HU183675B - Process for the purification of oxytocin - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya új eljárás szintetikusan előállított nyers oxitocin tisztítására, amelynek során a nyers, adott esetben a szintézis utolsó kémiai művelete előtt már ioncserével tisztított, oxitocin oldatát kationcserélő gyantán — előnyösen gyengén savanyú, karboximetil-csoporttal módosított, térhálósított dextrán-gyantából — készített oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg 5 és 6 közötti, előnyösen 5,4 pH-értékű, 0,05—0,25 mol/1 — előnyösen 0,1 mol/I — koncentrációjú ammóniumacetát-oldattal egyensúlyba hoztuk, majd az oxitocint ugyanezen oldattal eluáljuk és kívánt esetben az oszlopot ugyanezzel az oldattal történő mosásai regeneráljuk. Az eljárás ipari méretekben is egyszerűen és igen jó hatásfokkal vitelezhető ki. -1-The present invention relates to a novel process for the purification of crude oxytocin produced synthetically, wherein the crude oxytocin solution, which has been purified by ion exchange prior to the last chemical process of synthesis, is applied on a cation-exchange resin, preferably a weakly acidic, carboxymethyl-modified cross-linked dextran resin. which has been equilibrated with a solution of ammonium acetate of from 0.05 to 0.25 mol / l, preferably 0.1 mol / l, previously at 5 to 6, preferably at pH 5.4, and then eluted with the same solution; if desired, the column is regenerated by washing with the same solution. The process can be carried out on an industrial scale simply and with great efficiency. -1-

Description

A találmány tárgya eljárás a szintetikus oxitoein tisztítására.The present invention relates to a process for the purification of synthetic oxytoin.

Az ember- és állatgyógyászatban egyaránt használatos oxitoein az agyalapi mirigy hátsó lebenyének hormonja. Az oxitoein élettani hatása a inch izomzatúnak összehúzása és a tejelválasztás serkentése, ennek megfelelően fő felhasználási területe a szülészet.Oxytoin, used in both human and veterinary medicine, is a hormone in the posterior pituitary gland. The physiological effect of oxytoin is to contract inch muscles and stimulate milk secretion, and accordingly its main use is in obstetrics.

Számos módszert dolgaztak ki a természetes oxitocin izolálására a kísérő vazopresszin, aminosavak, peptidek, egyéb hormonok és fehérjék mellől. Ezek a tisztítási és izolálási eljárások a következő típusokba sorolhatók: zónaelektroforézis különböző hordozókon, ioncserés kromatográfia, ellenáramú folyadékkromatográfia és gélszűrés. Ezek az eljárások azonban — kivétel nélkül — analitikai jellegűek, cs legfeljebb csak néhány milligramm oxitoein kinyerésére alkalmasak.Several methods have been devised to isolate natural oxytocin from accompanying vasopressin, amino acids, peptides, other hormones, and proteins. These purification and isolation procedures can be classified into the following types: zone electrophoresis on various supports, ion exchange chromatography, countercurrent liquid chromatography and gel filtration. However, these procedures are, without exception, analytical in nature and are only capable of yielding up to a few milligrams of oxytoin.

Az oxitoein tiszta állapotban való izolálása és szerkezetfelderítése után számos eljárást dolgoztak ki az oxitoein szintézisére. Mivel az oxitocint főként injekció formájában alkalmazzák, a szintézis végén kapott oxitocin-oldatból az oxitocint általában nem izolálják. Ebben az esetben a terméket biológiai aktivitásával jqllemzik. A teljesen tiszta oxitoein biológiai aktivitása izolált tengerimalac- vagy patkányméhen, tyúk vérnyomását csökkentő hatásán vagy frissen szült nyúl tejelválasztását fokozó hatásán mérve kb. 500 NE/mg. Ennek alapján a gyártás utolsó lépésében bemért védett nonapeptidamid mennyiségéből kiszámítható, hogy a nem tisztított oxitocinoldatok milyen tisztaságúak. Esetenként a szennyezések mennyisége eléri a 30—80%-ot is; e szennyezések, ha nem is mérgezőek, de allergiás reakciót kiválthatnak, így az ilyen termék minősége nem felel meg a korszerű gyógyszerkészítményekkel szemben támasztott egyre szigorúbb követelményeknek.Following the isolation and structural discovery of oxytoin in a pure state, a number of methods have been developed for the synthesis of oxytoin. Because oxytocin is mainly used for injection, oxytocin is not usually isolated from the oxytocin solution obtained at the end of the synthesis. In this case, the product is characterized by its biological activity. The biological activity of completely pure oxytoin is measured in isolated guinea-pig or rat uterus, as measured by the antihypertensive effect of the hen, or by the milk secretion effect of the freshly rabbit, ca. 500 IU / mg. Based on this, the purity of the unpurified oxytocin solutions can be calculated from the amount of protected nonapeptidamide measured in the final step of the preparation. Occasionally, contamination amounts to 30-80%; these contaminants, although not toxic, can cause an allergic reaction, so the quality of such a product does not meet the increasingly stringent requirements of modern pharmaceuticals.

