IT202000012259A1 - Nuova terapia per il trattamento di malattie vascolari fibroproliferative - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo:
?Nuova terapia per il trattamento di malattie vascolari fibroproliferative?
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell?invenzione
La presente descrizione riguarda una nuova strategia per il trattamento terapeutico di malattie vascolari fibroproliferative.
Tecnica di sfondo
Le malattie cardiovascolari rappresentano una parte significativa della morbilit? e della mortalit? in tutto il mondo. Queste patologie spesso derivano da una disfunzione e una occlusione a livello vascolare, che si verificano anche dopo strategie di intervento utilizzate nel trattamento dell?aterosclerosi. Ad esempio, l?iperplasia intimale (IH) consegue dallo sviluppo di placche aterosclerotiche ma anche da un?angioplastica transluminale e il posizionamento di uno stent, un trattamento standard dell?aterosclerosi. L?IH consiste in una complessa risposta multifattoriale della parete del vaso con conseguente formazione di uno strato multicellulare all?interno del lume arterioso. Questo comporta fenomeni infiammatori e fibroproliferativi dovuti a un danneggiamento endoteliale e conseguente dedifferenziazione delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), il che porta alla loro sovra-proliferazione e migrazione. Complessivamente, questi processi si concludono con un ispessimento intimale e una riduzione del flusso sanguigno, il che pu? avere conseguenze drammatiche. Pertanto, comprendere i meccanismi della proliferazione delle VSMC ? fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per prevenire l?IH [1, 2].
Tra le molecole di segnalazione coinvolte nella proliferazione delle VSMC, il secondo messaggero adenosin-3?,5?-monofosfato ciclico (cAMP) svolge un ruolo fondamentale. Nelle VSMC, livelli elevati di cAMP inibiscono la proliferazione stimolata da mitogeno sia in vitro che in vivo [3-6]. Coerentemente, ? stato scoperto che cAMP ha un ruolo positivo nel ridurre l?ispessimento intimale in diversi modelli di danneggiamento vascolare. Inoltre, la segnalazione di cAMP ? influenzata in una grande variet? di patologie vascolari tra cui l?aterosclerosi o la restenosi dopo l?angioplastica. I segnali di cAMP dipendono principalmente dalla sua produzione localizzata da parte della adenilil-ciclasi (AC) e dalla sua degradazione da parte delle fosfodiesterasi nucleotide ciclico (PDE) [7]. Nelle VSMC, PDE3A, PDE4 e PDE1C sono state implicate nella regolazione della proliferazione di VSMC e nell?IH [3, 8, 9]. ? interessante notare che ? stato dimostrato che la produzione di cAMP ? collegata a un aumento dell?attivit? di PDE4 e all?espressione sovraregolata dell?isoforma PDE4D nei fenotipi sia contrattile che sintetico [10]. Coerentemente, numerosi studi sono stati condotti utilizzando inibitori di PDE in vari modelli di malattie arteriose [3].
In questo contesto, ? stato descritto che la fosfoinositide 3-chinasi gamma (PI3K?), una chinasi lipidica coinvolta nella regolazione immunitaria di malattie cardiovascolari, regola i livelli di cAMP nei cardiomiociti attraverso un meccanismo chinasi-indipendente. Mentre, da un lato, PI3K? pu? generare secondi messaggeri lipidici 3-fosfoinositidi come chinasi, dall?altro, pu? agire come ?proteina di ancoraggio di A-chinasi? (AKAP) associandosi, all?interno dello stesso complesso macromolecolare, con chinasi cAMP-dipendente, nota anche come proteina chinasi A (PKA), e fosfodiesterasi 3 e 4 (PDE3 e PDE4), enzimi controllati da PKA responsabili della degradazione di cAMP. In linea con questa visione, la subunit? catalitica dell?oloenzima PI3K? (p110?) interagisce con PKA e partecipa ad un feedback loop negativo, portando all?attivazione di PDE3 e PDE4 e infine ad un aumento della degradazione di cAMP.
Nelle cellule cardiache, PI3K? contiene l?aumento di cAMP in risposta alla stimolazione beta-adrenergica, riducendo in definitiva la contrattilit? cardiaca [11]. Al contrario, la regolazione mediata da PI3K? dei livelli di cAMP nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree promuove la contrazione, con conseguente broncocostrizione. Di conseguenza, l?inibizione della funzione chinasiindipendente di PI3K? nei muscoli lisci delle vie aeree con un peptide competitivo che permea attraverso le cellule promuove il broncorilassamento [12].
Sintesi dell?invenzione
Lo scopo della presente descrizione ? quello di fornire una nuova strategia per il/la trattamento/prevenzione/ritardo dell?insorgenza di malattie vascolari fibroproliferative.
Secondo l?invenzione, lo scopo di cui sopra ? raggiunto grazie all?oggetto richiamato specificamente nelle rivendicazioni che seguono, che sono intese come parte integrante della presente descrizione.
La presente invenzione riguarda un peptide di fusione e una composizione farmaceutica contenente un peptide di fusione per l?uso nel trattare, prevenire e/o ritardare l?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa, in cui il peptide di fusione comprende:
(a) una sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o un omologo correlato avente almeno l?85%, preferibilmente almeno il 90%, pi? preferibilmente almeno il 95% di similarit? con SEQ ID No.: 1 e avente la capacit? della sequenza SEQ ID No.: 1 di inibire la funzione chinasiindipendente di PI3K?, e
(b) un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula.
