CN108976195B

CN108976195B - 2-硫脲基(脲基)噻吩-3-甲酸酯类衍生物及其用途

Info

Publication number: CN108976195B
Application number: CN201811074103.7A
Authority: CN
Inventors: 程魁; 陈之朋; 刘叔文
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2038-09-14
Also published as: CN108976195A

Abstract

本发明涉及2‑硫脲基(脲基)噻吩‑3‑甲酸酯类衍生物及其用途，具体地，公开了式I所示化合物；式I所示化合物或其药物可接受盐在激活TLR1‑TLR2或用于抗肿瘤药物中的用途。

Description

2-硫脲基(脲基)噻吩-3-甲酸酯类衍生物及其用途

技术领域

本发明涉及医药卫生和化工领域，具体涉及2-硫脲基(脲基)噻吩-3-甲酸酯类衍生物及其在激活TLR1-TLR2以及在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

Toll样受体(TLRs)是一类高度保守的跨膜蛋白，它们通过选择识别微生物保守的病原相关分子模式(PAMPs)来触发免疫应答反应以抵抗病原体的入侵，包括固有性免疫与获得性免疫。TLR家族成员可与其自身或其他TLR二聚化以形成同型或异型二聚体，连同衔接蛋白介导下游信号传导，例如TLR1-TLR2和TLR2-TLR6。

TLR的调节剂可用于人体免疫调节或肿瘤免疫治疗，目前，以TLR4、TLR7为作用靶点，已有药物上市；以TLR2为靶点的药物还处于临床研究阶段，其结构为大分子化合物或提取物，尚未有小分子调节剂的研究。如TLR2的激活剂云芝多糖在临床II期，用于乳腺癌的治疗；TLR1-TLR2的激动剂细菌性脂蛋白(BLP)可以抑制肺癌，白血病，黑色素瘤等。

目前为止，文献报道的选择性激活TLR1-TLR2的小分子化合物只有1个(CU-T12-9)，不存在由于其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于肿瘤的免疫治疗和防治具有显著的进步，极有可能被开发成新型的抗肿瘤药物。本发明涉及的式I所示化合物在选择性激活TLR1-TLR2及其用于制备抗肿瘤药物中的用途属于首次公开。

发明内容

本发明的目的在于提供了2-硫脲基(脲基)噻吩-3-甲酸酯类化合物，及其在选择性激活TLR1-TLR2和作为制备抗肿瘤药物中的应用，具有重要的研发价值和开发意义。

本发明一个方面提供了一种2-硫脲基(脲基)噻吩-3-甲酸酯衍生化合物，其结构如式I所示，

其中：R₁选自正丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个；R₂选自氢，烷基，酰基，苄基，芳基或杂环；X为S，O中任意一个；n为1、2或3。

在本发明的技术方案中，R₂基优选为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、苯基、苄基、乙酰基。

本发明另一个方面提供了式I所示化合物的制备方法，其中式I化合物中X为硫原子，制备方法如下：1

1)将

与硫光气在碱性条件下进行反应至完全，

2)加入

至反应完全得到式I所示化合物。

式I化合物中X为氧原子，制备方法如下：

1)将

与固体光气进行反应至完全，

2)加入

至反应完全得到式I所示化合物。

实验方法详述如下：

方法1：

其中：

将A溶于二氯甲烷中，加入三乙胺，冰浴冷却至0℃，滴加硫光气。薄层色谱跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，往残留物中加入二氯甲烷，水洗两次，无水硫酸钠干燥。减压除溶剂，加入C，室温搅拌至反应结束。减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，得目标产物。

方法2:

其中：

将A溶于碳酸二甲酯中，加入固体光气，90℃反应，薄层色谱跟踪反应至结束。冷却至室温，加入D，室温搅拌至反应结束。减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，得目标产物。

本发明另一个方面提供了式I所示化合物或其药物可接受盐在制备激活TLR1-TLR2的激动剂中的应用。其中，R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个；R₂选自氢，烷基，酰基，苄基，芳基或杂环；X为S，O中任意一个；n为1、2或3。本发明另一个方面提供了式I所示化合物或其药物可接受盐在制备抗肿瘤药物中的应用。其中，R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个；R₂选自氢，烷基，酰基，苄基，芳基或杂环；X为S，O中任意一个；n为1、2或3。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、白血病、***、卵巢癌。

