IT202100002717A1 - METHOD FOR THE DETECTION AND MEASUREMENT OF SPECIFIC ANTIGENS - Google Patents
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Description
METODO PER LA RIVELAZIONE E LA MISURA DI ANTIGENI METHOD FOR THE DETECTION AND MEASUREMENT OF ANTIGENS
SPECIFICI SPECIFIC
CAMPO DI APPLICAZIONE FIELD OF APPLICATION
Forma oggetto del seguente trovato un metodo, afferente al campo del monitoraggio degli inquinanti ambientali, per la rilevazione e la misura di Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), come ma non solo il Benzo[a]pirene (B[a]p), mediante un dispositivo elettronico, anche portatile, di tipo immunosensore, che fa uso di anticorpi monoclonali e policlonali specifici rispetto ad IPA. The following invention relates to a method, pertaining to the field of monitoring environmental pollutants, for detecting and measuring Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), such as but not only Benzo[a]pyrene (B[a]p), by an electronic device, also portable, of the immunosensor type, which makes use of specific monoclonal and polyclonal antibodies with respect to PAH.
STATO DELLA TECNICA STATE OF THE ART
Le emissioni inquinanti costituiscono un pericolo per la salute umana e per quella ambientale, per questa ragione da tempo si adottano misure volte a ridurre l?impatto delle attivit? che le provocano. Tra gli inquinanti con un maggiore impatto ambientale vi sono gli IPA, i quali hanno noti effetti negativi sull'ambiente, sulla salute umana ed animale, come effetti tossicologici, cancerogeni e mutageni. Il B(a)p ? uno tra gli IPA pi? potenti per i suoi effetti sulla salute. Il B(a)p ? considerato altamente cancerogeno per l'uomo, e la sua esposizione cronica pu? causare una diminuzione della funzione respiratoria, dolore toracico, irritazione e tosse. Questi si formano principalmente come sottoprodotti di pirolisi, soprattutto durante la combustione incompleta di materiali organici. Una delle principali fonti di emissione del B(a)p, soprattutto nelle aree urbane, ? rappresentata dai gas di scarico dei motori a combustione interna dei veicoli. Polluting emissions constitute a danger to human health and the environment, for this reason measures have been taken for some time to reduce the impact of environmental activities. which cause them. Among the pollutants with a greater environmental impact are the PAHs, which have known negative effects on the environment, on human and animal health, such as toxicological, carcinogenic and mutagenic effects. The B(a)p ? one of the IPA pi? potent for its health effects. The B(a)p ? considered highly carcinogenic to humans, and its chronic exposure can? cause a decrease in respiratory function, chest pain, irritation and cough. These are mainly formed as by-products of pyrolysis, especially during the incomplete combustion of organic materials. One of the main sources of B(a)p emissions, especially in urban areas, is represented by the exhaust gases of internal combustion engines of vehicles.
Le vigenti e prossime norme che regolano la qualit? delle emissioni richiedono e richiederanno sempre pi? urgentemente l'accesso agli strumenti diagnostici che consentano il monitoraggio della produzione degli IPA. The current and upcoming standards that regulate the quality? of emissions require and will require more and more? urgently access to diagnostic tools that allow monitoring of the production of PAHs.
Una soluzione ? fornita dal brevetto KR20110040159, che propone l?utilizzo di un kit per la diagnosi di contaminazione da Benzo[a]pirene in vivo contenente un antigene che si lega specificamente ad un marcatore, se il valore del marcatore supera un certo livello di soglia vi ? contaminazione. A solution ? provided by the KR20110040159 patent, which proposes the use of a kit for the diagnosis of Benzo[a]pyrene contamination in vivo containing an antigen that binds specifically to a marker, if the marker value exceeds a certain threshold level there? contamination.
Il brevetto US6676904, invece, atto ad isolare un generico analita in un campione di prova, prevede l?utilizzo di una membrana semipermeabile modificata chimicamente per la trattenuta dell?analita e di un sistema per il rilevamento della loro presenza sulla membrana. Patent US6676904, on the other hand, suitable for isolating a generic analyte in a test sample, provides for the use of a chemically modified semipermeable membrane for retaining the analyte and a system for detecting their presence on the membrane.
Entrambe le soluzioni presentano delle differenze sostanziali da quello oggetto della richiesta di brevetto. Le differenze fondamentali risiedono nell?incapacit? di misurare il quantitativo di antigene ma solo di rilevarne la presenza, nel limite di non poter essere utilizzate in tempo reale, e di non avere lo stesso grado di sensibilit? e di specificit?. Both solutions present substantial differences from the one covered by the patent application. The fundamental differences reside in the inability? to measure the quantity of antigen but only to detect its presence, within the limit of not being able to be used in real time, and not having the same degree of sensitivity? and specificity.