A természetes oxitoein izolálásakor az oxitocint aminosavaktól, peptidektől és fehérjéktől kell elválasztani, így jelentős tisztulást lehet elérni már egyszeri molekulasúly szerinti frakcionálással is. A szintetikus oxitocint viszont dimerek, oligomerek, sérült és töredékmolekulák szennyezik, amelyek a szintézis, a védőcsoport-eltávolítás vagy az oxidáció során képződnek. E szennyezők fizikai-kémiai és kémiai sajátságai jelentősen eltérnek a természetes hormont kísérő anyagokétól, így a szintetikus oxitoein tisztításakor a molekulasúly szerinti frakcionálástól alig várható jó eredmény.In the isolation of natural oxytoin, oxytocin has to be separated from amino acids, peptides and proteins, so significant purification can be achieved even by a single molecular weight fractionation. Synthetic oxytocin, on the other hand, is contaminated by dimers, oligomers, damaged and fragmented molecules that are formed during synthesis, deprotection or oxidation. The physico-chemical and chemical properties of these impurities are significantly different from those of the natural hormone, so that purification of synthetic oxytoin by molecular weight fractionation is unlikely.

A szintetikus oxitoein tisztítására kidolgozott eljárásokat a következő fő csoportokba lehet osztani:The procedures developed for the purification of synthetic oxytoin can be divided into the following main groups:

1. ellenáramú megoszlásos folyadékkromatográfia: Photaki, I., J. Am. Chem. Soc. 88, 2292 (1966); Guttmann, S., Helv. Chim. Acta 49, 83 (1966); Bodanszky, M. és du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. 81, 2504 (1959),1. Countercurrent Partition Liquid Chromatography: Photaki, I, J. Am. Chem. Soc., 88, 2292 (1966); Guttmann, S., Helv. Chim. Acta 49, 83 (1966); Bodanszky, M. and du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc., 81, 2504 (1959),

2. megoszlási kromatográfia Sephadex G-25 gyantán: Yamashiro, D., Natúré 207, 76 (1964); Glass, J. D. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 96, 6476 (1974),2. Partition Chromatography on Sephadex G-25: Yamashiro, D., Natura 207, 76 (1964); Glass, J.D. et al., J. Am. Chem. Soc. 96, 6476 (1974),

3. gélszűrés Sephadex G-15 cs G-25 gyantán: Manning, M. és munkatársai, J. Chromat. 38, 396 (1968); Fujino, M. és munkatársai, 2728462 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás és Chem. Pharm. Bull. 26, 1576 (1978): Hughes, J. L. és munkatársai, 4212795 számú amerikai egyesült államok2 beli szabadalmi leírás és 2647 843 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás; Mühlemann, M. és munkatársai, Helv. Chim, Acta 55, 2854 (1972),3. Gel filtration on Sephadex G-15 cs G-25 resin: Manning, M. et al., J. Chromat. 38, 396 (1968); Fujino, M. et al., German Patent Specification 2728462 and Chem. Pharm. Bull. 26, 1576 (1978) to Hughes, J.L. et al., U.S. Patent No. 4,212,7952, and U.S. Patent No. 2,647,843; Mühlemann, M., et al., Helv. Chim, Acta 55, 2854 (1972),

4. az előzőekben emh'tett módszerek kombinációjával: Meinhofer, J. A., 3 960828 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Live, D. H. és munkatársai, J. Org. Chem. 42, 3556 (1977), valamint4. a combination of the above methods: Meinhofer, J.A., U.S. Patent No. 3,960,828; Live, D.H., et al., J. Org. Chem. 42, 3556 (1977);

IC 5. adszorpciós kromatográfia szilikagélen: 6 918030 számú holland szabadalmi leírás; Fleuret, G. és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés. 13, 137 (1979); Milkowski, J. D. és munkatársai, 4038 306 számú amerikai egyesült államokbeli szaba16 dalmi leírás.IC 5 adsorption chromatography on silica gel: Dutch Patent 6 918030; Fleuret, G., et al., Int. J. Peptide Protein Res. 13, 137 (1979); Milkowski, J.D., et al., U.S. Patent 4,038,306.