Il rimodellamento arterioso riscontrato nell?ipertensione e nell?iperplasia intimale comporta infiammazione e flusso alterato, che contribuiscono entrambi alla de-differenziazione e alla proliferazione delle cellule muscolari lisce. Nella presente domanda, gli inventori hanno identificato per la prima volta un ruolo chiave chinasiindipendente della fosfoinositide 3-chinasi gamma (PI3K?) non-ematopoietica nella parete vascolare durante l?iperplasia intimale usando modelli murini con delezione di PI3K? o esprimenti una versione chinasi-inattiva dell?enzima. Inoltre, gli inventori hanno scoperto che l?assenza di PI3K? in VSMC porta a una modulazione della proliferazione cellulare legata ad un aumento dei livelli di cAMP intracellulare. L?analisi in tempo reale della dinamica di cAMP rivela che PI3K? modula la degradazione di cAMP indipendentemente dalla sua attivit? di chinasi in VSMC primarie attraverso la regolazione degli enzimi fosfodiesterasi (PDE) 4. La presente invenzione riguarda quindi l?applicazione terapeutica del peptide competitivo Nterminale di PI3K? (avente la sequenza amminoacidica indicata in SEQ ID No.: 1) o un omologo corrispondente che ? in grado di bloccare la proliferazione di VSMC primarie. Questi dati forniscono prove del ruolo chinasi-indipendente di PI3K? nel rimodellamento arterioso e rivelano nuove strategie mirate alla funzione di ancoraggio di PI3K? per il/la trattamento/prevenzione/ritardo dell?insorgenza di malattie vascolari fibroproliferative.
Breve descrizione dei disegni
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio, a puro titolo di esempio illustrativo e non limitativo e, con riferimento ai disegni allegati, in cui:
- Figura 1: PI3K? controlla l?IH e la proliferazione di VSMC
A. Sezioni trasversali rappresentative di arterie femorali danneggiate colorate con colorazione Tricromica di Masson dalle chimere ematopoietiche indicate. Barre di scala = 100 ?M. Topi riceventi WT, PI3K? KD (KD) e PI3K? KO irradiati hanno subito il trapianto di midollo osseo dai donatori indicati per ottenere le chimere indicate. Topi WT irradiati hanno subito il trapianto di midollo osseo da WT, PI3K? KD o PI3K? KO per ottenere le seguenti chimere ematopoietiche: WT>WT, KD>WT e KO>WT. Topi riceventi KD irradiati hanno subito il trapianto di midollo osseo da topi donatori WT o PI3K? KD (WT>KD; KD>KD). Topi KO riceventi irradiati hanno subito il trapianto di midollo osseo da donatori WT o KO (WT>KO e KO>KO). B. Analisi quantitativa dei rapporti intima/media delle chimere ematopoietiche indicate. L?istogramma rappresenta il rapporto neointima/media per ciascuna chimera (n > 6 topi per ciascun gruppo). I dati sono presentati come media ? SEM e sono stati confrontati utilizzando un test ANOVA a criterio singolo. C.
Rappresentazione schematica del modello sperimentale utilizzato per studiare l?implicazione di PI3K? nel controllo della proliferazione di SMC. D. Western blot dell?espressione di PI3K? in ciascun genotipo. E. Tasso di proliferazione misurato mediante incorporazione di BrdU ed espresso come coefficiente di aumento rispetto al controllo di VSMC primarie da aorta WT, PI3K? KO o PI3K? KD incubata 24 h con mezzo bloccante o trattata con 25 ng/ml di PDGF, con o senza aggiunta di forskolina 25 ?M. (5<n<12 colture per ciascun genotipo). I dati sono presentati come media ? SEM e sono stati confrontati utilizzando un test ANOVA a criterio singolo.
- Figura 2: PI3K? controlla la dinamica del cAMP indipendentemente dalla sua attivit? di chinasi in VSMC A. Riquadro a sinistra: Variazioni medie della concentrazione di cAMP intracellulare ([cAMP]i) in VSMC primarie da topi WT (in alto), PI3K? KO (al centro) e PI3K?-KD (in basso) ed esprimenti il biosensore <T>Epac<VV>. La linea nera rappresenta il rapporto medio di emissione F480/F535 nel tempo in risposta a stimolazione con forskolina (fsk) 2,5 ?M e trattamento con fsk (2,5 ?M) IBMX (200 ?M). B.
Istogrammi che rappresentano i valori medi per le risposte alla forskolina. I risultati sono espressi come percentuale della variazione massima del rapporto (% di Rmax (risposta IBMX)) determinata dall?applicazione finale di forskolina (2,5 ?M) IBMX (200 ?M). I dati mostrati sono le medie ? SEM. (n = 5 topi). I dati sono presentati come media ? SEM e sono stati confrontati usando un test di Kruskal-Wallis.
C. Dosaggio della fluorescenza omogenea risolta nel tempo (HTRF) di cAMP intracellulare da VSMC primarie WT, PI3K? KO o PI3K? KD dopo 30 min di trattamento con veicolo o Forskolina 0,5 ?M.
- Figura 3: PI3K? controlla i livelli di cAMP attraverso PDE4 in VSMC
A. Variazioni medie di [cAMP]i in VSMC primarie da topi WT (in alto), PI3K? KO (al centro) e PI3K?-KD (in basso) ed esprimenti il biosensore <T>Epac<VV>. La traccia indica il rapporto medio di emissione F480/F535 nel tempo in risposta a trattamento con forskolina 2,5 ?M, cilostamide (1 ?M), rolipram (1 ?M) e forskolina (2,5 ?M) IBMX (200 ?M). B.
Istogrammi che rappresentano i valori medi per le risposte a rolipram e cilostamide. I risultati sono espressi come percentuale della variazione massima del rapporto (% di Rmax (risposta IBMX)) determinata dall?applicazione finale di forskolina (2,5 ?M) IBMX (200 ?M). I dati sono presentati come media ? SEM (n > 22 con 4 topi diversi) e sono stati confrontati usando un test di Kruskal-Wallis. C. Attivit? di fosfodiesterasi rilevata negli immunoprecipitati di PDE4D da VSMC primarie. I dati mostrati sono le medie ? SEM e sono stati confrontati usando ANOVA a criterio singolo seguito dal test post-hoc di Bonferroni (n = 3). D. Western blot rappresentativo di immunoprecipitati di PDE4D.
- Figura 4: Un peptide N-terminale permeante di PI3K? interferisce selettivamente con l?attivit? di ancoraggio di PI3K?
