IT201800006314A1 - USE OF CATION EXCHANGE RESINS FOR THE PURIFICATION OF LIPOPOLIPEPTIDIC ANTIBIOTICS - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: Description of the patent for industrial invention entitled:

“USO DI RESINE A SCAMBIO CATIONICO PER LA PURIFICAZIONE DI ANTIBIOTICI LIPOPOLIPEPTIDICI” "USE OF CATION EXCHANGE RESINS FOR THE PURIFICATION OF LIPOPOLIPEPTIDIC ANTIBIOTICS"

Campo dell’invenzione Field of the invention

La presente invenzione descrive l’uso di resine a scambio cationico per la separazione di antibiotici lipopolipeptidici da impurezze presenti nel terreno di fermentazione e il relativo processo di purificazione. The present invention describes the use of cation exchange resins for the separation of lipopolipeptide antibiotics from impurities present in the fermentation medium and the related purification process.

Background dell’invenzione Background of the invention

La daptomicina è un antibiotico lipopolipeptidico, caratterizzato da una particolare struttura peptidica ciclica di 13 aminoacidi ed utilizzato per la terapia delle infezioni antibiotico-resistenti; è ottenuto per fermentazione e successiva purificazione, come descritto in US 4,885,243 e US Re39,071. Nel terreno di fermentazione il prodotto è accompagnato da numerose impurezze, la maggior parte delle quali sono polipeptidi o lipopolipeptidi, frammenti della catena polipeptidica dell’antibiotico o derivanti dalla sostituzione di un aminoacido: il metodo analitico e la struttura di alcune impurezze sono descritti in US 6,696,412. Daptomycin is a lipopolipeptide antibiotic, characterized by a particular cyclic peptide structure of 13 amino acids and used for the therapy of antibiotic-resistant infections; it is obtained by fermentation and subsequent purification, as described in US 4,885,243 and US Re39,071. In the fermentation medium the product is accompanied by numerous impurities, most of which are polypeptides or lipopolipeptides, fragments of the polypeptide chain of the antibiotic or deriving from the substitution of an amino acid: the analytical method and the structure of some impurities are described in US 6,696,412.

Per ottenere un prodotto di qualità sufficiente per uso farmaceutico è richiesto un notevole lavoro di purificazione: tutti i processi attuali per la produzione di daptomicina si sulla purificazione per cromatografia, effettuando diversi passaggi su resine a scambio ionico e/o adsorbenti, fino ad ottenere un prodotto di elevata purezza chimica, come descritto per esempio in US 9,358,267. Tipicamente, i processi produttivi richiedono almeno tre passaggi di purificazione per cromatografia su resina, oltre a altri passaggi come ultrafiltrazioni e nanofiltrazioni, che danno pochi vantaggi in termini di purezza del prodotto ma che sono comunque necessari per motivi tecnologici. La purificazione della daptomicina dalle impurezze più strettamente correlate è generalmente affidata ad una cromatografia per interazione idrofobica (HIC), che però da sola non è sufficiente. Per esempio, EP239881 prevede due successivi passaggi di cromatografia HIC a due pH diversi per ottenere un prodotto sufficientemente puro. Inoltre, la cromatografia HIC richiede l’uso di solventi organici miscibili con acqua, tipicamente etanolo o isopropanolo, che poi vanno rimossi dal prodotto; l’uso su scala industriale di questi solventi, infiammabili e inquinanti, comporta ovvi problemi e costi di gestione. To obtain a product of sufficient quality for pharmaceutical use, considerable purification work is required: all the current processes for the production of daptomycin are on purification by chromatography, carrying out several passages on ion exchange resins and / or adsorbents, until obtaining a product of high chemical purity, as described for example in US 9,358,267. Typically, the production processes require at least three purification steps for resin chromatography, in addition to other steps such as ultrafiltration and nanofiltration, which give few advantages in terms of product purity but which are still necessary for technological reasons. The purification of daptomycin from the more closely related impurities is generally entrusted to hydrophobic interaction chromatography (HIC), which, however, alone is not sufficient. For example, EP239881 provides two successive HIC chromatography steps at two different pHs to obtain a sufficiently pure product. In addition, HIC chromatography requires the use of organic solvents miscible with water, typically ethanol or isopropanol, which must then be removed from the product; the use on an industrial scale of these solvents, flammable and polluting, involves obvious problems and management costs.

