ITMI20110829A1 - Condroitin solfato biotecnologico solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica e procedimento per la sua preparazione - Google Patents

Description

Descrizione

“CONDROITIN SOLFATO BIOTECNOLOGICO SOLFATATO IN POSIZIONE 4 O 6 SULLA STESSA CATENA POLISACCARIDICA E PROCEDIMENTO PER LA SUA PREPARAZIONEâ€

Campo tecnico dell’invenzione

La presente invenzione ha per oggetto un metodo per la produzione di condroitin solfato mediante solfatazione chimica a partire da uno scheletro di condroitina non solfatata. Il procedimento dell’invenzione consente la solfatazione contemporanea, all’interno della stessa catena polisaccaridica, della posizione 4 o della posizione 6 del residuo N-acetil-D-galattosamminico. Il condroitin solfato così ottenuto presenta lo stesso schema di solfatazione che si osserva nel condroitin solfato naturale, al contrario di quanto ottenuto coi metodi di sintesi finora descritti.

Background tecnico

Il condroitin solfato (CS) Ã ̈ un polisaccaride naturale complesso appartenente alla classe dei glicosamminoglicani (GAGS), costituito da sequenze disaccaridiche formate da residui solfatati in posizione diversa di acido glucuronico (GlcA) e N-acetil-D-galattosamina (GalNAc) legati da legami beta 1-3.

Il CS à ̈ presente nei tessuti animali con funzioni strutturali e fisiologiche. A seconda dell’origine, il CS à ̈ costituito principalmente da percentuali variabili di due tipi di unità disaccaridiche monosolfatate in posizione 4 o in posizione 6 di GalNAc (rispettivamente disaccaride A e C). Tuttavia all’interno delle catene polisaccaridiche possono essere presenti in varie percentuali disaccaridi nei quali i gruppi solfato sono presenti in diverso numero e in posizioni diverse. Nello scheletro del CS à ̈ presente anche il disaccaride non solfatato, generalmente in piccole quantità. Disaccaridi disolfatati aventi due gruppi solfato legati attraverso l’atomo di ossigeno in varie posizioni, come in posizione 2 di GlcA e in 6 di GalNAc (disaccaride D), in posizione 2 di GlcA e in 4 di GalNac, o in posizione 4 e 6 di GalNAc (disaccaride E), possono essere presenti nello scheletro del CS in percentuali variabili a seconda delle fonti animali specifiche (Volpi N. J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr Pharm Des 12, 639, 2006).

L’unità ripetuta del disaccaride che si trova nel CS presenta la seguente formula chimica

COO<- OR>4 OR6

<O>

HOO OO

OR2NHAc

in cui R2, R4e R6sono indipendentemente H o SO -3.

Le cariche negative dei gruppi carbossilato e solfato presenti nella unità ripetuta del disaccaride sono neutralizzati da ioni sodio.

Il significato degli acronimi più ricorrenti utilizzati per identificare i disaccaridi variamente solfatati à ̈ riportato qui sotto:

Di-0S (R2=H; R4=H; R6=H)

Di-6S (C) (R2=H; R4=H; R6= SO3-)

Di-4S (A) (R2=H; R4= SO3-; R6=H)

Di-4,6diS (E) (R2=H; R4= SO3-; R6= SO3-)

Di-2,6diS (D) (R2= SO3-; R4=H; R6= SO3-)

Di-2,4diS (B) (R2= SO3-; R4= SO3-; R6=H)

Di-2,4,6triS (R2= SO3-; R4= SO3-; R6= SO3-)

I campioni di CS provenienti da diverse fonti animali sono caratterizzati

anche da un’eterogeneità di peso molecolare e di densità di carica, quest’ultimo

parametro essendo direttamente correlato agli specifici gruppi solfatati.

La Tabella 1 illustra i principali disaccaridi che si trovano nel CS

naturale estratto dalla cartilagine e da altri tessuti di differenti specie animali:

<CS>CS Suino CS di CS di CS di CS diBovinogallina squalo razza calamaro

Mn (kDa) 12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80 Mw (kDa) 20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120 Indice di

Polidispersità1.8-2.2 1.4-1.8 1.6-2.0 1.0-2.0 1.2-2.5 0.8-1.3

Di-0S 6 6 8 3 3 13 Di-6S 33 14 20 44 39 15 Di-4S 61 80 72 32 43 50 Di-2,6diS ND ND ND 18 13 0 Di-4,6diS ND ND ND 2 1 22 Di-2,4diS ND ND ND 1 1 0

Densità di

Carica0.90-0.96 0.92-0.96 0.90-0.94 1.15-1.25 1.08-1.20 1.00-1.20 Rapporto

4S/6S1.50-2.00 4.50-7.00 3.00-4.00 0.45-0.90 1.00-1.40 2.50-4.00

Tabella 1 - Mn = peso molecolare medio numerico; Mw = peso molecolare

medio ponderale; Indice di polidispersità = Mw/Mn; la densità di carica à ̈ il

numero di gruppi solfato per unità disaccaridiche; ND = Non individuato

La Tabella 1 mostra come il CS derivante da animali terrestri abbia parametri di massa molecolare simili (Mn e Mw), mentre à ̈ diverso da quella proveniente da specie ittiche, queste ultime avendo valori di massa molecolare superiori. I campioni di CS terrestre sono caratterizzati anche da valori di densità di carica (CD) inferiori a 1.0, mentre i campioni di CS ittici mostrano sempre valori di CD superiori a 1.0. Questa caratteristica à ̈ dovuta alla differente distribuzione dei disaccaridi solfatati. Generalmente i disaccaridi disolfatati si trovano in quantità in tracce nel CS terrestre e nel CS naturale non si osservano disaccaridi polisolfatati (tri- e tetra- solfati).

L’assenza dei disaccaridi tri- e tetra- solfati può essere facilmente evidenziata dall’analisi seguente alla digestione del polisaccaride con condroitinasi ABC, un enzima litico specifico per i disaccaridi monosolfatati (Di-4S e Di-6S) e per i disaccaridi non solfatati (Di-0S), in grado di digerire i disaccaridi di-solfatati ma incapace di idrolizzare la catena polisaccaridica in corrispondenza dei disaccaridi polisolfatati. L’analisi FACE (Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis) dei CS naturali digeriti con condroitinasi ABC non rivela la presenza delle bande elettroforetiche caratteristiche degli oligosaccaridi parzialmente non digeriti presenti invece nei CS sintetici o semi-sintetici derivanti dall’arte nota.

