ITGE20130040A1 - Metodo per la produzione di collagene marino ricombinante e organismo capace di produrre detto collagene marino - Google Patents

Metodo per la produzione di collagene marino ricombinante e organismo capace di produrre detto collagene marino

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ITGE20130040A1
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IT000040A
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Umberto Benatti
Valentina Berilli
Gianluca Damonte
Marco Giovine
Francesca Mussino
Marina Pozzolini
Annalisa Salis
Sonia Scarfi
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Univ Degli Studi Genova
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

"Metodo per la produzione di collagene marino ricombinante e organismo capace di produrre detto collagene marino"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un metodo per la produzione di proteine collageniche derivanti da spugna di mare e un organismo capace di produrre dette proteine.
Il collagene à ̈ una proteina della matrice extracellulare presente in tutti gli animali, dai più semplici all'uomo, che negli ultimi due decenni ha assunto un rilevante interesse commerciale.
La domanda di brevetto US 2010/0260823, ad esempio, descrive preparazioni farmaceutiche contenenti collagene marino trattato ed ottenuto da spugne, preferibilmente da Chondrosia.reniformis.
In natura il suo processo di biosintesi, messo in atto da cellule specializzate, prevede diversi passaggi che iniziano con la trascrizione del, o dei, geni che ne codificano la struttura primaria e proseguono con l'intervento di enzimi che la modicano sino a farle assumere la conformazione attiva, matura.
In particolare il collagene nasce come pre-procollagene, prodotto che possiede rispetto al collagene, due pro-peptidi, uno all'N-terminale ed uno C-terminale, che hanno struttura globulare.
La catena di pre-procollagene subisce la rimozione del peptide segnale, 1'idrossilazione di specifici residui di prolina e lisina ad idrossiprolina ed idrossilisina. Tre di queste catene si avvolgono a formare una tripla elica, stabilizzata da legami idrogeno tra amminoacidi idrossilati, dando origine al pro-collagene.
I passi successivi prevedono la glicosilazione dell'elica, la secrezione all'esterno della cellula e l'azione di alcune procollagene peptidasi che rimuovono i pro-peptidi all' N-terminale ed al C-terminale, trasformando il pro-collagene in tropocollagene .
Il tropocollagene à ̈ quindi l'unità strutturale del collagene, ed à ̈ una proteina formata da tre catene peptidiche con andamento sinistrorso che si associano a formare una tripla elica destrorsa.
Le tre catene nel tropocollagene sono tenute insieme da legami idrogeno, legami che sono possibili grazie alla presenza di glicine e alle modifiche post-traduzionali di lisina e prolina.
Le principali modifiche del procollagene, nel processo di maturazione del collagene, consistono quindi nell' idrossilazione delle proline (uno degli amminoacidi caratterizzanti questa tipologia di proteine) e nella glicosilazione (aggiunta di zuccheri) : queste modifiche vengono effettuate da specifici enzimi presenti nella cellula produttrice di collagene.
La prolil-4-idrossilasi (P4H) à ̈ un enzima chiave, necessario per ottenere collagene da procollagene e, nei mammiferi, à ̈ un tetramero con subunità α2β2.
Le subunità alfa contengono i siti catalitici coinvolti nell'idrossilazione dei residui di prolina.
Le subunità beta sono identiche alla proteina disolfuro isomerasi (PDI) e nel caso specifico svolgono una funzione strutturale nel mantenere funzionale la subunità alfa.
E' noto l'utilizzo di sistemi ricombinanti per la produzione in organismi ospiti, quali funghi e batteri, di collagene umano.
L'espressione di geni esogeni codificanti per collagene in sistemi ricombinanti risulta, tuttavia difficoltosa dato che, per ottenere la formazione di una proteina funzionante, Ã ̈ necessario un complesso sistema di gestione delle necessarie modificazioni post-traduzionali .
L'interesse verso sorgenti di collagene alternative a quelle tradizionali, bovine o suine, Ã ̈ cresciuto negli ultimi anni, anche a seguito dei problemi di biosicurezza emersi con l'impiego di bioderivati da mammiferi.
Con il termine di "proteine collageniche marine derivanti da spugna" si intendono proteine con struttura collagenica prodotte da poriferi, ossia precursori del collagene (procollagene), collagene, frammenti di questi o simili.
Il collagene marino ad oggi à ̈ ottenuto solo da estrazione dall'organismo sorgente, ossia dalle spugne, con notevoli difficoltà di purificazione per la frequente co-presenza di altri componenti tossici e con rilevante impatto ambientale in quanto la spugna sottoposta al processo di estrazione non proviene da allevamento ma dall'ambiente naturale.
La domanda di brevetto US 2003/0032601 descrive un metodo di estrazione di collagene da spugne.
E' noto che queste proteine ottenute da spugne presentano alcune peculiarità rispetto a quelle dei mammiferi, in particolare il collagene di spugna C. reniformis risulta essere particolarmente utile in campo cosmetico e farmacologico, in particolare per la costituzione di capsule di rivestimento per l'assunzione orale di farmaci.
Tuttavia la co-presenza nell'animale di origine di notevoli quantità di composti tossici rende difficoltoso, lungo e costoso il metodo di estrazione di questa miscela di proteine dalla biomassa di provenienza.
Scopo della presente invenzione à ̈ quello di:
produrre collagene, in particolare proteine collageniche, derivanti da spugna di mare, in modo rapido e poco costoso,
- ottenere elevate quantità di collagene senza un impatto negativo sull'ambiente (come invece accade per i metodi di produzione tradizionali che prevedono il prelievo di spugne dall'ambiente),
- ovviare ai problemi di estrazione evidenziati dall'arte nota e consentire, quindi, di avere un composto sostanzialmente puro, privo di altri componenti, anche tossici, normalmente presenti nell'organismo produttore.
Oggetto della presente invenzione à ̈ quindi un metodo per la produzione di proteine collageniche ricombinanti di spugna di mare il quale metodo prevede la trasformazione di un organismo ospite prescelto con vettori di espressione che consentono di :
- aggiungere l'informazione genetica codificante per almeno un enzima coinvolto nella modifica della struttura primaria della proteina per permetterne una sua corretta organizzazione,
- aggiungere l'informazione genetica codificante per la struttura primaria della o delle proteine.
Il metodo di produzione prevede quindi l'introduzione e l'espressione all'interno di un organismo ospite di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una catena peptidica di collagene marino e di almeno una sequenza nucleotidica codificante per un enzima o per almeno una sua subunità, il quale enzima à ̈ coinvolto nelle modifiche post-traduzionali del processo di formazione del collagene marino.
Il metodo prevede quindi, sfruttando la tecnologia ricombinante, l'espressione all'interno di un organismo ospite di almeno un gene coinvolto nel processo di produzione di collagene marino di spugna.
Secondo il metodo oggetto della presente invenzione detto organismo ospite à ̈ costituito da cellule eucariotiche di lievito trasformate con vettori di espressione: la trasformazione, con vettori di espressione ricombinanti contenenti le sequenze codificanti per almeno un enzima coinvolto nell'attività prolil-idrossilasica, permette di ottenerne ceppi in grado di esprimere tale polipeptide funzionale nel reticolo endoplasmatico della cellula del sistema ospite.
Questa cellula base potrà poi essere trasformata con uno o più specifici geni codificanti per proteine collageniche di spugna.
Vantaggiosamente per avere un'adeguata produzione di collagene ricombinante à ̈ necessario selezionare cellule che abbiamo più copie integrate di geni del collagene nel proprio genoma.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente quindi di ottenere elevate quantità di collagene e/o precursori del collagene marino di spugna all'interno di un organismo ospite che, in assenza del processo di trasformazione, non sarebbe in grado di produrre detta molecola o i suoi precursori .
Questo consente di facilitare il processo di purificazione del collagene e/o dei suoi precursori.
Vantaggiosamente, secondo la presente invenzione come organismo ospite à ̈ stato scelto un lievito (eucariote unicellulare), il quale, rispetto ad un batterio (pur essendo più semplice da utilizzare), permette di sfruttare un preesistente apparato enzimatico in grado di glicosilare, essendo comunque necessaria l'introduzione degli enzimi coinvolti nel processo di idrossilazione per consentire al lievito di produrre collagene e/o procollagene con la corretta struttura a tripla elica.
Oggetto della presente invenzione à ̈ quindi anche un sistema eucariotico per l'espressione in forma ricombinante di proteine collageniche derivanti da spugna di mare in cui le cellule esprimono, come mRNA e proteina, uno o più geni che codificano per il collagene e per uno o più enzimi necessari per le modificazioni post-traduzionali dei collageni medesimi .
Secondo l'invenzione il ceppo di lievito à ̈ stato trasformato con i geni di entrambe le subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi di spugna di mare.
In particolare la spugna appartiene alla specie C . reniformis.
Il ceppo di lievito à ̈ anche stato trasformato con specifico gene codificante per il procollagene non fibrillare di spugna C.reniformis ossia il gene ColCH.
L'organismo ospite trasformato, utilizzato per produrre proteine collageniche ricombinanti secondo la presente invenzione, Ã ̈ un ceppo di lievito Pichia pastoris .
In particolare, come descritto di seguito, sono stati utilizzati ceppi di P. pastoris del kit PichiaPinkâ„¢ Expression System, ma à ̈ possibile utilizzare qualsiasi ceppo di lievito aventi caratteristiche simili sul quale à ̈ possibile applicare la tecnologia ricombinante.
Il ceppo di P. pastoris del kit PichiaPinkâ„¢ Expression System à ̈ difettivo del gene relativo alla sintesi dell'adenina.
Le caratteristiche del kit e del ceppo sono contenute nel suo manuale di utilizzo (Pichia Expression Kit Catalog no. K1710-01, Manual part no.
25-0043).
Il ceppo non à ̈ tossico né pericoloso per l'uomo e l'ambiente.
Detto ceppo di lievito Pichia pastoris, trasformato come sopra descritto, identificato con il riferimento "Pichia pastoris ColCH4" Ã ̈ stato depositato presso la Collezione dei Lieviti Industriali DBVPG (Industriai Yeasts Collection DBVPG) , con sede in Borgo 20 Giugno 74 06121 Perugia Italia, in data 05/04/13 con numero 34P, secondo le diposizioni del Trattato di Budapest.
Vantaggiosamente il ceppo di lievito à ̈ stato trasformato, tramite tecnologia ricombinante, con un gene codificante per un collagene marino analogo al collagene di tipo IV dei vertebrati, pertanto il metodo e l'organismo oggetto della presente invenzione à ̈ anche in grado di produrre collageni di struttura complessa similari ai collageni di tipo IV degli organismi superiori.
Le cellule di lievito trasformate sono poi messe in coltura per consentire l'espressione delle proteine ricombinanti e l'estrazione/purificazione del bioprodotto ricombinante (collagene marino).
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche un metodo di trasformazione tramite tecnologia ricombinante di un ceppo di lievito per l'espressione all'interno delle cellule di detto ceppo di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una proteina enzimatica o di almeno una sua subunità coinvolta nelle modifiche di detta catena nel processo di formazione del collagene marino.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente di trasformare il ceppo di Pichia pastoris con tre differenti vettori ciascuno comprendente una specifica sequenza di DNA.
Il metodo consente quindi di introdurre nel genoma di Pichia pastoris tre differenti sequenze nucleotidiche codificanti ciascuna per una proteina coinvolta nella formazione del collagene marino.
Secondo l'invenzione detto metodo comprende i seguenti passi:
identificazione delle sequenze nucleotidiche codificanti per le catene alfa e beta dell'enzima coinvolto nelle modifiche post-traduzionali del collagene,
- preparazione ed utilizzo di almeno un vettore di espressione per l'introduzione di dette sequenze all 'interno delle cellule,
selezione degli organismi trasformati contenenti dette sequenze integrate nel proprio genoma .
Detto metodo di trasformazione del lievito per la produzione di proteine ricombinati di spugna di mare C. reniformis à ̈ possibile grazie all'identificazione dell'enzima prolil-4 -idrossilasi di spugna di mare, isolata dall'animale.
Il metodo prevede la co-trasformazione del ceppo di lievito con i due vettori comprendenti uno la sequenza codificante per le subunità alfa e l'altro la sequenza codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi, seguita dalla trasformazione con il vettore di espressione comprendente la sequenza codificante per 11 procollagene non fibrillare.