在本发明的技术方案中，所述式I化合物选自以下化合物中的一种：

本发明另一个方面提供了一种用于激活TLR1-TLR2以及抗肿瘤用途的药物组合物，其含有作为活性物质的式I所示化合物或其药物可接受盐。

在本发明的技术方案中，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

在本发明的技术方案中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

附图说明

图1为SMU127对TLR2的激活作用。

图2为SMU127激活TLR1-TLR2的抗体实验。

图3为SMU127对接种乳腺癌4T1的BABL/c小鼠的抑制作用，其中A为治疗阶段肿瘤体积变化，B为治疗阶段小鼠体重变化，C为给药24天后给药组和对照组肿瘤体积差异。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

实施例1化合物1的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

将

(1mmol)溶于5mL碳酸二甲酯中，加入固体光气(1mmol)，90℃反应，薄层色谱(TLC)跟踪反应至结束。冷却至室温，加入

(1mmol)，室温搅拌至反应结束。减压旋干溶剂，残留物用硅胶柱层析分离，得目标产物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.85(s,1H),5.14-5.20(m,1H),3.59-3.61(m,4H),2.81-2.90(m,4H),2.48-2.51(m,4H),2.35-2.38(m,5H),1.35(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.1,155.1,152.6,140.8,130.0,106.2,67.5,54.4,45.9,43.5,30.3,28.7,27.6,21.9.ESI-MS:m/z 352.1([M+H]⁺).

实施例2化合物2的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

将

(1mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入0.5mL三乙胺，冰浴冷却至0℃，滴加硫光气(1mmol)。薄层色谱(TLC)跟踪反应至结束，减压旋干溶剂，往残留物中加入50mL二氯甲烷，水洗两次(2×5mL)，无水硫酸钠干燥。减压除溶剂至5mL左右，加入

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.13(s,1H),5.16-5.22(m,1H),4.09-4.12(m,4H),2.91(t,2H),2.84(t,2H),2.65-2.67(m,4H),2.42(s,3H),2.37(t,2H),1.36(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ175.8,166.7,155.6,140.8,131.4,108.8,68.1,54.2,47.4,45.5,30.5,28.8,27.6,22.0.ESI-MS:m/z 368.2([M+H]⁺).

实施例3化合物3的制备：

2-(4-乙酰基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例2的方法仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.14(s,1H),5.16-5.22(m,1H),3.99-4.16(m,4H),3.66-3.83(m,4H),2.81-2.92(m,4H),2.34-2.39(m,2H),2.14(s,3H),1.35(d,J＝6.4Hz,6H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ175.6,169.2,166.5,155.1,140.8,131.3,108.8,68.1,46.8,44.9,40.1,30.4,28.7,27.6,21.9,21.3.ESI-MS:m/z 396.2([M+H]⁺).

实施例4化合物4的制备

2-(哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例2的方法仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.08(s,1H),5.18-5.2(m,1H),3.99-4.01(m,4H),2.82-3.03(m,8H),2.35-2.39(m,2H),2.03(s,1H),1.35(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ175.6,166.5,155.6,140.7,131.1,108.6,68.2,50.7,49.0,47.8,45.6,30.5,28.8,27.6,22.0.ESI-MS:m/z 354.2([M+H]⁺).

实施例5化合物5的制备：

2-(4-苯基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例2的方法仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.18(s,1H),7.32(t,J₁＝7.2Hz,J₂＝14.4Hz,2H),6.91-6.97(m,3H),5.18-5.24(m,4H),4.19-4.22(m,4H),3.39-3.41(m,4H),2.84-2.95(m,4H),2.36-2.40(m,2H),1.37(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ175.9,166.8,155.6,140.9,131.5,129.3,120.2,115.9,108.9,68.1,48.4,47.5,30.5,28.8,27.7,22.0.ESI-MS:m/z 430.2([M+H]⁺).

实施例6化合物6的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸正丙酯

按实施例1的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.86(s,1H),4.22(t,J₁＝6.4Hz,J₂＝12.8Hz,2H),3.58-3.62(m,4H),2.82-2.92(m,4H),2.47-2.52(m,4H),2.35-2.39(m,5H),1.75-1.80(m,2H),1.04(t,J₁＝7.2Hz,J₂＝14.4Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.8,155.5,152.7,140.7,130.1,105.9,65.8,54.4,45.9,43.6,30.3,28.7,27.6,22.0,10.5.ESI-MS:m/z 352.3([M+H]⁺).

实施例7化合物7的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-甲酰胺基)-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-3-甲酸正丙酯

按实施例1的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.17(s,1H),4.21(t,2H),3.56-3.59(m,4H),2.60-2.76(m,4H),2.45-2.48(m,4H),2.33(s,3H),1.74-1.79(m,6H),1.02(t,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ167.3,152.8,151.5,130.1,124.8,109.0,65.8,54.4,45.9,43.6,26.3,24.1,22.8,22.8,21.9,10.6.ESI-MS:m/z 366.2([M+H]⁺).