Inoltre à ̈ ben noto che, a causa di processi biosintetici, tutti i CS naturali mostrano sempre la presenza contemporanea di disaccaridi monosolfatati in posizione 4 o 6 di GalNAc sulle stesse catene polisaccaridiche (D’Arcy SM et al., Carbohydr Res. 1994 Mar 4;255:41-59. Hardingham TE et al., Carbohydr Res. 1994 Mar 4;255:241-54. Cheng F, et al., Glycobiology. 1992 Dec; 2(6):553-61. Chai W et al., Anal Biochem. 1996 May 15;237(1):88-102. Zaia J et al., Anal Chem. 2001 Dec 15;73(24):6030-9.

Desaire H et al., Anal Chem. 2001 Aug 1;73(15):3513-20).

Sono state riportate differenti attività per CS in relazione alla sua struttura molecolare (Kimata K et al., Mol Cell Biochem 1, 211, 1963. Volpi N. Biomaterials 23, 3015, 2002. Volpi N, Tarugi P. Biochimie 81, 955, 1999. Volpi N. Biomaterials 20, 1359, 1999. Suzuki S et al., J Biol Chem 243, 7, 1968).

Il CS presenta attività antinfiammatoria e attualmente à ̈ raccomandato nel trattamento dell’osteoartrite (OA) come farmaco sintomatico ad azione lenta (Symptomatic Slow Acting Drug for Osteo Arthritis, SYSADOA) in Europa, in particolare per il trattamento dell’osteoartrite del ginocchio (Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003), dell’anca (Jordan KM et al. Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003) e della mano (Zhang W et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007) in base a evidenze cliniche e a relative meta-analisi di numerosi studi clinici. Inoltre, il CS à ̈ utilizzato ampiamente anche come nutraceutico in Europa e negli USA, da solo o in combinazione con altri ingredienti (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).

Il CS commerciale à ̈ ottenuto per estrazione di tessuti animali, come per esempio tessuti bovini, suini (Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998), di uccelli (Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002) e cartilagini di pesci (Sugahara K et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003).

L’origine animale del CS commerciale comporta problemi di sicurezza associati ad agenti infettivi trasmissibili che provocano patologie come l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e limita le eventuali fonti in considerazione della crescente domanda a livello mondiale. Queste considerazioni hanno stimolato la ricerca di metodi alternativi per la produzione di CS.

Sono stati svolti sforzi intensi per trovare una via biotecnologica per la produzione di CS, utilizzando un microorganismo come fonte di un polisaccaride precursore che mostri una struttura parzialmente simile a quella di CS e procedendo attraverso la solfatazione chimica per produrre un CS simile a quello naturale.

Un esempio di questa strategia à ̈ la produzione di CS biotecnologico a partire dal polisaccaride capsulare K4 di E. coli O5:K4:H4 come descritto in EP 1304338 B1. Questo brevetto descrive un procedimento in cui il polisaccaride K4 prodotto in colture liquide viene estratto e purificato, e successivamente ridisciolto e sottoposto a idrolisi acida per eliminare i residui di fruttosio legati ai residui di GlcA del polimero. Il polimero defruttosilato, identico allo scheletro non solfatato di CS (CH), viene poi solfatato in posizione 4 o in posizione 6 del residuo GalNAc seguendo due diverse vie di sintesi chimica. Nel brevetto viene descritta una terza via in cui viene ottenuto un CS disolfatato in entrambe le posizioni 4 e 6. Il CS ivi descritto presenta un contenuto di almeno 70% di polisaccaridi solfatati consistenti di mono- e/o di- solfatati in posizione 4 e 6 del residuo GalNAc, la posizione 2’ del residuo GlcA essendo non solfatata, e ha peso molecolare (Mw) di 6 - 25 kDa e una densità di carica (CD) di 0.7 - 2.0.

In EP 1304338 B1 gli autori descrivono e rivendicano, in funzione della strategia sintetica adottata, la possibilità di:

a) sintetizzare il CS 4S proteggendo selettivamente la posizione 6 di tutti i residui di N-acetilgalattosamina (GalNAc) presenti ottenendo così un polimero solfatato selettivamente ed esclusivamente nella posizione 4 di tutti i residui di N-acetilgalattosamina (GalNAc) b) ottenere un polimero avente in analogia solfatati i gruppi idrossilici in posizione 6 di tutti i residui di GalNAc proteggendo in modo opportuno i residui idrossilici presenti in posizione 4.

Nel procedimento descritto in EP 1304338 B1 risulta quindi che non si verifica mai la solfatazione contemporanea nelle posizioni 4 o 6 all’interno della stessa catena, contrariamente a quanto avviene nel CS naturale.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione descrive un metodo per la produzione di un CS in seguito a solfatazione chimica a partire da uno scheletro di condroitina non solfatata (CH), questa CH essendo ottenuta mediante idrolisi acida di un polisaccaride microbico naturale (cioà ̈ K4), oppure essendo prodotta direttamente da un E. coli modificato geneticamente, come per esempio il ceppo E. coli DSM23644 descritto nelle domande di brevetto MI2010A001300 e MI2010A001264. Il ceppo batterico ivi descritto reca una mutazione che provoca l’inattivazione del gene KfoE per la fruttosilazione di K4.

Il CS ottenuto col procedimento dell’invenzione presenta le caratteristiche di un CS naturale con un titolo superiore al 95% in base ai metodi analitici descritti nella Farmacopea Europea.

Il CS ottenuto con il procedimento della presente invenzione ha un peso molecolare medio misurato mediante SEC (Mw) di 10 - 30 kDa, preferibilmente 20 - 30 kDa, e presenta una distribuzione di gruppi mono-solfati variante da 90% di 4-solfato e 10% di 6-solfato a 10% di

4-solfato e 90% di 6-solfato (Tabella 2).

