BR112013027389B1

BR112013027389B1 - Processo para o preparo de sal sódico de sulfato de condroitina

Info

Publication number: BR112013027389B1
Application number: BR112013027389-5A
Authority: BR
Inventors: Davide Bianchi; Marco Valetti; Paola Bazza; Niccolò Miraglia; Ermanno Valoti
Original assignee: Gnosis S.P.A.
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2021-06-01
Also published as: EA201391673A1; MX351660B; MX2013013181A; EA023849B1; DK2707396T3; KR20140034790A; KR101883910B1; ES2705734T3; IL229367A0; ZA201308458B; HUE042378T2; CA2835498C; AU2012252415B2; GEP201606591B; JP6205350B2; US20140315854A1; NZ617564A; CY1121099T1; HRP20190183T1; LT2707396T

Abstract

sulfato de condroitina biotecnológico sulfatado na posição 4 ou 6 na mesma cadeia polissacarídica e processo para seu preparo a presente invenção descreve um processo para a produção de sulfato de condroitina com uma massa molecular (mw) média de 10-30 kda por sulfatação química a partir de uma estrutura de condroitina não sulfatada, obtida, por sua vez, por hidrólise ácida do polissacarídeo capsular k4 produzido diretamente a partir de e. coli cepa 05:k4:h4 ou diretamente a partir de uma cepa geneticamente modificada de e. coli. sulfatação do resíduo de n-acetil-d-galactosamina na posição 4 ou 6 que ocorre simultaneamente na mesma cadeia polissacarídica, simulando o padrão de sulfatação observado no sulfato de condroitina natural, ao contrário da sulfatação obtida com os métodos de síntese descritos até o momento.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] . A presente invenção se refere a um método para a produção de sulfato de condroitina por meio da sulfatação química a partir de uma estrutura de condroitina não sulfatada. O processo de acordo com a presente invenção permite a sulfatação simultânea, no interior da mesma cadeia polissacarídica, da posição 4 ou da posição 6 do resíduo de N-acetil-D-galactosamina. O sulfato de condroitina assim obtido apresenta o mesmo padrão de sulfatação observado no sulfato de condroitina natural, ao contrário daquele obtido com os métodos de síntese descritos até o momento.

[002] . A presente invenção também se refere a um sulfato de condroitina que apresenta uma massa molecular média determinada por SEC (Mw) de 4-9 kDa, e uma distribuição de grupos monossulfatados que varia de 90% de 4-sulfato e 10% de 6-sulfato a 10% de 4-sulfato e 90% de 6-sulfato.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003]. O sulfato de condroitina (SC) é um polissacarídeo natural complexo pertencente à classe dos glicosaminoglicanos (GAG), composto por sequências dissacarídicas formadas por resíduos de ácido glucorônico (AGlc) e N-acetil-D- galactosamina (GalNAc) sulfatados em diferentes posições e ligados por 1-3 ligações.

[004]. O SC está presente em tecidos animais, com funções estruturais e fisiológicas. Dependendo de sua origem, o SC é composto, principalmente, de porcentagens variáveis de dois tipos de unidades dissacarídicas monossulfatadas na posição 4 ou na posição 6 da GalNAc (dissacarídeos A e C, respectivamente). Contudo, os dissacarídeos nos quais os grupos sulfatos estão presentes em números e posições diferentes podem estar presentes em diversas porcentagens nas cadeias polissacarídicas. A estrutura de SC também contém dissacarídeos não sulfatados, em geral em pequenas quantidades. Os dissacarídeos dissulfatados que possuem dois grupos sulfatos ligados através do átomo de oxigênio em diversas posições, tais como a posição 2 do AGlc e 6 da GalNAc (dissacarídeo (d), posição 2 do AGlc e 4 da GalNAc ou posições 4 e 6 da GalNAc (dissacarídeo (e), podem estar presentes na estrutura de SC em porcentagens variadas, dependendo das fontes animais específicas (Volpi N. J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr Pharm Des 12, 639, 2006).

[005]. A unidade dissacarídica repetitiva encontrada no SC possui a seguinte fórmula química:

na qual R2, R4 e R6 são independentemente H ou SO3-.

[006]. As cargas negativas dos grupos carboxilato e sulfato na unidade dissacarídica repetitiva são neutralizadas por íons de sódio.

[007]. Os significados das abreviaturas usadas com mais frequência para identificar os dissacarídeos sulfatados mais de uma vez são definidos abaixo: (R2=H; R4=H; R6=H) (R2=H; R4=H; R6= SO3-) (R2=H; R4=SO3-; R6=H) (R2=H; R4=SO3-; R6=SO3-) (R2=SO3-; R4=H; R6=SO3-) (R2=SO3-; R4=SO3-; R6=H) (R2=SO3-; R4=SO3-; R6=SO3-)

[008]. Amostras de SC oriundas de fontes animais diferentes também são caracterizadas por massas moleculares e densidades de carga diferentes, estando esse ultimo parâmetro diretamente correlacionado com os grupos sulfatados específicos.

[009]. A Tabela 1 exibe os principais dissacarídeos encontrados no SC natural extraído da cartilagem e de outros tecidos de diversas espécies animais:

Tabela 1 - Mn = número médio da massa molecular ; Mw = massa média da massa molecular; índice de polidispersibilidade = Mw/Mn; a densidade de carga é o número de grupos sulfatos por unidade dissacarídica; NI = não identificado

[0010]. Conforme mostrado na Tabela 1, o SC derivado de animais terrestres possui parâmetros (Mn e Mw) de massa molecular semelhantes, ao passo que é diferente daquele oriundo de espécies aquáticas, que possuem valores de massa molecular mais altos. As amostras de SC terrestre também são caracterizadas por valores de densidade de carga (DC) inferiores a 1,0, ao passo que as amostras de SC marinho sempre apresentam valores de SC superiores a 1,0. Essa característica se deve à distribuição diferente dos dissacarídeos sulfatados. Em geral, os dissacarídeos dissulfatados são encontrados em quantidades vestigiais no SC terrestre e nenhum dissacarídeo polissulfatado (trissulfato e tetrassulfato) é observado no SC natural.

[0011]. A ausência de dissacarídeos trissulfatados e tetrassulfatados pode ser facilmente evidenciada pela análise após a digestão do polissacarídeo com condroitinase ABC, uma enzima lítica específica para dissacarídeos monossulfatados (Di- 4S e Di-6S) e para dissacarídeos não sulfatados (Di-0S), que é capaz de digerir os dissacarídeos dissulfatados, mas é incapaz de hidrolisar a cadeia polissacarídica correspondente de dissacarídeos polissulfatados. A análise FACE (Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis - Eletroforese de Carboidratos Assistida por Fluoróforo) do SC natural digerido com condroitinase ABC não detecta as faixas de eletroforese características dos oligossacarídeos parcialmente não digeridos que são encontrados no SC sintético ou semissintético derivado da técnica anterior.

[0012]. Sabe-se também que, devido ao processo de biossíntese, todos os SCs naturais sempre exibem a presença simultânea de dissacarídeos monossulfatados na posição 4 ou 6 da GalNAc nas mesmas cadeias polissacarídicas (D' Arcy SM et al., Carbohydr Res. Mar 1994 4;255:41-59. Hardingham TE et al., Carbohydr Res. Mar 1994 4;255:241-54. Cheng F, et al., Glycobiology. Dez 1992; 2(6):553-61. Chai W et al., Anal Biochem. Mai 1996 15;237(1):88-102. Zaia J et al., Anal Chem. Dez 2001 15;73(24):6030-9. Desaire H et al., Anal Chem. Ago 2001 1 ;73(15):3513-20).

[0013]. Foram relatadas diferentes atividades para o SC em relação a sua estrutura molecular (Kimata K et al., Mol Cell Biochem 1, 211, 1963. Volpi N. Biomaterials 23, 3015, 2002. Volpi N, Tarugi P. Biochimie 81, 955, 1999. Volpi N. Biomaterials 20, 1359, 1999. Suzuki S et al., J Biol Chem 243, 7, 1968).

[0014]. O SC possui atividade anti-inflamatória, e é atualmente recomendado no tratamento da osteoartrite (OA) como um Medicamento Sintomático de Ação Lenta para Osteoartrite (MSALOA) na Europa, em especial para o tratamento da osteoartrite do joelho (Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003), do quadril (Jordan KM et al. Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003) e da mão (Zhang W et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007) com base na evidência clínica e nas meta-análises correspondentes de numerosos ensaios clínicos. O SC também é amplamente utilizado como um nutracêutico na Europa e EUA, seja sozinho ou em combinação com outros ingredientes (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).

[0015]. O SC comercial é obtido por meio da extração de tecido animal, tais como os tecidos bovino e suíno (Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998), tecido aviário (Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002) e cartilagem de peixes (Sugahara K et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003).

