ITFI20010243A1 - Gel solubili e biocompatibili di acido ialuronico cross-linked con l-amminoacidi o l-amminoesteri bifunzionali - Google Patents
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Description
Descrizione della Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo: Gel solubili e biocompatibili di Acido laluronico cross-linked con L-amminoacidi o L-amminoesteri bifunzionali
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a gel solubili e biocompatibili costituiti da Acido laluronico cross-linked con L-amminoacidi o L-amminoesteri bifunzionali, o loro miscele, ad un processo per la loro preparazione ed al loro uso in campo farmaceutico, cosmetico, chirurgico e medico in generale.
Stato dell’arte:
L’acido laluronico è un mucopolisaccaride costituito da unità alternate di Acido D-Glucoronico e N-Acetil-D-Glucosammina, legati insieme attraverso legami β 1-3 e β1-4.
In natura l’Acido laluronico si trova nel fluido sinoviale dei giunti articolari, nell’umore vitreo degli occhi, nel cordone ombelicale e nel tessuto connettivo. L’Acido laluronico viene ottenuto per estrazione da tessuti animali come le creste di gallo o i cordoni ombelicali, oppure recuperato da brodi di fermentazione di particolari ceppi di Streptococchi.
Il rapido sviluppo delle biotecnologie ha portato ad una ottimizzazione e potenziamento di quest’ultima strategia di produzione dell'Acido Ialuronico, risultando oggi la più semplice e conveniente.
Le applicazioni dell’Acido Ialuronico, che vanno dall’uso in chirurgia a quello farmacologico e in genere biomedico, sono state ampiamente descritte in letteratura, vedi ad esempio: Balazs et al."Hyaluronan Biomaterials: Medicai Applications”, Handbook of Biomaterials and Applications, ed. DL Wise et al., 1995, 2719-2741; US -5,559,104,1996; Pape, Balazs, Ophthalmology, 87, No. 7, 1980; Iwata, Clin. Orthop., 289, 285-291 ; 1993; US - 5,128,326; US - 4,500,676; US - 5,840,046; US - 5,795,584; US - 6,010,692; US - 5, 658, 331.
Poiché l’importante ruolo svolto dall’Acido laluronico neH’organismo umano è determinato dalle particolari caratteristiche manifestate dalle sue soluzioni acquose come le proprietà viscoelastiche, lubrificanti e idrofiliche, i ricercatori si sono da tempo orientati verso la sintesi di nuovi derivati dell’acido ialuronico che migliorino o modulino dette caratteristiche in modo da ottenere i prodotti più adatti per i vari impieghi.
Una vasta letteratura riporta vari prodotti di cross-link dell’ Acido laluronico con, ad esempio, formaldeide (Balazs, U.S. Pat. 4,713,448, 1987), divinil sulfone (Balazs, U.S. Pat. 4,582,865, 1986), aziridine, alcoli (Della Valle, U.S. Pat. 4,851,521, 1989) e amminoacidi monofunzionali (Hamilton, U.S. Pat. 4,937,270, 1990).
In particolare Miller et al., U.S. Pat. 5,760,200, 1998 descriveva già i metodi preparazione di derivati insolubili dell’Acido laluronico, ad esempio con L-lisina etilestere, in presenza di una carbodiimmide solubile in acqua; la reazione veniva condotta in forte eccesso di attivante e amminoacido allo scopo di ottenere un gel insolubile.
Inoltre nel brevetto (WO 01/58961), a nome della stessa Richiedente, sono descritti derivati di Acido laluronico cross-linked con L-amminoacidi o L-amminoesteri bifunzionali, e loro processi di preparazione sia in acqua che in solventi organici, tuttavia i prodotti ivi descritti e rivendicati, pur nella loro validità, sono però suscettibili di ulteriori miglioramenti delle loro caratteristiche di viscoelasticità, biocompatibilità e purezza in vista degli impieghi farmacologici, medici o chirurgici cui questi prodotti sono normalmente destinati.
E’ evidente in questa ottica l’interesse a disporre di sempre nuovi prodotti in modo da allargare e migliorare l'impiego dell'Acido laluronico per gli usi di interesse o per nuove applicazioni.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La presente invenzione consente di rispondere alle esigenze suddette rendendo disponibili gel solubili in acqua e biocompatibili derivati dal cross-link dell’Acido laluronico con L-amminoacidi o L-amminoesteri bifunzionali o loro miscele.
Dette caratteristiche rendono i prodotti secondo l’invenzione ideali per l’impiego in numerosi campi, dal farmaceutico al medico.