实施例8化合物8的制备：

2-(4-乙基哌嗪-1-甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例1的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.84(s,1H),5.13-5.19(m,1H),3.59-3.62(m,4H),2.80-2.88(m,4H),2.47-2.54(m,6H),2.34-2.38(m,2H),1.34(d,J＝6.4Hz,6H),1.11(t,3H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ166.1,155.2,152.6,140.8,129.9,106.2,67.5,52.1,52.0,43.6,30.3,28.7,27.6,21.9,11.7.ESI-MS:m/z 366.3([M+H]⁺).

实施例9化合物9的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例2的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.47(s,1H),5.20-5.23(m,1H),4.02-4.04(m,4H),2.64-2.77(m,4H),2.53-2.56(m,4H),2.35(s,3H),1.781.79(m,4H),1.36(d,J＝6.4Hz,6H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ176.2,167.2,152.0,130.3,125.7,111.8,68.1,54.4,47.8,45.7,26.4,24.2,22.9,22.0.ESI-MS:m/z 382.2([M+H]⁺).

实施例10化合物10的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-3-甲酸正丙酯

按实施例2的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.46(s,1H),4.24(t,J₁＝6.4Hz,J₂＝12.8Hz,2H),4.04-4.06(m,4H),2.64-2.78(m,4H),2.55-2.58(m,4H),2.37(s,3H),1.76-1.82(m,6H),1.04(t,J₁＝7.2Hz,J₂＝14.4Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ175.9,167.6,152.1,130.0,125.3,111.2,66.2,54.3,47.6,45.6,26.2,24.1,22.8,21.9,10.7.ESI-MS:m/z 382.2([M+H]⁺).

实施例11化合物11的制备：

2-(4-苯基哌嗪-1-甲酰胺基)-5，6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施1的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.94(s,1H),7.29-7.35(m,2H),6.95-7.00(m,3H),5.16-5.22(m,1H),3.76-3.77(m,4H),3.28-3.33(m,4H),2.83-2.92(m,4H),2.37-2.40(m,2H),1.37(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.3,155.2,152.8,150.8,141.0,130.2,129.2,120.3,116.4,106.5,67.7,49.0,43.6,30.5,28.8,27.7,22.1.ESI-MS:m/z 414.2([M+H]⁺).

实施例12化合物12的制备：

2-(4-甲基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢-4H-环庚烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例2的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.39(s,1H),5.20-5.26(m,1H),4.00-4.03(m,4H),3.02-3.05(m,2H),2.71-2.74(m,2H),2.53-2.54(m,4H),2.36(s,3H),1.83-1.86(m,2H),1.61-1.68(m,4H),1.37(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ176.1,167.3,149.9,135.8,129.8,113.1,68.4,54.3,47.7,45.6,31.9,28.4,28.2,27.7,26.8,21.9.ESI-MS:m/z396.2([M+H]⁺).

实施例13化合物13的制备：

2-(4-苄基哌嗪-1-硫代甲酰胺基)-5,6-二氢-4H-环戊烯并[b]噻吩-3-甲酸异丙酯

按实施例2的方法制备，仅将

替换为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.09(s,1H),7.31-7.36(m,5H),5.14-5.21(m,1H),4.02-4.04(m,4H),3.55(s,2H),2.82-2.93(m,4H),2.58-2.61(m,4H),2.35-2.38(m,2H),1.35(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ175.7,166.7,155.9,140.8,138.0,137.5,131.3,129.2,128.2,127.0,108.6,68.0,63.0,53.0,52.4,47.9,30.6,28.9,27.7,22.1.ESI-MS:m/z 428.2([M+H]⁺).

实施例14 SMU127对TLR2的激活活性实验：

实验中的HEK BLUE TLR2细胞为本科室所有；胎牛血清购自美国GIBICO公司；细胞培养板购自美国康宁公司；DMEM培养基购自美国GIBICO公司；Quanti-blue购自美国InvivoGen公司；SMU127为本科室合成。

实验步骤如下：

1接种HEK BLUE TLR2细胞：用含10％胎牛血清(60℃加热30分钟)的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔20000个细胞接种到384孔细胞培养板，每孔接种体积30μL；

2加入SMU127，培养：向各个孔加入10μL用含10％胎牛血清(60℃加热30分钟)的DMEM培养基稀释成相应浓度的SMU127，在37℃，5％CO₂培养条件下培养24小时；

4呈色：培养24小时后，每孔避光加40μL Quanti-blue溶液。

5测量与计算：在620nm吸光度下15分钟为单位读数4次，以检测细胞上清中SEAP的信号强度。EC₅₀通过Growth/Sigmoidal中的Hill1进行非线性拟合。

