ITMI20082336A1 - Composti inibitori irreversibili di egfr con attivita' antiproliferativa - Google Patents
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- C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
- C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
- C07D239/86—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 4
- C07D239/94—Nitrogen atoms
Description
Domanda di breveto per invenzione industriale dal titolo:
COMPOSTI INIBITORI IRREVERSIBILI DI EGFR CON ATTIVITÀ’ ANTI PROLI FERATIVA
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda la sintesi e l'attività farmacologica di nuovi composti derivati di 4-anilinochinazolina impiegabili come inibitori irreversibili del recetore per il fattore di crescita dell’epidermide (EGFR).
STATO DELLA TECNICA
La famiglia di recetori per il fatore di crescita dell’epidermide comprende quatro recetori transmembrana (erbB1/EGFR, erbB2/FIER2, erbB3/HER3 ed erbB4/HER4) costituiti da una porzione extracellulare che lega il Iigando (eccetto erbB2), un dominio transmembrana ed un dominio intracellulare ad attività tirosinchinasica (eccetto erbB3). I ligandi di EGFR, erbB3 ed erbB4, principalmente il fattore di crescita dell’epidermide (EGF) ed il fattore di crescita trasformante a (TGF-a), legano la porzione extracellulare del recettore ativando il processo di dimerizzazione e la conseguente fosforilazione di specifici residui di tirosina nel dominio intracellulare. L’ativazione del recettore porta ad una cascata di segnali che mediano la crescita, la proliferazione, la motilità e la sopravvivenza cellulare (Wells, A. EGF receptor. Int. J. Biochem. Celi Biol. 1999, 31, 637-643). EGFR è sovraespresso o presente in forma costitutivamente attivata in diversi tumori solidi di origine epiteliale, come il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), ed il suo coinvolgimento nell’insorgenza e progressione tumorale è spesso associato a prognosi negativa (Voldborg, B. R.; Damstrup, L.; Spng-Thomsen, M.; Poulsen, H. S. Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, function and possible role in clinical trials. Ann. Oncol. 1997, 8, 1197-1206; Ritter, C. A.; Artega, C. L. The epidermal growth factor receptor tyrosine kinase: a promising therapeutic target in solid tumors. Semin. Oncol. 2003, 30, 993-1011; Raymond, E.; Faivre, S.; Armand, J. P. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase as a target for anticancer therapy. Drugs, 2000, 60, 15-23; Salomon, D. S.; Brandt, R.; Ciardiello, F.; Normanno, N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit. Rev. Oncoi. Hematol. 1995, 19, 183-232).
Gefitinib (Iressa®; AstraZeneca) ed erlotinib (Tarceva®; Genenthec), approvati per il trattamento di tumori polmonari (NSCLC), sono composti 4-anilinochinazolinici attivi come inibitori reversibili di EGFR, la cui formula è rappresentata in Figura 1a. I derivati 4-anilinochinazolinici inibiscono in modo potente e selettivo l’attività tirosin-chinasica di EGFR legando il sito per ATP nella porzione intracellulare del recettore (Wissner, A.; Berger, D. M.; Boschelli, H. D.; Floyd M. B.; Greenberger, L. M.; Gruber, B. C.; Johnson, B. D.; Mamuya, N.; Nilakantan, R.; Reich, M. F.; Shen, R.; Tsou, H. R.; Wang, Y. F.; Wu, B.; Ye, F.; Zhang, N. 4-Anilino-6,7-dialkoxyquinoline-3-carbonitrile Inhibitors of Epidermal Growth Factor Receptor Kinase and Their Bioisosteric Relationship to thè 4-Anilino-6,7-dialkoxyquinazoline Inhibitors. J. Med. Chem. 2000, 43, 3244; Bridges, A. J.; Zhou, H.; Cody, D. R.; Rewcastle, G. W.; McMichael, A.; Showalter, H. D. H.; Fry, D. W.; Kraker, A. J.; Denny, W. A. Tyrosine Kinase Inhibitors. 8. An Unusually Steep Structure-Activity Relationship for Analogues of 4-(3-Bromoanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline (PD 153035), a Potent Inhibitor of thè Epidermal Growth Factor Receptor. J. Med. Chem. 1996, 39, 267; Traxler, P; Bold, G.; Frei, J.; Lang, M.; Lydon, N.; Mett, H.; Buchdunger, E.; Meyer, T.; Mueller, M.; Furet, P. Use of a Pharmacophore Model for thè Design of EGF-R Tyrosine Kinase Inhibitors: 4-(PhenyIamino)pyrazolo[3,4-d]pyrimidines. J. Med. Chem. 1997, 40, 3601 ). Nonostante gefitinib ed erlotinib si siano rivelati molto utili nel trattamento di specifici gruppi di pazienti (donne asiatiche, non fumatrici, portatrici di specifiche mutazioni a carico di EGFR), la pratica clinica ha evidenziato fenomeni di resistenza primaria ed acquisita che ne limitano l'utilità (Fukuoka, M.; Yano, S.; Giaccone, G.; Tamura, T.; Nakagawa, K.; Douillard, J.; Nishiwaki, Y.; Vansteenkiste, J.; Kudoh, S.; Rischin, D.; Eek, R.; Horai, T.; Noda, K; Takata, I.; Smit, E.; Averbuch, S.; Macleod, A.; Feyereislova, A; Dong, R.; Baselga, J. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J. CUn. Oncol. 2003, 12, 2237-2246; Pérez-Soler, R.; Chachoua, A.; Hammond, L. A.; Rowinsky, E. K.; Huberman, M.; Karp, D.; Rigas, J.; Clark, G. M.; Santabàrbara, P.; Bonomi, P. Determinants of tumor response and survival with erlotinib in patients with non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2004, 22, 3238-3247). Nel tentativo di superare questo tipo di resistenza, una linea di ricerca chimicofarmaceutica si è recentemente rivolta verso lo sviluppo di inibitori irreversibili, in grado di legarsi covalentemente ad amminoacidi vicini al sito di legame dell'ATP. A questa classe appartengono, per esempio, gli inibitori irreversibili PD168393, composto 5a rappresentato in Figura 1 b (Fry, D. W.; Briges, A. J.; Denny, W. A.; Doerthy, A.; Greis, K. D.; Hicks, J. L; Hook, K. E.; Keller, P. R.; Leopold, W. R.; Loo, J. A.; McNamara, D. J.; Nelson, J. M.; Sherwood, V.; Smail, J. B.; Trumpp-Kallmeyer, S.; Dobrusin, E. M. Specific, irreversible inactivation of thè epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 12022-12027) e canertinib (CI-1033, Pfizer, rappresentato in Figura 1b) (Smalli, J. B.; Rewcastle, G. W.; Loo, J. A.; Greis, K. D.; Chan, O. H.; Reyner, E. L.; Lipka, E.; Showalter, H. D. H.; Vincent, P. W.; Elliott, W. L.; Denny, W. A. Tyrosine kinase inhibitors. 17. Irreversible inhibitors of thè epidermal growth factor receptor: 4-(phenylamino)quinazoline- and 4-(phenylamino)pyrido[3,2-d]pyrimidine-6-acrylamides hearing additional solubilizing functions. J. Med. Chem. 2000, 43, 1380-1397; Alien, L. F.; Eiseman, I. A., Fry, D. W.; Lenehan, P. F. CI-1033, an irreversible pan-erbB receptor inhibitor and its potential application for thè treatment of breast cancer. Semin. Oncol. 2003, 30, 65-78), quest’ultimo in fase II di sviluppo per il trattamento di NSCLC, che presentano un gruppo acrilammidico in grado di formare un legame chimicamente stabile con Cys773 nel sito attivo di EGFR ( Blair, J. A.; Rauh, D.; Kung, C.; Yun, C.-H.; Fan, Q.-W.; Rode, H.; Zhang, C.; Eck, M. J.; Weiss, W. A.; Shokat, K. M.; Structure-guided development of affinity probes for tyrosine kinases using Chemical genetics. Nature Chem. Biol. 2007, 3, 229-238).