Caratteristiche del CS descritto nella presente invenzione

Mw (kDa) 10-30

Digeribilità con condroitinasi ABC > 95%

Di-0S < 10%

Di-6S 10 – 90%

Di-4S 90 – 10%

Di-2,6diS < 5%

Di-4,6diS < 5%

Di-2,4diS < 5%

Di-triS ND

Di-tetraS ND

Titolo (w/w) > 95% (o.d.b.)* ;Densità di Carica 0.8-1.0 ;Rapporto 4S/6S 0.1-9.0 ;;* - o.d.b.: on dry basis

Tabella 2

Il CS ottenuto con il procedimento della presente invenzione mostra

una piccola quantità (<10%) di disaccaride non solfatato e percentuali molto

basse (< 5%) di disaccaridi disolfatati, mentre non sono individuabili

disaccaridi trisolfatati.

Il CS ottenuto con il procedimento dell’invenzione à ̈ caratterizzato da

valori di densità di carica di 0.8 - 1.0.

In alcune forme di esecuzione della presente invenzione, il CS ottenuto

mostra un rapporto tra disaccaride solfatato nella posizione 4 (Di-4S) e

disaccaride solfatato nella posizione 6 (Di-6S) inferiore a 1, mentre in altre forme essa mostra un rapporto tra (4S) disaccaride e (6S) disaccaride superiore a 1.

Il procedimento della presente invenzione consente di modulare la solfatazione sito-specifica allo scopo di fornire un CS con uno specifico rapporto 4S/6S nei limiti sopra indicati.

Un aspetto della presente invenzione riguarda la composizione del CS della presente invenzione e un carrier accettabile in campo farmaceutico o nutraceutico. Tale composizione può essere formulata in varie forme solide, quali compresse, capsule rigide, capsule di gelatina morbida, miscele per bevande in polvere, o in forme liquide (soluzioni), preferibilmente sottoforma di preparazioni farmaceutiche o nutraceutiche per somministrazione parenterale o orale. La composizione può comprendere altri ingredienti attivi o inattivi.

La composizione può anche e preferibilmente comprendere almeno una delle seguenti sostanze: glucosammina cloridrato, glucosammina solfato, N-acetil glucosammina, acido ialuronico, eparina, cheratina, dermatina, metilsolfonilmetano, folati e folati ridotti, vitamine del gruppo B, S-adenosilmetionina (SAMe), acido ascorbico o manganese ascorbato. La composizione può essere somministrata ad un soggetto in quantità efficace in relazione alla sua necessità.

A titolo di esempio, ma senza limitarne l’impiego il CS o la composizione descritta nella presente invenzione può essere somministrato in una quantità compresa tra 100 e 3000 mg giornalieri, preferibilmente tra 1000 e 2000 mg giornalieri e più preferibilmente tra 1250 e 1750 mg giornalieri suddivisi in due dosi da circa 600 mg o tre dosi da 400 mg al giorno.

La presente invenzione, inoltre, riguarda l’uso del CS descritto o di una sua composizione per il trattamento o la prevenzione dell’osteoartrite o per il mantenimento del benessere muscolo-scheletrico come ingrediente in un farmaco o in un supplemento nutrizionale.

Come esempio, il CS descritto o una sua composizione può essere usato nella preparazione di un preparato farmaceutico, un additivo alimentare o un supplemento nutrizionale per la prevenzione e/o il trattamento dell’osteoartrite dell’anca, della mano e del ginocchio e i suoi principali sintomi (dolore, rigonfiamento delle giunture, infiammazione), del morbo di Alzheimer, delle infezioni microbiche, dell’arteriosclerosi, dell’osteoporosi e come adiuvante nella terapia antitumorale e nella rigenerazione dei tessuti compreso il tessuto nervoso.

Una caratteristica vantaggiosa del procedimento dell’invenzione à ̈ che la solfatazione in posizione 4 o in posizione 6 del residuo GalNAc si verifica contemporaneamente all’interno della stessa catena polisaccaridica, simulando lo schema di solfatazione che si osserva nel CS naturale, al contrario di quanto ottenuto coi metodi di sintesi finora descritti. Questo aspetto à ̈ confermato dai dati ottenuti tramite l’utilizzo di due sistemi enzimatici diversi e precisamente con la condroitinasi ABC, in grado di digerire le unità solfatate in posizione 6, in posizione 4 e quelle non solfatate, e con la condroitinasi C, una endoliasi che à ̈ in grado di idrolizzare in corrispondenza sia dei residui solfatati in posizione 6, sia dei residui non solfatati ed à ̈ incapace di eseguire analogo taglio litico in corrispondenza dei residui solfatati in posizione 4. I prodotti della digestione, ottenuti sia con condroitinasi ABC che con la sola condroitinasi C, vengono analizzati mediante tecniche cromatografiche HPLC, come descritto da Joon-Soo Sim et al. (J. Chromatography B, 2005 vol. 818, 133-139)., evidenziando in modo quali- e quantitativo la presenza sia di disaccaridi Di-0S, Di-4S e di Di-6S sia quella di eventuali oligosaccaridi non digeriti dagli enzimi.

Dall’analisi dei prodotti di digestione con condroitinasi ABC si osserva la pressoché totale digestione del prodotto con la formazione del disaccaride non solfatato Di-0S, di disaccaridi monosolfatati Di-4S e di Di-6S e di tracce di disaccaride disolfatato Di-4,6S.

Per contro, dall’analoga analisi condotta sui prodotti della digestione con condroitinasi C si evince chiaramente la presenza di sequenze disaccaridiche ma soprattutto di sequenze oligosaccaridiche relative all’incapacità dell’enzima di degradare completamente il polisaccaride a causa della presenza sulle stesse catene di GalNAc solfatata in 4. Ciò à ̈ dovuto al fatto che ove sia presente un residuo solfatato in 4 l’enzima non à ̈ in grado di agire lasciando quindi dei residui oligosaccaridici. Questi ultimi vengono ben evidenziati anche con tecniche cromatografiche ed elettroforetiche, sia su gel che in elettroforesi capillare (CE), come mostrato, ad esempio, nei tracciati cromatografici delle Figure 1, 2 e 3, relativi alla digestione con condroitinasi C di CS di origine naturale, bovina e suina, e di CS biotecnologico ottenuto secondo la presente invenzione,. In essi sono presenti vari oligosaccaridi di lunghezza diversa che evidenziano la presenza di gruppi solfato in posizione 4 oppure 6 del residuo di GalNAc sulla stessa catena polisaccaridica.