[0016]. A origem animal do SC comercial envolve problemas de segurança associados a agentes infecciosos transmissíveis que causam doenças tais como a encefalopatia espongiforme bovina (EEB), e restringem as possíveis fontes disponíveis para atender à crescente demanda mundial. Esses fatores estimularam a pesquisa de métodos alternativos de produção do SC.

[0017]. Foram feitos intensos esforços para descobrir um método biotecnológico para produzir SC, usando um microrganismo como fonte de um polissacarídeo precursor que possui uma estrutura parcialmente semelhante àquela do SC e realizando a sulfatação química para produzir um SC semelhante ao natural.

[0018]. Um exemplo dessa estratégia é a produção do SC biotecnológico a partir do polissacarídeo capsular K4 de E. coli O5:K4:H4, conforme descrito no EP 1304338 B1. A dita patente apresenta um processo no qual o polissacarídeo K4 produzido em culturas líquidas é extraído, purificado, e, em seguida, redissolvido e submetido à hidrólise ácida para eliminar os resíduos de frutose ligados aos resíduos de AGlc do polímero. O polímero desfrutosilado, idêntico à estrutura não sulfatada do SC (CH), é, em seguida, sulfatada na posição 4 ou posição 6 do resíduo de GalNAc de acordo com dois métodos diferentes de síntese química. A dita patente também apresenta um terceiro método pelo qual um SC dissulfatado é obtido tanto na posição 4 quanto na 6. O SC ali descrito possui um teor de pelo menos 70% de polissacarídeos sulfatados consistindo em monossulfatados e/ou dissulfatados na posição 4 e 6 do resíduo de GalNAc, posição 2' do resíduo de AGlc não sulfatado, e possuem uma massa molecular (Mw) de 6-25 kDa e uma densidade de carga (DC) de 0,7-2,0.

[0019]. No EP 1304338 B1, os autores apresentam e reivindicam, dependendo da estratégia de síntese utilizada, a possibilidade de: a) sintetizar o SC 4S por meio da proteção seletiva da posição 6 de todos os resíduos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) presentes, obtendo assim um polímero seletivamente sulfatado apenas na posição 4 de todos os resíduos de N- acetilgalactosamina (GalNAc) b) obter um polímero no qual, da mesma forma, os grupos hidroxilas na posição 6 de todos os resíduos de GalNAc são sulfatados, protegendo adequadamente os resíduos de hidroxila presentes na posição 4.

[0020]. No processo descrito no EP 1304338 B1, a sulfatação simultânea, portanto, nunca ocorre nas posições 4 ou 6 na mesma cadeia, ao contrário do que ocorre com o SC natural.

[0021]. Uma publicação recente (Bedini E et al, Angew Chem Int Ed Engl. 18 de maio de 2011) descreve um processo no qual o polissacarídeo K4 produzido é sulfatado na posição 4 e/ou posição 6 do resíduo de GalNAc na mesma cadeia. No entanto, o SC biotecnológico descrito por Bedini et al. possui uma massa molecular semelhante àquela do SC natural, a saber, aproximadamente 17 kDa, o que leva à baixa biodisponibilidade típica dos produtos extraídos de fontes animais. Bedini et al. não relataram qualquer caracterização farmacológica do produto que obtiveram.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

[0022]. A Figura 1 se refere ao sulfato de condroitina natural de origem bovina tratado com condroitinase C. São formados diversos oligossacarídeos de comprimentos diferentes, o que demonstra a presença de grupos sulfatos na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc, na mesma cadeia polissacarídica.

[0023]. O cromatograma foi obtido por separação gradiente em uma coluna de troca aniônica forte (SAX-HPLC) e detecção UV a 232 nm. O gradiente foi obtido por 50 mM de NaCl até 1,2 M de NaCl de 0 a 60 minutos.

[0024]. A Figura 2 se refere ao sulfato de condroitina natural de origem suína tratado com condroitinase C. São formados diversos oligossacarídeos de comprimentos diferentes, o que demonstra a presença de grupos sulfatos na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc, na mesma cadeia polissacarídica.

[0025]. O cromatograma foi obtido por separação gradiente em uma coluna de troca aniônica forte (SAX-HPLC) e detecção UV a 232 nm.

[0026]. A Figura 3 se refere ao sulfato de condroitina biotecnológico de acordo com a presente invenção tratado com condroitinase C. Com esse polissacarídeo também são formados diversos oligossacarídeos de comprimentos diferentes, o que demonstra a presença de grupos sulfatos na posição 4 ou 6 do resíduo GalNAc, na mesma cadeia polissacarídica.

[0027]. O cromatograma foi obtido por separação gradiente em uma coluna de troca aniônica forte (SAX-HPLC) e detecção UV a 232 nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0028]. A presente invenção descreve um método para a produção de SC após a sulfatação química a partir de uma estrutura de condroitina não sulfatada (CH), sendo tal CH obtida pela hidrólise ácida de um polissacarídeo microbiano natural i.l. (K4) ou produzida diretamente de uma E. coli geneticamente modificada, tal como a E. coli cepa DSM23644 descrita nos pedidos de patente MI2010A001300 e MI2010A001264. A cepa bacteriana neles descrita carrega uma mutação que causa a inativação do gene KfoE para frutosilação da K4.

[0029]. O SC obtido pelo processo de acordo com a presente invenção apresenta as características de um SC natural com um título superior a 95% com base nos métodos analíticos descritos na Farmacopeia Europeia.

[0030]. O SC obtido com o processo de acordo com a presente invenção possui uma massa molecular média (Mw), medida por SEC, de 10-30 kDa, preferencialmente 20-30 kDa, e apresenta uma distribuição de grupos monossulfatados de 90% de 4-sulfato e 10% de 6-sulfato a 10% de 4-sulfato e 90% de 6-sulfato (Tabela 2).

Tabela 2

[0031]. O SC obtido com o processo de acordo com a presente invenção contém um pequeno teor (<10%) de dissacarídeos não sulfatados e porcentagens muito baixas (< 5%) de dissacarídeos dissulfatados; dissacarídeos trissulfatados não podem ser identificados.

[0032]. O SC obtido com o processo de acordo com a presente invenção é caracterizado por valores de densidade de carga de 0,8-1,0.

[0033]. Em algumas das formas de implementação da presente invenção, o SC obtido exibe uma razão entre o dissacarídeo sulfatado na posição 4 (Di-4S) e o dissacarídeo sulfatado na posição 6 (Di-6S) inferior a 1, ao passo que em outras formas exibe uma razão entre o dissacarídeo (4S) e o dissacarídeo (6S) superior a 1.

[0034]. O processo de acordo com a presente invenção permite a sulfatação de um local específico a ser modulado para produzir um SC com uma razão 4S/6S específica dentro da faixa especificada acima.

[0035]. A presente invenção também se refere à produção de sulfato de condroitina (SC) com baixa massa molecular (LMW-CS BIOTEC, 4.000-9.000 daltons) pela sulfatação química de uma estrutura não sulfatada, que por sua vez é obtida pela hidrólise ácida do polissacarídeo capsular K4 produzido pela E. coli cepa O5:K4:H4 ou produzida diretamente a partir de uma E. coli geneticamente modificada. O sulfato de condroitina de baixa massa molecular que é objeto da presente invenção é caracterizado por um intervalo de massa molecular de 4.000-9.000 daltons, que é muito inferior àquele dos sulfatos de condroitina de origem natural, seja terrestre, em especial de origem bovina, suína ou aviária (14.000-26.000 daltons) ou de origem marinha, obtida, por exemplo, de tubarões, lulas, raias ou peixes ósseos (em geral > 40.000 daltons). Em vista de tais características, o sulfato de condroitina de acordo com a presente invenção apresenta uma absorção mais alta após a administração oral e, portanto, uma maior biodisponibilidade em humanos que o sulfato de condroitina natural de alta pureza ou o sulfato de condroitina produzido por processos químicos/biotecnológicos. O sulfato de condroitina de acordo com a presente invenção possui atividade anti-inflamatória e antiartrítica comparáveis àquelas do sulfato de condroitina natural de alta pureza. O sulfato de condroitina de acordo com a presente invenção é adequado para uso no tratamento de processos inflamatórios e osteoartríticos/artríticos.

[0036]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção possui uma massa molecular média, medida por SEC (Mw), de 4-9 kDa, e uma distribuição de grupos monossulfatados variando de 90% de 4-sulfato e 10% de 6-sulfato até 10% de 4-sulfato e 90% de 6-sulfato. As características do SC de baixa massa molecular de acordo com a presente invenção são substancialmente idênticas àquelas dos derivados com alta massa molecular relatados acima na Tabela 2.

[0037]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção possui uma pequena quantidade (<10%) de dissacarídeo não sulfatado e porcentagens muito baixas (<5%) de dissacarídeos dissulfatados, ao passo que nenhum dissacarídeo trissulfatado é identificável.

[0038]. O LMW-CS BIOTEC é caracterizado por valores de densidade de carga de 0,8-1,0, que são comparáveis àqueles do SC natural de origem terrestre (consulte a Tabela 1).