Infatti, le miscele di IPA hanno generalmente composizioni caratterizzate da concentrazioni differenti per ciascuna singola specie. Dato che ogni singola specie ha un impatto molto diverso sulla salute umana, e, in generale, sull?ambiente, risulta chiara l?importanza di utilizzare tecniche che consentano l'identificazione e la quantificazione di sostanze organiche in una variet? di matrici. In fact, PAH blends generally have compositions characterized by different concentrations for each single species. Given that each individual species has a very different impact on human health, and, in general, on the environment, the importance of using techniques that allow the identification and quantification of organic substances in a variety of species is clear. of arrays.
Soluzioni esemplificative sono la Gas-Cromatografia - Spettrometria di Massa (GC-MS), e la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), come previsto dai brevetti CN106198796A e WO2020244311A1. Exemplary solutions are Gas-Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS), and high performance liquid chromatography (HPLC), as foreseen by the patents CN106198796A and WO2020244311A1.
Tali soluzioni presentano, tuttavia, il limite di non essere applicabili per analisi in sito e in tempo reale, in quanto tecniche da laboratorio che impiegano macchinari di grosse dimensioni, i quali, per di pi?, hanno costi di acquisto, di esercizio e di manutenzione rilevanti e richiedono l?impiego di operatori specializzati. However, these solutions have the limitation of not being applicable for on-site and real-time analysis, as they are laboratory techniques that use large-sized machinery, which, moreover, have purchase, operating and maintenance and require the use of specialized operators.
Si pone, quindi, la necessit? di implementare una tecnologia innovativa per misurare l'emissione della specifica specie di IPA in sito e in tempo reale. Therefore, does the need arise? to implement an innovative technology to measure the emission of the specific PAH species on site and in real time.
Un metodo per la rilevazione e la misura di inquinanti ? descritto nel brevetto CN105699345A, un metodo per misurare gli inquinanti in virt? della combinazione di uno spettro di fluorescenza tridimensionale e un algoritmo PARAFAC, in particolare un metodo per identificare rapidamente inquinanti con caratteristiche di fluorescenza, come ma non solo il B(a)P, in ambienti quali acqua e suolo. A method for detecting and measuring pollutants? described in the patent CN105699345A, a method for measuring pollutants in virtue of the combination of a three-dimensional fluorescence spectrum and a PARAFAC algorithm, in particular a method for rapidly identifying pollutants with fluorescence characteristics, such as but not limited to B(a)P, in environments such as water and soil.
Il metodo, secondo il presente trovato, ha un principio di funzionamento differente. Infatti, prevede il rilevamento e la misurazione della massa di uno specifico IPA attraverso l?impiego di un dispositivo che utilizza anticorpi monoclonali e policlonali. Gli anticorpi policlonali vengono utilizzati per l?appesantimento degli IPA secondo un protocollo di tipo sandwich, come ma non solo quello utilizzato nel Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). The method according to the present invention has a different operating principle. In fact, it provides for the detection and measurement of the mass of a specific PAH through the use of a device that uses monoclonal and polyclonal antibodies. Polyclonal antibodies are used to weight down PAHs according to a sandwich-type protocol, such as but not limited to that used in the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).
Esistono brevetti che utilizzano tale protocollo. Un esempio ? il brevetto CN105738611A, che prevede l?impiego di un kit ELISA per rilevare B(a)P residuo. Il kit ELISA include una piastra ELISA rivestita da B(a)P, anticorpi specifici per B(a)P, anticorpi secondari per protocollo ELISA, una soluzione di riferimento per B(a)P, un diluente per campioni, un anticorpo diluente, un agente di sviluppo del colore e una soluzione di arresto. There are patents using this protocol. An example ? the patent CN105738611A, which provides for the use of an ELISA kit to detect residual B(a)P. The ELISA kit includes a B(a)P coated ELISA plate, B(a)P specific antibodies, secondary antibodies per ELISA protocol, B(a)P reference solution, sample diluent, antibody diluent, a color developing agent and a stop solution.
Il metodo, secondo il presente trovato, seppur basato su un protocollo di appesantimento, quale ma non solo ELISA, differisce da tale brevetto per la metodologia di rilevamento e misura degli IPA. Infatti, al protocollo di appesantimento tipo sandwich, affinch? vi sia il rilevamento e la misura degli IPA con l?elemento sensibile del dispositivo, ? associato un protocollo di funzionalizzazione dell?elemento sensibile con anticorpi monoclonali, come ma non solo Photonic Immobilization Technique (PIT). The method according to the present invention , although based on a weighting protocol, such as but not limited to ELISA, differs from this patent in the method of detecting and measuring the PAHs. In fact, the sandwich-type weighting protocol, so that? there is the detection and measurement of the PAHs with the sensitive element of the device, ? associated with a protocol for functionalisation of the sensitive element with monoclonal antibodies, such as but not limited to the Photonic Immobilization Technique (PIT).