A. Rappresentazione schematica del peptide competitivo di PI3K? che permea attraverso le cellule. La regione 126-150 di PI3K? ? stata fusa con il peptide Penetratina 1 (P1) che penetra attraverso le cellule. Un peptide di controllo ? stato generato mediante inserimento di due mutazioni puntiformi (K>A e R>A rispettivamente nelle posizioni 1 e 5 della sequenza di PI3K?). B. Macrofagi RAW sono stati pretrattati con veicolo, il peptide PI3K? (10 ?M) o l?inibitore della chinasi PI3K? AS605240 (1 ?M) per 1 ora e quindi con C5a (50 ?M) per 5 minuti. Sono mostrate immagini di Western blot rappresentative di fosfo-AKT (Ser-473) e AKT totale (a sinistra) e quantificazione del rapporto (a destra). GAPDH ? stata usata come controllo di caricamento. N=3. C. Incorporazione da parte delle VSMC primarie di un peptide PI3K? marcato con FITC a 1 h, 5 h, 24 h e 30 h dopo l?incubazione. D. Quantificazione dell?intensit? di fluorescenza associata a FITC all?interno dell?area delle VSMC.
- Figura 5: Un peptide N-terminale permeante di PI3K? riduce la proliferazione di VSMC
A, B, C. Tasso di proliferazione misurato mediante incorporazione di BrdU ed espresso come coefficiente di aumento rispetto al controllo di VSMC primarie da aorta WT (A), PI3K? KD (B) o PI3K? KO (C) incubata per 24 h con 25 ng/ml di PDGF con o senza aggiunta di forskolina 25 ?M, in presenza di 25 ?M di controllo (barre bianche) o peptide bloccante (barre nere). BrdU ? stato aggiunto durante le ultime 18 h (n = 8 colture per ciascun genotipo). I dati sono presentati come media ? SEM e sono stati confrontati utilizzando un test ANOVA a criterio singolo. D. Modello schematico dell?implicazione di PI3K? nella proliferazione di VSMC. La proliferazione di VSMC ? indotta dalla stimolazione da parte del PDGF. I precedenti risultati degli Inventori, rappresentati in grigio, dimostrano che la secrezione autocrina di MCP1 recluta e attiva PI3K? attraverso la segnalazione di GPCR per controllare la migrazione cellulare dopo la stimolazione da parte del PDGF [13]. Questo reclutamento di PI3K? potrebbe anche concentrare le fosfodiesterasi (PDE) che controbilanciano la produzione di cAMP da parte dell?adenilato ciclasi (AC) indotta da altri segnali. Con questi meccanismi, PI3K? agisce come un amplificatore della transizione sintetica delle VSMC.
- Figura 6: Sequenze amminoacidiche di peptidi che hanno la capacit? di penetrare in una membrana cellulare.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Nella descrizione che segue, vengono forniti numerosi dettagli specifici per permettere una comprensione approfondita delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o pi? dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a ?una sola forma di realizzazione? o ?una forma di realizzazione? indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in connessione con la forma di realizzazione ? incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni ?in una sola forma di realizzazione? o ?in una forma di realizzazione? in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati in qualsiasi modo adatto in una o pi? forme di realizzazione.
Le intestazioni qui fornite servono solo per comodit? e non interpretano l?ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un peptide di fusione per l?uso nel trattare, prevenire e/o ritardare l?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa, in cui il peptide di fusione comprende:
a) una sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID n. 1 o un omologo correlato avente almeno l?85%, preferibilmente almeno il 90%, pi? preferibilmente almeno il 95% di similarit? (preferibilmente identit?) con SEQ ID No.: 1 e avente la capacit? della sequenza SEQ ID No.: 1 di inibire la funzione chinasi-indipendente di PI3K?, e (b) un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula.
In un?ulteriore forma di realizzazione, il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula ? selezionato tra le sequenze specificate in SEQ ID No.: 2 a 12, preferibilmente SEQ ID No.: 2 a 5, pi? preferibilmente SEQ ID No.: 2.
In una forma di realizzazione, il peptide di fusione pu? comprendere un linker, preferibilmente un linker di amminoacidi, che consente il legame della sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o un suo omologo con il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula. La presenza del linker non ? tuttavia obbligatoria.
In ancora un?ulteriore forma di realizzazione, il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula ? legato al terminale carbossilico o al terminale amminico di SEQ ID No.: 1 o suoi omologhi.
In un?ulteriore forma di realizzazione, il peptide di fusione ha una sequenza amminoacidica come indicata in SEQ ID No.: 14.
In un?ulteriore forma di realizzazione, il peptide di fusione come sopra definito ? adatto per il/la trattamento/prevenzione/ritardo dell?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa selezionata tra restenosi, ipertensione, ipertensione polmonare, preferibilmente ipertensione arteriosa polmonare, aterosclerosi e rottura delle placche a causa dell?ispessimento intimale.
In una diversa forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica per l?uso nel trattare, prevenire e/o ritardare l?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa contenente un peptide di fusione e un veicolo farmaceuticamente accettabile, in cui il peptide di fusione comprende (a) una sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o un omologo correlato avente almeno l?85%, preferibilmente almeno il 90%, pi? preferibilmente almeno il 95% di similarit? (preferibilmente identit?) con SEQ ID No.: 1 e avente la capacit? della sequenza SEQ ID No.: 1 di inibire la funzione chinasi-indipendente di PI3K? e (b) un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula.
In una forma di realizzazione, il peptide di fusione contenuto nella composizione farmaceutica comprende un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula, selezionato tra le sequenze specificate in SEQ ID No. 2 a 12, preferibilmente SEQ ID No.: 2 a 5, pi? preferibilmente SEQ ID No.: 2.
In una forma di realizzazione, il peptide di fusione contenuto nella composizione farmaceutica comprende un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula, in cui tale peptide ? legato al terminale carbossilico o al terminale amminico di SEQ ID No.: 1 o suoi omologhi.
In una forma di realizzazione, il peptide di fusione contenuto nella composizione farmaceutica pu? comprendere un linker, preferibilmente un linker di amminoacidi, che consente il legame della sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o suo omologo con il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula. La presenza del linker non ? tuttavia obbligatoria.
In un?ulteriore forma di realizzazione, la composizione farmaceutica comprende un peptide di fusione avente una sequenza amminoacidica come indicata in SEQ ID No.: 14.
In una forma di realizzazione, la composizione farmaceutica ? adatta per il/la trattamento/prevenzione/ritardo dell?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa selezionata tra restenosi, ipertensione, ipertensione polmonare, preferibilmente ipertensione arteriosa polmonare, aterosclerosi e rottura delle placche a causa dell?ispessimento intimale.