Ovviamente à ̈ possibile prevedere l'uso di un solo vettore comprendente le sequenze codificanti per entrambe le subunità.
Preferibilmente tra detti due passi à ̈ previsto un passo di selezione dei ceppi di lievito con elevata attività prolil-idrossilasica.
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche almeno un vettore di espressione per la trasformazione di un organismo ospite tramite tecnologia ricombinante.
Detti vettori comprendono le sequenze codificanti per la struttura peptidica del collagene marino e/o per i geni degli enzimi coinvolti nel processo di trasformazione di dette catene peptidiche .
Secondo l'invenzione sono stati realizzati vettori di espressione che presentano sequenze codificanti per peptidi segnale ottimali posizionate a monte delle regioni codificanti le proteine di interesse.
Preferibilmente secondo l'invenzione sono stati sviluppati vettori di espressione comprendenti:
cDNA codificante (SEQ ID NO: 1) per la subunità alfa della prolil-4-idrossilasi (vettori pPinkHC\α o pPinkLC\α),
cDNA codificante (SEQ ID NO: 3) per la subunità beta della prolil-4-idrossilasi (vettore apPIC6B\PDI)
cDNA codificante (SEQ ID NO: 5) per il collagene non fibrillare di C. reniformis (pPICZB\colCH).
In particolare, in una forma esecutiva della presente invenzione, nel vettore di espressione con la sequenza di DNA codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi il sito di clonaggio à ̈ preceduto dalla regione codificante per l'Alfa Mating factor (AM) di S. cerevisiae.
E' possibile prevedere l'uso di altri fattori di secrezione oltre a quello sopra indicato.
Secondo la presente invenzione sono stati caratterizzati gli enzimi responsabili della idrossilazione delle catene peptidiche nel processo di biosintesi del collagene nella spugna e le loro sequenze geniche e con esse à ̈ stato trasformato un lievito, in particolare à ̈ stato caratterizzato l'enzima prolil-4-idrossilasi (subunità alfa e beta) di C.reniformis.
Detto enzima appartiene alla categoria delle prolil-idrossilasi di tipo II.
I polipeptidi che costituiscono le subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi della spugna di mare C. reniformis e la loro rispettiva sequenza amminoacidica non sono noti allo stato dell'arte.
In particolare oggetto dell'invenzione sono le sequenze nucleotidiche ed amminoacidiche che codificano le subunità alfa e beta dell'enzima prolil 4-idrossilasi (rispettivamente (SEQ ID NO: 1,2,3 e 4).
I geni (SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO:3) codificanti per l'enzima avente attività idrossilasica nel
procedimento di produzione di collagene marino di C.reniformis sono stati isolati dall'organismo e identitificati tramite il procedimento tecnico (PCR) descritto con maggiori dettagli di seguito.
Il metodo e l'organismo trasformato tramite vettori oggetto della presente invenzione consentono quindi la produzione su larga scala di proteine della matrice extracellulare derivanti da spugne, le quali proteine, in particolare il collagene ed i suoi derivati, potranno essere utilizzate nel settore biomedico, farmaceutico e cosmetico.
Il collagene marino à ̈ un biomateriale che può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con il collagene di mammifero.
Il metodo di ottenimento per via ricombinante presenta numerosi vantaggi:
- consente una produzione su larga scala senza impatto sull'ambiente in quanto non utilizza animali che vivono in natura (Ã ̈ noto infatti che le spugne sono animali non facilmente allevabili, pertanto i metodi tradizionali per la produzione di collagene sfruttano animali non di allevamento con notevole impatto ambientale),
elimina il problema della co-presenza di metaboliti secondari nei preparati naturali (i metodi tradizionali di base che prevedono l'estrazione di collagene da spugne non separano con sufficiente efficacia i metaboliti secondari e questo inconveniente può conferire all'estratto notevole tossicità. Questo complica il processo di estrazione obbligando a costosi e lunghi processi di purificazione del materiale estratto),
consente di ottenere biomateriale estratto pulito (ossia privo di sostanze tossiche ed estranee al collagene ed ai suoi derivati), ben caratterizzato ed omogeneo,
annulla il rischio di avere contaminanti tossici o sostanze allergeniche, grazie alla produzione di collagene marino in lievito (comunemente presenti nelle matrici naturali e/o nel collagene suino o bovino).
Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno più chiaramente dalla seguente descrizione di alcuni esempi esecutivi illustrati nei disegni allegati in cui:
la fig.1 illustra la strategia di cotrasformazione del ceppo di lievito difettivo per il gene relativo alla sintesi dell'adenina, con i tre vettori, contenenti rispettivamente 1) il gene codificante la sub-unità a di P4H e il gene Ade+, 2) il gene relativo alla sintesi della PDI, con il marcatore per la resistenza alla blasticidina, e 3) il gene codificante per il collagene non fibrillare con marcatore per la resistenza alla zeocina. I ceppi co-trasformati vengono facilmente selezionati in piastre prive di adenina e con l'antibiotico blasticidina e zeocina;
la fig.2 illustra schematicamente i tre vettori di espressione ed il relativo marcatore di selezione;
le fig.3a e 3b illustrano la mappa dei vettori pPinkLC e pPinkHC.
la fig.4 illustra la mappa del vettore apPIC6; la fig.5 illustra la mappa del vettore pPICZA; la fig.6 illustra l'attività della P4H ricombinante nei diversi ceppi di P. pastoris analizzata mediante la quantificazione della<14>C02prodotta dalla decarbossilazione del 2-oxo [l-<14>C] glutarato; come controllo à ̈ stato utilizzato il ceppo αβΙΗ incubato per 30 minuti in ghiaccio con un inibitore specifico della P4H, l'acido cumalico;
la fig.7 illustra la comparazione dell'attività della P4H ricombinante nei due ceppi di P. pastoris High copy e Low copy analizzata mediante la quantificazione della<14>C02prodotta dalla decarbossilazione del 2-oxo [l-<14>C] glutarato; come controllo à ̈ stato utilizzato il ceppo αβΙΗ incubato per 30 minuti in ghiaccio con un inibitore specifico della P4H, l'acido cumalico;
la fig.8 illustra la valutazione dell'espressione della P4H ricombinante nel tempo sul ceppo αβ2L.; l'espressione della P4H à ̈ stata analizzata mediante la quantificazione dell'attività enzimatica (<14>C02prodotta dalla decarbossilazione del 2-oxo [l-<14>C] glutarato) ; come controllo à ̈ stato utilizzato il ceppo αβ1Η incubato per 30 minuti in ghiaccio con un inibitore specifico della P4H, l'acido cumalico;
la fig.9 illustra l'analisi quantitativa relativa al numero di copie di geni inseriti stabilmente nel genoma dei diversi ceppi di lievito trasformati ;
la fig. 10 illustra l'espressione degli mRNA relativi ai tre geni inseriti nei ceppi di P. pastoris P4H, PDI e ColCH valutati mediante PCR quantitativa. I livelli di espressione dei messaggeri sono stati analizzati nei lieviti 24 ore dopo l'induzione. T0 rappresenta il campione controllo costituito dal ceppo ColCH4 estratto immediatamente dopo 1'indùzione;
la fig.ll illustra l'analisi mediante SDS-Page seguita da colorazione di Coomassie del (a) e del terreno di coltura concentrato e dializzato contro acqua (b) di ceppi di P. pastoris indotti con metanolo.
a) 50 Î1⁄4g di proteine derivate da totale del ceppo αβ2L> (A) e del ceppo ColCH4 (B) dopo induzione con metanolo per 60 ore.
b) 30 Î1⁄4g di proteine presenti nel terreno di coltura concentrato e dializzato del ceppo ColCH4 che non à ̈ stato indotto (C) o che à ̈ stato indotto per 60 ore con metanolo (D); 15 Î1⁄4g di proteine presenti nel terreno di coltura concentrato e dializzato del ceppo αβ2L (F) e ColCH4 (E) indotti per 60 ore con metanolo;
la fig.12 illustra l'identificazione tramite spettro MS<2>del peptide triptico GAVGPGGKPGPR (doppio caricato m/z 525.5).
Secondo la presente invenzione il metodo per la produzione di proteine collageniche ricombinanti derivanti dalla spugna di mare C. reniformis, in particolare di pro-collagene idrossilato, prevede l'utilizzo di un organismo ospite costituito da un ceppo di lievito geneticamente modificato.
Il metodo di ottenimento di detto organismo atto alla produzione di proteine di spugna di mare ricombinanti prevede la co-trasformazione di ceppi di lievito con tre differenti vettori di espressione comprendenti rispettivamente:
la sequenza codificante per la subunità a dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H),
la sequenza codificante della subunità β dell'enzima prolil-4-idrossilasi (Proteina Disolfuro Isomerasi, PDI),
- la sequenza codificante per un collagene di tipo non fibrillare.
Il ceppo di lievito utilizzato à ̈ il ceppo di Pichia pastoris.
Preferibilmente il metodo di ottenimento prevede la trasformazione del ceppo con i vettori con le sequenze codificanti per l'enzima coinvolto nella modifica post-traduzionale della proteina collagenica e la successiva trasformazione di detto ceppo (contenente i geni per codificanti per le subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi) con uno o più geni codificanti per proteine collageniche di spugna di mare.
Secondo l'invenzione il ceppo trasformato tramite specifico vettore di espressione, come descritto con maggiore dettaglio di seguito, contiene il gene codificante per il procollagene di spugna C. reniformis ColCH.
La sequenza nucleotidica del gene (ColCH) codificante per il pro-collagene non fibrillare e la sequenza amminoacidica della proteina di procollagene non fibrillare à ̈ accessibile in GenBank con numero DQ874470.
Il gene ColCH codificante per la proteina di pro-collagene non fibrillare ha una sequenza nucleotidica secondo la SEQ ID NO: 5.
La proteina ColCH ha una sequenza amminoacidica secondo la SEQ ID NO:6.
Oggetto della presente invenzione sono la sequenza codificante per la subunità a dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) e la sequenza codificante per la subunità β del detto enzima (Proteina Disolfuro Isomerasi, PDI), non ancora note allo stato dell'arte. Dette sequenze sono state isolate, identificate, inserite in vettori plasmidici e clonate in ceppi di E. coli.
Il gene codificante per la subunità alfa della proteina enzimatica prolil-4-idrossilasi (P4H) presenta una sequenza nucleotidica corrispondente alla sequenza SEQ ID NO: 1.
La subunità alfa della proteina prolil-4 -idrossilasi (P4H) presenta una sequenza amminoacidica corrispondente alla sequenza SEQ ID NO: 2.
Il gene codificante per la proteina Disolfuro Isomerasi (PDI) (subunità beta dell'enzima Prolil 4 -idrossilasi) presenta una sequenza nucleotidica corrispondente alla sequenza SEQ ID NO: 3.
La proteina Disolfuro Isomerasi (PDI) presenta una sequenza amminoacidica corrispondente alla sequenza SEQ ID NO: 4.
Come illustrato in figura 1 per la realizzazione dei ceppi di P. pastoris in grado di esprimere e quindi produrre proteine ricombinanti, Ã ̈ stato utilizzato il kit commerciale PichiaPinkâ„¢ Expression System (Life Technology), in cui ceppi denominati Pichia Pink â„¢ sono difettivi per il gene relativo alla sintesi dell'adenina (ade2); i vettori presenti nel kit (pPinkHC o pPinkLC) contengono il gene ADE2, che permette al lievito trasformato di crescere su terreno privo di adenina.
Questo ceppo commerciale à ̈ adatto all'espressione di un singolo polipeptide ricombinante per volta.
La presente invenzione prevede una modificazione del metodo di trasformazione del lievito e ha permesso l'integrazione di tre differenti sequenze codificanti, inserite in tre vettori differenti, e la loro co-espressione in un unico sistema.
I vettori presenti nel kit (pPinkHC o pPinkLC) e che contengono il gene ADE2 sono stati utilizzati per contenere la sequenza codificante per la subunità a dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H).
Per la sequenza codificante la subunità β (Proteina Disolfuro Isomerasi, PDI) à ̈ stato utilizzato un vettore di espressione contenente il marcatore per la resistenza alla blasticidina.
Per la sequenza codificante il pro-collagene di C. reniformis à ̈ stato utilizzato un vettore pPICZ contenente geni che conferiscono la resistenza all'antibiotico zeocina.