Ricerche preliminare e incomplete sul metodo oggetto del presente trovato sono state pubblicate su riviste scientifiche. Ne sono un esempio: Preliminary and incomplete research on the method object of the present invention has been published in scientific journals. They are an example:
- "Detection of parathion and patulin by quartzcrystal microbalance functionalized by the photonics immobilization technique." Biosensors and Bioelectronics 67 (2015): 224-229. https://doi.org/10.1016/j.bios.2014.08.020 - "Detection of parathion and patulin by quartzcrystal microbalance functionalized by the photonics immobilization technique." Biosensors and Bioelectronics 67 (2015): 224-229. https://doi.org/10.1016/j.bios.2014.08.020
- "Detection of parathion pesticide by quartz crystal microbalance functionalized with UV-activated antibodies." Analytical chemistry 85.13 (2013): 6392-6397. https://doi.org/10.1021/ac400852c - "Light assisted antibody immobilization for bio-sensing." Biomedical optics express 2.11 (2011): 3223-3231. https://doi.org/10.1364/BOE.2.003223 - "Detection of parathion pesticide by quartz crystal microbalance functionalized with UV-activated antibodies." Analytical chemistry 85.13 (2013): 6392-6397. https://doi.org/10.1021/ac400852c - "Light assisted antibody immobilization for bio-sensing." Biomedical optics express 2.11 (2011): 3223-3231. https://doi.org/10.1364/BOE.2.003223
Altra versione incompleta del metodo ? quella presentata nella domanda di deposito n? IO 61438, IT UB20169920. Another incomplete version of the method ? the one presented in the filing application n? IO 61438, IT UB20169920.
Si sintetizzano di seguito le principali differenze rispetto alle precedenti versioni incomplete del metodo: The main differences with respect to the previous incomplete versions of the method are summarized below:
- Il metodo prevede l?utilizzo di un dispositivo, anche portatile, per la rilevazione e la misura di IPA in sito e in tempo reale. - The method involves the use of a device, also portable, for the detection and measurement of PAHs on site and in real time.
- Il metodo, secondo il presente trovato, ? innovativo nelle fasi (a), (b), (c). - The method, according to the present invention, ? innovative in phases (a), (b), (c).
Infatti, il metodo, secondo il trovato, prevedere, attraverso tali fasi, la raccolta del campione da analizzare direttamente in fase gassosa, con condensazione attraverso un appropriato elemento, quale, ma non solo, trappola raffreddata a ghiaccio, e filtraggio del campione con filtro, quale ma non solo, filtro in teflon. In fact, the method according to the invention provides, through these phases, for the collection of the sample to be analyzed directly in the gaseous phase, with condensation through a suitable element, such as, but not limited to, an ice-cooled trap, and filtering of the sample with a filter , which but not only, Teflon filter.
- L?immunosensore, secondo il trovato, ? compatibile per il funzionamento in soluzioni acquose. Gli IPA, invece, sono scarsamente solubili in acqua. Il metodo, secondo il trovato, consente, attraverso le fasi innovative (d) (e), che definiscono come appropriata una miscela di etanolo e acqua 20-80%, di ottimizzare allo stesso tempo la solubilit? degli IPA e di garantire il corretto funzionamento dell?immunosensore. - The immunosensor, according to the invention ? compatible for operation in aqueous solutions. PAHs, on the other hand, are poorly soluble in water. The method according to the invention allows, through the innovative steps (d) (e), which define a mixture of ethanol and water 20-80% as appropriate, to optimize at the same time the solubility? of PAHs and to ensure proper functioning of the immunosensor.
- Il metodo, secondo il presente trovato, ? innovativo nelle fasi (f), (g), (h). - The method, according to the present invention, ? innovative in phases (f), (g), (h).
Tali fasi prevedono l?utilizzo in combinazione di anticorpi monoclonali e policlonali. Gli anticorpi policlonali, sono in grado di riconoscere diversi epitopi dello stesso antigene, ed hanno quindi elevata possibilit? di catturare una specifica classe di IPA in una soluzione contenente molti tipi di antigeni. Gli anticorpi monoclonali riconoscono un solo epitopo della specifica classe di IPA, garantendo la cattura di quella sola specifica classe di IPA. Tali fasi rendono, pertanto, il metodo altamente sensibile e specifico. These steps involve the use of monoclonal and polyclonal antibodies in combination. Polyclonal antibodies are able to recognize different epitopes of the same antigen, and therefore have a high possibility to capture a specific class of PAHs in a solution containing many types of antigens. Monoclonal antibodies recognize only one epitope of the specific PAH class, ensuring that only that specific PAH class is captured. These phases therefore make the method highly sensitive and specific.
Per ovviare a tutti gli inconvenienti su menzionati ed ottenere ulteriori vantaggi, il Richiedente ha studiato e realizzato il presente trovato. To obviate all the drawbacks mentioned above and obtain further advantages, the Applicant has studied and implemented the present invention.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO DISCOVERY DISPLAY
Il presente trovato ? esposto e caratterizzato nelle sue rivendicazioni principali. The present found ? exposed and characterized in its main claims.
Altre caratteristiche sono presenti nelle rivendicazioni secondarie. Other characteristics are present in the secondary claims.
