ITMI972814A1 - Solfatazione selettiva di glicosamminoglicani contenenti acido iduronico e prodotti cosi' ottenuti - Google Patents
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Description
Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Solfatazione selettiva di glicosamminoglicani contenenti acido iduronico e prodotto così ottenuti.
La presente invenzione riguarda un processo di solfatazione selettiva delle unità iduroniche contenute in un polisaccaride comprendente unità ripetitive disaccaridiche formate da un’acido uranico e da una glucosammina legati in posizione 1-4, e polisaccaridi così ottenuti. Detto processo permette di ottenere polisaccaridi nei quali almeno il 20% degli acidi iduronici presentano esclusivamente la solfatazione in posizione 2, ed è quindi di particolare interesse sia nella sintesi di polisaccaridi aventi una struttura che emula quella dell’eparina, sia per ripristinare l’attività antitrombotica dell’eparina parzialmente 2-O-desolfatata.
L'eparina, impiegata da oltre cinquanta anni come farmaco anticoagulante ed antitrombotico è un polisaccaride solfato estratto da organi animali. La struttura deH'eparina può essere schematizzata nelle strutture seguenti
L’eparina è prevalentemente rappresentata dalle sequenze "regolari" 1 , costituite da unità di acido iduronico solfato in posizione e di glucosammina N-solfatata e solfatata in posizione 6 Le proprietà anticoagulanti e in larga misura quelle antitrombotiche dell'eparina sono peraltro associate alla presenza della specifica sequenza pentasaccaridica 2, che rappresenta il sito attivo dell'eparina per l'antitrombina. Il contenuto in sequenze 1 e 2 è diverso a seconda dell'organo e della specie animale da cui l'eparina viene estratta. Le sequenze 1 rappresentano dal 65% all'85% delle catene polisaccaridiche che costituiscono le eparine comunemente impiegate in terapia (estratte da mucosa intestinale suina o da polmone bovino), e le sequenze 2 rappresentano soltanto il 3-5% per entrambi i tipi di eparina. Oltre ad una unità disaccaridica comune a quella delle "regioni regolari", le sequenze 2 contengono una unità di glucosammina solfata in posizione che è considerata un marker del sito attivo per l'antitrombina, preceduta da una unità di acido glucuronico (GlcA), a sua volta preceduto da un'unità di glucosammina N-acilata od N-solfata E' importante sottolineare che le sequenze 2 sono contenute soltanto in una frazione (circa un terzo) delle catene che costituiscono le eparine correntemente impiegate in terapia.
I gruppi solfato essenziali per una elevata affinità per l'antitrombina e per una elevata attività antitrombotica sono evidenziati in grassetto nella formula della sequenza pentasaccaridica 2. La mancanza o la rimozione anche di uno solo di questi gruppi SO3 } e particolarmente di quello in posizione 3 dell'unità centrale comporta una notevole diminuzione delle suddette attività (B. Casu: Structure and biological activity of heparin. Advances Carbohydr. Chem. Biochem. 43, 51-134 (1985); D.A. Lane, I. Bjork, U. Lindahl: Heparin and related polysaccharides, Plenum Press, New York, 1992.).
Recenti studi di correlazione struttura-attività hanno dimostrato che la solfatazione in posizione 3 delle unità iduroniche comporta un effetto di inibizione del binding con l’antitrombina. Tale effetto di inibizione spiega anche il fatto che la solfatazione totale dell'eparina (cioè, oltre che dei gruppi amminici, di tutti i gruppi ossidrilici) risulta in una diminuzione anziché in un aumento di attività anticoagulante (M.L. Wolffom e T.M. Shen Han, J. Am. Chem. Soc. 81, 1764-1766 (1959); A. Naggi et al, Biochem. Pharmacol. 36, 1895-1900(1987), ciò malgrado il fatto che la solfatazione di tutti i gruppi ossidrilici dell'eparina genera naturalmente anche le unità glucosamminiche 3-O-solfate (GIcNS033,6S03) tipiche del sito attivo per l'antitrombina.