Un nuovo metodo di purificazione della daptomicina è quindi di interesse industriale, sia come semplice alternativa alle procedure esistenti, sia per limitare l’utilizzo di solventi organici. In letteratura tuttavia non sono finora descritti metodi di purificazione basati sull’uso di resine a scambio cationico. A new method of purification of daptomycin is therefore of industrial interest, both as a simple alternative to existing procedures, and to limit the use of organic solvents. However, so far no purification methods based on the use of cation exchange resins have been described in the literature.

Descrizione dell’invenzione Description of the invention

Abbiamo ora trovato che la cromatografia su resina a scambio cationico consente di separare la daptomicina da impurezze difficilmente separabili con altre tecniche di purificazione, come la HIC e la cromatografia su resina a scambio anionico. In particolare, come sotto descritto, è utile per separare la daptomicina da un polipeptide noto con la sigla CB131005 e da un isomero noto come beta-isomero; le strutture di entrambe le impurezze ed il metodo analitico HPLC per la determinazione sono descritti per esempio in US 8,129,342. We have now found that cation exchange resin chromatography allows to separate daptomycin from impurities that are difficult to separate with other purification techniques, such as HIC and anion exchange resin chromatography. In particular, as described below, it is useful for separating daptomycin from a polypeptide known with the abbreviation CB131005 and from an isomer known as beta-isomer; the structures of both impurities and the HPLC analytical method for the determination are described for example in US 8,129,342.

Si è inoltre trovato che la cromatografia a scambio cationico può essere convenientemente utilizzata anche per la rimozione di solventi da soluzioni di antibiotici lipopolipeptidici, in particolare daptomicina, e per la decolorazione delle soluzioni risultanti dai brodi di fermentazione. It has also been found that cation exchange chromatography can also be conveniently used for the removal of solvents from solutions of lipopolipeptide antibiotics, in particular daptomycin, and for the decolorization of the solutions resulting from the fermentation broths.

L’invenzione riguarda pertanto l’uso di resine a scambio cationico per purificare soluzioni di daptomicina, in particolare per ridurre il contenuto in impurezza CB131005 e/o in beta-isomero. L’impurezza CB131005 corrisponde all’analogo della daptomicina in cui il residuo di acido decanoico è sostituito da un residuo di acido nonanoico. The invention therefore relates to the use of cation exchange resins to purify daptomycin solutions, in particular to reduce the content in CB131005 impurity and / or in beta-isomer. The CB131005 impurity corresponds to the analogue of daptomycin in which the decanoic acid residue is replaced by a nonanoic acid residue.

L’invenzione ha inoltre per oggetto un processo per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidici, in particolare di daptomicina, che comprende almeno uno stadio di cromatografia a scambio cationico. Un ulteriore oggetto dell’invenzione è la daptomicina ottenuta da tale processo. The invention also relates to a process for the purification of lipopolipeptide antibiotics, in particular of daptomycin, which includes at least one stage of cation exchange chromatography. A further object of the invention is the daptomycin obtained from this process.

Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention

Nel dettaglio, l’uso delle resine a scambio cationico dell’invenzione viene attuato attraverso un processo dell’invenzione che comprende: In detail, the use of the cation exchange resins of the invention is implemented through a process of the invention which includes:

a) rimozione del micelio dal brodo di coltura (per microfiltrazione, centrifugazione o altro processo); a) removal of the mycelium from the culture broth (by microfiltration, centrifugation or other process);

b) cromatografia a scambio anionico della soluzione dallo stadio a); c) eventuale concentrazione della frazione purificata dallo stadio b), in particolare per nanofiltrazione; b) anion exchange chromatography of the solution from step a); c) possible concentration of the purified fraction from step b), in particular by nanofiltration;

d) cromatografia a interazione idrofobica della frazione dallo stadio b) o c) eluendo con alcoli C1-C4; d) hydrophobic interaction chromatography of the fraction from step b) or c) eluting with C1-C4 alcohols;

e) cromatografia a scambio cationico della frazione arricchita in daptomicina dallo stadio d), eluendo con soluzioni saline eventualmente a pH superiore al punto isoelettrico del lipopolipeptide; e) cation exchange chromatography of the fraction enriched in daptomycin from step d), eluting with saline solutions possibly having a pH higher than the isoelectric point of the lipopolipeptide;

f) dialisi, concentrazione e liofilizzazione o spray-drying della daptomicina purificata. f) dialysis, concentration and lyophilization or spray-drying of the purified daptomycin.

In una variante del processo, gli stadi d) ed e) vengono invertiti, cioè si effettua prima la cromatografia su resina cationica e successivamente la cromatografia su resina idrofobica. In a variant of the process, steps d) and e) are inverted, i.e. first chromatography on cationic resin and subsequently chromatography on hydrophobic resin.

