ITMI20060366A1 - Composti organo tiopirosfosfati metodo per prepararli e composizioni che li contengono - Google Patents

Composti organo tiopirosfosfati metodo per prepararli e composizioni che li contengono Download PDF

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ITMI20060366A1
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carbon atoms
cat
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IT000366A
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Francesca Angeli
Perla Breccia
Vittorio Colizzi
Mario Pinza
Fabrizio Poccia
Alessandra Topai
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C4T S C A R L
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
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    • C07F9/16—Esters of thiophosphoric acids or thiophosphorous acids
    • C07F9/165—Esters of thiophosphoric acids
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Description

DESCRIZIONE
Della Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal Titolo:
“Composti organo tiopirofosfati, metodo per prepararli e composizioni che li contengono”
Campo Tecnico
La presente invenzione riguarda un composto organo tiopirofosfato, un metodo per prepararlo ed una composizione che lo contiene.
Più in particolare, l’organo tiopirofosfato della presente invenzione è dotato di attività attivante su linfociti T γδ.
Sfondo dell’Invenzione
È noto che alcuni composti organici dell'acido pirofosforico, sia naturali che di sintesi, sono dotati di attività attivante sui linfociti T γ9δ2 (Fournié et al., Microbes and Infection 2001, 3, 645-654). Grazie a tale attività essi sono utili per il trattamento di disordini immunologici ed allergici (asma, morbo di Crohn, sclerosi multipla) (Bendelac et al., Nat. Rev. Immunol. 2001, 1, 177-185) nonché di malattie infettive (Wang et al., J. din. Invest. 2001, 108, 1349-1357) e tumori (Girardi et al., Science 2001, 294, 605-609; Sicard et al., Mol Med. 2001, 7, 711-722).
Inoltre U.S. 5,639,653 descrive l’uso di composti di formula
ROPO(OH)OP(OH)2
dove
R è alchile lineare o ramificato avente da 1 a 4 atomi di carbonio, o alchenile lineare o ramificato avente da 2 a 20 atomi di carbonio,
per stimolare la proliferazione in mammiferi di cellule T Vy2Vδ2 e, in particolare, per il trattamento di linfomi, leucemia, lebbra, malaria, AIDS, artrite reumatoide, colite ulcerosa ed anemia.
È altresì noto che altri composti organici dell’acido pirofosforico, sia naturali che di sintesi, si comportano da attivanti dei linfociti T γδ Un esempio di tali composti naturali è il pirofosfato di isopentenile (IPP) (“ Isopentenyl Pyrophosphate, a Mycobacterìal Non-peptidic Antigen, Trìggers Delayed and Highly Sustained Signaling in Human γδ T Lymphocytes without Inducing Down-modulation of T Celi Antigen Receptor " Lafont V. et al,. J. Biol. Chem.
2001, 276, 15961-15967) mentre, tra i composti di sintesi finora noti, i più attivi sembrano essere le fosfoalodrine in U.S. 6,660,723B1 e da Espinosa E. et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 18337-18344).
Le formule dell’IPP e di dette fosfoalodrine sono le seguenti:
Tra i fosfoantigeni naturali, identificati dapprima negli estratti di Mycobacterium tuberculosis, il composto (E)-4-idrossi-3-metil-2-butenil pirofosfato, (intermedio della via metabolica di Rohmer alternativa al mevalonato) estratto da E.coli è ad oggi il più attivo stimolante delle cellule γ9δ2 (Hintz, M. et al., Febs. Lett. 2001, 509, 317-322).
A seguito di studi di relazione struttura-attività di una classe di prodotti dotati di attività attivante dei linfociti T γδ è stato riportato che è necessaria la presenza di due porzioni molecolari: una catena alchenilica ed un gruppo pirofosfonico.
La catena alchenilica associata al gruppo pirofosfato che mostra proprietà attivante sui linfociti T γδ può possedere un numero di atomi di carbonio compreso fra 3 e 5 ed un doppio legame in posizione 2 o 3 (Morita C. et al., J. Immunol. 2001, 167, 36-41).
In ulteriori studi è stato osservato un aumento di attività dovuto all’addizione di una aloidrina in posizione C3 o sostituendo il doppio legame fra C3 e C4 con un gruppo carbonilico in posizione C4 (Belmant, C. et al. FASEB J., 2000, 14, 1669-1670). In tali studi è stato evidenziato che è anche necessaria la presenza di un legame fosfodiestere idrolizzabile (Belmant, C. et al. FASEB J., 2000, 14, 1669-1670).
Dopo incubazione di composti attivanti con cellule T γδ è stata rilevata la produzione di una molecola di fosfato libero.
Inoltre, in letteratura sono stati riportati dati discordanti circa l’attività di composti bisfosfonati in cui è presente la sequenza di legame P-CH2-P in luogo della sequenza P-O-P. Infatti, secondo alcuni autori la sostituzione della sequenza P-O-P con la sequenza P-CH2-P comporta una drastica riduzione della capacità di attivare i linfociti T γ9δ2 (Bioorg. & Med. Chem. Lett.
13, (2003) 1257-1260. Al contrario, secondo altri autori i composti aventi la sequenza P-CH2-P si comportano da inibitori dei linfociti T γ9δ2 (Belmant et al., U.S. 6,624,151 B1).
attivatori inibitori o attivatori molto deboli Anche la presenza della sequenza C-O-P è stata oggetto di studio per la limitata stabilità metabolica, cruciale per eventuali applicazioni cliniche in immunoterapia; recentemente sono state studiate modificazioni strutturali in cui, in luogo della sequenza C-O-P, è presente la sequenza C-C-P (Zgani, I. et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 4600-4612) ottenendo dei composti in cui il tempo di vita medio aumenta e si conserva la corrispondente attività del metabolita.
attivatori attivatori migliori
Infine, in letteratura sono noti anche alcuni composti di tipo tiopirofosfato, che presentano la sequenza C-S-P in luogo dalla sequenza C-O-P, analoghi dell’isopentenile pirofosfato e derivati (geranil, farnesil pirofosfati) ma di essi è stata valutata solo l’attività come inibitori/substrati dell’enzima farnesil/geranil/undecaprenil pirofosfato sintetasi (Phan, R.M.; Poulter, D. J. Org. Chem.