Scopo del seguente trovato ? quello di definire una metodologia per il rilevamento e la misura di specifici IPA, come ma non solo il Benzo[a]pirene (B[a]p), in sito e in tempo reale, mediante un dispositivo elettronico di tipo immunosensore che sia pratico, funzionale, e che possa esser utilizzato in condizioni di assoluta sicurezza anche da parte di utenti non esperti. Purpose of the following invention ? that of defining a methodology for the detection and measurement of specific PAHs, such as but not only Benzo[a]pyrene (B[a]p), in situ and in real time, using an immunosensor-type electronic device that is practical , functional, and that can be used in conditions of absolute safety even by non-expert users.
Il metodo, secondo il trovato, si basa sull?utilizzo di un dispositivo elettronico di tipo immunosensore, anche portatile, comprendente: The method according to the invention is based on the use of an electronic device of the immunosensor type, also portable, comprising:
1) Una linea per il prelievo del campione costituita da un elemento per la condensazione, quale, ma non solo, trappola raffreddata a ghiaccio, e filtro, quale ma non solo filtro in teflon; 1) A sampling line consisting of a condensing element, such as, but not limited to, an ice-cooled trap, and filter, such as, but not limited to Teflon filter;
2) un elemento per la produzione di luce impulsata ultravioletta, quali ma non solo lampade impulsate UV e/o laser ultravioletti; 2) an element for producing pulsed ultraviolet light, such as but not limited to pulsed UV lamps and/or ultraviolet lasers;
3) un circuito fluidico con pompa, come ma non solo una pompa peristaltica; 4) un elemento sensibile, come ma non solo un elettrodo; 3) a fluid circuit with a pump, such as but not limited to a peristaltic pump; 4) a sensing element, such as but not limited to an electrode;
5) uno strumento per la misura del peso, come ma non solo una microbilancia a cristalli di quarzo; 5) an instrument for measuring weight, such as but not limited to a quartz crystal microbalance;
6) un PC con software per la lettura e analisi in tempo reale. 6) a PC with software for real-time reading and analysis.
Il metodo, secondo il trovato, consente il rilevamento e la misura di specifici IPA, quale ma non solo il Benzo[a]pirene (B[a]p), attraverso l?utilizzo di un dispositivo di tipo immunosensore, comprendente le fasi di: The method according to the invention allows the detection and measurement of specific PAHs, such as but not only Benzo[a]pyrene (B[a]p), through the use of a device of the immunosensor type, comprising the steps of :
a) Raccolta del campione in fase gassosa; a) Collection of the sample in the gaseous phase;
b) Condensazione del campione attraverso un elemento condensatore, quale, ma non solo, una trappola raffreddata a ghiaccio, per la raccolta delle specie condensate; b) Condensation of the sample through a condenser element, such as, but not limited to, an ice-cooled trap, for the collection of the condensed species;
c) Filtrazione del campione con filtro, come ma non solo filtro in teflon, per la raccolta delle particelle di fuliggine; c) Filtration of the sample with a filter, such as but not limited to a Teflon filter, for the collection of soot particles;
d) Lavaggio dell?elemento condensatore e del filtro con un solvente organico volatile, quale ma non solo il diclorometano, per la solubilizzazione delle specie condensate e delle particelle di fuliggine; d) Washing of the condenser element and of the filter with a volatile organic solvent, such as but not only dichloromethane, for the solubilization of the condensed species and of the soot particles;
e) Volatilizzazione del solvente organico volatile, seguita da una dissoluzione preliminare del campione in etanolo e poi da una diluizione con acqua, in una miscela del 20-80%; e) Volatilization of the volatile organic solvent, followed by a preliminary dissolution of the sample in ethanol and then by a dilution with water, in a mixture of 20-80%;
f) Irradiazione mediante dispositivo per la produzione di luce impulsata ultravioletta, e deposizione degli anticorpi monoclonali sull?elemento sensibile con orientamento preferenziale attraverso un protocollo specifico, come ma non solo Photonic Immobilization Technique (PIT); f) Irradiation using a device for the production of pulsed ultraviolet light, and deposition of monoclonal antibodies on the sensitive element with preferential orientation through a specific protocol, such as but not limited to Photonic Immobilization Technique (PIT);
g) Appesantimento degli antigeni con anticorpi policlonali secondo un protocollo di tipo sandwich, come ma non solo quello utilizzato nel Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA); g) Weighting of the antigens with polyclonal antibodies according to a sandwich-type protocol, such as but not limited to the one used in the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA);
h) Ancoraggio degli appesantiti antigeni agli anticorpi monoclonali e misurazione in tempo reale della variazione della frequenza di oscillazione effettiva dell'elemento sensibile; h) Anchoring of the weighted antigens to the monoclonal antibodies and real-time measurement of the variation of the effective oscillation frequency of the sensitive element;
i) Elaborazione dei dati su PC. i) Data processing on PC.