La presente invenzione descrive anche un procedimento per trattare/prevenire/ritardare l?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa comprendente la somministrazione a un paziente che ne necessita di almeno un peptide di fusione in una quantit? sufficiente per eseguire detto trattamento, in cui il peptide di fusione comprende:
a) la sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o un omologo correlato avente almeno l?85% di similarit? con SEQ ID No.: 1 e avente la capacit? della sequenza SEQ ID No.: 1 di inibire la funzione chinasiindipendente di PI3K?, e
b) un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula.
In varie malattie come l?aterosclerosi [14] e l?ipertensione arteriosa polmonare [15, 16], le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) intimali proliferano in modo anomalo, provocando infine l?iperplasia intimale (IH) che porta all?occlusione dei vasi. L?angioplastica e l?impianto di stent metallici aprono i vasi ristretti da tale sovracrescita di VSMC, ma questo trattamento fallisce se le VSMC continuano ad espandersi e a provocare la restenosi. Allo stesso modo, gli innesti di by-pass venoso hanno spesso esito negativo a causa della crescita di VSMC in un nuovo strato intimale occlusivo. Pertanto, la riduzione farmacologica della proliferazione di VSMC ? di fondamentale importanza nel trattamento dell?occlusione vascolare dovuta a IH.
Un grande corpo di letteratura suggerisce che l?aumento intracellulare della molecola di segnalazione cAMP svolge un ruolo importante sia nel mantenimento della quiescenza di VSMC in vasi sani sia nella riduzione della restenosi nei distretti vascolari malati [6]. Gli inibitori a molecola piccola di fosfodiesterasi (PDE), gli enzimi che idrolizzano il cAMP, hanno un effetto antiproliferativo su VSMC e farmaci come il cilostazolo possono avere un potenziale per l?uso terapeutico clinico per la prevenzione della restenosi in seguito a un intervento su arterie [17]. La difficolt? di limitare l?esposizione sistemica a tali farmaci, che porta infine a effetti collaterali indesiderati, come l?aritmia cardiaca, ha impedito l?adozione su larga scala di tali interventi. Inoltre, le PDE sono una grande famiglia di isoenzimi, classificati in 11 gruppi [6], e la mancanza di inibitori di PDE isoforma-selettivi, specialmente all?interno dei membri della stessa famiglia, ha ulteriormente limitato l?applicazione dell?aumento sicuro ed efficace di cAMP, nel trattamento dell?IH [6].
I presenti risultati hanno indicato che un peptide che permea nelle cellule contenente i residui tra 126 e 150 del dominio N-terminale della proteina PI3K? (SEQ ID No.: 1) pu? aumentare selettivamente il cAMP in VSMC alterando la funzione di una specifica isoforma di PDE, PDE4D. Questo peptide (chiamato KIT2014; [12]) rompe l?interazione tra PI3K? e PKA, delocalizzando PKA e riducendo la sua capacit? di attivare isoforme di PDE specifiche per tipo di cellule selezionate [18]. La sequenza amminoacidica di PI3K? trovata in KIT2014 ha precedentemente dimostrato di ridurre l?attivit? di PDE3 causando aritmia in vitro nei cardiomiociti [19]. Inoltre, questo peptide ha dimostrato di rompere il complesso PI3K?/PKA nei muscoli lisci delle vie aeree, portando all?inibizione di PDE4B/D e al broncorilassamento [12]. I presenti risultati dimostrano che, quando ? coniugata con un peptide che penetra nelle cellule come la Penetratina 1, questa sequenza entra in modo efficiente e aumenta i livelli di cAMP in VSMC che, sebbene siano simili alle cellule del muscolo liscio delle vie aeree, non sono sovrapponibili in termini di espressione genica e biologia cellulare [20, 21].
Se KIT2014 fosse in grado di causare l?arresto proliferativo cAMP-dipendente in VSMC era impossibile da prevedere partendo dalla tecnica nota. Il consenso sul modo di azione del cAMP evidenzia una compartimentalizzazione della segnalazione subcellulare complessa dovuta all?esistenza, nella stessa cellula, di diversi pool di cAMP con funzioni distinte [22]. I precedenti risultati degli Inventori hanno dimostrato che nei cardiomiociti e nei muscoli lisci delle vie aeree KIT2014 regola pool di cAMP che controllano rispettivamente la contrazione cardiaca e il broncorilassamento. I dati qui riportati confermano la presenza di compartimenti funzionali distinti di segnalazione di cAMP nei muscoli lisci [23], nonch? la capacit? di KIT2014 di agire su pool di cAMP subcellulari selezionati [12, 19]. I presenti risultati, che indicano che KIT2014 ha specificamente attenuato la funzione di PDE4D e soppresso la proliferazione di VSMC in risposta a PDGF e forskolina, hanno dimostrato in conclusione che, nel contesto delle VSMC, l?aumento di cAMP provocata da KIT2014 ? sufficiente per ridurre la proliferazione e l?IH.