2001, 66, 6705-6710). In tali esperimenti la presenza di un gruppo tiopirofosfato in luogo di un gruppo pirofosfato trasforma i substrati (FPP in FsPP) in inibitori (Chen et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 7369-7376) .
Peraltro, in letteratura è stato anche riportato che la conversione del geranilpirofosfato nel corrispondente tiopirofosfato conferisce un’attività inibente della famesilpirofosfato sintasi (FFPase) di cui è substrato naturale (Dale Poulter et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4895; Organic Letters 2000, 15, 2287).
Per tali tioderivati non risulta essere mai stata valutata l'attività antigenica sui linfociti T γδ.
Pertanto, non essendo ancora note le basi del meccanismo molecolare del riconoscimento fosfoantigene-TCR γδ e non essendo ancora stato provato che tale riconoscimento diretto sia realmente responsabile dell'attivazione, la persona esperta del ramo non dispone ancora di alcun strumento per prevedere quale influenza potranno avere le variazioni della struttura dei fosfoantigeni naturali sulla funzionalità dei linfociti T γδ.
Ora è stata sorprendentemente trovata una classe di tiopirofosfati chimicamente più stabili dei corrispondenti pirofosfati e che sono dotati di attività attivante su linfociti T γδ.
Descrizione dell’Invenzione
Un primo oggetto della presente invenzione è costituito da un composto di formula generale (I):
(l) in cui
X è un atomo di ossigeno, un atomo di zolfo od un legame covalente, n è zero quando X è un legame covalente ed è 1 , 2 o 3 quando X è O o S, R è (i) un gruppo alifatico, lineare o ramificato, saturo od insaturo, avente da 1 a 9 atomi di carbonio, in cui un atomo di idrogeno è eventualmente sostituito con un atomo di alogeno, un gruppo ossidrilico, un gruppo nitrile, un gruppo cicloalchilico avente da 3 a 6 atomi di carbonio, un gruppo arilico od un gruppo eterociclico, od
(ii) un gruppo eterociclico, e
Cat<+>è un catione organico od inorganico fisiologicamente accettabile.
Significati preferiti di alogeno sono cloro e fluoro.
Significati preferiti di arile sono benzene e piridina.
Significati preferiti di eterociclo sono ossetano, diossolano e tetraidropirano.
Tipici esempi di cationi inorganici sono ammonio, i metalli alcalini ed i metalli alcalino-terrosi. Significati preferiti di cationi inorganici sono NH4<+>, Na<+>e K<+>.
Tipici esempi di cationi organici sono lisina, arginina, trometamina, idrossietilpirrolidina, trietanolammina ed N-metilglucamina
I composti di formula (I) secondo la presente invenzione attivano i linfociti T γδ con potenza almeno paragonabile a quella dei fosfoantigeni naturali. Essi, inoltre, presentano il vantaggio di essere notevolmete più stabili verso l'idrolisi enzimatica dei fosfoantigeni naturali.
Tale stabilità è stata dimostrata in un esperimento in cui è stata analizzata nel tempo la concentrazione di un composto IPP (isopentenil pirofosfato) ed il Composto 8 della presente invenzione (isopentenil tiopirofosfato) in soluzioni tamponate in presenza di fosfatasi alcalina (Esempio 17).
Ciò rende i composti di formula I della presente invenzione metabolicamente più stabili e conferisce loro importanti vantaggi terapeutici.
Un secondo oggetto della presente Invenzione è costituito da un metodo per preparare un composto di formula (I), in cui n, X, R e Cat<+>hanno i significati indicati più sopra, caratterizzato dal fatto che un alcool di formula (II)
R-X-(CH2)n-OH
(II) in cui n, X ed R hanno i significati indicati più sopra,
viene fatto reagire in fase solida con un tiopirofosfato di formula (III)
(III) in cui Cat<+>ha i significati indicati più sopra.
Preferibilmente Cat<+>è un catione capace di solubilizzare il composto (III) in solventi organici.
Tipicamente, Cat<+>è un gruppo tetraalchil ammonio di formula (R”)4N<+>dove R” è un alchile avente da 1 a 5 atomi di carbonio.
Un significato preferito di R” è butile.
Il composto di formula (III) può essere preparato secondo metodi noti quali, ad esempio, il procedimento descritto da Poulter D.C. e Phan R.M. ( Orga -nic Letters 2000, 2, 2287-2289) che porta al composto desiderato in 4 fasi come indicato nel seguente Schema 1 :
Schema 1
Preferibilmente, il supporto solido utilizzato per realizzare la reazione in fase solida secondo la presente invenzione è polistirene benzen solfonil cloruro (PS-TsCI) a bassa capacità di carico (1,3 mmol/g).
Preferibilmente, gli equivalenti di alcool di formula (II) che vengono legati al supporto solido secondo il metodo della presente invenzione variano da 1 a 5 a seconda della natura del gruppo R.
In una forma di realizzazione preferita, il carico di alcool di formula (II) sul supporto solido viene effettuato in diclorometano in presenza di piridina o dimetilammino piridina.
Vantaggiosamente, il tempo di reazione dell’alcool di formula (II) con il supporto solido varia da 24 a 48 ore. Tipicamente, l’andamento di tale reazione viene controllato qualitativamente con il test del blu di bromofenolo secondo il quale si preleva una piccola quantità di resina ed a questa viene aggiunto 1,2-diamminoetano (soluzione al 5% in dimetilformammide) che si lega ai siti della resina che non hanno già reagito. Poi, la resina viene lavata e fatta reagire con una soluzione di blu di bromofenolo che reagisce con i gruppi amminici. La colorazione blu delle perline di resina indica, quindi, che il carico dell’alcool di formula (II) non è completo ed indica che deve essere caricato altro alcool di formula (II).
Al termine della reazione, l'eccesso di reagenti viene allontanato per filtrazione e successivi lavaggi. Vantaggiosamente, tali lavaggi vengono effettuati utilizzando, in successione, diclorometano, dimetilformammide, tetraidrofurano/acqua 3:1 e, infine, tetraidrofurano.