Il prodotto, sotto forma di gel o film, può essere ad esempio utilizzato come materiale anti-aderenziale in campo chirurgico (addominale, spinale, ecc.); in questo caso il materiale forma una barriera di separazione tra i tessuti lesionati e viene riassorbito dall’organismo dopo un periodo di tempo sufficiente alla ricostruzione dei tessuti.
I prodotti secondo l'invenzione possono essere inoltre impiegati come substrato per l’ingegneria dei tessuti (derma, epidermide, ossa, cellule adipose, ecc.); infine può trovare applicazione in campo oftalmico, dermatologico, nel campo delle osteoartriti, ecc.
I prodotti secondo l'invenzione si preparano in acqua oppure in miscele acqua e solventi organici come DMF o DMSO, a seconda delle applicazioni. In tutti i casi la reazione avviene in due passaggi successivi: il primo consiste nell'attivazione dell'Acido laluronico e il secondo nella formazione dei legami tra Acido laluronico e agente cross-linkante. L'attivazione dell'Acido laluronico avviene ad opera di una carbodiimmide solubile in acqua, secondo uno schema noto (vedi ad esempio Tomihata, J. Biomed. Mater. Res., 1997, 37(2), 243-251; Danishefsky, Carbohydrate Res., 1971, 16, 199-205). Tra le diverse carbodiimmidi solubili in acqua, particolarmente preferita, secondo l'invenzione, è la N-3-dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato. Gli agenti cross-linkanti utilizzati secondo l’invenzione sono a L-amminoacidi bifunzionali, aventi cioè un secondo gruppo funzionale oltre a quello amminoacidico, o i loro esteri o miscele. Particolarmente preferiti sono la L-Lisina, L-Serina, L-Lisina etilestere dicloridrato, L-Lisina metilestere dicloridrato, L-Serina metilestere cloridrato, L-Serina etilestere cloridrato o loro miscele. L’utilizzo degli amminoesteri al posto degli amminoacidi assicura la protezione delle funzioni carbossiliche degli amminoacidi nei confronti di un’eventuale attivazione e coinvolgimento in reazioni collaterali.
La reazione viene condotta all'interno di un reattore termostatato e munito di agitazione meccanica. L’Acido laluronico sale sodico viene disciolto in acqua in concentrazione compresa tra 0.5-2.5% a seconda delle caratteristiche che si vogliono ottenere nel prodotto finale; la concentrazione preferita è tra 1-1.5%.
La temperatura di reazione è uno dei fattori determinanti per ottenere i prodotti secondo l’invenzione e deve essere compresa tra 0-25°C, preferibilmente tra 0° -10°C.
Il pH di reazione viene portato a valori compresi tra 3 - 6, preferibilmente tra 4 - 5, ad esempio aggiungendo una soluzione di HCI diluito.
Un altro fattore determinante per ottenere i prodotti secondo l’invenzione è il rapporto tra attivante e Acido laluronico sale sodico di partenza; l’attivante viene aggiunto in quantità comprese tra 0.05-0.5 equivalenti per equivalente monomerico di Acido laluronico, preferibilmente tra 0.1 e 0.2 equivalenti. Utilizzare quantità di attivante superiori rispetto a quelle riportate sopra comporta la formazione prevalente di legami irreversibili tra Acido laluronico e attivante a scapito di quelli tra Acido laluronico e agente cross-linkante il che si traduce nell’ottenimento di prodotti indesiderati, insolubili o parzialmente insolubili in acqua e con caratteristiche di biocompatibilità e purezza diverse rispetto a quelle dei prodotti descritti nella presente invenzione.
L’Agente cross-linkante, infine, viene aggiunto in quantità comprese tra 0.1 - 1 equivalenti per equivalente di unità monomerica di Acido laluronico di partenza.
Terminate le aggiunte suddette la miscela di reazione è mantenuta a temperatura e in agitazione per un periodo di tempo compreso tra 15 minuti - 4 ore, preferibilmente tra 30 minuti e 2 ore.
Si aggiunge quindi una soluzione di NaCI 1 M e una soluzione tampone a pH 7 - 8 (preferibilmente 7.5) quindi si procede ad una purificazione secondo i metodi già conosciuti tra cui dialisi e/o diafiltrazione su membrana di ultrafiltrazione e/o precipitazione con solvente organico e/o evaporazione sotto vuoto e/o liofilizzazione. I metodi preferiti sono la diafiltrazione su membrana a cutoff di 30 KDa e la liofilizzazione. Il prodotto solido può essere ridisciolto in acqua o in soluzione fisiologica, in diverse concentrazioni per ottenere soluzioni viscose o gel trasparenti; è possibile ottenere anche film sottili, membrane, a seconda del tipo di applicazione a cui viene destinato.