Il metodo, secondo il trovato, attraverso tali fasi (a), (b), (c), consente la raccolta del campione da analizzare direttamente in fase gassosa, con condensazione attraverso un appropriato elemento, quale, ma non solo, trappola raffreddata a ghiaccio, per la raccolta delle specie condensate, e filtraggio con filtro, quale ma non solo filtro in Teflon, per la raccolta delle particelle di fuliggine. The method according to the invention , through these steps (a), (b), (c), allows the collection of the sample to be analyzed directly in the gaseous phase, with condensation through a suitable element, such as, but not limited to, a trap cooled to ice, for the collection of the condensed species, and filtering with a filter, such as but not limited to a Teflon filter, for the collection of the soot particles.
Il metodo, secondo il trovato, prevede l?utilizzo di un solvente organico volatile, quale ma non solo il diclorometano, per sciogliere il campione di idrocarburi dopo la condensazione e la filtrazione. Viene quindi consentita la rapida volatilizzazione del solvente organico volatile, seguita da una dissoluzione preliminare dell'analita nel metanolo e poi da una diluizione nell'acqua. Questa procedura consente il campionamento degli inquinanti nel solvente organico e il successivo passaggio ad un solvente costituito da acqua o solventi solubili in acqua. The method according to the invention provides for the use of a volatile organic solvent, such as but not only dichloromethane, to dissolve the hydrocarbon sample after condensation and filtration. Rapid volatilization of the volatile organic solvent is then allowed, followed by a preliminary dissolution of the analyte in methanol and then a dilution in water. This procedure allows for the sampling of pollutants in the organic solvent and the subsequent passage to a solvent consisting of water or water soluble solvents.
Il metodo, secondo il trovato, prevede, con le fasi (d) (e), la dissoluzione del campione in un solvente costituito da un'appropriata miscela di etanolo e acqua (20-80%). Questa soluzione consente di creare un ambiente compatibile per il funzionamento dell?immunosensore, che necessita di soluzioni acquose, e di garantire una sufficiente solubilit? degli IPA, i quali, invece, sono scarsamente solubili in acqua. The method according to the invention provides, with steps (d) (e), for dissolving the sample in a solvent consisting of an appropriate mixture of ethanol and water (20-80%). This solution makes it possible to create a compatible environment for the functioning of the immunosensor, which requires aqueous solutions, and to ensure sufficient solubility in the immunosensor. of PAHs, which, on the other hand, are poorly soluble in water.
Il metodo, secondo il trovato, prevede l?impiego di un dispositivo il cui funzionamento si basa sull?uso di anticorpi specifici per la rivelazione e la misura di specifici IPA, quale ma non solo il Benzo[a]pirene. La fase (f), secondo il trovato consente la funzionalizzazione dell?elemento sensibile del dispositivo di tipo immunosensore. La funzionalizzazione si basa su una metodologia di deposizione di anticorpi monoclonali, come ma non solo Photonic Immobilization Technique (PIT), che avviene una tantum a monte del processo di misura. Essa ? realizzata mediante una sorgente di luce impulsata, quali ma non solo lampade impulsate UV e/o laser ultravioletti, e serve a consentire la deposizione sull?elemento sensibile del dispositivo di anticorpi monoclonali specifici, con orientamento preferenziale e non casualmente come per un tipico processo di adsorbimento, in grado di individuare l?antigene oggetto della ricerca. La fase di irradiazione avviene a monte della fase di deposizione. The method according to the invention provides for the use of a device whose operation is based on the use of specific antibodies for the detection and measurement of specific PAHs, such as but not only benzo[a]pyrene. Step (f), according to the invention allows the sensitive element of the device of the immunosensor type to be functionalised. The functionalization is based on a monoclonal antibody deposition methodology, such as but not limited to the Photonic Immobilization Technique (PIT), which takes place once upstream of the measurement process. It ? made by means of a pulsed light source, such as but not only pulsed UV lamps and/or ultraviolet lasers, and serves to allow specific monoclonal antibodies to be deposited on the sensitive element of the device, with a preferential orientation and not randomly as for a typical adsorption, capable of identifying the antigen being searched for. The irradiation phase takes place upstream of the deposition phase.
Il metodo, secondo il trovato, consente con la fase (g) di migliorare la sensibilit? dell?elemento sensibile del dispositivo di tipo immunosensore per il rilevamento e la misurazione della massa degli specifici IPA, quale ma non solo il Benzo[a]pirene. Si ricorre ad un protocollo di appesantimento tipo sandwich legando anticorpi policlonali con gli specifici IPA, come ma non solo quello utilizzato nel Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (saggio ELISA). The method according to the invention allows with step (g) to improve the sensitivity? of the sensing element of the immunosensor-type device for the detection and mass measurement of specific PAHs, such as but not limited to Benzo[a]pyrene. A sandwich-type weighting protocol is used by binding polyclonal antibodies with specific PAHs, such as but not only the one used in the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA assay).