Il legame irreversibile ad EGFR conferisce a questa classe di inibitori notevoli vantaggi rispetto agli inibitori reversibili gefitinib ed erlotinib: (a) mantengono un effetto prolungato nel tempo, una volta che l’inibitore irreversibile è legato covalentemente all’enzima l'effetto persiste fino a nuova resintesi di EGFR; (b) presentano una migliore selettività d’azione, gli inibitori irreversibili legano covalentemente un residuo di cisteina situato in prossimità dell’ingresso al sito di legame per ATP (Cys773 in EGFR, Cys784 in erbB2, e Cys778 in erbB4), che caratterizza in modo univoco la famiglia erbB rispetto alle altre chinasi; (c) sono in grado di superare la resistenza secondaria al trattamento con gefitinib ed erlotinib. L’inibizione irreversibile di EGFR, quindi, rappresenta un approccio molto importante per lo sviluppo di farmaci antitumorali (Carter, T. A.; Wodicka, L. M.; Shah, N. P.; Velasco, A. M.; Fabian, M. A.; Treiber, D. K.; Milanov, Z. V.; Atteridge, C. E.; Biggs III, W. H.; Edeen, P. T.; Floyd, M.; Ford, J. M.; Grotzfeld, R. M.; Herrgard, S.; Insko, D. E.; Mehta, S. A.; Patel, H. K.; Pao, W.; Sawyers, C. L.; Varmus, H.; Zarrinkar, P. P.; Lockhart, D. J. Inhibition of drug-resistant mutants of ABL, KIT, and EGF receptor kinases. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 11011-11016).
Gli inibitori irreversibili di EGFR descritti in letteratura sono pertanto caratterizzati da un nucleo 4-aniIinochinazoIinico o 4-anilinochinolino-3-carbonitrilico a cui è legato il gruppo reattivo in grado di instaurare il legame covalente con il target molecolare mediante reazioni di addizione 1,4 tipo-Michael, o di sostituzione nucleofila, con i residui di cisteina presenti nel sito catalitico della proteina target. I gruppi accettori di Michael, presenti negli inibitori irreversibili noti, ad es. acrilammidi, propargilammidi e vinilsulfonammidi, hanno una intrinseca tendenza a reagire con alcuni amminoacidi (preferenzialmente cisteine); anche se la porzione rimanente della molecola dovrebbe conferire selettività di reazione, ovvero dovrebbe rendere molto meno probabili reazioni che diano addotti con proteine diverse da EGFR, è possibile che si abbiano effetti collaterali dovuti a reazioni indesiderate. Per questo motivo, è importante che una nuova strategia terapeutica non sia affidata a composti con le stesse caratteristiche chimiche, pur promettenti come canertinib, ma sia supportata da studi sulla possibilità di modulare la struttura chimica deH'inibitore, per conoscere le relazioni struttura-attività ed avere alternative a possibili problemi che emergano dagli studi clinici.
Scopo della presente invenzione è pertanto fornire composti che possono essere impiegati come inibitori irreversibili con elevata selettività di reazione.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Tale scopo è stato raggiunto mediante un derivato di 4-anilinochinazolina di formula (A)
in cui X rappresenta idrogeno, bromo, cloro, fluoro, etinile oppure metile;
A è un residuo scelto dal gruppo consistente in
i)
in cui
Y rappresenta -CO- oppure -CHR-i-;
Z rappresenta -OR2, -SR2oppure -NR2R3;
R-i, R2e R3rappresentano, indipendentemente l’uno dall'altro, idrogeno, (Ci_ 6)alchile, (CH2)n-COOR4, (CH2)n-CONR4R5, (CH2)n-NR4R5oppure (CH2)n-morfolina;
R4 e R5rappresentano, indipendentemente, idrogeno oppure (Ci_6)alchile;
n può essere un numero intero scelto tra 0, 1 , 2, 3, 4, 5, e 6.
ii)
in cui
R6rappresenta idrogeno oppure (Ci-6)alchile;
R7, Re, R9, R10 e R11 rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno, cloro, fluoro, il radicale CF3, -N02oppure -OR12;
R12rappresenta idrogeno, (Ci-6)alchile, (CH2)n-COOR13, (CH2)n-CONR13R14, (CH2)n-NRi3Ri4oppure (CH2)n-morfolina;
RI3e R14 rappresentano, indipendentemente l’uno dall'altro, idrogeno oppure (C-|.
6)alchile; e n è un numero intero scelto tra 0, 1 , 2, 3, 4, 5, e 6.
iii)
in cui
R15, rappresenta idrogeno, (C1-6)alchile, (CH2)n-COOR18j(CH2)n-CONR18Rig, (CH2)n-NRi8Rig oppure (CH2)n-morfolina;
Ri6, Ri7, Rie e R19rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (Ci-8)alchile;
iv)
Re rappresenta idrogeno oppure (C1-6)alchile;
W rappresenta -C= oppure -N=;
R20, R21. R22 e R23rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno, cloro, fluoro, il radicale -CF3, -N02, (Ci-6)alchile.
v)
in cui
R24 rappresenta (C1-6)alchile, (CFl2)n-COOR251(CH2)n-CONR25R26, (CH2)n-NR25R26 oppure (CH2)n-morfolina;
R25 e R26 rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C-i-
6)alchile;
vi)
in cui
R6 rappresenta idrogeno oppure (Ci-6)alchile;
Q rappresenta un gruppo arilico oppure eteroarilico, facoltativamente sostituiti con uno 0 più sostituenti scelti, indipendentemente l’uno dall’altro, tra idrogeno, cloro, fluoro, il radicale CF3, -N02oppure -OR12;
R12 rappresenta idrogeno, (Ci-6)alchile, (ChhVCOOR^, (CH2)n-CONR'i3R14, (CH2)n-NRi3Ri4 oppure (CH2)n-morfoIina;
RI3e R14 rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C-i.
6)alchile; e n è un numero intero scelto tra 0, 1, 2, 3, 4, 5, e 6.
vii)
R27 e R28 possono rappresentare idrogeno oppure (C1-6)alchile; -NR28R29 può essere morfolina;
Il derivato dell’invenzione è impiegabile come inibitore irreversibile dell’attività tirosin-chinasica associata al recettore per il fattore di crescita dell’epidermide (EGFR).