[0039]. O processo de acordo com a presente invenção também permite a sulfatação em um local específico a ser modulado a fim de fornecer um SC com uma razão 4S/6S específica dentro dos limites especificados acima, que são semelhantes àqueles presentes no SC de origem natural.

[0040]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção é reconhecido e digerido pela condroitinase ABC, uma enzima lítica que tem a função de catabolizar o SC natural em organismos específicos, o que demonstra, portanto, que as cadeias polissacarídicas do LMW-CS biotecnológico não sofreram modificações estruturais capazes de prejudicar o reconhecimento altamente sensível e específico das enzimas naturais.

[0041]. Por fim, o LMW-CS BIOTEC digerido com condroitinase C, uma endoliase que hidrolisa o polissacarídeo em resíduos sulfatados na posição 6, mas não na posição 4, produz sequências oligossacarídicas típicas da presença de unidades de Di-4S alternadas com unidades de Di-6S na mesma cadeia polissacarídica, assim como ocorre no SC natural (Figuras 1, 2 e 3). A Figura 1, em especial, descreve o sulfato de condroitina natural de origem bovina tratado com condroitinase C. Oligossacarídeos de diferentes comprimentos podem ser vistos, o que indica a presença de grupos sulfatos na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc, na mesma cadeia polissacarídica. O cromatograma foi obtido por separação gradiente em coluna de troca aniônica forte (SAX-HPLC) e detecção UV a 232 nm. O gradiente foi obtido com 50 mM de NaCl até 1,2 M de NaCl de 0 a 60 minutos;

[0042]. a figura 2 descreve o sulfato de condroitina natural de origem suína tratado com condroitinase C. Oligossacarídeos de diferentes comprimentos podem ser observados, o que indica a presença de grupos sulfatos na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc, na mesma cadeia polissacarídica. O cromatograma foi obtido por separação gradiente em coluna de troca aniônica forte (SAX-HPLC) e detecção UV a 232 nm;

[0043]. a figura 3 descreve o LMW-CS BIOTEC da presente invenção, tratado com condroitinase C. Mais uma vez, oligossacarídeos de diferentes comprimentos são visíveis, o que indica a presença de grupos sulfatos na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc, na mesma cadeia polissacarídica.

[0044]. O cromatograma foi obtido por separação gradiente em coluna de troca aniônica forte (SAX-HPLC) e detecção UV a 232 nm.

[0045]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção foi avaliado quanto à absorção oral e biodisponibilidade em humanos pela comparação com SC natural de alta pureza de origem bovina, o primeiro padrão da Farmacopeia Europeia. Isso é especialmente importante porque a presença de uma bactéria capaz de biossintetizar uma enzima lítica específica para a quebra do SC (e derivados de baixa massa molecular) foi descrita na flora bacteriana humana, mas não na animal (Ahn MY, et al., Can J Microbiol 1998; 44: 423-9).

[0046]. A absorção oral e a biodisponibilidade do LMW-CS BIOTEC foram avaliadas em humanos por meio de técnicas conhecidas.

[0047]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção foi avaliado quanto à possível atividade anti-inflamatória usando testes específicos tais como: da capacidade de inibir uma enzima proteolítica produzida durante os processos inflamatórios pelos leucócitos, a saber a elastase leucocitária humana (Kostoulas G. et al., Biol Chem 378, 1481, 1997; Volpi N. Chem Biol Interact 105, 157, 1997; Ying QL et al., Am J Physiol. 272, L533, 1997); da capacidade de inibir a liberação da lisozima antiquimiotática, atividade fagocítica, e de danificar a membrana biológica por meio de radicais livres em neutrófilos humanos (Matzner Y. et al., Thromb Haemost 52, 134, 1984; Ronca F, Palmieri L et al., Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 14, 1998).

[0048]. Tais testes foram conduzidos no LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção por meio da comparação com um composto de referência, um SC natural de alta pureza de origem bovina que é o primeiro padrão da Farmacopeia Europeia.

[0049]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção também foi avaliado quanto às propriedades antiartríticas em um modelo animal, o "modelo de Artrite Adjuvante (AA)", que é amplamente reconhecido pela comunidade científica e foi publicado em numerosos artigos científicos. Mais uma vez, os resultados foram comparados com aqueles obtidos anteriormente com a molécula de referência: o padrão da Farmacopeia Europeia, um SC natural de alta pureza de origem bovina (Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007). De fato, os modelos animais de OA e artrite reumatoide (AR) são ferramentas úteis para o estudo de tais processos patogênicos. "Artrite Adjuvante" (AA) é um dos modelos usados com mais frequência. A AA em ratos é um modelo experimental de poliartrite que tem sido amplamente utilizado para testar numerosos agentes antiartríticos e medicamentos antes e após exaustivos ensaios clínicos (Bendele A et al., Toxicol Pathol 27, 134, 1999; Rovensky J et al., Rheumatol Int. 31, 507, 2011; Bauerova K et al., Interdisc Toxicol 4, 101, 2011). Também foram conduzidos numerosos estudos nos quais os dados em animais obtidos com o teste AA foram comparados com os resultados em humanos (Kannan K et al., Pathophysiology 12, 167, 2005).

[0050]. A monossulfatação simultânea na posição 4 ou 6 da cadeia polimérica, a pureza e a baixa massa molecular fornecem ao LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção uma maior absorção oral e uma melhor biodisponibilidade.

[0051]. Um aspecto da presente invenção se refere à composição do SC de acordo com a presente invenção e um veículo aceitável no campo farmacêutico ou nutracêutico. A dita composição pode ser formulada em diversas formulações sólidas, tais como comprimidos, cápsulas rígidas, cápsulas gelatinosas moles ou misturas em pó para bebidas, ou em formulações líquidas (soluções), preferencialmente, na forma de preparações farmacêuticas ou nutracêuticas para administração parenteral ou oral. A composição pode conter outros ingredientes ativos ou inativos.

[0052]. A composição também pode, preferencialmente, conter pelo menos uma das seguintes substâncias: cloridrato de glucosamina, sulfato de glucosamina, N- acetil-glucosamina, ácido hialurônico, heparina, queratina, dermatina, metilsulfonilmetano, folatos ou folatos reduzidos, vitaminas do grupo B, S-adenosilmetionina (SAM), ácido ascórbico ou ascorbato de manganês. A composição pode ser administrada a pacientes em quantidades efetivas baseadas em suas necessidades.

[0053]. Por exemplo, mas sem limitar seu uso, o SC ou a composição descrita na presente invenção pode ser administrado em uma quantidade entre 100 e 3000 mg por dia, preferencialmente, entre 1000 e 2000 mg por dia, e mais preferencialmente entre 1250 e 1750 mg por dia, divididos em duas doses de aproximadamente 600 mg ou três doses de 400 mg diárias.

[0054]. A presente invenção também se refere ao uso do SC descrito, ou de uma composição do mesmo, para o tratamento ou prevenção da osteoartrite ou para a manutenção do bem-estar músculo esquelético como um ingrediente de um medicamento ou suplemento nutricional.

[0055]. Por exemplo, o SC descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para fazer uma preparação farmacêutica, aditivo alimentar ou suplemento nutricional para a prevenção e/ou tratamento de osteoartrite do quadril, mão ou joelho e seus principais sintomas (dor, inchaço nas juntas, inflamação), mal de Alzheimer, infecções microbianas, arteriosclerose e osteoporose e como adjuvante no tratamento antitumoral e na regeneração de tecidos, inclusive de tecidos nervosos.

[0056]. Uma característica vantajosa do processo de acordo com a presente invenção é que a sulfatação na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc ocorre simultaneamente na mesma cadeia polissacarídica, simulando o padrão de sulfatação observado no SC natural, ao contrário daquele obtida com os métodos de síntese descritos até o momento. Esse aspecto é confirmado pelos dados obtidos com o uso de dois sistemas enzimáticos diferentes, a saber, a condroitinase ABC, que é capaz de digerir unidades sulfatadas na posição 6 e posição 4 e unidades não sulfatadas, e a condroitinase C, uma endoliase que é capaz de hidrolisar os resíduos correspondentes sulfatados na posição 4 e os resíduos não sulfatados, mas incapaz de realizar uma clivagem lítica semelhante nos resíduos correspondentes sulfatados na posição 4. Os produtos da digestão, obtidos com condroitinase ABC e com condroitinase C sozinha, são analisados com técnicas de cromatografia HPLC, tal como descrito por Joon-Soo Sim et al. (J. Chromatography B, 2005 vol. 818, 133-139), indicando qualitativa e quantitativamente a presença de dissacarídeos Di-0S, Di-4S e Di-6S e quaisquer oligossacarídeos não digeridos pelas enzimas.

[0057]. A análise dos produtos da digestão com condroitinase ABC demonstra a digestão quase total do produto com formação do dissacarídeo não sulfatado Di-0S, dos dissacarídeos monossulfatados Di-4S e Di-6S e vestígios do dissacarídeo dissulfatado Di-4,6S.