Il metodo, secondo il trovato, consente con la fasi (h), (i) di rilevare e misurare gli specifici IPA. I dati misurati in tempo reale sono la frequenza di oscillazione effettiva dell'elemento sensibile. Questi dati vengono elaborati, attraverso lo strumento di misura del peso, valutando la variazione della frequenza di oscillazione dell'elettrodo dovuta all'aumento della massa dell'elemento sensibile durante l?accoppiamento degli appesantiti IPA agli anticorpi monoclonali. Maggiore ? la massa complessiva, minore ? la frequenza di vibrazione finale. The method according to the invention allows with steps (h), (i) to detect and measure the specific PAHs. The data measured in real time is the effective oscillation frequency of the sensing element. These data are processed, through the weight measuring instrument, by evaluating the variation of the oscillation frequency of the electrode due to the increase in the mass of the sensitive element during the coupling of the weighed down PAHs to the monoclonal antibodies. Greater ? the total mass, less? the final vibration frequency.
Calibrando preventivamente la risposta in frequenza del dispositivo con quella di IPA noti, ? possibile valutare quantitativamente la massa degli IPA catturati dall?elemento sensibile. Quindi ? possibile stimare la massa dell'antigene sottraendo la massa dell'anticorpo policlonale nota da quella catturata. By previously calibrating the frequency response of the device with that of known PAHs, ? It is possible to quantitatively evaluate the mass of PAHs captured by the sensitive element. So ? It is possible to estimate the mass of the antigen by subtracting the known polyclonal antibody mass from that captured.
Il metodo, secondo il trovato, prevede l?utilizzo di anticorpi monoclonali e policlonali per la loro specificit? rispetto agli IPA e per la loro elevata massa. The method according to the invention provides for the use of monoclonal and polyclonal antibodies due to their specificity. compared to IPAs and due to their high mass.
Il metodo, secondo il trovato, si avvale di anticorpi monoclonali, con funzione di riconoscimento immunitario e cattura degli IPA, e anticorpi policlonali, con funzione di appesantimento di tipo sandwich degli IPA. La funzionalizzazione dell?elemento sensibile con anticorpi monoclonali e l?appesantimento di tipo sandwich degli IPA con anticorpi policlonali avvengono a monte della fase di rilevamento e misura. Questo tipo di protocollo raggiunge il miglior compromesso tra specificit?, che preferisce l'uso di anticorpi monoclonali nella fase di cattura, e l'efficienza, per la quale ? richiesto l'uso di anticorpi policlonali nella fase di appesantimento. In linea di principio, avremmo potuto invertire l?utilizzo degli anticorpi monoclonali e policlonali. Ci? avrebbe condotto a (1) minore efficienza nell?appesantimento, perch? gli anticorpi monoclonali riconoscono una singola regione molecolare dell'antigene (epitopo) piuttosto che molte regioni diverse come il policlonale e (2) minore specificit? nella catturare selettiva degli antigeni, perch? gli anticorpi policlonali, riconoscendo pi? di una regione molecolare dell'antigene (epitopo), hanno sempre maggiori probabilit? di commettere un errore nel riconoscimento molecolare rispetto agli anticorpi monoclonali, catturando altri analiti, non in esame, che espongono lo stesso dominio molecolare dell'antigene oggetto di analisi. Questa parte del metodo, vale a dire l'uso appropriato del doppio tipo di anticorpi ? completamente nuovo e innovativo. The method according to the invention makes use of monoclonal antibodies, with the function of immune recognition and capture of the PAHs, and polyclonal antibodies, with the function of sandwich-type weighting of the PAHs. The functionalization of the sensitive element with monoclonal antibodies and the sandwich-type weighting of the PAHs with polyclonal antibodies occur upstream of the detection and measurement phase. This type of protocol achieves the best compromise between specificity, which prefers the use of monoclonal antibodies in the capture phase, and efficiency, for which it is required the use of polyclonal antibodies in the weighting phase. In principle, we could have reversed the use of monoclonal and polyclonal antibodies. There? would have led to (1) less efficiency in the weighting, why? monoclonal antibodies recognize a single molecular region of the antigen (epitope) rather than many different regions such as polyclonal and (2) lower specificity? in the selective capture of antigens, why? polyclonal antibodies, recognizing pi? of a molecular region of the antigen (epitope), are always more likely? to make a mistake in molecular recognition compared to monoclonal antibodies, capturing other analytes, not under test, which expose the same molecular domain of the antigen under analysis. This part of the method, namely the appropriate use of the dual type of antibodies ? completely new and innovative.
Il metodo ? quindi reso altamente sensibile dall?uso di anticorpi policlonali e altamente specifico grazie all'uso di anticorpi monoclonali. The method ? therefore made highly sensitive by the use of polyclonal antibodies and highly specific by the use of monoclonal antibodies.