La cromatografia a scambio cationico è effettuata utilizzando una resina funzionalizzata con gruppi acidi forti, eluendo a pH compresi fra 3 e 7. Cation exchange chromatography is performed using a resin functionalized with strong acid groups, eluting at pH between 3 and 7.

Secondo l’invenzione è possibile utilizzare con successo una resina a scambio cationico per la purificazione della daptomicina, in particolare per la separazione cromatografica della daptomicina stessa da impurezze correlate, più in particolare due di queste: l’impurezza nota come beta-isomero e l’impurezza CB131005 (analogo della daptomicina in cui il residuo di acido decanoico è sostituito da un residuo di acido nonanoico). Quest’ultima impurezza è particolarmente difficile da separare dalla daptomicina a causa della forte similitudine strutturale dei due composti La combinazione di tecniche cromatografiche diverse come la cromatografia a scambio ionico con la cromatografia per interazione idrofobica (HIC) permette di ottenere una daptomicina sufficientemente pura per applicazioni farmaceutiche. According to the invention it is possible to successfully use a cation exchange resin for the purification of daptomycin, in particular for the chromatographic separation of daptomycin itself from related impurities, more particularly two of these: the impurity known as beta-isomer and the impurity CB131005 (analogue of daptomycin in which the residue of decanoic acid is replaced by a residue of nonanoic acid). The latter impurity is particularly difficult to separate from daptomycin due to the strong structural similarity of the two compounds The combination of different chromatographic techniques such as ion exchange chromatography with hydrophobic interaction chromatography (HIC) allows to obtain a sufficiently pure daptomycin for applications pharmaceuticals.

Allo scopo possono essere impiegate resine a scambio ionico di vario tipo, basate sia su polimeri naturali come il destrano e l’agarosio, sia su polimeri sintetici come i polimetacrilati e i polistireni; i polimeri sintetici sono particolarmente adatti ad applicazioni su scala industriale. Come gruppi funzionali possono essere impiegati gruppi acidi forti, per esempio il gruppo solfato; queste resine sono in grado di legare la daptomicina nel range di pH in cui il prodotto è più stabile, e di rilasciarlo poi con buone rese. Per l’eluizione possono essere utilizzati appropriati eluenti, preferibilmente eluenti acquosi, operando sia in gradiente salino sia di pH. For this purpose, various types of ion exchange resins can be used, based both on natural polymers such as dextran and agarose, and on synthetic polymers such as polymethacrylates and polystyrenes; synthetic polymers are particularly suitable for applications on an industrial scale. Strong acid groups, for example the sulfate group, can be used as functional groups; these resins are able to bind daptomycin in the pH range in which the product is more stable, and then release it with good yields. For elution appropriate eluents can be used, preferably aqueous eluents, operating both in saline and pH gradient.

Un secondo campo di applicazione della cromatografia su resina a scambio cationico è la desolvatazione delle soluzioni di daptomicina, per esempio le frazioni ottenute da una cromatografia HIC. La cromatografia HIC impiega solventi organici miscibili con acqua, tipicamente vengono impiegati acetonitrile, isopropanolo, o etanolo, in concentrazioni variabili; si ottiene quindi la daptomicina purificata in forma di soluzione mista acqua/solvente. Grazie all’uso di resine a scambio cationico è possibile legare il prodotto alla resina, mentre il solvente viene eluito e scartato; in seguito, si eluisce la daptomicina con una soluzione acquosa salina e/o mediante un cambio di pH, ottenendo quindi una soluzione di daptomicina priva di solventi. A second field of application of cation exchange resin chromatography is the desolvation of daptomycin solutions, for example the fractions obtained from an HIC chromatography. HIC chromatography uses organic solvents miscible with water, typically acetonitrile, isopropanol, or ethanol are used, in varying concentrations; the purified daptomycin is then obtained in the form of a mixed water / solvent solution. Thanks to the use of cation exchange resins, it is possible to bind the product to the resin, while the solvent is eluted and discarded; thereafter, daptomycin is eluted with an aqueous saline solution and / or by means of a pH change, thus obtaining a solvent-free daptomycin solution.

L’invenzione ha inoltre per oggetto l’uso di una resina a scambio cationico con soluzioni acquose di daptomicina per la contemporanea purificazione, decolorazione e rimozione di solventi organici. The invention also relates to the use of a cation exchange resin with aqueous solutions of daptomycin for the simultaneous purification, discoloration and removal of organic solvents.