[0058]. Contudo, a mesma análise conduzida nos produtos da digestão com condroitinase C exibe claramente a presença de sequências de dissacarídeos, e em nível mais alto do que todas as sequências oligossacarídicas, indicando a incapacidade da enzima em quebrar completamente o polissacarídeo devido a presença nas mesmas cadeias de GalNAc sulfatada na 4. Isso ocorre quando um resíduo sulfatado está presente na 4, a enzima é incapaz de agir, e consequentemente deixa os resíduos oligossacarídeos. Os ditos resíduos também são claramente detectados por técnicas de cromatografia e eletroforese, tais como cromatografia em gel e eletroforese capilar (EC), como mostrado, por exemplo, nos diagramas cromatográficos nas Figuras 1, 2 e 3, relacionados à digestão com condroitinase C do SC natural (bovino e suíno) e o SC biotecnológico obtido de acordo com a presente invenção. Eles contêm diversos oligossacarídeos de comprimentos diferentes nos quais os grupos sulfatos estão presentes na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc na mesma cadeia polissacarídica.

[0059]. Todas essas propriedades fornecem ao SC obtido com o processo de acordo com a presente invenção, a estrutura de um SC natural apresentando as seguintes características: a) todos ou quase todos os resíduos de GalNAc são monossulfatados na posição 6 ou 4; b) dependendo das condições de síntese utilizadas, a razão entre os resíduos 4S e 6S (4S/6S) é completamente análoga àquela encontrada no SC tanto de origem terrestre quanto marítima.

[0060]. Normalmente, o SC de acordo com a presente invenção pode ser obtido usando como substrato inicial o polissacarídeo capsular K4 naturalmente produzido pela E. coli cepa O5:K4:H4 (EP 1304338 B1) ou outro polissacarídeo que possua a estrutura de condroitina não sulfatada (CH).

[0061]. No primeiro caso, o polissacarídeo K4, obtido a partir de um caldo de cultura de E. coli cepa O5:K4:H4, é desfrutosilado no fim da fermentação por hidrólise termoácida, e a condroitina é purificada de acordo com uma adaptação dos métodos descritos por Rodriguez e Jann (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988).

[0062]. Como alternativa, o polissacarídeo inicial pode ser obtido, por exemplo, a partir da cultura de E. coli cepa DSM23644 descrita no MI2010A001300 que, devido a uma mutação induzida no gene KfoE responsável pela frutosilação da K4, produz um polissacarídeo idêntico à CH não sulfatada natural. A desfrutosilação não é necessária neste caso; contudo, a etapa de hidrólise termoácida é mantida para eliminar algumas impurezas, incluindo as endotoxinas bacterianas que se precipitam como um resultado do tratamento. Em seguida, a condroitina (CH) é purificada por centrifugação, diálise e secagem por spray.

[0063]. A hidrólise é conduzida no sobrenadante da cultura, separado da biomassa por centrifugação contínua. A hidrólise parcial e a desfrutosilação da K4 é realizada por incubação a 90-95°C por 30-50 min em pH 2,8-3,0.

[0064]. Após o período de incubação, a suspensão resultante é resfriada a uma temperatura abaixo de 40°C, preferencialmente 20-30°C, para mitigar a reação de hidrólise e o pH é simultaneamente ajustado para 4-4,5. A suspensão resultante é submetida, em sequência, a uma clarificação por centrifugação contínua, ultrafiltração e por fim, diálise com água através de uma membrana de 30 kDa.

[0065]. O retentado dialisado (aproximadamente 1/10 do volume do caldo de cultura inicial) é filtrado e, por fim, secado com uma secagem por spray para obter um polissacarídeo que apresente a estrutura de CH, a ser submetida ao processo de sulfatação. A CH obtida possui um título de 80-90% por uma via seca (m/m), conforme determinado por eletroforese capilar (EC) ou HPLC.

[0066]. A CH assim obtida assume a forma de sal sódico, e para ser sulfatada, precisa ser convertida para ácido livre ou um sal da mesma.

[0067]. O processo de sulfatação de acordo com a presente invenção, que permite que as posições 4 ou 6 do resíduo de GalNAc da mesma cadeia polissacarídica sejam aleatoriamente monossulfatadas, inclui a formação de um ortoéster que envolve simultaneamente as posições 4 e 6 da GalNAc e seu rearranjo posterior em um éster que, surpreendentemente, pode ser modulado para liberar principalmente a hidroxila na 4 ou na 6, permitindo assim a sulfatação seletiva de tais hidroxilas.

[0068]. O processo de acordo com a presente invenção inclui as seguintes etapas:

[0069]. (a) Conversão do sal sódico de condroitina em ácido livre ou, alternativamente, em um sal do mesmo com um íon amônio quaternário, tal como tetrametil, tetraetil ou tetrabutilamônio ou com piridina. Preferencialmente, é usado o sal de tetrabutilamônio (TBA).

[0070]. Como alternativa, a condroitina (CH) em forma ácida é convertida em seu éster metílico após a reação em metanol e cloreto acetílico.

[0071]. (b) Reação do sal de condroitina, ou éster metílico de condroitina, com um ortoéster de fórmula RC(OR1)3, na qual R é selecionado dentre hidrogênio, metil, etil ou fenil e R1 é selecionado dentre metil ou etil, na presença de catálise ácida, obtendo assim um ortoéster cíclico formado pelo movimento de dois alcóxis do ortoéster inicial por funções de álcool 4 e 6 do resíduo de GalNAc. No composto obtido nesta etapa, todas ou quase todas as unidades dissacarídicas presentes possuem uma estrutura de ortoéster cíclica representada pela fórmula I,

na qual R, R1 são tais como definidos acima.

[0072]. Exemplos de ortoésteres que podem ser usados são trimetilortoacetato, trietilortoacetato, trimetilortoformiato, trietilortoformiato, trimetilortopropionato, trietilortopropionato ou trimetilortobenzoato. Preferencialmente, são usados trimetilortoacetato ou trietilortoacetato. É especialmente preferido o uso de trimetilortoacetato.

[0073]. Um ácido selecionado dentre ácido canforsulfônico, ácido paratoluenossulfônico, ácido metanossulfônico ou uma resina sulfônica, preferencialmente ácido canforsulfônico ou uma resina sulfônica, mais preferencialmente ácido canforsulfônico, é utilizado como catalisador ácido.

[0074]. (c) Proteção dos grupos álcool nas posições 2' e 3' do resíduo de AGlc por acilação com um anidrido de um ácido carboxílico de fórmula (R2CO)2O, na qual R2 é preferencialmente selecionado dentre metil, etil ou propil na presença de piridina ou de uma base orgânica terciária, tal como trietilamina ou tri-isopropiletilamina, e de quantidades catalíticas de 4-dimetilaminopiridina (DMAP), para resultar em um produto no qual a unidade dissacarídica repetitiva encontrada na condroitina possui uma estrutura de ostoéster cíclica acilatada em 2' e 3' que é representada pela fórmula II

II na qual R, R1 e R2 são tais como definidos acima.

[0075]. Preferencialmente, é usado o anidrido acético.

[0076]. (d) Rearranjo de ortoéster cíclico em éster, uma reação que é realizada em uma mistura de um ácido orgânico solúvel em água e água ou em água apenas. Esse rearranjo, que ocorre aleatoriamente nas diversas unidades de GalNAc da sequência polissacarídica, pode ser modulado para promover a liberação de uma hidroxila ou outra (em 4 ou 6, respectivamente), com a formação simultânea do éster com o ácido orgânico solúvel na posição restante (6 ou 4, respectivamente). O resultado é a formação, na mesma cadeia polissacarídica, de duas unidades dissacarídicas diferentes, a saber: - aquelas com uma estrutura na qual as hidroxilas nas posições 6, 2' e 3' são acilatadas e a hidroxila na 4 é livre, sendo as ditas unidades representadas pela fórmula IIIa;

Illa na qual R e R2 são tais como definidos acima; ou - aquelas com uma estrutura na qual as hidroxilas nas posições 4, 2' e 3' são acilatadas e a hidroxila na 6 é livre, sendo as ditas unidades representadas pela fórmula IIIb

na qual R e R2 são tais como definidos acima.

[0077]. Pela condução da reação a uma temperatura entre 20°C e 40°C, preferencialmente à temperatura ambiente por um tempo entre 1 e 48 horas, preferencialmente entre 3 e 38 horas, e mais preferencialmente por 38 horas, é observado, surpreendentemente, um maior teor do composto que apresenta a hidroxila livre na 6, ao passo que quando a reação é conduzida a uma temperatura entre 40°C e 70°C, preferencialmente a 60°C, por um tempo entre 1 e 48 horas, preferencialmente entre 3 e 38 horas, e mais preferencialmente por 18 horas, prevalece o produto com hidroxila livre na posição 4. O ácido orgânico solúvel em água é selecionado dentre ácido acético, fórmico, propiônico, tartárico e cítrico ou uma resina catiônica tal como, por exemplo, Sepra SCX 50 μm 65A, preferencialmente ácido acético ou propiônico, e mais preferencialmente ácido acético.