Al supporto solido, al quale è stato così legato l’alcool di formula (II), viene aggiunta una soluzione di tiopirofosfato di formula (III).
In una forma di realizzazione preferita, il solvente è acetonitrile.
Vantaggiosamente, la quantità di tiopirofosfato di formula (III) che viene aggiunta al supporto solido al quale è stato legato l’alcool di formula (II) varia da 0,8 ad 1 equivalente.
Tipicamente, questa fase di reazione viene condotta sotto agitazione per un tempo di circa 24 ore a temperatura ambiente.
Al termine della reazione, si raccoglie il filtrato e si converte il prodotto così ottenuto nel sale di ammonio o di sodio utilizzando una resina a scambio ionico (DOWEX® 50-WX8-200) opportunatamente preparata (forma NH4<+>o Na<+>).
I prodotti così ottenuti vengono analizzati per LC-MS (ESI negativo o positivo) ed eventualmente purificati per precipitazione e/o cromatografia su colonna di cellulosa.
In alternativa alla sintesi in fase solida, i composti di formula (I) secondo la presente invenzione possono anche essere preparati in soluzione (vedansi Esempi 7, 8 e 10-16) in modo analogo a quanto descritto da Poulter (J. Org. Chem. 2001, 66, 6705-6710).
I prodotti così ottenuti sono, però, meno puri di quelli ottenuti in fase solida e richiedono ulteriori purificazioni.
Un terzo oggetto della presente invenzione è costituito da una composizione farmaceutica comprendente un composto di formula (I) secondo la presente invenzione ed almeno un veicolo fisiologicamente accettabile.
È riportato in letteratura che i linfociti T γδ mostrano un’attività citotossica in risposta a cellule infettate dal virus HIV (Poccia F. et al., J. Immunol. 159, 6009-6017; Wallace M. et al., Clin. Exp. Immunol., 103, 177-184; Poccia F. et al., J. Infect. Dis. 180, 858-861; Agerberth B. et al., Blood 963086-3093) e mostrano un’attività killer verso il mycobacterium tubercolosi (Dieli F. et al., J. Infect. Dis. 184, 1082-1085; Dieli F. et al., Eur. J. Immunol. 30, 1512-1519) e verso una vasta gamma di mielomi e linfomi (Wihelmm M. et al. Blood 102, 200-206; Kunzmann V. et al., Blood 96, 384-392; Fisch P. et al., Eur. J. Immunol. 27, 3368-3379; Sicard H. T. et al., Mol. Med. 7, 711-722).
Tipici esempi di stati patologici che possono trarre giovamento dal trattamento con una composizione farmaceutica secondo la presente invenzione sono, quindi, le infezioni da virus HIV, le infezioni da mycobacterium tubercolosi, i mielomi, i linfomi ed alcune forme tumorali come il carcinoma renale (Viey E. et al., J. Immunol. 174 (2005) 1338-1347).
Preferibilmente, le composizioni farmaceutiche della presente invenzione vengono preparate sotto forma di adatte forme di dosaggio comprendenti una dose efficace di almeno un composto di formula I ed almeno un ingrediente inerte fisiologicamente accettabile adatte per somministrazione orale, rettale, topica, endovenosa, subcutanea, intramuscolare o intraperitoneale.
Esempi di adatte forme di dosaggio sono le compresse, le capsule, le compresse rivestite, i granuli, le soluzioni e gli sciroppi per somministrazione orale; le creme, gli unguenti ed i cerotti medicati per somministrazione topica; le supposte per somministrazione rettale e le soluzioni sterili per somministrazione per via iniettabile, aerosolica od oftalmica.
Le forme di dosaggio possono anche contenere altri ingredienti tradizionali come: conservanti stabilizzanti, tensioattivi, tamponi, sali per regolare la pressione osmotica, emulsionanti, dolcificanti, coloranti, aromi e simili.
Se richiesto da particolari terapie, la composizione farmaceutica della presente invenzione può contenere altri ingredienti farmacologicamente attivi la cui somministrazione contemporanea sia utile.
La quantità di composto di formula I nella composizione farmaceutica della presente invenzione può variare entro un ampio intervallo in funzione di fattori noti come, per esempio, il tipo di malattia da trattare, la severità della malattia, il peso corporeo del paziente, la forma di dosaggio, la via di somministrazione prescelta, il numero di somministrazioni giornaliere e l'efficacia del composto di formula I prescelto. Tuttavia, la quantità ottimale può essere determinata dal tecnico del ramo in modo facile e routinario.
Tipicamente, la quantità di composto di formula I nella composizione farmaceutica della presente invenzione sarà tale da assicurare un livello di somministrazione compreso fra 1 e 500 mg/Kg/giorno.
Le forme di dosaggio della composizione farmaceutica della presente invenzione possono essere preparate secondo tecniche ben note al chimico farmaceutico che comprendono la miscelazione, la granulazione, la compressione, la dissoluzione, la sterilizzazione e simili.
Un quarto oggetto della presente invenzione è costituito da un metodo per attivare linfociti T γδ di un mammifero comprendente il contatto di detti linfociti con una quantità efficace di un composto di formula I.
Tipicamente, detto metodo viene utilizzato per il trattamento di pazienti umani affetti da infezioni da virus HIV, infezioni da mycobacterìum tubercolosis, mielomi, linfomi ed alcune forme tumorali come il carcinoma renale.
Vantaggiosamente detto metodo comprende il prelievo di una adatta quantità di sangue periferico da un paziente, il contatto di detto sangue con un composto di formula I secondo la presente invenzione per un tempo sufficiente a stimolare la proliferazione ex vivo di linfociti T γδ, la raccolta delle cellule T γδ così trattate e la loro somministrate al paziente per via endovenosa.
Parte Sperimentale
Gli esempi che seguono descrivono la preparazione di alcuni composti di formula I della presente invenzione (Esempi 1-16) ed i risultati delle prove di confronto (i) della stabilità verso l'idrolisi enzimatica (Esempio 17) e (ii) delle proprietà biologiche dei composti di formula I della presente invenzione rispetto all’attivante di linfociti T γδ naturale più rappresentativo (IPP) (Esempio 18).