L’invenzione è illustrata in maggior dettaglio nei seguenti esempi. The invention is illustrated in greater detail in the following examples.

Per purezza si intende il rapporto percentuale tra l’area del picco della daptomicina e la somma totale delle aree dei picchi della daptomicina e delle impurezze, determinato per analisi in HPLC secondo quanto descritto in US8129342 (colonna 22). Dove indicato, il contenuto delle singole impurezze si riferisce all’area del picco della sostanza indicata rispetto al totale delle aree, determinata in HPLC come sopra. By purity we mean the percentage ratio between the area of the daptomycin peak and the total sum of the areas of the daptomycin peaks and impurities, determined by HPLC analysis as described in US8129342 (column 22). Where indicated, the content of the individual impurities refers to the peak area of the indicated substance with respect to the total of the areas, determined in HPLC as above.

Esempio 1 Example 1

Una coltura di Streptomyces roseosporus viene fatta crescere in fermentazione aerobica sommersa come descritto nel brevetto EP0178152B1, somministrando acido decanoico durante le fasi finali di fermentazione e prendendo le opportune precauzioni per evitarne l’accumulo, come descritto in US 4208403. A culture of Streptomyces roseosporus is grown in submerged aerobic fermentation as described in patent EP0178152B1, administering decanoic acid during the final stages of fermentation and taking appropriate precautions to avoid its accumulation, as described in US 4208403.

Si ottengono 40 litri di una sospensione contenente circa 2,5 grammi di daptomicina per grammo di brodo di fermentazione, che viene purificata secondo i seguenti passaggi: 40 liters of a suspension are obtained containing about 2.5 grams of daptomycin per gram of fermentation broth, which is purified according to the following steps:

a) Il brodo intero viene sottoposto a microfiltrazione utilizzando delle membrane a base di biossido di titanio di porosità adeguata (0,2 µm). Si ottiene un filtrato pressoché limpido, che viene avviato alla fase successiva di nanofiltrazione; il micelio presente nel retentato viene risospeso in acqua e nuovamente microfiltrato, il secondo filtrato viene riunito al primo per migliorare il recupero di prodotto. Si ottiene infine una soluzione acquosa di colore scuro, con una concentrazione di daptomicina pari a circa 1,5 g/l, corrispondente ad una resa di processo di oltre il 90%. La soluzione viene parzialmente concentrata per nanofiltrazione, eliminando il permeato (che è privo di prodotto) e conservando il retentato; per abbreviare la lavorazione e limitare la degradazione del prodotto, la nanofiltrazione viene condotta a temperatura ridotta e viene avviata in contemporanea alla microfiltrazione. Si ottiene una soluzione concentrata di daptomicina grezza, di colore rosso-bruno, con purezza di circa 50-55% in area HPLC (determinata come descritto sopra), che viene denominata brodo microfiltrato; a) The whole broth is subjected to microfiltration using membranes based on titanium dioxide of suitable porosity (0.2 µm). An almost clear filtrate is obtained, which is sent to the next step of nanofiltration; the mycelium present in the retentate is resuspended in water and again microfiltered, the second filtrate is combined with the first to improve product recovery. Finally, an aqueous solution of dark color is obtained, with a concentration of daptomycin equal to about 1.5 g / l, corresponding to a process yield of over 90%. The solution is partially concentrated by nanofiltration, eliminating the permeate (which is product-free) and preserving the retentate; to shorten the processing and limit the degradation of the product, the nanofiltration is carried out at a reduced temperature and is started at the same time as the microfiltration. A concentrated solution of crude daptomycin is obtained, red-brown in color, with a purity of about 50-55% in the HPLC area (determined as described above), which is called microfiltered broth;