CDNA Vettore di Vettore di
Tipo di espressione usato espressione
selezione ricombinante ottenuto
P4H pPink pPink\a Ade+ PDI apPIC6 B apPIC6 B\PDI Resistenza blasticidina COLLIeh pPICZ pPICZ\Colch Resistenza zeocina
Dopo la trasformazione, i ceppi in cui si erano integrate le tre sequenze codificanti sono stati facilmente selezionati in piastre prive di adenina, con i suddetti antibiotici.
Poiché l'enzima ricombinante prolil-4 idrossilasi deve svolgere la propria attività enzimatica all'interno della cellula di lievito, ossia à ̈ necessario che nella cellula di lievito ricombinante siano presenti entrambe le sequenze codificanti per le subunità alfa e beta dell'enzima, la sequenza codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) e per il collagene (ColCH) sono state inserite nei vettori di espressione provviste dei loro peptidi segnali, mentre nella sequenza codificante per la subunità beta dell'enzima (PDI) il peptide segnale proprio à ̈ stato sostituito con quello di S. cerevisiae AlfaMating factor (AM), scegliendo la versione del vettore pPIC6 in cui il MCS (multi cloning site, sito di multi clonaggio) , à ̈ preceduto dalla sequenza codificante per questo peptide segnale (apPIC).
Identificazione e clonaggio delle sequenze codificanti per la subunità alfa e beta della prolil-4-idrossilasi di C. reniformis.
Le sequenze codificanti complete per la subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H e PDI) di C. reniformis sono state identificate mediante approccio PCR.
In entrambi i casi sono state identificate zone altamente conservate delle regioni codificanti della P4H e della PDI della specie A. queenslandica ; all'interno di esse sono stati disegnati quindi un set di oligonucleotidi da impiegare come primers senso in reazioni di PCR in cui, come antisenso.
veniva impiegato un oligonucleotide dalla sequenza (5'-GTACTAGTCGACGCGTGGCC -3'), in grado di appaiarsi in modo specifico all'estremità 3' di sequenze di cDNA opportunamente retrotrascritte con un oligo-dT-adapter (5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ') come innesco .
Una volta identificata amplificata e sequenziata una prima regione all'estremo 3' del cDNA della due sequenze, con il sistema GeneRacerâ„¢ (Life Technology) Ã ̈ stato possibile amplificare e sequenziare la regione mancante in 5'.
Una volta completata l'intera sequenza nucleotidica del cDNA, à ̈ stata fatta un'ultima reazione di amplificazione ad alta fedeltà, impiegando una coppia di primers collocati nelle regioni più esterne del cDNA e 1 Î1⁄4l di prodotto di amplificazione à ̈ stato inserito, mediante una reazione ligasica, nel plasmide pCR*II e clonato in ceppi di E. coli.
Le sequenze sino ad oggi non note allo stato dell'arte dei cDNA della P4H e della PDI di C. reniformis ottenute sono state analizzate utilizzando l'algoritmo BLAST nel "National Centre for Biotechnology Information" (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast .cgi).
Le sequenze amminoacidiche dedotte sono state analizzate usando "SignalP 3.9 server" (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) , per identificare il sito di taglio dell'eventuale peptide segnale .
In relazione alla sequenza amminoacidica dedotta di P4H, l'analisi con Signal P 3.9 Server rivela la probabile presenza di un peptide segnale in posizione 1-28 con sito di taglio tra Gly 27 e Glu 28. La presenza di un dominio Pfam P4Ha_N (subunità a della P4H, regione N-terminale) tra l'aa 32 e l'aa 163 indica che la proteina à ̈ un membro della superfamiglia delle prolil-4-idrossilasi, mentre tra i residui 332 e 517 c'à ̈ un P4Hc (dominio omologo della sub-unità a della prolil-4-idrossilasi) al cui interno à ̈ presente un dominio 20G-Fell_0xy (residui 412-517), che si trova nei membri della superfamiglia delle ferro-diossigenasi 2-ossoglutarato (20G)-dipendenti, così come il C-terminale della sub-unità a della P4H , che à ̈ una regione coinvolta nell'attività catalitica. Inoltre à ̈ presente un potenziale sito di N-glicosilazione in posizione 157 (Asp) all'interno dei tetra-amminoacido 157-160, mentre non à ̈ presente alcun sito di O-glicosilazione. Infine tra i residui 302 e 304 à ̈ presente la triade His-His-Lys che lega il gruppo carbossilico al C5 del 2-ossoglutarato .
Il prodotto putativo della traduzione di P4Hach ha un peso molecolare stimato di 61,9 kDa ed un punto isolelettrico di 6,31.
In relazione alla sequenza amminoacidica dedotta della PDI, l'analisi con Signal P 3.9 Server rivela la probabile presenza di un peptide segnale in posizione 1-16 con un sito di taglio tra Gly 16 e Ala 17. Le analisi con BLAST e Smart della sequenza del polipeptide mostrano la presenza di quattro differenti domini TRX (avvolgimento tioredossinatipo): 1) PDIa, motivo TRX redox attivo all'N-terminale tra l'aa 30 e il 127; 2) PDIb, motivo TRXslmile redox inattivo tra aa 135 e aa 230; 3) PDIb', motivo TRX-simile redox inattivo tra aa 242 e aa 345, 4) PDIa_PDIa'C con una regione TRX redox attiva al C-terminale in posizione 366-466. Non sono presenti siti di N- e O-glicosilazioni. In ciascuno dei due domini TRX con attività redox (PDIa e PDIa_PDIa'C) à ̈ presente il motivo -Cys-Gly-His-Cys-, che rappresentano due siti catalitici che agiscono indipendentemente per l'attività della PDI.
Il prodotto putativo della traduzione della PDI ha un peso molecolare stimato di 58,8 kDa ed un punto isoelettrico di 4,34.
Preparazione dei vettori di espressione Preparazione del vettore di espressione comprendente la sequenza codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil 4-idrossilasi (P4H): pPinkHC\α e di pPinkLC\α
Il cDNA codificante per la sub-unità a della prolil-4-idrossilasi di C. reniformis, esteso dalla sequenza consenso per l'inizio della traduzione fino al codone di stop, e fiancheggiato dal sito per EcoRI in 5' e per KpnI in 3', à ̈ stato amplificato mediante PCR e inserito con reazione ligasica all'interno dell'MCS nel vettore pPinkHC (high copy) o pPinkLC (low copy) (Fig.3b e 3a) (Life Technologyâ„¢), preventivamente linearizzati con EcoRI e con Kpnl, generando così, rispettivamente, pPinkH/α e pPinkL/a.
Nello specifico, al fine di introdurre immediatamente prima del codone codificante per la metionina iniziale la sequenza consenso di lievito, relativa all'inizio della traduzione (sequenza di Kozac, gaaacg), Ã ̈ stata eseguita un'amplificazione in PCR in due step.
Una prima amplificazione à ̈ stata effettuata impiegando la coppia di primers FwalfaRO come senso e RewalfaT come antisenso:
• nome: FwalfaRO
sequenza : 5'-gaaacgatgcagttggtattagggatgagt-3' posizione:1-24
SEQ ID NO: 7.
• nome: RewalfaT
sequenza: 5'-cgcaaagtggtatgacaatga-3' posizione: 1642-1663
SEQ ID NO: 8
• nome: FwalfaRl
sequenza: 5'-aattGAATTCgaaacgatgcagttggtatt-3' posizione: 1 - 14
SEQ ID NO: 9
• nome: RewalfaRl
sequenza: 5'-aattGGTACCcgcaaagtggtatgacaatg-3' posizione: 1642-1662
SEQ ID NO: 10
(doppia sottolineatura utilizzata per identificare la sequenza di Kozac, in maiuscolo sono stati indicati i siti di restrizione mentre la sottolineatura singola indica le triplette di inizio e fine dell'ORF)
L'amplificazione à ̈ avvenuta secondo le condizioni sotto riportate:
Conc . Reagenti (Î1⁄4l)
finale High Fidelity PCR Buffer lOx 2.5 lx dNTP mix 10 mM 0.5 0.2 mM MgS0450mM 1 2 mM FwalfaRO 10 Î1⁄4Îœ 0.5 0.2 Î1⁄4Îœ RewalfaTIO Î1⁄4Îœ 0.5 0.2 Î1⁄4Îœ Plasmide pCR<^>II /P4H (40 ng/Î1⁄4Î ) 1.6
1
preparato in sez. 6.5.1. ng/Î1⁄4Î Platinum Taq High Fidelity (Life 1.0 0.1 Technologyâ„¢) unità H20 sterile 18.9 Volume Totale 25
Il profilo termico prevede 2 minuti di denaturazione iniziale a 94°C, seguiti dalla ripetizione per 20 cicli di 30 secondi a 94°C, 30 secondi a 60°C, 1,5 minuti a 68°C; una volta terminati i cicli, 7 minuti a 68°C.
L'amplificato ottenuto dalla reazione à ̈ stato poi diluito 1:100 e amplificato con le stesse modalità, impiegando la coppia di primers FwalfaRl come senso e RewRl come antisenso. In tal caso il profilo termico à ̈ stato: 2 minuti di denaturazione iniziale a 94°C, seguiti dalla ripetizione per 28 cicli di 30 secondi a 95°C, 30 secondi a 62°C, 1,5 minuti a 68°C; quindi, una volta terminati i cicli, 10 minuti a 68°C.
Otto reazioni di amplificazione identiche sono state riunite e purificate con il kit commerciale High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) secondo le indicazioni del prodotto.
Amplificato purificato e vettori pPink HC o pPink LC sono stati quindi digeriti con EcoRI e Kpnl ed in fine à ̈ allestita la seguente reazione ligasica:
Reagenti Volume
Ligase buffer 5x 2 Î1⁄4Î
H20 sterile 1.9 /il
Plasmide digerito e
4 /il
purificato 4.9 ng/Î1⁄4Î
Inserto digerito e
1.6 /il
purificato 12 ng/Î1⁄4l
T4 DNA ligase (5U//il) 0.5 /il
Volume finale 10 /il
La reazione à ̈ stata effettuata per 18 ore a 16°C.
I Î1⁄4Î di prodotto della reazione ligasica à ̈ stato clonato in batteri One shot TOPIO chimicamente competenti (Life technologies). Identificate le colonie positive mediante analisi con PCR, i vettori ricombinanti pPinkHC/α e pPinkLC/a sono stati estratti da 200 mi di sospensione di E. coli trasformati, mediante impiego del kit Nucleobond Xtra midi (Macherey-Nagel) e successivamente linearizzati con l'enzima di restrizione Spel (Bcul).
Preparazione del vettore di espressione comprendente la sequenza codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi (proteina disolfuro Isomerasi PDI):αpPIC6B/PDI
Il cDNA codificante per la subunità β della prolil-4-idrossilasi (PDI) di C. reniformis, esteso dal codone codificante per il primo amminoacido (Ala i7), dopo il sito di taglio del peptide segnale, fino al codone di stop, e fiancheggiato dai siti per Pmll in 5' e per NotI in 3', à ̈ stato amplificato mediante PCR con FwPDIr come primer senso e RewPDIr come primer antisenso:
• nome: FwPDIr
sequenza: 5'-aattCACGTGgcagacgatatccctgaaga-3' posizione: 49 - 69
SEQ ID NO: 11
• nome: RewPDIr
sequenza: aattGCGGCCGCctaaagttcaatcttttt-3' posizione: 1579-1597
SEQ ID NO: 12
(in maiuscolo sono evidenziati i siti di restrizione ed à ̈ stata sottolineata la tripletta di STOP) .
Il cDNA à ̈ stato quindi inserito con reazione ligasica all'interno dell'MCS nel vettore αpPIC6B (Life Technologyâ„¢) (Figura 4), preventivamente linearizzati con Piali e con Noti, generando così il costrutto apPIC6B/PDI.
La reazione di amplificazione à ̈ stata eseguita nelle condizioni sotto riportate:
Conc. Reagenti (Î1⁄4Î )
finale High Fidelity POR Buffer lOx 2.5 lx dNTP mix 10 mM 0.5 0.2 mM MgS0450mM 1 2 mM FwPDIr 10 Î1⁄4Îœ 0.5 0.2 Î1⁄4Îœ FwPDIr 10 /zM 0.5 0.2 Î1⁄4Îœ Plasmide pCR<^>II /PDI (50 ng/Î1⁄4Î )
1 2 ng/Î1⁄4Î preparato in sez. 6.5.1.
