for their widespread use and for the potential severity of their toxicity. In fact, the peripheral neurotoxicity of antineoplastic drugs constitutes the main cause of suspension or reduction of the treatment dose. Furthermore, even if the neurotoxicity is not so severe as to limit the treatment dose, its onset can seriously affect the quality of life of patients with cancer and cause chronic discomfort.

Tra i farmaci antineoplastici, i derivati del platino (cis platino e oxaliplatino) risentono maggiormente di questo tipo di tossicità neurologica, che rappresenta un fattore limitante il loro utilizzo. La tossicità che limita la somministrazione dell’ oxaliplatino à ̈ di tipo neurologico. Comprende una neuropatia sensoriale periferica caratterizzata disestesie e/o parestesie delle estremità accompagnate o meno da crampi, spesso scatenate dal freddo. Questi sintomi si verificano fino al 95% dei pazienti trattati. Among the antineoplastic drugs, platinum derivatives (cis platinum and oxaliplatin) are most affected by this type of neurological toxicity, which is a limiting factor in their use. The toxicity that limits the administration of oxaliplatin is neurological. It includes a peripheral sensory neuropathy characterized by dysesthesia and / or paresthesia of the extremities accompanied or not by cramps, often triggered by the cold. These symptoms occur in up to 95% of treated patients.

Il dolore neuropatico cronico à ̈ quindi un problema neurologico importante sia per la sua frequenza sia per la tendenza a cronicizzare e ad assumere un carattere invalidante. È inoltre un dolore che non risponde bene ai più comuni analgesici come acido acetilsalicilico, paracetamolo oppure ai più comuni farmaci antinfiammatori non steroidei. Chronic neuropathic pain is therefore an important neurological problem both for its frequency and for the tendency to become chronic and to assume a disabling character. It is also a pain that does not respond well to the most common analgesics such as acetylsalicylic acid, paracetamol or the most common non-steroidal anti-inflammatory drugs.

L’obiettivo dei trattamenti farmacologici dovrebbe essere la prevenzione o la scomparsa del dolore, ma con i trattamenti attualmente disponibili in realtà si riesce ad ottenere al massimo una riduzione del dolore ad un livello tollerabile. The goal of pharmacological treatments should be the prevention or disappearance of pain, but with the treatments currently available in reality it is possible to obtain a maximum reduction of pain to a tolerable level.

L’effetto dei farmaci sul dolore viene normalmente quantificato con una VAS (Visual analogic scale) o una scala numerica a 11 valori che permette la graduazione da “nessun dolore†a “ massimo dolore†. A questo si aggiunge spesso la valutazione della qualità della vita e del cambiamento percepito dal paziente o dal medico. The effect of drugs on pain is usually quantified with a VAS (Visual analogic scale) or a numerical scale with 11 values that allows the graduation from "no pain" to "maximum pain". To this is often added the evaluation of the quality of life and of the change perceived by the patient or doctor.

Ad oggi, nessuna classe di farmaci à ̈ stata provata come universalmente efficace per la prevenzione o la risoluzione del dolore dei pazienti con dolore neuropatico. To date, no drug class has been proven to be universally effective for the prevention or relief of pain in patients with neuropathic pain.

Si usano in genere dei farmaci “off label†appartenenti alle seguenti categorie, che però a lungo termine presentano importanti effetti collaterali: In general, off-label drugs belonging to the following categories are used, which however have important side effects in the long term:

- antidepressivi; - antidepressants;

- anticonvulsivanti (gabapentin): - anticonvulsants (gabapentin):

- oppioidi (metadone - oxicodone); - opioids (methadone - oxycodone);

- tramadolo; - tramadol;

- lidocaina; - lidocaine;

- antinfiammatori inibitori delle citochine. - anti-inflammatory cytokine inhibitors.

Gli antidepressivi, in particolare i triciclici, hanno un certo effetto positivo su alcuni tipi di dolore neuropatico. La loro efficacia à ̈ stata dimostrata per il dolore neuropatico di origine diabetica e traumatica, la neuralgia post erpetica, e quello da danno al midollo spinale. Sono però gravati da importanti effetti collaterali, quali anomalie della conduzione dello stimolo elettrico cardiaco, ritenzione urinaria, sedazione, vertigini, ipotensione ortostatica, secchezza delle fauci (Jensen et al.2009). Antidepressants, especially tricyclics, have some positive effect on some types of neuropathic pain. Their efficacy has been demonstrated for diabetic and traumatic neuropathic pain, post herpetic neuralgia, and spinal cord damage. However, they are burdened by important side effects, such as anomalies in the conduction of the cardiac electrical stimulus, urinary retention, sedation, dizziness, orthostatic hypotension, dry mouth (Jensen et al. 2009).

I gabapentinoidi con indicazioni approvate per il dolore neuropatico non sono composti ad azione specifica, ma hanno un’azione generale sulla ipereccitabilità neuronale, maccanismo comune a molte condizioni di dolore cronico, inclusa la fibromialgia e la Complex regional pain syndrome (CRPS). Gabapentin e pregabalin sono generalmente ben tollerati, tra i loro effetti collaterali vengono segnalati sedazione, vertigini e edemi periferici. Gabapentinoids with approved indications for neuropathic pain are not compounds with specific action, but have a general action on neuronal hyperexcitability, a mechanism common to many chronic pain conditions, including fibromyalgia and Complex regional pain syndrome (CRPS). Gabapentin and pregabalin are generally well tolerated, among their side effects sedation, dizziness and peripheral edema are reported.

Gli oppiodi sembrano essere efficaci nella riduzione dell’intensità del dolore neuropatico di origine diabetica, di quello postamputazione e della neuralgia post erpetica, oltre a quello da danno al midollo spinale. Questi farmaci però causano comunemente effetti negativi a carico della sfera cognitiva, costipazione e nausea, il loro utilizzo à ̈ limitato anche dal rischio di abuso del farmaco e di disfunzioni immunitarie e ormonali. Opioids appear to be effective in reducing the intensity of diabetic neuropathic pain, post-amputation pain and post-herpetic neuralgia, as well as spinal cord damage. However, these drugs commonly cause negative effects on the cognitive sphere, constipation and nausea, their use is also limited by the risk of drug abuse and immune and hormonal dysfunctions.

I vari farmaci anche quando risultano efficaci, ottengono una riduzione parziale del dolore: 25-40% nel 40-60% dei pazienti a fronte dei numerosi effetti collaterali indesiderati provocati dal loro impiego continuo. Even when the various drugs are effective, they obtain a partial reduction of pain: 25-40% in 40-60% of patients in the face of the numerous unwanted side effects caused by their continuous use.

E’ importante sottolineare che non esiste attualmente alcun trattamento efficace per prevenire o invertire questa condizione dolorosa. Gabapentin, pregabalin e acido alfalipoico sono quasi completamente privi di qualsiasi efficacia anti-iperalgesica. (Nanna, 2007; Bridges, 2001; Andrés J.D 2003, Fernihough J 2004; Jackson KC , 2006; Dworkin RH 2003, Taylor RS ). It is important to note that there is currently no effective treatment to prevent or reverse this painful condition. Gabapentin, pregabalin and alpha-lipoic acid are almost completely devoid of any antihyperalgesic efficacy. (Nanna, 2007; Bridges, 2001; Andrà © s J.D 2003, Fernihough J 2004; Jackson KC, 2006; Dworkin RH 2003, Taylor RS).

Da qui l’esigenza di un prodotto con funzione analgesica, ma privo di effetti collaterali importanti e limitanti come gli oppiodi o gli antiepilettici. Hence the need for a product with an analgesic function, but without important and limiting side effects such as opioids or antiepileptics.

Nella domanda di brevetto internazionale WO2009106263(A1) à ̈ descritto l’uso di estratti di iperico contenenti ipericina nel trattamento del dolore neuropatico. In the international patent application WO2009106263 (A1) the use of hypericum extracts containing hypericin in the treatment of neuropathic pain is described.

Il dolore neuropatico, a causa della sua gravità, cronicità, resistenza alla terapia abituale e gravi conseguenze sulla qualità della vita, rappresenta pertanto un importante necessità medica non soddisfatta. Neuropathic pain, due to its severity, chronicity, resistance to habitual therapy and serious consequences on the quality of life, therefore represents an important unmet medical need.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION

La presente invenzione riguarda una nuova miscela di composti di particolare efficacia per il trattamento del dolore neuropatico. The present invention relates to a new mixture of compounds of particular efficacy for the treatment of neuropathic pain.

L’efficacia della composizione della presente invenzione nel trattamento del dolore neuropatico à ̈ stata valutata in diversi modelli sperimentali. In particolare essa à ̈ stata analizzata in un modello in vivo, secondo quanto descritto in Cavalletti et al. 2001 (Cavalletti et al. “Effects of different schedules of oxaliplatin treatment on the peripheral nervous system of the rat<†>Eur. J. Cancer 37, 2457-2463 2001), per valutare la capacità di un determinato composto di far regredire una neuropatia indotta nel ratto mediante agenti chemioterapici. Questi esperimenti hanno evidenziato che l’efficacia della composizione nel far regredire il dolore neuropatico à ̈ potenziata dalla selezione di particolari componenti, ad esempio derivanti da fitocomplessi, in determinate proporzioni. The effectiveness of the composition of the present invention in the treatment of neuropathic pain has been evaluated in various experimental models. In particular, it was analyzed in an in vivo model, as described in Cavalletti et al. 2001 (Cavalletti et al.  € œEffects of different schedules of oxaliplatin treatment on the peripheral nervous system of the rat <â €> Eur. J. Cancer 37, 2457-2463 2001), to evaluate the ability of a given compound to regress an induced neuropathy in the rat by chemotherapeutic agents. These experiments have shown that the effectiveness of the composition in reversing neuropathic pain is enhanced by the selection of particular components, for example deriving from phytocomplexes, in certain proportions.

I dati sperimentali indicano che la composizione della presente invenzione à ̈ estremamente efficace nel trattamento del dolore neuropatico in pazienti con dolori neuropatici in genere, compresi quelli che hanno dolori neuropatici causati da trattamento con chemioterapici. In particolare, à ̈ stato visto e dimostrato che la composizione dell’invenzione ha il vantaggio di non inibire in alcun modo l’attività antitumorale del chemioterapico nei casi di dolore neuropatico provocato da chemioterapici. La presente descrizione riporta, nella sezione sperimentale, esperimenti in vitro (su linee cellulari) e in vivo (su topi) che hanno dimostrato che l’associazione di polifenoli (con una particolare composizione in flavonoidi e quercetina) con antocianosidi totali in determinate proporzioni secondo la presente descrizione (quindi la composizione dell’invenzione), pur aumentando l’efficacia nel trattamento del dolore neuropatico, non interferisce con l’attività del chemioterapico. Questa composizione presenta quindi il fondamentale vantaggio di permettere il trattamento del dolore neuropatico senza interferire con l’attività antitumorale del chemioterapico. Experimental data indicate that the composition of the present invention is extremely effective in the treatment of neuropathic pain in patients with neuropathic pain in general, including those who have neuropathic pain caused by treatment with chemotherapy. In particular, it has been seen and demonstrated that the composition of the invention has the advantage of not inhibiting in any way the antitumor activity of the chemotherapist in cases of neuropathic pain caused by chemotherapy. This description reports, in the experimental section, in vitro (on cell lines) and in vivo (on mice) experiments which have shown that the association of polyphenols (with a particular composition in flavonoids and quercetin) with total anthocyanosides in certain proportions according to the present description (hence the composition of the invention), while increasing the efficacy in the treatment of neuropathic pain, it does not interfere with the activity of the chemotherapeutic agent. This composition therefore has the fundamental advantage of allowing the treatment of neuropathic pain without interfering with the anticancer activity of the chemotherapy.

E’ oggetto della presente invenzione una composizione per uso terapeutico comprendente: The object of the present invention is a composition for therapeutic use comprising:

a) polifenoli tra il 3 ed il 9% in peso di detta composizione a) polyphenols between 3 and 9% by weight of said composition

di cui of which

a’) flavonoidi, esclusa la quercetina, tra l’1 ed il 7% in peso di detta composizione; a’’) quercetina tra lo 0,05 e lo 0,3% in peso di detta composizione; aâ € ™) flavonoids, excluding quercetin, between 1 and 7% by weight of said composition; aâ € ™ â € ™) quercetin between 0.05 and 0.3% by weight of said composition;

b) antocianosidi totali tra lo 0,1 e l’1% in peso. b) total anthocyanosides between 0.1 and 1% by weight.

Le composizioni secondo la presente invenzione sono caratterizzate dal fatto di non inibire l’attività antitumorale di un chemioterapico. The compositions according to the present invention are characterized by the fact that they do not inhibit the antitumor activity of a chemotherapeutic agent.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Fig. 1. Livelli in % di malonil dialdeide (MDA) rilevati nel saggio della lipoperossidazione. La figura mostra i valori di malonil dialdeide, saggiati su cellule trattate con le miscele riportate in Tabella 1 (ABO- ), rispetto ad un controllo di cellule non trattate (controllo) e rispetto ad un controllo di cellule trattate con reattivo di Fenton in assenza di composto (ossidazione). I valori riportati, proporzionali all’entità della reazione di lipoperossidazione, sono espressi in percentuale rispetto alla condizione di controllo e riportati come valore ± s.e.m. * p<0.01 rispetto al controllo; ^ p<0.01 rispetto al valore di ossidazione. Controllare l’esattezza di questa didascalia. Fig. 1. Levels in% of malonyl dialdehyde (MDA) detected in the lipoperoxidation assay. The figure shows the values of malonyl dialdehyde, tested on cells treated with the mixtures reported in Table 1 (ABO-), compared to a control of untreated cells (control) and compared to a control of cells treated with Fenton reagent in the absence of compound (oxidation). The reported values, proportional to the entity of the lipoperoxidation reaction, are expressed as a percentage with respect to the control condition and reported as a value ± s.e.m. * p <0.01 compared to the control; ^ p <0.01 with respect to the oxidation value. Check the accuracy of this caption.

Fig. 2. Livelli di NBT ossidato dall’anione superossido generato dalla reazione tra ipoxantina e xantina ossidasi. I valori di assorbanza relativi all’ossidazione di NBT sono espressi come valori di assorbanza ± s.e.m. * p<0.01 rispetto al controllo; ^ p<0.01 rispetto al valore di ossidazione. Fig. 2. Levels of NBT oxidized by the superoxide anion generated by the reaction between hypoxanthine and xanthine oxidase. The absorbance values related to NBT oxidation are expressed as absorbance values ± s.e.m. * p <0.01 compared to the control; ^ p <0.01 with respect to the oxidation value.

Fig. 3. Livelli di anione superossido liberato nelle colture di astrociti corticali di ratto in seguito a trattamento con oxaliplatino 100 µM. Le concentrazioni di anione superossido liberato nella colture cellulari sono espressi in µmol ± s.e.m. * p<0.01 rispetto al controllo; ^ p<0.01 rispetto al valore di ossidazione. Fig. 3. Levels of superoxide anion released in rat cortical astrocyte cultures following treatment with oxaliplatin 100 µM. The concentrations of superoxide anion released in cell cultures are expressed in µmol ± s.e.m. * p <0.01 compared to the control; ^ p <0.01 with respect to the oxidation value.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invenzione riguarda una composizione per uso terapeutico comprendente: The present invention relates to a composition for therapeutic use comprising:

a) polifenoli tra il 3 ed il 9% in peso di detta composizione a) polyphenols between 3 and 9% by weight of said composition

di cui of which

a’) flavonoidi, esclusa la quercetina, tra l’1 ed il 7% in peso di detta composizione; a’’) quercetina tra lo 0,05 e lo 0,3% in peso di detta composizione; aâ € ™) flavonoids, excluding quercetin, between 1 and 7% by weight of said composition; aâ € ™ â € ™) quercetin between 0.05 and 0.3% by weight of said composition;

b) antocianosidi totali tra lo 0,1 e l’1% in peso. b) total anthocyanosides between 0.1 and 1% by weight.

In una forma di realizzazione dell’invenzione, la composizione come descritta in qualsiasi parte della presente descrizione e delle rivendicazioni à ̈ una composizione per uso nel trattamento del dolore neuropatico. In one embodiment of the invention, the composition as described in any part of the present disclosure and claims is a composition for use in the treatment of neuropathic pain.

I polifenoli sono composti ubiquitari nel mondo vegetale ed hanno un ruolo fondamentale nella fisiologia della pianta, in quanto contribuiscono ai seguenti aspetti: Polyphenols are ubiquitous compounds in the plant world and play a fundamental role in the physiology of the plant, as they contribute to the following aspects:

• resistenza nei confronti di microrganismi e insetti; â € ¢ resistance to microorganisms and insects;

• pigmentazione; â € ¢ pigmentation;

• caratteristiche organolettiche. â € ¢ organoleptic characteristics.

La frutta ed i vegetali necessitano di una molteplicità di composti per preservare la loro integrità in quanto sono continuamente esposti a tensioni ambientali, come i raggi UV e le alte temperature. Questi fattori stimolano la sintesi di composti protettivi come le antocianine; ed infatti i vegetali e la frutta dell’area mediterranea proprio per la particolare combinazione di calore e luce ne sono particolarmente ricchi. Fruits and vegetables need a variety of compounds to preserve their integrity as they are continuously exposed to environmental tensions, such as UV rays and high temperatures. These factors stimulate the synthesis of protective compounds such as anthocyanins; and in fact the vegetables and fruit of the Mediterranean area are particularly rich in it due to the particular combination of heat and light.

Il termine polifenoli include parecchie classi di composti con una struttura chimica comune: sono derivati del benzene con uno o più gruppi idrossilici associati all’anello. Questa struttura consente a tali composti di funzionare attivamente da antiossidanti in quanto stabilizzano chimicamente i radicali liberi, fungono inoltre da chelanti di metalli pro-ossidanti e quencher della formazione di ossigeno singoletto. I polifenoli costituiscono i principi attivi di molte piante medicinali e i meccanismi d’azione responsabili della loro attività farmacologica non sono ancora completamente conosciuti. Generalmente influenzano la qualità, l’accettabilità e la stabilità dell’alimento agendo come aromatizzanti, coloranti e antiossidanti. The term polyphenols includes several classes of compounds with a common chemical structure: they are derivatives of benzene with one or more hydroxyl groups associated with the ring. This structure allows such compounds to actively function as antioxidants as they chemically stabilize free radicals, they also act as pro-oxidant metal chelators and quenchers of singlet oxygen formation. Polyphenols are the active principles of many medicinal plants and the mechanisms of action responsible for their pharmacological activity are not yet fully known. Generally they influence the quality, acceptability and stability of the food by acting as flavoring, coloring and antioxidants.

Secondo la presente descrizione per polifenoli totali s’intendono tutte le molecole comprendenti almeno una funzione fenolica come ad esempio fenoli semplici e flavonoidi. According to the present description by total polyphenols we mean all the molecules comprising at least one phenolic function such as simple phenols and flavonoids.

I polifenoli totali della composizione della presente invenzione potranno essere ottenuti da estratti di vegetali di Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis, Malpighia glabra Curcuma longa, Curcuma xantorrhiza. The total polyphenols of the composition of the present invention can be obtained from plant extracts of Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis, Malpighia glabra Curcuma longa, Curcuma xantorrhiza.

Tali estratti potranno essere estratti idroalcolici, estratti idroalcolici liofilizzati, estratti secchi, estratti molli, granulati o loro miscele. These extracts can be hydroalcoholic extracts, freeze-dried hydroalcoholic extracts, dry extracts, soft extracts, granulates or their mixtures.

Gli estratti come sopra definiti potranno essere preparati secondo un qualsiasi metodo comunemente utilizzato dal tecnico del settore. The extracts as defined above can be prepared according to any method commonly used by those skilled in the art.

La percentuale in peso di polifenoli totali nella composizione della presente invenzione potrà variare tra il 3 ed il 9% in peso, ad esempio potrà essere circa il 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 5,7%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5% e 9% in peso della composizione. E’ evidente che anche tutti gli altri numeri oltre a quelli sopra indicati puntualmente, inclusi i decimali, compresi nell’intervallo tra 3 e 9 sono da intendersi esplicitamente parte della presente invenzione. The percentage by weight of total polyphenols in the composition of the present invention can vary between 3 and 9% by weight, for example it can be about 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5 , 5%, 5.7%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5% and 9% by weight of the composition. It is evident that also all the other numbers besides those indicated above punctually, including decimals, included in the interval between 3 and 9 are to be understood explicitly as part of the present invention.

La concentrazione di polifenoli totali nella composizione potrà essere espressa come contenuto di acido gallico e potrà essere determinata, ad esempio, mediante la reazione di Folin-Ciocalteu, reazione che prevede l’estrazione delle sostanze fenoliche in etanolo 45% e la reazione dell’estratto con il reattivo di folin in ambiente basico con sodio carbonato al 20%. Dopo due ore si legge l’assorbanza a 760nm. The concentration of total polyphenols in the composition can be expressed as the content of gallic acid and can be determined, for example, by the Folin-Ciocalteu reaction, which involves the extraction of phenolic substances in 45% ethanol and the reaction of ™ extracted with folin reagent in a basic environment with 20% sodium carbonate. After two hours the absorbance is read at 760nm.

Tale determinazione includerà tra i polifenoli totali anche i flavonoidi e quindi anche la quercetina e quegli antocianosidi che comprendono almeno un gruppo fenolico. This determination will include among the total polyphenols also the flavonoids and therefore also the quercetin and those anthocyanosides which include at least one phenolic group.

Pertanto, nei valori indicati come polifenoli totali, saranno compresi anche alcuni ma non tutti antocianosidi. Di conseguenza à ̈ fornita nella presente descrizione anche una misura degli antocianosidi totali che comprenda anche tutti gli antocianosidi privi di gruppo fenolico. Therefore, some but not all anthocyanosides will be included in the values indicated as total polyphenols. Consequently, a measurement of the total anthocyanosides is also provided in the present description which also includes all the anthocyanosides without the phenolic group.

I flavonoidi dal punto di vista chimico sono dei difenilpropani distinti in varie classi a seconda del grado di ossidazione dell’anello eterociclico. Costituiscono una categoria di sostanze polifunzionali ad elevata bioattività, comprese nei polifenoli, che comprende più di 5000 composti. From the chemical point of view, flavonoids are distinct diphenylpropanes in various classes according to the degree of oxidation of the heterocyclic ring. They constitute a category of polyfunctional substances with high bioactivity, included in polyphenols, which includes more than 5000 compounds.

Possiedono proprietà biochimiche d’interesse funzionale nel campo nutrizionale e terapeutico. They possess biochemical properties of functional interest in the nutritional and therapeutic fields.

E’ stato dimostrato che i flavonoidi hanno un ruolo importante nella cardioprotezione, dal momento che molti studi riportano che diete ricche in flavonoidi riducono il rischio di malattie cardiovascolari. Flavonoids have been shown to play an important role in cardioprotection, since many studies report that diets rich in flavonoids reduce the risk of cardiovascular disease.

I flavonoidi favoriscono anche la neuro protezione e fungono, inoltre, da detossificanti in quanto aumentano l’attività degli enzimi della fase II, deputati all’eliminazione di metaboliti ad azione tossica per l’organismo. Flavonoids also promote neuro-protection and also act as detoxifiers as they increase the activity of phase II enzymes, responsible for eliminating metabolites with toxic action for the body.