Precedenti studi indicano che il blocco dell?attivit? di PI3K? in VSMC potrebbe rappresentare un nuovo approccio terapeutico per il trattamento dell?IH [24]. Tuttavia, PI3K? ? una proteina bifunzionale dotata non solo della capacit? di interagire con PKA e di modulare i livelli di cAMP (attivit? di ancoraggio) ma anche di generare molecole rappresentate da secondi messaggeri lipidici attraverso la sua attivit? catalitica. A differenza di quanto qui riportato, studi precedenti su PI3K? in VSMC si sono concentrati sul ruolo catalitico della proteina piuttosto che sulla sua capacit? di interagire con PKA e modulare i livelli di cAMP. In particolare, Yu et al. [24] insegnano che l?attivit? catalitica di PI3K? ? necessaria per la proliferazione di VSMC. In linea con questa visione, l?attivit? catalitica di PI3K? media la capacit? delle cellule T di innescare l?IH [25, 26] e Yu et al. dimostrano che la proliferazione di VSMC dipende da PI3K? espressa nelle cellule derivate dal midollo osseo, come le cellule T. Pertanto, Yu et al. indicano che l?IH dipende indirettamente dalla funzione catalitica di PI3K? espressa in cellule T. Al contrario, i dati qui presentati dimostrano chiaramente che la funzione chinasi-indipendente di PI3K? influenza la proliferazione di VSMC attraverso un meccanismo diretto, cellula-autonomo. I dati attuali operano una inconfutabile distinzione tra un ruolo chinasi-dipendente e uno chinasiindipendente di PI3K? in vivo attraverso lo studio di topi geneticamente modificati per esprimere una versione chinasiinattiva dell?enzima (topi PI3K?-KD) che mantiene la capacit? di interagire con PKA [19]. I presenti risultati con topi PI3K?-KD hanno chiaramente dimostrato che la perdita di attivit? catalitica nel compartimento ematopoietico ha portato a una piccola riduzione dell?IH. Al contrario, la perdita dell?attivit? catalitica di PI3K? nel compartimento non ematopoietico non ? stata in grado di bloccare l?IH. In linea con il ruolo dell?interazione proteina-proteina tra PI3K? e PKA, la completa perdita di PI3K? in topi KO ha portato a una forte riduzione in vivo dell?IH. Come ulteriore prova del coinvolgimento della funzione di ancoraggio di PI3K? nel controllo della proliferazione di VSMC, un peptide che bersaglia specificamente l?ancoraggio ma non l?attivit? catalitica di PI3K? (KIT2014) inibisce la proliferazione di VSMC in vitro. In linea con questa visione, la capacit? di KIT2014 di bloccare la proliferazione di VSMC agisce indipendentemente dall?attivit? catalitica di PI3K? e conferma che i due ruoli dell?enzima possono essere bersagliati in maniera indipendente.
In sintesi, i presenti risultati sono coerenti con un ruolo senza precedenti per KIT2014 nel distruggere il complesso PI3K?/PKA che promuove la soppressione di cAMP PDE4D-dipendente necessaria per mantenere la proliferazione di VSMC. Su questa base, i risultati degli inventori indicano un uso non ovvio di KIT2014 nel trattamento dell?IH, che si verifica in malattie come la restenosi, l?aterosclerosi e l?ipertensione arteriosa polmonare. KIT2014 potrebbe essere usato come componente di stent medicati o trattamenti locali in concomitanza con l?angioplastica per il trattamento dell?aterosclerosi e della restenosi o come agente inalato per il trattamento dell?ipertensione arteriosa polmonare.
Risultati
I precedenti risultati degli Inventori hanno identificato un ruolo dell?attivit? catalitica di PI3K? nei processi immunitari dello sviluppo dell?IH e della guarigione arteriosa [26]. Ci? ? stato dimostrato usando topi knock-in esprimenti una PI3K? cataliticamente inattiva (PI3K?-KD) sottoposti a un danneggiamento arterioso meccanico. Topi PI3K? KD hanno mostrato ridotta occlusione arteriosa e accumulo di monociti e cellule T attorno ai siti della lesione vascolare. Nel presente studio gli inventori intendevano esplorare ulteriormente le implicazioni di PI3K? nel compartimento vascolare e valutare un possibile ruolo della sua funzione non catalitica e di ancoraggio nell?IH. Chimere di midollo osseo [27] sono state generate usando topi PI3K?-KO e PI3K?-KD come riceventi, per operare una distinzione tra funzione chinasi-dipendente o chinasiindipendente di PI3K? nel compartimento vascolare. Gli inventori hanno introdotto BM da animali WT in animali PI3K?-KO (WT>KO) o PI3K?-KD (WT>KD) e viceversa (KO>WT e KD>WT). Dopo l?attecchimento, le arterie femorali sono state danneggiate e le lesioni sono state analizzate 28 giorni dopo. Nelle chimere BM WT>KO e KO>KO, il rapporto intima/media ? diminuito del 40% rispetto alla chimera BM WT>WT (Figura 1A), mentre non sono state osservate differenze nelle chimere BM WT>KD come precedentemente osservato [26]. Questi risultati hanno indicato che la presenza di PI3K?, e non la sua attivit? catalitica, ? richiesta nel compartimento vascolare per indurre una risposta fibroproliferativa al danneggiamento.
Coerentemente con i precedenti risultati degli inventori [26], le chimere BM KO>WT, BM KD>WT o BM KD>KD hanno mostrato una forte riduzione del rapporto intima/media confermando il ruolo dell?attivit? catalitica di PI3K? nel compartimento immunitario (Figura 1A). L?analisi istologica mediante colorazione Tricromica di Masson delle arterie danneggiate ha mostrato una ridotta area della neointima nelle chimere BM WT>KO e BM KO>WT rispetto ai controlli (Figura 1A). Questa colorazione indicava chiaramente che la ridotta area della neointima in BM WT>KO ? principalmente dovuta a una minore espansione dello strato di VSMC (Figura 1A). Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che la proliferazione di VSMC post-danneggiamento ? indipendente dalla funzione catalitica della PI3K? ma coinvolge piuttosto la sua funzione di ancoraggio.
Data l?importanza del cAMP nell?inibizione della proliferazione di VSMC in vitro e in vivo [3-5], gli inventori hanno ipotizzato che una funzione chinasiindipendente di PI3K? potrebbe anche essere implicata nella proliferazione di VSMC attraverso la regolazione di cAMP. Per verificare questa ipotesi, la proliferazione di VSMC primarie da diversi genotipi (WT, PI3K?-KO o PI3K?-KD) ? stata valutata mediante stimolazione con un potente agente mitogeno per le VSMC, il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF). Un attivatore dell?adenilato ciclasi, la forskolina (FSK), ? stato integrato in terreni di coltura per aumentare i livelli di cAMP e controbilanciare la proliferazione di VSMC indotta dal PDGF (Figura 1C). I risultati degli inventori hanno dimostrato che 25 ?M di FSK hanno ridotto la proliferazione di VSMC e hanno dimostrato che l?effetto della FSK ? significativamente potenziato in assenza di PI3K? (PI3K?-KO) ma non in PI3K?-KD VSMC, confermando il ruolo della funzione AKAP di PI3K? in VSMC (Figure 1D ed E). Questi risultati hanno dimostrato che PI3K? controlla la proliferazione di VSMC regolando la concentrazione intracellulare di cAMP, indipendentemente dalla sua attivit? enzimatica.