Le caratterizzazioni analitiche dei composti sono state effettuate con un sistema HPLC-MS Nebula (Gilson-Thermofinnegan) utilizzando una colonna Synergy Polar RP (150 x 4.6; Phenomenex) o ODS3 (150 x 4.6; GL Science) e attraverso la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (<1>H-NMR). Gli spettri<1>H-NMR sono stati registrati con uno strumento Bruker Avance 300 MHz.
Esempio 1
S-(4-clorobutil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 1
A 114 mg (0,165 mmol) di resina PS-TsCI (1,47 mmol/g) rigonfiata in THF, sono stati aggiunti 27 mg di 4-clorobutanolo (0,248 mmol) in 0,6 mi di diclorometano-piridina (1:1).
La miscela reazione è stata lasciata sotto agitazione per 24 ore e, dopo filtrazione del reagente in eccesso, la resina è stata lavata in successione con diclorometano (3 x 1 mi), dimetilformammide (3 x 1 mi), tetraidrofurano/acqua 3:1 (3 x 1 mi) e tetraidrofurano (3 x 1 mi). Su tale resina è stato effettuato il test del blu di bromofenolo fino a scomparsa del colore blu della resina.
Dopo di ché la resina è stata rigonfiata in THF ed è stato aggiunto tiopirofosfato di tetrabutilammonio (152 mg, 0,165 mmol) disciolto in acetonitrile (0,6 mi). La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione per 24 ore. Poi la miscela di reazione è stata filtrata, ed il filtrato, contenente il prodotto, è stato passato su una resina DOWEX® (NH4<+>) per la conversione del sale di tetrabutilammonio in sale di ammonio eluendo con una miscela di 25 mMol di NH4HCO3al 2% in isopropanolo (iPrOH).
Il prodotto, ottenuto per liofilizzazione dell’eluato, è stato purificato da eventuali monotiofosfati e tiopirofosfati inorganici, precipitando tali impurezze con una miscela iPr0H:CH3CN:NH4HC03(0,1 M) (4, 5:2, 5:3). Dopo centrifugazione, è stato raccolto il surnatante che è stato nuovamente liofilizzato.
Per completare la purificazione, il prodotto ottenuto dalla liofilizzazione è stato ulteriormente purificato per cromatografia su cellulosa utilizzando come eluente isocratico una miscela di iPr0H:CH3CN:NH4HC03(0,1 M) (4, 5:2, 5:3).
Dopo liofilizzazione il prodotto (32 mg, resa: 61%) è stato caratterizzato per analisi LC-MS ed<1>H-NMR.
Analisi (ESI ) = 283,2 (M-1).
<1>H-NMR (300 MHz, D20): δ (ppm) 3,70 (2H, m), 2,92-2,85 (2H, m), 2,01-1,80 (4H, m).
Esempio 2
S-[2-(2-cloroetossi)etil] estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 2
Lavorando in modo analogo a quanto descritto nell’Esempio 1, a 116 mg (0,170 mmol) di resina PS-TsCI (1,45 mmol/g) in tetraidrofurano (THF) sono stati aggiunti 90 μΙ di 2-(2-cloroetossi)etanolo (0,850 mmol) in 0,6 mi di diciorometano (DCM)-piridina (1:1).
La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione per 24 ore e, dopo filtrazione dell’eccesso di reagente, la resina è stata lavata in successione con DCM (3 x 1 mi), dimetilformammide (DMF) (3 x 1 mi), THF/acqua 3:1 (3 x 1 mi), THF (3 x 1 mi).
Tale resina, dopo il test del blu di bromofenolo positivo, è stata rigonfiata in THF e poi è stato aggiunto tiopirofosfato di tetrabutilammonio (155 mg, 0,17 mmol) disciolto in acetonitrile (0,6 mi).
Dopo 24 ore la miscela di reazione è stata filtrata ed il filtrato è stato passato su resina DOWEX® (forma NH4<+>) per la conversione in sale di ammonio (eluente 25 mM di NH4HCO3al 2% in iPrOH). Dopo liofilizzazione, il prodotto ottenuto è stato purificato da eventuali monotiofosfati e tiopirofosfati inorganici precipitandoli con una miscela di iPrOH:CH3CN:NH4HCO3(0,1 M) (4,5: 2,5: 3).
Analisi (ESI ) = 299,1 (M-1).
1H-NMR (300 MHz, D20): δ (ppm) 4,05-3,95 (4H, m), 3,92-3,84 (2H, m), 3,24-3,12 (2H, m).
Esempio 3
S-(2-ciclopropiletil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 3
Lavorando in modo analogo a quanto descritto nell’Esempio 1 , sono stati utilizzati 114 mg (0,165 mmol) di resina PS-TsCI (1,450 mmol/g) in THF, a cui sono stati aggiunti 71 mg di 2-ciclopropiletanolo (0,825 mmol) in 0,6 mi di DCM-piridina (1:1).
Poi sono stati aggiunti 151,3 mg (0,165 mmol) di tiopirofosfato di tetrabutilammonio (155 mg, 0,17 mmol) disciolto in acetonitrile (0,6 mi). La purificazione, effettuata per precipitazione e cromatografia su colonna di cellulosa, ha dato 40 mg di Composto 3 (resa: 77%).
Analisi (ESI ) = 261 ,2 (M-1).
Esempio 4
S-[2-(allilossi)etil] estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 4
Lavorando in modo analogo a quanto descritto nell’Esempio 1, sono stati utilizzati 206 mg (0,300 mmol) di resina PS-TsCI (1,45 mmol/g) in THF a cui sono stati aggiunti 160 μΙ di 2-(allilossi)etanolo (1,5 mmol) in 0,8 mi di DCM-Piridina (1:1).
Poi sono stati aggiunti 275,4 mg (0,3 mmol) di tiopirofosfato di tetrabutilammonio disciolto in acetonitrile (0,8 mi). Il filtrato è stato passato su una colonna a scambio ionico (resina DOWEX® NH4<+>). La purificazione è stata effettuata per cromatografia su colonna di cellulosa con eluente NH4HCO3(25 mMol):iPrOH:CH3CN (1:2:1).