L’invenzione pertanto concerne un derivato di Formula (A) scelto dal gruppo consistente in:
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente i), ossia un derivato di Formula (I),
Formula (I)
in cui;
X, Y e Z hanno il significato indicato per la formula (A);
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente ii), ossia un derivato di di Formula (il)
Formula (II)
in cui X, R6,R7, Re, Rg, R-ιο e R11hanno il significato indicato in formula (A);
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente iii), ossia un derivato di di Formula (III)
Formula (III) in cui X, R-15, R16, R17, Rie e R-ig hanno il significato indicato in formula (A);
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente iv), ossia un derivato di di Formula (IV)
Formula (IV)
in cui X, Re,W, R20, R21, R22 e R23hanno il significato indicato in formula (A);
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente v), ossia un derivato di di Formula (V)
Formula (V)
in cui X , R241R25e R26hanno il significato indicato in formula (A);
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente vi), ossia un derivato di di Formula (VI)
Formula (VI)
in cui X, R6,Q hanno il significato indicato in formula (A);
- un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente vii), ossia un derivato di di Formula (VII)
Formula (VII)
in cui X, R6,R27 e R28 hanno il significato indicato in formula (A);
Tali composti sono in grado di interagire covalentemente con residui di cisteina presenti nel sito catalitico di EGFR e di altri recettori ad attività tirosin-chinasica della stessa famiglia, conferendo ai composti l’abilità di mantenere un’inibizione protratta nel tempo e di superare la resistenza delle cellule tumorali verso gli inibitori reversibili di EGFR. I composti oggetto della presente invenzione sono costituiti da gruppi reattivi verso le cisteine, in particolare epossidi, arilossimetilcarbonili, isotiazolinoni, benzisotiazolinoni, 1 ,2,4-tiadiazoli o carbammati, uniti mediante legame ammidico ad un nucleo 6-amino-4-anilinochinazolìnico, responsabile dell'interazione con il target molecolare. Anche ammidi derivanti da β-amminocarbossili sono oggetto della presente invenzione, poiché, in seguito ad una reazione di β-eliminazione, possono dare origine a derivati acrilammidici. La presente invenzione riguarda la loro preparazione ed il loro uso come farmaci antitumorali nel trattamento di tumori solidi di origine epiteliale come il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) con particolare riferimento a tumori che hanno sviluppato resistenza secondaria a inibitori reversibili di EGFR come gefitinib ed erlotinib.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L’invenzione verrà ora descritta in dettaglio facendo riferimento ad alcune figure in cui:
le Figure 1a e 1 b mostrano le strutture di inibitori di EGFR noti in letteratura, inibitori reversibili (gefitinib ed erlotinib, Figura 1a) ed irreversibili (PD168393 e canertinib, Figurai b);
le Figure 2a e 2b mostrano l’effetto del Composto 7a (UPR1135) dell’invenzione sui livelli di autofosforilazione di EGFR in cellule A431 . Le cellule sono incubate 1 h con varie concentrazioni di Composto 7a, e successivamente stimolate con EGF subito dopo l’incubazione (Figura 2a) oppure 8 h dopo la rimozione del composto (Figura 2b);
la Figura 3 mostra l’effetto antiproliferativo dell’inibitore reversibile gefitinib (Iressa, barre piene) e del Composto 7a (UPR1135, barre vuote) sulla linea cellulare H1975. Le cellule sono incubate con varie concentrazioni di inibitore per 72 h. La proliferazione cellulare è determinata mediante saggio MTT. I risultati sono riportati come medie deviazione standard (SD) per due esperimenti indipendenti; La Figura 4 mostra l’effetto di gefitinib (Iressa), PD187376 e Composto 7a (UPR1135) sui livelli di autofosforilazione di EGFR ed erbB2 in cellule H1975. Le cellule sono incubate 1 h con varie concentrazioni di inibitore, stimolate con EGF e sottoposte successivamente ad analisi mediante Western blot.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
L’invenzione pertanto concerne un derivato di 4-anilinochinazolina di formula (A)
in cui X rappresenta idrogeno, bromo, cloro, fluoro, etinile oppure metile;
A è un residuo scelto dal gruppo consistente in
i)
in cui
Y rappresenta -CO- oppure -CHR1-;
Z rappresenta -OR2, -SR2oppure -NR2R3;
R-i,R2e R3rappresentano, indipendentemente l'uno dall’altro, idrogeno, (C-i.
6)alchile, (CH2)n-COOR4, (CH2)n-CONR4R5, (CH2)n-NR4R5oppure (CH2)n-morfolina;
R4e R5rappresentano, indipendentemente, idrogeno oppure (C1-6)alchile;
n può essere un numero intero scelto tra 0, 1 , 2, 3, 4, 5, e 6.
ii)
in cui
Re rappresenta idrogeno oppure (C)alchile;
R7IRB, R9, R10 e Rn rappresentano, indipendentemente i’uno dall’altro, idrogeno, cloro, fluoro, il radicale CF3, -N02oppure -OR12;
Rì2rappresenta idrogeno, (Ci-6)alchile, (CH2)n-COOR13, (CH2)n-CONRi3R14, (CH2)n-NRi3R14oppure (CH2)n-morfolina;
R-I3e RM rappresentano, indipendentemente l’uno dall'altro, idrogeno oppure (C-i-6)alchile; e n è un numero intero scelto tra 0, 1 , 2, 3, 4, 5, e 6.
iii)
in cui
R15, rappresenta idrogeno, (Ci-6)alchile, (CH2)n-COOR18, (CH2)n-CONR18Ri9, (CH2)n-NR18R19oppure (CH2)n-morfolina;
R16. R17, Rie e R19 rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C1-6)alchile;
iv)
R6rappresenta idrogeno oppure (Ci-6)alchile;
W rappresenta -C= oppure -N=;
R20, R21, R22e R23rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno, cloro, fluoro, il radicale -CF3, -N02, (C1-6)alchile.
v)
in cui
R24rappresenta (C1-6)alchile, (CH2)n-COOR25, (CH2)n-CONR25R26, (CH2)n-NR25R26oppure (CH2)n-morfolina;
R25 e R26rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C-i.
6)alchile;
vi)
in cui
R6rappresenta idrogeno oppure (Ci-6)alchile;
Q rappresenta un gruppo arilico oppure eteroarilico, facoltativamente sostituiti con uno 0 più sostituenti scelti, indipendentemente l'uno dall’altro, tra idrogeno, cloro, fluoro, il radicale CF3, -N02oppure -OR-|2;
RI2rappresenta idrogeno, (C1-6)alchile, (CH2)n-COOR13, (CH2)n-CONR13R14, (CH2)n-NRi3Ri4 oppure (CH2)n-morfolina;
R13 e R-I4rappresentano, indipendentemente l’uno dall'altro, idrogeno oppure (C-ie)alchile; e n è un numero intero scelto tra 0, 1, 2, 3, 4, 5, e 6.
vii)
R27 e R28possono rappresentare idrogeno oppure (C1-6)alchile; -NR28R29 può essere morfolina.
Nella presente descrizione quando si impiega il termine
- "gruppo arilico” si intende un anello aromatico monociclico o policiclico fuso composto solo da atomi di carbonio con un sistema di elettroni-π completamente coniugato;
- per "gruppo eteroarilico" si intende un sistema monociclico 0 policiclico fuso avente nell’anello uno o più eternatomi, quali per esempio azoto, ossigeno, zolfo e caratterizzato da un sistema di elettroni-π completamente coniugato.
Il derivato dell’invenzione è impiegabile come inibitore irreversibile dell’attività tirosin-chinasica associata al recettore per il fattore di crescita dell’epidermide (EGFR).
Preferibilmente il composto di Formula (A), è un composto in cui il sostituente A è scelto dal gruppo consistente in:
vii)
Più preferibilmente, il derivato dell’invenzione di formula (A) ha come sostituente A il sostituente i), più preferibilmente il derivato dell’invenzione è estere etilico dell’acido trans-(2R,3R)-3-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-iI-carbamoil)-2,3-epossibutirrico.
I composti oggetto della presente invenzione, caratterizzati dalla presenza di gruppi in grado di instaurare legami chimici covalenti con bio-nucleofili, come residui di cisteina, legati mediante legame ammidico ad una porzione 4-anilinochinazolinica sono in grado di assicurare selettivamente l’interazione tra i composti descritti ed EGFR. L’associazione delle due metà rende poco probabili reazioni che diano addotti covalenti con proteine diverse da EGFR, portando all'inibizione selettiva degli enzimi che contemporaneamente riconoscono con elevata affinità la porzione di riconoscimento e presentano in posizione stericamente favorevole un amminoacido in grado di reagire con la porzione reattiva.
Nelle Formule (A), (l)-(VII):
- il termine (Ci-6)alchile preferibilmente è un alchile scelto dal gruppo consistente in metile, etile, propile, isopropile, n-butile, sec-butile, iso-butile e tert-butile, npentile, n-esile;
- i termini (CH2)n-COOR, (CH2)n-CONRiRj, (CH2)n-NRjRjdove i-j sono rispettivamente R4,R5; Ri3,Ri4;, Ri8,Ri9; R2,R26nelle formule più sopra oppure (CH2)n-morfolina rappresentano preferibilmente catene alchiliche lineari metileniche, etileniche, propileniche, butileniche, pentileniche, oppure esileniche che funzionano da spaziatori alchilici e legano sul carbonio terminale gruppi carbossilici, ammidici, oppure amminici.