I flavonoidi della composizione della presente invenzione potranno essere ottenuti da estratti di vegetali, come sopra indicati di Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolymus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis. The flavonoids of the composition of the present invention can be obtained from plant extracts, as indicated above, of Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolymus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis.

La percentuale in peso di flavonoidi esclusa la quercetina nella composizione della presente invenzione potrà variare tra l’1 ed il 7% in peso, circa 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 5,7%, 6%, 6,5%, 7%, in peso della composizione. E’ evidente che anche tutti gli altri numeri oltre a quelli sopra indicati puntualmente, inclusi i decimali, compresi nell’intervallo tra 1 e 7 sono da intendersi esplicitamente parte della presente invenzione. The percentage by weight of flavonoids excluding quercetin in the composition of the present invention may vary between 1 and 7% by weight, approximately 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3, 5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 5.7%, 6%, 6.5%, 7%, by weight of the composition. It is evident that all the other numbers besides those indicated above punctually, including decimals, included in the interval between 1 and 7 are to be explicitly understood as part of the present invention.

La concentrazione di flavonoidi esclusa la quercetina nella composizione, potrà essere determinata ad esempio facendo reagire una soluzione metanolica contenete i flavonoidi da analizzare con una soluzione di acido borico ed acido ossalico in acido acetico ed acido formico e leggendo l’assorbanza della soluzione contenente i flavonoidi a 425 nm. The concentration of flavonoids excluding quercetin in the composition, can be determined for example by reacting a methanolic solution containing the flavonoids to be analyzed with a solution of boric acid and oxalic acid in acetic acid and formic acid and reading the absorbance of the solution containing the flavonoids at 425 nm.

La quercetina à ̈ un composto naturale ampiamente diffuso nel mondo vegetale e fa parte del gruppo di flavonoidi classificati come flavonoli. Quercetin is a natural compound widely found in the plant world and is part of the group of flavonoids classified as flavonols.

E’ chiamata anche meletina o sofretina ed à ̈ un flavonolo con azione anti-ossidante, anti-infiammatoria, anti-virale, immunomodulatoria, anticancro, e gastroprotettiva. Si riconoscono inoltre azione anti-allergica e preventiva delle complicazioni secondarie del diabete. It is also called meletin or sofretin and is a flavonol with anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-viral, immunomodulatory, anti-cancer, and gastroprotective action. They also recognize anti-allergic and preventive action of the secondary complications of diabetes.

L’alimentazione occidentale generalmente fornisce un apporto giornaliero di flavonoli compreso tra 20-50 mg e la maggior parte di questo à ̈ rappresentato da glicosidi della quercetina, del caempferolo e della miricetina. Di questi, circa 13,82 mg sono rappresentati da glicosidi della quercetina. È contenuta in diversi frutti come ad es. mela, bacche, brassicacee, pomodori, tà ̈, cipolle, ecc. ed anche in estratti (anche estratti idroalcolici) di Hypericum perforatum, Camelia sinensis, Sylibum marianum, Vaccinium myrtillus. Western nutrition generally provides a daily intake of flavonols between 20-50 mg and most of this is represented by glycosides of quercetin, caempferol and myricetin. Of these, about 13.82 mg are represented by quercetin glycosides. It is contained in various fruits such as eg. apple, berries, brassicas, tomatoes, tea, onions, etc. and also in extracts (including hydroalcoholic extracts) of Hypericum perforatum, Camelia sinensis, Sylibum marianum, Vaccinium myrtillus.

La percentuale in peso di quercetina nella composizione della presente invenzione potrà variare dallo 0,05% allo 0,3% in peso, ad esempio 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%,0,09%,0,1%, 0,11%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19%, 0,2%, 0,21%, 0,22%, 0,23%, 0,24%, 0,25%, 0,26%, 0,27%, 0,28%, 0,29%, 0,3% in peso della composizione. The percentage by weight of quercetin in the composition of the present invention may vary from 0.05% to 0.3% by weight, for example 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0, 09%, 0.1%, 0.11%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.18%, 0.19%, 0, 2%, 0.21%, 0.22%, 0.23%, 0.24%, 0.25%, 0.26%, 0.27%, 0.28%, 0.29%, 0, 3% by weight of the composition.

La concentrazione di quercetina nella composizione potrà essere determinata, ad esempio, mediante HPLC in fase mobile e misurando la lunghezza d’onda a 370 nm. Gli antocianosidi sono una classe di pigmenti vegetali poliaromatici poliossidrilati in grado di reagire con gli ossidanti quali l'ossigeno molecolare e i radicali liberi riducendo così i danni che queste molecole possono provocare alle cellule e ai tessuti. The concentration of quercetin in the composition can be determined, for example, by HPLC in the mobile phase and by measuring the wavelength at 370 nm. Anthocyanosides are a class of polyhydroxylated polyaromatic plant pigments capable of reacting with oxidants such as molecular oxygen and free radicals thus reducing the damage these molecules can cause to cells and tissues.

Si ritrovano nei fiori e frutti così come negli arbusti e nelle foglie autunnali di alcune piante. Il colore degli antocianosidi può variare dal rosso al blu e dipende dal pH del mezzo in cui si trovano e dalla formazione di sali con metalli pesanti presenti in quei tessuti. They are found in flowers and fruits as well as in the shrubs and autumn leaves of some plants. The color of anthocyanosides can vary from red to blue and depends on the pH of the medium in which they are found and on the formation of salts with heavy metals present in those tissues.

Gli antocianosidi della composizione della presente invenzione potranno essere ottenuti da estratti di vegetali, come ad esempio estratti idroalcolici, di vitis vinifera, Vaccinium myrtillus, Hibiscus sabdariffa. The anthocyanosides of the composition of the present invention can be obtained from plant extracts, such as for example hydroalcoholic extracts, of vitis vinifera, Vaccinium myrtillus, Hibiscus sabdariffa.

La percentuale in peso degli antocianosidi totali (comprendente anche gli antocianosidi aventi gruppi fenolici) nella composizione della presente invenzione potrà variare dallo 0,1 all’1% in peso, ad esempio 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% in peso della composizione. The percentage by weight of the total anthocyanosides (including also the anthocyanosides having phenolic groups) in the composition of the present invention may vary from 0.1 to 1% by weight, for example 0.1%, 0.2%, 0.3 %, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1% by weight of the composition.

La concentrazione degli antocianosidi totali nella composizione potrà essere determinata, ad esempio, mediante un test che prevede l’estrazione del campione con HCl 0,1% in MeOH al riparo dalla luce e la successiva lettura della soluzione ottenuta a 540 nm. The concentration of total anthocyanosides in the composition can be determined, for example, by means of a test which involves the extraction of the sample with 0.1% HCl in MeOH away from light and the subsequent reading of the solution obtained at 540 nm.

Per la preparazione degli estratti vegetali da utilizzare nella composizione della presente invenzione potranno essere usati i metodi convenzionali noti al tecnico del settore che quindi non necessitano di ulteriore descrizione. For the preparation of the vegetable extracts to be used in the composition of the present invention, conventional methods known to those skilled in the art can be used and therefore do not require further description.

Tali estratti potranno essere estratti idroalcolici, estratti idroalcolici liofilizzati, estratti secchi, estratti molli, granulati o loro miscele. These extracts can be hydroalcoholic extracts, freeze-dried hydroalcoholic extracts, dry extracts, soft extracts, granulates or their mixtures.

Qualsiasi metodo di estrazione noto al tecnico del settore può essere utilizzato per preparare l'estratto di secondo l'invenzione, ad esempio, mediante la preparazione di estratti acquosi o alcolici o di estratti ottenibili mediante solventi organici. Il termine "solvente acquoso" indica qualsiasi solvente composto totalmente o parzialmente di acqua. Tale termine potrà quindi definire l’acqua stessa, soluzioni idroalcoliche in qualsiasi proporzione o solventi composti da acqua e da un composto come il propilen glicole in qualsiasi proporzione. Tra i solventi alcolici, si può citare in particolare l’etanolo. L’estratto finale potrà essere preparato ad esempio in forma di estratto secco, molle, liofilizzato, granulato, secondo i metodi noti nello stato della tecnica. Estratti vegetali liofilizzati potranno essere preparati per evaporazione (sublimazione) totale del solvente dopo concentrazione dell’estratto idroalcolico e congelamento dell’estratto così ottenuto. Detta evaporazione potrà essere realizzata a temperature inferiori a 50°C, ad esempio inferiori a 40°C in modo da non alterare i principi attivi. Any extraction method known to those skilled in the art can be used to prepare the extract according to the invention, for example, by preparing aqueous or alcoholic extracts or extracts obtainable by means of organic solvents. The term "aqueous solvent" means any solvent that is wholly or partially composed of water. This term can therefore define water itself, hydroalcoholic solutions in any proportion or solvents composed of water and a compound such as propylene glycol in any proportion. Among the alcoholic solvents, ethanol can be mentioned in particular. The final extract can be prepared for example in the form of dry, soft, lyophilized, granulated extract, according to the methods known in the state of the art. Freeze-dried plant extracts can be prepared by total evaporation (sublimation) of the solvent after concentration of the hydroalcoholic extract and freezing of the extract thus obtained. Said evaporation can be carried out at temperatures below 50 ° C, for example below 40 ° C so as not to alter the active ingredients.

Secondo la presente descrizione, quindi, sono possibili diverse forme di realizzazione della composizione dell’invenzione, ne saranno di seguito indicate alcune. According to the present description, therefore, different embodiments of the composition of the invention are possible, some of them will be indicated below.

In una forma di realizzazione i polifenoli totali sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis, in cui i flavonoidi sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis, la quercetina à ̈ ottenuta da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Camelia sinenis, Sylibum marianum, Vaccinium myrtillus, gli antocianosidi sono ottenuti da estratti di uno o più tra Vitis vinifera e/o Vaccinium myrtillus. In one embodiment, the total polyphenols are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis, in which the flavonoids are obtained from extracts of one or more between Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis, quercetin is obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Camelia sinenis, Sylibum marianum, Vaccinium myrtillusidi, the anthocyanins are obtained from extracts of one or more of Vitis vinifera and / or Vaccinium myrtillus.

In un’altra forma di realizzazione i polifenoli totali sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Vitis vinifera, Rosmarinus officinalis, in cui i flavonoidi sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Vitis vinifera, Rosmarinus officinalis, la quercetina à ̈ ottenuta da estratti di Hypericum perforatum, gli antocianosidi sono ottenuti da estratti di Vitis vinifera. In another embodiment, the total polyphenols are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Vitis vinifera, Rosmarinus officinalis, in which the flavonoids are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Vitis vinifera, Rosmarinus officinalis , quercetin is obtained from Hypericum perforatum extracts, anthocyanosides are obtained from Vitis vinifera extracts.

Secondo un’altra forma di realizzazione i polifenoli totali sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Rosmarinus officinalis, in cui i flavonoidi sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Rosmarinus officinalis, la quercetina à ̈ ottenuta da estratti di Hypericum perforatum, gli antocianosidi sono ottenuti da estratti di Vitis vinifera. According to another embodiment, the total polyphenols are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Rosmarinus officinalis, in which the flavonoids are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Rosmarinus officinalis, quercetin is obtained from extracts of Hypericum perforatum, anthocyanosides are obtained from extracts of Vitis vinifera.

In un’altra forma di realizzazione , i polifenoli totali sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Vitis vinifera, in cui i flavonoidi sono ottenuti da estratti di uno o più tra Hypericum perforatum, Vitis vinifera, la quercetina à ̈ ottenuta da estratti di Hypericum perforatum, gli antocianosidi sono ottenuti da estratti di Vitis vinifera. In another embodiment, the total polyphenols are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Vitis vinifera, in which the flavonoids are obtained from extracts of one or more of Hypericum perforatum, Vitis vinifera, quercetin is obtained from Hypericum perforatum extracts, anthocyanosides are obtained from Vitis vinifera extracts.

In una ulteriore forma di realizzazione, i polifenoli totali sono ottenuti da estratti di Hypericum perforatum e/o Cynara scolymus e/o Rosmarinus officinalis, in cui i flavonoidi sono ottenuti da estratti di Hypericum perforatum e/o Cynara scolymus, la quercetina à ̈ ottenuta da estratti di Hypericum perforatum, gli antocianosidi sono ottenuti da estratti di Vitis vinifera e/o Vaccinium myrtillus. In a further embodiment, the total polyphenols are obtained from extracts of Hypericum perforatum and / or Cynara scolymus and / or Rosmarinus officinalis, in which the flavonoids are obtained from extracts of Hypericum perforatum and / or Cynara scolymus, quercetin is obtained from extracts of Hypericum perforatum, anthocyanosides are obtained from extracts of Vitis vinifera and / or Vaccinium myrtillus.

In un ulteriore forma di realizzazione detti polifenoli sono ottenuti da estratti di Hypericum perforatum e Rosmarinus officinalis, in cui detti flavonoidi sono ottenuti da estratti di Hypericum perforatum, detta quercetina à ̈ ottenuta da estratti di Hypericum perforatum e detti antocianosidi sono ottenuti da estratti di Vitis vinifera. In a further embodiment said polyphenols are obtained from Hypericum perforatum and Rosmarinus officinalis extracts, in which said flavonoids are obtained from Hypericum perforatum extracts, said quercetin is obtained from Hypericum perforatum extracts and said anthocyanosides are obtained from Vitis extracts vinifera.

L’iperico perforato (Hypericum perforatum), noto anche come Erba di San Giovanni, à ̈ una specie appartenente al genere Hypericum, contiene un gran numero di differenti classi di sostanze: derivati del naftodiantrone come l’ipericina, pseudoipericina e isoipericina, e derivati del floroglucinolo come l’iperforina. Contiene anche flavonoidi come iperossido, rutina, quercetina, quercitrina e isoquercitrina, procianidine, oli essenziali e xantani. Hypericum perforated (Hypericum perforatum), also known as St. John's wort, is a species belonging to the genus Hypericum, it contains a large number of different classes of substances: derivatives of naphtho-anthrax such as hypericin, pseudohyperericin and isoipericin, and derivatives of phloroglucinol such as hyperforin. It also contains flavonoids such as hyperoxide, rutin, quercetin, quercitrin and isoquercitrin, procyanidins, essential oils and xanthans.

Dagli studi effettuati dai presenti inventori risulta che estratti liofilizzati di Hypericum perforatum contengono circa il 10-14 % di polifenoli espressi come % di acido gallico, in particolare tra il 6 e l’8% dell’estratto di iperico à ̈ rappresentato da flavonoidi totali, e tra l’1,2 e l’1,7% dell’estratto di iperico à ̈ rappresentato da quercetina. L’estratto non contiene antocianosidi. From the studies carried out by the present inventors it appears that lyophilized extracts of Hypericum perforatum contain about 10-14% of polyphenols expressed as% of gallic acid, in particular between 6 and 8% of the hypericum extract is represented by total flavonoids, and between 1.2 and 1.7% of the hypericum extract is represented by quercetin. The extract does not contain anthocyanosides.

Per la preparazione dell’estratto sono usate come materia prima sia le sommità fiorite che l’intera pianta appartenente a detta specie. Le procedure per essiccare le piante o parti di essa sono note al tecnico del settore e non necessitano qui di ulteriore descrizione. In una forma di realizzazione, detto estratto à ̈ ottenibile in forma liquida utilizzando un idoneo solvente o miscela di solventi scelti nel gruppo comprendente etanolo, acqua, acqua distillata, esteri, eteri, acetone o una miscela idroalcolica, ad esempio all'80, 75, 70, 60% di alcool in acqua. For the preparation of the extract both the flowering tops and the entire plant belonging to this species are used as raw material. The procedures for drying the plants or parts thereof are known to those skilled in the art and need no further description here. In one embodiment, said extract can be obtained in liquid form using a suitable solvent or mixture of solvents selected from the group comprising ethanol, water, distilled water, esters, ethers, acetone or a hydroalcoholic mixture, for example 80, 75 , 70, 60% alcohol in water.

Naturalmente, l'estratto può essere preparato da almeno una delle molte varietà appartenenti alla specie Hypericum perforatum (Iperico perforato). E' dunque inteso che, nella presente descrizione, il termine "Hypericum perforatum" o “Iperico perforato†o “Iperico†deve essere considerato come indicare una qualsiasi delle molte varietà di piante appartenenti alla specie Hypericum perforatum. Of course, the extract can be prepared from at least one of the many varieties belonging to the Hypericum perforatum species (Hypericum perforated). It is therefore understood that, in the present description, the term "Hypericum perforatum" or "Hypericum perforatum" or "Hypericum" must be considered as indicating any of the many varieties of plants belonging to the species Hypericum perforatum.

La specie Vitis vinifera comprende un numero elevatissimo di vitigni diversi, alcuni di questi, per la particolare colorazione fogliare, sono definiti come “vite rossa†. In una forma particolare di realizzazione dell’invenzione il termine Vitis vinifera à ̈ inteso essere limitato a vitigni di vite rossa. Per la preparazione dell’estratto di vite rossa secondo la presente invenzione possono essere utilizzati materiali vegetali derivati dalle foglie in tutti i suoi stadi di sviluppo. L'estratto può essere preparato da almeno una delle molte varietà appartenenti alla specie Vitis vinifera che ricadono nella definizione di vite rossa. E' dunque inteso che, nella presente descrizione, il termine “vite rossa†o “vite†deve essere considerato come indicare una qualsiasi delle molte varietà di piante appartenenti alla specie Vitis vinifera comunemente definite come “vite rossa†. The Vitis vinifera species includes a very high number of different vines, some of these, due to the particular leaf color, are defined as â € œred vineâ €. In a particular embodiment of the invention the term Vitis vinifera is intended to be limited to red grape varieties. For the preparation of the red vine extract according to the present invention, plant materials derived from the leaves in all its stages of development can be used. The extract can be prepared from at least one of the many varieties belonging to the Vitis vinifera species that fall under the definition of red vine. It is therefore understood that, in the present description, the term â € œred vineâ € or â € œscrewâ € must be considered as indicating any of the many varieties of plants belonging to the Vitis vinifera species commonly defined as â € œred vineâ €.

Il Rosmarinus officinalis noto anche come rosmarino à ̈ una specie appartenente al genere Rosmarinus, contiene differenti classi di sostanze tra le quali il pinene, canfene, cineolo, eucaliptolo, canfora, borneolo, diterpeni fenolici quali carnosolo e acido carnosico, derivati idrossicinnamici quali acido rosmarinico, flavonoidi quali nepetina e triterpenoidi quali acido oleanoico. Rosmarinus officinalis also known as rosemary is a species belonging to the genus Rosmarinus, it contains different classes of substances including pinene, camphene, cineol, eucalyptol, camphor, borneol, phenolic diterpenes such as carnosol and carnosic acid, hydroxycinnamic derivatives such as rosmarinic acid , flavonoids such as nepetin and triterpenoids such as oleanoic acid.

Naturalmente, l'estratto può essere preparato da almeno una delle molte varietà appartenenti alla specie Rosmarinus officinalis. E' dunque inteso che, nella presente descrizione, il termine "Rosmarinus officinalis" o “rosmarino†deve essere considerato come indicare una qualsiasi delle molte varietà di piante appartenenti alla specie Rosmarinus officinalis. Of course, the extract can be prepared from at least one of the many varieties belonging to the Rosmarinus officinalis species. It is therefore understood that, in the present description, the term "Rosmarinus officinalis" or â € œrosemaryâ € must be considered as indicating any of the many varieties of plants belonging to the Rosmarinus officinalis species.

Punica granatum, comunemente noto come melograno, Ã ̈ un fruttifero arbusto deciduo o piccolo albero che cresce tra i cinque e gli otto metri di altezza. Punica granatum, commonly known as pomegranate, is a fruit-bearing deciduous shrub or small tree that grows between five and eight meters in height.

Silybum marianum, comunemente noto come Cardo Mariano, Ã ̈ una pianta annuale o biennale della famiglia delle Asteraceae. Le parti della pianta usate per ottenere gli estratti sono i semi maturi. Silybum marianum, commonly known as Milk Thistle, is an annual or biennial plant of the Asteraceae family. The parts of the plant used to obtain the extracts are the ripe seeds.

Cynara scolimus à ̈ una pianta appartenente alla specie Cynara cardunculus (var. Scolymus) originaria del Sud Europa. Le parti della pianta usate per ottenere gli estratti sono le foglie basali, intere o ridotte in frammenti. Cynara scolimus is a plant belonging to the species Cynara cardunculus (var. Scolymus) native to Southern Europe. The parts of the plant used to obtain the extracts are the basal leaves, whole or reduced in fragments.

Camelia sinensis à ̈ la specie di pianta le cui foglie e boccioli di foglie sono usati per la produzione di tà ̈ verde. E' una pianta appartenente al genere Camellia. Camelia sinensis is the plant species whose leaves and leaf buds are used for the production of green tea. It is a plant belonging to the Camellia genus.

La pianta del Mirtillo (Vaccinium myrtillus) cresce in Europa, Nord America e Asia. Le parti della pianta usate per ottenere gli estratti sono le bacche. Tra i composti presenti negli estratti di mirtillo ci sono i tannini, flavonoidi glicosidici, acidi fenolici, pectine, triterpeni, polifenoli quali procianidine e antocianodine The Blueberry plant (Vaccinium myrtillus) grows in Europe, North America and Asia. The parts of the plant used to obtain the extracts are the berries. Among the compounds present in blueberry extracts are tannins, glycosidic flavonoids, phenolic acids, pectins, triterpenes, polyphenols such as procyanidins and anthocyanins

Curcuma longa à ̈ una pianta erbacea perenne rizomatosa della famiglia dello zenzero, Zingiberaceae. L’estratto à ̈ preparato per estrazione con solvente dal rizoma essiccato e macinato. Curcuma longa is a rhizomatous herbaceous perennial plant of the ginger family, Zingiberaceae. The extract is prepared by solvent extraction from the dried and ground rhizome.

In una forma di realizzazione le composizioni della presente invenzione comprendono ulteriormente Vitamina B1, Vitamina B6 e/o Vitamina B12. Le vitamine del complesso B sono a completamento dell’azione del prodotto, data le loro proprietà di rigenerazione del sistema nervoso. La combinazione di vitamina B1, B6 e B12 agisce in maniera sinergica nel trattamento del dolore neuropatico con gli altri composti della composizione della presente invenzione migliorando l’allodinia, l’iperalgesia e la velocità di conduzione del nervo. In one embodiment the compositions of the present invention further comprise Vitamin B1, Vitamin B6 and / or Vitamin B12. The vitamins of the B complex complement the action of the product, given their regenerative properties of the nervous system. The combination of vitamins B1, B6 and B12 acts synergistically in the treatment of neuropathic pain with the other compounds of the composition of the present invention by improving allodynia, hyperalgesia and the speed of nerve conduction.

In particolare, la vitamina B1 potrà essere presente in una concentrazione in peso di composizione compresa tra circa lo 0,005% e lo 0,01%; la vitamina B6 potrà essere presente in una concentrazione in peso di composizione compresa tra circa lo 0,005% e lo 0,01%. In particular, vitamin B1 may be present in a composition by weight of between about 0.005% and 0.01%; vitamin B6 may be present in a composition by weight of between about 0.005% and 0.01%.