Il prodotto può infine essere sterilizzato, ad esempio per filtrazione a 0.2 μ·
Le quantità reciproche di Acido laluronico/attivante/agente crosslinkante influenzano il grado di cross-link del prodotto e quindi verranno adottate in funzione delle proprietà visco-elastiche che si intendono ottenere.
Ovviamente le caratteristiche del prodotto finale saranno anche influenzate dal tipo di Acido laluronico utilizzato come prodotto di partenza per la reazione. E’ infatti evidente che a parità di altre condizioni Acido laluronico avente peso molecolare più alto consentirà di ottenere un gel più viscoso e compatto rispetto a quello ottenibile a partire da Acido laluronico di peso molecolare inferiore.
Preferibilmente secondo l’invenzione si utilizza Acido laluronico avente . peso molecolare compreso tra 100.000 e 2.000.000 ed i prodotti finali ottenuti hanno peso molecolare compreso tra 200.000 e 2.500.000.
I prodotti finali presentano un grado di cross-link compreso tra 2-40 %. L’invenzione sarà meglio compresa alla luce degli esempi qui di seguito riportati.
ESEMPIO 1
1.0 g di Acido laluronico sale sodico (PM 1.550.000) (2.5 mmoli) vengono disciolti in 100 mi di acqua demineralizzata. La temperatura di reazione viene mantenuta a 5°C e il pH corretto a 4.5 aggiungendo una soluzione di HCI diluito. Vengono aggiunti 0.048 g (0.1 eq.) di N-3-dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato e 0.31 g (0.5 eq.) di L-Lisina etilestere dicloridrato.
Dopo 1 ora vengono aggiunti 10 mi di soluzione di NaCI 1M e 10 mi di soluzione tampone a pH 7.5; il gel viene diafiltrato con 10 volumi di acqua demineralizzata su membrana a cutoff di 30 KDa e infine liofilizzato.
ESEMPIO 2
1.0 g di Acido laluronico sale sodico (PM1.550.000) (2.5 mmoli) vengono disciolti in 100 mi di acqua demineralizzata. La temperatura di reazione viene mantenuta a 5°C e il pH corretto a 4.5 aggiungendo una soluzione di HCI diluito. Vengono aggiunti 0.096 g (0.2 eq.) di N-3dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato e 0.31 g (0.5 eq.) di L-Lisina etilestere dicloridrato.
Dopo 1 ora vengono aggiunti 10 mi di soluzione di NaCI 1M e 10 mi di soluzione tampone a pH 7.5; il gel viene diafiltrato con 10 volumi di acqua demineralizzata su membrana a cutoff di 30 KDa e infine liofilizzato.
ESEMPIO 3
1.0 g di Acido laluronico sale sodico (PM 750.000) (2.5 mmoli) vengono disciolti in 100 mi di acqua deinineralizzata. La temperatura di reazione viene mantenuta a 5°C e il pH corretto a 4.5 aggiungendo una soluzione di HCI diluito. Vengono aggiunti 0.048 g (0.1 eq.) di N-3-dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato e 0.20 g (0.5 eq.) di L-Serina metilestere cloridrato.
Dopo 1 ora vengono aggiunti 10 mi di soluzione di NaCI 1M e 10 mi di soluzione tampone a pH 7.5; il gel viene diafiltrato con 10 volumi di acqua demineralizzata su membrana a cutoff di 30 KDa e infine liofilizzato.
ESEMPIO 4
1.0 g di Acido laluronico sale sodico (PM 750.000) (2.5 mmoli) vengono disciolti in 100 mi di acqua demineralizzata. La temperatura di reazione viene mantenuta a 5°C e il pH corretto a 4.5 aggiungendo una soluzione di HCI diluito. Vengono aggiunti 0.096 g (0.2 eq.) di N-3-dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato e 0.20 g (0.5 eq.) di L-Serina metilestere cloridrato.
Dopo 1 ora vengono aggiunti 10 mi di soluzione di NaCI 1M e 10 mi di soluzione tampone a pH 7.5; il gel viene diafiltrato con 10 volumi di acqua demineralizzata su membrana a cutoff di 30 KDa e infine liofilizzato.
ESEMPIO 5
1.0 g di Acido laluronico sale sodico (PM 1.600.000) (2.5 mmoli) vengono disciolti in 100 mi di acqua demineralizzata. La temperatura di reazione viene mantenuta a 5°C e il pH corretto a 4.5 aggiungendo una soluzione di HCI diluito. Vengono aggiunti 0.048 g (0.1 eq.) di N-3-dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato e 0.18 g (0.5 eq.) di L-Lisina.
Dopo 1 ora vengono aggiunti 10 mi di soluzione di NaCI 1M e 10 mi di soluzione tampone a pH 7.5; il gel viene diafiltrato con 10 volumi di acqua demineralizzata su membrana a cutoff di 30 KDa e infine liofilizzato.