Dopo liofilizzazione, sono stati ottenuti 26,7 mg di Composto 4 (resa: 30%).
Analisi (ESI-) = 277,2 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D20): δ (ppm) 6,18-6,04 (1H, m), 5,48 (1H, d), 5,38 (1H, d), 4,22 (2H, d), 3,92 (2H, t), 3,62 (1H, d) 3,21-3,10 (2H, m).
Esempio 5
S-[(3-metilossetan-3-il)metil] estere dell’acido tiofosforico sale trisodico
Composto 5
Lavorando in modo analogo a quanto descritto nell’Esempio 1, sono stati utilizzati 200 mg (0,29 mmol) di resina PS-TsCI (1,45 mmol/g) in THF a cui sono stati aggiunti 144,5 μΙ di (3-metilossetan-3-il)-metanolo (1,5 mmol) in 0,8 mi di DCM-piridina (1:1).
Poi sono stati aggiunti 293 mg (0,32 mmol) di tiopirofosfato di tetrabutilammonio disciolto in acetonitrile (0,8 ml). Il filtrato è stato passato su una colonna a scambio ionico (resina DOWEX® NH4<+>). La purificazione è stata effettuata per cromatografia su colonna di cellulosa con eluente NH4HCO3(25 mMol):iPrOH:CH3CN 1:2:1.
Sono stati ottenuti 88,2 mg di Composto 5 (resa: 92%).
Analisi (ESI-) = 291,2 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 4,80 (2H, d), 4,55 (2H, d), 3,27 (2H, d), 1,51 (3H, s).
Esempio 6
S-(3-idrossibutil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 6
Lavorando in modo analogo a quanto descritto nell’Esempio 1, sono stati utilizzati 200 mg (0,29 mmol) di resina PS-TsCI (1,45 mmol/g) in THF a cui sono stati aggiunti 52 μΙ di S-(3-idrossi)butanolo (0,6 mmol) in 0,8 mi di una soluzione di DCM e dimetilamminopiridina (DMAP) (35,4 mg, 0,29 mmol).
Dopo 24 ore sono stati aggiunti 293 mg (0,32 mmol) di tiopirofosfato di tetrabutilammonio disciolto in acetonitrile (0,8 mi). Il filtrato è stato passato su una colonna a scambio ionico (resina DOWEX® NH4<+>). La purificazione è stata effettuata per cromatografia su colonna di cellulosa con eluente NH4HCO3(25 mMol):iPrOH:CH3CN (1:2:1).
Sono stati ottenuti 79 mg di Composto 6 (resa: 86%).
Analisi (ESI-) = 279,0 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 4,12-4,07 (1H, m), 3,07-2,97 (1H, m) 2,90-2,84 (1H, m), 1,98-1,85 (2H, m), 1,30 (3H, d).
Esempio 7
S-(benzil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 7
Ad una soluzione di bromuro di benzile 3,56 μΙ (0,03 mmol) in acetonitrile (0,5 mi) è stato aggiunto, a 0 °C, tiopirosfato di tetrabutilammonio (63 mg, 0,067 mmol) disciolto in 0,5 mi di acetonitrile. La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione a temperatura ambiente per 3 ore.
Dopo aver allontanato il solvente per evaporazione a pressione ridotta, il grezzo è stato sottoposto alle metodiche di purificazione descritte nell’Esempio 1 (colonna a scambio ionico DOWEX® NH4<+>, precipitazione e cromatografia su colonna di cellulosa) per dare 8,2 mg di prodotto puro (resa: 81%). Analisi (ESI ) = 283,2 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 7,50 (2H, d), 7,42 (2H, t) 7,37-7,33 (1H, m) 4,13 (2H, d).
Esempio 8
S-(3-metil-3-butenil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 8
Lavorando in modo analogo a quanto descritto da Poulter in J. Org. Chem.
2001, 66, 6705-6710, sono stati utilizzati 11,1 mg di tosilato di isopentenile (0,046 mmol) e 100 mg di tetrabutilammonio tiopirofosfato (0,106 mmol). Dopo purificazione (colonna a scambio ionico NH4<+>, precipitazione e cromatografia su colonna di cellulosa) sono stati ottenuti 7,1 mg di Composto 8 (resa: 49%).
Analisi (ESI<’>) = 261,0 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 4,85 (2H, d), 3,04-2,97 (2H, m), 2,44 (2H, t), 1,77 (3H, s).
Esempio 9
S-[(E)-4-idrossi-3-metil-2-butenil] estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 9
Il Composto 9 è stato ottenuto lavorando in modo analogo a quanto descritto da Amslinger et al. ( J . Org. Chem. 2002, 67, 4590) salvo che è stato utilizzato tiopirofosfato di tetrabutilammonio al posto del pirofosfato di tetrabutilammonio e che la deprotezione del gruppo alcolico è stata effettuata in modo diverso (vedi Schema 2).
Schema 2
(a) toluene, riflusso (23 h);
(b)(1) DIBALH, CH2CI2, -78°C (2,5 h);
(b)(2) 1 M NaOH/H2O;
(c) p-TsCI, DMAP, CH2CI2, 25°C (3 h);
(d) idrogeno di fosfato di tris(tetra n-butilammonio), CH3CN, 25°C (3 h);
(e), NaCNBH3, BF3OEt225°C (20 min).
Sono stati isolati 32 mg di prodotto puro come sale sodico dopo purificazione su colonna a scambio ionico (eluente: NH4HCO325 mM al 2% in I-sPrOH).
Analisi (ESI ) = 276,97 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 5,57 (1H, t), 3,90 (2H, s), 3,48-3,40 (2H, m), 1,62 (3H, s).
Esempi 10 - 16
Lavorando in modo analogo a quanto descritto nell’Esempio 7 sono stati ottenuti i seguenti composti.
10) S-[2-(etiltio)propil] estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 10
Analisi (ESI ) = 294,96 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): □ (ppm) 3,14-2,96 (2H, m), 2,81 (2H, t), 2,71 (2H, q), 2,12-2,04 (2H, m), 1,35 (3H, t).