Il coinvolgimento di PI3K? nel controllo della concentrazione intracellulare di cAMP in VSMC ? stato confermato studiando la dinamica dei segnali di cAMP in VSMC primarie WT, PI3K?-KD o PI3K?-KO utilizzando il biosensore
<T>Epac<VV >basato su FRET [28]. Le variazioni relative dei livelli di cAMP in risposta a forskolina 2,5 ?M sono state monitorate nel tempo, calcolando il rapporto tra fluorescenza del donatore (F480 nm) e fluorescenza dell?accettore (F535 nm). Il livello di cAMP ? determinato come percentuale della variazione massima del rapporto (Rmax). Rmax ? stata determinata alla fine dell?esperimento aggiungendo 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) 200 ?M, un inibitore pan-PDE, in presenza di forskolina 2,5 ?M. Come mostrato nella figura 2, la produzione di cAMP in risposta alla forskolina 2,5 ?M ? aumentata in VSMC primarie PI3K?-KO rispetto a VSMC primarie WT di 2,2 volte (24,09% vs 52,57% della risposta IBMX, p = 0,03), mentre la risposta alla forskolina di cellule PI3K?-KD rimane simile alle cellule WT (Figura 2A-C). I livelli basali di cAMP non sono stati alterati allo stato stazionario in tutti e tre i genotipi (Figura 2A e B). Inoltre, la variazione massima del rapporto era anche identica in VSMC da tutti i genotipi (Figura 2A). Complessivamente, questi risultati hanno mostrato che la risposta del cAMP alla forskolina ? maggiore nelle VSMC PI3K?-KO rispetto alle cellule WT e PI3K?-KD, il che dimostra un ruolo per PI3K? nella limitazione dei livelli di cAMP.
Il livello intracellulare di cAMP dipende dalla sua produzione e degradazione da parte delle adenilil-ciclasi (AC) e PDE, rispettivamente. ? gi? stato dimostrato che PI3K? si lega a PDE nei cardiomiociti [11, 19], e tra queste gli inventori si sono concentrati su PDE3 e 4 poich? sono state implicate nell?IH [8, 10, 29]. Essi hanno successivamente trattato VSMC stimolate con forskolina con cilostamide e rolipram, inibendo rispettivamente PDE3 e PDE4 e hanno quantificato il livello di cAMP secondo Rmax. Questi esperimenti hanno permesso di valutare la proporzione relativa dei pool di cAMP regolati da ogni PDE in diversi genotipi. I risultati hanno mostrato che i livelli di cAMP sono per lo pi? regolati da PDE4 in cellule WT e PI3K?-KD (rispettivamente 67% e 73% rispetto alla risposta IBMX). L?implicazione di PDE3 nella regolazione dei livelli di cAMP in queste cellule ? limitata al 25% e al 17% della risposta a IBMX, rispettivamente (Figura 3A, B e C). Di conseguenza, nelle cellule PI3K?-KO la principale isoforma di PDE che degrada il cAMP ? PDE3 (il 49% della risposta a IBMX per PDE3 vs il 43% della risposta a IBMX per PDE4, Figura 2C). Per confermare l?implicazione degli enzimi PDE4 nella regolazione di cAMP a valle di PI3K?, gli inventori hanno eseguito l?immunoprecipitazione e hanno misurato l?attivit? di PDE4. Si sono concentrati su PDE4D, che ? la principale isoforma espressa in VSMC. Coerentemente con le misurazioni di cAMP degli inventori in cellule viventi, l?attivit? di PDE4D ? stata significativamente ridotta nelle cellule PI3K?-KO rispetto a WT e PI3K?-KD (Figura 3D ed E).
? stato dimostrato che PI3K? regola i livelli e la segnalazione di cAMP tramite la sua funzione AKAP nei cardiomiociti [19]. ? interessante notare che l?interazione tra PI3K? e il complesso PKA/PDE ? stata mappata sulla regione N-terminale di p110? tra l?amminoacido 126 e 150 [19]. Per studiare ulteriormente la relazione funzionale tra PI3K?, la regolazione di cAMP da parte di PKA/PDE e la proliferazione di VSMC, gli inventori hanno interrotto l?interazione PI3K?/PKA trattando le cellule con un peptide competitivo penetrante nelle cellule corrispondente alla regione di legame di PKA su p110?, e hanno sondato la loro proliferazione in risposta a PDGF e forskolina [19]. Un peptide di controllo ? stato progettato con due mutazioni puntiformi (K>A e R>A rispettivamente nelle posizioni 1 e 5 della sequenza di PI3K?), il quale non interagisce con PKA [19] (Figura 4A). Innanzitutto, gli inventori hanno valutato la capacit? del peptide di interferire selettivamente con la funzione di ancoraggio e non con la funzione catalitica di PI3K?. Hanno scoperto che la fosforilazione di Akt mediata da C5a nei macrofagi, un evento basato sull?attivit? catalitica di PI3K? [30], era inalterata nelle cellule trattate con il peptide PI3K?, mentre era significativamente ridotta in quelle esposte all?inibitore canonico di PI3K? chinasi AS-6052540 (Figura 4B). Successivamente, hanno determinato il decorso temporale della penetrazione del peptide in VSMC usando una versione del peptide marcata con FITC. Il peptide era rivelabile nelle cellule dopo 5 ore ed era ancora rivelabile 30 h dopo l?incubazione (Figura 4C-D). Pertanto, gli inventori hanno usato il peptide PI3K? per bloccare l?interazione PI3K?-PKA in un esperimento di proliferazione cellulare come nella figura 1D. L?incubazione con il peptide bloccante ha inibito la proliferazione cellulare nelle cellule WT e PI3K?-KD (Figura 5A e B) mentre non ? stata osservata alcuna differenza nelle cellule PI3K?KO (Figura 5C). Questi dati dimostrano chiaramente che PI3K? controlla la proliferazione di VSMC mediante la sua funzione AKAP.
Complessivamente, i presenti risultati consentono di concludere che PI3K? agisce come catalizzatore della proliferazione di VSMC diminuendo i livelli di cAMP principalmente attraverso il controllo diretto degli enzimi PDE4 (Figura 5D).