Platinum Tag High Fidelity (Life
0.1 1.0 unità Technology™)
H20 sterile 18.9
Volume Totale 25
Il profilo termico prevede: 2 minuti di denaturazione iniziale a 94°C, seguiti dalla ripetizione per 30 cicli di 30 secondi a 94°C, 30 secondi a 58°C, 2 minuti a 68°C; quindi, una volta terminati i cicli, 7 minuti a 68°C.
Otto reazioni di amplificazione identiche sono state riunite e purificate con il kit commerciale High Pure PCR Produci Purification Kit (Roche) secondo le indicazioni del prodotto.
Amplificato purificato e vettore PIC6aB, sono stati quindi digeriti prima con Pmll per 2 ore a 37°C.
Al termine della reazione à ̈ stata allestita la seconda digestione con NotI.
Inserto e vettore sono stati impiegati per la seguente reazione ligasica:
Reagenti Volume Ligase buffer 5x 2 Î1⁄4l
H20 sterile 1.5 Î1⁄4l Plasmide digerito e
4 Î1⁄4l purificato 5.1 ng/Î1⁄4Î
Inserto digerito e
2 Î1⁄4l purificato 21.25 ng/Î1⁄4l
T4 DNA ligase (5U/Î1⁄4l) 0.5 Î1⁄4l Volume finale 10 Î1⁄4l
La reazione à ̈ stata effettuata per 18 ore a 16°C.
1 Î1⁄4l di reazione ligasica così preparata, à ̈ stata usata per trasformare il ceppo di E. coli TOP10 chimicamente competente, secondo procedure standard con la differenza che l'antibiotico impiegato à ̈ stato in tal caso la blasticidina, usata 100 Î1⁄4g/ml, e che il terreno di coltura utilizzato à ̈ stato LB medium con una concentrazione NaCl dimezzata. Dopo aver identificato le colonie positive mediante analisi con PCR, il vettore ricombinante apPIC6B/PDI à ̈ stato estratto da 200 mi di sospensione di E. coli trasformati, mediante il kit Nucleobond Xtra midi (Macherey-Nagel) e linearizzato con l'enzima Spel (BcuI), secondo lo schema sottostante:
Reagenti Volume
Buffer 10 X 25 Î1⁄4l
Sac I lOu/Î1⁄4Ι (Thermo
60 Î1⁄4Î Scientific)
Vettore <xpPIC6B/PDI 2,3
26 Î1⁄4l
mg/mi
H20 sterile 139 Î1⁄4l Volume finale 250 Î1⁄4l
Preparazione_ del vettore di espressione comprendente la sequenza codificante per procollagene non_ fibrillare di_ C.reniformis: pPICZB\ColCH
Il cDNA codificante per il procollagene non fibrillare di C. reniformis (accessibile su GenBank DQ874470 e mostrato in SEQ ID NO: 5) esteso dalla sequenza consenso per l'inizio della traduzione fino al codone di stop e fiancheggiato dai siti per Pmll in 5' e per Noti in 3', à ̈ stato amplificato mediante PCR, quindi inserito con reazione ligasica all'interno dell'MCS nel vettore pPICZA (Life Technologyâ„¢) (Figura 5), preventivamente linearizzato con PmlI e con NotI generando così il costrutto pPICZA/ColCH.
Anche in questo caso, al fine di introdurre immediatamente prima del codone codificante per la metionina iniziale la sequenza consenso di lievito, relativa all'inizio della traduzione (sequenza di Kozac, gaaacg) , Ã ̈ stata eseguita un'amplificazione in PCR in due fasi.
Una prima amplificazione à ̈ stata effettuata impiegando la coppia di primers FwColRO come senso e RewColRT come antisenso:
• nome: FwColRO
sequenza : 3'-GAAACGatggagaagaccagttctaaagtg-5' posizione: 1 - 24
SEQ ID NO: 13
• nome: FwColR
sequenza: 3'-AATTCACGTGGAAACGatggagaagaccag -5' posizione: 1 - 14
SEQ ID NO: 14
• nome: RewColR
sequenza: 5'-AATT GCGGCCGC ttactttgtgcacactgc-3' posizione: 2275-2292
SEQ ID NO: 15
(in maiuscolo e sottolineato à ̈ indicata la sequenza di Kozac, in maiuscolo con doppia sottolineatura i siti di restrizione, in minuscolo e sottolineato le triplette di inizio e fine dell'ORF), secondo le condizioni sotto riportate:
Conc . Reagenti (Î1⁄4l)
finale High Fidelity PCR Buffer lOx 2.5 lx dNTP mix 10 mM 0.5 0.2 mM MgS0450mM 1 2 mM FwColRO 10 Î1⁄4Îœ 0.5 0.2 Î1⁄4Îœ RewColR 10 Î1⁄4Îœ 0.5 0.2 Î1⁄4Îœ Plasmide pCR<^>II /ColCH (40
1 1.6 ng/Î1⁄4Î ng/Î1⁄4Î )
Platinimi Taq High Fidelity
0.1 1.0 unità (Life Technology™)
H20 sterile 18.9 Volume Totale 25
Il profilo termico prevede 2 minuti di denaturazione iniziale a 94°C, seguiti dalla ripetizione per 15 cicli di 30 secondi a 94°C, 30 secondi a 63.7°C, 2,5 minuti a 68°C; una volta terminati i cicli, 7 minuti a 68°C.
1 Î1⁄4l di prodotto di PCR ottenuto dalla reazione à ̈ stato amplificato con le stesse modalità, impiegando la coppia di primers FwColRl come senso e RewColR come antisenso. In tal caso il profilo termico à ̈ stato: 2 minuti di denaturazione iniziale a 94°C, seguiti dalla ripetizione per 28 cicli di 30 secondi a 95°C, 30 secondi a 62°C, 2,5 minuti a 68°C; quindi, una volta terminati i cicli, 10 minuti a 68°C.
Otto reazioni identiche di questa amplificazione sono state riunite e purificate con il kit commerciale High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) secondo le indicazioni del prodotto. Amplificato, purificato e vettore PICZA, sono stati quindi digeriti prima con PmlI e poi con NotI.
A termine à ̈ stata allestita la seguente reazione ligasica:
Reagenti Volume Ligase buffer 5x 2 Î1⁄4l
H20 sterile 1 Î1⁄4l Plasmide digerito e
6.5 Î1⁄4l purificato 2.71 ng/Î1⁄4l
Inserto digerito e
1 Î1⁄4l purificato 20 ng/Î1⁄4l
T4 DNA ligase (250U/Î1⁄41) 0.5 /il Volume finale 10 Î1⁄4l
La reazione à ̈ stata effettuata per 18 ore a 16 °C.
1 Î1⁄4l di reazione ligasica così preparata, à ̈ stata usata per trasformare il ceppo di E. coli TOP10 chimicamente competente, secondo la procedura standard, con la differenza che l'antibiotico impiegato à ̈ stato in tal caso la zeocina, usata 100 Î1⁄4g/ml, e che il terreno di coltura utilizzato à ̈ stato LB medium con una concentrazione di NaCl dimezzata rispetto allo standard.
Dopo aver identificato le colonie positive mediante analisi con PCR, il vettore ricombinante pPICZA/ColCH Ã ̈ stato estratto da 200 mi di sospensione di E. Coli trasformati, mediante il kit Nucleobond Xtra midi (Macherey-Nagel) e linearizzato con l'enzima Pmel.
Trasformazione e selezione dei ceppi di P. pastoris con attività proli-idrossilasica
I quattro differenti ceppi di P. pastoris presenti nel kit PichiaPinkâ„¢ Expression System (Life Technologyâ„¢), con i genotipi sotto indicati, sono stati resi chimicamente competenti utilizzando in kit EasyCompâ„¢ (Life Technologyâ„¢), secondo le indicazioni del prodotto.
Genotipo
Ceppo Pichia Pink â„¢
predominante 5
1 (wild type) ade2
2 ade2, pep4 3 ade2,prbl
4 ade2, pep4, prbl
10
I 4 ceppi resi competenti, sono stati quindi cotrasformati, con le modalità riportate nel kit PichiaPink™ Expression System (Life Technology™), con 5 pg pPinkHC/α o di pPinkLC/a linearizzati e con 5 pg di apPIC6B/PDI linearizzato.
In questo caso specifico, poiché il marcatore per la selezione del vettore αpPIC6B/PDI era la resistenza ad un antibiotico, dopo lo shock termico, le cellule sono state incubate per 2 ore a 30°C in presenza di YPD, per permettere l'espressione del gene che conferisce tale resistenza.
Solo dopo questo tempo, le cellule sono state piastrate su piastre selettive PAD/agar senza adenina con blasticidina 0,3 mg/mi, generando così gli 8 differenti ceppi sotto riportati, esprimenti contemporaneamente la subunità a della prolil-4-idrossilasi e la proteina disolfuro isomerasi (PDI), preceduta dall'Alfa Mating factor di S. cerevisiae. Un controllo negativo à ̈ stato realizzato trasformando il ceppo Pichia pinkl di P. pastoris con 5 pg pPinkHC vuoto e 5 pg di apPIC6B vuoto.
Ceppo Polipeptide
Nome VETTORE SELEZIONE trasformato espresso
Plchia pinK adenina/ αβΙΗ pPinkHCa/apPIC6BPDI P4H<a>/amI’DI<b>
1 blasticidina Pichla pinK adenina/ αβ2Η pPinkHCa/apPIC6BPDI P4H/amPDI
2 blasticidina Plchia pinK adenina/ αβ3Η pPinkHCa/apPIC6BPDI P4H/amPDI
3 blasticidina Plchia pinK adenina/ αβ4Η pPinkHCa/apPIC6BPDI P4H/amPDl
4 blasticidina Pichla pinK adenina/ αβΠΠι pPinkLCa/apPIC6BPDI P4H/amPDI
1 blasticidina Pichla pinK adenina/ αβ2Ι· pPinkLCa/apPIC6BPDI P4H/amPDI
2 blasticidina Plchia pinK adenina/ αβ3Ι<pPinkLCa/ocpPIC6BPDI P4H/amPDI
3 blasticidina Pi chia pinK adenina/ αβ4Ι<pPinkLCa<'>apPIC6BPDI P4H/amPDI
4 blasticidina Pichia pinK adenina\ negativo pPinkHC/apPIC6BI niente
1 blasticidina<a>subunità a della prolil-4-idrossilasl di C. reni fonai 8
<b>subunità β della prolil-4 -idrossilasi di C. renifonais (PDI) il cui peptide segnale à ̈ stato sostituito con quello di S. cerevisiae Alpha mating (AM) .
L'avvenuta inserzione dei costrutti di espressione nel genoma di P. pastoris à ̈ stata verificata su almeno 5 colonie positive di ciascun tipo di ceppo, mediante PCR tradizionale con la procedura riportata sul manuale del kit PichiaPinkâ„¢ Expression System (pag. 70) (Life Technologyâ„¢) .
Al posto dei primers universali forniti dal kit tuttavia sono stati usati un set di primers specifici per questa specifica applicazione.
I primers universali, infatti, sono progettati per appaiarsi alle regioni fiancheggianti il sito di clonaggio che nei due vettori à ̈ identico: i due geni eventualmente integrati nel genoma del lievito, quindi competerebbero per la stessa coppia di primers .
Per ovviare a questo problema si sono usate coppie di oligonucleotidi in cui il primer senso appaiasse con una regione del vettore e l'antisenso con una regione dell'inserto che à ̈ quindi genespecifico.
Anche i primers senso pur essendo complementari al vettore differiscono tra P4H e PDI, poiché il vettore usato per la PDI ha il sito di clonaggio preceduto dalla regione codificante per l'Alfa Mating factotor (AM) di S. cerevisiae ed à ̈ proprio in questa regione che si à ̈ scelto di far appaiare il primer senso per verificare 1'avvenuta integrazione del costrutto apPIC6B\PDI nel genoma di lievito.
Le sequenze di primers impiegati per la verifica mediante PCR dell'avvenuta integrazione dei costrutti ricombinanti nel genoma di lievito sono i seguenti:
FwOxi: 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3' SEQ ID NO: 16 RewP4H: 5'-CCAAAGCCACAGCAGACATA-3' SEQ ID NO: 17 FwAM: 5'-CTATTGCCAGCATTGCTGC-3' SEQ ID NO: 18 RewPDI: 5'TCACAATGTCCTCTGCTTGC-3' SEQ ID NO: 19 Coltivazione dei ceppi di P. pastoris e induzione_ dell'espressione_ delle_ proteine ricombinanti
Le cellule di lievito sono state messe in coltura.