In una forma di realizzazione le composizioni della presente invenzione comprendono anche pappa reale e/o lievito di birra e/o spirulina o loro derivati. La presenza nella composizione della pappa reale presenta il vantaggio di apportare aminoacidi essenziali, l’aggiunta di lievito di birra o delle vitamine da esso derivate presenta il vantaggio di apportare vitamina B1, mentre l’aggiunta di spirulina presenta il vantaggio di apportare vitamina B12. Tali nutrienti hanno tutti effetti benefici sul corretto funzionamento della trasmissione nervosa e quindi indirettamente sul trattamento del dolore neuropatico. In one embodiment the compositions of the present invention also comprise royal jelly and / or brewer's yeast and / or spirulina or derivatives thereof. The presence in the composition of royal jelly has the advantage of providing essential amino acids, the addition of brewer's yeast or vitamins derived from it has the advantage of providing vitamin B1, while the addition of spirulina has the advantage of providing vitamin B12. These nutrients all have beneficial effects on the correct functioning of nerve transmission and therefore indirectly on the treatment of neuropathic pain.

La pappa reale potrà essere ad esempio in una percentuale tra il 10 ed il 30% in peso della composizione. Il lievito di birra potrà essere ad esempio in una percentuale tra il 20 ed il 40% in peso della composizione. La spirulina in una percentuale in peso tra il 10 e il 30% in peso della composizione. L’uso di pappa reale in queste percentuali determina un buon apporto di aminoacidi essenziali e ramificati, in grado di contrastare l’aumentato turn-over delle proteine e conseguente perdita di tono muscolare dovuto all’elevato catabolismo che si verifica nelle persone affette da tumori. Royal jelly could be for example in a percentage between 10 and 30% by weight of the composition. The brewer's yeast may, for example, be in a percentage between 20 and 40% by weight of the composition. Spirulina in a percentage by weight between 10 and 30% by weight of the composition. The use of royal jelly in these percentages determines a good supply of essential and branched amino acids, able to counteract the increased turnover of proteins and consequent loss of muscle tone due to the high catabolism that occurs in people suffering from tumors.

Rientrano nell’ambito di tutela della presente invenzione anche tutte le composizioni comprendenti i composti a), a’), a’’) e b) nei relativi rapporti ponderali sopra descritti. Le composizioni secondo la presente invenzione sono estremamente efficaci nel trattamento, inteso anche come profilassi e terapia, del dolore neuropatico in genere. In particolare, potranno essere usate nel trattamento del dolore neuropatico causato da un trattamento con un farmaco, in particolare con un farmaco chemioterapico (ad esempio un trattamento con oxaliplatino, vincristina, vinblastina, paclitaxel, cisplatino, taxano, epotiloni, bortemozide, alcaloidi della vinca), da malattie croniche, traumi, esposizione a sostanze chimiche tossiche, un’infezione in corso, un’infezione pregressa, funzione alterata di un organo, malattie vascolari, malattie metaboliche, malattie autoimmuni o quando non si conosce la causa (dolore neuropatico idiopatico). Le composizioni potranno anche essere usate nel trattamento del dolore neuropatico descritto come neuropatia diabetica periferica, nevralgia erpetica postale, nevralgia del trigemino, dolore neuropatico della parte bassa della schiena, distrofia simpatica riflessa, sindrome dell'arto fantasma. Laddove tali dolori possano dipendere da cause diverse, à ̈ chiaro che la composizione della presente invenzione risulta efficace indipendentemente dalle cause a monte di tali sintomatologie, indipendentemente dal fatto che siano da attribuire all’uso di chemioterapici o ad altre cause. All compositions including compounds a), aâ € ™), aâ € ™ â € ™) and b) in the relative weight ratios described above also fall within the scope of protection of the present invention. The compositions according to the present invention are extremely effective in the treatment, also intended as prophylaxis and therapy, of neuropathic pain in general. In particular, they can be used in the treatment of neuropathic pain caused by a treatment with a drug, in particular with a chemotherapy drug (for example a treatment with oxaliplatin, vincristine, vinblastine, paclitaxel, cisplatin, taxane, epothilones, bortemozide, vinca alkaloids ), from chronic diseases, trauma, exposure to toxic chemicals, an ongoing infection, a previous infection, impaired organ function, vascular disease, metabolic disease, autoimmune disease or when the cause is unknown (pain idiopathic neuropathic). The compositions can also be used in the treatment of neuropathic pain described as diabetic peripheral neuropathy, post herpetic neuralgia, trigeminal neuralgia, neuropathic pain of the lower back, reflex sympathetic dystrophy, phantom limb syndrome. Where such pains may depend on different causes, it is clear that the composition of the present invention is effective regardless of the underlying causes of these symptoms, regardless of whether they are attributable to the use of chemotherapeutic agents or to other causes.

Il dosaggio delle composizioni potrà variare in funzione dell’età, del sesso e delle condizioni generali del paziente, della natura e della gravità della patologia o disturbo. Per la determinazione del dosaggio si dovrà quindi tener conto, della condizione da trattare, della severità della condizione da trattare, dell’età, del peso e delle condizioni fisiche generali del particolare paziente così come da altre medicine che il paziente sta assumendo, com’à ̈ ben noto agli esperti del settore. The dosage of the compositions may vary according to the age, sex and general conditions of the patient, the nature and severity of the pathology or disorder. For the determination of the dosage it will therefore be necessary to take into account the condition to be treated, the severity of the condition to be treated, the age, weight and general physical condition of the particular patient as well as other medicines that the patient is taking, as it is well known to the experts of the sector.

La composizione della presente invenzione potrà essere somministrata anche in associazione o in concomitanza o sequenzialmente con altri farmaci che potranno essere farmaci chemioterapici come quelli sopra riportati o anche farmaci per il trattamento di una o più delle condizioni patologiche sopra indicate. The composition of the present invention may also be administered in association or concomitantly or sequentially with other drugs which may be chemotherapeutic drugs such as those listed above or also drugs for the treatment of one or more of the pathological conditions indicated above.

È quindi evidente che detto quantitativo efficace può essere all’occorrenza abbassato o aumentato secondo le risposte del paziente trattato e/o secondo la valutazione del medico che prescrive le associazioni e/o le composizioni della presente invenzione. La composizione potrà essere somministrata per via orale. It is therefore evident that said effective quantity can be lowered or increased if necessary according to the responses of the patient treated and / or according to the evaluation of the doctor who prescribes the combinations and / or compositions of the present invention. The composition can be administered orally.

Tipicamente composizioni, per uso orale in forma solida, possono contenere una quantità per unità di dosaggio di polifenoli compresa tra 20 e 50 mg, ad esempio da 30 a 40 mg, una quantità di antocianosidi tra 1 e 4 mg, ad esempio da 2 a 3 mg, una quantità di flavonoidi da 10 e 25 mg, ad esempio da 15 a 20 mg, una quantità di quercetina tra 0,1 e 1 mg, ad esempio da 0,3 a 0,5 mg. Typically compositions, for oral use in solid form, can contain an amount per dosage unit of polyphenols ranging from 20 to 50 mg, for example from 30 to 40 mg, an amount of anthocyanosides between 1 and 4 mg, for example from 2 to 3 mg, a quantity of flavonoids from 10 and 25 mg, for example from 15 to 20 mg, a quantity of quercetin between 0.1 and 1 mg, for example from 0.3 to 0.5 mg.

Tipici regimi di dosaggio potranno essere da 2 a 8 unità di dosaggio al giorno nelle quantità sopra definite, ad esempio somministrando una o due unità di dosaggio ogni 6-8 ore. Typical dosage regimens may be from 2 to 8 dosage units per day in the amounts defined above, for example by administering one or two dosage units every 6-8 hours.

Con il termine unità di dosaggio s’intende nella presente descrizione la formulazione unitaria per una singola somministrazione, ad esempio una compressa, capsula ecc. Tali composizioni potranno essere preparate secondo le tecniche note al tecnico del settore utilizzando i composti ottenuti dagli estratti sopra descritti e uno o più veicolanti e/o diluenti e/o eccipienti, ad esempio miscelando i singoli estratti direttamente durante la preparazione della composizione o aggiungendo ai veicolanti e/o diluenti e/o eccipienti una miscela dei composti precedentemente preparata. In the present description, the term dosage unit means the unitary formulation for a single administration, for example a tablet, capsule, etc. These compositions can be prepared according to the techniques known to those skilled in the art using the compounds obtained from the extracts described above and one or more carriers and / or diluents and / or excipients, for example by mixing the individual extracts directly during the preparation of the composition or by adding to the carriers and / or diluents and / or excipients a previously prepared mixture of the compounds.

Le composizioni potranno essere in qualsiasi formulazione preparata secondo le tecniche note all’esperto medio del settore, quale ad esempio forme solide, semisolide, liquide, granulari, capsule, compresse, pasticche, granulati, polveri, sciroppi, elisir, gelatine dura, gelatine morbide, sospensioni, emulsioni (olio in acqua o acqua in olio), soluzioni, gel. The compositions may be in any formulation prepared according to the techniques known to the average expert in the field, such as for example solid, semi-solid, liquid, granular forms, capsules, tablets, tablets, granulates, powders, syrups, elixirs, hard jellies, jellies. soft, suspensions, emulsions (oil in water or water in oil), solutions, gels.

La composizione come qui descritta, in una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra indicate potrà essere in forma di composizione farmaceutica, ovvero comprendere ingredienti di grado farmaceutico oppure potrà essere o essere inserita in un integratore alimentare, in un alimento a fini speciali. The composition as described herein, in any of the embodiments indicated above may be in the form of a pharmaceutical composition, or comprise pharmaceutical grade ingredients, or may be or be incorporated into a food supplement, into a special purpose food.

Per la preparazione delle composizioni farmaceutiche la miscela dei composti sarà formulata in idonee unità di dosaggio con uno o più eccipienti e additivi farmaceuticamente accettabili. Composizioni farmaceutiche in forma di compresse e capsule per somministrazione orale possono essere in forma a dosaggio unitario, e possono contenere eccipienti convenzionali inclusi, per esempio, agenti leganti, per esempio, gomma arabica, gelatina, sorbitolo, gomma adragante, o polivinilpirrolidone; riempitivi, per esempio lattosio, zucchero, amido di mais, fosfato di calcio, sorbitolo o glicina; lubrificanti di pastigliatura, per esempio stearato di magnesio, talco, polietilenglicole o silice; disintegranti, per esempio amido di patata; e agenti bagnanti accettabili farmaceuticamente, per esempio sodio laurilsolfato. Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti nella normale pratica farmaceutica. For the preparation of the pharmaceutical compositions the mixture of the compounds will be formulated in suitable dosage units with one or more pharmaceutically acceptable excipients and additives. Pharmaceutical compositions in tablet and capsule form for oral administration may be in unit dosage form, and may contain conventional excipients including, for example, binding agents, for example, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, or polyvinylpyrrolidone; fillers, for example lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine; tableting lubricants, for example magnesium stearate, talc, polyethylene glycol or silica; disintegrants, for example potato starch; and pharmaceutically acceptable wetting agents, for example sodium lauryl sulfate. The tablets can be coated according to methods well known in normal pharmaceutical practice.

Le composizioni potranno essere realizzate in forma d’integratore alimentare, alimento a fini medici speciali, o tal quale oppure aggiungendo ad essa uno o più eccipienti e/o ingredienti alimentari. The compositions can be made in the form of a food supplement, food for special medical purposes, or as it is or by adding to it one or more excipients and / or food ingredients.

La presente descrizione fornisce anche un metodo per il trattamento del dolore neuropatico comprendente la somministrazione a pazienti che ne abbiano bisogno, di quantitativi efficaci di una composizione come qui descritta. The present disclosure also provides a method for the treatment of neuropathic pain comprising administering effective amounts of a composition as described herein to patients in need.

Detto dolore neuropatico potrà essere dolore causato da: un trattamento con un farmaco, un trattamento con un farmaco chemioterapico, malattie croniche, traumi, esposizione a sostanze chimiche tossiche, un’infezione in corso, un’infezione pregressa, funzione alterata di un organo, malattie vascolari, malattie metaboliche, malattie autoimmuni; o essere descritto come neuropatia diabetica periferica, nevralgia erpetica postale, nevralgia del trigemino, dolore neuropatico della parte bassa della schiena, distrofia simpatica riflessa, sindrome dell'arto fantasma o essere un dolore neuropatico di cui non si conosce la causa (dolore neuropatico idiopatico). Said neuropathic pain may be pain caused by: a treatment with a drug, a treatment with a chemotherapy drug, chronic diseases, trauma, exposure to toxic chemicals, an ongoing infection, a previous infection, altered function of a organ, vascular diseases, metabolic diseases, autoimmune diseases; o be described as diabetic peripheral neuropathy, post herpetic neuralgia, trigeminal neuralgia, neuropathic lower back pain, reflex sympathetic dystrophy, phantom limb syndrome o be neuropathic pain of unknown cause (idiopathic neuropathic pain) .

Nel metodo di trattamento il dosaggio esatto e la frequenza di somministrazione delle composizioni dipenderà dalla particolare severità della condizione da trattare, dall’età, dal peso e dalle condizioni fisiche generali del particolare paziente come à ̈ ben noto agli esperti del settore. Tipici regimi di dosaggio da usare nel metodo di trattamento potranno essere da 2 a 8 unità di dosaggio al giorno nelle quantità sopra definite, ad esempio somministrando una o due unità di dosaggio ogni 6-8 ore. In the method of treatment, the exact dosage and frequency of administration of the compositions will depend on the particular severity of the condition to be treated, on the age, weight and general physical condition of the particular patient as is well known to those skilled in the art. Typical dosage regimens to be used in the treatment method may be from 2 to 8 dosage units per day in the amounts defined above, for example by administering one or two dosage units every 6-8 hours.

La presente invenzione à ̈ stata fin qui descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione. È da intendersi che possono esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, tutte rientranti nell’ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate. The present invention has been described up to now with reference to some of its embodiments. It is to be understood that other embodiments may exist which pertain to the same inventive nucleus, all falling within the scope of the protection of the claims set forth below.

E’ inteso che quando le quantità delle componenti indicate negli esempi di composizione sotto non raggiungono il quantitativo totale indicato, le restanti componenti potranno essere eccipienti intesi nel senso più ampio e generale del termine come utilizzato comunemente, potranno quindi comprendere eccipienti in senso stretto, conservanti, addensanti, leganti, veicolanti, ecc. It is understood that when the quantities of the components indicated in the composition examples below do not reach the total quantity indicated, the remaining components may be excipients intended in the broadest and most general sense of the term as commonly used, they may therefore include excipients in the strict sense, preservatives, thickeners, binders, carriers, etc.

ESEMPI DI COMPOSIZIONI EXAMPLES OF COMPOSITIONS

Esempio 1 Example 1

COMPOSTI NEL PRODOTTO % nella miscela del prodotto COMPOUNDS IN THE PRODUCT% in the product mixture

Polifenoli totali come acido gallico 6 Total polyphenols such as gallic acid 6

antocianosidi 0,5 Vitamine totali 0,05 anthocyanosides 0.5 Total vitamins 0.05

Vitamina B1 0,0078 Vitamin B1 0.0078

Vitamina B6 0,0085 eccipienti 93,4873 Vitamin B6 0.0085 excipients 93.4873

* Il 6% in peso di composizione di polifenoli totali comprende, espresso in % in peso * 6% by weight of total polyphenol composition includes, expressed in% by weight

della composizione, of the composition,

flavonoidi totali 4 total flavonoids 4

Quercetina 0,1 Quercetin 0.1

Esempio 2 Example 2

COMPOSTI NEL PRODOTTO % nella miscela del prodotto COMPOUNDS IN THE PRODUCT% in the product mixture

Polifenoli totali come acido gallico 5,7 Total polyphenols such as gallic acid 5,7

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

flavonoidi 3,9 flavonoids 3.9

quercetina 0,52 quercetin 0.52

antocianosidi totali 0,52 total anthocyanosides 0.52

Acidi organici totali 0,50 Total organic acids 0.50

Proteine 23,15 Proteins 23.15

Aminoacidi liberi totali 1,21 Total free amino acids 1.21

Polisaccaridi 34,02 Polysaccharides 34.02

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

fibra alimentare solubile 2,38 soluble dietary fiber 2.38

Fibra alimentare insolubile 6,44 Insoluble dietary fiber 6.44

Zuccheri 16,13 Sugars 16.13

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

monosaccaridi 13,74 monosaccharides 13.74

oligosaccaridi 2,39 oligosaccharides 2,39

Grassi 1,90 Fat 1.90

Vitamine totali 0,05 Total vitamins 0.05

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

Vitamina B10,0078 Vitamin B10.0078

Vitamina B60,0085 Vitamin B60.0085

Metalli totali 3,80 Total metals 3.80

Esempio 3 Example 3

COMPONENTI per porzione per porzione giornaliera massima 4640 giornaliera minima mg (8 op) 3480 mg (6 op) COMPONENTS per serving per serving maximum daily 4640 minimum daily mg (8 op) 3480 mg (6 op)

VITAMINE VITAMINS

Vitamina B10,23 mg 0,3 mg Vitamine B60,25 mg 0,33 mg Altri fattori nutrizionali Vitamin B 10.23 mg 0.3 mg Vitamins B 60.25 mg 0.33 mg Other nutritional factors

Polifenoli totali espressi 165 mg 220 mg come acido gallico* Total polyphenols expressed 165 mg 220 mg as gallic acid *

Antocianosidi totali 15 mg 20 mg VALORE ENERGETICO 12,25 Kcal 16,33 Kcal Proteine 0,515 g Total anthocyanosides 15 mg 20 mg ENERGY VALUE 12.25 Kcal 16.33 Kcal Proteins 0.515 g

carboidrati 1,075 g carbohydrates 1,075 g

grassi 0,06 g fat 0.06 g

* I 165 mg di polifenoli totali comprendono * The 165 mg of total polyphenols include

di cui Flavonoidi totali 113 mg 151 mg di cui Quercetina 5,8 mg 7,7 mg of which total flavonoids 113 mg 151 mg of which Quercetin 5.8 mg 7.7 mg

Esempio 4 Example 4

COMPOSTI NEL PRODOTTO mg per 6 mg per 8 COMPOUNDS IN THE PRODUCT mg per 6 mg per 8

capsule capsule Polifenoli totali come acido gallico* 210 280 Antocianosidi totali 15 20 Acidi organici totali 14,4 19,2 Proteine 671,0 894,6 Aminoacidi liberi totali 34,9 46,6 Polisaccaridi 985,9 1314,6 di cui fibra alimentare solubile 69,0 mg per 6 capsule capsules capsules Total polyphenols as gallic acid * 210 280 Total anthocyanosides 15 20 Total organic acids 14.4 19.2 Proteins 671.0 894.6 Total free amino acids 34.9 46.6 Polysaccharides 985.9 1314.6 of which dietary fiber soluble 69.0 mg for 6 capsules

e 92,0 mg per 8 capsule and 92.0 mg for 8 capsules

Fibra alimentare insolubile 186,6 248,8 Zuccheri 467,4 623,2 di cui monosaccaridi 398,2 530,9 di cui oligosaccaridi 69,2 92,3 Grassi 55,2 73,6 Vitamine totali 1,4 1,8 Vitamina B10,1 e Vitamina B60,2 per 6 capsule Insoluble dietary fiber 186.6 248.8 Sugars 467.4 623.2 of which monosaccharides 398.2 530.9 of which oligosaccharides 69.2 92.3 Fats 55.2 73.6 Total vitamins 1.4 1.8 Vitamin B10,1 and Vitamin B60,2 for 6 capsules

Vitamina B10,2 e Vitamina B60,3 per 8 capsule Vitamin B10,2 and Vitamin B60,3 for 8 capsules

Metalli totali 109,3 145,8 Perdita all’essiccamento 180 243 Total metals 109.3 145.8 Loss on drying 180 243

* I 210 mg di polifenoli totali comprendono * 210 mg of total polyphenols include

flavonoidi totali 113 151 Quercetina 2,8 3,7 Esempio 5 total flavonoids 113 151 Quercetin 2.8 3.7 Example 5

% nella miscela del COMPOSTI NEL PRODOTTO prodotto % in the mixture of COMPOUNDS IN THE PRODUCT produced

Polifenoli totali come acido gallico 6 Antocianosidi totali 0,5 Vitamine totali Total polyphenols such as gallic acid 6 Total anthocyanosides 0.5 Total vitamins

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

Vitamina B10,0078 Vitamin B10.0078

Vitamina B60,0085 0,05 Lievito di birra 20,8 pappa reale 25,1 amido di riso 16,7 Vitamin B 60,0085 0,05 Brewer's yeast 20,8 royal jelly 25,1 rice starch 16,7

* Il 6% in peso di composizione di polifenoli totali comprende, espresso in % in peso * 6% by weight of total polyphenol composition includes, expressed in% by weight

della composizione, of the composition,

flavonoidi totali 4 Quercetina 0,1 total flavonoids 4 Quercetin 0.1

Esempio 6 Example 6

% nella miscela del COMPOSTI NEL PRODOTTO prodotto % in the mixture of COMPOUNDS IN THE PRODUCT produced

Polifenoli totali come acido gallico* 6 Antocianosidi totali 0,5 Vitamine totali 0,05 Lievito di birra 20 pappa reale 25 amido di riso 17 acqua 27,25 Total polyphenols as gallic acid * 6 Total anthocyanosides 0.5 Total vitamins 0.05 Brewer's yeast 20 royal jelly 25 rice starch 17 water 27.25

* Il 6% in peso di composizione di polifenoli totali comprende, espresso in % in peso * 6% by weight of total polyphenol composition includes, expressed in% by weight

della composizione, of the composition,

flavonoidi totali 4 Quercetina 0,2 Esempio 7 total flavonoids 4 Quercetin 0.2 Example 7

% nella miscela del COMPOSTI NEL PRODOTTO prodotto % in the mixture of COMPOUNDS IN THE PRODUCT produced

Polifenoli totali come acido gallico * 6 antocianosidi 0,5 Vitamine totali Total polyphenols as gallic acid * 6 anthocyanosides 0.5 Total vitamins

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

Vitamina B10,0078 Vitamin B10.0078

Vitamina B60,0085 Vitamin B60.0085

Vitamina B120,0080 0,05 eccipienti 90 Vitamin B 120.0080 0.05 excipients 90

* Il 6% in peso di composizione di polifenoli totali comprende, espresso in % in peso * 6% by weight of total polyphenol composition includes, expressed in% by weight

della composizione, of the composition,

flavonoidi totali 4 Quercetina 0,2 total flavonoids 4 Quercetin 0.2

Esempio 8 Example 8

% nella miscela del COMPOSTI NEL PRODOTTO prodotto % in the mixture of COMPOUNDS IN THE PRODUCT produced

Polifenoli totali come acido gallico * 6 antocianosidi 0,5 Vitamine totali Total polyphenols as gallic acid * 6 anthocyanosides 0.5 Total vitamins

di cui % nella miscela del prodotto of which% in the product mixture

Vitamina B10,0078 Vitamin B10.0078

Vitamina B60,0085 0,05 spirulina 25,1 amido di riso 16,7 Vitamin B 60,0085 0,05 spirulina 25,1 rice starch 16,7

* Il 6% in peso di composizione di polifenoli totali comprende, espresso in % in peso * 6% by weight of total polyphenol composition includes, expressed in% by weight

della composizione, of the composition,

flavonoidi totali 4 Quercetina 0,2 ESEMPI SPERIMENTALI total flavonoids 4 Quercetin 0.2 EXPERIMENTAL EXAMPLES

Negli esperimenti decritti di seguito le seguenti composizioni sono indicate con i In the experiments described below, the following compositions are indicated with i

rispettivi codici respective codes

I valori riportati nella griglia sotto rappresentano la percentuale di ciascun The values shown in the grid below represent the percentage of each

componente rispetto alla miscela analizzata. component with respect to the analyzed mixture.