E’ stato recentemente proposto ( Carboydrate Letters, volume 1, pp 107-114, 1994) di preparare per via sintetica un polisaccaride avente struttura e attività biologica simile all’eparina a partire dal polisaccaride batterico K5 epimerizzato. E’ noto nell’arte la preparazione del K5 epimerizzato con una percentuale di epimerizzazione maggiore o uguale al 50%
A la luce di quanto detto sopra è evidente che per preparare un composto avente caratteristiche biologiche simili all’eparina naturale a partire da K5, bisogna che le seguenti condizioni siano rispettate:
a) la posizione 2 dell’acido iduronico deve essere solfatata il più possibile;
b) la posizione 3 dell’acido iduronico deve essere solfatata il meno possibile;
c) la posizione 3 della glucosammina deve essere solfatata in quantità tale che una glucosammina solfatata sia presente nell’unità centrale della sequenza 2.
Diversi procedimenti di solfatazione chimica sono stati proposti soprattutto allo scopo di recuperare l'attività di eparine parzialmente desolfatate. Infatti una diminuzione di attività dell'eparina viene comunemente osservata ogni qualvolta, nel processo di estrazione delle eparine da organi animali e della loro purificazione, vengano impiegate condizioni drastiche di acidità o basicità.
Questi processi (riassunti in :B. Casu, rif. citato.) sono basati sull'impiego di reagenti sia non depolimerizzanti (addotti dell'anidride solforica SO3 con solventi aprotici quali il dimetil solfo ssido o la dimetilformamide (DMF)) che depolimerizzanti (quali l'acido solforico concentrato e l'acido clorosolfonico). Fatta eccezione per i procedimenti correntemente impiegati per la N-risolfatazione in ambiente acquoso, tutti i metodi di solfatazione descritti nella letteratura scientifica e brevettuale comportano la solfatazione delle eparine anche in posizioni indesiderate. In particolare, la solfatazione di eparine totalmente o parzialmente desolfatate, generalmente condotta con addotti deH'anidride solforica con solventi aprotici, porta anche alla solfatazione dell'ossidrile in posizione 3 delle unità iduroniche (Perlin et al, Carbohydr. Res. 210, 299-310 (1991); v. Esempio 1). Tale solfatazione comporta generalmente una diminuzione delle attività anticoagulante ed an ti trombotica.
E’ stato sorprendentemente trovato che è possibile ottenere la solfatazione selettiva della posizione 2 dell’acido iduronico e della posizione 3 della glucosammina attraverso la protezione della posizione 3 dell’acido iduronico mediante una reazione di acilazione.
Si è visto che nella reazione di acilazione la posizione 3 dell’acido iduronico è la prima ad essere acilata seguita dalla posizione 3 della glucosammina e dalla posizione 2 dell’acido iduronico. I gruppi acilici protettivi non vengono rimossi da successivi trattamenti di solfatazione e possono invece essere facilmente rimossi dopo detti trattamenti, generando strutture attive ricche in sequenze
L'acilazione di gruppi ossidrilici dell'eparina era stata finora impiegata soltanto ai fini di ridurre l'idrofilicità delle eparine. EP 356 275 descrive un procedimento per l'acetilazione dei soli gruppi ossidrilici dei glicosaminoglicani, ma non indica alcuna reattività preferenziale di specifici gruppi ossidrilici, dal brevetto infatti appare che le strutture che si ottengono sono tutte completamente acilate.
Oggetto della presente invenzione sono polisaccaridi contenenti unità ripetitive disaccaridiche formate da un’acido uranico e da una glucosammina legati in posizione 1-4 in cui le unità iduroniche siano solfatate prevalentemente in posizione 2.
I polisaccaridi contenenti unità ripetitive disaccaridiche formate da un’acido uranico di cui preferibilmente almeno il 5% di acido iduronico e da una glucosammina legati in posizione 1-4 oggetto della presente invenzione sono caratterizzati dal fatto di contenere:
a) almeno il 20% di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3;
b) tra il 10% e 30% di unità glucosamminiche solfatate in posizione 3; ed
c) aventi un rapporto molare solfati/carbossili compreso tra 1.5 e 3.5, preferibilmente tra 1.7 e 3.1 più preferibilmente tra 2.2 e 2.8.