L'espressione delle proteine ricombinanti à ̈ stata effettuata in sospensioni di cellule di lievito cresciute prima in terreno minimo con glicerolo 1% (BMGY, pH 6.0) e poi trasferite in terreno minimo con metanolo (BMMY, pH 6.0) al fine di avviare 1'induzione dell'espressione.
Durante l'espressione, fatta avvenire a 28°C in agitazione a 250 rpm, ogni 12 ore sono stati aggiunti metanolo allo 0,5 % ed acido ascorbico alla concentrazione finale di 80 Î1⁄4g/ml.
La temperatura può essere compresa tra 20 e 30°C.
Analisi delle proteine ricombinati prodotte La produzione delle proteine ricombinanti à ̈ stata valutata mediante analisi dell'attività dell'enzima P4H nei lisati cellulari di lievito.
Dapprima nei quattro ceppi αβΗΙ, αβΗ2, αβΗ3 e αβΗ4.
Le cellule, dopo 60 ore di induzione in terreno BMMY, sono state recuperate centrifugando per 10 minuti a 1.500 x g, a temperatura ambiente, lavate una volta con terreno BMMY e risospese nel seguente tampone: NaCl 0,1 M, glieina 0,1 M, Triton X-100 0,05%, ditiotreitolo (DTT) 10 Î1⁄4Îœ, Tris-HCl 10 mM pH 7.8, cocktail di inibitori delle proteasi diluito 1:100 (P8465 Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), il tutto precedentemente raffreddato in ghiaccio.
Le cellule sono state utilizzando un omogenizzatore di Potter e l'avvenuta lisi cellulare à ̈ stata monitorata al microscopio ottico (Olympus CKX41).
In seguito il liso à ̈ stato centrifugato a 15.000 x g per 15 minuti, a 4°C, al fine di ottenere la sola frazione citosolica e microsomiale, il sopranatante à ̈ stato recuperato e mantenuto in ghiaccio fino al successivo dosaggio dell'attività della P4H mediante il metodo descritto da Kivirikko e Myllyla, basato sull' idrossilazione accoppiata alla decarbossilazione del 2-osso [1-<14>C]glutarato, con alcune modificazioni.
Utilizzando 0,5 Î1⁄4Ci di 2-osso [l-<14>C]glutarato à ̈ stata fatta avvenire la reazione in una particolare ampolla costituita da due camere comunicanti ed ermeticamente sigillate: l'ampolla consente la cattura della C02sviluppata durante il dosaggio dell'attività della P4H in lisato di P. pastoris.
In una delle due camere à ̈ stata inserita la miscela di reazione descritta da Kivirikko contenente FeS0450 mM, Tris-HCl 50mM pH 7.8, DTT 0,1 mM, acido ascorbico 2 mM, peptide substrato dell'enzima (Pro-Pro-Gly) io 30 mM, BSA 2 mg/ml e catalasi 600 U, mentre nell'altra camera sono stati posti 200 Î1⁄4l di una soluzione di NaOH 2 M in grado di catturare la<14>C02gassosa prodotta dalla reazione enzimatica della prolil-idrossilasi attiva.
Al fine di poter eliminare dalla quantificazione l'attività dell'α-chetoglutarato deidrogenasi, un enzima mitocondriale che tramite la decarbossilazione ossidativa dello stesso substrato 2-osso [l-<14>C]glutarato porta anch'esso alla formazione di<14>C02(e di succinato), la reazione à ̈ stata fatta avvenire anche in presenza di un inibitore specifico della P4H , l'acido cumalico, in grado di bloccare selettivamente l'enzima ricombinante. Il lisato di cellule di lievito, contenente per ogni reazione 120 Î1⁄4g di proteine, à ̈ stato pre-incubato in ghiaccio per 30 minuti in presenza di acido cumalico 8 mM e successivamente sono stati introdotti i substrati della reazione enzimatica con i relativi coenzimi.
La miscela à ̈ stata quindi incubata a 37°C per 30 minuti.
La radioattività della<14>C02gassosa catturata dalla trappola liquida di NaOH à ̈ stata dunque quantificata utilizzando uno scintillatore liquido Beckman.
Al termine della suddetta prova si à ̈ osservato che il ceppo 2 risultava quello con l'attività enzimatica maggiore, come raffigurato in figura 6.
Una volta stabilito quale ceppo presentava una maggiore attività prolil-idrossilasica si à ̈ proceduto a valutare se vi era una differente espressione dell'enzima tra i ceppi trasformati con il vettore pPinkHC\a o pPinnkLC\a (come illustrato in figura 7), nonché il tempo ottimale di induzione del ceppo che determinava una maggiore espressione dell'enzima, (come illustrato in figura 8).
Trasformazione del ceppo «82L con il vettore pPICZa/ColCH
Il ceppo di P. pastoris αβ2L à ̈ stato reso chimicamente competente utilizzando in kit EasyCompâ„¢ (Life Technologyâ„¢), secondo le indicazioni del prodotto.
Il ceppo competente à ̈ stato, quindi, trasformato, con le modalità riportate nel kit PichiaPinkâ„¢ Expression System (Life Technologyâ„¢), con 10 Î1⁄4g pPICZA\ColCH linearizzato.
Poiché il marcatore per la selezione del vettore pPICZA\ColCH era la resistenza a un antibiotico, dopo lo shock termico, le cellule sono state incubate per 2 ore a 30°C in presenza di YPD, per permettere l'espressione del gene che conferisce tale resistenza.
Solo dopo questo tempo, le cellule sono state piastrate su piastre selettive PAD/agar senza adenina con blasticidina 0,3 mg/ml e zeocina 0,1 mg\ml.
L'avvenuta inserzione del costrutto di espressione nel genoma di P. pastoris à ̈ stata verificata su almeno otto colonie positive, mediante PCR tradizionale con la procedura riportata sul manuale del kit PichiaPinkâ„¢ Expression System (pag.70) (Life Technologyâ„¢), utilizzando però, come primers per la reazione di PCR, la coppia di oligonucleotidi, FwCs: 5'-AATTCACGTGGAAACGATGGAG-3' (SEQ ID NO: 20), come senso, e RewCs : 5'-TCCTTTCGCACCTAATCCTG-3 ' (SEQ ID NO: 21) come antisenso .
In questo caso, il primo oligonucleotide riconosce la regione di fusione del vettore con l'inserto, mentre il secondo, una regione dell'inserto .
Al fine di selezionare, inoltre, i ceppi potenzialmente più efficienti, mediante PCR quantitativa à ̈ stata fatta un'analisi per valutare il numero di copie di geni inseriti nei differenti ceppi positivi (Figura 9).
Il DNA genomico à ̈ stato estratto dai differenti ceppi con le modalità riportate a pag. 70 del manuale d'uso del kit kit PichiaPinkâ„¢ Expression System (pag.70), diluito 20 volte ed amplificato in un volume finale di 20 Î1⁄4Î , secondo lo schema sottostante :
Composizione Î1⁄4l Conc. finale H20 nuclease-free sterile 5.2
10 /xM miscela di primers
800 nM senso e antisenso
2X master mix iQ SIBR<®>Green
10∞ 1 x
(Bio-Rad) o
cDNA o controllo negativo 4
Volume finale 20
Il profilo termico adottato à ̈ stato: 3 min 95°C, (15 sec 95°C, 30 sec 60°C, lettura fluorescenza) 45 x, melting curve da 58°C a 95°C, lettura ogni 0.5°C. Ogni reazione à ̈ stata allestita in triplicato.
Per tutte le prove di PCR quantitativa à ̈ stato utilizzato il termociclatore Cromo 4 (MJ Research; UK) interfacciato al software DNA Engine Opticon 3 Real-Time Detection System Software (versione 3.03 ).
Per tali analisi à ̈ stato utilizzato il Gene Expression Analysis per iCycler iQ Reai Time Detection System (Bio-Rad) .
Il gene della β-actina à ̈ stato utilizzato per la normalizzazione dei campioni. La quantità di DNA à ̈ stata espressa relativamente al campione con i quantitativi più bassi.
Coltivazione dei ceppi ColCH e induzione dell'espressione del collagene ricombinante
Le cellule di lievito derivate dalla colonia positiva 4 (ceppo ColCH4) sono state messe in coltura .
L'espressione delle proteine ricombinanti à ̈ stata effettuata in sospensioni di cellule di lievito cresciute prima in terreno minimo con glicerolo 1% (BMGY, pH 6.0) e poi trasferite in terreno minimo con metanolo (BMMY, pH 6.0) al fine di avviare l'induzione dell'espressione.
Durante l'espressione, fatta avvenire a 28°C in agitazione a 250 rpm, ogni 12 ore sono stati aggiunti metanolo allo 0,5 % ed acido ascorbico alla concentrazione finale di 80 pg/ml.
• Quantificazione dei trascritti mediante qPCR I livelli di mRNA relativi ai tre geni inseriti nel ceppo ColCH4 indotto con metanolo, come sopra riportato, sono stati misurati mediante PCR quantitativa.
L'RNA totale à ̈ stato estratto da 5x10<7>cellule di lievito a 0 e a 24 ore dall'inizio dell'induzione con il kit RNeasy Mini Kit (Qiagen).
Le cellule di lievito sono state lisate mediante distruzione meccanica con 600 Î1⁄4Î di biglie di vetro di 0,45-0,55 mm di diametro pre-lavate con acido nitrico.
Le cellule sono state agitate vigorosamente utilizzando un Tissue lyser (Qiagen) a 30 Hz per 8 minuti con biglie aggiunte secondo un rapporto in volume rispetto al di 1:1.
In seguito il lisato à ̈ stato centrifugato a 10000 x g per 2 minuti a 4°C.
Dal sopranatante ottenuto si à ̈ proceduto all'estrazione dell'RNA totale, secondo le indicazioni del prodotto, includendo anche la fase di digestione con DNase I (27 Kunità).
1 Î1⁄4g di RNA totale à ̈ stato retrotrascritto in un volume finale di 20 Î1⁄4l, nell'appropriato tampone contenente 2,5 Î1⁄4Îœ di random examers, 0,5 mM dNTP mix, 5 mM DTT, 40 unità di inibitore delle ribonucleasi RNAseOUT (Life Technologyâ„¢) e 15 unità di Super ScriptIIIâ„¢ (Life Technologyâ„¢).
La reazione à ̈ stata condotta per 10 minuti a 25°C, quindi 50 minuti a 50°C.
Per rimuovere l'RNA complementare al cDNA sono state aggiunte 2 unità di E. coli RNase H (Life Technologyâ„¢) e la miscela incubata per 20 minuti a 37°C.
Il cDNA ottenuto à ̈ stato poi diluito 1:5 e impiegato per la reazione di PCR quantitativa effettuata con le stesse modalità sopra riportate nel capitolo relativo alla trasformazione del ceppo aβ2L con il vettore pPICZa/ColCH.
L'analisi dei livelli di mRNA della P4H, della PDI e del collagene a 24 ore dall'induzione con metanolo del ceppo ColCH4 effettuato mediante PCR quantitativa indica che tutti i 3 geni risultano 100.000 volte più espressi rispetto al tempo zero di induzione. (Figura 10).
• Valutazione produzione collagene ricombinante nel ceppo ColCH4
Le cellule e terreno di coltura del ceppo ColCH4 dopo 60 ore di induzione in terreno BMMY sono stati recuperati.
Le cellule sono state centrifugate per 10 minuti a 1500 x g, a temperatura ambiente, lavate una volta con terreno BMMY e risospese in un tampone contenente 5% glicerolo, EDTA 1 mM, fosfato di sodio 50 mM, pH 7,4, cocktail di inibitori delle proteasi diluito 1:100 (P8465 Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) .
Le cellule sono state U sate agitando vigorosamente utilizzando un tissue lyser (Qiagen) a 30 Hz per 8 minuti con biglie di vetro (0,5 mm aggiunte secondo un rapporto in volume rispetto al di 1:1. In seguito il à ̈ stato centrifugato a 10.000 x g per 30 minuti a 4° C, il sopranatante à ̈ stato quindi recuperato .