[0078]. (e) O que é seguido pela sulfatação com trióxido de enxofre-piridina em DMF de acordo com o método já descrito no EP 1304338 B1, ou com o complexo trióxido de enxofre-DMF, para obter um SC que, de acordo com as condições de rearranjo utilizadas e, consequentemente, com a porcentagem de estruturas IIIa e IIIb presentes neles, será alternada ou simultaneamente sulfatado na posição 4 do dissacarídeo IIIa ou na posição 6 do dissacarídeo IIIb. A reação de sulfatação é seguida pela remoção, por tratamento básico, dos grupos acila presentes nas posições 2' e 3' do resíduo de AGlc e nas posições 4 ou 6 do resíduo de GalNAc, de acordo com os procedimentos descritos no EP 1304338 B1, resultando no sal sódico de SC que é parcialmente sulfatado na 4 e na 6.

[0079]. Algumas técnicas usadas durante o processo levaram à despolimerização da cadeia polissacarídica de modo a produzir um SC sulfatado na posição 4 ou 6 do resíduo de GalNAc caracterizado por uma baixa massa molecular (LMW).

[0080]. A condroitina também pode ser despolimerizada no estágio de rearranjo do ortoéster, usando o ácido como solvente ou co-solvente da reação. A alta concentração de ácido neste estágio leva à ruptura da cadeia polissacarídica, com a consequente produção de cadeias de baixa massa molecular, na faixa de 4-9 kD.

[0081]. O LMW-CS BIOTEC, 4.000-9.000 daltons, obtido pelo processo descrito, foi avaliado quanto à eficácia em um modelo animal experimental de artrite (Artrite Adjuvante AA) em ratos, e os resultados foram comparados com aqueles do SC natural de grau farmacêutico de origem extraída utilizado no mesmo modelo experimental (Bauerova K. et al., Osteoarthritis Cartilage 2011, publicação online antes da impressão) após o tratamento oral diário com 900 mg/kg.

[0082]. A AA foi induzida por uma única injeção intradérmica de Mycobacterium butyricum em adjuvante incompleto de Freund. Os experimentos incluíram animais saudáveis, animais artríticos não tratados e animais artríticos tratados. Entre os animais tratados, um grupo de animais foi submetido a um pré-tratamento que incluiu a administração de 900 mg/kg de LMW-CS BIOTEC por dia por 14 dias antes que a artrite fosse induzida, continuando por 28 dias após a indução da AA. Outro grupo de animais foi tratado com 900 mg/kg de LMW-CS BIOTEC por dia apenas durante os 28 dias após a indução da AA.

[0083]. O edema desenvolvido na pata traseira foi significativamente reduzido nos animais pré-tratados. O pré-tratamento com LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção (900 mg/kg/dia) reduziu significativamente o edema ao longo do experimento em comparação com os controles não tratados. O pré-tratamento com LMW- CS BIOTEC também restaura o peso corporal em aproximadamente 8-15% em comparação com o controle artrítico não tratado.

[0084]. A gravidade da artrite foi quantificada com base nos níveis crescentes de inchaço e eritema periarticular. 900 mg/kg/dia de LMW-CS BIOTEC, administrados tanto como pré-tratamento quanto como tratamento, são significativamente efetivos na redução da pontuação de artrite. Além disso, o pré-tratamento é efetivo ao longo do estágio subagudo (do dia 14 ao dia 28 após a indução da AA), ao passo que o tratamento é efetivo apenas em médio-longo prazo, nos dias 21-28 após a indução da AA, e não no estágio agudo (os primeiros 14 dias após a indução da AA).

[0085]. O estresse oxidativo, uma consequência dos processos inflamatórios crônicos que ocorrem nos processos artríticos/osteoartríticos, aumenta significativamente no modelo animal tanto no estágio agudo quanto no subcrônico. O aumento do estresse oxidativo induz o alto consumo de antioxidantes endógenos no plasma, e consequentemente, causa uma redução na capacidade antioxidante do plasma, medida como o status antioxidante total. O pré-tratamento com LMW-CS BIOTEC é efetivo na correção do status antioxidante total no modelo animal, reduzindo significativamente o consumo de antioxidantes endógenos. Comprovou-se que a atividade da y-glutamil transferase, que aumenta de acordo com o estresse oxidativo e é, portanto, considerada como sendo um bom marcador para o estresse oxidativo, medida em homogenatos de tecidos das juntas, é consideravelmente superior em animais com poliartrite experimentalmente induzida, e consideravelmente inferior nos animais tratados com LMW- CS BIOTEC, pela comparação com os animais não tratados.

[0086]. A interleucina-1β (IL-1β) e a interleucina-6 (IL-6), citocinas pro- inflamatórias, aumentaram significativamente no modelo animal de artrite experimentalmente induzida, com um aumento dramático na IL-6 no estágio agudo, apresentando um nível 10 vezes superior ao dos controles saudáveis. O efeito terapêutico do LMW-CS BIOTEC já era evidente a partir do dia 14, no estágio agudo, pela redução da concentração de IL-6 em aproximadamente 30-40% em comparação com os animais que sofriam de AA.

[0087]. O marcador básico de proteínas inflamatórias, a saber, a proteína C- reativa (PCR) possui um perfil de tempo muito semelhante ao da IL-6. O aumento no estágio agudo foi aproximadamente 7,5 vezes superior no modelo de artrite experimental em relação aos controles saudáveis. O efeito do LMW-CS BIOTEC na PCR, assim como seu efeito no nível da IL-6, é observado no estágio agudo, com uma redução significativa na concentração de PRC no plasma.

[0088]. No que diz respeito à atividade fagocítica e o aumento intracelular oxidativo dos neutrófilos, as diferenças observadas entre o controle saudável e o controle que sofria de AA experimental induzida foram significativas no caso do aumento da atividade fagocítica. A administração do LMW-CS BIOTEC como um pré-tratamento induziu uma redução significativa na fagocitose e no burst oxidativo.

[0089]. O LMW-CS BIOTEC de acordo com a presente invenção reduz significativamente a gravidade dos processos artríticos e o estresse oxidativo gerado como resultado de processos inflamatórios crônicos. O pré-tratamento com LMW-CS BIOTEC é efetivo ao longo do estágio subagudo, ao passo que o tratamento a partir do dia 1 do início de atividade da AA é efetivo apenas durante o período crônico. Os efeitos são confirmados por um aumento no status antioxidante total e na atividade da y-glutamil transferase. O LMW-CS BIOTEC, administrado como um pré-tratamento, reduz também a produção de citocinas pro-inflamatórias, a proteína C-reativa no plasma, a atividade fagocítica e o burst oxidativo intracelular dos neutrófilos. Por fim, o LMW-CS BIOTEC mostrou- se efetivo na diminuição do desenvolvimento da artrite/osteoartrite experimental tanto no estágio agudo quanto no subcrônico, e na redução dos marcadores da doença, sustentando assim sua atividade benéfica, de forma comparável à do composto de referência.

EXEMPLOS

[0090]. A presente invenção será agora mais detalhadamente ilustrada pelos seguintes exemplos.

Exemplo 1: Preparo de um sal de piridínio ou de tetralquilamônio de condroitina

[0091]. O sal sódico de CH obtido após a hidrólise, purificação e secagem pelos métodos descritos acima, a partir do polissacarídeo K4 ou do polissacarídeo obtido a partir da fermentação da E. Coli cepa DSM23644, é dissolvido em um meio aquoso. Após a dissolução completa, a solução é introduzida em uma coluna empacotada com uma resina de troca catiônica, tal como a Amberjet 1200 H, Rohm e Haas, ou equivalente.

[0092]. As frações eluídas a pH 1,5-4,0, ou preferencialmente a pH 1,5-2,0, são coletadas, e uma solução aquosa de um íon selecionado dentre tetrametil, tetraetil e tetrabutilamônio ou piridínio é adicionada até que um pH de 6,0-8,0, ou preferencialmente de 6,5 - 7,0, seja obtido. A solução é, em seguida, evaporada até a secagem total por secagem por congelamento ou secagem por spray para obter o sal correspondente.

Exemplo 2: Proteção das funções hidroxiladas (4 e 6) da porção GalNac com formação do ortoéster metílico cíclico de CH correspondente (CH-cMOE)

[0093]. O sal obtido a partir da condroitina, tal como o sal de tetrabutilamônio (TBA), é misturado com dimetilformamida (DMF) em um balão de ensaio nas quantidades de 5,2 g e 130 ml, respectivamente. 8,49 g de trimetilortoacetato são adicionadas no balão, seguidas pela adição de 300 mg de ácido canforsulfônico, e a mistura da reação é mantida a 70°C por 72 h. A reação é, em seguida, evaporada sob vácuo, até estar seca, e secada novamente em forno a 40°C por 20 h para que se obtenha 6,1 g de condroitina- MOE TBA na forma de um sólido.