11) S-(4-cianobutil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 11
Analisi (ESI<'>) = 276,1 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 2,84-2,72 (2H, m), 2,45 (2H, t), 1,80-1,65 (4H, m).
12) S-(2-etil-1 ,3-diossolanil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 12
Analisi (ESI<'>) = 295,1 (M-1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 4,98 (1H, t), 3,98-3,83 (4H, m), 2,87-2,77 (2H, m), 2,04-1,98 (2H, m).
13) S-(4-fluorobutil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 13
Analisi LCMS (ESI<+>) = 295,1 (M+1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 4,55 (1H, t), 4,39 (1H, t), 2,84-2,73 (2H, m), 1,84-1,64 (4H, m).
14) S-(6-eptenil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 14
Analisi LCMS (ESI<+>) = 291,1 (M+1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 5,90-5,73 (1H, m), 4,96 (1H, d), 4,88 (1H, d) 2,78-2,70 (2H, m), 1,99-1,96 (2H, m), 1,61-1,56 (2H, m).
15) S-[etil-2-(tetraidro-2/-/-2-piranilossi)] estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 15
Analisi LCMS (ESI<+>) = 239,1 (M+1 -85)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm) 4,75 (1H, m), 3,94-3,81 (2H, m), 3,78-3,71 (1H, m), 3,55-3,49 (1H, m), 3,02-2,93 (2H, m), 1,73-1,70 (2H, m), 1,48-1,46 (2H, m).
16) S-(etil-2- cicloesil) estere dell’acido tiodifosforico sale trisodico
Composto 16
Analisi LCMS (ESI<+>) = 305,1 (M+1)
<1>H-NMR (300 MHz, D2O): □ (ppm) 2,83-2,73 (2H, m), 1,64-1,43 (7H, m), 1,15-1,08 (4H, m), 0,86-0,78 (2H, m).
Esempio 17
Prove di stabilità
Per le prove di stabilità in soluzione acquosa alcalina in presenza di fosfatasi alcalina (SIGMA Phosphatase, alkaline-Agarose from calf intestine-P0762) sono stati scelti i seguenti composti:
Soluzione A:
soluzione a pH 8 con tampone TRIS-HCI e 2 mM di MgCl2;
Soluzione B:
soluzione 2 mM di isopentenil pirofosfato (IPP) di confronto nella Soluzione A;
Soluzione C:
soluzione 2 mM dell’isopentenil tiopirofosfato (Composto 8) della presente invenzione nella Soluzione A.
Soluzione D:
soluzione di enzima fosfatasi immobilizzato su supporto solido (agarosio), 50 unità biologiche in 10 mi di Soluzione A.
Condizioni dell’esperimento
Sono stati prelevati 0,5 mi di Soluzione B ed a questa sono stati aggiunti
20 μΙ di Soluzione D. Il sistema è stato lasciato sotto agitazione a temperatura ambiente. Ad intervalli di tempo prestabiliti (20, 30, 40, 50 e 60 minuti) la soluzione è stata filtrata per allontanare l'enzima e quindi è stata analizzata con HPLC-MS.
Con la Soluzione C si è operato allo stesso modo.
I risultati sono illustrati nella seguente Tabella 1.
Tabella 1
Percentuale di Com sosto non Idrolizzato
t = 0 min t = 20 min t = 30 min t = 40 min t = 50 min t = 60 min
IPP 94% 48% 54% - - 27%
Composto 8 100% 90% 90% 90% 90% 90%
I risultati mostrati di Tabella 1 dimostrano che l'ΙΡΡ si degrada rapidamente mentre l’isopentenil tiopirofosfato (Composto 8) della presente invenzione è molto più resistente all’idrolisi.
Esempio 18
Test Biologici
1. Test su cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs)
L’attivazione di linfociti T γδ è stata testata mediante un saggio relativo alla produzione di citochine quali TNFa e IFNy da parte dei linfociti T γδ di cellule mononucleate di sangue periferico di donatori sani (PBMCs) (Poccia, F et al. The Journal of Immunology 1997, 159, 6009-6017).
Cellule mononucleate (PBMCs) sono state isolate dal sangue periferico di donatori sani, messe in coltura a 37°C in terreno completo, composto da RPMI 1640, FCS 10%, L-glutammina 1%, penicillina-streptomicina 1%, in presenza di interleukina 2 (IL-2), fattore di crescita dei linfociti T, 5% CO2ed in ambiente ad umidità controllata, e poi stimolate con isopentenilpirofosfato (IPP 10μΜ) come controllo positivo di attivazione e, rispettivamente, con varie dosi (10μΜ, 100μΜ e 1000μΜ) di composti dell’invenzione.
Quindi è stata effettuata una marcatura citofluorimetrica con anticorpi monoclonali specifici (marcatura di membrana per l’espansione e intracitoplasmatica per le citochine) ed una lettura citofluorimetrica per stabilire la percentuale di cellule T γδ che producono TNFa e IFNy (saggio di produzione di citochine).
I risultati sono illustrati nella seguente Tabella 2 dove “PBMC/IL-2” sta ad indicare le cellule mononucleate di sangue periferico di donatori sani in presenza del solo terreno completo.