b) Il brodo microfiltrato viene caricato corretto a pH=6 e caricato su una colonna di resina anionica Diaion FPDA13, previamente equilibrata con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH 6. La daptomicina si lega interamente alla resina, mentre nell’effluente si elimina una soluzione limpida colorata. Si lava la resina con acqua demineralizzata, quindi con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH 6; l’effluente ottenuto dalla colonna contiene prevalentemente impurezze e viene eliminato. Si eluisce il prodotto dalla resina utilizzando una soluzione di magnesio acetato 50 mM e magnesio solfato da zero a 500 mM a pH 6, suddividendo l’effluente in varie frazioni, quindi si effettua analisi HPLC come descritto sopra di ogni frazione. Si riuniscono le frazioni con purezza adeguata, che vengono concentrate per nanofiltrazione, utilizzando membrane polimeriche con cut-off circa 500 Da: non si osserva alcuna formazione di micelle; b) The microfiltered broth is loaded corrected to pH = 6 and loaded onto a column of Diaion FPDA13 anionic resin, previously equilibrated with a buffer solution of 50 mM magnesium acetate at pH 6. The daptomycin binds entirely to the resin, while in the effluent a clear colored solution is removed. The resin is washed with demineralized water, then with a buffer solution of 50 mM magnesium acetate at pH 6; the effluent obtained from the column mainly contains impurities and is eliminated. The product is eluted from the resin using a solution of 50 mM magnesium acetate and magnesium sulfate from zero to 500 mM at pH 6, dividing the effluent into various fractions, then HPLC analysis is carried out as described above for each fraction. The fractions with adequate purity are combined, which are concentrated by nanofiltration, using polymeric membranes with a cut-off of about 500 Da: no formation of micelles is observed;

c) La soluzione di daptomicina viene caricata su una colonna di resina Diaion HP20ss, previamente condizionata in tampone ammonio acetato 50 mM a pH circa 6.3 ed impaccata a pressione in un contenitore a letto fisso. La soluzione in uscita dalla colonna durante il carico viene scartata, quindi si carica un volume di acqua demineralizzata pari al volume di resina, scartando la soluzione in uscita. Si eluisce il prodotto mediante una soluzione tampone ammonio acetato 50 mM pH 6 con quantità crescenti di isopropanolo, aumentando la concentrazione di solvente con gradualità lineare, passando dal 5% al 40% (in volume); la soluzione in uscita viene frazionata in porzioni pari a metà del volume di resina. Le frazioni vengono analizzate in HPLC e riunite o scartate in base al dato di purezza della daptomicina, in area % con il metodo sopra indicato; c) The daptomycin solution is loaded onto a column of Diaion HP20ss resin, previously conditioned in 50 mM ammonium acetate buffer at pH about 6.3 and pressure packed in a fixed bed container. The solution coming out of the column during loading is discarded, then a volume of demineralized water equal to the volume of resin is loaded, discarding the outgoing solution. The product is eluted by means of a 50 mM pH 6 ammonium acetate buffer solution with increasing quantities of isopropanol, increasing the solvent concentration gradually, passing from 5% to 40% (by volume); the solution at the outlet is fractionated into portions equal to half the volume of resin. The fractions are analyzed in HPLC and combined or discarded on the basis of the purity data of daptomycin, in area% with the method indicated above;

d) La soluzione purificata di daptomicina ottenuta come sopra viene diluita con uguale volume di acqua demineralizzata, quindi caricata su una colonna di resina Relisorb SP400 (Resindion) preventivamente condizionata a pH 3 con acido formico diluito. Si lava la resina con una soluzione di acido formico 0,1% diluito in acqua per iniettabili (WFI), utilizzando due volumi di soluzione per volume di resina; in questa fasi la perdita di prodotto nell’effluente è pressoché nulla. Si eluisce la daptomicina dalla resina utilizzando una soluzione acquosa di ammonio acetato 100 mM a pH 5, quindi si concentra mediante nanofiltrazione fino a ridurre il volume ad 1/5 del volume iniziale. Il concentrato viene dializzato con acqua WFI aggiungendola in continuo nel retentato in quantità pari al flusso di permeato. d) The purified daptomycin solution obtained as above is diluted with an equal volume of demineralized water, then loaded onto a column of Relisorb SP400 (Resindion) resin previously conditioned to pH 3 with diluted formic acid. The resin is washed with a 0.1% formic acid solution diluted in water for injection (WFI), using two volumes of solution per volume of resin; in these phases the loss of product in the effluent is practically nil. Daptomycin is eluted from the resin using an aqueous solution of 100 mM ammonium acetate at pH 5, then concentrated by nanofiltration until the volume is reduced to 1/5 of the initial volume. The concentrate is dialyzed with WFI water by adding it continuously to the retentate in an amount equal to the permeate flow.

La soluzione di daptomicina così ottenuta viene ulteriormente concentrata fino a raggiungere una concentrazione di 130 g/l, quindi sottoposta a liofilizzazione. Si ottiene daptomicina in polvere con purezza del 96% ed un contenuto di magnesio residuo inferiore a 10 ppm. The thus obtained daptomycin solution is further concentrated until it reaches a concentration of 130 g / l, then subjected to lyophilization. Powdered daptomycin is obtained with a purity of 96% and a residual magnesium content of less than 10 ppm.