I polisaccaridi secondo la presente invenzione possono comprendere unità ripetitive disaccaridiche del tipo rappresentato nella seguente tabella:
Preferibilmente i polisaccaridi oggetto della presente invenzione comprendono tra 0 e 95% preferibilmente tra 10% e 50% unità ripetitive disaccaridiche di tipo I e tra 100% e 5% preferibilmente tra 90% e 50% unità ripetitive disaccaridiche di tipo II. Infatti quando nell’unità I la glucosammina risulta 3, 6, N trisolfatata e nell’umtà II la posizione 3 risulta libera, è possibile ottenere la sequenza 2 tramite sequenze I-I-II o II-I-I1. Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un processo per ottenere polisaccaridi contenenti unità ripetitive disaccaridiche formate da un acido uronico e da una glucosammina legati in posizione 1-4 e contenenti: a) almeno il 20% di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3;
b) tra il 0 e 90% di unità glucosamminiche solfatate in posizione 3;
ed
c) aventi un rapporto molare solfati/carbossili compreso tra 1.5 e 3.5;
a partire dal corrispondente polisaccaride avente tra 0 e 60% della posizione 2 sull’acido iduronico e tra lo 0 e il 20% delle posizioni 3 della glucosammina solfatate. Per esempio nel caso di polisaccaridi (come il K5 epimerizzato) queste posizioni non sono solfatate, invece nel caso di eparine parzialmente desolfatate il grado di solfatazione può variare.
Detto processo è caratterizzato dai seguenti passaggi:
i) acilazione di una quantità compresa tra il 20% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 dell’acido iduronico e di una quantità compresa tra il 10% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 della glucosammina impiegando tra 1 e 5 (preferibilmente tra 1.5 e 4, ancora più preferibilmente tra 2 e 3.5) equivalenti di un agente acilante per equivalente di ossidrile libero; preferibilmente la quantità di ossidrili acilati in posizione 3 dell’acido iduronico varia tra 90% e 100% mentre la quantità di ossidrili in posizione 3 della glucosammina varia tra 10% e 100%;
ii) solfatazione degli ossidrili non protetti
iii) liberazione dei gruppi acilici in ambiente alcalino.
iv)N-risolfatazione opzionale del prodotto del passaggio iii), per esempio con addotto tributilammina*S03 in soluzione acquosa. ;L’agente acilante usato al passaggio i) preferibilmente è scelto dal gruppo comprendente le anidridi degli acidi carbossilici contenenti da 1 a 20 atomi di carbonio e per esempio: anidride acetica, anidride propionica, anidride benzoica e anidride succinica. I prodotti parzialmente acilati ottenuti sono stati O-solfatati al passaggio ii) per esempio con addotto piridina.S03 in dimetilformammide (DMF). ;Particolarmente importante in questo processo risulta essere l’ottenimento del prodotto acilato. Questo composto è un polisaccaride contenente unità ripetitive disaccari diche formate da un’acido uranico di cui preferibilmente almeno il 5% ( più preferibilmente almeno il 50%) è costituito da acido iduronico, e da una glucosammina legati in posizione 1-4 ed è caratterizzato dal fatto di avere tra il 20% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 dell’acido iduronico e tra il 10% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 della glucosammina sotto forma di arile; preferibilmente la quantità di ossìdrili acilati in posizione 3 dell’acido iduronico varia tra 90% e 100% mentre la quantità di ossidrili in posizione 3 dell’glucosammina varia tra 10% e 100%. ;I prodotti finali e quelli intermedi sono stati caratterizzati mediante spettrometria NMR 1H e ^C. Oltre a fornire specifiche "impronte digitali" dei prodotti, gli spettri NMR permettono di quantificare la distribuzione dei gruppi solfati nelle differenti posizioni delle unità uraniche e di quelle glucosamminiche. In particolare, metodi NMR recentemente sviluppati consentono di determinare la percentuale di unità iduroniche solfatate soltanto in posizione , e quella di unità glucosamminiche N,3 disolfate ed N,3,6 trisolfate. Il primo metodo si basa sulla integrazione di un tipico segnale (a 65 ppm, associabile soltanto alle unità iduroniche 2-solfate quando non siano solfatate anche in posizione 3, ed il secondo sull' integrazione di un segnale 1H-NMR a 3 ppm, tipico del derivato solfo-aziridinico specificamente e quantitativamente generato dalle unità ;