Tabella 2
Percentuali di incremento dei linfociti T γδ che producono TNFa e IFNy % incremento dei Composto Condizioni sperimentali linfociti T γδ che producono:
IFNy TNFa PBMC/IL-2 (bianco) 2-8 4-11 IPP(std) PBMC/IL-2/IPP (10μΜ) 100 100
PBMC/IL-2/composto1 (10μΜ) 131 81 composto 1 PBMC/IL-2/composto 1 (100μΜ) 94 127
PBMC/IL-2/composto1 (1000μΜ) 132 81,5 PBMC/IL-2/composto2 (10μΜ) 56,4 60,4 composto 2 PBMC/IL-2/composto2 (100μΜ) 67 71,8
PBMC/IL-2/composto2 (1000μΜ) 97,3 76,5 composto 3 PBMC/IL-2/composto3 (10μΜ) - 49,5
PBMC/IL-2/composto3 (100μΜ) - 123 PBMC/IL-2/composto3 (1000μΜ) _ 158,4 PBMC/IL-2/composto4(10μΜ) - 70,7 composto 4 PBMC/IL-2/composto4 (100μΜ) - 130,4 PBMC/IL-2/composto4 (1000μΜ) - 299,3 PBMC/IL-2/composto5 (10μΜ) - 48 composto 5 PBMC/IL-2/composto5 (100μΜ) - 229
PBMC/IL-2/composto5 (1000μΜ) - 337 PBMC/IL-2/composto6 (10μΜ) - 40 composto 6 PBMC/IL-2/composto6 (100μΜ) - 114
PBMC/IL-2/composto6 (1000μΜ) - 310 PBMC/IL-2/composto7 (10μΜ) 82 86 composto 7 PBMC/IL-2/composto7 (100μΜ) 112 116
PBMC/IL-2/composto7 (1000μΜ) 95 87 PBMC/IL-2/composto8 (10μΜ) 21 39 composto 8 PBMC/IL-2/composto8 (100μΜ) 86,5 92,6 PBMC/IL-2/composto8 (1000μΜ) 182 174,3 PBMC/IL-2/composto9 (10μΜ) - 82,3 composto 9 PBMC/IL-2/composto9 (100μΜ) - 175
PBMC/IL-2/composto9 (1000μΜ) - 464 PBMC/IL-2/composto10 (10μΜ) - -composto 10 PBMC/IL-2/composto10 (100μΜ) - -PBMC/IL-2/composto10 (1000μΜ) - -- = non testato
I dati di Tabella 2 mostrano che tutti i composti dell’invenzione aumentano il numero di cellule T γδ che producono citochine (attivazione dei linfociti T γδ); in particolare il composto 9 presenta un’attività confrontabile a quella dell'antigene naturale IPP nelle stesse condizioni sperimentali (ovvero ad una concentrazione di 10μΜ) e un aumento molto evidente a 100 e 1000μΜ.
2. Saggio di espansione cellulare cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs)
L’effetto dei composti della presente invenzione sulla espansione dei linfociti T γδ è stata studiata mediante un saggio effettuato su linfociti T γδ provenienti da cellule mononucleate di sangue periferico di donatori sani (PBMCs). I PBMCs sono stati separati mediante centrifugazione (Ficoll) eseguita su sangue intero di prelievi (residuai samples) di 7 donatori sani.
Dopo aver valutato la percentuale iniziale di cellule νγ9\/δ2 di ciascun donatore, mediante marcatura con un anticorpo anti-Vd2-FITC e analisi al citofluorimetro, le cellule sono state poste in piastre da 24 pozzetti (10<6>cellule/ mi) in terreno completo (avente la composizione indicata nella sezione 1 di questo esempio) ed in presenza del Composto 9 della presente invenzione (20 μΜ). In esperimenti di controllo, le cellule sono state trattate con IPP alle stesse concentrazioni e nelle stesse condizioni sperimentali.
Al decimo giorno di coltura, le cellule sono state recuperate e contate mediante conta vitale con Trypan Blue, e marcate con il medesimo anticorpo anti-Vd2-FITC ed infine analizzate al citofluorimetro per valutare la percentuale di cellule Vy9Vδ2.
II numero assoluto di cellule Ν/γ9\/δ2 è stato calcolato con la seguente formula:
n° di cellule Ν/γ9\/δ2 = (n° totale assoluto di cellule dopo espansione x % di cellule Vy9V62 dopo espansione)/100.
L’ indice di espansione è stato calcolato mediante il rapporto tra il numero assoluto di cellule Vy9V52 dopo l'espansione ed il numero assoluto di cellule Vy9Vδ2 iniziali ( Poccia, F. et al, J. Immunol., 1997, 159: 6009-6017).
I risultati ottenuti sono mostrati nella seguente Tabella 3 ed in Figura 1.
Tabella 3
donatore indice di espansione
Composto 9 (20 γΜ) IPP ( 20 γΜ)
A 129,28 5,41
B 80,96 2,42
C 51,30 11,11
D 59,10 2,81
E 624,02 72,92
F 35,37 23,87
G 42,09 3,35
3. Test su linee cellulari T νδ: produzione di TNFa e determinazione della EC5O secondo Espinosa. E. et al. (J Biol Chem. 2001. 276. 18337-441 3.1 Sviluppo della linea linfocitaria T νδ
Per lo sviluppo delle linee linfocitarie T γδ è stato selezionato un buffy coat proveniente da un donatore sano con un’alta percentuale basale di linfociti T γδ (circa il 6%).
I PBMCs sono stati separati e messi in coltura alla concentrazione di 1x10<6>cellule/ml in presenza di IPP (160 ng/ml) e IL-2 (100 U/ml).
Dopo 7 giorni in incubazione a 37°C e 5% CO2 ,3ml di terreno sono stati prelevati e sostituiti con altrettanto terreno fresco arricchito con IL-2 (concentrazione finale 100U/ml).
Dopo ulteriori 7 giorni in incubatore, è stata prelevata un’aliquota delle cellule in coltura in modo tale da effettuare una marcatura di membrana e analizzare la percentuale di cellule T γδ ottenuta dall’espansione.
Nel caso specifico è stata ottenuta una popolazione cellulare con 85% di cellule T γδ2 positive.
Questa linea cellulare è stata quindi utilizzata per valutare, mediante un test ELISA, la produzione di TNFa successiva alla stimolazione delle cellule con i composti in esame.
3.2 Test ELISA per la produzione di TNFa
Nel test ELISA sono state utilizzate cellule della linea prodotta ad una concentrazione di 2,5x10<5>cellule/ml (5x10<4>cellule/pozzetto).
Quindi le cellule sono state stimolate con i composti in esame e con isopentenilpirofosfato (IPP), come riferimento, a dosi scalari.
Dopo 24 ore sono stati prelevati i sovranatanti dai pozzetti contenenti le cellule stimolate ed è stato effettuato il test ELISA utilizzando il kit “Human TNFa Screeening Set” (Endogen). Il kit prevede il trattamento con un anticorpo policlonale anti-TNFa biotinilato, l'aggiunta di perossidasi coniugata a streptavidina ed il rilevamento quantitativo tramite un substrato cromogenico. La lettura delle piastre è stata effettuata spettrofotometricamente a 450 nm. Ciascun composto è stato testato in duplicato.