I composti oggetto della presente invenzione comprendono derivati carbossilici di gruppi reattivi verso i nucleofili, come epossidi (Formula I), arilossimetilcarbonili (Formula 11), isotiazolinoni (Formula III), benzisotiazolinoni (Formula IV), 1 ,2,4-tiadiazoli (Formula V), e carbammati (Formula VI). I derivati β-amminocarbossilici (Formula VII), in presenza di una base che stabilizzi la forma enolica deH’ammide, possono subire reazione di β-eliminazione con formazione del derivato acrilammidico corrispondente. ( Maresso, A. W.; Wu, R.; Kern, J. W.; Zhang, R.; Janik, D.; Missiakas, D. M.; Duban, M. E.; Joachimiak, A; Schneewind, O. Activation of inhibitors by sortase triggers irreversible modification of thè active site. J. Biol. Chem. 2007, 282, 23129-23139). Tutti i gruppi considerati sono legati mediante legame ammidico alla porzione 6-amino-4-anilinochinazoIinica, responsabile del riconoscimento con il target molecolare.
I composti appartenenti alle serie descritte hanno mostrato attività inibitoria irreversibile suN'autofosforilazione di EGFR ed attività antiproliferativa sia su una linea cellulare sensibili al trattamento con inibitori reversibili di EGFR (A431 , carcinoma ovarico umano, iperesprimente EGFR), sia su una linea cellulare resistente trattamento con inibitori reversibili di EGFR (H1975, carcinoma polmonare umano, portatrice della mutazione T790M nella porzione intracellulare del recettore responsabile della resistenza al trattamento con gefitinib). Inoltre, i composti dell’invenzione hanno mostrato attività inibitoria sia suH’autofosforilazione di EGFR che di erbB2 nella linea cellulare H1975.
I composti dell’invenzione possono essere preparati con i metodi o le tecniche convenzionali della chimica organica. Di seguito verranno descritte alcune vie di sintesi (schemi 1-8). Il tecnico medio del settore sarà in grado di scegliere i composti di partenza opportuni ed i corrispondenti reattivi e condizioni di reazione in funzione del prodotto desiderato neN’ambito delle Formule (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) e (VII) sopra riportate.
Le vie di sintesi si differenziano a seconda della porzione reattiva presente in posizione 6 sul nucleo 4-anilinochinazolinico, ed ogni porzione reattiva si differenzia a seconda del sostituente presente in posizione beta sull’α,β-epossi propionammide (Formula I), sull’anello aromatico (Formule II, IV e VI), in posizione 3 sull’anello 1 ,2,4-tiadiazolico (Formula V), oppure sull’atomo di azoto in posizione β rispetto alla funzione ammidica (Formula VII).
L’intermedio comune utilizzato per la sintesi dei composti oggetto della presente invenzione è la 4-anilinochinazolina (5) avente in posizione 6 un gruppo amminico — NH2ed in posizione 3’ un sostituente X, ossia un sostituente scelto dal gruppo consistente in idrogeno, bromo, cloro, fluoro e metile). L’intermedio (5) è stato sintetizzato secondo la via descritta nello schema 1 0 come riportato in letteratura. (Rewcastle, G. W.; Denny, W. A.; Bridges, A. J.; Zhou, H.; Cody, D. R.; McMichael, A.; Fry, D. W. Tyrosine kinase inhibitors: synthesis and structureactivity relationships for 4-[(phenylmethyl)amino]- and 4-[(phenylamino)quinazolines as potent adenosine 5’-triphosphate binding site inhibitors of thè tyrosine kinase domain of thè epidermal growth factor receptor. J. Med. Chem. 1995, 38, 3482-3487;. Domarkas, J.; Dudouit, F.; Williams, C; Qiyu, Q.; Banerjee, R.; Brahimi, F.; Jean-Claude, B. J. The combi-targeting concepì: synthesis of stable nitrosureas designed to inhibit thè epidermal growth factor receptor (EGFR). J. Med. Chem. 2006, 49, 3444-3552). Il prodotto di partenza 5-nitroantranilonitrile (1) è ciclizzato con riscaldamento a reflusso in acido formico/acido solforico concentrato per ottenere 6-nitrochinazoIin-4-one (2), che può essere clorurato in posizione 4 con cloruro di tionile. La risultante 4-cloro-6-nitrochinazolina (3) è trattata con anilina 3-sostituita per ottenere (4), in cui il gruppo nitro in posizione 6 può essere ridotto con ferro/acido acetico per ottenere il prodotto (5).
Schema 1
Reagenti : nella fase (i): H2S04/acido formico, reflusso; nella fase (ii): SOCI2, diossano, reflusso; nella fase (iii): anilina 3-sostituita, 2-propanolo, 60°C; nella fase (iv): Fe/acido acetico/etanolo/H20, reflusso.
La sintesi dei composti (7) di Formula (I) è effettuata come descritto nello schema 2, per reazione di derivati α,β-epossicarbossilici (6) con l'ammina (5), seguendo la procedura descritta da Miki et al. per derivati epossiammidici (Miki, T; Kori, M.; Tozawa, R.; Nakamura, M.; Sugiyama, Y.; Yukimasa, H. Synthesis of (4,1-benzoxazepine-3-yIidene)acetic acid derivatives and their inhibition of squalene synthase. Chem, Pharm. Bull. 2002, 50, 53-58).
Schema 2
Reagenti : nella fase (i) cloruro di diclorometilendimetilimminio, NaHC03, diclorometano, 0 °C.
I composti (9) di Formula (II) sono sintetizzati come descritto in schema 3. L’ammina (5) è acilata tramite l’acido β-fenossiacetico (8) corrispondente in presenza di PCI5.
Schema 3
Reagenti nella fase (i) PCI5, diclorometano, reflusso.
L’estere etilico dell’acido (3-ossoisotiazol-2(3/-/)-il)acetico (10) (Lewis, S. N.; Miller, G. A.; Hausman, M.; Szamborski, E. C. 4-isothiazolin-3-ones. A generai synthesis from 3,3’-dithiodipropionamides. J. Heterocycl. Chem. 1971 , 8, 571-580) è idrolizzato con acido trifluoroacetico (soluzione 1 M) per ottenere l’acido libero (11), che è stato condensato con l’ammina (5) per ottenere i derivati (12) di Formula (II), schema 4.
Schema 4
Reagenti', nella fase (i): acido trifluoroacetico soluzione 1M, reflusso; nella fase (ii): dicicloesilcarbodiimmide (DCC), dimetilformammide, da 0 °C a temperatura ambiente.
I composti (14) con Formula (IV) sono sintetizzati come descritto in schema 5. L’ammina (5) è trattata con il cloruro acilico dell’opportuno acido (3-osso-1,2-benzisotiazoIin-2-il)acetico (13). Gli acidi con formula (13) sono stati sintetizzati con procedure descritte in letteratura (Bordi, F.; Catellani, P. L; Morini, G.; Piazzi, P. V.; Silva, C.; Barocelli, E.; Chiavarini, M. 4-(3-Oxo-1 ,2-benzisothiazolin-2-yl)alkanoic, -phenylalkanoic, and -phenoxyalkanoic acids: synthesis and antiinflammatory, analgesie and antipyretic properties. Farmaco 1989, 44, 795-807).
Schema 5
Reagenti : nella fase (i): PCI5, diclorometano, reflusso.
L’estere dell’acido 1 ,2,4-tiadiazoI-5-carbossilico (15) (Howe, R. K.; Franz, J. E. Nitrile suphides. Synthesis of 1,2,4-thiadiazoles. J. Org. Chem. 1974, 39, 962-964) reagisce con l’ammina (5) in presenza di tert.-butossido di potassio (soluzione 1M) con formazione dei prodotti (16) a formula generale (V). La reazione è condotta con riscaldamento a microonde (schema 6).