Procedimenti
Animali: topi PI3K?-deficienti (PI3K?-KO) e topi esprimenti una forma cataliticamente inattiva di PI3K? (topi con chinasi PI3K? inattivata; PI3K?-KD) provenivano da un background C57BL/6J e sono stati descritti in precedenza [31-33]. WT, PI3K?-KD, PI3K?-KO sono stati mantenuti presso lo stabulario di Rangueil (UMS 06; piattaforma Anexplo) e mantenuti in condizioni SPF. Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformit? con le linee guida istituzionali sulla sperimentazione animale e sotto una licenza del Ministero dell?Agricoltura Francese.
Danneggiamento mediante filo dell?arteria femorale nei topi: Topi maschi WT, PI3K?-KD, PI3K?-KO di et? compresa tra 8 e 10 settimane sono stati studiati usando un modello stabilito di danneggiamento mediante filo dell?arteria femorale [27], per studi sull?IH. In breve, l?anestesia generale ? stata raggiunta con isoflurano al 2%. Quindi, l?arteria femorale ? stata isolata e un?incisione ? stata eseguita al microscopio chirurgico (Carl Zeiss). Un filo guida per angioplastica con diametro di 0,35 mm con una punta di 0,25 mm ? stato fatto avanzare tre volte nell?arteria fino al livello della biforcazione aortica, quindi tirato indietro. Dopo la rimozione del filo, il sito di arteriotomia ? stato legato. I topi sono stati sacrificati 28 giorni dopo il danneggiamento per l?analisi istologica e immunoistochimica.
Trattamento dei tessuti e morfometria: La quantificazione dell?IH ? stata eseguita con la tecnica dell?incorporazione in paraffina. Al momento dell?eutanasia, i topi sono stati perfusi con PBS, facendo seguire paraformaldeide al 4%. I vasi sono stati raccolti e fissati in formalina al 4%, pH = 8, per 24 h. Sono stati messi in paraffina e preparati come vetrini (sezioni spesse 4 ?m). Per quantificare la velocit? di IH, le sezioni sono state colorate con colorazione Tricromica di Masson (Bio Optica), quindi i perimetri di lume, IEL (lamina elastica interna) ed EEL (lamina elastica esterna) (?m) sono stati misurati a 4 sezioni (0,5, 2,0, 3,5 e 5 mm dal sito di legatura) per ogni vaso utilizzando il software LAS (Leica). Le arterie che hanno subito un evento trombotico occlusivo sono state escluse dal gruppo di quantificazione. L?area definita dall?EEL (?m<2>) ? stata calcolata assumendo la geometria circolare in vivo: (AEEL = circonferenza di EEL<2 >? 4?). L?area definita dall?IEL (?m<2>) ? stata calcolata utilizzando: (AIEL = circonferenza di IEL<2 >? 4?). L?area del lume (?m<2>) ? stata calcolata usando: (ALUM = circonferenza del lume<2 >? 4?). L?area neointimale (?m<2>) ? stata calcolata utilizzando: (ANEO = AIEL - ALUM). L?area mediale (?m<2>) ? stata calcolata utilizzando: (AMED = AEEL - AIEL). Il rapporto intima/media ? stato calcolato utilizzando: (neointima/media = ANEO ? AMED).
Trapianto di midollo osseo (BM): BM ? stato ottenuto da topi WT, PI3K?-KD e PI3K?-KO di 8 settimane. Le cellule di BM sono state estratte da femori e tibie, quindi lavate, filtrate, contate e risospese in PBS sterile per l?iniezione retro-orbitale di 10<7 >cellule non frazionate per topo irradiato WT, PI3K?-KD o PI3K?-KO (9 Gy; irradiatore RadGil Gilardoni). 4 settimane dopo, ? stato praticato un danneggiamento dell?arteria femorale e i topi sono stati sottoposti a eutanasia 28 gg dopo l?intervento. L?attecchimento riuscito ? stato confermato dalla PCR.
Isolamento di SMC dall?aorta murina e coltura: VSMC di topo sono state isolate da topi WT secondo un protocollo modificato descritto da [34]. In breve, l?aorta di 4 topi WT ? stata dissezionata dalla loro origine alla biforcazione iliaca, lavata con PBS e rimossa. L?avventizia ? stata rimossa dall?aorta e i tubi lisci sono stati tagliati in pezzi di 1-2 mm e quindi digeriti in soluzione di collagenasi allo 0,3%. La digestione con collagenasi ? stata interrotta aggiungendo DMEM (D0822, Sigma Aldrich)/10% FBS (FBS, Thermo Fisher Scientific). Quindi, i pezzi di aorta sono stati lavati due volte e inseminati in piastre di coltura. Le colture confluenti primarie sono state tripsinizzate (0,1% di tripsina; Thermo Fisher Scientific) a 37?C, quindi le cellule sono state incubate a 37?C in 5% di CO2 in DMEM/10% FBS e coltivate fino al quarto passaggio.
Misurazione della proliferazione di SMC di topo: SMC primarie di topo sono state sub-coltivate su piastre di coltura cellulare a 48 pozzetti in terreno completo. Le cellule sono state trattate o meno con PDGF (520-BB-050, R&D Systems) e forskolina (F3917, Sigma Aldrich) per 24 h. Per bloccare gli esperimenti sui peptidi, le cellule sono state incubate per 24 h con 25 ?M di controllo (RQIKIWFQNRRMKWKKGAATHASPGQIHLVQRHPPSEESQAF - SEQ ID No.: 13) o peptide bloccante (RQIKIWFQNRRMKWKKGKATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF - SEQ ID No.: 14). I peptidi sono stati sintetizzati mediante GenScript (GenScript, Piscataway, NJ). I saggi di incorporazione di BrdU (00-0103, Invitrogen) sono stati eseguiti mediante procedura di immunofluorescenza classica usando anticorpo anti-BrdU (11-5071, eBioscience) e DAPI. Il tasso di proliferazione viene misurato come rapporto tra i nuclei positivi a BrdU e i nuclei totali ed espresso come coefficiente di aumento.