Esempio 2 Example 2

Si effettua la fermentazione e la microfiltrazione di S. roseosporus come descritto nell’esempio 1: The fermentation and microfiltration of S. roseosporus is carried out as described in example 1:

a) Il brodo microfiltrato 1 viene corretto a pH=6 e caricato su una colonna di resina anionica Diaion FPDA13, previamente equilibrata con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH=6: la daptomicina si lega interamente alla resina, mentre nell’effluente si elimina una soluzione limpida colorata. Si lava la resina con acqua demineralizzata, quindi con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH=6; l’effluente ottenuto dalla colonna contiene prevalentemente impurezze e viene eliminato. Si eluisce il prodotto dalla resina utilizzando una soluzione di magnesio acetato 50 mM e alluminio solfato da zero a 300 mM a pH 6 suddividendo l’effluente in varie frazioni, quindi si effettua analisi HPLC come descritto sopra di ogni frazione, si riuniscono le frazioni con purezza adeguata, e si concentra per nanofiltrazione senza osservare la formazione di micelle; a) The microfiltered broth 1 is corrected to pH = 6 and loaded onto a column of Diaion FPDA13 anionic resin, previously equilibrated with a buffer solution of 50 mM magnesium acetate at pH = 6: daptomycin binds entirely to the resin, while in effluent a clear colored solution is removed. The resin is washed with demineralized water, then with a buffer solution of 50 mM magnesium acetate at pH = 6; the effluent obtained from the column mainly contains impurities and is eliminated. The product is eluted from the resin using a solution of 50 mM magnesium acetate and aluminum sulphate from zero to 300 mM at pH 6 by dividing the effluent into various fractions, then HPLC analysis is carried out as described above for each fraction, the fractions are combined with adequate purity, and is concentrated by nanofiltration without observing the formation of micelles;

b) La soluzione parzialmente purificata viene caricata su una colonna di resina Purolite PCG1200M, previamente condizionata in tampone ammonio acetato 50 mM a pH circa 6.3 ed impaccata a pressione in un contenitore a letto fisso. La soluzione in uscita dalla colonna durante il carico viene scartata, quindi si carica un volume di acqua demineralizzata pari al volume di resina, scartando le soluzione in uscita. Si eluisce il prodotto mediante una soluzione tampone ammonio acetato 50 mM pH 6 con quantità crescenti di etanolo, aumentando la concentrazione di solvente con gradualità lineare, passando dal 10% al 60% (in volume); la soluzione in uscita viene frazionata in porzioni pari a metà del volume di resina. Le frazioni vengono analizzate in HPLC e riunite o scartate in base al dato di purezza della daptomicina, in area % con il metodo sopra indicato. Si ottiene una soluzione acquosa contenente etanolo in cui la daptomicina è presente con purezza pari al 96% circa; b) The partially purified solution is loaded onto a column of Purolite PCG1200M resin, previously conditioned in 50 mM ammonium acetate buffer at pH about 6.3 and pressure packed in a fixed bed container. The solution coming out of the column during loading is discarded, then a volume of demineralized water equal to the volume of resin is loaded, discarding the outgoing solutions. The product is eluted by means of a 50 mM pH 6 ammonium acetate buffer solution with increasing quantities of ethanol, increasing the solvent concentration linearly, passing from 10% to 60% (by volume); the solution at the outlet is fractionated into portions equal to half the volume of resin. The fractions are analyzed in HPLC and combined or discarded on the basis of the purity data of daptomycin, in% area with the method indicated above. An aqueous solution containing ethanol is obtained in which daptomycin is present with a purity of approximately 96%;

c) La soluzione purificata di daptomicina viene diluita con uguale volume di acqua demineralizzata, quindi caricata su una colonna di resina Relisorb SP400 (Resindion) preventivamente condizionata a pH 3 con acido formico diluito. Si lava la resina con una soluzione di acido formico 0,1% diluito in acqua per iniettabili (WFI), utilizzando due volumi di soluzione per volume di resina; in questa fasi la perdita di prodotto nell’effluente è pressoché nulla. Si eluisce la daptomicina dalla resina utilizzando una soluzione acquosa di magnesio solfato 500 mM a pH 3, quindi si concentra mediante nanofiltrazione, si dializza e si liofilizza come descritto nell’esempio 1. c) The purified daptomycin solution is diluted with an equal volume of demineralized water, then loaded onto a column of Relisorb SP400 (Resindion) resin previously conditioned to pH 3 with diluted formic acid. The resin is washed with a 0.1% formic acid solution diluted in water for injection (WFI), using two volumes of solution per volume of resin; in these phases the loss of product in the effluent is practically nil. Daptomycin is eluted from the resin using an aqueous solution of 500 mM magnesium sulfate at pH 3, then concentrated by nanofiltration, dialyzed and lyophilized as described in example 1.