实验结果证明不同浓度的SMU127对TLR2有激活作用，其EC₅₀为0.55±0.01μM。见附图1。

实施例15化合物1-27对TLR2的激活活性实验：

实验方法参考实施例14。实验结果如表1所示：

表1化合物对TLR2的激活活性

NA:无活性

实验结果分析：从表1中可知，该系列化合物有较好的激活TLR2的活性，具有良好的开发潜力。

实施例16SMU127激活TLR1-TLR2的抗体实验：

1接种HEK BLUE TLR2细胞：用含10％胎牛血清(60℃加热30分钟)的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔20000个细胞接种到384孔细胞培养板，每孔接种体积20μL；

2加入SMU127，h-TLR1、h-TLR2、h-TLR6抗体，培养：向各孔加入10μL0.5μM的SMU127，再加入10μL稀释成相应浓度的h-TLR1或h-TLR2或h-TLR6抗体，培养24小时；

3呈色：培养24小时后，每孔避光加40μL Quanti-blue溶液。

4测量与计算：在620nm吸光度下15分钟为单位读数4次，以检测细胞上清中SEAP的信号强度。

结果显示，加入h-TLR1或h-TLR2抗体后，可抑制细胞上清中的SEAP信号，加入h-TLR6抗体后，不能抑制细胞上清中的SEAP信号。说明SMU127可以激活TLR1-TLR2。见附图2。

实施例17 SMU127对多种肿瘤细胞的抑制实验：

采用MTT法测定肿瘤细胞的增殖。

1接种肿瘤细胞：用含10％胎牛血清(100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素)的DMEM或RPMI-1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔4000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μL，培养24h。

2加药物培养：每孔加入100μL浓度为60μM的SMU127，继续培养72h。

3测量与计算：

每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4h，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪测定490nm处的吸光度A值(OD值)，计算肿瘤细胞存活率。

抑制率(％)＝1－肿瘤细胞存活率×100％(实验重复三次)

表2 60μM SMU127对肿瘤细胞的抑制率

肿瘤细胞	抑制率(％)
		肺癌细胞A549	71
乳腺癌细胞4T1	100
		肝癌细胞H22	75

实施例18 SMU127对接种乳腺癌4T1的BABL/c小鼠的抑制作用实验：

1接种肿瘤细胞：对BABL/c小鼠以300000个细胞/鼠接种乳腺癌4T1细胞，7天后，至肿瘤可测量，对小鼠分2组。

2给药：腹腔注射给药，PBS为对照，SMU127以0.1mg/只(约5mg/Kg)隔天给药。

3测量：用游标卡尺测量肿瘤大小，用天平称量小鼠重量，记录。

4评价：24天后，处死小鼠，剥离肿瘤，测量体积及称重。

实验结果表明，SMU127对乳腺癌4T1有抑制作用，给药24天后，SMU127组肿瘤体积平均值为1035±196mm³，对照组(PBS)为2256±150mm³，给药后，小鼠重量没明显变化。见附图3。

Claims

1.一种2-硫脲基或2-脲基噻吩-3-甲酸酯衍生化合物，其结构如式I所示，

其中：R₁选自正丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个；R₂选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、苯基、苄基、乙酰基；X为S，O中任意一个；n为1、2或3。

2.如权利要求1所述的式I所示化合物的制备方法，其中式I化合物中X为硫原子，制备方法如下：

1)将

与硫光气在碱性条件下进行反应至完全，

2)加入

至反应完全得到式I所示化合物。

3.如权利要求1所述的式I所示化合物的制备方法，其中式I化合物中X为氧原子，制备方法如下：

1)将

与固体光气进行反应至完全，

2)加入

至反应完全得到式I所示化合物。

4.式I所示化合物或其药物可接受盐在制备TLR2选择性激动剂或TLR1-TLR2激动剂的用途，

其中，R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个；R₂选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、苯基、苄基、乙酰基；X为S，O中任意一个；n为1、2或3。

5.式I所示化合物或其药物可接受盐在制备抗肿瘤药物中的用途，

其中，R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个；R₂选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、苯基、苄基、乙酰基；X为S，O中任意一个；n为1、2或3；

所述抗肿瘤为抗乳腺癌、肺癌、黑素瘤、肾癌、肝癌、***癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、鼻咽癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、血液学癌或癌的转移性病变。

6.一种用于选择性激活TLR1-TLR2的组合物，其含有作为活性物质的如权利要求1所述的式I所示化合物或其药物可接受盐。

7.一种用于抗肿瘤的药物组合物，其含有作为活性物质的如权利要求1所述的式I所示化合物或其药物可接受盐。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。