Tutte queste proprietà conferiscono al CS ottenuto con il procedimento della presente invenzione la struttura di un CS naturale avente le seguenti caratteristiche:

a) tutti o quasi i residui di GalNAc monosolfatati in posizione o 6 o 4;

b) un rapporto tra i residui 4S e 6S (4S/6S), in funzione delle condizioni di sintesi adottate, del tutto analogo a quello riscontrabile nei CS sia di origine terrestre sia di origine ittica.

Tipicamente il CS della presente invenzione può essere ottenuto utilizzando come substrato di partenza il polisaccaride capsulare K4 prodotto naturalmente dal ceppo di E. coli O5:K4:H4 (EP 1304338 B1) oppure un altro polisaccaride avente la struttura della condroitina non solfatata (CH).

Nel primo caso il polisaccaride K4, ottenuto da un brodo di coltura del ceppo O5:K4:H4 di E. coli, viene defruttosilato a fine fermentazione mediante idrolisi termoacida e la purificazione della condroitina viene eseguita in accordo con un adattamento dei metodi descritti da Rodriguez e Jann (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988).

Alternativamente il polisaccaride di partenza à ̈ ottenuto per esempio dalla coltura del ceppo di E. coli DSM23644 descritto in MI2010A001300, che, in virtù di una mutazione indotta nel gene KfoE responsabile della fruttosilazione del K4, produce un polisaccaride identico alla CH naturale non solfatata. In questo caso non à ̈ necessaria la defruttosilazione, tuttavia il passaggio dell’idrolisi termoacida viene mantenuto allo scopo di eliminare alcune impurezze, tra cui le endotossine batteriche che precipitano per effetto del trattamento. Successivamente si procede alla purificazione della condroitina (CH) mediante centrifugazione, dialisi e spray drying.

L’idrolisi viene condotta sul surnatante della coltura separato dalla biomassa mediante centrifugazione continua. Si procede all’idrolisi parziale e alla defruttosilazione del K4 mediante incubazione a 90° - 95°C per 30 - 50 min a pH 2,8 - 3,0.

Terminato il periodo di incubazione, al fine di arrestare la reazione di idrolisi, si raffredda la sospensione risultante a una temperatura inferiore a 40°C, preferibilmente a 20°C - 30°C e contemporaneamente si aggiusta il pH a 4 - 4,5. La sospensione risultante viene sottoposta in sequenza a chiarificazione, mediante centrifugazione continua, a ultrafiltrazione ed infine a dialisi con acqua su una membrana da 30 kDa.

Il ritentato dializzato (circa 1/10 del volume del brodo di coltura iniziale) viene filtrato e infine essiccato mediante spray dryer per ottenere un polisaccaride avente la struttura della CH da sottoporre al processo di solfatazione. La CH ottenuta presenta un titolo sul secco (w/w) del 80 - 90% come determinato mediante analisi in elettroforesi capillare (CE) o in HPLC.

La CH così ottenuta à ̈ sotto forma di sale sodico e per essere solfatata richiede la sua trasformazione in acido libero o in un suo sale.

Il procedimento di solfatazione oggetto della presente invenzione che consente di mono-solfatare in modo casuale le posizioni 4 o 6 del residuo GalNAc della stessa catena polisaccaridica consiste nella formazione di un orto estere che coinvolge contemporaneamente le posizioni 4 e 6 della GalNAc e il suo successivo riarrangiamento a estere che, sorprendentemente, può essere modulato al fine di liberare prevalentemente l’idrossile in 4 o quello in 6 permettendo così la relativa selettiva solfatazione di questi idrossili.

Il procedimento dell’invenzione comprende i seguenti passaggi:

a) Trasformazione della condroitina sale sodico in acido libero o, in alternativa, in un suo sale con uno ione ammonio quaternario, quale ad esempio tetrametil-, tetraetil- e tetrabutil-ammonio, o con la piridina. Preferibilmente viene impiegato il sale di tetrabutil-ammonio (TBA).

Alternativamente, la condroitina (CH) in forma acida viene trasformata nel suo metilestere dopo reazione in metanolo e acetil cloruro.

b) Reazione del sale di condroitina, o della condroitina metilestere con un orto estere di formula RC(OR1)3, in cui R à ̈ scelto tra idrogeno, metile, etile o fenile ed R1à ̈ scelto tra metile o etile, in presenza di catalisi acida, ottenendo in questo modo la formazione di un orto estere ciclico che si forma per spostamento di due alcossili dell’orto estere di partenza da parte delle funzioni alcoliche 4 e 6 del residuo di GalNAc. Nel composto ottenuto in questo passaggio tutte o quasi tutte le unità disaccaridiche presenti possiedono una struttura di orto estere ciclico rappresentata dalla formula I,

R

OR1

<O>

OO<O>

O O

OOO

H O OH NHAc

I

in cui R R1sono come sopra definiti.

Esempi di orto esteri utilizzabili sono trimetil ortoacetato, trietil ortoacetato, trimetil ortoformiato, trietil ortoformiato, trimetil ortopropionato, trietil ortopropionato, o trimetil orto benzoato. Si utilizza preferibilmente trimetil ortoacetato o trietil ortoacetato. L’impiego del trimetil ortoacetato à ̈ particolarmente preferito.

Come catalizzatore acido si utilizza un acido scelto tra acido canforsolfonico, acido para-toluensolfonico, acido metansolfonico o una resina solfonica, preferibilmente acido canforsolfonico o una resina solfonica, più preferibilmente acido canforsolfonico.

c) Protezione dei gruppi alcolici in posizione 2’ e 3’ del residuo GlcA mediante acilazione con un’anidride di un acido carbossilico di formula (R2CO)2O, in cui R2à ̈ preferibilmente scelto tra metile, etile o propile in presenza di piridina o di una base organica terziaria, ad esempio trietilammina o triisopropiletilammina, e di quantità catalitiche di 4-dimetilamminopiridina (DMAP), per dare un prodotto in cui l’unità ripetuta del disaccaride che si trova nella condroitina ha una struttura di ortoestere ciclico acilato in 2’ e 3’ rappresentata dalla formula II

R

OR1

<O>

OO<O>

O O

OOO

O

R2 O NHAc

O R2

O

II

in cui R, R1ed R2sono come sopra definiti.