[0094]. As análises no produto da reação foram conduzidas para confirmar se a proteção havia ocorrido. O desaparecimento do produto inicial e o aparecimento de um novo produto com um massa molecular mais alta (48 KDa) foi estabelecido com SEC-HPLC. As análises realizadas pela digestão com condroitinase ABC, uma enzima capaz de hidrolisar a CH livre, mas não a protegida, demonstraram que a porcentagem desprotegida das moléculas de CH iniciais estava abaixo de 15%.

Exemplo 3: 2',3' Acetilação do ortoéster cíclico de condroitina (2’,3’diacetil CH- cMOE)

[0095]. A condroitina oriunda da etapa anterior, protegida como ortoéster metílico cíclico (CH-cMOE) (4,79 g) é introduzida em um balão de reação com 23,95 ml de acetonitrila, 15,69 ml de trietilamina (TEA), 6,21 ml de anidrido acético e 78,96 mg de 4- dimetilaminopiridina (DMAP). Após 2 horas em agitação a 25 - 26°C, 94 ml de éter di- isopropílico são adicionados para obter um sólido viscoso que é, em seguida, filtrado através do filtro de papel e secado em forno sob vácuo a 45 °C por 24 h. O ortoéster cíclico intermediário assim obtido possui o aspecto de um sólido rosa.

Exemplo 4: Rearranjo do ortoéster metílico cíclico em éster com formação prevalente de acetato na posição 4, e com a hidroxila livre na posição 6 (consulte a Figura IIIB)

[0096]. O intermediário obtido a partir da etapa precedente (2,42 g) é introduzido em um balão de reação, ao qual são adicionados 18,8 ml de ácido acético 96% e 2,35 ml de água desmineralizada. A mistura é agitada por 38 h à temperatura ambiente, após as quais 100 ml de uma solução 0,6M de NaCl são adicionados e a mistura é ultrafiltrada através de uma membrana de 5 kDa e dialisada, para recuperar um retentado com um pH de 3,32.

[0097]. A solução é evaporada sob vácuo a 45-50°C; após uma nova secagem em forno ao longo da noite, é obtido 1,38 g de um produto com o aspecto de um sólido vítreo.

Exemplo 5: Rearranjo de ortoéster metílico cíclico em éster com formação prevalente do acetato na posição 6, e com a hidroxila livre na posição 4 (veja a Figura IIIA)

[0098]. 2,42 g de ortoéster cíclico intermediário obtido a partir da etapa precedente são introduzidos em um balão de reação com 14,52 ml de ácido acético 96% e 9,8 ml de água desmineralizada e aquecidos para 60°C por 17,5 h, 100 ml de NaCl 0,6M são, a seguir, adicionados e a solução (pH 2,27) é ultrafiltrada e dialisada para recuperar um retentado com um pH de 3,56.

[0099]. A solução é evaporada sob vácuo a 45-50°C, e após secar mais em forno ao longo da noite, são obtidos 1,12 g de um produto com um aspecto de um sólido vítreo.

Exemplo 6: Preparo de sulfato de condroitina com complexo piridínio-trióxido de enxofre

[00100]. O intermediário obtido conforme descrito no exemplo 4 (0,76 g) é introduzido em um balão com 46,0 ml de DMF agitando a mistura a 30°C por 10 min. 0,72 g de piridínio trióxido de enxofre é adicionado e quando o material inicial estiver dissolvido (aproximadamente 10 min), a solução será deixada sob agitação a 30°C por 1 h. Mais 0,72 g de piridínio trióxido de enxofre é, a seguir, adicionados, seguido por mais 0,72 g de piridínio trióxido de enxofre. A solução é agitada por mais uma hora a 30°C.

[00101]. A reação é resfriada, derramando a mistura em 50 ml de NaHCO3 10% em água à temperatura ambiente (pH 7,81). Após a filtração, a solução é evaporada sob vácuo (10 mBar) até secar, o resíduo é redissolvido com 150 ml de NaCl 0,6M e, por fim, a solução é ultrafiltrada.

[00102]. Após 6 alterações de volume, o retentado possui um pH de 9,22; o pH é ajustado para 6,7 com HCl 1N e a ultrafiltração continua, substituindo a solução NaCl 0,6N com água desmineralizada.

[00103]. A solução resultante é ultrafiltrada novamente para 2 volumes e, em seguida, dialisada para um volume de 20 ml. A solução dialisada é concentrada até secar sob vácuo (10 mBar, 45°C).

[00104]. O produto assim obtido (0,88 g) é dissolvido com 34,0 ml de soda 0,2N (NaOH) e aquecido para 40°C sob agitação por 2 h. Por fim, a solução é diluída com uma solução aquosa 0,6M de cloreto de sódio, ultrafiltrada através de uma membrana de 5 kDa, e dialisada com água desmineralizada. O retentado é concentrado até secar sob vácuo (45°C, 10 mBar), para que se obtenha 0,67 g de sulfato de condroitina. O produto final, que possui uma massa molecular de 29 kDa, determinada por HPLC-SEC, apresenta: - digestibilidade com condroitinase ABC superior a 95%; - uma razão 4S/6S de 18/82; - um valor de densidade de carga total de aproximadamente 0,9; - digestibilidade apenas parcial com condroitinase C, demonstrada pela presença de oligossacarídeos devido à presença na mesma cadeia polissacarídica tanto de unidades 4-sulfatadas quanto 6-sulfatadas, características da presente invenção.

Exemplo 7: Preparo de sulfato de condroitina com complexo piridínio-trióxido de enxofre

[00105]. O intermediário obtido conforme descrito no exemplo 5 (1,12 g) é introduzido em um balão com 67,2 ml de DMF, agitando a mistura a 50°C por 10 min. 1,05 g de piridínio trióxido de enxofre é adicionado, e quando o material inicial é dissolvido (aproximadamente 10 min), a solução é deixada sob agitação a 50°C por 1 h. Mais 1,05 g de piridínio trióxido de enxofre é, em seguida, adicionado. A solução é agitada por mais uma hora a 50°C.

[00106]. A reação é resfriada, derramando a mistura em 60 ml de NaHCO3 10% em água à temperatura ambiente (TA) (pH 7,81). Após a filtração, a solução é evaporada sob vácuo (10 mBar) até secar, e o resíduo é redissolvido com 30 ml de NaCl 0,6M. Por fim, a solução é ultrafiltrada.

[00107]. Após 6 alterações de volume, o retentado possui um pH de 9,22; o pH é ajustado para a neutralidade (7,5) com HCl 1N e a ultrafiltração continua, substituindo a solução NaCl 0,6 N com água desmineralizada.

[00108]. A solução resultante é ultrafiltrada novamente para 2 volumes e, em seguida, dialisada para um volume de 20 ml. A solução dialisada é concentrada até secar sob vácuo (10 mBar, 45°C), para obter 1,53 g do produto.

[00109]. O resíduo é dissolvido em 59,6 ml de soda 0,2 N (NaOH) e aquecido a 60°C por 2 h. Por fim, a solução é diluída com uma solução aquosa 0,6M de cloreto de sódio, ultrafiltrada através de uma membrana de 3 kDa, e dialisada com água desmineralizada. O retentado é concentrado até secar sob vácuo (45°C, 10 mBar) até que se obtenha 0,76 g de sulfato de condroitina.

[00110]. O produto assim obtido possui uma massa molecular de 15,4 kDa, determinada por HPLC-SEC; digestibilidade com condroitinase ABC superior a 95%; uma razão 4S/6S de 82/18; e um valor total de densidade de carga de aproximadamente 1,09. A digestão quase completa obtida com condroitinase ABC (mais de 95% do produto é quebrado), juntamente com a digestibilidade reduzida com condroitinase C, que são características da presente invenção, demonstra a existência tanto de unidades 4- sulfatadas quanto 6-sulfatadas na mesma cadeia polissacarídica.

[00111]. Mais de 95% de digestibilidade com condroitinase ABC demonstra também a ausência de dissacarídeos polissulfatados (trissulfatados e tetrassulfatados) na cadeia polissacarídica de SC que é descrita pela presente invenção.

Exemplo 8: Preparo de éster metílico de condroitina (CH)

[00112]. 10,0 g de CH em forma ácida são adicionados a uma solução de 1,3 L de metanol e 14,43 g de cloreto acetílico colocados sob agitação à temperatura ambiente por 2 horas em um balão de 3 litros, e a suspensão obtida é deixada sob agitação por 20 horas.

[00113]. Após esse tempo, a suspensão é filtrada, o sólido é lavado com 100 ml de metanol (2 x 50 ml) e secado a 50°C sob vácuo até que se recupere 9,4 g de sólido seco.

[00114]. A reação é repetida uma segunda vez com o mesmo procedimento, e após o segundo o período, a suspensão é resfriada entre 0 e 5°C por 60 minutos antes da filtração. O sólido obtido é lavado com metanol frio (0-5°C) e secado em forno sob vácuo por 3 horas a 50°C para que se recupere 6,3 g de sólido.