ESEMPIO 6
Il solido ottenuto dall'esempio 1 viene ridisciolto in acqua in concentrazione di 3-4 g/l e filtrato a 0.2 micron, in condizioni asettiche. Il gel filtrato risulta sterile ed ha un contenuto di endotossine inferiore a 0.2 EU/mg (ss).
La caratterizzazione chimico-fisica ha evidenziato un grado di cross-link del 10%, una perdita all'essiccamento del 18-20% e i seguenti segnali
Claims (21)
- Rivendicazioni 1. Processo per la preparazione di gel solubili e biocompatibili costituiti da Acido laluronico cross-linked con cross-linkanti bifunzionali in cui: - l’acido ialuronico è sciolto in acqua a concentrazione compresa fra 0.5 - 2.5% (p/p) e a temperatura compresa fra 0° - 25°C e il pH della soluzione è portato a 3 - 6 con ; - si aggiungono alla soluzione gli agenti cross-linkanti bifunzionali in quantità comprese fra 0.1 - 1 equivalenti per equivalente di unità monomerica di acido ialuronico e una agente attivante in quantità compresa fra 0.05 - 0.5 equivalenti per equivalente di unità monomerica di acido ialuronico; - si mantiene sotto agitazione la soluzione per 15 minuti - 4 ore; - si aggiunge alla soluzione una soluzione di NaCI 1M ed una soluzione tampone a pH 7 - 8. - si raccoglie il gel formatosi e si purifica secondo tecniche note.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui i cross-linkanti bifunzionali sono L-amminoacidi e/o L-amminoesteri o loro miscele.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 2 in cui i cross-linkanti bifunzionali sono: L-Lisina, L-Serina, L-Lisina etilestere dicloridrato, L-Lisina metilestere dicloridrato, L-Serina etilestere cloridrato, L-Serina metilestere cloridrato, o loro miscele.
- 4. Processo secondo le rivendicazioni 1 - 3 in cui la temperatura di reazione è compresa tra 0 -10°C.
- 5.Processo secondo la rivendicazione 4 in cui il pH di reazione è compresa tra 3 - 6.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 5 in cui il pH di reazione è compresa tra 4 - 5.
- 7. Processo secondo le rivendicazioni 1 - 6 in cui l’agente attivante è una carbodiimmide solubile in acqua.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 7 in cui l'attivante è la N-3-dimetilammino-propiletilcarbodiimmide cloridrato.
- 9. Processo secondo le rivendicazioni 1 - 8 in cui l’agente attivante viene aggiunto in quantità comprese tra 0.1 -0.2 equivalenti per equivalente di unità monomerica di Acido laluronico.
- 10. Processo secondo le rivendicazioni 1 - 9 in cui il tempo di reazione è compreso tra 30 minuti e 2 ore.
- 11. Processo secondo le rivendicazioni 1 - 10 in cui al gel finale si aggiunge una soluzione di NaCI 1M e una soluzione tampone a pH 7.5.
- 12. Processo secondo la rivendicazione 1 - 11 in cui il gel viene purificato per dialisi e/o diafiltrazione su membrana di ultrafiltrazione e/o precipitazione con solvente organico e/o evaporazione sotto vuoto e/o liofilizzazione.
- 13. Processo secondo la rivendicazione 12 in cui il gel viene purificato per diafiltrazione su membrana a cutoff di 30 KDa e liofilizzato.
- 14. Processo secondo le rivendicazioni 1 - 13 in cui il gel purificato viene sterilizzato per filtrazione a 0.2 micron.
- 15.Processo secondo le rivendicazioni 1 -14 in cui l’acido ialuronico ha peso molecolare compreso fra 100.000 e 2.000.000.
- 16. Gel solubili e biocompatibili costituiti da Acido laluronico cross-linked con cross-linkanti bifunzionali ottenuti secondo un processo secondo le rivendicazioni 1 - 14.
- 17. Gel secondo la rivendicazione 17 avente un grado di cross-link compreso fra 2 - 40%.
- 18.Gel secondo le rivendicazioni 16 e 17 aventi peso molecolare compreso fra 200.000 e 2.500.000.
- 19. Uso di un gel secondo le rivendicazioni 16 - 18 come materiale antiaderenziale in campo chirurgico.
- 20.Uso di un gel secondo le rivendicazioni 16 - 18 come substrato per l'ingegneria dei tessuti (derma, epidermide, ossa, cellule adipose, ecc.)
- 21. Uso di un gel secondo le rivendicazioni 16 - 18 come prodotto per applicazioni in campo oftalmico, dermatologico o nel campo delle osteoartriti.
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