Schema 6
Reagenti : (i) potassio tert.-butossido, dimetilformammide, microonde, 100 °C. Il derivato /\/-(fenossicarbonil)gIicinico (17) e l’ammina (5) reagiscono in presenza di dicicloesilcarbodiimmide (DCC) con formazione dei composti (18) di Formula (VI), come descritto in schema 7.
Schema 7
Reagenti·, nella fase (i): dicicloesilcarbodiimmide (DCC), dimetilformammide, da 0 °C a temperatura ambiente.
I composti (21) di Formula (VII) sono sintetizzati come descritto in schema 8. L'ammina (5) è acilata con 3-cloropropionil cloruro (19) per ottenere l’intermedio 3-cloropropionammide (20). Successivamente, il trattamento con l’opportuna ammina secondaria porta al prodotto 3-amminopropionammide (21) in buone rese.
Reagenti·, nella fase (i): reflusso; nella fase (ii): NHR27R28, Nal, etanolo, reflusso. I composti dell’Invenzione possono contenere centri stereogenici e pertanto possono essere preparati e/o isolati sia come singoli stereoisomeri sia come loro miscele enantiomeriche 0 diastereoisomeriche. Sia i suddetti singoli stereoisomeri, sia le loro miscele enantiomeriche o diastereoisomeriche rientrano pertanto nell’ambito dell’invenzione qui rivendicato.
In alcuni casi, i composti dell’invenzione contengono un gruppo basico -NH- che può formare sali di addizione con acidi, in particolare con acidi farmaceuticamente accettabili.
La presente invenzione riguarda nuovi composti derivati di 4-anilinochinazolina impiegabili come inibitori irreversibili di EGFR ad attività antiproliferativa che possono essere utilizzati nel trattamento di disturbi connessi con un’alterata attività del recettore per EGF. In particolare, i composti della presente invenzione possono essere utilizzati come agenti terapeutici per il trattamento di patologie, come, ad esempio, diverse forme tumorali di origine epiteliale, nelle quali sia presente un’alterazione nel funzionamento di recettori ad attività tirosin-chinasica della famiglia di EGFR.
L’invenzione pertanto concerne l’impiego di tali composti nel trattamento di patologie nelle quali sia presente un’alterazione nel funzionamento di recettori ad attività tirosin-chinasica della famiglia di EGFR. Preferibilmente, l'invenzione pertanto concerne l’impiego di tali composti per il trattamento di diverse forme tumorali di origine epiteliale. Più preferibilmente, l’invenzione concerne altresì l’impiego di tali composti nel trattamento e nella prevenzione di disordini della proliferazione cellulare quali papilloma, blastoglioma, sarcoma di Kaposi, melanoma, tumore polmonare, tumore ovarico, tumore della prostata, tumore al seno, astrocitoma, tumore del pancreas, tumore gastrico, carcinoma epatocellulare, leucemia, linfoma.
Senza essere legati ad alcuna teoria, si ritiene che la capacità dei gruppi reattivi considerati di legare in modo covalente Cys773 di EGFR e Cys784 di erbB2 all'interno del sito di legame per l’ATP, rende i composti considerati inibitori irreversibili. I gruppi reattivi considerati possono dare reazioni di addizione (I, III, IV, V), o di sostituzione nucleofila (II, VI) con i residui di cisteina presenti nel sito catalitico della proteina target. I derivati β-amminocarbossilici (VII), in seguito a βeliminazione e formazione del derivato acrilammidico corrispondente, possono interagire con nucleofili mediante reazioni di addizione di Michael 1 ,4.
I seguenti esempi illustrano in modo non-limitativo la preparazione dei composti dell’invenzione secondo i procedimenti prima descritti
Parte sperimentale
Esempio 1:
Preparazione dell’estere etilico dell’acido trans-(2R,3R)-3-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il-carbamoil)-2.3-epossibutirrico (7a)
Una soluzione di mono etil estere dell’acido fra/?s-(2R,3R)-2,3-epossisuccinico (Korn, A.; Rudolph-Bòhner, S; Moroder, L. A convenient synthesis of optically pure (2 R, 3R)-2,3-epoxysuccinyl-dipeptides. Tetrahedron, 1994, 50, 8381-8392) (350 mg, 2.19 mmol) e cloruro di diclorometilendimetil imminio (356 mg, 2.19 mmol) in CH2CI2 (10 mL) è stata agitata per 1 ora a 0 °C, e successivamente addizionata di 6-ammino-4-(3-bromoanilino)chinazolina (5a) (458 mg, 1.46 mmol) e NaFICOa (613 mg, 7.3 mmol). La miscela è stata agitata per 1 ora a 0 °C, concentrata per distillazione a pressione ridotta, ed il residuo è stato diluito con una miscela di acetato di etile ed acqua. La fase organica è stata separata, anidrificata (Na2S04) ed il solvente distillato a pressione ridotta. Il solido ottenuto è stato purificato con lavaggi con metanolo caldo. Esso si presentava come solido bianco; resa 60%; p. f. > 230 °C dee.; MS (APCI): m/z 458.3, 459.2;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz) δ 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 3.82 ( d, J = 1.7 Hz, 1 H), 3.93 (d, J = 1.7 Hz, 1 H), 4.23 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.35 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.92-7.82 (m, 3H), 8.16 (b s, 1H), 8.60 (s, 1 H), 8.72 (d, J = 1.3 Hz, 1 H), 9.93 (b s, 1H), 10.80 (b s, 1 H).
Esempio 2:
Preparazione dell’estere etilico dell’acido trans-(2S,3S)-3-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il-carbamoil)-2.3-epossibutirrico (7b)
Seguendo la procedura indicata nell'esempio 1 , ma partendo dal mono etil estere deH'acido frans-(2S,3S)-2,3-epossisuccinico è stato ottenuto il composto del titolo (Tamai, M.; Yokoo, C.; Murata, M.; Oguma, K.; Sota, K.; Sato, E.; Kanaoka, Y. Efficient synthetic method for ethyl (+)-(2S,3S)-3-[(S)-3-methyl-1-(3-methylbutylcarbamoyl)butylcarbamoyl]-2-oxiranecarboxylate (EST), a new inhibitor of cysteine proteinase. Chem. Pharm. Bull. 1987, 35, 1098-1104. Hebicidal (1 ,2,4)thiadiazoles. European Patent EP0726260 A1 del 08/02/1995.). Il residuo è stato purificato mediante cromatografia (Si02, eluente CH2CI2/CH3OH da 99:1 a 97:3). Solido bianco; resa 66%; p. f. > 230 °C; MS (APCI): m/z 457.9, 459.3;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz) δ 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 3.81 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.92 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.23 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.35 (t, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.80-7.87 (m, 2H), 7.89 (dd, J = 9.0, 2.2 Hz, 1H), 8.16 (s, 1 H), 8.60 (s, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 9.94 (br s, 1 H), 10.80 (br s, 1 H).
Esempio 3:
Preparazione del composto A/-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-fenossiacetammide (9a)
Acido fenossiacetico (360 mg, 2.37 mmol) è stato aggiunto ad una sospensione di PCI5(490 mg, 2.37 mmol) in CH2CI2(15 mL) mantenuta in agitazione a temperatura ambiente. La miscela è stata scaldata a reflusso per 30 min e, dopo raffreddamento a temperatura ambiente, 6-ammino-4-(3-bromoanilino)chinazolina (5a) (500 mg, 1.59 mmol) è stata addizionata in porzioni in 10 minuti. La miscela di reazione è stata poi scaldata a reflusso per 2 ore, raffreddata in ghiaccio e 2.5 mL di acqua sono stati aggiunti. Dopo 30 minuti, la miscela è stata neutralizzata per aggiunta di una soluzione di Na2C03- Il prodotto precipitato è stato separato per filtrazione, purificato mediante cromatografia (S1O2, eluente CH2CI2/CH3OH da 99:1 a 95:5), e cristallizzato da etanolo/acqua. Sono stati ottenuti cristalli bianchi; resa 77%; p. f. 212 °C; MS (APCI): m/z 449.0, 451.0;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz) δ 4.79 (s, 2H), 6.99 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.27-7.36 (m, 4H), 7.80 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 7.85 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.95 (dd, J = 9.0, 2.1 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.58 (s, 1 H), 8.74 (d, J = 1.7 Hz, 1 H), 9.93 (s, 1 H), 10.44 (s, 1H).