La presente invenzione si prospetta di particolare utilità sia per la rigenerazione di eparine che (specialmente a causa di drastici trattamenti alcalini durante la loro preparazione) si siano parzialmente O-desolfatate, sia per il potenziamento di attività di comuni eparine commerciali. Inoltre, il procedimento descritto consente di ottenere glicosaminoglicani a struttura eparinica partendo da altri polisaccaridi di origine animale, vegetale 0 microbica, come ad esempio i solfaminoeparosani epimerizzati ottenuti dal polisaccaride microbico K5, contenenti sequenze IdoA-GlcNS03, solfatate o non solfatate in posizione 6 dell'unità glucosamminica. ;La presente invenzione viene ora ulteriormente descritta tramite esempi che sono da intendersi come illustrativi ma che non vogliono limitare in alcun modo Γ invenzione stessa. ;ESEMPI ;Nei seguenti esempi è stato usato come polisaccaride eparina de-solfatata. La struttura di questa risulta essere analoga per esempio a solfaminoeparosani epimerizzati ottenuti dal polisaccaride microbico K5. L’eparina è stata O-desolfatata attraverso il seguente processo generale. de-O-solfatazione dell’eparina ;Il composto (eparina sale sodico) è disciolto (10 mg/ml) in una soluzione 0.1 M aq di NaOH, congelato, e liofilizzato. ;Il prodotto ottenuto è sciolto in un piccolo volume di acqua ed è neutralizzato con HC1 diluito fino a un pH di 7. ;Il prodotto è dializzato (cut-off 6-8 KDa) contro acqua distillata e purificato per gel cromatografia con una colonna Sephadex G-25. Lo spettro mostra la scomparsa del tipico segnale anomerico de ;
la comparsa del corrispondente segnale relativo al IdoA. ;Acetilazione dell’eparina 2-O-desolfatata ;Viene ottenuta la forma acida del composto descritto precedentemente (utilizzando una colonna a scambio ionico (H^)). Questa è salificata fino a pH 8 con una soluzione di tetrabutilammonio idrossido. ;Il sale di tetrabutilammonio ottenuto dopo liofilizzazione, è sciolto in DMF/piridina (in rapporto 1/1), alla concentrazione di 45 mg/ml. ;Il reagente acetilante è aggiunto in quantità proporzionale al grado di acetilazione voluto, determinato come equivalenti di anidride acetica per ossidrili liberi per unità disaccaridica. La soluzione è lasciata sotto agitazione tutta la notte a temperatura ambiente in presenza di dimetilamminopiridina. ;La reazione è bloccata per aggiunta di acqua. ;La soluzione è trattata con un grande eccesso di etanolo saturato con acetato di sodio, ed è messa per 5 ore a 4°C. Il precipitato formatosi è filtrato, lavato con etanolo e ridisciolto in acqua. Il prodotto in soluzione è dializzato contro acqua deionizata, quindi passato su ima colonna a scambio ionico (tT), neutralizzato fino a un pH di 8 con una soluzione di NaOH 0.1 M per ottenere il sale sodico. ;Dopo concentrazione il composto è purificato su colonna Sephadex G-25, quindi liofilizzato. ;Gli studi NMR dei prodotti sono fatti in D20 su AMX500. ;Nella tabella seguente sono riportati il numero di acetili per unità disaccaridica e le percentuali di gruppi ossidrilici liberi dopo reazione condotta con diversi rapporti di reagente acetilante. Questi valori sono stati ottenuti mediante integrazione di segnali ’H-NMR (corretti per il contenuto di N-acetile del eparina utilizzata). Il valore ottenuto per IdoA20H può variare a secondo del sistema utilizzato per la determinazione dell’area (triangolazione, deconvoluzione, integrazione), vista P interferenza di altre risonanze. ; ;;
E stata controllata la possibilità di rimuovere i gruppi acetilici senza osservare desolfatazione. In pratica, un’eparina è stata acetilata con un grande eccesso di anidride acetica in DMF/piridìna come descritto prima. Il prodotto ottenuto presenta la struttura seguente: ;;; ;;;
La deacetilazione di un campione di eparina in forma sodica è condotta in una soluzione (100mg/ml) di idrossido di sodio 0.1M . ;Dopo 18 ore a temperatura ambiente, la soluzione è neutralizata con HC1 diluito fino a un pH di 7. II prodotto è purificato su colonna Sephadex G-25. Lo studio NMR non rileva né desolfatazione nella posizione 2 deU’iduronico né presenza di epossido. ;O-solfatazione deiresempio 2, (parzialmente acetilatoì. ;Il prodotto descritto nell’esempio 2 (130 mg) è passato su una colonna di scambio ionico (FT) ed è liofilizzato in presenza di un grande eccesso di piridina (Py) allo scopo di otenere il sale di piridina corrispondente. ;Al composto, disciolto in DMF (7 mi) è aggiunto Py S03 (20 equivalenti per OH libero) e la soluzione è riscaldata a 50°C. Dopo 18 ore, la reazione è neutralizzata con NaOH 0.1M, precipitata con etanolo saturato di acetato di sodio, filtrata e dializzata per 48 ore. ;Il composto è passato su una colonna di scambio ionico (H*) ed è neutralizzato fino a un pH di 8 con una soluzione di NaOH 0.1 M per ottenere un sale sodico.