Ezek az eljárások általában oldószer- és időigényesek. A tisztítandó anyagmennyiségre számított fajlagos oldószer- és/vagy géligényük nagy, ezért nem alkalmasak nagyításra, ipari méretű megvalósításra. A 20 felsorolt módszerekkel csak néhány száz milligramm nyerstermék tisztítását írták le. Az egyetlen kivétel a Fleuret és munkatársai által kidolgozott adszorpciós oszlopkromatográfia szilikagélen, amellyel már 2,8 g oxitoein nyersterméket is tisztítottak, de ez az eljárás 25 nem alkalmas ipari méretű tisztításra nagy oldószerigénye és költségessége miatt.These processes are generally solvent and time consuming. They have a high specific solvent and / or gel requirement based on the amount of material to be cleaned and are therefore not suitable for enlarging on an industrial scale. With the 20 methods listed, purification of only a few hundred milligrams of crude product has been described. The only exception is Fleuret et al. Adsorption column chromatography on silica gel, which has already purified 2.8 g of crude oxytoin, but this process is not suitable for industrial scale purification due to its high solvent requirement and cost.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a nyers szintetikus oxitoein tisztítására eddig nem alkalmazott egyensúlyi'ioncserés kromatográfia előnyösen és jó ered30 ménnyel alkalmazható az ilyen termék ipari méretű tisztítására, mivel gyorsan és egyszerűen kivitelezhető a gyógyszeriparban általánosan alkalmazott készülékekben, kromatográfiás oszlopokban, és lehetőség van a gyártás méretének növelésére. Az ioncserés tisz35 tításhoz nincs szükség szerves oldószerre, így a munkavégzés során nincs balesetveszély és egészségi ártalom. Az egyensúlyi ioncserés kromaíográfiát erre alkalmas erős vagy gyenge kationcserélő gyantákon végezhetjük, előnyösen nagy elválasztóképességű és 40 nagy terhelhetőségű kationcserélő gyantákat, különösen karboximetil-Sephadex C-25 gyantát alkalmazhatunk erre a célra. Karboximetil-Sephadex C-25 gyanta használata esetén különös előnyt jelent a gyanta kivételesen nagy elválasztóképessége és terhelhetősége, va45 lamint az egyensúlyi ioncserés kromatográfiára való előnyös alkalmazhatósága. A nagy terhelhetőség azt jelenti, hogy a tisztításnak — szemben az eddig alkalmazott eljárásokkal — kicsi a fajlagos gyantaszükségIctc a gyanta kitűnő elválasztóképessege miatt. Az 50 egyensúlyi ioncserés kromatográfia alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy az ehtció során a gyantaágy térfogata állandó. Mivel a gyanta regenerálására az elucióra alkalmazott oldatot lehet használni, az egyes tisztítások után a gyantát nem kell eltávolítani az osz55 lopból, és a regenerálást követően azonnal megvalósítható egy újabb tisztítás. Az egyensúlyi ioncserélő kromatográfiát 5 és 6 közötti, előnyösen 5,4 körüli pH-értékű ammónium-acetát-pufferoldat alkalmazásával végezzük, aminek további előnye, hogy az am60 mónium-acetát a kívánt mértékig eltávolítható a tiszta oxitoein mellől a liofilizáláskor.Surprisingly, it has now been found that equilibrium ion exchange chromatography, which has not been used to purify crude synthetic oxytoin, has been advantageously and successfully used to purify such a product on an industrial scale, because it can be quickly and easily carried out in equipment commonly used in the pharmaceutical industry. size. Ion-exchange cleaning requires no organic solvent, so there is no risk of accident or damage to health during work. Equilibrium ion exchange chromatography may be carried out on suitable strong or weak cation exchange resins, preferably high resolution and 40 high load cation exchange resins, in particular carboxymethyl-Sephadex C-25 resin. The use of carboxymethyl-Sephadex C-25 resin is particularly advantageous because of its exceptionally high resolution and loadability and its advantageous application to equilibrium ion-exchange chromatography. The high load-carrying capacity means that the specific resin requirement Ictc is low because of the excellent resin resolvability, in contrast to the processes used to date. The use of equilibrium ion exchange chromatography 50 has the advantage that the volume of the resin bed is constant during the passage. Because the elution solution can be used to regenerate the resin, it is not necessary to remove the resin from the stool after each purification and another purification can be carried out immediately after regeneration. Equilibrium ion-exchange chromatography is carried out using ammonium acetate buffer solution having a pH of 5 to 6, preferably about 5.4, which further has the advantage that am60 ammonium acetate can be removed to the desired extent from the pure oxytoin upon lyophilization.