Viene preferibilmente impiegata anidride acetica.

d) Riarrangiamento da ortoestere ciclico ad estere, reazione che viene eseguita in una miscela di un acido organico solubile in acqua ed acqua, o in sola acqua. Questo riarrangiamento che avviene in modo casuale sulle varie unità di GalNAc della sequenza polisaccaridica, può essere modulato al fine di favorire la liberazione dell’uno o dell’altro idrossile (rispettivamente in 4 o in 6), con la contemporanea formazione dell’estere con l’acido organico solubile utilizzato sulla restante posizione (rispettivamente in 6 o in 4). Come risultato si ottiene la formazione, all’interno della stessa catena polisaccaridica, delle due differenti unità disaccaridiche e precisamente:

- quelle aventi una struttura in cui gli idrossili in posizioni 6, 2’, 4’ sono acilati e quello in 4 libero, rappresentate dalla formula IIIa;

O R

<O>

OOH<O>

O O

OOO

O

R2 O NHAc

O R2

O

IIIa

in cui R ed R2sono come sopra definiti; oppure,

- quelle aventi una struttura in cui gli idrossili in posizioni 4, 2’, 4’ sono acilati e quello in 6 à ̈ libero, rappresentate dalla formula IIIb

R

<O>

OO O<OH>

O O

OOO

O

R2 O NHAc

O R2

O

IIIb

in cui R ed R2sono come sopra definiti.

Effettuando, infatti, la reazione a una temperatura compresa tra 20 e 40°C, preferibilmente a temperatura ambiente e per un tempo compreso tra 1 e 48 ore, preferibilmente tra 3 e 38 ore, più preferibilmente per un tempo di 38 ore si osserva sorprendentemente una maggior quantità di composto avente l’idrossile libero in 6, mentre operando ad una temperatura compresa tra 40 e 70°C, preferibilmente a 60°C, e per un tempo compreso tra 1 e 48 ore, preferibilmente tra 3 e 38 ore, più preferibilmente per un tempo di 18 ore, prevale il prodotto con l’idrossile libero in 4. L’acido organico solubile in acqua à ̈ scelto tra acido acetico, formico, propionico, tartarico, citrico o una resina cationica quale ad esempio Sepra SCX 50 µm 65A, preferibilmente acido acetico o acido propionico, più preferibilmente acido acetico.

d) Si procede quindi alla solfatazione con piridinio-solfotriossido in DMF secondo il metodo già descritto in EP 1304338 B1, o con il complesso DMF-solfotriossido, ottenendo un CS che, sulla base delle condizioni di riarrangiamento adottate e di conseguenza della percentuale di strutture IIIa e IIIb in essa presenti, risulterà essere contemporaneamente e variamente solfatato alla posizione 4 del disaccaride IIIa o alla posizione 6 del disaccaride IIIb. La reazione di solfatazione à ̈ poi seguita dalla rimozione, mediante trattamento basico, dei gruppi acilici presenti nelle posizioni 2’ e 3’ del residuo GlcA e nelle posizioni 4 o 6 del residuo GalNAc, secondo le procedure descritte in EP 1304338 B1, per dare CS sale sodico che risulta parzialmente solfatato in 4 e in 6.

L’invenzione à ̈ ora ulteriormente illustrata dai seguenti esempi.

Esempio 1: Preparazione di un sale di tetra-alchil ammonio o di piridinio di condroitina

La CH sale sodico ottenuta dopo idrolisi, purificazione ed essiccamento mediante i metodi sopra descritti a partire dal polisaccaride K4 o dal polisaccaride ottenuto dalla fermentazione del ceppo DSM23644 di E. Coli, viene disciolta in ambiente acquoso. Dopo completa dissoluzione, la soluzione stessa viene caricata su una colonna impaccata con una resina a scambio cationico, ad esempio Amberjet 1200 H, Rohm and Haas o equivalente.

Vengono raccolte le frazioni eluite a pH 1,5 - 4,0 o preferibilmente a pH 1,5 - 2,0 e viene aggiunta una soluzione acquosa di uno ione scelto tra tetrametil-, tetraetil- e tetrabutil- ammonio o piridinio fino ad ottenere un pH di 6,0 - 8,0 o preferibilmente di 6,5 - 7,0. La soluzione viene successivamente evaporata fino a completa secchezza per liofilizzazione o per spray drying in modo da ottenere il corrispondente sale.

Esempio 2: Protezione delle funzioni idrossilate (4 e 6) della porzione GalNAc con formazione del corrispondente CH metil-ortoestere ciclico (CH-cMOE)

Il sale ottenuto della condroitina, ad esempio il sale di tetrabutil ammonio (TBA), viene miscelato con dimetilformammide (DMF) in un pallone nelle rispettive quantità di 5,2 g e 130 ml. Nel pallone vengono aggiunti per gocciolamento 8,49 g di trimetil orto-acetato e a seguire 300 mg di acido canforsolfonico e si mantiene la miscela di reazione a 70°C per 72 h. La reazione viene quindi evaporata sotto vuoto fino a secchezza e ulteriormente asciugata in stufa a 40°C per 20 h ottenendo 6,1 g di condroitina-MOE TBA sotto forma di solido.

Le analisi eseguite sul prodotto di reazione sono state condotte al fine di appurare l’avvenuta protezione. Mediante SEC-HPLC à ̈ stato possibile verificare la scomparsa del prodotto di partenza e la comparsa di un nuovo prodotto con peso molecolare superiore (48 KDa). Quelle eseguite mediante digestione con condroitinasi ABC, enzima in grado di idrolizzare la CH libera e non quella protetta, hanno permesso di appurare una percentuale di molecole di CH di partenza non protetta inferiore al 15%.