Il metodo secondo il trovato rileva e misura l?antigene, che pu? essere un qualsiasi IPA, quale ma non solo il Benzo[a]pirene, ed ? facilmente estendibile per la rilevazione e la misura di un qualsiasi altro inquinante per il quale ? identificabile un anticorpo, o qualsiasi altra molecola con funzione di riconoscimento molecolare e cattura, quali ma non solo i MIP (Polimeri a Impronta Molecolare). The method according to the invention detects and measures the antigen, which can be any IPA, such as but not only Benzo[a]pyrene, and ? easily extendable for the detection and measurement of any other pollutant for which ? an identifiable antibody, or any other molecule with a molecular recognition and capture function, such as but not limited to MIPs (Polymers with Molecular Fingerprint).
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI ILLUSTRATION OF THE DESIGNS
Attraverso la descrizione di una forma preferenziale di realizzazione di tale trovato saranno pi? chiare queste ed altre caratteristiche dello stesso. Tale forma del trovato ? fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, nell?annesso disegno in cui: Through the description of a preferential embodiment of this invention will be more? clear these and other characteristics of the same. This form of the invention ? provided by way of non-limiting example in the attached drawing in which:
La Fig. illustra una schematizzazione di un dispositivo secondo il trovato. Fig. shows a schematic view of a device according to the invention.
DESCRIZIONE DI UNA FORMA PREFERENZIALE DEL TROVATO DESCRIPTION OF A PREFERRED FORM OF THE INVENTION
Una forma preferenziale del presente ? associata ad una sua possibile applicazione, ovvero la rilevazione e la misura, secondo il metodo proposto nell?invenzione, di B(a)p presenti nei gas esausti di un motore a combustione interna per veicoli, direttamente dalla fase gassosa attraverso il dispositivo di tipo immunosensore. A preferential form of the present? associated with a possible application thereof, i.e. the detection and measurement, according to the method proposed in the invention, of B(a)p present in the exhaust gases of an internal combustion engine for vehicles, directly from the gaseous phase through the device of the type immunosensor.
Infatti, una delle principali fonti di emissione di B(a)p, soprattutto nelle aree urbane, ? rappresentata dallo scarico dei veicoli. I produttori di veicoli sono tenuti ad equipaggiare i loro prodotti con sofisticati convertitori catalitici per limitare le emissioni di inquinanti. La realizzazione di convertitori catalitici sempre pi? sicuri con le massime prestazioni possibili per il pi? lungo tempo possibile ? tra gli obiettivi delle aziende automobilistiche e della ricerca in generale. Tipicamente, le aziende automobilistiche non monitorano l'emissione di singole specie di IPA, ma adottano solo una misurazione integrata dell'intera produzione di IPA. Si pone, quindi, la necessit? di implementare una tecnologia innovativa per misurare facilmente e in tempo reale l'emissione della specifica specie di IPA. In fact, one of the main sources of B(a)p emissions, especially in urban areas, is represented by vehicle exhaust. Vehicle manufacturers are required to equip their products with sophisticated catalytic converters to limit pollutant emissions. The construction of catalytic converters increasingly? safe with the maximum possible performance for the pi? long time possible? between the objectives of the automotive companies and of research in general. Typically, automotive companies do not monitor the emission of individual PAH species, but only adopt an integrated measurement of the entire PAH production. Therefore, does the need arise? to implement an innovative technology to easily measure the emission of the specific PAH species in real time.
Il metodo, secondo il trovato, consente l?utilizzo del dispositivo di tipo immunosensore per il monitoraggio delle prestazioni dei convertitori catalitici misurando il B(a)P ed eventualmente la presenza di altri IPA prima e dopo i convertitori. The method according to the invention allows the use of the device of the immunosensor type for monitoring the performance of the catalytic converters by measuring the B(a)P and possibly the presence of other PAHs before and after the converters.
In tale applicazione si prevede la raccolta del campione da analizzare dai gasi di scarico dei veicoli in fase gassosa, direttamente in un contesto reale, e non in laboratorio. La linea di campionamento ? costituita da una trappola raffreddata al ghiaccio per raccogliere le specie condensate e un filtro in teflon per raccogliere le particelle di fuliggine. This application provides for the collection of the sample to be analyzed from vehicle exhaust gases in the gaseous phase, directly in a real context, and not in the laboratory. The sampling line? consisting of an ice-cooled trap to collect the condensed species and a Teflon filter to collect the soot particles.
Il metodo, secondo il trovato, prevede l?utilizzo di un solvente organico volatile, quale ma non solo il diclorometano, per sciogliere il campione di idrocarburi dopo la condensazione e la filtrazione. Viene quindi consentita la rapida volatilizzazione del solvente organico volatile, seguita da una dissoluzione preliminare dell'analita nel metanolo e poi da una diluizione nell'acqua. Questa procedura consente il campionamento degli inquinanti nel solvente organico e il successivo passaggio ad un solvente costituito da acqua o solventi solubili in acqua. The method according to the invention provides for the use of a volatile organic solvent, such as but not only dichloromethane, to dissolve the hydrocarbon sample after condensation and filtration. Rapid volatilization of the volatile organic solvent is then allowed, followed by a preliminary dissolution of the analyte in methanol and then a dilution in water. This procedure allows for the sampling of pollutants in the organic solvent and the subsequent passage to a solvent consisting of water or water soluble solvents.