Si ottiene daptomicina in polvere con purezza superiore al 95%. Powdered daptomycin is obtained with purity higher than 95%.

Esempio 3 Example 3

a) La soluzione microfiltrata ottenuta nell’esempio 1 viene caricata in una colonna contenente resina cationica Amberlite1200H previamente equilibrata con tampone 50 mM sodio acetato pH 6; si osserva in uscita dalla colonna una soluzione di colore giallo, contenente circa la stessa concentrazione di daptomicina. Si eluisce ulteriormente la resina con lo stesso tampone, utilizzandone una quantità in volume pari al doppio del volume di resina; le soluzioni eluite vengono concentrate per ultrafiltrazione senza osservare la formazione di micelle. Si ottiene una soluzione decolorata con una resa pari al 95% in daptomicina; a) The microfiltered solution obtained in example 1 is loaded into a column containing Amberlite1200H cationic resin previously equilibrated with 50 mM sodium acetate buffer pH 6; a yellow solution is observed at the exit of the column, containing approximately the same concentration of daptomycin. The resin is further eluted with the same buffer, using an amount by volume equal to double the volume of resin; the eluted solutions are concentrated by ultrafiltration without observing the formation of micelles. A decolored solution is obtained with a yield equal to 95% of daptomycin;

b) La soluzione viene concentrata per nanofiltrazione, quindi acidificata a pH=3 con HCl e sottoposta ad estrazione con pari volume di n-butanolo: dopo separazione, la fase acquosa viene scartata. La fase organica viene estratta con una soluzione tampone 50 mM di ammonio acetato, aggiungendo ammoniaca per correggere il pH a 6; b) The solution is concentrated by nanofiltration, then acidified to pH = 3 with HCl and subjected to extraction with the same volume of n-butanol: after separation, the aqueous phase is discarded. The organic phase is extracted with a 50 mM ammonium acetate buffer solution, adding ammonia to correct the pH to 6;

c) La soluzione così ottenuta viene purificata per cromatografia su resina Relite Diaion HP20, eluendo con un gradiente lineare di etanolo da zero a 60%, a pH 6. Si selezionano le frazioni con purezza superiore al 85%, che vengono desolvatate con resina Relisorb SP400 come descritto nell’esempio precedente. Si dializza e si concentra per nanofiltrazione su membrane 500 Da. c) The solution thus obtained is purified by chromatography on Relite Diaion HP20 resin, eluting with a linear gradient of ethanol from zero to 60%, at pH 6. The fractions with purity higher than 85% are selected, which are desolvated with Relisorb resin SP400 as described in the previous example. It is dialyzed and concentrated by nanofiltration on 500 Da membranes.

Esempio 4 Example 4

Si opera come descritto nell’esempio 1 per la fermentazione e le fasi di purificazione a), b) e c). We operate as described in example 1 for fermentation and purification steps a), b) and c).

Le frazioni provenienti dalla cromatografia vengono riunite in base alla purezza, ottenendo complessivamente una soluzione a 5 g/l di daptomicina con purezza 96,7% (area %, HPLC); il contenuto di isopropanolo è di circa il 25%. Tale soluzione viene diluita con uguale volume di acqua e portata a pH 3. The fractions from chromatography are combined on the basis of purity, thus obtaining a 5 g / l solution of daptomycin with a purity of 96.7% (area%, HPLC); the isopropanol content is about 25%. This solution is diluted with an equal volume of water and brought to pH 3.

Si carica la soluzione su una colonna di resina Relisorb SP400 preventivamente condizionata a pH 2.8, fino ad un carico di 17,5 grammi di daptomicina per litro di resina. Si effettua un lavaggio con 4 volumi di una soluzione di sodio fosfato 50 mM a pH 2.8, quindi si eluisce il prodotto con una soluzione di sodio fosfato 50 mM a pH 6. The solution is loaded onto a column of Relisorb SP400 resin previously conditioned at pH 2.8, up to a load of 17.5 grams of daptomycin per liter of resin. A washing is carried out with 4 volumes of a 50 mM sodium phosphate solution at pH 2.8, then the product is eluted with a 50 mM sodium phosphate solution at pH 6.