Misurazione della dinamica del cAMP: SMC primarie sono state inseminate su vetrini e infettate con l?adenovirus di tipo 5 con codifica per <T>Epac<VV >(~100 particelle per SMC) come descritto altrove [35]. I vetrini sono stati posizionati in una camera per microscopio continuamente perfusa (2ml?min<-1>) con tampone BBS (NaCl 125 mM, CaCl22 mM, MgCl2 1 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO326 mM, glucosio 25 mM) saturata con 95% di O2-5% di CO2. Le analisi raziometriche sono state eseguite come segue: la fluorescenza ? stata eccitata con una sorgente LED a 435 nm e l?emissione della fluorescenza ? stata monitorata con uno specchio dicroico (T450LPXR) e filtri di emissione alternati per il donatore (HQ480/40) e l?accettore (D535/40). Coppie di immagini sono state registrate con una telecamera CCD Orca-ER (Hamamatsu Photonics, Giappone), a intervalli di 20 s. I cambiamenti in [cAMP]i sono espressi come rapporto tra fluorescenza del donatore (F480) e fluorescenza dell?accettore (F535). I rapporti sono stati moltiplicati per una stessa costante per tutti gli esperimenti, in modo tale che il rapporto di base fosse pari a 1 in condizioni basali. La variazione massima del rapporto (Rmax) ? stata ottenuta stimolando le cellule con forskolina 2,5 ?M e IBMX 200 ?M (I5879, Sigma Aldrich). Filtri e specchi sono stati ottenuti da AHF analysentechnik AG, T?bingen, Germania.
Misurazione dell?attivit? di PDE: Le cellule sono state raschiate in 120 mmol/l di NaCl, 50 mmol/l di Tris-HCl (pH 8,0) e Triton X-100 all?1%, con integrazione di inibitori di proteasi e fosfatasi e centrifugate a 13.000 giri al minuto per 10 min a 4?C. I supernatanti sono stati sottoposti a immunoprecipitazione e quindi saggiati per l?attivit? di PDE o Western Blotting. Per i saggi di immunoprecipitazione, 200 ?g di estratti pre-chiarificati sono stati incubati con 20 ?l di una sospensione 1:1 di proteina A o proteina G-Sepharose (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) e 1 ?g di anticorpo anti-PDE4D (Abcam #ab171750) per 2 h a 4?C. Gli immunocomplessi sono stati quindi ampiamente lavati con tampone di lisi e sottoposti al saggio di attivit? di PDE. L?attivit? di PDE negli immunoprecipitati ? stata misurata secondo il procedimento in due fasi di Thompson e Appleman con lievi modifiche. In breve, le immunoprecipitazioni sono state saggiate in un volume totale di 200 ?l di miscela di reazione contenente 40 mmol/l di Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/l di MgCl2, 1,4 mmol/l di 2-mercapto-etanolo, 1 ?mol/l di cAMP (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) e 0,1 ?Ci di [<3>H]cAMP (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK) per 45 min a 33?C. Per bloccare la reazione i campioni sono stati fatti bollire a 95?C per 3 min. Il prodotto di reazione di PDE 5?-AMP ? stato quindi idrolizzato mediante incubazione della miscela di saggio con 50 ?g di veleno di serpente Crotalus Atrox per 15 min a 37?C (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). L?adenosina risultante ? stata separata mediante cromatografia a scambio anionico usando 400 ?l di una sospensione al 30% (peso/volume) di resina Dowex AG1-X8 (Bio-Rad, Segrate, Milano, Italia). La quantit? di adenosina radiomarcata nel supernatante ? stata quantificata mediante conteggio della scintillazione (liquido di scintillazione Ultima Gold della Perkin Elmer, Waltham, MA).
Fosforilazione di Akt mediata da C5a nei macrofagi:
Dopo 3 h di coltura senza nutrienti in terreno privo di siero, i macrofagi RAW264 sono stati pretrattati con il peptide competitivo PI3K? (25 ?M) o l?inibitore di PI3K? AS-605240 (1 ?M; MedChemExpress) o DMSO per 30 min e stimolati per 5 min con 50 nM di C5a (Sigma Aldrich). La fosforilazione di Akt in Ser-473 ? stata rilevata mediante Western blot usando un anticorpo specifico per Akt in Ser473 (Cell Signaling Technology).
Claims (10)
1. Peptide di fusione per l?uso nel trattare, prevenire e/o ritardare l?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa, in cui il peptide di fusione comprende:
(a) una sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o un omologo correlato avente almeno l?85% di similarit? con SEQ ID No.: 1 e avente la capacit? della sequenza SEQ ID No.: 1 di inibire la funzione chinasiindipendente di PI3K? e
(b) un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula.
2. Peptide di fusione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula ? selezionato tra le sequenze specificate in SEQ ID No.: 2 a 12.
3. Peptide di fusione per l?uso secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula ? legato al terminale carbossilico o al terminale amminico di SEQ ID No.: 1 o suoi omologhi.
4. Peptide di fusione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il peptide di fusione ha una sequenza amminoacidica come indicata in SEQ ID No.: 14.
5. Peptide di fusione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la malattia vascolare fibroproliferativa ? selezionata tra restenosi, ipertensione, ipertensione polmonare, preferibilmente ipertensione arteriosa polmonare, aterosclerosi e rottura delle placche.
6. Composizione farmaceutica per l?uso nel trattare, prevenire e/o ritardare l?insorgenza di una malattia vascolare fibroproliferativa, contenente un peptide di fusione e un veicolo farmaceuticamente accettabile, in cui il peptide di fusione comprende: (a) una sequenza amminoacidica come definita in SEQ ID No.: 1 o un omologo correlato avente almeno l?85% di similarit? con SEQ ID No.: 1 e avente la capacit? della sequenza SEQ ID No.: 1 di inibire la funzione chinasi-indipendente di PI3K?, e (b) un peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula.
7. Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione 6, in cui il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula ? selezionato tra le sequenze specificate in SEQ ID No.: 2 a 12.
8. Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione 6 o la rivendicazione 7, in cui il peptide avente la capacit? di penetrare in una cellula ? legato al terminale carbossilico o al terminale amminico di SEQ ID No.: 1 o suoi omologhi.
9. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 a 8, in cui il peptide di fusione ha una sequenza amminoacidica come indicata in SEQ ID No.: 14.
10. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 a 9, in cui la malattia vascolare fibroproliferativa ? selezionata tra restenosi, ipertensione, ipertensione polmonare, preferibilmente ipertensione arteriosa polmonare, aterosclerosi e rottura delle placche.
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