Il terreno di coltura à ̈ stato centrifugato 20 minuti, a 20.000 x g, a 4°C,concentrato dieci volte in Amicon (Millipore) dal taglio molecolare 50.000 Da e dializzato contro acqua distillata, ossia sottoposto ad una procedura per separare il contenuto proteico presente nel terreno di coltura, trasferendolo da qui all'acqua distillata.
Lisato cellulare e terreno di coltura concentrato e dializzato sono stati analizzati mediante (SDS-Page Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, ossia elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato per l'analisi di estratti proteici) rivelato tramite colorazione di Coomassie (Figura 11).
La banda corrispondente al peso teorico atteso del collagene à ̈ stata estratta da gel di acrilamide e digerita secondo la metodica descritta da Shervenko et al.
Dopo la digestione, i peptidi triptici ottenuti per estrazione diretta dal gel, sono stati portati a secco con evaporatore centrifugo (Speed Vac) e successivamente ripresi in un volume noto dell' eluente A (H20/Acido formico (FOA) 0,1%) utilizzato per la separazione cromatografica e separati usando un cromatografo liquido ad alte prestazioni (Agilent 1100) a micro flussi (40Î1⁄4l/min ), iniettando circa 3⁄4 del volume totale del campione in colonna.
È stata utilizzata una colonna analitica RP Zorbax Cie (150 x 1 mm ID) "particle size" 5Î1⁄4m.
Come fasi eluenti sono state utilizzate:
A: H20 EOA 0.1% e
B: CH3CN FOA 0.05%;
Il gradiente di eluizione prevedeva:
- andamento in condizioni isocratiche al 90% di A 10% di B per 5 minuti,
- gradiente lineare fino al 95% di B 5% di A in 65 minuti,
- quindi 10 minuti isocratico al 95% di B 5% di A.
Tramite accoppiamento diretto, l'eluato proveniente dall'HPLC Ã ̈ stato introdotto in uno spettrometro di massa equipaggiato con una sorgente elettrospray a geometria ortogonale e analizzatore a trappola ionica (Agilent 1100 series LC/MSD ion trap XCT instrument), in questo modo, i peptidi eluiti durante la corsa cromatografica sono stati direttamente analizzati permettendo di ottenere i singoli valori di m/z corrispondenti (spettri MS).
Nel caso dei segnali più intensi à ̈ stato possibile ottenere spettri di frammentazione riferiti principalmente agli ioni doppio caricati (spettri MS<2>).
La raccolta degli spettri MS e MS/MS ha permesso la ricerca su database (Mascot-Matrixscience).
Tutte le analisi MS e MS/MS sono state condotte in modalità ioni positivi e confermate mediante sequenza manuale de-novo.
A titolo esplicativo in figura 12 viene riportato lo spettro di frammentazione MS<2>del peptide doppio caricato a m/z 525.5, la cui sequenza GAVGPGGKPGPR corrisponde alla sequenza nucleotidica attesa ggtgctgttggaccaggtggtaaaccaggaccacgg per il procollagene marino.
Il metodo per la produzione di proteine collageniche ricombinati derivanti da spugna di mare e un lievito capace di produrre dette proteine consente di avere un biomateriale molto raffinato, di facilitare e rendere meno costosa la realizzazione di composti collagenici ben caratterizzati ed omogenei, rispetto agli estratti ottenuti da spugne con i metodi tradizionali.
Inoltre l'utilizzo di un ceppo trasformato di P. pastoris annulla il rischio di avere contaminanti tossici per l'uomo e per l'ambiente, comunemente presenti nelle matrici naturali.
Deposito di materiale biologico
Il microorganismo Pichia pastoris identificato con il riferimento Pichia pastoris ColCH4, modificato e selezionato come sopra descritto, Ã ̈ stato depositato presso la Collezione dei Lieviti Industriali DBVPG (Industriai Yeasts Collection DBVPG), Borgo 20 Giugno 74 06121 Perugia Italia in data 05/04/13 con numero 34P, secondo le diposizioni del Trattato di Budapest.
Allegato sequenze
P4HchPDichCOLchol igo .txt
SEQUENCE LISTING
<110> università Degli studi di Genova
<120> Metodo per la produzione di collagene marino ricombinante e organismo capace di produrre detto collagene marino
(method for production of marine collagen and organism capable of produci ng said marine collagen)
<130> 1
<160> 21
<170> Patentin versi on 3.5
<210> 1
<211> 1804
<212> DNA
<213> Chondrosia reniformi s
<220>
<221> CDS
<222> (17) ..(1618)
<400> 1
tcgacatatc cgggtt atg cag ttg gta tta gag atg agt tct act act ttg 52
Met Gin Leu vai Leu Gly Met ser Ser Thr Thr Leu
1 5 10
ttg ctg ctg tgt agt tta gga gtg gtt att cca tct ctt gtc tgt gga 100 Leu Leu Leu Cys Ser Leu Gly Val Val Ile Pro Ser Leu Val Cys Gly
15 20 25
gaa atg ttt aca gcc ctt tta cat atg gaa gga ctg gta gag tta gaa 148 Giu Met Phe Thr Ala Leu Leu His Met Giu Gly Leu Val Giu Leu Giu
30 35 40
gaa caa tta gtg caa cac età aaa tee tat ata agg aaa gag gag gaa 196 Giu Gin Leu vai Gin His Leu Lys Ser Tyr Ile Arg Lys Giu Giu Giu
45 50 55 60
ega tta gga gaa ctt aag aag ttt tta get tea gca gag aat get caa 244 Arg Leu Gly Giu Leu Lys Lys Phe Leu Ala Ser Ala Giu Asn Ala Gin
65 70 75
agt ttg cca aga aat gaa cca aga gag cac ctc tac cac ccg acc aat 292 Ser Leu Pro Arg Asn Giu Pro Arg Giu His Leu Tyr His Pro Thr Asn
80 85 90
gcc ttg get gtc att atg cgg tat cac agt gga tgg gac caa aaa ctg 340 Ala Leu Ala Val ile Met Arg Tyr His Ser Gly Trp Asp Gin Lys Leu
95 100 105
tea gaa tat gtc tac cag gat aac tct cat gat ctt atg tct get gtg 388 Ser Giu Tyr Val Tyr Gin Asp Asn Ser His Asp Leu Met Ser Ala Val
110 115 120
get ttg gag aag tat ege ttt cct tea aag gag gac tac tct ggt gca 436 Ala Leu Giu Lys Tyr Arg Phe Pro Ser Lys Giu Asp Tyr Ser Gly Ala
125 130 135 140
gti act get atc att ega ctg caa gac gca tac aag att agt ccc aga 484 va Thr Ala ile ile Arg Leu Gin Asp Ala Tyr Lys Ile Ser Pro Arg
145 150 155
aac ctg aca cag tct att ttg ggg gag agg cag gcc att aaa gtg aca 532 P4HchPDichcOLcholigo.txt
Asn Leu Thr Gin ser ile Leu Gly Giu Arg Gin Ala ile Lys Val Thr
160 165 170
acc aga att tgc ttt gaa ata ggt aga gag gcc tat tat età gag aac 580 Thr Arg ile Cys Phe Giu ile Gly Arg Giu Ala Tyr Tyr Leu Giu Asn
175 180 185
tat tgg cac act aaa gag tgg atg ttg gag tgt ctg agg aaa atg gat 628 Tyr Trp His Thr Lys Giu Trp Met Leu Giu Cys Leu Arg Lys Met Asp
190 195 200
gag gag aat gat tat gaa gat gtc agc età cca gaa att tat gac ttt 676 Giu Giu Asn Asp Tyr Giu Asp Val Ser Leu Pro Giu Ile Tyr Asp Phe
205 210 215 220
ctg gca ttt tet gaa tac aaa gtt ggt aac ctg ege aaa gca atg caa 724 Leu Ala Phe ser Giu Tyr Lys Val Gly Asn Leu Arg Lys Ala Met Gin
225 230 235
tat acg aag gac att ttg caa agt gac ccc act cat gaa agg gcc ttg 772 Tyr Thr Lys Asp ile Leu Gin ser Asp Pro Thr His Giu Arg Ala Leu
240 245 250
aga aat tta aat ttt ttt teg gaa caa atg aaa gaa gat cct gaa gca 820 Arg Asn Leu Asn Phe Phe Ser Giu Gin Met Lys Giu Asp Pro Giu Ala
255 260 265
ttt aac aga gta gtt aca gag cag aca agg aat gta tat cct gaa acg 868 Phe Asn Arg Val Val Thr Giu Gin Thr Arg Asn Val Tyr Pro Giu Thr
270 275 280
tta ggc tat gag gag ctg tgt aga gaa gca aag cca att cca aag gag 916 Leu Gly Tyr Giu Giu Leu Cys Arg Giu Ala Lys Pro Ile Pro Lys Giu
285 290 295 300
aac cat cac aag atg gtc tgc ttc tat ttc aca cat aag aac aat cct 964 Asn His His Lys Met Val Cys Phe Tyr Phe Thr His Lys Asn Asn Pro
305 310 315
cgt ctt att ctc ege cca att aaa gtq gaa gta get cac tta aaa cca 1012 Arg Leu Ile Leu Arg Pro Ile Lys Val Giu Val Ala His Leu Lys Pro
320 325 330
aga att tgg atc ttc aaa aag ttt ctt tet gaa aca gaa atg get cgt 1060 Arg Ile Trp Ile Phe Lys Lys Phe Leu Ser Giu Thr Giu Met Ala Arg
335 340 345
ctg agg gaa ctg get gta ccc aaa età aaa ega gca act get aga aat 1108 Leu Arg Giu Leu Ala Val Pro Lys Leu Lys Arg Ala Thr Ala Arg Asn
350 355 360
tgg aaa acg gqa gaa ttt gaa ccg get gat tat agg att agt aag agt 1156 Trp Lys Thr Gly Giu Phe Giu Pro Ala Asp Tyr Arg Ile Ser Lys Ser
365 370 375 380
ggt tgg ctc agt gaa gat gat gac gaa tet act gat att gta cac cgg 1204 Gly Trp Leu Ser Giu Asp Asp Asp Giu Ser Thr Asp ile Val His Arg
385 390 395
ata aat aat agg att gac gat tee aca ggt ctc tee atg gca aca gca 1252 ile Asn Asn Arg ile Asp Asp ser Thr Gly Leu Ser Met Ala Thr Ala
400 405 410
gag gac età caa gta gtq aat tac gaa ata ggt gqa cat tat gaa ccg 1300 Giu Asp Leu Gin Val Val Asn Tyr Gly ile Gly Gly His Tyr Giu Pro
415 420 425
cat tat gat ttt gca aga aag aat gaa gat gcc ttc tea agg ttg ggg 1348 P4HchPDichC0Lcholigo.txt
His Tyr Asp Phe Ala Arg Lys Asn Giu Asp Ala Phe Ser Arg Leu Gly
430 435 440
tgg gqt aat agg ata tct act età ctt att tat atg agc aat gta acg 1396 Trp Gly Asn Arg ile Ser Thr Leu Leu Ile Tyr Met Ser Asn Val Thr
445 450 455 460
ctg gga gqt gcc acg gtq ttt act gaa tct gqa gqc aga att ata cct 1444 Leu Gly Gly Ala Thr Val Phe Thr Giu Ser Gly Gly Arg ile ile Pro
465 470 475
tac aat gqt gat gca gtq tac tgg tgg aat ctg aag cgt tea gqt gag 1492 Tyr Asn Gly Asp Ala vai Tyr Trp Trp Asn Leu Lys Arg Ser Gly Giu
480 485 490
gqt gat atg aga aca aga cat gca gcc tgt cca gtq età gta gqa acc 1540 Gly Asp Met Arg Thr Arg His Ala Ala cys Pro vai Leu Val Gly Thr
495 500 505
aaa tgg gtc tgt aac aag tgg att cac gag get gqg cag gaa ttt aga 1588 Lys Trp Val Cys Asn Lys Trp ile His Giu Ala Gly Gin Giu Phe Arg
510 515 520
aga cca tgt teg tta aat aaa aac cag taa tgacattttg gtgacctttc 1638 Arg Pro Cys ser Leu Asn Lys Asn Gin
525 530
aaaatctttc aaatttcact gtcattgtca taccactttg egatatattt atettaattt 1698 gataacaaat ttaattttat gcataacttt attttaggta tgtattcatg tgaatgtcat 1758 gtgattttca tgtggttgtt gtggttgata gaaaaaaaaa aaaaaa 1804
<210> 2
<211> 533
<212> PRT
<213> Chondrosia reniformis
<400> 2
Met Gin Leu Val Leu Gly Met Ser Ser Thr Thr Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15
Ser Leu Gly Val Val ile Pro Ser Leu Val Cys Gly Giu Met Phe Thr
20 25 30
Ala Leu Leu His Met Giu Gly Leu vai Giu Leu Giu Giu Gin Leu Val
35 40 45
Gin His Leu Lys Ser Tyr Ile Arg Lys Giu Giu Giu Arg Leu Gly Giu
50 55 60
Leu Lys Lys Phe Leu Ala ser Ala Giu Asn Ala Gin Ser Leu Pro Arg
65 70 75 80
Asn Giu Pro Arg Giu His Leu Tyr His Pro Thr Asn Ala Leu Ala Val
85 90 95
Ile Met Arg Tyr His Ser Gly Trp Asp Gin Lys Leu Ser Giu Tyr Val
100 105 110
p4HchPDichcoLcholigo . txt
Tyr Gin Asp Asn ser His Asp Leu Met Ser Ala Val Ala Leu Giu Lys 115 120 125
Tyr Arg Phe Pro ser Lys Giu Asp Tyr ser Gly Ala vai Thr Ala ile 130 135 140
ile Arg Leu Gin Asp Ala Tyr Lys ile Ser Pro Arg Asn Leu Thr Gin 145 150 155 160
Ser ile Leu Gly Giu Arg Gin Ala ile Lys Val Thr Thr Arg ile cys
165 170 175
Phe Giu ile Gly Arg Giu Ala Tyr Tyr Leu Giu Asn Tyr Trp His Thr 180 185 190
Lys Giu Trp Met Leu Giu Cys Leu Arg Lys Met Asp Giu Giu Asn Asp 195 200 205
Tyr Giu Asp Val Ser Leu Pro Giu ile Tyr Asp Phe Leu Ala Phe Ser 210 215 220
Giu Tyr Lys Val Gly Asn Leu Arg Lys Ala Met Gin Tyr Thr Lys Asp 225 230 235 240
ile Leu Gin Ser Asp Pro Thr His Giu Arg Ala Leu Arg Asn Leu Asn