Exemplo 9: Proteção das funções hidroxiladas (4 e 6) da porção GalNAc do éster metílico de CH por formação de ortoéster

[00115]. 150 ml de dimetilformamida (DMF) e 6,0 g do produto obtido na etapa precedente são introduzidos em um balão de 500 ml com uma válvula de cloreto de cálcio e fluxo de nitrogênio. A seguir, são adicionados 20,06 g de trimetilortoacetato e 0,71 g de ácido canforsulfônico. A solução obtida é aquecida a 50°C (temperatura interna) por 18 horas.

[00116]. Ao fim de tal período, é deixada para esfriar à TA e concentrada sob vácuo para que se obtenha 8,5 g do produto.

Exemplo 10: Acetilação das 2',3' hidroxilas do produto derivado do Exemplo 9

[00117]. 8,0 g do produto obtido na etapa precedente, 40 ml de DMF, 28,6 g de trietilamina, 17,15 g de anidrido acético e 96 mg de dimetilaminopiridina são introduzidos em um balão de 250 ml com uma válvula de cloreto de cálcio e fluxo de nitrogênio à temperatura ambiente.

[00118]. A solução obtida é deixada sob agitação por 3 horas; ao fim de tal período, 150 ml de éter isopropílico são adicionados ao balão e um precipitado sólido amorfo se forma. As águas são eliminadas por decantação e 100 ml de éter isopropílico são adicionados ao sólido e deixados sob agitação por 1 hora. A seguir, o sólido é filtrado, lavado com 50 ml de éter isopropílico e secado sob vácuo a 40°C para recuperar 8,52 g do produto.

Exemplo 11: Rearranjo do ortoéster derivado do exemplo 10

[00119]. 7,0 g do produto obtido na etapa precedente, 72,8 g de ácido acético glacial e 8,7 ml de água são introduzidos em um balão de 250 ml para que se obtenha uma solução que é deixada sob agitação à TA por 3 horas. Em seguida, a solução é diluída para 150 ml com cloreto de sódio 0,6 M e a solução resultante é purificada por ultrafiltração através de uma membrana de 5 KD. Após a diálise, a solução obtida é concentrada sob vácuo e 6,7 g do produto sólido são recuperados.

Exemplo 12: Sulfatação do éster triacetilmetilico

[00120]. 670 mg do produto obtido na etapa precedente são introduzidos em um balão de 250 ml com fluxo de nitrogênio e válvula de cloreto de cálcio com 40 ml de DMF.

[00121]. 630,44 g do complexo piridínio trióxido de enxofre são adicionados à solução obtida e a solução resultante é aquecida a 50°C (temperatura interna) por 1 hora. A seguir, 630,44 g do complexo piridínio trióxido de enxofre são adicionados ao balão na mesma temperatura e novamente deixado sob agitação por 1 hora.

[00122]. Ao fim de tal período, a solução é resfriada à TA e 40 ml de NaHCO3 3% são adicionados ao balão à mesma temperatura para produzir uma solução que é concentrada sob vácuo para que se obtenha 2,3 g do sólido misturado com sais inorgânicos. O produto obtido é diluído para 150 ml de cloreto de sódio 0,6 M e ultrafiltrada através de uma membrana de 5 KDa.

[00123]. Após a diálise, a solução obtida é concentrada sob vácuo e 1,32 g do produto sólido é recuperado.

Exemplo 13: Para obter sulfato de condroitina

[00124]. O produto obtido na etapa precedente é introduzido em um balão de 100 ml com 33 ml de soda 0,2 M. A solução é aquecida a 40°C (temperatura interna) por 2 horas, após as quais é resfriada à TA e neutralizada com HCl 1 M.

[00125]. A solução é diluída para 150 ml de cloreto de sódio 0,6 M e ultrafiltrada através de uma membrana de 5 KDa. Após a diálise e concentração da solução sob vácuo, são obtidos 350 mg do sólido.

[00126]. O produto obtido neste exemplo possui uma massa molecular de 11 KDa, uma razão 4S/6S de 47/53 e um valor de densidade de carga de 0,9.

Exemplo 14: formação de ortoéster cíclico nas funções hidroxilas na 4 e 6 da porção GalNAc, com despolimerização simultânea da cadeia polissacarídica

[00127]. Uma suspensão de sal de tetrabutilamônio de condroitina, obtida como descrito acima (4,07 g, 6,535 mmols), em dimetilformamida (101 ml), foi mantida sob agitação e sob fluxo de nitrogênio à temperatura ambiente (20-25°C). Foram adicionados trimetilortoacetato (9,03 ml, 71,89 mmols) e ácido canforsulfônico (1,82 g; 7,84 mmols). A suspensão foi aquecida a 70°C (temperatura interna), e a dissolução completa foi observada após apenas alguns minutos. A reação foi mantida sob agitação à mesma temperatura por 18-20 h. No dia seguinte, a reação foi concentrada pela remoção do solvente por evaporação sob vácuo, gerando 13,67 g do produto na forma de um resíduo elástico amarelo brilhante.

[00128]. O conteúdo residual de condroitina desprotegida após a digestão é de 4,6%. A presença do ortoéster é demonstrada pelo sinal correspondente em FTIR.

[00129]. O produto assim obtido foi utilizado nas etapas posteriores conforme descrito acima, até que fosse obtido um LMW-CS BIOTEC sulfatado na posição 4 ou 6 no resíduo de GalNAc.

Exemplo 15: abertura do ortoéster cíclico de condroitina para éster com formação prevalente de acetato na posição 4 ou 6 da porção GalNAc e a despolimerização simultânea da cadeia polissacarídica

[00130]. O ortoéster de condroitina (3,00 g), água (3,14 ml) e ácido acético (26,25 g, 437 mmols) foram introduzidos em um balão de 250 ml com três gargalos. A suspensão obtida foi aquecida por 36 h à temperatura ambiente (20-25°C). A seguir, foi adicionada água para formar uma solução com um volume total de 100 ml. Em seguida, a solução obtida foi ultrafiltrada (membrana de 5 KD). O retentado coletado foi dialisado para um volume menor (20 ml), e, a seguir, concentrado até secar por evaporação sob vácuo, gerando 1,55 g de resíduo sólido correspondente ao produto desejado (condroitina triacetílica).

[00131]. O produto assim obtido foi usado nas etapas posteriores conforme descrito acima, até que fosse obtido um LMW-CS BIOTEC sulfatado na posição 4 ou 6 no resíduo de GalNAc. Exemplo 16: indução de artrite (Artrite Adjuvante, AA) em ratos, e tratamento com LMW-CS BIOTEC

[00132]. 40 ratos Lewis machos com peso entre 150 e 190 g foram randomizados para quatro grupos de 10 animais cada, alojados em gaiolas de polipropileno em um ambiente mantido à temperatura de 22 ± 2°C, e alimentados com uma dieta laboratorial padrão com acesso ilimitado à água.

[00133]. Os grupos experimentais foram os seguintes: (1) grupo de controle saudável sem tratamento. (2) Um grupo de controle não tratado com artrite adjuvante induzida (AA). (3) um grupo de ratos artríticos tratados oralmente com LMW-CS BIOTEC a uma dose de 900 mg/dia por kg de peso corporal por 28 dias após a indução de AA (dias 0-28 do experimento). (4) Um grupo pré-tratado oralmente com LMW-CS BIOTEC a uma dose de 900 mg/dia por kg de peso corporal por 14 dias antes da indução de Artrite Adjuvante, e por 28 dias após a indução de AA (dias -14 a +28 do experimento).

[00134]. A artrite foi experimentalmente induzida nos ratos no dia 0 por uma única injeção intradérmica de 1 ml de uma mistura composta de Mycobacterium butyricum inativada por calor em adjuvante incompleto de Freund.

[00135]. O LMW-CS BIOTEC foi dissolvido em água destilada na concentração de 20 mg/ml e administrado oralmente como uma única dose diária por gavagem.

[00136]. No fim dos 28 dias de tratamento, os ratos foram sacrificados sob anestesia e o sangue e os tecidos envolvidos foram coletados e analisados para avaliar os parâmetros observados no estudo.

Exemplo 17: efeitos do LMW-CS BIOTEC na avaliação da AA em ratos por meio do registro do edema desenvolvido, peso corporal e pontuação de artrite

[00137]. O edema desenvolvido como uma consequência da artrite foi mensurado pela observação do aumento no volume da pata traseira com uma pinça adequada para a medição. As medições foram realizadas antes da indução de AA e no dia 28 do estudo.

[00138]. O peso corporal dos ratos foi mensurado antes da indução de AA e no fim do tratamento (dia 28). O efeito do tratamento sobre esse parâmetro foi avaliado pela comparação dos diversos aumentos de peso dos diferentes grupos durante o período de tratamento.