I risultati ottenuti sono stati quindi analizzati attraverso uno specifico programma di analisi ( Graph Pad Prìsm ) ed hanno restituito l’ECso dei composti in esame (Tabella 4).
Tabella 4
Valori di EC50ottenuti con test ELISA per la produzione di TNFa su linea linfocitaria T γδ
Composto EC50 (μΜ)
IPP 5,92
1 100
2 0,39
3 13
4 10
5 14
6 75
7 55
8 3,75
9 0,0048
10 0,055
La Tabella 3 mostra che i valori di EC50dei composti degli Esempi 10 e 9 sono pari a 100 e, rispettivamente, 1000 volte la EC50dell’IPP.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un composto di formula generale (I):
    (I) in cui X è un atomo di ossigeno, un atomo di zolfo od un legame covalente, n è zero quando X è un legame covalente ed è 1 , 2 o 3 quando X è O od S, R è (i) un gruppo alifatico, lineare o ramificato, saturo od insaturo, avente da 1 a 9 atomi di carbonio, in cui un atomo di idrogeno è eventualmente sostituito con un atomo di alogeno, un gruppo ossidrilico, un gruppo nitrile, un gruppo cicloalchilico avente da 3 a 6 atomi di carbonio, un gruppo arilico od un gruppo eterociclico, od (ii) un gruppo eterociclico, e Cat<+>è un catione organico od inorganico fisiologicamente accettabile.
  2. 2. Un composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’atomo di alogeno è cloro o fluoro.
  3. 3. Un composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il gruppo arilico è scelto dal gruppo comprendente benzene e piridina.
  4. 4. Un composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il gruppo eterociclico è scelto dal gruppo comprendente 3-metilossetano, diossolano e tetraidropirano.
  5. 5. Un composto di formula (I) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto che Cat<+>è un catione inorganico scelto fra ammonio, i metalli alcalini ed i metalli alcalino-terrosi.
  6. 6. Un composto di formula (I) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto che Cat<+>è un catione organico scelto lisina, arginina, trometamina, idrossietilpirrolidina, trietanolammina ed N-metilglucamina.
  7. Un metodo per preparare un composto di formula (I) (l) in cui X è un atomo di ossigeno, un atomo di zolfo od un legame covalente, n è zero quando X è un legame covalente ed è 1 , 2 o 3 quando X è O od S, R è (i) un gruppo alifatico, lineare o ramificato, saturo od insaturo, avente da 1 a 9 atomi di carbonio, in cui un atomo di idrogeno è eventualmente sostituito con un atomo di alogeno, un gruppo ossidrilico, un gruppo nitrile, un gruppo cicloalchilico avente da 3 a 6 atomi di carbonio, un gruppo arilico od un gruppo eterociclico, od (ii) un gruppo eterociclico, e Cat<+>è un catione organico od inorganico fisiologicamente accettabile, caratterizzato dal fatto che un alcool di formula (II) R-X-(CH2)n-OH (H) in cui n, X ed R hanno i significati indicati più sopra, viene fatto reagire in fase solida con un tiopirofosfato di formula (III) (III) in cui Cat<+>ha i significati indicati più sopra.
  8. 8. Un metodo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che Cat<+>è un gruppo tetraalchil ammonio di formula (R”)4N<+>dove R” è un alchile avente da 1 a 5 atomi di carbonio.
  9. 9. Un metodo secondo la rivendicazione 7 od 8, caratterizzato dal fatto che il supporto solido utilizzato per realizzare la reazione in fase solida secondo la presente invenzione è polistirene benzensolfonil cloruro (PS-TsCI) a bassa capacità di carico (1,3 mmol/g).
  10. 10. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9, caratterizzato dal fatto che gli equivalenti di alcool di formula (II) che vengono legati al supporto solido variano da 1 a 5 a seconda della natura del gruppo R.
  11. 11. Una composizione farmaceutica comprendente un composto di formula (I)
    (I) in cui X è un atomo di ossigeno, un atomo di zolfo od un legame covalente, n è zero quando X è un legame covalente ed è 1 , 2 o 3 quando X è O od R è (i) un gruppo alifatico, lineare o ramificato, saturo od insaturo, avente da 1 a 9 atomi di carbonio, in cui un atomo di idrogeno è eventualmente sostituito con un atomo di alogeno, un gruppo ossidrilico, un gruppo nitrile, un gruppo cicloalchilico avente da 3 a 6 atomi di carbonio, un gruppo arilico od un gruppo eterociclico, od (ii) un gruppo eterociclico, e Cat<+>è un catione organico od inorganico fisiologicamente accettabile, ed almeno un veicolo fisiologicamente accettabile.
  12. 12. Un metodo per attivare linfociti T γδ di un mammifero caratterizzato dal fatto di comprendere il contatto di detti linfociti con una quantità efficace di un composto di formula I (i) in cui X è un atomo di ossigeno, un atomo di zolfo od un legame covalente, n è zero quando X è un legame covalente ed è 1 , 2 o 3 quando X è O od s R è (i) un gruppo alifatico, lineare o ramificato, saturo od insaturo, avente da 1 a 9 atomi di carbonio, in cui un atomo di idrogeno è eventualmente sostituito con un atomo di alogeno, un gruppo ossidrilico, un gruppo nitrile, un gruppo cicloalchilico avente da 3 a 6 atomi di carbonio, un gruppo arilico od un gruppo eterociclico, od (ii) un gruppo eterociclico, e Cat<+>è un catione organico od inorganico fisiologicamente accettabile.
  13. 13. Un metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto di comprendere - il prelievo di una adatta quantità di sangue periferico da un paziente, - il contatto di detto sangue con un composto di formula I per un tempo sufficiente a stimolare la proliferazione ex vivo di linfociti T γδ, - la raccolta delle cellule T γδ così trattate, e - la loro somministrate al paziente per via endovenosa.
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