Con riferimento alla Figura, il campione, una volta disciolto in soluzione di etanolo e acqua, contenuto in una cuvette 1, ? pronto per l?analisi mirata alla rivelazione e misurazione di B(a)p contenute attraverso il dispositivo di tipo immunosensore. With reference to the Figure, the sample, once dissolved in a solution of ethanol and water, contained in a cuvette 1, ? ready for the analysis aimed at the detection and measurement of B(a)p contained through the immunosensor type device.
Tale sensore comprende un dispositivo per la produzione di luce impulsata 8 atta alla funzionalizzazione, mediante metodologia PIT, degli anticorpi monoclonali anti-B(A)p presenti in una cuvette 1, un circuito fluidico 7 con pompa peristaltica 3, un elemento sensibile, elettrodo 4, inserito nella microbilancia a cristallo di quarzo 5, un PC con software per la lettura/analisi in tempo reale 6. This sensor comprises a device for the production of pulsed light 8 suitable for the functionalisation, by PIT methodology, of the anti-B(A)p monoclonal antibodies present in a cuvette 1, a fluidic circuit 7 with peristaltic pump 3, a sensitive element, electrode 4, inserted in the quartz crystal microbalance 5, a PC with real-time reading/analysis software 6.
Il campione ? prelevato tramite variazione di pressione, indotta nel circuito dalla pompa peristaltica 3, mediante luce impulsata, quale ad esempio quella prodotta mediante lampade UV o laser ultravioletti 2, si ottiene la funzionalizzazione degli anticorpi monoclonali presenti in una cuvette che successivamente vanno ad ancorarsi all?elettrodo 4 della bilancia a microcristalli di quarzo 5. The sample ? taken by pressure variation, induced in the circuit by the peristaltic pump 3, by means of pulsed light, such as for example that produced by UV lamps or ultraviolet lasers 2, the functionalisation of the monoclonal antibodies present in a cuvette is obtained which subsequently anchor to the electrode 4 of the quartz microcrystal balance 5.
I B(a)p vengono appesantiti con anticorpi policlonali secondo un protocollo di tipo sandwich, come ma non solo quello utilizzato nel Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). The B(a)p are weighted with polyclonal antibodies according to a sandwich-type protocol, such as but not limited to that used in the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).
La bilancia a microcristalli di quarzo 5 rileva la variazione di frequenza dell?elemento sensibile dovuta all'aumento della massa durante la cattura con anticorpi monoclonali dei B(a)p appesantiti con anticorpi policlonali. The quartz microcrystal balance 5 detects the frequency variation of the sensitive element due to the increase in mass during the capture with monoclonal antibodies of the B(a)p weighted with polyclonal antibodies.
Successivamente la bilancia a microcristalli di quarzo invia il segnale digitale al sistema di lettura informatico 6 che ne evidenzia il salto in frequenza. Subsequently, the quartz microcrystal scale sends the digital signal to the computer reading system 6 which highlights the jump in frequency.
Un ulteriore forma preferenziale del trovato consiste nell?impiegare il metodo per il monitoraggio dell'inquinamento delle acque marine costiere da IPA. Si tratta di un tema di grande interesse attuale e di enorme impatto per l'influenza di queste sostanze tossiche sulla salute umana, sia per contatto diretto con l'acqua che per contatto indiretto attraverso il consumo di pesce e crostacei. Questi problemi sono ancora pi? cruciali in aree con massiccia presenza di impianti industriali (per esempio metallurgici). Quest'ultima applicazione ? particolarmente adatta per il metodo secondo il trovato in quanto il dispositivo di tipo immunosensore funziona naturalmente in una matrice liquida a base acquosa, l'acqua marina ? una di queste matrici e il monitoraggio di vaste aree costiere richiede la risposta online di piccoli dispositivi portatili come quello che il metodo prevede di utilizzare. A further preferential embodiment of the invention consists in using the method for monitoring the pollution of coastal marine waters by PAHs. This is a subject of great current interest and of enormous impact due to the influence of these toxic substances on human health, both through direct contact with water and through indirect contact through the consumption of fish and shellfish. These problems are even more crucial in areas with a massive presence of industrial plants (for example metallurgical). The latter application? particularly suitable for the method according to the invention since the immunosensor-type device works naturally in an aqueous-based liquid matrix, sea water? one of these arrays and monitoring large coastal areas requires online response of small portable devices such as what the method plans to use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| IT102021000002717A IT202100002717A1 (en) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | METHOD FOR THE DETECTION AND MEASUREMENT OF SPECIFIC ANTIGENS |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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| IT102021000002717A IT202100002717A1 (en) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | METHOD FOR THE DETECTION AND MEASUREMENT OF SPECIFIC ANTIGENS |
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