Esempio 3: Acetilazione in 2’,3’ del ortoestere ciclico della condroitina- (2’,3’diacetil CH-cMOE)

La condroitina protetta come metil-ortoestere ciclico proveniente dal passaggio precedente (CH-cMOE) (4,79 g) viene caricata in un pallone di reazione unitamente a 23,95 ml di acetonitrile, 15,69 ml di trietilammina (TEA), 6,21 ml di anidride acetica e 78,96 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP). Dopo 2 h di agitazione a 25 - 26°C vengono aggiunti 94 ml di di-isopropiletere fino ad ottenere un solido colloso che viene poi filtrato su carta ed essiccato in stufa sottovuoto a 45°C per 24 h. L’intermedio ortoestere ciclico così ottenuto ha l’aspetto di un solido di color rosa.

Esempio 4: Riarrangiamento da metil ortoestere ciclico ad estere con prevalente formazione dell’acetato in 4 e con l’idrossile in 6 libero. (vedi figura IIIB)

L’intermedio ottenuto dal passaggio precedente (2,42 g) viene caricato in un pallone di reazione a cui sono aggiunti 18,8 ml di acido acetico al 96% e 2,35 ml di acqua demineralizzata. La miscela viene agitata 38 h a temperatura ambiente, quindi vengono aggiunti 100 ml di una soluzione 0,6 M di NaCl e la miscela viene ultrafiltrata su membrana da 5 kDa quindi dializzata, recuperando un ritentato con un pH di 3,32.

La soluzione viene evaporata sotto vuoto a 45-50°C, quindi, dopo ulteriore essiccamento in stufa per una notte, si ottengono 1,38 g di un prodotto dall’aspetto di un solido vetroso.

Esempio 5: Riarrangiamento da metil orto-estere ciclico ad estere con prevalente formazione dell’acetato in posizione 6 e con l’idrossile libero in 4 (vedi figura IIIA)

In un pallone di reazione vengono caricati 2,42 g di intermedio orto-estere ciclico ottenuto dal passaggio precedente unitamente a 14,52 ml di acido acetico 96% e 9,8 ml di acqua demineralizzata scaldando a 60°C per 17,5 h, quindi si aggiungono 100 ml di NaCl 0,6 M e la soluzione (pH 2,27) viene ultrafiltrata, quindi dializzata, recuperando un ritentato con un pH di 3,56.

La soluzione viene evaporata sotto vuoto a 45-50°C,quindi dopo ulteriore essiccamento in stufa per una notte si ottengono 1,12 g di un prodotto dall’aspetto di un solido vetroso.

Esempio 6: Preparazione di condroitina solfato con il complesso piridino-solfotriossido

In un pallone si carica l’intermedio ottenuto come da esempio 4 (0,76 g) unitamente a 46,0 ml di DMF agitando la miscela a 30°C per 10 min, si aggiungono 0,72 g di piridinio-solfotriossido, dopo dissoluzione del materiale di partenza (ca. 10 min) si lascia in agitazione a 30°C per 1 h e si aggiungono altri 0,72 g di piridinio-solfotriossido, quindi si aggiungono ulteriori 0,72 g di piridinio-solfotriossido. La soluzione viene agitata per un’altra ora a 30°C.

la reazione viene spenta versando la miscela in 50 ml di NaHCO3al 10% in acqua a temperatura ambiente (pH 7,81), dopo aver filtrato si evapora sotto vuoto (10 mBar) a secchezza, si ridiscioglie il residuo con 150 ml di NaCl 0,6 M e, infine, si ultrafiltra la soluzione.

Dopo 6 cambi di volume il ritentato ha un pH di 9,22, il pH viene portato a 6,7 con HCl 1 N e si continua la ultrafiltrazione sostituendo la soluzione NaCl 0,6 N con acqua demineralizzata.

Si ultrafiltra ancora per 2 volumi, quindi si dializza fino ad un volume di 20 ml. La soluzione dializzata viene concentrata a secchezza sotto vuoto (10 mBar, 45°C).

Il prodotto così ottenuto (0,88 g) viene sciolto con 34,0 ml di soda (NaOH) 0,2 N e scaldato a 40°C in agitazione per 2 h. Al termine la soluzione viene diluita con una soluzione acquosa 0,6 M di sodio cloruro, ultrafiltrata su membrana da 5 kDa e in seguito dializzata con acqua demineralizzata. Il ritentato viene concentrato a secchezza sotto vuoto (45°C, 10 mBar), fornendo 0,67 g di condroitin solfato. Il prodotto finale che possiede un peso molecolare pari a 29 kDa, determinato mediante HPLC-SEC mostra:

- una digeribilità con condroitinasi ABC superiore al 95%;

- un rapporto 4S/6S pari a 18/82;

- un valore complessivo di densità di carica di circa 0,9;

- una non totale digeribilità con condroitinasi C evidenziata dalla presenza di oligosaccaridi dovuti alla presenza sulla medesima catena polisaccaridica di unità sia 4-solfatate sia 6-solfatate, caratteristica della presente invenzione.

Esempio 7: preparazione di condroitin solfato con il complesso piridinio-solfotriossido

In un pallone si carica l’intermedio ottenuto come da esempio 5 (1,12 g) unitamente a 67,2 ml di DMF agitando la miscela a 50°C per 10 min, si aggiungono 1,05 g di piridinio-solfotriossido, dopo dissoluzione del materiale di partenza (ca. 10 min) si lascia in agitazione a 50°C per 1 h e si aggiungono altri 1,05 g di piridinio-solfotriossido. La soluzione viene agitata per un’altra ora a 50°C.

La reazione viene spenta versando la miscela in 60 ml di NaHCO3al 10% in acqua a temperatura ambiente (RT) (pH 7,81), dopo aver filtrato si evapora sotto vuoto (10 mBar) a secchezza, si ridiscioglie il residuo con 30 ml di NaCl 0,6 M e, infine, si ultrafiltra la soluzione.

Dopo 6 cambi di volume il ritentato ha un pH di 9,22, il pH viene portato a neutralità (7,5) con HCl 1 N e si continua la microfiltrazione sostituendo la soluzione NaCl 0,6 N con acqua demineralizzata.