CODICE PERCENTUALE IN PESO DEI COMPONENTI NELLA MISCELA<MISCELA>POLIFENOL FLAVONOI ANTO- Quercetina Ulteriori principi attivi rilevanti I TOTALI DI TOTALI, CIANOSIDI presenti nella miscela espressi espressi TOTALI, CODE PERCENTAGE BY WEIGHT OF THE COMPONENTS IN THE BLEND <MIX> POLYPHENOL FLAVONOI ANTO- Quercetin Further relevant active ingredients TOTALS OF TOTALS, CYANOSIDES present in the mixture expressed expressed TOTAL,

come acido come espressI as acid as expressed

Gallico iperoside come Gallic hyperoside like

cianidina cyanidine

ABO -01 1,2 1 non presenti non ABO -01 1,2 1 not present not

presente here I'm

ABO-02 2 1,7 non presenti non ABO-02 2 1,7 not present not

presente here I'm

ABO-05 8 5 non presenti 0,24 ABO-05 8 5 not present 0.24

ABO-06 7,70 4,83 non presenti non Derivati caffeoilchinici espressi presente come acido clorogenico: 10,9 ABO-07 7 - 0,05 tracce Procianidine totali espresse come cianidina: 25 ABO-06 7.70 4.83 not present not Caffeoylquinic derivatives expressed as chlorogenic acid: 10.9 ABO-07 7 - 0.05 traces Total procyanidins expressed as cyanidin: 25

ABO-08 2 1,4 0,17 - 0,25 0,2 Acidi totali espressi come acido idrossi citrico: 27 ABO-09 12,25 7,76 non presenti 1,52 ipericine totali: 0,284, ABO-08 2 1,4 0,17 - 0,25 0,2 Total acids expressed as hydroxy citric acid: 27 ABO-09 12,25 7,76 not present 1,52 total hypericins: 0,284,

Iperforine 0,946 Hyperforine 0.946

ABO-10 33 - non presenti 1 caffeina: 5, ABO-10 33 - not present 1 caffeine: 5,

epigallo catechin gallato: 12 ABO-11 16,12 7,77 non presenti non Carnosolo: 1, epigallo catechin gallate: 12 ABO-11 16.12 7.77 not present non Carnosol: 1,

presente acido rosmarinico: 4 present rosmarinic acid: 4

ABO-12 19,90 3-7 1,39 0,5-2 ABO-12 19.90 3-7 1.39 0.5-2

ABO-13 6,47 1,89 non presenti 0,092 CURCUMINA: 3,8 ABO-13 6.47 1.89 not present 0.092 CURCUMIN: 3.8

ABO -14 0,4 0,006 0,09 0,005 Vitamina C: 6 ABO -14 0.4 0.006 0.09 0.005 Vitamin C: 6

ABO-15 0,4 0,006 0,09 0,005 Vitamina C: 5 ABO-15 0.4 0.006 0.09 0.005 Vitamin C: 5

ABO-17 0,018 0,001 non presenti non nota apigenina ABO-17 0.018 0.001 not present not known apigenin

<ABO-21>35,4 1,7 25,56 0,1 <ABO-21> 35.4 1.7 25.56 0.1

1. Valutazione dell’effetto di alcune frazioni di estratti vegetali in un modello di ossidazione indotta da oxaliplatino. 1. Evaluation of the effect of some fractions of plant extracts in a model of oxidation induced by oxaliplatin.

1.1 Descrizione del modello di ossidazione indotta da oxaliplatino 1.1 Description of the oxaliplatin-induced oxidation model

L’agente chemioterapico oxaliplatino à ̈ in grado di evocare un effetto neurotossico che si estrinseca in alterazioni morfologiche e molecolari del tessuto nervoso. Tale danneggiamento à ̈ responsabile di una sintomatologia algica invalidante e cronicizzante in funzione della dose di chemioterapico. The chemotherapeutic agent oxaliplatin is able to evoke a neurotoxic effect which is expressed in morphological and molecular alterations of the nervous tissue. This damage is responsible for disabling and chronic pain symptoms depending on the dose of chemotherapy.

L’oxaliplatino induce in colture di cellule neuronali cosi come di cellule gliali la produzione di radicali dell’ossigeno. L’incubazione con oxaliplatino 30 µM à ̈ in grado di promuovere l’ossidazione di una sonda fluorescente. Tal effetto à ̈ immediatamente successivo all’aggiunta della sostanza al mezzo di coltura suggerendo che lo stress ossidativo sia un meccanismo all’origine del danno cellulare indotto da oxaliplatino. Analogamente in vivo (ratto), la somministrazione ripetuta quotidianamente di oxaliplatino 2,4 mg/kg<-1>intraperitoneo (i.p.) per 21 giorni induce stress ossidativo sia a livello del sistema nervoso periferico che del centrale. Tale sbilancio ossido-riduttivo si concretizza in un danno a livello lipidico (perossidazione lipidica), proteico (carbonilazione proteica) e del DNA (incremento dei livelli di 8-OH-dG, 8-idrossiguanosina). Oxaliplatin induces the production of oxygen radicals in cultures of neuronal cells as well as glial cells. Incubation with oxaliplatin 30 µM is able to promote the oxidation of a fluorescent probe. This effect is immediately following the addition of the substance to the culture medium suggesting that oxidative stress is a mechanism at the origin of the cell damage induced by oxaliplatin. Similarly in vivo (rat), repeated daily administration of oxaliplatin 2.4 mg / kg <-1> intraperitoneum (i.p.) for 21 days induces oxidative stress in both the peripheral and central nervous systems. This redox imbalance results in damage at the lipid level (lipid peroxidation), protein (protein carbonylation) and DNA (increase in levels of 8-OH-dG, 8-hydroxyguanosine).

Il modello di neuropatia da oxaliplatino indotta nel ratto mediante il protocollo di somministrazione descritto sopra promuove, contemporaneamente al danno ossidativo, una forma di dolore neuropatico caratterizzato da iperalgesia e allodinia. The oxaliplatin model of neuropathy induced in rats by the administration protocol described above promotes, simultaneously with oxidative damage, a form of neuropathic pain characterized by hyperalgesia and allodynia.

1.2 Valutazione dell’effetto antiossidante 1.2 Evaluation of the antioxidant effect

E’ stato valutato in modo approfondito il profilo antiossidante di estratti e frazioni ricchi in composti chimici ad attività antiossidante (polifenoli, flavonoidi, procianidine, antocianosidi, catechine, derivati dell’acido carnosico, vitamine, ecc) a partire dalla concentrazione risultata non citotossicha, al fine di individuare possibili agenti farmacologici impiegabili nelle problematiche del dolore neuropatico derivante dal trattamento con chemioterapici. The antioxidant profile of extracts and fractions rich in chemical compounds with antioxidant activity (polyphenols, flavonoids, procyanidins, anthocyanosides, catechins, carnosic acid derivatives, vitamins, etc.) was evaluated in depth starting from the resulting concentration. cytotoxicity, in order to identify possible pharmacological agents that can be used in the problems of neuropathic pain deriving from treatment with chemotherapy.

A tale scopo il profilo antiossidante à ̈ stato studiato sia nei confronti del radicale idrossile (lipoperossidazione), dell’anione superossido generato in seguito a xantina e ipoxantina e che dell’anione che in seguito a trattamento chemioterapico con oxaliplatino. For this purpose, the antioxidant profile has been studied both against the hydroxyl radical (lipoperoxidation), the superoxide anion generated following xanthine and hypoxanthine and the anion and following chemotherapy treatment with oxaliplatin.

In laboratorio à ̈ stata caratterizzata una neuropatia indotta dall’agente chemioterapico oxaliplatino che induce nell’animale da esperimento una sindrome dolorosa accompagnata da alterazioni morfologiche e molecolari del tessuto nervoso. Tra queste risultano evidenti danni ossidativi riproducibili in modelli cellulari di tossicità da oxaliplatino. In particolare, in colture primarie di astrociti corticali di ratto, oxaliplatino à ̈ in grado di indurre un incremento della produzione di anione superossido. In the laboratory, a neuropathy induced by the chemotherapeutic agent oxaliplatin has been characterized which induces a painful syndrome in the experimental animal accompanied by morphological and molecular alterations of the nervous tissue. Among these are evident reproducible oxidative damage in cellular models of oxaliplatin toxicity. In particular, in primary cultures of rat cortical astrocytes, oxaliplatin is able to induce an increase in the production of superoxide anion.

I test sono stati realizzati in due differenti esprimenti: il primo à ̈ stato realizzato sui campioni da ABO-1 a ABO-17, il secondo con il campione ABO-21. I risultati sono riportati separatamente essendo diversi anche i relativi controlli. The tests were carried out in two different experiments: the first was carried out on the samples from ABO-1 to ABO-17, the second with the ABO-21 sample. The results are reported separately as the relative controls are also different.

Materiali e metodi Materials and methods

Colture cellulari Cell cultures

La linea primaria di astrociti à ̈ stata ottenuta secondo il metodo descritto da McCarthy e De Vellis (1980). Gli astrociti sono stati isolati dalla corteccia di ratti neonati (P1-P3). Le corteccie, dopo aver eliminato le meningi, sono state omogenate meccanicamente, e digerite con tripsina-EDTA (Sigma - Germania) 0,5% e DNAsi (Sigma, Germania) 1% per 30 minuti a 37°C sotto blanda agitazione. La sospensione à ̈ stata quindi filtrata (filtro da 100 µm, Millipore - Italia) e centrifugata a 1200 rpm per 10 minuti. Il pellet à ̈ stato risospeso nell’apposito medium (DMEM alto glucosio (4,5 g/l), penicillina (100 U/ml), streptomicina (100 µg/ml), sodio piruvato 1mM, glutammina 1%, 20% siero fetale bovino (FBS; Lonza – Belgio), e piastrato in fiasche precedentemente polilisinate (10 µg/mL di poli-l-lisina; Sigma). Ogni 2-3 giorni il medium descritto à ̈ stato sostituito con altro terreno di coltura contenente siero fetale bovino al 10%. Una volta raggiunta la confluenza si à ̈ proceduto all’eliminazione della microglia con uno shaker a circa 200 rpm per 1 ora seguito da uno a maggior velocità protratto per una notte per staccare gli oligodendrociti. Le cellule rimaste adese alla fiasca hanno dato luogo a una coltura astrocitaria pura al 90%. Sono state quindi incubate a 37°C in atmosfera umida e contenente il 5% di CO2per 21 giorni prima dell’esperimento. The primary line of astrocytes was obtained according to the method described by McCarthy and De Vellis (1980). Astrocytes were isolated from the cortex of newborn rats (P1-P3). The cortices, after eliminating the meninges, were mechanically homogenized, and digested with trypsin-EDTA (Sigma - Germany) 0.5% and DNAse (Sigma, Germany) 1% for 30 minutes at 37 ° C under gentle stirring. The suspension was then filtered (100 µm filter, Millipore - Italy) and centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes. The pellet was resuspended in the appropriate medium (DMEM high glucose (4.5 g / l), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 µg / ml), sodium pyruvate 1mM, glutamine 1%, 20% fetal bovine serum (FBS; Lonza - Belgium), and plated in previously polylysinated flasks (10 µg / mL of poly-1-lysine; Sigma). Every 2-3 days the medium described was replaced with other medium of culture containing 10% fetal bovine serum. Once the confluence was reached, the microglia were eliminated with a shaker at about 200 rpm for 1 hour followed by a higher speed one continued for one night to detach the oligodendrocytes. cells adhered to the flask gave rise to a 90% pure astrocyte culture and were then incubated at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% CO2 for 21 days before the experiment.

Lipoperossidazione Lipoperoxidation

Il FeCl3e l’acido ascorbico generano radicale idrossile secondo la reazione di Fenton. Tale radicale à ̈ in grado di interagire con i lipidi presenti nel tessuto cerebrale generando malonil dialdeide. A tale scopo materiale cerebrale di ratto (ratti maschi Sprague-Dawley, Harlan, Italia) à ̈ stato omogenato in PBS in modo da ottenere una concentrazione finale del 10% p/v. I composti in esame alla concentrazione di 50 µg/mL, sono stati aggiunti a 100 µL dell’omogenato di tessuto nervoso e incubati per 30 minuti a 37 C° insieme a FeCl3(20 µM) e acido ascorbico (100 µM). Al termine dell’incubazione sono stati aggiunti alla miscela 4 mL di acido tiobarbiturico (Sigma-Aldrich, Germania) 36 Mm (sciolto in una soluzione di acido acetico al 10% e quindi portato a pH 4.0 con NaOH ). I campioni sono stati quindi bolliti per 1 ora e la reazione à ̈ stata bloccata ponendo le provette in ghiaccio. Dopo centrifugazione a 1600xg a 4°C per 10 minuti si à ̈ proceduto al dosaggio spettrofometrico (550 nm) dei livelli di malonil dialdeide nel surnatante. FeCl3 and ascorbic acid generate hydroxyl radical according to the Fenton reaction. This radical is able to interact with the lipids present in the brain tissue generating malonyl dialdehyde. For this purpose, rat brain material (male Sprague-Dawley rats, Harlan, Italy) was homogenized in PBS in order to obtain a final concentration of 10% w / v. The compounds under examination at a concentration of 50 µg / mL, were added to 100 µL of the homogenate of nervous tissue and incubated for 30 minutes at 37 ° C together with FeCl3 (20 µM) and ascorbic acid (100 µM). At the end of the incubation, 4 mL of 36 Mm thiobarbituric acid (Sigma-Aldrich, Germany) (dissolved in a 10% acetic acid solution and then brought to pH 4.0 with NaOH) were added to the mixture. The samples were then boiled for 1 hour and the reaction stopped by placing the tubes on ice. After centrifugation at 1600xg at 4 ° C for 10 minutes we proceeded to the spectrophometric assay (550 nm) of the levels of malonyl dialdehyde in the supernatant.

Test di ossidazione del Nitro Blue Tetrazolium (NBT) Nitro Blue Tetrazolium (NBT) Oxidation Test

Gli esperimenti sono stati condotti secondo il metodo descritto da Ciuffi et al., 1998. Il saggio comporta la produzione di anione superossido mediante la reazione tra ipoxantina (600 mM) e xantina ossidasi (10 mU/ml). E’ stato valutato il profilo antiossidante dei composti in esame monitorando la cinetica di ossidazione del nitro blue tetrazolium (NBT, 10 mM) in presenza di una concentrazione 50 µg/mL dei singoli estratti. La misurazione dell’attività antiossidante à ̈ stata effettuata spettrofotometricamente alla lunghezza d’onda di 560 nm. I valori riportati sono stati registrati dopo 60 minuti di reazione e sono stati espressi come Unità Arbitrarie di assorbanza (U.A). The experiments were carried out according to the method described by Ciuffi et al., 1998. The assay involves the production of superoxide anion by the reaction between hypoxanthine (600 mM) and xanthine oxidase (10 mU / ml). The antioxidant profile of the compounds under examination was evaluated by monitoring the oxidation kinetics of nitro blue tetrazolium (NBT, 10 mM) in the presence of a concentration of 50 µg / mL of the individual extracts. The measurement of the antioxidant activity was performed spectrophotometrically at the wavelength of 560 nm. The reported values were recorded after 60 minutes of reaction and were expressed as Arbitrary Units of absorbance (U.A).

Risultati Results

Lipoperossidazione Lipoperoxidation

La reazione tra il FeCl3e l’acido ascorbico, specifica per generare radicale idrossile, incrementa significativamente i livelli di ossidazione lipidica, innalzando il valore basale di malonildialdeide da 23,40 ± 2,20 µmol/mg proteine (100 %) a 44,10 ± 2,5 µmol/mg proteine (188,50± 10,89 %), (Figura 1).L’analisi del profilo antiossidante degli estratti vegetali ha rivelato un’ottima efficacia degli estratti arricchiti in antocianosidi ABO-12 (27,84 ± 0,99 %), catechine ABO-10 (26,71 ± 0,87 %) e derivati dell’acido carnosico ABO-11 (26,12 ±1,84 %). Queste sostanze non solo prevengono totalmente l’ossidazione dovuta al reattivo di Fenton ma sono addirittura in grado di ridurre i livelli basali al di sotto del 100%. Gli estratti ABO-13 (56,27 ± 1,61 %), ABO-05 (88,26 ± 0,04 %) e ABO-07 (99,40 ± 1,34 %) possiedono, anch’essi, spiccate proprietà antiossidanti riportando i livelli di malonil dialdeide ai livelli di controllo. Anche l’estratto ricco in polifenoli, in particolare flavonoidi e quercetina ABO-09 contrasta in modo significativo la generazione del prodotto di ossidazione di circa il 60 % (124,91±7,05 %). In misura minore rispetto al precedente, l’estratto ABO-08 limita la generazione di malonil dialdeide (149,27 ± 4,96 %). Blande proprietà antiossidanti (riduzione del 20% circa) sono state rilevate anche per l’estratto di ABO-01 (160,01 ± 1,12 %), per l’estratto ABO-06 (158,87±1,36 %) e per ABO-02 (160,01±1,12 %). Non à ̈ stata registrata alcuna attività antiossidante per gli estratti di ABO-03, ABO-14, ABO-17 e per ABO-15 che sono gli unici a non essere statisticamente significativi (Fig.1). The reaction between FeCl3 and ascorbic acid, specific to generate hydroxyl radical, significantly increases the levels of lipid oxidation, raising the basal value of malonyldialdehyde from 23.40 ± 2.20 µmol / mg protein (100%) to 44, 10 ± 2.5 µmol / mg proteins (188.50 ± 10.89%), (Figure 1). The analysis of the antioxidant profile of the plant extracts revealed an excellent efficacy of the extracts enriched in ABO-12 anthocyanosides (27.84 ± 0.99%), catechins ABO-10 (26.71 ± 0.87%) and derivatives of carnosic acid ABO-11 (26.12 ± 1.84%). These substances not only totally prevent the oxidation due to the Fenton reagent but are even able to reduce the basal levels below 100%. The extracts ABO-13 (56.27 ± 1.61%), ABO-05 (88.26 ± 0.04%) and ABO-07 (99.40 ± 1.34%) also possess strong antioxidant properties bringing the levels of malonyl dialdehyde back to control levels. Also the extract rich in polyphenols, in particular flavonoids and quercetin ABO-09 significantly contrasts the generation of the oxidation product by about 60% (124.91 ± 7.05%). To a lesser extent than the previous one, the ABO-08 extract limits the generation of malonyl dialdehyde (149.27 ± 4.96%). Good antioxidant properties (reduction of about 20%) were also detected for the ABO-01 extract (160.01 ± 1.12%), for the ABO-06 extract (158.87 ± 1.36 %) and for ABO-02 (160.01 ± 1.12%). No antioxidant activity was recorded for ABO-03, ABO-14, ABO-17 and ABO-15 extracts which are the only ones not statistically significant (Fig. 1).

1.3 Test di ossidazione del Nitro Blue Tetrazolium (NBT) 1.3 Nitro Blue Tetrazolium (NBT) oxidation test

Il livello basale di ossidazione del Nitro Blue Tetrazolium risulta di 0,15 ± 0,02 U.A. In seguito alla reazione tra xantina e ipoxantina, grazie alla quale viene generato anione superossido, il valore di ossidazione del NBT risulta significativamente incrementato, 5,35 ± 0,56 U.A. (Fig.2). The basal level of oxidation of Nitro Blue Tetrazolium is 0.15 ± 0.02 U.A. Following the reaction between xanthine and hypoxanthine, thanks to which superoxide anion is generated, the oxidation value of the NBT is significantly increased, 5.35 ± 0.56 U.A. (Fig.2).

La valutazione del profilo antiossidante dei differenti estratti (Fig. 2) ha permesso di osservare spiccate proprietà antiossidanti per l’estratto ABO-12 (1,62 ± 0,09 U.A.), per l’estratto ABO-10 (0,82 ± 0,04 U.A.) e per l’estratto ABO-11 (1,70 ± 0,07 U.A.), i quali riducono notevolmente l’ossidazione massima del Nitro Blue Tetrazolium riportandola quasi ai livelli di controllo. Un significativo effetto antiossidante à ̈ stato registrato anche per l’estratto ABO-05 (1,93 ± 0,17 U.A.), ABO-13 (3,17 ± 0,03 U.A.) e ABO-09 (1,81 ± 0,03 U.A.). Tale effetto antiossidante rispecchia i valori registrati negli esperimenti di lipoperossidazione. L’estratto ABO-09 risulta maggiormente efficace nel limitare la generazione dell’anione superossido rispetto al radicale idrossile (Fig. 2 e Fig. 3). Anche gli estratti ABO-06, ABO-08 e ABO-07 (2,20 ± 0,17 U.A.) riducono significativamente i livelli di anione superossido liberato dalla reazione tra ipoxantina e xantina ossidasi (rispettivamente 2,34 ± 0,13 U.A e 2,11 ± 0,03 U.A). Tali dati, se confrontati con quelli ricavati dagli esperimenti di lipoperossidazione, indicano che sia ABO-06, sia ABO-08, sono in grado di ridurre selettivamente i livelli dell’anione superossido rispetto al radicale idrossile. Un effetto antiossidante à ̈ stato osservato anche per ABO-14 (4,07 ± 0.1 U.A.). The evaluation of the antioxidant profile of the different extracts (Fig. 2) made it possible to observe marked antioxidant properties for the ABO-12 extract (1.62 ± 0.09 U.A.), for the ABO-10 extract (0, 82 ± 0.04 U.A.) and for the ABO-11 extract (1.70 ± 0.07 U.A.), which considerably reduce the maximum oxidation of Nitro Blue Tetrazolium bringing it back to almost control levels. A significant antioxidant effect was also recorded for the extract ABO-05 (1.93 ± 0.17 U.A.), ABO-13 (3.17 ± 0.03 U.A.) and ABO-09 (1.81 ± 0.03 U.A.). This antioxidant effect mirrors the values recorded in the lipoperoxidation experiments. The ABO-09 extract is more effective in limiting the generation of the superoxide anion than the hydroxyl radical (Fig. 2 and Fig. 3). Also the extracts ABO-06, ABO-08 and ABO-07 (2.20 ± 0.17 U.A.) significantly reduce the levels of superoxide anion released by the reaction between hypoxanthine and xanthine oxidase (respectively 2.34 ± 0.13 U.A and 2.11 ± 0.03 U.A). These data, when compared with those obtained from lipoperoxidation experiments, indicate that both ABO-06 and ABO-08 are able to selectively reduce the levels of the superoxide anion with respect to the hydroxyl radical. An antioxidant effect was also observed for ABO-14 (4.07 ± 0.1 U.A.).

Nessun effetto antiossidante significativo à ̈ stato rilevato per l’estratto di ABO-01, ABO-02, ABO-03, ABO-17. Nella seconda tranche di campioni il più potente e significativo à ̈ risultato ABO-21. No significant antioxidant effect was detected for the ABO-01, ABO-02, ABO-03, ABO-17 extract. In the second tranche of samples the most powerful and significant was ABO-21.

1.4 Danno ossidativo da oxaliplatino. Dosaggio dell’anione superossido in colture di astrociti corticali di ratto mediante citocromo C. 1.4 Oxaliplatin oxidative damage. Determination of superoxide anion in rat cortical astrocyte cultures by cytochrome C.