245 250 255
Phe Phe Ser Giu Gin Met Lys Giu Asp Pro Giu Ala Phe Asn Arg Val 260 265 270
Val Thr Giu Gin Thr Arg Asn Val Tyr Pro Giu Thr Leu Gly Tyr Giu 275 280 285
Giu Leu cys Arg Giu Ala Lys Pro ile Pro Lys Giu Asn His His Lys 290 295 300
Met vai Cys Phe Tyr Phe Thr His Lys Asn Asn Pro Arg Leu ile Leu 305 310 315 320
Arg Pro ile Lys Val Giu Val Ala His Leu Lys Pro Arg ile Trp ile
325 330 335
Phe Lys Lys Phe Leu Ser Giu Thr Giu Met Ala Arg Leu Arg Giu Leu 340 345 350
Ala vai Pro Lys Leu Lys Arg Ala Thr Ala Arg Asn Trp Lys Thr Gly 355 360 365
Giu Phe Giu Pro Ala Asp Tyr Arg Ile Ser Lys Ser Gly Trp Leu Ser 370 375 380
P4HchPDichCOLcholigo . txt
Gi u Asp Asp Asp Giu Ser Thr Asp ile vai His Arg ile Asn Asn Arg
385 390 395 400
ile Asp Asp Ser Thr Gly Leu ser Met Ala Thr Ala Gi u Asp Leu Gin
405 410 415
vai Val Asn Tyr Gly ile Gly Gly His Tyr Giu Pro Hi s Tyr Asp Phe
420 425 430
Ala Arg Lys Asn Gi u Asp Ala Phe Ser Arg Leu Gly Trp Gly Asn Arg
435 440 445
ile Ser Thr Leu Leu ile Tyr Met Ser Asn Val Thr Leu Gly Gly Ala
450 455 460
Thr Val Phe Thr Gi u Ser Gly Gly Arg Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Asp
465 470 475 480
Ala Val Tyr Trp Trp Asn Leu Lys Arg Ser Gly Giu Gly Asp Met Arg
485 490 495
Thr Arg Hi s Ala Ala Cys Pro Val Leu vai Gly Thr Lys Trp Val cys
500 505 510
Asn Lys Trp ile Hi s Gi u Ala Gly Gi n Giu Phe Arg Arg Pro Cys Ser
515 520 525
Leu Asn Lys Asn Gin
530
<210> 3
<211> 1814
<212> DNA
<213> Chondrosia reni formi s
<220>
<221> CDS
<222> (64) . . (1644)
<400> 3
ttgtacaact ccagtaagcc acagtctgct agactatctc ttcagagcca gtggtgatca 60
gaa atg tta aaa gga atc att ttc tct ata ttg gcc att età att ctt 108 Met Leu Lys Gly ile ile Phe Ser ile Leu Ala ile Leu Ile Leu 1 5 10 15
gga gca gac gat atc cct gaa gaa gat gga gtg tta gtg teg aca tea 156 Gly Ala Asp Asp ile Pro Giu Giu Asp Gly vai Leu Val Ser Thr ser
20 25 30
gac aac ttt aag caa gca gta ggg agt ata gac aac ata ctc gta gaa 204 Asp Asn Phe Lys Gin Ala Val G ly Ser Ile Asp Asn Ile Leu Val Giu
35 40 45
ttt tat gca ccg tgg tgc ggt cat tgc aaa get ctg gcg cca aat tat 252 Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Asn Tyr
P4HchPDichC0Lcholigo.txt
50 55 60
gcg aaa gca gca gaa ttg ttg cag aag gaa gga tct gaa atc cgt ctc 300 Ala Lys Ala Ala Giu Leu Leu Gin Lys Giu Gly Ser Giu ile Arg Leu
65 70 75
gct aaa gtg gat gca aca att cac tcg gat ctg gca cag aag ttt gga 348 Ala Lys Val Asp Ala Thr Ile His Ser Asp Leu Ala Gin Lys Phe Gly
80 85 90 95
gtg aga ggt tac ccc acc atc aag ttc ttc aga gga gaa gac aat gtg 396 Val Arg Gly Tyr Pro Thr ile Lys Phe Phe Arg Gly Giu Asp Asn vai
100 105 110
gtg gac tat tea gct ggc agg caa gca gag gac att gtg aac tgg tta 444 vai Asp Tyr ser Ala Gly Arg Gin Ala Giu Asp ile Val Asn Trp Leu
115 120 125
aag aag aag act ggc ccc cct gcc act gac ctg acc aca gct gaa cag 492 Lys Lys Lys Thr Gly Pro Pro Ala Thr Asp Leu Thr Thr Ala Giu Gin
130 135 140
gcc aag gag ttc tct gag agt gca gag gct gtg gtg gtt gga ttc ttt 540 Ala Lys Giu Phe Ser Giu Ser Ala Giu Ala Val Val vai Gly Phe Phe
145 150 155
gaa tct gct gaa tea gag gag gcc aag gcg tac ata gca gca gtt acc 588 Giu Ser Ala Giu Ser Giu Giu Ala Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Val Thr
160 165 170 175
aag ctt gag gac atg ccg gct ggg att gtc acc aat aag gag gtt gcc 636 Lys Leu Giu Asp Met Pro Ala Gly Ile Val Thr Asn Lys Giu vai Ala
180 185 190
gaa tea ctt gga gcc act gtt agc agt att gta atg ttt caa aag ttt 684 Giu Ser Leu Gly Ala Thr Val Ser Ser Ile Val Met Phe Gin Lys Phe
195 200 205
gac gat gga aag gtg gtt tac agt ggg gag tac aac ggt gta gac ata 732 Asp Asp Gly Lys vai vai Tyr Ser Gly Giu Tyr Asn Gly Val Asp ile
210 215 220
ctg tee ttt gtg aat gct gaa cgg ctc cca ttg ttc att gaa ttt aat 780 Leu Ser Phe Val Asn Ala Giu Arg Leu Pro Leu Phe Ile Giu Phe Asn
225 230 235
gat aag act gct aac agt atc ttc agc ggc agc atc aag gtg cac ttt 828 Asp Lys Thr Ala Asn Ser Ile Phe Ser Gly Ser ile Lys Val His Phe
240 245 250 255
ctt gtc ttc tat tea gat gac tcg gat gaa gca gcc agc att tea gag 876 Leu Val Phe Tyr Ser Asp Asp Ser Asp Giu Ala Ala Ser Ile Ser Giu
260 265 270
gct gtc act gct gta gcc aaa gaa ttt aga ggc aga ata atc ttt gtt 924 Ala Val Thr Ala vai Ala Lys Giu Phe Arg Gly Arg ile ile Phe Val
275 280 285
agg gtt aat aca gat gtg gag aat aac aac aga att gtt gag ttt ttc 972 Arg Val Asn Thr Asp Val Giu Asn Asn Asn Arg Ile Val Giu Phe Phe
290 295 300
aat ctt aag gag gac gat ttc cct tgt gga cgg ctg att cag ctg gac 1020 Asn Leu Lys Giu Asp Asp Phe Pro Cys Gly Arg Leu Ile Gin Leu Asp
305 310 315
gat gac atg aga aaa ttt agg ccc gac ttt gat tea ctc aat gaa gaa 1068 Asp Asp Met Arg Lys Phe Arg Pro Asp Phe Asp Ser Leu Asn Giu Giu
P4HchPDichcoLcholigo.txt
320 325 330 335
aat att agg act ttc tta acc aac ttt ttt gat ggt aaa ctg aag cca 1116 Asn ile Arg Thr Phe Leu Thr Asn Phe Phe Asp Gly Lys Leu Lys Pro
340 345 350
cat ctc agc tct gaa gat atc ccc gaa gat tgg gat gcc aaa cca gtc 1164 His Leu Ser Ser Giu Asp ile Pro Giu Asp Trp Asp Ala Lys Pro Val
355 360 365
aag att ctt gtc gga cgt aac ttt tgg gat gtt atc aag agt ggg aaa 1212 Lys ile Leu Val Gly Arg Asn Phe Trp Asp Val Ile Lys Ser Gly Lys
370 375 380
gat gtc ttt gtt gag ttt tat gcc ccc tgg tgt ggt cac tgc aag gcc 1260 Asp vai Phe vai Giu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala
385 390 395
ctg gct ccc act tgg gat gag ctt gga gag aag ttt gtc gac agc gac 1308 Leu Ala Pro Thr Trp Asp Giu Leu Gly Giu Lys Phe vai Asp Ser Asp
400 405 410 415
gtc att att gca aaa ata gac tcg aca gcc aac gag att gat ggt att 1356 Val ile Ile Ala Lys ile Asp Ser Thr Ala Asn Giu ile Asp Gly ile
420 425 430
aag att gaa ggt ttt cca act età aaa tat ttc aag agt gat gat cca 1404 Lys Ile Giu Gly Phe Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Lys Ser Asp Asp Pro
435 440 445
gag tct cca att gac ttc atg ggc ggc agg aca ctt gac gac ctt gtc 1452 Giu Ser Pro ile Asp Phe Met Gly Gly Arg Thr Leu Asp Asp Leu Val
450 455 460
aag ttt gta gag tee aaa ggg act gat ege ggt gtc aag gag ccg tee 1500 Lys Phe Val Giu Ser Lys Gly Thr Asp Arg Gly vai Lys Giu Pro Ser
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gaa gac ctc gga gat gaa ttc ttt gac agc ctt gaa gat gaa gat ttt 1548 Giu Asp Leu Gly Asp Giu Phe Phe Asp Ser Leu Giu Asp Giu Asp Phe
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gaa gat gaa gat tat gaa gat gaa gat gaa gat gaa gga atg gat gag 1596 Giu Asp Giu Asp Tyr Giu Asp Giu Asp Giu Asp Giu Gly Met Asp Giu
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cag gag gat gta gga gag cct gct aaa gat aaa aag att gaa ctt tag 1644 Gin Giu Asp Val Gly Giu Pro Ala Lys Asp Lys Lys ile Giu Leu
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gtgttaattg atagaaaata ttttactcct tatcaaatta atcaaattta ggagagcatg 1704 taagcttttg cacaatgatt cagttctgaa tttaatttac tctgttatgt atggttttgc 1764 ttttccatcg acaatatatt taatgatttt gtcgaaaaaa aaaaaaaaaa 1814
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Ala Asp Asp ile Pro Gi u Giu Asp Gly vai Leu vai Ser Thr ser Asp 20 25 30
Asn Phe Lys Gin Ala Val Gly Ser ile Asp Asn Ile Leu Val Giu Phe 35 40 45
Tyr Ala Pro Trp cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Asn Tyr Ala 50 55 60
Lys Ala Ala Gi u Leu Leu Gin Lys Giu Gly Ser Giu ile Arg Leu Ala 65 70 75 80 Lys Val Asp Ala Thr ile His Ser Asp Leu Ala Gi n Lys Phe Gly vai
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Ser Phe vai Asn Ala Giu Arg Leu Pro Leu Phe ile Gi u Phe Asn Asp 225 230 235 240 Lys Thr Ala Asn Ser ile Phe Ser Gly Ser Ile Lys vai Hi s Phe Leu
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Val Phe Tyr Ser Asp Asp ser Asp Gi u Ala Ala Ser Ile Ser Giu Ala 260 265 270
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Val Asn Thr Asp Val Giu Asn Asn Asn Arg ile vai Gi u Phe Phe Asn 290 295 300
Leu Lys Gi u Asp Asp Phe Pro Cys Gly Arg Leu ile Gi n Leu Asp Asp 505 310 315 320
Asp Met Arg Lys Phe Arg Pro Asp Phe Asp Ser Leu Asn Gi u Giu Asn
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ile Arg Thr Phe Leu Thr Asn Phe Phe Asp Gly Lys Leu Lys Pro Hi s 340 345 350
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ile Leu Val Gly Arg Asn Phe Trp Asp Val Ile Lys Ser Gly Lys Asp 370 375 380
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Il e ile Ala Lys Ile Asp Ser Thr Ala Asn Gi u Ile Asp Gly Ile Lys 420 425 430
Ile Gi u Gly Phe Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Lys Ser Asp Asp Pro Giu 435 440 445
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20 25 30
act cat gtc aat cgt ggc ttg agg aaa agg cag aca agt gaa gac aac 204 Thr His Val Asn Arg Gly Leu Arg Lys Arg Gin Thr ser Giu Asp Asn
35 40 45
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cca cct ggt cca cct ggt cct gca gga agg gat ggc agg gat gct gtc 300 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Arg Asp Gly Arg Asp Ala Val
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tgc tct aac cag aca aca gga tta ggt gcg aaa gga gat aga ggt cca 348 Cys Ser Asn Gin Thr Thr Gly Leu Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Pro
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P4HchPDichCOLcholigo.txt
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cca ggc aga gca gga gca cag gga gat aga ggt gat cct ggt gat gat 828 Pro Gly Arg Ala Gly Ala Gin Gly Asp Arg Gly Asp Pro Gly Asp Asp
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aag gga gag aag ggt gat act tgc att cct gac agt aat agt acc età 1260 Lys Gly Giu Lys Gly Asp Thr Cys ile Pro Asp Ser Asn Ser Thr Leu
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ggt cct tct ggc cct tct ggt ccc aca ggg cca cct ggt cct aag gga 1596 Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly
p4HchPDichcoLcholigo.txt
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gta aga ggt gca caa ggc aga cca gga gat aga ggc tct cca ggt gat 1644 vai Arg Gly Ala Gin Gly Arg Pro Gly Asp Arg Gly Ser Pro Gly Asp
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gtt ggt ccc ata ggt gct cct ggt cct cct ggg gcg gat ggt gtt ccg 1692 vai Gly Pro ile Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Val Pro