Come si legge nella Tabella 1 sottostante, si ottiene un miglioramento della purezza complessiva della daptomicina, in particolare per l’impurezza CB131005 e per il beta-isomero, due sostanze a struttura polipeptidica particolarmente difficili da separare dalla daptomicina con le altre tecniche cromatografiche. Contemporaneamente, si ottiene una drastica diminuzione del contenuto di solvente residuo. As shown in Table 1 below, an improvement in the overall purity of daptomycin is obtained, in particular for the CB131005 impurity and for the beta-isomer, two substances with a polypeptide structure that are particularly difficult to separate from daptomycin with other chromatographic techniques. At the same time, a drastic decrease in the residual solvent content is obtained.

Tabella 1 Table 1

Daptomicina, beta-isomero e CB131005: valori % in area (HPLC, UV) Solvente: valori in % volume/volume (GC, FID) Daptomycin, beta-isomer and CB131005:% values in area (HPLC, UV) Solvent: values in% volume / volume (GC, FID)

Il colore della soluzione caricata in colonna è giallo-bruno, mentre il colore della soluzione risultante dopo colonna è giallo paglierino. The color of the solution loaded in the column is yellow-brown, while the color of the resulting solution after the column is straw yellow.

Esempio 5 Example 5

La fermentazione e la purificazione vengono condotti come descritto nell’esempio 1, con la differenza che nello stadio b) viene impiegato sodio cloruro. La soluzione risultante viene sottoposta a nanofiltrazione per concentrazione e dialisi, ottenendo una soluzione a 3,0 g/l di daptomicina con purezza 90,6%, di colore giallo-rossastro. Fermentation and purification are carried out as described in example 1, with the difference that sodium chloride is used in step b). The resulting solution is subjected to nanofiltration by concentration and dialysis, obtaining a solution at 3.0 g / l of daptomycin with purity 90.6%, of a reddish-yellow color.

La soluzione viene caricata su resina Relite SP400 preventivamente condizionata a pH 2,8, quindi si procede ad un lavaggio con 4 volumi di soluzione acquosa 30 mM di sodio fosfato a pH 2,8. The solution is loaded onto Relite SP400 resin previously conditioned at pH 2.8, then washed with 4 volumes of 30 mM aqueous solution of sodium phosphate at pH 2.8.

Si eluisce il prodotto con una soluzione 50 mM di sodio fosfato a pH 6, ottenendo una soluzione limpida di colore giallo con le caratteristiche indicate in Tabella 2. The product is eluted with a 50 mM sodium phosphate solution at pH 6, obtaining a clear yellow solution with the characteristics indicated in Table 2.

, , , ,,,

Tabella 2 Table 2

Esempio 6 Example 6

Si opera come descritto nell’esempio 9, ottenendo una soluzione di daptomicina con concentrazione 5 g/l e purezza 87%, di colore giallo-rosa. We operate as described in example 9, obtaining a solution of daptomycin with a concentration of 5 g / l and a purity of 87%, of a yellow-pink color.

Si utilizza la resina Relite SP400 preventivamente condizionata a pH 2,8, caricando la soluzione di daptomicina e lavando la resina con 4 volumi di soluzione di sodio fosfato 30 mM a pH 2,8. Relite SP400 resin is previously conditioned at pH 2.8, loading the daptomycin solution and washing the resin with 4 volumes of 30 mM sodium phosphate solution at pH 2.8.

Si eluisce con una soluzione di sodio fosfato 30 mM, sodio cloruro 500 mM, pH 2,8, ottenendo una soluzione giallina i cui risultati analitici sono riportati in Tabella 3. It is eluted with a solution of 30 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 2.8, obtaining a yellowish solution whose analytical results are reported in Table 3.

Tabella 3 Table 3

Claims (4)

RIVENDICAZIONI 1. Uso di una resina a scambio cationico per purificare soluzioni di daptomicina, in particolare per ridurre il contenuto in impurezza CB131005 e/o in beta-isomero. CLAIMS 1. Use of a cation exchange resin to purify daptomycin solutions, in particular to reduce the CB131005 impurity and / or beta-isomer content. 2. Uso di una resina a scambio cationico secondo la rivendicazione 1 per la contemporanea rimozione di solventi e di impurezze. 2. Use of a cation exchange resin according to claim 1 for the simultaneous removal of solvents and impurities. 3. Metodo di purificazione della daptomicina mediante l’uso di resine a scambio cationico. 3. Method of purification of daptomycin through the use of cation exchange resins. 4. Daptomicina ottenuta dal processo della rivendicazione 3. 4. Daptomycin obtained from the process of claim 3.