Nella coltura astrocitaria, oxaliplatino 100 µM induce, dopo 4 ore di incubazione, uno stress ossidativo misurato come incremento dei livelli di anione superossido da 154,9 ±13,1 µmol O2-, valore basale, a 380,1 ± 11,4 µmol O2-. Anche in questo sistema complesso, le capacità antiossidanti degli estratti in esame sono risultate confrontabili con quelle delineatesi nel test biochimico dell’NBT, anch’esso relativo alla misurazione dell’anione superossido (Fig.3). L’estratto ABO-12 (145,4 ± 11,4 µmol di O2-), l’estratto ABO-10 (110,3 ± 17,8 µmol di O2-), l’estratto ABO-11 (148,8 ± 22,9 µmol di O2-), sono in grado di prevenire l’ossidazione mantenendo al valore di controllo i livelli di anione superossido (Fig. 3). Un significativo effetto antiossidante à ̈ stato registrato anche per ABO-07 (203,6 ± 22,4 µmol di O2-), ABO-05 (198,5 ± 25,6 µmol di O2-), ABO-08 (201,7 ± 33,7 µmol di O2-), ABO-06 (216,8 ± 24,2 µmol di O2-), ABO-09 (184,3 ± 15,7 µmol di O2-) e ABO-13 (254,9 ± 24,6 µmol di O2). Gli estratti ABO-01, ABO-02, ABO-03, ABO-15, ABO-14 e ABO-17 non sono in grado di ridurre i livelli di anione superossido generato in seguito al trattamento delle colture con oxaliplatino. Nella seconda tranche di campioni il più potente e significativo à ̈ risultato ABO-21. In astrocyte culture, oxaliplatin 100 µM induces, after 4 hours of incubation, an oxidative stress measured as an increase in superoxide anion levels from 154.9 ± 13.1 µmol O2-, basal value, to 380.1 ± 11.4 µmol O2-. Also in this complex system, the antioxidant capacities of the extracts under examination were found to be comparable with those delineated in the NBT biochemical test, also related to the measurement of superoxide anion (Fig. 3). ABO-12 extract (145.4 ± 11.4 µmol of O2-), ABO-10 extract (110.3 ± 17.8 µmol of O2-), ABO-11 extract ( 148.8 ± 22.9 µmol of O2-), are able to prevent oxidation by maintaining the superoxide anion levels at the control value (Fig. 3). A significant antioxidant effect was also recorded for ABO-07 (203.6 ± 22.4 µmol of O2-), ABO-05 (198.5 ± 25.6 µmol of O2-), ABO-08 (201, 7 ± 33.7 µmol of O2-), ABO-06 (216.8 ± 24.2 µmol of O2-), ABO-09 (184.3 ± 15.7 µmol of O2-) and ABO-13 (254 , 9 ± 24.6 µmol of O2). The extracts ABO-01, ABO-02, ABO-03, ABO-15, ABO-14 and ABO-17 are not able to reduce the superoxide anion levels generated following the treatment of the cultures with oxaliplatin. In the second tranche of samples the most powerful and significant was ABO-21.

1.5 Danno ossidativo da oxaliplatino. Dosaggio dell’anione superossido in colture di astrociti corticali di ratto mediante citocromo C. 1.5 Oxaliplatin oxidative damage. Determination of superoxide anion in rat cortical astrocyte cultures by cytochrome C.

Il metodo consente di rilevare l’entità del danno ossidativo, indotto dall’agente chemioterapico oxaliplatino attraverso il dosaggio dell’anione superossido generato in colture primarie di astrociti corticali di ratto. Le cellule, sono state piastrate in multiwell da 6 pozzetti (5<.>10<5>/pozzetto). Una volta raggiunta la confluenza le cellule sono state starvate per almeno 12 ore. Per generare l’anione superossido le colture sono state quindi incubate per 4 ore a 37°C con oxaliplatino 100 µM (in un medium senza rosso fenolo contenente FBS allo 0.1%) e citocromo C (Sigma - Germania) (1mg/mL), in presenza degli estratti di origine vegetale da testare (50 µg/mL). Al termine dell’incubazione il surnatante Î ̧ stato centrifugato. La quantitΰ di anione superossido presente nella soluzione (color porpora) viene misurata spettrofometricamente a 550 nm. La produzione di anione superossido Î ̧ espressa come µmol/h/pozzetto usando un coefficiente di estinzione molare di 2,1<.>10<4>M<-1>cm<-1>. The method allows to detect the extent of oxidative damage induced by the chemotherapeutic agent oxaliplatin through the dosage of the superoxide anion generated in primary cultures of rat cortical astrocytes. The cells were plated in 6-well multiwells (5 <.> 10 <5> / well). Once confluence was reached, the cells were starvated for at least 12 hours. To generate the superoxide anion, the cultures were then incubated for 4 hours at 37 ° C with oxaliplatin 100 µM (in a medium without phenol red containing 0.1% FBS) and cytochrome C (Sigma - Germany) (1mg / mL) , in the presence of the extracts of plant origin to be tested (50 µg / mL). At the end of the incubation the supernatant was centrifuged. The amount of superoxide anion present in the solution (purple color) is measured spectrophometrically at 550 nm. The superoxide anion production Î ̧ expressed as µmol / h / well using a molar extinction coefficient of 2.1 <.> 10 <4> M <-1> cm <-1>.

1.6 Analisi statistica 1.6 Statistical analysis

Tutti i risultati sperimentali sono espressi come media±S.E.M. E’ stata condotta un’analisi della varianza (ANOVA) one way, seguita dal test di Bonferroni per verificare la significatività tra due medie. L’analisi della varianza e il test di Bonferroni sono stati eseguiti con il programma statistico OriginPro 8.1. Sono stati considerati significativi valori di P< 0,05 o P<0,01. All experimental results are expressed as mean ± S.E.M. A one way analysis of variance (ANOVA) was conducted, followed by the Bonferroni test to verify the significance between two means. The analysis of variance and the Bonferroni test were performed with the statistical program OriginPro 8.1. Values of P <0.05 or P <0.01 were considered significant.

2 EFFETTO SULL’IPERALGESIA DA OXALIPLATINO 2 EFFECT ON OXALIPLATINE HYPERALGESIA

Sono stati condotti esprimenti di induzione di dolore neuropatico da chemioterapico (Cavalletti et al, 2001). Expressions of induction of neuropathic pain from chemotherapy have been carried out (Cavalletti et al, 2001).

L’oxaliplatino nel ratto alla dose di 2,4 mg/kg<-1>i.p. induce al giorno 21 una neuropatia caratterizzata da iperalgesia e allodinia in accordo ai dati di Cavaletti et al. L’esame post-mortem del midollo spinale del ratto trattato con oxaliplatino rivela una componente di danno ossidativo che si estrinseca anche a livello lipidico. Oxaliplatin in rats at a dose of 2.4 mg / kg <-1> i.p. induces on day 21 a neuropathy characterized by hyperalgesia and allodynia according to the data of Cavaletti et al. The post-mortem examination of the spinal cord of the rat treated with oxaliplatin reveals a component of oxidative damage that is also expressed at the lipid level.

2.1 MATERIALE E METODI 2.1 MATERIAL AND METHODS

Induzione di iperalgesia con oxaliplatino nel ratto Induction of hyperalgesia with oxaliplatin in the rat

La riduzione della soglia algica viene indotta dalla somministrazione di oxaliplatino 2,4 mg/kg i.p., precedentemente disciolto in soluzione glucosata al 5% per 5 giorni consecutivi per un totale di 2 settimane (10 somministrazioni). La dose totale di oxaliplatino iniettata à ̈ quindi pari a 24 mg/kg i.p. Ai controlli viene somministrata soltanto la soluzione glucosata. The reduction of the pain threshold is induced by the administration of oxaliplatin 2.4 mg / kg i.p., previously dissolved in 5% glucose solution for 5 consecutive days for a total of 2 weeks (10 administrations). The total dose of oxaliplatin injected is therefore equal to 24 mg / kg i.p. Controls are given only the glucose solution.

Test della pressione sulla zampa Paw pressure test

Il test viene eseguito su ratti. L'apparecchio usato à ̈ un analgesimetro che esercita una forza, espressa in grammi, che viene applicata a velocità costante (32 g/s) attraverso un punzone di forma conica sulla superficie superiore della zampa posteriore dell'animale. L'entità della forza viene costantemente rilevata da un indicatore che si muove lungo una scala lineare. L'animale viene tenuto fermo nel palmo della mano e la soglia nocicettiva viene espressa come quella forza a cui l'animale reagisce retraendo la zampa, o irrigidendo il corpo, o squittendo. Anche in questo caso, per poter rilevare variazioni indotte dal farmaco, viene valutata la soglia nocicettiva degli animali sia prima che dopo il trattamento. Quando la forza raggiunge il valore di 240 g l'animale viene tolto anche se non ha ancora reagito allo stimolo. Leighton et al., Br. J.Pharmacol., 93, 553-560, 1988. The test is performed on rats. The device used is an analgesimeter that exerts a force, expressed in grams, which is applied at constant speed (32 g / s) through a conical punch on the upper surface of the animal's hind leg. The magnitude of the force is constantly detected by an indicator that moves along a linear scale. The animal is held still in the palm of the hand and the nociceptive threshold is expressed as that force to which the animal reacts by retracting the paw, or by stiffening the body, or by squeaking. Also in this case, in order to detect changes induced by the drug, the nociceptive threshold of the animals is evaluated both before and after treatment. When the force reaches the value of 240 g the animal is removed even if it has not yet reacted to the stimulus. Leighton et al., Br. J.Pharmacol., 93, 553-560, 1988.

Risultati Results

In tab.3 sono riportati i risultati relativi all’effetto di una singola somministrazione degli estratti di: ABO-10, ABO-07, ABO-11 e ABO-12 (30-300 mg kg<-1>p.o.) nei confronti dell’iperalgesia indotta dal trattamento ripetuto con l’agente chemioterapico oxaliplatino valutato nel ratto in presenza di uno stimolo pressorio (paw-pressure test). Tutti gli estratti saggiati sono privi di efficacia alle dosi di 30 e 60 mg kg<-1>p.o. Per gli estratti di ABO-12 anche la dose di 100 mg kg<-1>p.o.à ̈ risultata priva di effetto. Al contrario la dose di 300 mg kg<-1>p.o. per tutti gli estratti saggiati si à ̈ dimostrata capace di ridurre l’abbassamento della soglia algica indotta da oxaliplatino. Tale attività si ottiene dai 15 min. dopo la somministrazione, raggiunge il massimo effetto dopo 30 min e poi decade fino a scomparire nell’ambito di 120 min. Table 3 shows the results relating to the effect of a single administration of the extracts of: ABO-10, ABO-07, ABO-11 and ABO-12 (30-300 mg kg <-1> p.o.) against hyperalgesia induced by repeated treatment with the chemotherapeutic agent oxaliplatin evaluated in the rat in the presence of a pressure stimulus (paw-pressure test). All the tested extracts are ineffective at doses of 30 and 60 mg kg <-1> p.o. For ABO-12 extracts, even the dose of 100 mg kg <-1> p.o. was found to have no effect. On the contrary, the dose of 300 mg kg <-1> p.o. for all the tested extracts it proved capable of reducing the lowering of the algic threshold induced by oxaliplatin. This activity is obtained from 15 min. after administration, it reaches its maximum effect after 30 min and then decays until it disappears within 120 min.

Solo la frazione ABO-09 ha dimostrato una significativa attività anche alle dosi di 30 e 60 mg/kg a partire da 15 minuti, risultando quindi la più potente. Only the ABO-09 fraction showed significant activity even at doses of 30 and 60 mg / kg starting from 15 minutes, making it the most powerful.

Tabella 3 Table 3

Effetto di alcuni estratti sull’iperalgesia indotta nel ratto da oxaliplatino (test della pressione sulla zampa) (Paw pressure test) Effect of some extracts on oxaliplatin-induced hyperalgesia in rats (paw pressure test)

Test della pressione sulla zampa (g) Paw pressure test (g)

Trattamento Treatment

Prima del Dopo il trattamento Before the After the treatment

mg/kg ,p,o, tratt mg / kg, p, o, treat

CMC 62,7 2,8 58,1 3,3 62,7 4,4 61,2 3,8 63,9 4,6 OXALIPLATIN 29,5 2,7 33,4+ 3,4 30,9 3,6 32,3 3,5 29,8 3,0 OXA ABO-1030 mg/kg 32,4+ 2,6 36,8 3,5 38,2 4,2 34,5 4,1 30,7 3,5 OXA ABO-1060 mg/kg 31,2 2,5 37,2 3,4 41,1 3,7 36,2 4,1 37,5 3,9 OXA ABO-10100 mg/kg 33,4 2,8 45,8 3,1* 46,2 3,3* 41,8 3,0^ 35,8 2,5 OXA ABO-10300 mg/kg 30,9 3,1 44,9 3,9* 47,1 3,1* 39,5 3,6^ 34,7 3,1 OXA ABO-07 30 mg/kg 31,4 2,5 35,5 3,3 36,2 4,9 36,5 3,7 31,4 3,3 CMC 62.7 2.8 58,1 3.3 62.7 4.4 61.2 3.8 63.9 4.6 OXALIPLATIN 29.5 2.7 33.4+ 3.4 30.9 3, 6 32.3 3.5 29.8 3.0 OXA ABO-1030 mg / kg 32.4+ 2.6 36.8 3.5 38.2 4.2 34.5 4.1 30.7 3, 5 OXA ABO-1060 mg / kg 31.2 2.5 37.2 3.4 41.1 3.7 36.2 4.1 37.5 3.9 OXA ABO-10 100 mg / kg 33.4 2. 8 45.8 3.1 * 46.2 3.3 * 41.8 3.0 ^ 35.8 2.5 OXA ABO-10 300 mg / kg 30.9 3.1 44.9 3.9 * 47, 1 3.1 * 39.5 3.6 ^ 34.7 3.1 OXA ABO-07 30 mg / kg 31.4 2.5 35.5 3.3 36.2 4.9 36.5 3.7 31.4 3.3

OXA ABO-07 60 mg/kg 33,1 2,8 38,9 4,2 39,7 3,1 39,8 2,6 36,7 4,0 OXA ABO-07 60 mg / kg 33.1 2.8 38.9 4.2 39.7 3.1 39.8 2.6 36.7 4.0

OXA ABO-07 100 mg/kg 32,2 2,6 35,5 3,1 39,1 4,4 36,2 3,1 35,9 3,4 OXA ABO-07 100 mg / kg 32.2 2.6 35.5 3.1 39.1 4.4 36.2 3.1 35.9 3.4

5,2 3,2 5.2 3.2

Effetto di alcuni estratti sull’iperalgesia indotta nel ratto da oxaliplatino (test della pressione sulla zampa) (Paw pressure test) Effect of some extracts on oxaliplatin-induced hyperalgesia in rats (paw pressure test)

Test della pressione sulla zampa (g) Paw pressure test (g)

Trattamento Treatment

Prima del Dopo il trattamento Before the After the treatment

mg/kg ,p,o, tratt mg / kg, p, o, treat

29,8 2,2 29.8 2.2

OXA ABO-07 300 mg/kg 43,2 3,7* 45,3 2,9* 42,5 3,6* 37,3 3,5 OXA ABO-07 300 mg / kg 43.2 3.7 * 45.3 2.9 * 42.5 3.6 * 37.3 3.5

5,2 3,2 5.2 3.2

OXA ABO-11 30 mg/kg 32,9 2,9 33,4 2,7 28,7 2,5 31,1 3,2 35,6 3,1 OXA ABO-11 60 mg/kg 31,4 3,1 37,5 3,9 39,1 3,4 36,3 3,6 32,8 4,1 OXA ABO-11 100 mg/kg 33,2 3,0 44,2 3,1* 45,2 3,2* 42,6 3,7* 31,5 3,0 OXA ABO-11 300 mg/kg 29,5 2,9 41,8 4,0* 48,5 3,4* 43,6 4,1* 33,1 4,7 OXA ABO-12 30 mg/kg 32,3 2,6 31,5 2,4 33,6 2,8 30,6 3,4 33,0 2,8 OXA ABO-12 60 mg/kg 28,5 3,1 32,5 3,1 29,6 3,0 33,9 3,5 36,4 4,5 OXA ABO-12 100 mg/kg 30,7 3,5 35,3 3,8 39,1 3,4 34,5 2,6 32,9 3,7 OXA ABO-12 300 mg/kg 32,2 3,4 39,5 2,2^ 46,7 2,6* 45,1 3,9* 41,5 4,3^ ^P< 0,05; *P< 0,01 in vs CMC Ciascun valore rappresenta la media di 8 ratti, OXA ABO-11 30 mg / kg 32.9 2.9 33.4 2.7 28.7 2.5 31.1 3.2 35.6 3.1 OXA ABO-11 60 mg / kg 31.4 3 , 1 37.5 3.9 39.1 3.4 36.3 3.6 32.8 4.1 OXA ABO-11 100 mg / kg 33.2 3.0 44.2 3.1 * 45.2 3.2 * 42.6 3.7 * 31.5 3.0 OXA ABO-11 300 mg / kg 29.5 2.9 41.8 4.0 * 48.5 3.4 * 43.6 4, 1 * 33.1 4.7 OXA ABO-12 30 mg / kg 32.3 2.6 31.5 2.4 33.6 2.8 30.6 3.4 33.0 2.8 OXA ABO-12 60 mg / kg 28.5 3.1 32.5 3.1 29.6 3.0 33.9 3.5 36.4 4.5 OXA ABO-12 100 mg / kg 30.7 3.5 35, 3 3.8 39.1 3.4 34.5 2.6 32.9 3.7 OXA ABO-12 300 mg / kg 32.2 3.4 39.5 2.2 ^ 46.7 2.6 * 45.1 3.9 * 41.5 4.3 ^ ^ P <0.05; * P <0.01 in vs CMC Each value represents the mean of 8 rats,

Tabella 4 Table 4

Curva dose risposta dell’estratto di ABO-09 sull’iperalgesia indotta da ossalilplatino nel test di pressione sulla zampa di ratto Dose response curve of ABO-09 extract on oxalylplatin-induced hyperalgesia in rat paw pressure test

Pressione sulla zampa nei ratti (g) TRATTAMENTO TRATTAMENTO Paw pressure in rats (g) TREATMENT TREATMENT

Pre-test 15 min. 30 min 45 min i.p. per os Pre-test 15 min. 30 min 45 min i.p. per os

SALINA CMC 57,4 3,5 61,8 5,4 67,4 6,3 62,3 5,4 OXA CMC 22,6 4,6 25,1 6,1 26,9 5,4 24,3 6,6 OXA ABO-09 30 mg/kg 21,7 1,2 58,1 3,5* 67,8 2,0* 29,1 2,0 ABO-09 60 SALINA CMC 57.4 3.5 61.8 5.4 67.4 6.3 62.3 5.4 OXA CMC 22.6 4.6 25.1 6.1 26.9 5.4 24.3 6 , 6 OXA ABO-09 30 mg / kg 21.7 1.2 58.1 3.5 * 67.8 2.0 * 29.1 2.0 ABO-09 60

OXA 24,5 1,3 48,2 4,6* 25,7 2,4 21,5 0,0 mg/kg OXA 24.5 1.3 48.2 4.6 * 25.7 2.4 21.5 0.0 mg / kg

Ossalilplatino 2,4 mg/kg per 5 giorni consecutivi alla settimana (15 iniezioni i.p. - dose cumulativa 36 mg/kg) ^ P< 0,05 * p> 0,01 Oxalylplatin 2.4 mg / kg for 5 consecutive days per week (15 i.p. injections - cumulative dose 36 mg / kg) ^ P <0.05 * p> 0.01

Il campione ABO-07 (particolarmente ricco di prociantocianosidi) viene scartato dall’analisi di successivi studi di approfondimento perché à ̈ efficace ad una sola posologia, la più alta, 300 mg/kg. The ABO-07 sample (particularly rich in prociantocyanosides) is discarded from the analysis of subsequent in-depth studies because it is effective at a single dose, the highest, 300 mg / kg.

I campioni ABO-10 (ricco di polifenoli, in particolare di catechine), ABO-11 (ricco di composti antiossidanti derivati del carnosolo) alla dose di 100 e 300 mg/kg fino a 90 minuti dopo l’assunzione e ABO-12 (elevata concentrazione di antocianosidi) alla dose di 300 mg/kg, l’unica attiva, ma a tutti i tempi valutati, fino a 120 minuti dall’assunzione. Samples ABO-10 (rich in polyphenols, in particular catechins), ABO-11 (rich in antioxidant compounds derived from carnosol) at a dose of 100 and 300 mg / kg up to 90 minutes after intake and ABO-12 (high concentration of anthocyanosides) at a dose of 300 mg / kg, the only active one, but at all times evaluated, up to 120 minutes from intake.

Il campione ABO-09 à ̈ in assoluto il più potente, essendo efficace anche a posologie molto basse: 30 mg/kg. The ABO-09 sample is by far the most powerful, being effective even at very low dosages: 30 mg / kg.

Sommario risultati ottenuti Summary of results obtained

Riepilogando questi sono i composti selezionati mediante screening in vitro per il loro potere antiossidante verso anione superossido generato da oxaliplatino che si sono poi rivelati efficaci anche nel modello in vivo, singolarmente con potenze più o meno paragonabili ad eccezione di ABO-09, che à ̈ risultato il più potente: In summary, these are the compounds selected by in vitro screening for their antioxidant power against superoxide anion generated by oxaliplatin which have then proved effective also in the in vivo model, individually with more or less comparable powers with the exception of ABO-09, which is most powerful result:

• ABO-09: estratto caratterizzato da un elevato contenuto di flavonoidi; â € ¢ ABO-09: extract characterized by a high content of flavonoids;

• ABO-10: estratto ad elevata concentrazione di catechine; â € ¢ ABO-10: extract with a high concentration of catechins;

• ABO-11: estratto ad elevata concentrazione di derivati del carnosolo; â € ¢ ABO-11: extract with a high concentration of carnosol derivatives;

• ABO-12: estratto ad elevata concentrazione di antocianosidi; â € ¢ ABO-12: extract with a high concentration of anthocyanosides;

La sperimentazione à ̈ proseguita andando a valutare l’efficacia in vivo di composizioni ottenute da una miscela di alcuni dei campioni (ABO-10, ABO-11 alla dose fisa di 100 mg/kg e ABO-12 alla dose fissa di 300 mg/kg) con il campione ABO-09 alle dosi variabili di 10, 30 e 60 mg/kg. I risultati sono riportati di seguito. The experimentation continued by evaluating the in vivo efficacy of compositions obtained from a mixture of some of the samples (ABO-10, ABO-11 at the fixed dose of 100 mg / kg and ABO-12 at the fixed dose of 300 mg / kg) with the ABO-09 sample at variable doses of 10, 30 and 60 mg / kg. The results are shown below.

Tabella 5 Valutazione nel ratto dell’azione antiperalgesica nel modello di neuropatia indotta da oxaliplatino di miscele dei singoli estratti con Abo-09 Effetto di alcune miscele di singoli estratti sull’iperalgesia indotta nel ratto da oxaliplatino (paw-pressure test ) Table 5 Evaluation in rats of the antiperalgesic action in the oxaliplatin-induced neuropathy model of mixtures of single extracts with Abo-09 Effect of some mixtures of single extracts on oxaliplatin-induced hyperalgesia in rats (paw-pressure test)

Test della pressione sulla zampa (g) Paw pressure test (g)

TRATTAMENTO mg/kg Prima del Dopo il trattamento TREATMENT mg / kg Before after After treatment

,p.o. tratt. ,bit. treat.