Si ultrafiltra ancora per 2 volumi, quindi si dializza fino ad un volume di 20 ml. La soluzione dializzata viene concentrata a secchezza sotto vuoto (10 mBar, 45°C) ottenendo 1,53 g di prodotto.

Questo residuo viene sciolto in 59,6 ml di soda (NaOH) 0,2 N e scaldato a 60°C per 2 h. Al termine la soluzione viene diluita con una soluzione acquosa 0,6 M di sodio cloruro, ultrafiltrata su membrana da 3 kDa e in seguito dializzata con acqua demineralizzata. Il ritentato viene concentrato a secchezza sotto vuoto (45°C, 10 mBar), fornendo 0,76 g di condroitin solfato.

Il prodotto così ottenuto mostra un peso molecolare pari a 15,4 kDa, determinato mediante HPLC-SEC; una digeribilità con coindroitinasi ABC superiore al 95%; un rapporto 4S/6S pari a 82/18; un valore complessivo di densità di carica di circa 1,09. La pressoché completa digestione ottenuta con condroitinasi ABC (viene degradato più del 95% del prodotto) associata ad una ridotta digeribilità con condroitinasi C, caratteristiche della presente invenzione, evidenziano l’esistenza sulla medesima catena polisaccaridica di unità sia 4-solfatate sia 6-solfatate.

La digeribilità con condroitinasi ABC superiore al 95%, inoltre, evidenzia l’assenza di disaccaridi polisolfatati (tri- e tetra- solfatati) nella catena polisaccaridica del CS relativo alla presente invenzione.

Esempio 8: preparazione del metilestere della condroitina (CH)

Ad una soluzione di 1,3 L di metanolo e 14,43 g di acetil-cloruro posta in agitazione a temperatura ambiente per 2 ore in un pallone da 3 litri, si aggiungono 10,0 g di CH in forma acida e la sospensione ottenuta si mantiene in agitazione per 20 ore.

Scaduto il tempo si filtra la sospensione ed il solido viene lavato con 100 ml di metanolo (2X50 ml) e si secca a 50°C in vuoto recuperando 9,4 g di solido secco.

La reazione viene ripetuta una seconda volta con le stesse modalità e allo scadere della seconda si raffredda tra 0 e 5°C per 60 minuti prima di filtrare. Il solido ottenuto, si lava con metanolo freddo (0-5°C) e si essicca per 3 ore in stufa a 50°C in vuoto recuperando 6,3 g di solido.

Esempio 9: Protezione mediante formazione di ortostere delle funzioni idrossilate (4 e 6) della porzione GalNAc della CH metilestere

In un pallone da 500 ml provvisto di valvola a calcio cloruro e flusso di azoto, si caricano 150 ml di dimetilformammide (DMF) e 6,0 g del prodotto ottenuto nello step precedente. Successivamente si aggiungono 20,06 g di trimetilortoacetato e 0,71 g di acido canforsolfonico. La soluzione ottenuta si scalda a 50°C interni per 18 ore.

Al termine si lascia raffreddare a RT e si concentra sotto vuoto ottenendo 8,5 g di prodotto.

Esempio 10: Acetilazione degli idrossili 2’,3’ del prodotto derivante dall’esempio 9

In un pallone da 250 ml provvisto di valvola a calcio cloruro e flusso di azoto, si caricano a temperatura ambiente 8,0 g del prodotto ottenuto nel passaggio precedente, 40 ml di DMF, 28,6 g di trietilammina, 17,15 g di anidride acetica e 96 mg di dimetilamminopiridina.

La soluzione ottenuta viene lasciata 3 ore in agitazione e una volta scaduto il tempo si aggiungono nel pallone 150 ml di etere isopropilico ottenendo la precipitazione di un solido amorfo. Si eliminano le acque per decantazione e si aggiungono al solido 100 ml di etere isopropilico lasciando in agitazione per 1 ora. Al termine si filtra il solido e si lava con 50 ml di etere isopropilico per poi seccare in vuoto a 40°C recuperando 8,52 g di prodotto.

Esempio 11: Riarrangiamento dell’ortoestere derivante dall’esempio 10. In un pallone da 250 ml di caricano 7,0 g del prodotto ottenuto nello step precedente, 72,8 g di acido acetico glaciale e 8,7 ml di acqua, ottenendo una soluzione che viene lasciata in agitazione a RT per 3 ore. Al termine si diluisce la soluzione a 150 ml con sodio cloruro 0,6 M e si purifica la soluzione per ultrafiltrazione su membrana con taglio a 5 KD. Dopo dialisi, la soluzione ottenuta si concentra sotto vuoto recuperando 6,7 g di prodotto solido.

Esempio 12: Solfatazione del triacetil metilestere

670 mg di prodotto ottenuto nel passaggio precedente si caricano in un pallone da 250 ml provvisto di flusso di azoto e valvola a calcio cloruro con 40 ml di DMF.

Alla soluzione ottenuta si aggiungono 630,44 g di complesso piridiniosolfotriossido e si scalda a 50°C interni per 1 ora. Al termine alla stessa temperatura si aggiungono nel pallone 630,44 g di complesso piridinio solfotriossido e si lascia di nuovo in agitazione per 1 ora.

Scaduto il tempo si raffredda a RT e alla stessa temperatura si aggiungono nel pallone 40 ml di NaHCO3al 3% ottenendo una soluzione che viene concentrata sotto vuoto ottenendo 2,3 g di solido misto a sali inorganici. Il prodotto ottenuto si diluisce a 150 ml di sodio cloruro 0,6 M e viene ultrafiltrato su membrana 5 KDa.

Dopo dialisi la soluzione ottenuta si concentra sotto vuoto ottenendo 1,32 g di prodotto solido.

Esempio 13: Ottenimento del condroitin solfato

In un pallone da 100 ml si caricano, il prodotto ottenuto nello step precedente e 33 ml di soda 0,2 M. La soluzione si scalda a 40°C interni per 2 ore e al termine si raffredda a RT e si neutralizza con HCl 1M.

La soluzione si diluisce a 150 ml di sodio cloruro 0,6 M e si ultrafiltra su membrana con taglio a 5 KDa. Si ottengono dopo dialisi e concentrazione sotto vuoto della soluzione, 350 mg di solido.