Il prodoto viene infine purificato su colonna Sephadex G-25. Lo spettro 13C-NMR mostra la N desolfatazione del campione e la presenza del segnale a 65 ppm carateristico della strutura IdoA2S03-IdoA30H nella eparina N desolfatata.
O-deacetilazione
La deaceti lazione del campione è condotta in una soluzione (100mg/ml) di idrossido di sodio 0.1M.
Dopo 18 ore a temperatura ambiente, la soluzione è neutralizzata con HC1 diluito fino a un pH di 7. Il prodotto è purificato su colonna Sephadex G-25. L’analisi NMR mostra la scomparsa dei segnali degli OAc.
N-solfatazione
Il campione viene sciolto in una soluzione acquosa satura di NaHCC^ e addizionato con un eccesso di trimetilamminaS03, mantenuto sotto agitazione a 40° C per 16 h.
Il campione è purificato per dialisi e gel filtrazione come negli esempi precedenti.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Polisaccaride contenente unità ripetitive disaccaridiche formate da un’acido uranico e da una glucosammina legati in posizione 1-4 caratterizzato dal fatto di contenere: a) almeno il 20% di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3; b) tra il 10% e 30% di unità glucosamminiche solfatate in posizione 3; ed c) aventi un rapporto molare solfati/carbossili compreso tra 1.5 e 3.5; 2. Polisaccaride secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il rapporto molare solfati/carbossili è compreso tra 1.7 e 3.1. 3. Polisaccaride secondo la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che il rapporto molare solfati/carbossili è compreso tra 2.2 e 2.8. 4. Polisaccaride secondo le rivendicazioni 1-3 comprendente tra 0 e 95% di unità ripetitive disaccaridiche contenenti acido glucuronico e tra 100% e 5% di unità ripetitive disaccaridiche contenenti acido iduronico. 5. Processo per ottenere polisaccaridi contenenti unità ripetitive disaccaridiche formate da un’acido uranico e da una glucosammina legati in posizione 1-4 e contenenti: a) almeno il 20% di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3; b) tra il 0 e 90% di unità glucosamminiche solfatate in posizione 3; ed c) aventi un rapporto molare solfati/carbossili compreso tra 1.7 e 3.5; a partire dal corrispondente polisaccaride avente tra 0 e 60% delle posizioni 2 sull’acido iduronico e tra lo 0 e il 20% delle posizioni 3 della glucosammina solfatate; caratterizzato dai seguenti passaggi: i) acilazione di una quantità compresa tra il 20% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 deH’acido iduronico e di una quantità compresa tra il 10% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 della glucosammina impiegando fra 1 e 5 equivalenti di un agente acilante per equivalente di ossidrile libero; ii) solfatazione degli ossidrili non protetti iii) liberazione dei gruppi acile in ambiente alcalino. iv) opzionale N-risolfatazione del prodotto del passaggio iii). 6. Processo secondo la rivendicazione 5 in cui l’agente acilante usato al passaggio i) è l’anidride di un acido carbossilico contenente da 1 a 20 atomi di carbonio. 7. Processo secondo le rivendicazioni 5-6 caratterizzato dal fatto che nel passaggio i) la quantità degli ossidrili acilati in posizione 3 dell’acido iduronico varia tra 90% e 100% e la quantità di ossidrili acilati in posizione 3 della glucosammina varia tra 10% e 100%; 8. Polisaccaride contenente unità ripetitive disaccaridiche formate da un’acido uronico e da una glucosammina legati in posizione 1-4 caratterizzato dal fatto di avere tra il 20% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 dell’acido iduronico e tra il 10% e il 100% degli ossidrili in posizione 3 della glucosammina sotto forma di acile; 9. Polisaccaride secondo la rivendicazione 8 caratterizzato dal fatto di avere tra 90% e 100% di ossidrili in posizione 3 dell’ acido iduronico acilati.
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