30 min 60 min 90 min 120 min CMC 60,5 3,0 59,4 3,1 63,1 3,5 58,8 4,2 61,7 4,3 OXALIPLATINO 30,4 2,5 31,3+ 3,5 32,4 2,9 31,6 3,4 28,8 3,1 OXA ABO-0910 mg/kg 31,9+ 2,8 44,3 3,7* 45,3 4,1* 40,6 3,9* 34,0 3,5 ABO-10 100 mg/kg 30 min 60 min 90 min 120 min CMC 60.5 3.0 59.4 3.1 63.1 3.5 58.8 4.2 61.7 4.3 OXALIPLATINE 30.4 2.5 31.3+ 3.5 32.4 2.9 31.6 3.4 28.8 3.1 OXA ABO-0910 mg / kg 31.9+ 2.8 44.3 3.7 * 45.3 4.1 * 40 , 6 3.9 * 34.0 3.5 ABO-10 100 mg / kg

OXA ABO-0930 mg/kg 28,4 2,6 57,1 4,4* 61,1 3,8* 55,2 4,6* 39,6 3,5^ ABO-10 100 mg/kg OXA ABO-0930 mg / kg 28.4 2.6 57.1 4.4 * 61.1 3.8 * 55.2 4.6 * 39.6 3.5 ^ ABO-10 100 mg / kg

OXA ABO-0960 mg/kg 30,5 3,1 58,3 4,1* 59,5 3,4* 53,8 3,8* 36,2 4,5 ABO-10 100 mg/kg OXA ABO-0960 mg / kg 30.5 3.1 58.3 4.1 * 59.5 3.4 * 53.8 3.8 * 36.2 4.5 ABO-10 100 mg / kg

OXA ABO-0910 mg/kg 31,7 2,8 41,6 3,5* 43,5 3,9* 39,8 3,2^ 32,3 3,9 ABO-12 300 mg/kg OXA ABO-0910 mg / kg 31.7 2.8 41.6 3.5 * 43.5 3.9 * 39.8 3.2 ^ 32.3 3.9 ABO-12 300 mg / kg

OXA ABO-0930 mg/kg 32,5 3,1 44,5 4,0^ 42,3 4,1* 40,9 3,8^ 35,7 3,1 ABO-12 300 mg/kg OXA ABO-0930 mg / kg 32.5 3.1 44.5 4.0 ^ 42.3 4.1 * 40.9 3.8 ^ 35.7 3.1 ABO-12 300 mg / kg

OXA ABO-0960 mg/kg 29,1 2,9 45,7 3,1* 59,2 4,2* 57,2 3,3* 42,9 3,5 ABO-12 300 mg/kg OXA ABO-0960 mg / kg 29.1 2.9 45.7 3.1 * 59.2 4.2 * 57.2 3.3 * 42.9 3.5 ABO-12 300 mg / kg

OXA ABO-0910 mg/kg 28,4 2,5 46,3 3,2* 48,7 3,5* 41,9 3,0* 36,6 3,0 ABO-11 100 mg/kg OXA ABO-0910 mg / kg 28.4 2.5 46.3 3.2 * 48.7 3.5 * 41.9 3.0 * 36.6 3.0 ABO-11 100 mg / kg

OXA ABO-0930 mg/kg 32,3 3,0 52,5 3,8* 51,2 3,9* 46,3 3,6* 38,8 4,4 ABO-11 100 mg/kg OXA ABO-0930 mg / kg 32.3 3.0 52.5 3.8 * 51.2 3.9 * 46.3 3.6 * 38.8 4.4 ABO-11 100 mg / kg

OXA ABO-0960 mg/kg 30,1 3,1 59,1 3,2* 58,1 4,2* 51,6 3,7* 44,5 3,6 ABO-11 100 mg/kg OXA ABO-0960 mg / kg 30.1 3.1 59.1 3.2 * 58.1 4.2 * 51.6 3.7 * 44.5 3.6 ABO-11 100 mg / kg

Effetto di alcune miscele di singoli estratti sull’iperalgesia indotta nel ratto da oxaliplatino (paw-pressure test ) Effect of some mixtures of single extracts on oxaliplatin-induced hyperalgesia in rats (paw-pressure test)

Test della pressione sulla zampa (g) Paw pressure test (g)

TRATTAMENTO mg/kg Prima del Dopo il trattamento TREATMENT mg / kg Before after After treatment

,p.o. tratt. ,bit. treat.

OXA ABO-0910 mg/kg 30,5 2,7 39,2 2,5 37,5 3,4 35,6 3,5 35,1 2,7 ABO-21 100 mg/kg OXA ABO-0910 mg / kg 30.5 2.7 39.2 2.5 37.5 3.4 35.6 3.5 35.1 2.7 ABO-21 100 mg / kg

OXA ABO-0930 mg/kg 29,4 3,2 41,8 3,0* 43,6 2,9* 38,8 3,1 32,9 2,5 ABO-21 100 mg/kg OXA ABO-0930 mg / kg 29.4 3.2 41.8 3.0 * 43.6 2.9 * 38.8 3.1 32.9 2.5 ABO-21 100 mg / kg

OXA ABO-0960 mg/kg 32,8 3,4 40,5 3,2^ 44,7 3,2* 37,1 2,5 30,6 2,2 ABO-21 100 mg/kg OXA ABO-0960 mg / kg 32.8 3.4 40.5 3.2 ^ 44.7 3.2 * 37.1 2.5 30.6 2.2 ABO-21 100 mg / kg

^P< 0,05; *P< 0,01 in vs CMC, Ciascun valore rappresenta la media di 8 ratti, ^ P <0.05; * P <0.01 in vs CMC, Each value represents the mean of 8 rats,

I risultati dimostrano che le associazioni hanno prodotto risultati migliori arrivando anche a valori uguali al controllo negativo, con solo CMC. The results show that the combinations produced better results even reaching values equal to the negative control, with only CMC.

3 Valutazione in vitro della capacità di miscele dei singoli estratti di modulare i processi apoptotici indotti da oxaliplatino 3 In vitro evaluation of the ability of mixtures of single extracts to modulate the apoptotic processes induced by oxaliplatin

Le associazioni di estratti vegetali risultate efficaci nel far regredire, nell’animale da esperimento il dolore neuropatico indotto da oxaliplatino sono state esaminate in vitro al fine di escludere che l’azione neuroprotettiva da esse esibita nei confronti dell’ agente chemioterapico in esame causasse la sopravvivenza anche delle cellule tumorali inficiando l’azione dell’oxaliplatino. The combinations of plant extracts found to be effective in reversing the neuropathic pain induced by oxaliplatin in the experimental animal were examined in vitro in order to exclude that the neuroprotective action they exhibited against the chemotherapeutic agent under examination. also caused the survival of tumor cells by invalidating the action of oxaliplatin.

Nell’ambito di questa ricerca abbiamo focalizzato la nostra attenzione su una linea tumorale di cellule HT-29 di carcinoma di colon umano (neoplasia particolarmente sensibile all’oxaliplatino) dove abbiamo indotto il danno dal chemioterapico in esame. La vitalità delle cellule incubate con oxaliplatino à ̈ stata valutata in presenza ed in assenza delle preparazioni in esame. Inoltre sulla stessa linea cellulare à ̈ stata valutata la capacità pro-apoptotica dell’agente antitumorale anche in questo caso in presenza ed in assenza delle associazioni di estratti vegetali. In particolare abbiamo valutato, l’effetto di esse sull’attività enzimatica di caspasi 3, effettore centrale della cascata apoptotica (Springer, J Biochem Mol Biol, 35: 94-105, 2002) mediante un saggio fluorescente. In pratica abbiamo misurato l’azione apoptotica dell’oxaliplatino e l’abbiamo confrontata con quella esplicata dall’agente chemioterapico in presenza delle suddette associazioni. In questo modo abbiamo verificato che un eventuale effetto antiapoptotico degli estratti non infici l’azione antineoplastica dell’oxaliplatino. As part of this research we have focused our attention on a tumor line of HT-29 human colon carcinoma cells (neoplasm particularly sensitive to oxaliplatin) where we induced the damage from the chemotherapy under examination. The viability of the cells incubated with oxaliplatin was evaluated in the presence and absence of the preparations under examination. Furthermore, the pro-apoptotic capacity of the antitumor agent was evaluated on the same cell line also in this case in the presence and absence of the associations of plant extracts. In particular, we evaluated their effect on the enzymatic activity of caspase 3, the central effector of the apoptotic cascade (Springer, J Biochem Mol Biol, 35: 94-105, 2002) by means of a fluorescent assay. In practice, we measured the apoptotic action of oxaliplatin and compared it with that exerted by the chemotherapeutic agent in the presence of the aforementioned associations. In this way we have verified that any antiapoptotic effect of the extracts does not affect the antineoplastic action of oxaliplatin.

Sulla base di quanto esposto, nell’ambito della ricerca sono state testate in una linea cellulare tumorale umana di colon retto (HT 29), in presenza di oxaliplatino, le seguenti quattro associazioni, estratto di ABO-09 con ABO-21, o ABO-11 o ABO-10 o ABO-12 variamente combinati, e denominati: On the basis of the above, the following four associations, extract of ABO-09 with ABO-21, were tested in a human colorectal cancer cell line (HT 29) in the presence of oxaliplatin, or ABO-11 or ABO-10 or ABO-12 variously combined, and denominated:

Associazione ABO-09 e ABO-21 ABO-09 and ABO-21 Association

ABO-09-21/ 10 (ABO-09: 9% - ABO-21: 91%) ABO-09-21 / 10 (ABO-09: 9% - ABO-21: 91%)

ABO-09-21 / 30 (ABO-09, 23% -ABO-21: 77%) ABO-09-21 / 30 (ABO-09, 23% -ABO-21: 77%)

ABO-09-21 / 60 (ABO-09: 37,5% – ABO-21: 62,5%); ABO-09-21 / 60 (ABO-09: 37.5% â € “ABO-21: 62.5%);

Associazione ABO-09 e ABO-11 ABO-09 and ABO-11 Association

ABO-09-11 /10 (ABO-09: 9% - ABO-11: 91%) ABO-09-11 / 10 (ABO-09: 9% - ABO-11: 91%)

ABO-09-11/ 30 (ABO-09: 23% - ABO-11: 77%) ABO-09-11 / 30 (ABO-09: 23% - ABO-11: 77%)

ABO-09-11/ 60 (ABO-09: 37,5% - ABO-11: 62,5%) ABO-09-11 / 60 (ABO-09: 37.5% - ABO-11: 62.5%)

Associazione ABO-09 e ABO-10 ABO-09 and ABO-10 Association

ABO-09-10 /10 (ABO-09: 9% - ABO-10: 91%) ABO-09-10 / 10 (ABO-09: 9% - ABO-10: 91%)

ABO-09-10/ 30 (ABO-09: 23% - ABO-10: 77%) ABO-09-10 / 30 (ABO-09: 23% - ABO-10: 77%)

ABO-09-10/ 60 (ABO-09: 37,5% - ABO-10: 62,5%) ABO-09-10 / 60 (ABO-09: 37.5% - ABO-10: 62.5%)

Associazione ABO-09 e ABO-12 ABO-09 and ABO-12 Association

ABO-09-12 /10 (ABO-09: 9% - ABO-12: 91%) ABO-09-12 / 10 (ABO-09: 9% - ABO-12: 91%)

ABO-09-12/ 30 (ABO-09: 23% - ABO-12: 77%) ABO-09-12 / 30 (ABO-09: 23% - ABO-12: 77%)

ABO-09-12/ 60 (ABO-09: 37,5% - ABO-12: 62,5%) ABO-09-12 / 60 (ABO-09: 37.5% - ABO-12: 62.5%)

Risultati: Results:

L’associazione ABO-09-ABO-12 non interferisce con l’azione di oxaliplatino sulla linea tumorale HT-29 né in termini di vitalità cellulare né in termini di morte cellulare programmata. L’associazione ABO-09-ABO-11 riduce l’azione antitumorale oxaliplatino-dipendente solo in termini di mortalità a 48h e solo nei confronti della concentrazione più alta di oxaliplatino. Non altera il fenomeno apoptotico. Le combinazione ABO-09-21/30 e 60 riducono la mortalità indotta da oxaliplatino dopo 48h di incubazione e la sua azione apoptotica. Le combinazioni ABO-09-10/30 e 60 riducono la mortalità indotta da oxaliplatino dopo 24h di incubazione così come la sua azione apoptotica. The ABO-09-ABO-12 association does not interfere with the action of oxaliplatin on the HT-29 tumor line neither in terms of cell viability nor in terms of programmed cell death. The ABO-09-ABO-11 association reduces the oxaliplatin-dependent antitumor action only in terms of mortality at 48h and only against the higher oxaliplatin concentration. It does not alter the apoptotic phenomenon. The combinations ABO-09-21 / 30 and 60 reduce the mortality induced by oxaliplatin after 48h of incubation and its apoptotic action. The combinations ABO-09-10 / 30 and 60 reduce the mortality induced by oxaliplatin after 24h of incubation as well as its apoptotic action.

Tabella 1 A: VITALITA’ CELLULARE % DOPO 24H D’INCUBAZIONE CON OXALIPLATINO A CONCENTRAZIONI CRESCENTI: Table 1 A: CELLULAR VITALITY% AFTER 24H INCUBATION WITH GROWING CONCENTRATION OXALIPLATIN:

ABO-09-21 (50 µg/mL) ABO-09-21 (50 µg / mL)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-21/ 10 ABO-09-21/ 30 ABO-09-21/60 oxaliplatino (µM) Control Concentration ABO-09-21 / 10 ABO-09-21 / 30 ABO-09-21 / 60 oxaliplatin (µM)

0 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 0 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6

0,3 87,5 ± 7,3 89,7 ± 3,2 90,2 ± 2,6 91,1 ± 1,6 0.3 87.5 ± 7.3 89.7 ± 3.2 90.2 ± 2.6 91.1 ± 1.6

1 84,0 ± 4,5 86,6 ± 0,9 89,3 ± 1,2 89,6 ± 1,4 1 84.0 ± 4.5 86.6 ± 0.9 89.3 ± 1.2 89.6 ± 1.4

3 84,0 ± 2,9 85,3 ± 2,0 84,8 ± 1,7 87,5 ± 4,5 3 84.0 ± 2.9 85.3 ± 2.0 84.8 ± 1.7 87.5 ± 4.5

10 78,7 ± 3,5 81,8 ± 4,0 83,6 ± 2,2 82,7 ± 3,3 Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino 10 78.7 ± 3.5 81.8 ± 4.0 83.6 ± 2.2 82.7 ± 3.3 Cell vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-21/ 10 ABO-09-21/ 30 ABO-09-21/60 oxaliplatino (µM) Control Concentration ABO-09-21 / 10 ABO-09-21 / 30 ABO-09-21 / 60 oxaliplatin (µM)

30 73,9 ± 3,4 80,1 ± 3,3 79,8 ± 1,9 80,1 ± 2,3 30 73.9 ± 3.4 80.1 ± 3.3 79.8 ± 1.9 80.1 ± 2.3

100 62,4 ± 2,5 68,3 ± 4,5 69,1 ± 4,3 69,4 ± 3,4 100 62.4 ± 2.5 68.3 ± 4.5 69.1 ± 4.3 69.4 ± 3.4

Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza ABO-09-21 (50 µg/mL), I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti, La condizione di controllo à ̈ fissata a 100% Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-21 (50 µg / mL), Values are expressed in percentage as mean ± s.e.m of 6 experiments, The control condition is set at 100%

Tabella 1 B: Vitalita’ cellulare % dopo 48h d’incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti: effetto dell’estratto di abo-09-21 (50 µg/ml) Table 1 B: Cell vitality% after 48h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of abo-09-21 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-21/10 ABO-09-21/ 30 ABO-09-oxaliplatino (µM) 21/60 Control Concentration ABO-09-21 / 10 ABO-09-21 / 30 ABO-09-oxaliplatin (µM) 21/60

0 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 0 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5

0,3 89,1 ± 2,7 89,8 ± 2,8 89,2 ± 3,4 89,8 ± 3,1 0.3 89.1 ± 2.7 89.8 ± 2.8 89.2 ± 3.4 89.8 ± 3.1

1 79,2 ± 3,8 82,5 ± 2,5 84,8 ± 2,2 83,7 ± 2,3 1 79.2 ± 3.8 82.5 ± 2.5 84.8 ± 2.2 83.7 ± 2.3

3 76,2 ± 4,3 77,8 ± 2,3 82,4 ± 4,0 82,6 ± 1,6 Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino 3 76.2 ± 4.3 77.8 ± 2.3 82.4 ± 4.0 82.6 ± 1.6 Cell vitality% Treatment with oxaliplatin

10 74,3 ± 3,2 76,5 ± 1,9 79,2 ± 2,0 79,7 ± 1,1 10 74.3 ± 3.2 76.5 ± 1.9 79.2 ± 2.0 79.7 ± 1.1

30 67,7 ± 4,2 65,7 ± 1,3 75,3 ± 1,7 73,6 ± 2,5 * 30 67.7 ± 4.2 65.7 ± 1.3 75.3 ± 1.7 73.6 ± 2.5 *

100 44,0 ± 1,7 47,5 ± 1,0 52,8 ± 1,6 * 54,2 ± 1,7 * 100 44.0 ± 1.7 47.5 ± 1.0 52.8 ± 1.6 * 54.2 ± 1.7 *

Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza dell’estratto IPE- Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of the IPE- extract.

Tabella 2 A: Vitalità cellulare % dopo 24h d’incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti:effetto dell’estratto di Abo-09-11 (50 µg/ml) Table 2 A: Cell viability% after 24h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of Abo-09-11 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-11/ 10 ABO-09-11/ 30 ABO-09-11/ 60 Control Concentration ABO-09-11 / 10 ABO-09-11 / 30 ABO-09-11 / 60

0 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 0,3 87,5 ± 7,3 99,3 ± 4,1 90,2 ± 2,7 91,1 ± 1,6 0 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 0.3 87.5 ± 7.3 99.3 ± 4.1 90.2 ± 2.7 91.1 ± 1.6

1 84,0 ± 5,5 90,9 ± 2,4 89,3 ± 1,2 89,6 ± 1,4 1 84.0 ± 5.5 90.9 ± 2.4 89.3 ± 1.2 89.6 ± 1.4

3 84,0 ± 2,9 90,2 ± 3,4 84,9 ± 1,7 87,5 ± 1,3 3 84.0 ± 2.9 90.2 ± 3.4 84.9 ± 1.7 87.5 ± 1.3

10 78,7 ± 3,5 84,6 ± 4,3 83,6 ± 2,2 82,6 ± 3,3 10 78.7 ± 3.5 84.6 ± 4.3 83.6 ± 2.2 82.6 ± 3.3

30 73,9 ± 3,4 78,8 ± 3,1 79,0 ± 2,2 80,1 ± 2,9 30 73.9 ± 3.4 78.8 ± 3.1 79.0 ± 2.2 80.1 ± 2.9

100 62,4 ± 2,5 68,0 ± 5,3 68,3 ± 3,3 69,1 ± 4,3 100 62.4 ± 2.5 68.0 ± 5.3 68.3 ± 3.3 69.1 ± 4.3

Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza di ABO-09-11 (50 µg/mL). I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti. La condizione di controllo à ̈ fissata a 100%. Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-11 (50 µg / mL). The values are expressed as a percentage of the mean ± s.e.m of 6 experiments. The check condition is set at 100%.

Tabella 2 B: Vitalità cellulare % dopo 48h d’incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti: effetto dell’estratto di abo-09-11 (50 µg/ml) Table 2 B: Cell viability% after 48h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of abo-09-11 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-11/ 10 ABO-09-11/ 30 ABO-09-11/ oxaliplatino (µM) 60 Control Concentration ABO-09-11 / 10 ABO-09-11 / 30 ABO-09-11 / oxaliplatin (µM) 60

0<100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5>0 <100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5>

0,3<89,1 ± 2,7 80,4 ± 1,4 86,2 ± 2,4 88,1 ± 3,6>1<79,2 ± 3,8 77,4 ± 0,8 81,6 ± 1,2 81,2 ± 4,2>3<76,2 ± 4,3 75,1 ± 1,9 80,3 ± 2,1 77,8 ± 2,8>10<74,3 ± 3,2 70,7 ± 2,1 73,7 ± 1,6 77,7 ± 6,0>30<67,7 ± 4,2 67,0 ± 1,3 71,2 ± 1,8 73,1 ± 5,0>100<44,0 ± 1,7 49,5 ± 1,7 57,9 ± 1,5* 59,4 ± 2,1*>Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza di ABO-09-11 (50 µg/mL). I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti. La condizione di controllo à ̈ fissata a 100%. *P <0,05 rispetto a controllo. 0.3 <89.1 ± 2.7 80.4 ± 1.4 86.2 ± 2.4 88.1 ± 3.6> 1 <79.2 ± 3.8 77.4 ± 0.8 81 , 6 ± 1.2 81.2 ± 4.2> 3 <76.2 ± 4.3 75.1 ± 1.9 80.3 ± 2.1 77.8 ± 2.8> 10 <74.3 ± 3.2 70.7 ± 2.1 73.7 ± 1.6 77.7 ± 6.0> 30 <67.7 ± 4.2 67.0 ± 1.3 71.2 ± 1.8 73 , 1 ± 5.0> 100 <44.0 ± 1.7 49.5 ± 1.7 57.9 ± 1.5 * 59.4 ± 2.1 *> Human colorectal cancer cells (HT- 29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-11 (50 µg / mL). The values are expressed as a percentage of the mean ± s.e.m of 6 experiments. The check condition is set at 100%. * P <0.05 compared to control.

Tabella 3 A: Vitalità cellulare % dopo 24h d’incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti: effetto dell’estratto di abo-09-10 (50 µg/ml) Table 3 A: Cell viability% after 24h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of abo-09-10 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-10/ 10 ABO-09-10/ 30 ABO-09-10/ 60 Control Concentration ABO-09-10 / 10 ABO-09-10 / 30 ABO-09-10 / 60

0 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 0,3 87,5 ± 7,3 85,2 ± 6,1 80,6 ± 9,4 85,3 ± 5,7 0 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 0.3 87.5 ± 7.3 85.2 ± 6.1 80.6 ± 9.4 85.3 ± 5.7

1 84,0 ± 5,5 83,2 ± 8,3 81,7 ± 7,5 84,1 ± 9,5 1 84.0 ± 5.5 83.2 ± 8.3 81.7 ± 7.5 84.1 ± 9.5

3 84,0 ± 2,9 80,9 ± 4,0 80,7 ± 9,0 77,2 ± 3,2 3 84.0 ± 2.9 80.9 ± 4.0 80.7 ± 9.0 77.2 ± 3.2

10 78,7 ± 3,5 79,5 ± 2,6 80,2 ± 1,9 77,1 ± 2,3 10 78.7 ± 3.5 79.5 ± 2.6 80.2 ± 1.9 77.1 ± 2.3

30 73,9 ± 3,4 70,7 ± 3,0 76,9 ± 6,5 74,0 ± 3,0 30 73.9 ± 3.4 70.7 ± 3.0 76.9 ± 6.5 74.0 ± 3.0

100 62,4 ± 2,5 69,2 ± 4,1 72,4 ± 1,9 * 72,8 ± 1,0 * Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza di ABO-09-10 (50 µg/mL). I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti. La condizione di controllo à ̈ fissata a 100%. * P < 0,05 rispetto al controllo. 100 62.4 ± 2.5 69.2 ± 4.1 72.4 ± 1.9 * 72.8 ± 1.0 * Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-10 (50 µg / mL). The values are expressed as a percentage of the mean ± s.e.m of 6 experiments. The check condition is set at 100%. * P <0.05 compared to the control.