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Claims (32)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la produzione di proteine collageniche ricombinanti di spugna di mare caratterizzato dal fatto che prevede l'introduzione e l'espressione all'interno di un organismo ospite di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una proteina enzimatica o di almeno una sua subunità coinvolta nelle modifiche di detta catena nel processo di formazione del collagene marino.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detto organismo ospite à ̈ costituito da cellule eucariotiche di lievito e 1'introduzione di sequenze nucleotidiche nel suo genoma avviene con almeno un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per almeno un enzima, o per almeno una sua subunità, coinvolto nella idrossilazione della catena polipeptidica di procollagene marino.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che all'interno dell'organismo ospite ricombinante à ̈ introdotta ed espressa la sequenza nucleotidica codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) di spugna di mare e la sequenza nucleotidica codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi di spugna di mare (PDI).
  4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto che all'interno dell'organismo ospite ricombinante à ̈ introdotta ed espressa, con almeno un vettore di espressione, la sequenza nucleotldica codificante per il procollagene non fibrillare di spugna C.reniformis.
  5. 5. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detto organismo ospite à ̈ costituito da cellule eucariotiche di lievito trasformate, con vettori di espressione, con le sequenze nucleotidiche codificanti per le subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi di spugna C.reniformis e con almeno la sequenza nucleotidica codificante per il procollagene non fibrillare di spugna C.reniformis.
  6. 6. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detto organismo ospite à ̈ costituito da cellule eucariotiche di lievito Pichia pastoris.
  7. 7 . Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detto organismo ospite à ̈ costituito da cellule eucariotiche del ceppo di lievito Pichia pastoris depositato con numero 34P in data 05/04/13 presso la Collezione dei lieviti Industriali DBVPG avente riferimento "Pichia pastoris ColCH4".
  8. 8. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che il vettore di espressione comprende la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID NO: 1 codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi di spugna di mare.
  9. 9. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che il vettore di espressione comprende la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID NO: 3 codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi di spugna di mare.
  10. 10. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che il vettore di espressione comprende la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID NO: 5 codificante per il procollagene non fibrillare di spugna C .reniformis.
  11. 11 . Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che l'espressione delle proteine ricombinanti à ̈ effettuata in sospensioni di cellule di lievito cresciute prima in terreno minimo con glicerolo 1% e poi trasferite in terreno minimo (BMMY, pH 6.0) con metanolo in modo tale da avviare l'induzione dell'espressione, essendo prevista, durante l'espressione, l'aggiunta di metanolo ed acido ascorbico, sotto agitazione ad una temperatura compresa tra 20 e 30°C.
  12. 12. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede il passo di selezionare le cellule eucariotiche di lievito, trasformate con almeno un vettore di espressione, che hanno più copie integrate di sequenze nucleotidiche codificanti il procollagene non fibrillare di spugna.
  13. 13. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede il passo di isolare detta o dette proteine collageniche ricombinanti di spugna di mare dall' organismo ospite trasformato tramite la preparazione di un cellulare e terreno di coltura concentrato e dializzato.
  14. 14. Metodo di trasformazione tramite tecnologia ricombinante di un ceppo di lievito per l'espressione all'interno delle cellule di detto ceppo di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una proteina enzimatica o di almeno una sua subunità coinvolta nelle modifiche di detta catena nel processo di formazione del collagene marino caratterizzato dal fatto che detto metodo comprende i seguenti passi: - identificazione delle sequenze nucleotidiche codificanti le subunità alfa e beta dell'enzima con attività prolil-idrossilasica coinvolte nelle modifiche di detta catena, - preparazione ed utilizzo di almeno un vettore di espressione per l'introduzione di dette sequenze all'interno delle cellule, selezione degli organismi trasformati contenenti dette sequenze integrate nel proprio genoma.
  15. 15. Metodo di trasformazione secondo la rivendicazione 14 caratterizzato dal fatto che prevede un passo di co-trasformazione con un primo vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) e un secondo vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossllasi (PDI) di spugna C. reniformis .
  16. 16. Metodo di trasformazione secondo la rivendicazione 15 caratterizzato dal fatto che detto primo vettore contiene la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID N0:1 e detto secondo vettore contiene la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID NO:3.
  17. 17. Metodo di trasformazione secondo la rivendicazione 14, 15 o 16 caratterizzato dal fatto che prevede un passo di trasformazione con vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica codificante per il procollagene non fibrillare di spugna C.reniformis.
  18. 18. Metodo di trasformazione secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 14 a 17 caratterizzato dal fatto che il passo di cotrasformazione con i vettori con le sequenze per le subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi precede il passo di trasformazione con il vettore con la sequenza nucleotidica codificante per il procollagene non fibrillare di spugna, essendo tra detti due passi interposto un passo di selezione dei ceppi di lievito con elevata attività prolilidrossilasica.
  19. 19. Metodo di trasformazione secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 14 a 18 caratterizzato dal fatto che prevede la trasformazione di un ceppo di lievito del genere Pichia pastoris.
  20. 20. Metodo di trasformazione secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 14 a 19 caratterizzato dal fatto che il vettore di espressione comprendente la sequenza per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi (PDI) ha il sito di clonaggio preceduto dalla regione codificante per l'Alfa Mating Factor (AM) di S. cerevisiae.
  21. 21. Metodo di trasformazione secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 14 a 20 caratterizzato dal fatto che à ̈ previsto un unico vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) e la sequenza nucleotidica codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi (PDI) di spugna C. reniformis .
  22. 22. Vettore di espressione per la trasformazione di un organismo ospite per la produzione tramite tecnologia ricombinate di proteine collageniche di spugna di mare caratterizzato dal fatto che comprende la sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 1 codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) di spugna C. reniformis il quale enzima, avente attività prolil-idrossilasica, à ̈ coinvolto nelle modifiche catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e nel processo di formazione del collagene marino.
  23. 23. Vettore di espressione per la trasformazione di un organismo ospite per la produzione tramite tecnologia ricombinate di proteine collageniche di spugna di mare caratterizzato dal fatto che comprende la sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 3 codificante per la subunità beta dell'enzima prolil4-idrossilasi (PDI) di spugna C. reniformis il quale enzima, avente attività prolil-idrossilasica, à ̈ coinvolto nelle modifiche catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e nel processo di formazione del collagene marino.
  24. 24. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 22 e 23 caratterizzato dal fatto che comprende entrambe le sequenze nucleodiche mostrate in SED ID NO: l e SED ID NO: 3
  25. 25. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 23 caratterizzato dal fatto che il sito di clonaggio à ̈ preceduto dalla regione codificante per l'Alfa Mating factor (AM) di S. cerevisiae .
  26. 26. Ceppo di lievito ricombinante per la produzione di proteine collageniche di spugna di mare caratterizzato dal fatto che esprime al suo interno almeno una sequenza nucleotidica codificante per una catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e di almeno una sequenza nucleotidica codificante per una proteina enzimatica o di almeno una sua subunità coinvolta nelle modifiche di detta catena nel processo di formazione del collagene marino.
  27. 27. Ceppo di lievito secondo la rivendicazione 26 caratterizzato dal fatto che appartiene alla specie Pichia pastoris.
  28. 28. Ceppo di lievito secondo la rivendicazione 26 o 27 caratterizzato dal fatto che detto ceppo esprime le sequenze nucleotidiche codificanti per le subunità alfa e beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi di spugna C.reniformis, il quale enzima, avente attività prolil-idrossilasica, à ̈ coinvolto nelle modifiche catena polipeptidica primaria di collagene marino, cosiddetto procollagene, e nel processo di formazione del collagene marino, e almeno la sequenza nucleotidica codificante per il procollagene non fibrillare di spugna C.reniformis
  29. 29. Ceppo di lievito Pichia pastoris caratterizzato dal fatto che à ̈ il ceppo depositato con numero 34P in data 05/04/13 presso la Collezione dei lieviti Industriali DBVPG avente riferimento "Pichia pastoris ColCH4".
  30. 30. Acido nucleico isolato comprendente la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID NO:1 e codificante per la subunità alfa dell'enzima prolil-4-idrossilasi (P4H) coinvolto nella idrossilazione della catena polipeptidica di procollagene marino.
  31. 31. Acido nucleico isolato comprendente la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ ID NO:3 e codificante per la subunità beta dell'enzima prolil-4-idrossilasi (PDI) coinvolto nella idrossilazione della catena polipeptidica di procollagene marino.
  32. 32. Enzima prolil-4-idrossilasi coinvolto nella idrossilazione della catena polipeptidica di procollagene marino le cui subunità alfa e beta presentano una sequenza amminoacidica come mostrato rispettivamente in SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, essendo detta subunità alfa caratterizzata da un peso molecolare di 61.9 e da un punto isoelettrico di 6.31 ed essendo detta subunità beta caratterizzata da un peso molecolare di 58.8 e da un punto isoelettrico di 4.34.
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