Esempio 4:
Preparazione del composto A/-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(4-fluorofenossOacetammide (9b)
Seguendo la procedura indicata nell’esempio 4 è stato ottenuto il prodotto del titolo, il quale è stato purificato mediante cromatografia (SÌO2, eluente CH2CI2/CH3OH da 99:1 a 97:3), e cristallizzato da etanolo/acqua. Esso si presentava come cristalli bianchi; resa 67%; p. f. 224 °C; MS (APCI): m/z 467.3, 469.1;<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 4.78 (s, 2H), 7.07 (dd, J = 9.2, 4.3 Hz, 2H), 7.15-7.21 (m, 2H), 7.27-7.37 (m, 2H), 7.85 (m, 2H), 7.95 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H), 8.16 (b s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.74 (b s, 1H), 9.93 (b s, 1 H), 10.44 (b s, 1 H).
Esempio 5:
Preparazione del composto /V-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(2.3.4.5.6-pentafluorofenossi)acetammide (9c)
Seguendo la procedura indicata nell’esempio 4 è stato ottenuto il prodotto del titolo, il quale è stato purificato mediante cromatografia (Si02, eluente CH2CI2/CH3OH da 99:1 a 97:3), e cristallizzato da etanolo/acqua. Il prodotto si presentava come cristalli bianchi; resa 50%; p. f. 220-221 °C; MS (APCI): m/z 539.1 , 541.1 ;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz) δ 4.99 (s, 2H), 7.24-7.34 (m, 2H), 7.75-7.87 m, 3H), 8.11 (s, 1 H), 8.55 (s, 1 H), 8.66 (s, 1H), 9.91 (b s, 1H), 10.50 (b s, 1H).
Esempio 6:
Preparazione del composto A/-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(3-oxoisotiazol-2(3/-/)-il)acetammide (12a)
a) Preparazione dell'acido (3-oxoisotiazol-2(3/-/)-il)acetico (11a)
Una soluzione di estere etilico dell’acido (3-oxoisotiazol-2(3H)-il)acetico (10) (200 mg, 1.07 mmol) in acido trifluoroacetico 1M (27 mL, 27 mmol) è stata scaldata a reflusso per 12 ore. Il solvente è stato evaporato per distillazione a pressione ridotta ed il residuo (11) è stato utilizzato nella reazione successiva senza ulteriori purificazioni. Resa quantitativa;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 Mz) δ 4.41 (s, 2H), 6.19 (d, J = 6.2 Hz, 1 H), 8.51 (d, J = 6.2 Hz, 1 H).
b) A/-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(3-oxoisotiazol-2(3/-/)-il)acetammide (12a)
Ad una soluzione di 6-ammino-4-(3-bromoaniIino)chinazolina (5a) (200 mg, 0.64 mmol) in dimetilformammide (3 mL) raffreddata in un bagno di acqua e ghiaccio, sono stati aggiunti l’acido (11) (152 mg, 0.96 mmol) e dicicloesilcarbodimmide (DCC) (208 mg, 1.02 mmol). La miscela è stata poi agitata a temperatura ambiente per 16 ore. Il solido sospeso è stato eliminato per filtrazione, e la soluzione distillata a pressione ridotta per ottenere il prodotto 13a grezzo, che è stato purificato mediante cromatografia (Si02, eluente acetato di etile, poi acetato di etiIe/CH30H a 90:10), e cristallizzato da etanolo/acqua. Il prodotto si presentava comecristalli bianchi; resa 40%; p. f. > 230 °C; MS (APCI): m/z 456.1 , 458.3;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz) δ 4.65 (s, 2H), 6.24 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.79-7.85 (m, 3H), 8.10 (s, 1H), 8.55 (d, J = 6.2 Hz, 1 H), 8.55 (s, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 9.94 (b s, 1 H), 10.69 (b s, 1 H).
Esempio 7:
Preparazione del composto A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-ivD-2-(3-oxo-1 ,2-benzoisotiazolin-2(3/-/)-il)acetamide (14a)
A partire da 6-ammino-4-(3-bromoanilino)chinazolina (5a) e acido (13), seguendo la procedura indicata nell’esempio 4, è stato ottenuto il prodotto del titolo, il quale è stato purificato per cromatografia (Si02, eluente acetato di etile/n-esano 99:1), e cristallizzato da metanolo. Cristalli bianchi; resa 45%; p. f. 238 °C; MS (APCI): m/z 506.1 , 508.1 ;<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz) δ 4.75 (s, 2H), 7.25-7.31 (m, 2H), 7.43 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.76-7.83 (m, 3H), 7.88 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 9.89 ( b s, 1H), 10.66 (b s, 1H).
Esempio 8:
Preparazione del composto A/-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-isopropil-1.2,4-tiadiazol-5-carbossammide (16a)
Ad una miscela di 6-ammino-4-(3-bromoaniIino)chinazolina (5a) (0.235 g, 0.75 mmol) ed estere etilico dell'acido 3-isopropil-1,2,4-tiodiazol-5-carbossilico (15) (0.150 g, 0.75 mmol) (Hebicidal (1,2,4)thiadiazoles. European Patent EP0726260 A1 del 08/02/1995) in dimetilformammide (1 mL) sono aggiunti 0.75 ml_ di una soluzione 1M di tert.-butossido di potassio in tetraidrofurano (0.75 mmol). La reazione è scaldata a 100 °C per 10 min. con riscaldamento a microonde a 150 Watt. La miscela è poi diluita con acqua ed estratta con acetato di etile. La fase organica è lavata con acqua, salamoia, anidrificata (Na2S04) ed il solvente distillato a pressione ridotta. Il prodotto è purificato per cromatografia (Si02, eluente CH2CI2/CH3OH 98:2), e cristallizzato da cloruro di metilene. Cristalli gialli; resa 40%; p. f. 224 °C; MS (APCI): m/z 469.0, 471.0.<1>H NMR (DMSO -d6, 300 MHz) δ 1.47 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 3.43 (sep, J = 6.9 Hz, 1H), 7.34 (dt, J = 8.2, 1.5 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.9Hz, 1H), 8.20-8.23 (m, 2H), 8.68 (s, 1H), 8.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 10.01 (s, 1H), 11.33 (brs, 1 H).
Esempio 9:
Preparazione del composto fenil 2-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-ilammino)-2-oxoetiDcarbammato (18a)
A partire da 6-ammino-4-(3-bromoanilino)chinazolina (5a) e acido (17), seguendo la procedura indicata nell'esempio 6 è stato ottenuto il prodotto del titolo, il quale è stato purificato mediante cromatografia (S1O2, eluente acetato di etile), e cristallizzato da etanolo/acqua. Il prodotto si presentava come solido bianco; resa 55 %; p. f. . >250 °C (dee,); MS (APCI): m/z 492.1.<1>H NMR (DMSO-c/6, 300 MHz): δ 4.20 (s, 2H), 6.73-6.78 (m, 3H), 7.15 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 7.32 (dt, J = 8.1, 1.6 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.82-7.93 (m, 3H), 8.21 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.57 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.70 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.98 (b s, 1H).