Tabella 3 B: Vitalità cellulare % dopo 48h d’incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti: effetto dell’estratto di abo-09-10 (50 µg/ml) Table 3 B: Cell viability% after 48h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of abo-09-10 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-10/ 10 ABO-09-10/ 30 ABO-09-10/ 60 oxaliplatino (µM) Control Concentration ABO-09-10 / 10 ABO-09-10 / 30 ABO-09-10 / 60 oxaliplatin (µM)

0 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 0,3 89,1 ± 2,7 88,3 ± 6,6 85,6 ± 7,1 89,6 ± 2,8 1 79,2 ± 3,8 79,2 ± 3,9 72,0 ± 2,3 75,6 ± 1,6 0 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 0.3 89.1 ± 2.7 88.3 ± 6.6 85.6 ± 7.1 89.6 ± 2.8 1 79.2 ± 3.8 79.2 ± 3.9 72.0 ± 2.3 75.6 ± 1.6

3 76,2 ± 4,3 70,3 ± 3,4 58,2 ± 1,6 65,6 ± 6,6 10 74,3 ± 3,2 65,3 ± 2,5 57,2 ± 2,8 69,9 ± 5,2 30 67,7 ± 4,2 62,8 ± 1,1 55,6 ± 1,6 60,4 ± 3,1 3 76.2 ± 4.3 70.3 ± 3.4 58.2 ± 1.6 65.6 ± 6.6 10 74.3 ± 3.2 65.3 ± 2.5 57.2 ± 2, 8 69.9 ± 5.2 30 67.7 ± 4.2 62.8 ± 1.1 55.6 ± 1.6 60.4 ± 3.1

100 44,0 ± 1,7 46,8 ± 2,7 46,0 ± 1,0 48,2 ± 2,7 100 44.0 ± 1.7 46.8 ± 2.7 46.0 ± 1.0 48.2 ± 2.7

Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza di ABO-09-10 (50 µg/mL). I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti. La condizione di controllo à ̈ fissata a 100%. Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-10 (50 µg / mL). The values are expressed as a percentage of the mean ± s.e.m of 6 experiments. The check condition is set at 100%.

Tabella 4 A: Vitalità cellulare % dopo 24h d’incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti: effetto dell’estratto di abo-09-12 (50 µg/ml) Table 4 A: Cell viability% after 24h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of abo-09-12 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-12/10 ABO-09-12/30 ABO-09-12/60 Control Concentration ABO-09-12 / 10 ABO-09-12 / 30 ABO-09-12 / 60

0 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 100,0 ± 2,6 0,3 87,5 ± 7,3 91,0 ± 1,6 93,6 ± 2,2 96,1 ± 2,6 0 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 100.0 ± 2.6 0.3 87.5 ± 7.3 91.0 ± 1.6 93.6 ± 2.2 96.1 ± 2.6

1 84,0 ± 5,5 90,5 ± 2,5 89,7 ± 2,3 92,5 ± 2,3 Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino 1 84.0 ± 5.5 90.5 ± 2.5 89.7 ± 2.3 92.5 ± 2.3 Cell vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-12/10 ABO-09-12/30 ABO-09-12/60 Control Concentration ABO-09-12 / 10 ABO-09-12 / 30 ABO-09-12 / 60

3 84,0 ± 2,9 87,4 ± 2,2 87,0 ± 0,4 88,6 ± 5,0 3 84.0 ± 2.9 87.4 ± 2.2 87.0 ± 0.4 88.6 ± 5.0

10 78,7 ± 3,5 84,6 ± 0,5 85,1 ± 2,2 87,3 ± 3,5 30 73,9 ± 3,4 75,1 ± 2,0 76,9 ± 1,3 81,3 ± 1,4 100 62,4 ± 2,5 62,7 ± 1,1 63,2 ± 2,8 65,5 ± 2,6 10 78.7 ± 3.5 84.6 ± 0.5 85.1 ± 2.2 87.3 ± 3.5 30 73.9 ± 3.4 75.1 ± 2.0 76.9 ± 1, 3 81.3 ± 1.4 100 62.4 ± 2.5 62.7 ± 1.1 63.2 ± 2.8 65.5 ± 2.6

Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0.3 - 100 µM) in presenza o in assenza di ABO-09-12 (50 µg/mL). I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti. La condizione di controllo à ̈ fissata a 100%. Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin (0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-12 (50 µg / mL). The values are expressed as a percentage of the mean ± s.e.m of 6 experiments. The check condition is set at 100%.

Tabella 4 B: Vitalità cellulare % dopo 48h di incubazione con oxaliplatino a concentrazioni crescenti: effetto dell’estratto di abo-09-12 (50 µg/ml) Table 4 B: Cell viability% after 48h of incubation with oxaliplatin at increasing concentrations: effect of abo-09-12 extract (50 µg / ml)

Vitalità cellulare % Trattamento con oxaliplatino Cellular vitality% Treatment with oxaliplatin

Concentrazione di Controllo ABO-09-12/10 ABO-09-12/30 ABO-09-12/60 Control Concentration ABO-09-12 / 10 ABO-09-12 / 30 ABO-09-12 / 60

0 100,0 ± 1.5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 100,0 ± 1,5 0 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5 100.0 ± 1.5

0,3 89,1 ± 2,7 92,1 ± 3,0 91,8 ± 4,5 94,9 ± 3,1 0.3 89.1 ± 2.7 92.1 ± 3.0 91.8 ± 4.5 94.9 ± 3.1

1 79,2 ± 3,8 89,2 ± 6,4 85,9 ± 3,6 83,3 ± 3,5 1 79.2 ± 3.8 89.2 ± 6.4 85.9 ± 3.6 83.3 ± 3.5

3 76,2 ± 4,3 81,9 ± 2,5 80,0 ± 3,6 80,1 ± 3,9 3 76.2 ± 4.3 81.9 ± 2.5 80.0 ± 3.6 80.1 ± 3.9

10 74,3 ± 3,2 80,4 ± 3,6 76,3 ± 2,0 76,9 ± 5,9 10 74.3 ± 3.2 80.4 ± 3.6 76.3 ± 2.0 76.9 ± 5.9

30 67,7 ± 4,2 69,0 ± 2,6 68,6 ± 3,0 71,1 ± 2,0 30 67.7 ± 4.2 69.0 ± 2.6 68.6 ± 3.0 71.1 ± 2.0

100 44,0 ± 1,7 43,2 ± 2,0 40,5 ± 1,2 42,3 ± 1,9 Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state esposte a concentrazioni crescenti di oxaliplatino (0,3 - 100 µM) in presenza o in assenza di ABO-09-12 (50 µg/mL). I valori sono espressi in percentuale come media ± s.e.m di 6 esperimenti. La condizione di controllo à ̈ fissata a 100%. 100 44.0 ± 1.7 43.2 ± 2.0 40.5 ± 1.2 42.3 ± 1.9 Human colorectal cancer cells (HT-29) were exposed to increasing concentrations of oxaliplatin ( 0.3 - 100 µM) in the presence or absence of ABO-09-12 (50 µg / mL). The values are expressed as a percentage of the mean ± s.e.m of 6 experiments. The check condition is set at 100%.

ATTIVITA’ % DI CASPASI 3 DOPO 4H D’INCUBAZIONE CON OXALIPLATINO 100 µM: EFFETTO DI ASSOCIAZIONI DI ESTRATTI (50 ÎœG/ML) ACTIVITY% OF CASPASIS 3 AFTER 4 HOURS OF INCUBATION WITH OXALIPLATIN 100 µM: EFFECT OF ASSOCIATION OF EXTRACTS (50 ÎœG / ML)

Oxaliplatino 100 µM Oxaliplatin 100 µM

Trattamento Controllo Oxaliplatino ABO-09- 10 ABO-09- 30 ABO-09- 60 Oxaliplatin Control Treatment ABO-09- 10 ABO-09- 30 ABO-09- 60

100 µM mg/kg mg/kg mg/kg 100 µM mg / kg mg / kg mg / kg

ABO-09 – 100,0 ± 9,0 142,1 ± ,8,1* 105,0 ± 6,4^ 100,9 ± 2,4^ 115,3 ± 5,5^ ABO-21 ABO-09 - 100.0 ± 9.0 142.1 ±, 8.1 * 105.0 ± 6.4 ^ 100.9 ± 2.4 ^ 115.3 ± 5.5 ^ ABO-21

ABO-09- 142,5 ± 2,7 135,8 ± 2,2 133,3 ± 10,1 ABO-11 ABO-09- 142.5 ± 2.7 135.8 ± 2.2 133.3 ± 10.1 ABO-11

ABO-09- 100,1 ± 9,2^ 117,9 ± 7,3^ 118,5 ± 3,3^ ABO-10 ABO-09- 100.1 ± 9.2 ^ 117.9 ± 7.3 ^ 118.5 ± 3.3 ^ ABO-10

ABO-09- 138,3 ± 8,0 144,9 ± 1,6 145,3 ± 0,7 ABO-12 ABO-09- 138.3 ± 8.0 144.9 ± 1.6 145.3 ± 0.7 ABO-12

Cellule umane tumorali di colon-retto (HT-29) sono state incubate con oxaliplatino 100 µM in presenza o in assenza delle combinazioni di estratti descritte alla concentrazione di 50 µg/mL. La condizione basale, controllo, Ã ̈ stata fissata arbitrariamente come 100%. I valori sono espressi come media ± s.e.m di 6 esperimenti. *P<0.05 rispetto al controllo, ^P<0.05 rispetto al trattamento con oxaliplatino da solo. Human colorectal cancer cells (HT-29) were incubated with oxaliplatin 100 µM in the presence or absence of the combinations of extracts described at a concentration of 50 µg / mL. Baseline condition, control, was arbitrarily set as 100%. Values are expressed as mean ± s.e.m of 6 experiments. * P <0.05 compared to the control, ^ P <0.05 compared to treatment with oxaliplatin alone.

I dati della interferenza con l’attività dell’oxaliplatino, hanno dato indicazioni che ABO-10 (ricco in catechine) e ABO-21 (ricco in antocianosidi) hanno ridotto in maniera significativa l’attività citotossica dell’oxaliplatino, provocando quindi interferenze di tipo farmacodinamico. Sono stati quindi esclusi da ulteriori approfondimenti. The data of the interference with oxaliplatin activity, have given indications that ABO-10 (rich in catechins) and ABO-21 (rich in anthocyanosides) significantly reduced the cytotoxic activity of oxaliplatin, thus causing pharmacodynamic interferences. They were therefore excluded from further investigation.

Riepilogando, in base a tutti i risultati degli studi preclinici effettuati sono stati selezionati ABO-09 come fonte di flavonoidi e le ABO-12 come fonte di antocianosidi ma anche di vitamina B6. In summary, based on all the results of the preclinical studies carried out, ABO-09 was selected as a source of flavonoids and ABO-12 as a source of anthocyanosides but also of vitamin B6.

A complemento dell’azione antiossidante nella formulazione à ̈ stata aggiunta una fonte di vitamina B1 (lievito di birra) e una fonte di aminoacidi essenziali (pappa reale), mentre l’apporto di vitamina B6 à ̈ garantito dall’estratto di vite rossa. To complement the antioxidant action in the formulation, a source of vitamin B1 (brewer's yeast) and a source of essential amino acids (royal jelly) have been added, while the supply of vitamin B6 is guaranteed by the extract of Red grapevine.

2.2 Valutazione in vitro della capacità dell’associazione di polifenoli totali (con flavonoidi e con quercetina), antocianosidi e vitamina B1, B6 e aminoacidi essenziali (ABO-09+ ABO-21 fonte di aa essenziali e ramificati) di modulare i processi apoptotici indotti da oxaliplatino 2.2 In vitro evaluation of the ability of the association of total polyphenols (with flavonoids and quercetin), anthocyanosides and vitamins B1, B6 and essential amino acids (ABO-09 + ABO-21 source of essential and branched aa) to modulate apoptotic processes induced by oxaliplatin

La formulazione a base di ABO-09, ABO-12, lievito (B1) e papa reale à ̈ stata testata in 3 linee cellulari (mammella MDA-MB231, polmone H1299, colon HCT116) trattate per 72h con dosi crescenti di chemioterapico, neurodol o entrambi. The formulation based on ABO-09, ABO-12, yeast (B1) and royal pope has been tested in 3 cell lines (breast MDA-MB231, lung H1299, colon HCT116) treated for 72h with increasing doses of chemotherapy, neurodol or both.

2.2.1. Materiali e metodi 2.2.1. Materials and methods

Condizioni di coltura cellulare: le cellule sono state coltivate in terreno DMEM/F-12 Glutamax (Invitrogen) al quale à ̈ stato aggiunto FBS 10% (Invitrogen) e Insulina 5µgr/ml (SIGMA), temperatura 37°C, 5% CO2 e umidità costante. Cell culture conditions: cells were grown in DMEM / F-12 Glutamax medium (Invitrogen) to which 10% FBS (Invitrogen) and Insulin 5µgr / ml (SIGMA), temperature 37 ° C, 5% CO2 was added and constant humidity.

Assay di vitalità cellulare: à ̈ stato utilizzato il kit ATPlite 1step (PerkinElmer) seguendo le istruzioni consigliate dal protocollo PerkinElmer. Cell viability assay: The ATPlite 1step kit (PerkinElmer) was used following the instructions recommended by the PerkinElmer protocol.

Reagenti: Pemetrexed (ALIMTA, Lilly), Paclitaxel (Mylan), Oxaliplatino (Eloxatin, Sanofi Aventis), 5 Fluorouracile (Teva), associazione Aboca. Reagents: Pemetrexed (ALIMTA, Lilly), Paclitaxel (Mylan), Oxaliplatin (Eloxatin, Sanofi Aventis), 5 Fluorouracil (Teva), Aboca association.

Le tre linee sono state trattate per 72h con dosi crescenti di chemioterapico, neurodol o entrambi. The three lines were treated for 72h with increasing doses of chemotherapy, neurodol or both.

2.2.2. Risultati 2.2.2. Results

Linea di tumore della mammella: Vitalità cellulare della linea di mammella mda-mb-231 rilevata a 72 h dopo trattamento con dosi crescenti dell’associazione (da 150 µg/ml a 8 mg/ml) (A), Paclitaxel (0,15nM a 50 nM) (B) e associazione con dose fissa dell’associazione (50 ug/ml) e dosi crescenti di Paclitaxel (0,15 nM a 12 nM) (C). Breast cancer lineage: Cell viability of the mda-mb-231 breast lineage detected at 72 h after treatment with increasing doses of the combination (from 150 µg / ml to 8 mg / ml) (A), Paclitaxel (0, 15nM at 50 nM) (B) and combination with fixed dose of the combination (50 ug / ml) and increasing doses of Paclitaxel (0.15 nM at 12 nM) (C).

LINEA DI LUNG: Vitalità cellulare della linea di polmone H1299 rilevata a 72 h dopo trattamento con dosi crescenti dell’associazione Aboca (da 150ug/ml a 8 mg/ml) (D), Paclitaxel (0,15nM a 50 nM) (E) e associazione con dose fissa dell’associaizone Aboca (50 ug/ml) e dosi crescenti di Paclitaxel (0,15 nM a 50 nM) (F). LONG LINE: Cell viability of the H1299 lung line detected at 72 h after treatment with increasing doses of the Aboca combination (from 150ug / ml to 8 mg / ml) (D), Paclitaxel (0.15nM at 50 nM) ( E) and combination with fixed dose of the Aboca association (50 ug / ml) and increasing doses of Paclitaxel (0.15 nM to 50 nM) (F).

Anche in questo caso si esclude l’interferenza del neurodol sull’azione citotossica del paclitaxel. Also in this case the interference of neurodol on the cytotoxic action of paclitaxel is excluded.

Nel caso specifico si esclude l’interferenza del neurodol sull’azione citotossica del paclitaxel. LINEA DI COLON: Vitalità cellulare della linea di colon HCT116 rilevata a 72h dopo trattamento con dosi crescenti dell’associazione Aboca (da 150ug/ml a 8 mg/ml) (A), Oxaliplatino (6 uM a 400 uM) (B), associazione con dose fissa dell’associazione Aboca (50 ug/ml) e dosi crescenti di Oxaliplatino (1,5 uM a 25 uM) (C), 5 Fluoruracile (0,75 uM a 50 uM) (D) e associazione con dose fissa dell’associazione Aboca (50ug/ml) e dosi crescenti di 5 Fluoruracile (0,15 uM a 25 uM) (E). In the specific case, the interference of neurodol on the cytotoxic action of paclitaxel is excluded. COLON LINE: Cell viability of the HCT116 colon line detected at 72h after treatment with increasing doses of the Aboca combination (from 150ug / ml to 8 mg / ml) (A), Oxaliplatin (6 uM to 400 uM) (B) , combination with fixed dose of the Aboca combination (50 ug / ml) and increasing doses of Oxaliplatin (1.5 uM to 25 uM) (C), 5 Fluoruracil (0.75 uM at 50 uM) (D) and combination with fixed dose of the Aboca combination (50ug / ml) and increasing doses of 5 Fluoruracil (0.15 uM to 25 uM) (E).

Nell’esperimento di associazione tra il prodotto ABO-09+ABO-12 aa essenziali e ramific vitamina B6+vitamina B1 e oxaliplatino e 5 FU si sono utilizzate dosi più basse di chemioterapico vista l’azione molto citotossica dei composti alle dosi precedentemente usate nel trattamento singolo. Anche in questo caso à ̈ evidente che il prodotto Aboca non interferisce con l’azione citotossica dei due chemioterapici In the experiment of association between the essential product ABO-09 + ABO-12 aa and ramified vitamin B6 + vitamin B1 and oxaliplatin and 5 FU, lower doses of chemotherapy were used due to the very cytotoxic action of the compounds at the doses previously used in single treatment. Also in this case it is evident that the Aboca product does not interfere with the cytotoxic action of the two chemotherapeutic agents

Valutazione nel ratto dell’azione antiperalgesica di associazioni di estratti vegetali nel modello di neuropatia indotta da paclitaxel Evaluation in the rat of the antiperalgesic action of associations of plant extracts in the model of neuropathy induced by paclitaxel

Tabella 5 Table 5

Effetto dell’associazione di estratto di abo-09, abo-12, pappa reale e lievito di birra sull’iperalgesia indotta nel ratto da paclitaxel (paw-pressure test) Effect of the association of abo-09, abo-12 extract, royal jelly and brewer's yeast on paclitaxel-induced hyperalgesia in rats (paw-pressure test)

test della pressione della zampa (g) paw pressure test (g)

Trattamento mg/kg Prima del dopo il trattamento Treatment mg / kg Before after after treatment

tratt. treat.

30 min 60 min 90 min 120 min 30 min 60 min 90 min 120 min

62,4 62.4

CMC 57,9 2,8 62,9 3,0 58,2 3,3 55,9 3,6 CMC 57.9 2.8 62.9 3.0 58.2 3.3 55.9 3.6

2,9 Effetto dell’associazione di estratto di abo-09, abo-12, pappa reale e lievito di birra sull’iperalgesia indotta nel ratto da paclitaxel (paw-pressure test) 2,9 Effect of the association of abo-09, abo-12 extract, royal jelly and brewer's yeast on paclitaxel-induced hyperalgesia in rats (paw-pressure test)

test della pressione della zampa (g) paw pressure test (g)

Trattamento mg/kg Prima del dopo il trattamento Treatment mg / kg Before after after treatment

tratt. treat.

33,8 33.8

PACLITAXEL 34,5 2,9 33,8 2,9 35,8 3,4 32,3 2,5 PACLITAXEL 34.5 2.9 33.8 2.9 35.8 3.4 32.3 2.5

3,1 3.1

PACLITAXEL PACLITAXEL

ABO-0960 mg/kg ABO-0960 mg / kg

ABO-12300 mg/kg ABO-12300 mg / kg

fonte di amminoacidi source of amino acids

essenziali e 35,1 2,8 51,2 3,5* 48,2 3,8* 41,8 3,6^ 38,5 essential and 35.1 2.8 51.2 3.5 * 48.2 3.8 * 41.8 3.6 ^ 38.5

3,7 ramificati 240 mg/kg 3.7 branched 240 mg / kg

fonte di vitamina B1 source of vitamin B1

200 mg/kg 200 mg / kg

Trattamento: Paclitaxel 0,5 mg kg<-1>à ̈ stato iniettato per 4 giorni (giorni 1, 3, 5, 8). Dose cumulativa di Paclitaxel: 2,0 mg kg<-1>. Il test à ̈ stato eseguito 14-18 giorni dopo l’ultima iniezione di paclitaxel. *P< 0.01 ^ P< 0.05 in paragone al gruppo trattato con paclitaxel. Ciascun valore rappresenta la media di 8 ratti. Treatment: Paclitaxel 0.5 mg kg <-1> was injected for 4 days (days 1, 3, 5, 8). Cumulative dose of Paclitaxel: 2.0 mg kg <-1>. The test was performed 14-18 days after the last paclitaxel injection. * P <0.01 ^ P <0.05 compared to the paclitaxel treated group. Each value represents the mean of 8 rats.

Valutazione nel ratto dell’azione antiperalgesica di associazioni di estratti vegetali nel modello di neuropatia indotta da vincristina Evaluation in the rat of the antiperalgesic action of associations of plant extracts in the vincristine-induced neuropathy model

Tabella 6 Table 6

EFFETTO DELL’ASSOCIAZIONE DI ESTRATTO DI ABO-09, ABO-12, PAPPA REALE E LIEVITO DI EFFECT OF THE ASSOCIATION OF ABO-09, ABO-12, ROYAL JELLY AND YEAST EXTRACT

BIRRA SULL’IPERALGESIA INDOTTA NEL RATTO DA VINCRISTINA (PAW-PRESSURE TEST ) BEER ON VINCRISTINA INDUCED HYPERALGESIA IN RAT (PAW-PRESSURE TEST)

T e s t d e l l a p r e s s i o n e d e l l a z a m p a ( g ) TRATTAMENTO mg/kg ,p,o, prima del Dopo il trattamento T e s t d e l l a p r e s s i o n e d e l l a z a m p a (g) TREATMENT mg / kg, p, o, before After After treatment

tratt. treat.