[00139]. A pontuação de artrite foi avaliada pela atribuição de uma pontuação ao inchaço da junta da pata e pela extensão do eritema periarticular. A pontuação de artrite ou artrograma foi medida como a soma total do edema (em ml, máx. 8 pontos), do diâmetro da pata dianteira (em mm, máx. 5 pontos), do diâmetro da ferida no local da aplicação de Mycobacterium butyricum medida em paralelo à coluna espinhal (em mm, máx. 5 pontos), para cada animal.

Exemplo 18: efeito do LMW-CS BIOTEC na atividade da Y-glutamil transferase como um marcador do estresse oxidativo induzido por AA

[00140]. O estresse oxidativo foi avaliado pela medição da atividade da Y—glutamil transferase em homogenatos de tecido da junta colhido de ratos no fim dos tratamentos com LMW-CS BIOTEC. A Y-glutamil transferase é considerada como sendo um marcador do estresse oxidativo.

[00141]. A atividade da Y-glutamil transferase celular foi determinada em homogenatos de tecidos colhidos da pata traseira, e avaliada pelo método de Orlowski e Meister (Orlowski M, Meister A. The gamma-glutamyl cycle: a possible transport system for amino acids. Proc Natl Acad Sci USA 1970; 67: 1248-1255) conforme modificado por Ondrejickova et al. (Cardioscience 1993; 4: 225-230). As amostras foram homogeneizadas em um tampão (NaH2PO4 2,6 mM, Na2HPO4 50 mM, EDTA 15 mM, NaCl 68 mM, pH 8,1) em uma solução 1:9 (m/v) com UltraTurax TP 18/10 (Janke & Kunkel, Alemanha) por 1 min a 0°C. Os substratos, 8,7 mM de p-nitroanilida de Y-glutamil e 44 mM de metionina, foram adicionados a 65% de álcool isopropílico nas concentrações finais de 2,5 mM e 12,6 mM, respectivamente. Após a incubação por 60 min a 37°C, a reação foi interrompida pela adição de 2,3 ml de metanol frio, e os tubos de ensaio foram centrifugados por 20 min a 5000 rpm. A absorção do sobrenadante foi medida com um espectrofotômetro Specord 40 (Jena, Alemanha) em tinas de 0,5 cm a 406 nm. As misturas de reação na ausência do substrato ou receptor foram usadas como amostras de referência.

Exemplo 19: efeito do LMW-CS BIOTEC no estado inflamatório induzido por AA pela avaliação dos níveis de citocinas pro-inflamatórias (I-1, IL-6) e de proteína C-reativa (PCR) no plasma

[00142]. Amostras de sangue foram coletadas de ratos no fim do experimento e colocadas em tubos de ensaio contendo heparina como anticoagulante; o plasma foi separado da parte corpuscular composta por células de sangue por centrifugação, e as citocinas inflamatórias (IL-1, IL-6) foram avaliadas com a técnica ELISA usando kits comerciais específicos.

[00143]. A proteína C-reativa foi avaliada no plasma dos ratos com um kit ELISA (Immunology Consultant Laboratories, Inc., ICL). A reação do anticorpo secundário conjugado à biotina com anticorpos de proteína C-reativa antirratos foi avaliada por meio da atividade da peróxidase de rábano-estreptavidina (PRE). A reação de metilbenzidina com PRE ligado aos complexos imunes foi, em seguida, mensurada a 450 nm usando um leitor de microplaca Labsystems Multiskan RC. Os resultados foram calculados utilizando a curva de calibração padrão de acordo com as instruções do kit ELISA.

Exemplo 20: efeito do LMW-CS BIOTEC na atividade fagocítica e no burst oxidativo de neutrófilos induzido por AA

[00144]. A população de neutrófilos foi extraída do sangue dos ratos no fim da avaliação de sua atividade fagocítica e burst oxidativo. A medição da fagocitose, a saber, ingestão de bactérias, foi realizada em condições controladas usando Staphylococcus aureus opsonizada marcada com fluoresceína (SPA-FITC) (Invitrogen Molecular Probes, EUA). Em seguida, alíquotas de sangue periférico na heparina de lítio foram incubadas com hidroetidina (sondas moleculares Invitrogen, EUA) (15,75 mg em 5 ml de dimetilformamida, Merck, Alemanha) por 15 minutos a 37°C. Após o tratamento com SPA-FITC por 15 minutos a 37°C, a reação foi interrompida pela colocação dos tubos de ensaio no gelo. A lise posterior dos eritrócitos foi realizada por 15 min com uma solução de lise composta por cloreto de amônio frio/cloreto de potássio (200 ml de água deionizada, 1,658 g de NH4CL, 0,2 g de KHCO3 e 7,4 mg de Na2EDTA, pH 7,2-7,4). A porcentagem média de células fagocitárias representa a porcentagem de granulócitos que ingeriram pelo menos uma partícula de SPA- FITC, e a porcentagem média do burst respiratório representa a porcentagem de granulócitos marcados com etídio.

Claims

1. PROCESSO PARA O PREPARO DE SAL SÓDICO DE SULFATO DE CONDROITINA caracterizado pelo fato de que todas as unidades de N-acetil-D-galactosamina na mesma cadeia polissacarídica são monossulfatadas, aleatoriamente ou na posição 4 ou 6, tal processo incluindo as seguintes etapas: (a) transformação de sal sódico de condroitina em seu ácido livre ou alternativamente em um sal do mesmo com um cátion amônio quaternário selecionado dentre tetrametilamônio, tetraetilamônio ou tetrabutilamônio, ou com piridina ; (b) reação do composto obtido na etapa (a) com um ortoéster de fórmula RC(OR1)3, na qual R é selecionado dentre hidrogênio, metil, etil ou fenil e R1 é selecionado dentre metil ou etil, na presença de catálise ácida, para gerar um composto no qual a unidade dissacarídica repetitiva presente na condroitina possui a fórmula I

na qual R e R1 são tais como definidos acima (c) proteção dos grupos hidróxi nas posições 2' e 3' das unidades de ácido glicurônico do composto obtido na etapa anterior por meio da reação com um anidrido de fórmula (R2CO)2O na qual R2 é selecionado dentre metil, etil ou propil, na presença de piridina ou de uma base orgânica terciária selecionada entre trietilamina ou tri- isopropilamina e de 4-dimetilaminopiridina (DMAP), para gerar um composto no qual a unidade dissacarídica repetitiva presente na condroitina possui a fórmula II

na qual R, R1 e R2 são tais como definidos acima; (d) rearranjo da funcionalidade do ortoéster presente no produto obtido na etapa (c) com um ácido orgânico solúvel em água para gerar um derivado de éster no qual as unidades de GalNAc repetitivas no polissacarídeo consistem em derivados de triacila que apresentam a fórmula IIIa ou IIIb

na qual R e R2 são tais como definidos acima; (e) monossulfatação do composto obtido na etapa (d) seguida pela remoção dos grupos O-acil presentes nos compostos IIIa e IIIb obtidos na etapa anterior.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sal sódico de condroitina da etapa (a) é obtido a partir do polissacarídeo capsular K4 produzido por um caldo de cultura de E. Coli cepa O5:K4:H4 ou a partir do polissacarídeo produzido por um caldo de cultura de E. Coli cepa DSM23644.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada com um ortoéster selecionado dentre trimetilortoacetato, trietilortoacetato, trimetilortoformiato, trietilortoformiato, trimetilortopropionato, trietilortopropionato ou trimetilortobenzoato, preferencialmente com trimetilortoacetato ou trietilortoacetato, mais preferencialmente com trimetilortoacetato.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a catálise ácida da etapa (b) é realizada com um ácido selecionado dentre ácido canforsulfônico, ácido paratoluenossulfônico, ácido metanossulfônico ou com uma resina sulfônica, preferencialmente com ácido canforsulfônico ou com uma resina sulfônica, mais preferencialmente com ácido canforsulfônico.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é efetuada com anidrido acético.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é efetuada de 20 a 40°C, preferencialmente à temperatura ambiente.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é efetuada de 40 a 70°C, preferencialmente a 60°C.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é efetuada em uma mistura ácido orgânico solúvel em água/água ou apenas em água.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8,, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é selecionado dentre ácido acético, fórmico, propiônico, tartárico, ácido cítrico ou uma resina propiônica, preferencialmente ácido acético ou ácido propiônico, mais preferencialmente ácido acético.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sal sódico de sulfato de condroitina obtido possui uma massa molecular (Mw) média de 10-30 kDa.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o sal sódico de sulfato de condroitina possui uma distribuição de grupos monossulfatados cuja razão varia de 90/10 4S/6S a 10/90 4S/6S.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão entre as unidades de N-acetil-D-galactosamina sulfatadas na posição 4 e na posição 6 no sal sódico de sulfato de condroitina obtido é inferior a 1.

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão entre as unidades de N-acetil-D-galactosamina sulfatadas na posição 4 e na posição 6 no sal sódico de sulfato de condroitina obtido é superior a 1.