Esempio 10:
Preparazione del composto A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-(dimetilammino)propionammide (21 a)
a) Preparazione del composto A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-iD-3-cloropropanammide (20a)
Una sospensione di ammina (5) (300 mg, 0.95 mmol) e 3-cloropropionil cloruro (3 mL, 31.28 mmol) è stata scaldata a reflusso ed agitata per 16 ore. Dopo aver raffreddato a temperatura ambiente, il solido è stato raccolto per filtrazione, lavato con etere etilico ed asciugato sotto vuoto. Il prodotto è stato poi purificato mediante cromatografia (Si02, eluente CH2CI2/CH3OH da 98:2 a 95:5). E’ stato ottenuto un solido giallo chiaro; resa 80 %; MS (APCI): m/z 409.3, 407.4.<1>H NMR (CDCI3, 300 MHz): δ 2.96 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.95 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 7.31-7.33 (m, 2H), 7.78 (m, 3H), 8.14 (s, 1 H), 8.55 (s, 1 H), 8.72 (s, 1 H).
b)Preparazione del composto A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-(dimetilammino)propanammide (21 a)
Dimetilammina (1.6 mL di una soluzione al 33 % v/v in EtOH assoluto) è stata aggiunta in 15 min ad una sospensione di 3-cloropropionammide (20a) (290 mg, 0.714 mmol) e Nal (75 mg, 0.5 mmol) in 20 mL di EtOH assoluto agitata a reflusso. Dopo 8 ore a reflusso, la miscela di reazione è stata raffreddata a 0 °C, basificata per aggiunta di KOH (1.48 g, 26.42 mmol), agitata a 0 °C per 1 ora, ed il solvente evaporato per distillazione a pressione ridotta. II solido è stato poi estratto con acetato di etile, la fase organica lavata con salamoia, anidrificata (Na2S04) ed il solvente distillato a pressione ridotta. Il prodotto è stato purificato per cromatografia (S1O2, eluente CH2CI2/CH3OH da 100:0 a 70:30), e cristallizzato da acetato di etile/esano. E’ stato ottenuto un prodotto solido giallo; resa 86 %; p. f.
172 °C; MS (APCI): m/z 414.4, 416.4.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 2.35, (s, 6H), 2.65 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 7.29-7.31 (m, 2H), 7.74 (m, 3 H), 8.12 (b s, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.66 (b s, 1 H).
Esempio di inibizione
Sono stati impiegati per la prova di inibizione i seguenti composti:
Preparazione dei composti. Il composti 7a, 9c e 21 a sono stati preparati rispettivamente negli esempi 1 ,5,10. Come derivati noti sono stati impiegati i composti 5a, PD168393 e gefitinib che sono stati sintetizzati come descritto in letteratura. Per tutti i saggi, i composti sono stati sciolti in DMSO alla concentrazione di 10 mM e successivamente diluiti nel mezzo di coltura per ottenere concentrazioni finali di DMSO sempre inferiori a 0.1% (v/v). I campioni di controllo sono trattati con una quantità uguale di DMSO.
Colture cellulari. Le linee cellulari di carcinoma umano A431 (cervice uterina) e H1975 (carcinoma polmonare) sono state coltivate, rispettivamente, in D-MEM (Dulbecco’s modified Minimum Essential Medium) 4.5 g/l di glucosio, e RPMI, completati con 10% di siero di vitello fetale (FCS) e addizionati di antibiotici Penicillina (100 Ul/ml) e Streptomicina (100 pg/ml). Le cellule A431 esprimono elevati livelli di EGFR non mutato, mentre le cellule H1975 presentano la mutazione T790M nella porzione intracellulare del recettore, responsabile della diminuita sensibilità al trattamento con gefitinib. Le colture sono state mantenute in termostato a 37°C in aria satura di vapore acqueo ed arricchita con il 5% di CO2.
Test di inibizione deirautofosforilazione. L’inibizione deH’autofosforilazione di EGFR ad erbB2 in cellule intere A431 e H1975 è stata determinata utilizzando specifici anticorpi anti-tirosina fosforilata mediante tecnica Western blot. Le cellule sono state incubate 1 h con le concentrazioni indicate di inibitore, prima di essere stimolate con EGF (0.1 pg/ml) per 5 min. Aliquote uguali di iisato cellulare sono state analizzate mediante Western blot utilizzando anticorpi specifici anti-tirosina fosforilata (Cavazzoni, A.; Petronini, P.G.; Gaietti, M.; Roz, L; Andriani, F.; Carbognani, P.; Rusca, M.; Fumarola, C.; Alfieri, R.; Sozzi, G. Dose-dependent effect of FHIT-inducible expression in Calu-1 lung cancer celi line. Oncogene 2004, 23, 8439-46). Per valutare l’effetto irreversibile, un secondo set di cellule è stato incubato 1 h con le concentrazioni indicate di composto, successivamente l’inibitore è stato rimosso dal mezzo e le cellule sono sottoposte ad una serie di lavaggi per 8 h prima di essere stimolate con EGFR (0.1 pg/ml) per 5 min. Le cellule sono state poi analizzate mediante Western blot, come descritto in precedenza.
Test di inibizione della proliferazione cellulare. La vitalità delle colture cellulari è stata saggiata mediante l'utilizzo del saggio di vitalità MTT (bromuro di 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-difeniltetrazolio in formazano; Sigma, Dorset, UK), come precedentemente descritto (Cavazzoni, A.; Petronini, P.G.; Gaietti, M.; Roz, L.; Andriani, F.; Carbognani, P.; Rusca, M.; Fumarola, C.; Alfieri, R.; Sozzi, G. Dosedependent effect of FHIT-inducible expression in Calu-1 lung cancer celi line. Oncogene 2004, 23, 8439-46), dopo che le cellule sono state incubate 72 h con le concentrazioni indicate di composto.
I composti oggetto della presente invenzione hanno mostrato attività inibitoria suH’autofosforilazione di EGFR, sia su una linea cellulare sensibile al trattamento con gefitib (cellule A431) che su una linea cellulare resistente al trattamento con gefitinib (cellule H1975). Inoltre, i composti dell’invenzione hanno mostrato attività antiproliferativa nei modelli considerati. Infine, nel modello di tumore polmonare utilizzato, i composti dell’invenzione hanno mostrato attività inibitoria sull’autofosforilazione di erbB2. A titolo di esempio, i risultati ottenuti per alcuni composti oggetto della presente invenzione sono riportati nella Tabella 1 e nelle Figure 2-4. I risultati sono stati onfrontati con quelli ottenuti per i composti di riferimento 5a e PD168393 negli stessi saggi.
Tabella 1: Valori di IC50(μΜ) di inibizione dell’autofosforilazione di EGFR e della proliferazione di cellule A431 e H1975.
<a>Concentrazione che inibisce il 50% 'attività di autofosforilazione di EGFR in cellule A431 incubate 1 h con varie concentrazioni di composto e, immediatamente dopo, stimolate con EGF.
<b>Concentrazione che inibisce il 50% dell’attività di autofosforilazione di EGFR in cellule A431 incubate 1 h con varie concentrazioni di composto e stimolate con EGF dopo 8 h dalla rimozione deN’inibitore dal mezzo.
<c>Concentrazione che inibisce del 50% la proliferazione di cellule A431. La proliferazione cellulare è determinata mediante il saggio di vitalità MTT dopo trattamento per 72 h con concentrazioni di composto comprese tra 0.01 e 10 μΜ.<d>Concentrazione che inibisce del 50% la proliferazione di cellule H1973. La proliferazione cellulare è determinata mediante il saggio di vitalità MTT dopo trattamento per 72 h con concentrazioni di composto tra 0.01 e 20 μΜ.
L’effetto del composto 7a suH’autofosforilazione di EGFR in cellule A431 è stato riportato in Figura 2. Quando le cellule sono trattate con le concentrazioni riportate di composto 7a per 1 h e successivamente sono state stimolate con EGF, si otteneva una inibizione dose-dipendente deH'autofosforilazione di EGFR con IC5014 nM (Figura 2a e Tabella 1 ). A dimostrazione dell’effetto irreversibile, quando le cellule A431 sono state incubate 1 h con il composto 7a e successivamente sottoposte a lavaggi per 8 h, prima di essere stimolare con EGF, si otteneva una inibizione dose-dipendente deN’autofosforilazione di EGFR con IC50168 nM (Figura 2b e Tabella 1). I risultati ottenuti erano confrontabili a quelli del derivato acrilammidico PD1 68393 ottenuti nelle stesse condizioni (Tabella 1).