Il prodotto ottenuto in questo esempio mostra un peso molecolare pari a 11 KDa, un rapporto 4S/6S pari a 47/53, un valore di densità di carica di 0,9.

Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di condroitin solfato sale sodico in cui all’interno della stessa catena polisaccaridica le unità di N-acetil-D-galattosammina risultano essere tutte monosolfatate in modo casuale o in posizione 4 o in 6, detto processo comprendendo i seguenti passaggi: a. trasformazione della condroitina sale sodico nel suo acido libero o in un suo sale con un catione ammonico quaternario scelto tra tetrametilammonio, tetraetilammonio o tetrabutilammonio, o nel sale di piridinio o nel metilestere; b. reazione del composto ottenuto nel passaggio a) con un orto-estere di formula RC(OR1)3, in cui R à ̈ scelto tra idrogeno, metile, etile o fenile ed R1à ̈ scelto tra metile o etile, in presenza di catalisi acida, per dare un composto in cui l’unità ripetuta del disaccaride che si trova nella condroitina ha la formula I R OR1 <O> OO<O> O O OOO H O OH NHAc ; I in cui R ed R1sono come sopra definiti; c. protezione dei gruppi idrossilici nelle posizioni 2’ e 3’ delle unita di acido glucuronico del composto ottenuto nel passaggio precedente mediante reazione con una anidride di formula (R2CO)2O in cui R2à ̈ scelto tra metile, etile o propile, in presenza di piridina o di una base organica terziaria scelta tra trietilammina o triisopropilammina e di 4-dimetilamminopiridina (DMAP), a dare un composto in cui l’unità ripetuta del disaccaride che si trova nella condroitina ha la formula II R OR1 <O> OO<O> O O OOO O O NHAc R2 O R2 O II in cui R, R1ed R2sono come sopra definiti; d. riarrangiamento della funzione ortoesterica presente sul prodotto ottenuto nel passaggio c) con acido organico solubile in acqua per dare un derivato estereo in cui le unità di GalNAc che si ripetono nel polisaccaride sono costituite da triacil derivati aventi formula di struttura IIIIa o IIIb O R <O> OOH<O> O O OOO O R2 O NHAc O R2 O IIIa R <O> OO O<OH> O O OOO O R2 O NHAc O R2 O IIIb in cui R ed R2sono come sopra definiti; e. mono-solfatazione del composto ottenuto nel passaggio d) seguita da rimozione dei gruppi O-acilici presenti nei composti IIIa e IIIb ottenuti nel passaggio precedente.
2. 2. Il processo della rivendicazione 1 in cui la condroitina sale sodico del passaggio a) Ã ̈ ottenuta a partire dal polisaccaride capsulare K4 prodotto da un brodo di coltura del ceppo O5:K4:H4 di E. Coli, o a partire dal polisaccaride prodotto da un brodo di coltura del ceppo DSM23644 di E. Coli.
3. 3. Il processo della rivendicazione 1 in cui il passaggio b) à ̈ effettuato con un orto estere scelto tra trimetil ortoacetato, trietil ortoacetato, trimetil ortoformiato, trietil ortoformiato, trimetil ortopropionato, trietil ortopropionato, o trimetil orto benzoato, preferibilmente con trimetil ortoacetato o trietil ortoacetato, più preferibilmente con trimetil ortoacetato.
4. 4. Il processo della rivendicazione 1 in cui la catalisi acida di cui al passaggio b) à ̈ effettuata con un acido scelto tra acido canforsolfonico, acido para-toluensolfonico, acido metansolfonico o con una resina solfonica, preferibilmente con acido canforsolfonico o con una resina solfonica, più preferibilmente con acido canforsolfonico.
5. 5. Il processo della rivendicazione 1 in cui il passaggio c) Ã ̈ effettuato con anidride acetica.
6. 6. Il processo della rivendicazione 1 in cui il passaggio d) Ã ̈ effettuato tra 20 e 40°C, preferibilmente a temperatura ambiente.
7. 7. Il processo della rivendicazione 1 in cui il passaggio d) Ã ̈ effettuato tra 40 e 70°C, preferibilmente a 60°C.
8. 8. Il processo della rivendicazione 1 in cui il passaggio d) Ã ̈ effettuato in una miscela di acqua/acido organico solubile in acqua o in sola acqua.
9. 9. Il processo della rivendicazione 8, in cui l’acido organico à ̈ scelto tra acido acetico, formico, propionico, tartarico, citrico o una resina propionica, preferibilmente acido acetico o acido propionico, più preferibilmente acido acetico.
10. 10. Il processo della rivendicazione 1 in cui il condroitin solfato sale sodico ottenuto ha un peso molecolare medio Mw di 10-30 kDa.
11. 11. Il processo della rivendicazione 10 in cui il condroitin solfato sale sodico presenta una distribuzione di gruppi mono-solfato il cui rapporto varia da 90/10 4S/6S sino a 10/90 4S/6S.
12. 12. Il processo della rivendicazione 1 in cui nel condroitin solfato sale sodico ottenuto il rapporto tra le unità di N-acetil-D-galattosammina solfatate nelle posizione 4 e nella posizione 6 à ̈ inferiore a 1.
13. 13. Il processo della rivendicazione 1 in cui nel condroitin solfato ottenuto il rapporto tra le unità di N-acetil-D-galattosammina solfatate nelle posizione 4 e nella posizione 6 à ̈ superiore a 1.
14. 14. Condroitin solfato sale sodico ottenuto secondo il processo della rivendicazione 1.
15. 15. Uso del condroitin solfato della rivendicazione 14 nella prevenzione e nel trattamento dell’osteoartrite e/o per il mantenimento del benessere del sistema muscolo-scheletrico.
16. 16. Composizione comprendente il condroitin solfato secondo la rivendicazione 14 e uno o più eccipienti farmaceuticamente o nutraceuticamente accettabili.
17. 17. Composizione secondo la rivendicazione 16 per uso nella prevenzione e nel trattamento dell’osteoartrite e/o per il mantenimento del benessere del sistema muscolo-scheletrico.