30 min 60 90 min 120 min EFFETTO DELL’ASSOCIAZIONE DI ESTRATTO DI ABO-09, ABO-12, PAPPA REALE E LIEVITO DI 30 min 60 90 min 120 min EFFECT OF THE ASSOCIATION OF THE EXTRACT OF ABO-09, ABO-12, ROYAL JELLY AND YEAST

BIRRA SULL’IPERALGESIA INDOTTA NEL RATTO DA VINCRISTINA (PAW-PRESSURE TEST ) BEER ON VINCRISTINA INDUCED HYPERALGESIA IN RAT (PAW-PRESSURE TEST)

T e s t d e l l a p r e s s i o n e d e l l a z a m p a ( g ) T e s t d e l l a p r e s s i o n e d e l l a z a m p a (g)

CMC 58,3 CMC 58.3

2,7 56,4 3,5 62,6 2.7 56.4 3.5 62.6

3,1 60,3 3,8 63,5 3,8 3.1 60.3 3.8 63.5 3.8

VINCRISTINA 35,6 36,7 VINCRISTINA 35.6 36.7

2,7 34,0 2,7 4,1 31,2 3,7 35,3 3,4 2.7 34.0 2.7 4.1 31.2 3.7 35.3 3.4

VINCRISTINA VINCRISTINA

ABO-0960 mg/kg ABO-0960 mg / kg

ABO-12300 mg/kg 33,7 ABO-12300 mg / kg 33.7

fonte di aa ess e 3,5 49,6 3,0* 44,4 source of aa ess e 3.5 49.6 3.0 * 44.4

3,5* 38,2 3,3 33,6 2,8 ramificati 240 mg/kg 3.5 * 38.2 3.3 33.6 2.8 branched 240 mg / kg

fonte di vitamina B1200 source of vitamin B1200

Trattamento: vincristina à ̈ stata iniettata e,v, alla dose di 150 µg kg<-1>per 5 giorni ogni 2 giorni, Dose cumulativa 750 mg kg<-1>e.v. Il test à ̈ stato eseguito 4 giorni dopo l’ultima somministrazione, *P< 0,01 in paragone al gruppo trattato con Vincristina. Ciascun valore rappresenta la media di 8 ratti. Treatment: vincristine was injected and, v, at a dose of 150 µg kg <-1> for 5 days every 2 days, Cumulative dose 750 mg kg <-1> i.v. The test was performed 4 days after the last administration, * P <0.01 compared to the Vincristine group. Each value represents the mean of 8 rats.

Valutazione nel ratto della farmacocinetica di oxaliplatino in presenza di estratti di ABO-09 e ABO-12 Evaluation in rats of oxaliplatin pharmacokinetics in the presence of ABO-09 and ABO-12 extracts

La possibile interferenza in vivo sulla biodisponibilità con il farmaco oxaliplatino da parte di possibili interferenze di vite rossa e iperico con i sistemi di metabolismo epatico (citocromo) à ̈ stata valutata in vivo nel ratto. The possible in vivo interference on the bioavailability with the drug oxaliplatin by possible interference of red vine and St. John's wort with the hepatic metabolism systems (cytochrome) was evaluated in vivo in the rat.

E’stata indagata l’eventuale alterazione delle concentrazioni plasmatiche di platino dovuta alla somministrazione endovenosa di oxaliplatino alla dose di 5 mg kg-1 in conseguenza al pretrattamento con gli estratti vegetali sotto riportati. Gli estratti vegetali sono stati iniettati 30 min prima di oxaliplatino i.p. in modo da far coincidere il picco di attività degli estratti con la massima concentrazione plasmatica del chemioterapico. The possible alteration of plasma platinum concentrations due to the intravenous administration of oxaliplatin at a dose of 5 mg kg-1 as a consequence of pretreatment with the plant extracts listed below was investigated. The plant extracts were injected 30 min before oxaliplatin i.p. in order to make the peak activity of the extracts coincide with the maximum plasma concentration of the chemotherapeutic agent.

La scelta della dose di oxaliplatino usata in questo studio si basa non solo sul dosaggio raccomandato nell’uomo (130 mg/m2) ma anche per avere nei campioni esaminati una concentrazione superiore a quella minima determinabile. The choice of the dose of oxaliplatin used in this study is based not only on the recommended dosage in humans (130 mg / m2) but also on having in the samples examined a concentration higher than the minimum detectable.

PROTOCOLLO SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PROTOCOL

I ratti sono stati suddivisi in 5 gruppi di 6 animali ciascuno. The rats were divided into 5 groups of 6 animals each.

Gruppo n.1: CMC p.o. oxaliplatino 5 mg kg-1 e.v. Group 1: CMC p.o. oxaliplatin 5 mg kg-1 i.v.

Gruppo n.2: estratto di iperico 60 mg kg-1 p.o. oxaliplatino 5 mg kg-1 e.v. Group 2: hypericum extract 60 mg kg-1 p.o. oxaliplatin 5 mg kg-1 i.v.

Gruppo n.3: estratto costituito da: iperico 60 mg kg-1 p.o e Vite rossa 300 mg kg-1 p.o. oxaliplatino 5 mg kg-1 e.v. Group 3: extract consisting of: hypericum 60 mg kg-1 p.o and red vine 300 mg kg-1 p.o. oxaliplatin 5 mg kg-1 i.v.

Tabella 7 Table 7

Tempi di prelievo dei campioni (min) Sample collection times (min)

0 5 min 15 min 30 min 60 min 90 min CMC OXA e.v. 38.9 ± 20.4 ± 9.5 6.6 ± 4.3 ± 1.2 2.7 ± 1.1 2.6. ± 0.9 0 5 min 15 min 30 min 60 min 90 min CMC OXA i.v. 38.9 ± 20.4 ± 9.5 6.6 ± 4.3 ± 1.2 2.7 ± 1.1 2.6. ± 0.9

13.3 1.2 13.3 1.2

ABO-09 OXA e.v. 36.3± 22.0 ± 6.7 ± 3.9 ± 1.5 2.6 ± 0.9 2.3 ± 0.4 ABO-09 OXA i.v. 36.3 ± 22.0 ± 6.7 ± 3.9 ± 1.5 2.6 ± 0.9 2.3 ± 0.4

12.6 10.7 1.4 12.6 10.7 1.4

ABO-09 ABO-12 39.2 ± 19.8 ± 8.0 7.1 ± 4.4 ± 1.5 2.3 ± 0.9 2.61± 0.7 OXA E.V. 14.7 2.5 ABO-09 ABO-12 39.2 ± 19.8 ± 8.0 7.1 ± 4.4 ± 1.5 2.3 ± 0.9 2.61 ± 0.7 OXA E.V. 14.7 2.5

Tab.7. Concentrazione di Platino (media ± SD) nel plasma dopo somministrazione e.v. di oxaliplatino Tab. 7. Platinum concentration (mean ± SD) in plasma after i.v. of oxaliplatin

Materiali e metodi Materials and methods

Animali Animals

Ratti Sprague Dawley maschi di circa 200 grammi forniti dalla ditta Harlan, Italia. Gli animali sono stati tabulati in gruppi di quattro, in gabbie delle seguenti dimensioni: 26x41cm presso con un ciclo circadiano di 12 ore con acqua e cibo “ad libitum†. I ratti sono stati alimentati con dieta standard e sono stati stabulati alla temperatura di 23±1°C. La procedura sperimentale à ̈ stata approvata dal comitato locale per il controllo della sperimentazione su animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in accordo con le direttive del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (DL 116/92; 86/609/EEC) in merito alla manipolazione degli animali da esperimento e in accordo alle “National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals†, avendo recepito le linee guida della “International Association for the Study of Pain†sono state prese tutte le misure necessarie per ridurre al minimo sia il numero degli animali utilizzati che le loro sofferenze. Male Sprague Dawley rats weighing approximately 200 grams supplied by Harlan, Italy. The animals were tabulated in groups of four, in cages of the following dimensions: 26x41cm with a circadian cycle of 12 hours with water and food â € œad libitumâ €. The rats were fed the standard diet and were housed at a temperature of 23 ± 1 ° C. The experimental procedure was approved by the local committee for the control of experimentation on laboratory animals. All experiments were conducted in accordance with the directives of the Council of the European Community of 24 November 1986 (DL 116/92; 86/609 / EEC) regarding the manipulation of experimental animals and in accordance with the â € œNational Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsâ €, having implemented the guidelines of the â € œInternational Association for the Study of Painâ €, all the necessary measures have been taken to minimize both the number of animals used and their suffering.

Somministrazione di Oxaliplatino Administration of Oxaliplatin

L’agente neoplastico à ̈ stato iniettato alla dose di 5 mg kg-1 per via e.v. solubilizzato in un volume di 10 ml kg-1 di soluzione glucosata al 5% analogamente a quanto à ̈ stato effettuato in tutti gli esperimenti comportamentali condotti in precedenza. The neoplastic agent was injected at a dose of 5 mg kg-1 i.v. solubilized in a volume of 10 ml kg-1 of 5% glucose solution, similarly to what was carried out in all the behavioral experiments conducted previously.

Dosaggio Dosage

I campioni sono stati diluiti 1:4 con HCl (v/v) ed analizzati per il contenuto di platino a 306,4 nm con Spectraspan III (Applied Research Laboratories, Sunland, CA) secondo il metodo descritto da Pestieau et al. (J. Surgical Oncology, 2001: 76: 106-114). La linearità nell’emissione del segnale à ̈ stata ottenuta per una curva di calibrazione del platino nell’intervallo 0-2,0 mg/L con un coefficiente di correlazione > di 99%. Tra ciascun campione à ̈ stato analizzato un bianco di HCl al 10% (v/v). The samples were diluted 1: 4 with HCl (v / v) and analyzed for platinum content at 306.4 nm with Spectraspan III (Applied Research Laboratories, Sunland, CA) according to the method described by Pestieau et al. (J. Surgical Oncology, 2001: 76: 106-114). The linearity in the signal emission was obtained for a platinum calibration curve in the range 0-2.0 mg / L with a correlation coefficient> 99%. A 10% (v / v) HCl blank was analyzed between each sample.

Valutazione nel ratto dell’azione anti-iperalgesica in modelli di neuropatia indotta da streptozotocina e da legatura del nervo sciatico Evaluation in the rat of the antihyperalgesic action in models of neuropathy induced by streptozotocin and by ligation of the sciatic nerve

E’ stato valutato nel ratto l’efficacia antiperalgesica mostrata da un’associazione costituita da ABO-09 (30 mg kg<-1>p.o.), ABO-11 (100 mg kg<-1>p.o.) e ABO-12 (300 mg kg<-1>p.o.) in due modelli di neuropatia, quella indotta da legatura lassa del nervo sciatico e quella dovuta a streptozotocina (abbreviato STZ). The antiperalgesic efficacy shown by an association consisting of ABO-09 (30 mg kg <-1> p.o.), ABO-11 (100 mg kg <-1> p.o.) and ABO- 12 (300 mg kg <-1> p.o.) in two models of neuropathy, that induced by loose sciatic nerve ligation and that due to streptozotocin (abbreviated STZ).

Iperalgesia diabetica indotta da streptozotocina Streptozotocin-induced diabetic hyperalgesia

L’abbassamento della soglia algica, viene ottenuto per somministrazione i.p. di streptozotocina (50 mg/kg) Malcangio & Tomlison Pain, 76: 151-157, 1998. I ratti sviluppano iperalgesia a partire dalla quarta settimana dopo il trattamento con STZ. The lowering of the pain threshold is obtained by i.p. of streptozotocin (50 mg / kg) Malcangio & Tomlison Pain, 76: 151-157, 1998. Rats develop hyperalgesia starting from the fourth week after treatment with STZ.

Risultati Results

L’associazione reverte completamente l’iperalgesia da STZ fino a 120 minuti dopo l’iniezione The combination completely reverts STZ hyperalgesia up to 120 minutes after injection

Effetto di ABO-09, ABO-11 e ABO-12 sull’iperalgesia indotta nel ratto da streptozotocina Effect of ABO-09, ABO-11 and ABO-12 on streptozotocin-induced hyperalgesia in rats

Test della pressione sulla zampa (g) Paw pressure test (g)

Trattamento mg/kg .p.o.prima delTreatment mg / kg .p.o. before

trattamento dopo il trattamento treatment after treatment

30 min 60 min 90 min 120 min 30 min 60 min 90 min 120 min

CMC CMC 61,6 2,1 62,8 3,5 59,4 3,1 63,9 3,8 58,5 3,5 CMC CMC 61.6 2.1 62.8 3.5 59.4 3.1 63.9 3.8 58.5 3.5

STZ CMC 39,3 2,6 36,5 2,8 38,2 3,2 35,4 3,0 37,7 3,5 STZ CMC 39.3 2.6 36.5 2.8 38.2 3.2 35.4 3.0 37.7 3.5

STZ ABO-09 ABO-11 STZ ABO-09 ABO-11

37,2 2,9 65,9 3,0* 63,8 3,1* 66,2 4,1* 59,8 3,4* ABO-12 37.2 2.9 65.9 3.0 * 63.8 3.1 * 66.2 4.1 * 59.8 3.4 * ABO-12

^P< 0.05; *P< 0.01 in confronto con i topi trattati con STZ. Ciascun valore rappresenta la media di 8 ratti. ^ P <0.05; * P <0.01 in comparison with STZ-treated mice. Each value represents the mean of 8 rats.

Modello della mononeuropatia periferica nel ratto Model of peripheral mononeuropathy in the rat

Il dolore neuropatico à ̈ caratterizzato dallo sviluppo di un'alterata percezione del dolore che si manifesta come dolore spontaneo continuo ed iperalgesia. I ratti vengono anestetizzati e successivamente il nervo sciatico viene esposto a livello della coscia divaricando i bicipiti femorali. Prossimalmente alla triforcazione del nervo sciatico, circa 7 mm del nervo vengono liberati dalle membrane e 4 legature lasse vengono effettuate intorno al nervo, circa 1 mm l'una dall'altra. In un altro gruppo di animali viene effettuata un'incisione uguale, ma senza la legatura del nervo (sham operation). La neuropatia si sviluppa in 14 giorni. Le prove con le sostanze potenzialmente analgesiche vengono effettuate il 14° giorno dall'operazione usando il "paw pressure". (Bennett & Xie, Pain, 33, 87-107, 1988) Neuropathic pain is characterized by the development of an altered perception of pain that manifests itself as continuous spontaneous pain and hyperalgesia. The rats are anesthetized and subsequently the sciatic nerve is exposed at the level of the thigh by spreading the hamstrings. Proximity to the trifurcation of the sciatic nerve, approximately 7 mm of the nerve is freed from the membranes and 4 loose ligatures are made around the nerve, approximately 1 mm from each other. In another group of animals, an equal incision is made, but without the nerve ligation (sham operation). Neuropathy develops in 14 days. Tests with potentially analgesic substances are carried out on the 14th day after the operation using "paw pressure". (Bennett & Xie, Pain, 33, 87-107, 1988)

Risultati Results

L’associazione dei tre reverte completamente e in maniera statisticamente significativa l’iperalgesia da legatura del nervo sciatico fino a 120 minuti The association of the three completely and statistically significantly reverts hyperalgesia due to ligation of the sciatic nerve for up to 120 minutes

Effetto d’iperico vite rossa rosmarino sull’iperalgesia indotta nel ratto da legatura lenta del nervo sciatico Effect of hypericum red vine rosemary on hyperalgesia induced in rats by slow ligation of the sciatic nerve

Test della pressione sulla zampa (g) Paw pressure test (g)

Trattamento zampa prima del dopo il trattamento Paw treatment before the after treatment

mg/kg .p.o. trattamento mg / kg .p.o. treatment

30 min 60 min 90 min 120 min CMC sn 57,1 30 min 60 min 90 min 120 min CMC sn 57.1

<60,5 3,0 58,6 2,9 62,6 3,6 61,7 3,3>+ 3,4 CMC dx 26,7 <60.5 3.0 58.6 2.9 62.6 3.6 61.7 3.3> + 3.4 CMC right 26.7

<26,2 2,5 28,1 2,6 25,3 3,0 28,4 3,1>+ 2,5 ABO-09+ABO-11 sn 60,3 ABO-12<57,3 2,6 71,3 3,1^ 68,4 3,2 65,5 2,9>+ 3,9 ABO-09+ABO-11 dx 37,5 ABO-12<30,1 3,1 50,3 4.4* 46,6 3.7* 44,2 3.0*>+ 3.3 ^P< 0,05; *P< 0,01 in confronto con topi trattati con CMC. Ciascun valore rappresenta la media di 8 ratti <26.2 2.5 28.1 2.6 25.3 3.0 28.4 3.1> + 2.5 ABO-09 + ABO-11 sn 60.3 ABO-12 <57.3 2, 6 71.3 3.1 ^ 68.4 3.2 65.5 2.9> + 3.9 ABO-09 + ABO-11 right 37.5 ABO-12 <30.1 3.1 50.3 4.4 * 46.6 3.7 * 44.2 3.0 *> + 3.3 ^ P <0.05; * P <0.01 in comparison with CMC-treated mice. Each value represents the mean of 8 rats

BIBLIOGRAFIA BIBLIOGRAPHY

Kingery WS. A critical review of controlled clinical trials for peripheral neuropathic pain and complex regional pain syndromes. Pain 1997;73: 123-139. Kingery WS. A critical review of controlled clinical trials for peripheral neuropathic pain and complex regional pain syndromes. Pain 1997; 73: 123-139.

WO2009106263. WO2009106263.

Cavalletti et al. Effects of different schedules of oxaliplatin treatment on the peripheral nervous system of the rat Eur. J. Cancer 37, 2457-24632001. Cavalletti et al. Effects of different schedules of oxaliplatin treatment on the peripheral nervous system of the rat Eur. J. Cancer 37, 2457-24632001.

Springer, J Biochem Mol Biol, 35: 94-105, 2002. Springer, J Biochem Mol Biol, 35: 94-105, 2002.

Claims (16)

RIVENDICAZIONI 1. Composizione per uso terapeutico comprendente: a) polifenoli tra il 3 ed il 9% in peso di detta composizione di cui a’) flavonoidi, esclusa la quercetina, tra l’1 ed il 7% in peso di detta composizione; a’’) quercetina tra lo 0,05 e lo 0,3% in peso di detta composizione; b) antocianosidi totali tra lo 0,1 e l’1% in peso. CLAIMS 1. Composition for therapeutic use comprising: a) polyphenols between 3 and 9% by weight of said composition of which aâ € ™) flavonoids, excluding quercetin, between 1 and 7% by weight of said composition; aâ € ™ â € ™) quercetin between 0.05 and 0.3% by weight of said composition; b) total anthocyanosides between 0.1 and 1% by weight. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1 per uso nel trattamento del dolore neuropatico. 2. Composition according to claim 1 for use in the treatment of neuropathic pain. 3. Composizione secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detti a), a’), a’’) e/o b) sono ottenuti da estratti vegetali. 3. Composition according to claim 1 or 2 wherein said a), aâ € ™), aâ € ™ â € ™) and / or b) are obtained from plant extracts. 4. Composizione secondo la rivendicazione 3 in cui detti estratti sono estratti idroalcolici liofilizzati. 4. Composition according to claim 3 wherein said extracts are lyophilized hydroalcoholic extracts. 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 4 in cui detto dolore neuropatico à ̈ causato da: un trattamento con un farmaco, un trattamento con un farmaco chemioterapico, malattie croniche, traumi, esposizione a sostanze chimiche tossiche, una infezione in corso, una infezione pregressa, funzione alterata di un organo, malattie vascolari, malattie metaboliche, malattie autoimmuni; o à ̈ descritto come neuropatia diabetica periferica, nevralgia erpetica postale, nevralgia del trigemino, dolore neuropatico della parte bassa della schiena, distrofia simpatica riflessa, sindrome dell'arto fantasma o à ̈ un dolore neuropatico di cui non si conosce la causa (dolore neuropatico idiopatico). 5. Composition according to any one of claims 2 to 4 wherein said neuropathic pain is caused by: a treatment with a drug, a treatment with a chemotherapy drug, chronic diseases, trauma, exposure to toxic chemicals, an ongoing infection , a previous infection, impaired organ function, vascular diseases, metabolic diseases, autoimmune diseases; o It is described as diabetic peripheral neuropathy, post herpetic neuralgia, trigeminal neuralgia, neuropathic lower back pain, reflex sympathetic dystrophy, phantom limb syndrome o is neuropathic pain of which the cause is unknown (neuropathic pain idiopathic). 6. Composizione secondo la rivendicazione 5 in cui detto chemioterapico à ̈ oxaliplatino, vincristina, vinblastina, paclitaxel, cisplatino, taxano, epotiloni, bortemozide, alcaloidi della vinca. 6. Composition according to claim 5 wherein said chemotherapeutic agent is oxaliplatin, vincristine, vinblastine, paclitaxel, cisplatin, taxane, epothilones, bortemozide, vinca alkaloids. 7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui detti polifenoli sono ottenuti da estratti di Hypericum perforatum, Rooibos tes, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Tà ̈ verde, Rosmarinus officinalis, Malpighia glabra Curcuma longa, Curcuma xantorrhiza. 7. Composition according to any one of claims 1 to 6 wherein said polyphenols are obtained from extracts of Hypericum perforatum, Rooibos tes, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolimus, Vitis vinifera, Green tea, Rosmarinus officinalis, Malpighia glabra Curcuma longa , Curcuma xantorrhiza. 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui detti flavonoidi sono ottenuti da estratti di Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolymus, Vitis vinifera, verde Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis. 8. Composition according to any one of claims 1 to 7 wherein said flavonoids are obtained from extracts of Hypericum perforatum, Punica granatum, Sylibum marianum, Cynara scolymus, Vitis vinifera, verde Camelia sinensis, Rosmarinus officinalis. 9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui detti antocianosidi sono ottenuti da estratti di Vitis vinifera, Vaccinium myrtillus, Hibiscus sabdariffa. 9. Composition according to any one of claims 1 to 8 wherein said anthocyanosides are obtained from extracts of Vitis vinifera, Vaccinium myrtillus, Hibiscus sabdariffa. 10. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 in cui detta quercetina à ̈ ottenuta da estratti di Hypericum perforatum, Tà ̈ verde, Aspalathus linearis, Sylibum marianum, Vaccinium myrtillus. 10. Composition according to any one of claims 1 to 9, wherein said quercetin is obtained from extracts of Hypericum perforatum, green tea, Aspalathus linearis, Sylibum marianum, Vaccinium myrtillus. 11. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 ulteriormente comprendente Vitamina B1, Vitamina B6 e/o Vitamina B12. Composition according to any one of claims 1 to 10 further comprising Vitamin B1, Vitamin B6 and / or Vitamin B12. 12. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 ulteriormente comprendente pappa reale e/o lievito di birra. Composition according to any one of claims 1 to 11 further comprising royal jelly and / or brewer's yeast. 13. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12 in cui detta composizione à ̈ in forma di capsula, compressa, pasticca, granulato, polvere, sciroppo, elisir, gelatina dura, gelatina morbida, sospensione, emulsione, soluzione, gel. 13. Composition according to any one of claims 1 to 12 wherein said composition is in the form of capsule, tablet, tablet, granulate, powder, syrup, elixir, hard gelatin, soft gelatin, suspension, emulsion, solution, gel. 14. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 in cui detta composizione à ̈ compresa in o consiste in un integratore alimentare, in alimento a fini medici speciali, una composizione farmaceutica. Composition according to any one of claims 1 to 13 wherein said composition is comprised in or consists of a food supplement, food for special medical purposes, a pharmaceutical composition. 15. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14 caratterizzata dal fatto di non inibire l’attività antitumorale di un chemioterapico. 15. Composition according to any one of claims 1 to 14 characterized in that it does not inhibit the antitumor activity of a chemotherapeutic agent. 16. Nutriceutico, integratore alimentare o alimento a fini medici speciali comprendente una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15.A nutriceutic, food supplement or food for special medical purposes comprising a composition according to any one of claims 1 to 15.