Il composto 7a presentava attività antiproliferativa su cellule A431 con una IC50di 1.97 μΜ (Tabella 1). Il composto 7a aveva anche mostrato attività inibitoria sulla proliferazione di cellule H1975 con IC506.76 μΜ (Figura 3 e Tabella 1). Infine, nel modello H1975, 7a inibiva EGFR ed erbB2 (Figura 4) dimostrandosi capace di superare la resistenza che tale linea cellulare sviluppa verso gefitinib.
Claims (17)
- RIVENDICAZIONI 1. Un derivato di 4-anilinochinazolina di formula (A)in cui X rappresenta idrogeno, bromo, cloro, fluoro, etinile oppure metile; A è un residuo scelto dal gruppo consistente in i)in cui Y rappresenta -CO- oppure -CHR-i-; Z rappresenta -OR2, -SR2oppure -NR2R3; R-i,R2e R3rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno, (C-i. 6)alchile, (CH2)n-COOR4, (CH2)n-CONR4R5, (CH2)n-NR4R5oppure (CH2)n-morfolina; R4e R5rappresentano, indipendentemente, idrogeno oppure (C1-6)alchile; n può essere un numero intero scelto tra 0, 1 , 2, 3, 4, 5, e 6. ii)in cui R6rappresenta idrogeno oppure (Ci-6)alchile; R7, Re. R91R10e Rn rappresentano, indipendentemente l’uno dall'altro, idrogeno, cloro, fluoro, il radicale CF3, -N02oppure -ORI2; RI2rappresenta idrogeno, (C1-6)alchile, (CH2)n-COORi3, (CH2)n-CONR13R14, (CH2)n-NRi3R14oppure (CH2)n-morfolina; RI3e R14rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C-i. 6)alchile; e n è un numero intero scelto tra 0, 1 , 2, 3, 4, 5, e 6. iii)in cui Ri5>rappresenta idrogeno, (C1-6)alchile, (CH2)n-COOR18, (CH2)n-CONRi8Ri9, (CH2)n-NRi8Ri9oppure (CH2)n-morfolina; R161RI7, Rie e R19rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C1-6)alchile; iv)R6rappresenta idrogeno oppure (C1-6)alchile; W rappresenta -C= oppure -N=; R2o, R21. R22 e R23rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno, cloro, fluoro, il radicale -CF3, -N02, (Ci-6)alchile. v)in cui R24rappresenta (C1-6)alchile, (CH2)n-COOR25, (CH2)n-CONR25R26l(CH2)n-NR25R26oppure (CH2)n-morfolina; R25e R26rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (C-i- 6)alchile; vi)in cui R6 rappresenta idrogeno oppure (Ci_6)alchile; Q rappresenta un gruppo arilico oppure eteroarilico, facoltativamente sostituiti con uno 0 più sostituenti scelti, indipendentemente l’uno dall’altro, tra idrogeno, cloro, fluoro, il radicale CF3, -N02oppure -OR-I2; RI2rappresenta idrogeno, (Ci-6)alchile, (CH2)n-COORi3, (CH2)n-CONRi3R-i4, (CH2)n-NRi3Ri4 oppure (CH2)n-morfolina; RI3e R14 rappresentano, indipendentemente l’uno dall’altro, idrogeno oppure (Ci. 6)alchile; e n è un numero intero scelto tra 0, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. vii)R27e R28possono rappresentare idrogeno oppure (C1-6)alchile; -NR28R2gpuò essere morfolina.
- 2. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente i), ossia un derivato di Formula (I), Formula (I) in cui: X, Y e Z hanno il significato indicato per la formula (A).
- 3. Il derivato di 4-anilinochinazoIina di rivendicazione 1 , che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente ii), ossia un derivato di di Formula (II)Formula (II) in cui X, R6,R7, R8, Rg, R-10e R-n hanno il significato indicato in formula (A).
- 4. Il derivato di 4-anilinochinazoIina di rivendicazione 1 , che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente iii), ossia un derivato di Formula (III) Formula (III) in cui X, R15, R-16, R17, R-ιβ e R-ig hanno il significato indicato in formula (A).
- 5. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1 , che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente iv), ossia un derivato di di Formula (IV) Formula (IV) in cui X, R6,W, R2O, R21, R22 e R23 hanno il significato indicato in formula (A).
- 6. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente v), ossia un derivato di di Formula (V) Formula (V) in cui X , R24,l3⁄45 e R26hanno il significato indicato in formula (A).
- 7. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente vi), ossia un derivato di di Formula (VI) Formula (VI) in cui X, R6,Q hanno il significato indicato in formula (A).
- 8. Il derivato di 4-anilinochinazoIina di rivendicazione 1, che è un composto in cui il sostituente (A) è il sostituente vii), ossia un derivato di di Formula (VII)Formula (VII) in cui X, R6,R27 e R28 hanno il significato indicato in formula (A).
- 9. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, che è è un composto in cui il sostituente A è scelto dal gruppo consistente in: vii)
- 10. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 9, in cui il sostituente A è il sostituente i).
- 11. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 10 che è il composto estere etilico dell’acido trans-(2RI3R)-3-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il-carbamoil)-2,3-epossibutirrico.
- 12. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, che è un composto scelto dal gruppo consistente in: - estere etilico dell’acido trans-(2R,3R)-3-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-ilcarbamoil)-2,3-epossibutirrico (7a); - estere etilico dell’acido trans-(2S,3S)-3-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-ilcarbamoil)-2,3-epossibutirrico (7b); - N-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-fenossiacetammide (9a); - N-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(4-fluorofenossi)acetammide (9b) - N-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(2,3,4,5,6-pentafluorofenossi)acetammide (9c); - N-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-2-(3-oxoisotiazol-2(3H)-il)acetammide (12a) -N-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-iyl)-2-(3-oxo-1,2-benzoisotiazolin-2(3H)-il)acetamide (14a): - N-(4-(3-Bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-isopropil-1,2,4-tiadiazol-5-carbossammide (16a); - fenil 2-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-ilammino)-2-oxoetil)carbammato (18a): - A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-(dimetilammino)propionammide (21 a); - A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-cloropropanammide (20a) - A/-(4-(3-bromoanilino)chinazolin-6-il)-3-(dimetilammino)propanammide (21 a).
- 13. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, in cui (Ci-6)alchile è un alchile scelto dal gruppo consistente in metile, etile, propile, isopropile, n-butile, sec-butile, iso-butile e tert-butile, n-pentile, n-esile. 14. Il derivato di 4-anilinochinazolina di rivendicazione 1, in cui R4,R5; R13,R14;, Ri8>Ri9'. R25.R26 nella formula (A) oppure il frammento (CH2)ndel sostituente (CH2)n-morfolina rappresentano catene alchiliche lineari metileniche, etileniche, propileniche, butileniche, pentileniche, oppure esileniche.
- 14. Un derivato di 4-anilinochinazolina di formula (A) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 per l’uso come medicamento.
- 15. Impiego di un derivato di 4-anilinochinazolina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, per la fabbricazione di un medicamento per il trattamento e la prevenzione di patologie nelle quali sia presente un’alterazione nel funzionamento di recettori ad attività tirosin-chinasica della famiglia di EGFR.
- 16. Impiego secondo la rivendicazione 15, in cui le patologie nelle quali sia presente un’alterazione nel funzionamento di recettori ad attività tirosin-chinasica della famiglia di EGFR sono forme tumorali di origine epiteliale.
- 17. Impiego secondo la rivendicazione 15, in cui la patologia è scelta dal gruppo consistente in papilloma, blastoglioma, sarcoma di Kaposi, melanoma, tumore polmonare, tumore ovarico, tumore della prostata, tumore al seno, astrocitoma, tumore del pancreas, tumore gastrico, carcinoma epatocellulare, leucemia e linfoma.
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