A találmány tehát oly eljárás szintetikusan előállított oxitoein tisztítására, amelynek során a nyers oxitocin-oldatot kationcserélő gyantából — előnyösen 55 gyengén savanyú, karboximetil-csoporttal módost-2183 675 tott, térhálósított dextrán-gyantából — készített oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg 5 és 6 közötti, előnyösen 5,4 pH-értékű, 0,05—0,25 mol/1 — előnyösen 0,1 mol/1 — koncentrációjú ammóniumacetát-oldattal egyensúlyba hoztunk, majd az oxitocint ugyanezen oldattal eluáljuk és kívánt esetben az oszlopot ugyanezzel az oldattal történő mosással regeneráljuk.The invention thus provides a process for the purification of synthetically produced oxytoin by applying a crude oxytocin solution to a column of cation exchange resin, preferably 558,675,675 crosslinked dextran resins, preferably weakly acidic with carboxymethyl group. ammonium acetate, preferably pH 5.4, 0.05-0.25 mol / l, preferably 0.1 mol / l, the oxytocin is eluted with the same solution and, if desired, the column is treated with the same solution. regenerated by washing.

A találmány szerinti eljárásunkkal tisztított oxitocin tisztasága megfelel a korszerű gyógyszerkészítményekkel szemben támasztott legszigorúbb követelményeknek. A tisztítás végén kapott oldatból hígítással közvetlenül injekciós készítmények gyárthatók. Szükség esetén az oldatból bepárlással és Iiofilizálással korlátlan ideig tárolható, stabilis por készíthető. Ha az oldathoz az oxitocin mennyiségére számított sztöchiometrikus mennyiségű szerves savat adunk, úgy a bepárlás a liofilizálás után az oxitocin citrát, maleinát, tartarát vagy egyéb alkalmas szerves só alakjában nyerhető ki.The purity of the oxytocin purified by the process of the present invention meets the most stringent requirements for advanced pharmaceutical formulations. The solution obtained at the end of the purification can be prepared directly by dilution for injection. If necessary, the solution can be reconstituted and lyophilized to form a stable powder which can be stored indefinitely. If a stoichiometric amount of organic acid based on the amount of oxytocin is added to the solution, the evaporation may be carried out after lyophilization to form oxytocin in the form of citrate, maleinate, tartrate or other suitable organic salt.

A karboximetil-Sephadex gyantán végzett egyensúlyi ioncserés kromatográfia különleges előnyei azért meglepőek, mivel az igen hasonló szerkezetű karboximetil-cellulózokkal (Whatman 23 és 52) cs az erős kationcserélő SE- és SP-Sephadexekkel — bár ezek is alkalmasak az ioncserés tisztításra — megközelítőleg sem sikerült ilyen jó elválasztást elérni, még sokkal kisebb terhelés esetén sem, és ezen a gradiens elució alkalmazása sem változtatott.The particular advantages of equilibrium ion-exchange chromatography on carboxymethyl-Sephadex resin are surprising, since the carboxymethyl-celluloses (Whatman 23 and 52), which are very similar in structure to the strong cation-exchange SE- and SP-Sephadexes, although suitable for ion-exchange purification, to achieve such a good separation, even at much lower load, and the application of gradient elution did not change that.

A találmány szerinti eljárás alkalmazható bármely ismert módszerrel szintetikusan előállított oxitocin tisztítására. Az ismert oxitocin-szintézisek utolsó lépései rendszerint a nonapeptidlánc felépítése során kapott Z-Cys (Bzl)-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys (Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH₂ védett nonapeptid védőcsoportjainak lehasításából és az így kapott szabad oxitocein oxidatív gyűrűzárásából állnak; a védőcsoportok lehasítása ismert módon, cseppfolyós ammóniában oldott nátriummal történhet. Amennyiben a találmány szerinti eljárást ezzel az ismert oxitocin-szintézismóddal kapcsolatban alkalmazzuk, akkor előnyös, ha már a védőcsoportok lehasítása után, tehát az oxidatív gyűrűzárás előtt is beiktatunk egy kationcserélő gyantán végzett egyszeri tisztítási műveletet. Kationcserélő gyantaként ebben a tisztítási lépésben előnyösen H⁺ciklusú CM-Sephadex gyantát alkalmazunk. Ebben az esetben tehát oly módon járunk el, hogy a védett nonapeptid védőcsoportjait előnyösen cseppfolyós ammóniuában oldott nátriummal való redukció útján lehasítjuk, majd az ammónia elpárologtatása után a maradékot ionmentes vízben oldjuk és az oldat kémhatását CM-Sephadex C-25 (H⁺-ciklusú) gyantával pH 8—9-re állítjuk. A gyanta kiszűrése után az oldatot ionmentes vízzel hígítjuk, majd kémhatását ecetsavval 6,5-6,7 pH-értékre állítjuk be és a szokásos módon hidrogén-peroxid jelenlétében levegóátbuborékoltatással az oxidációt lefolytatjuk (151959 számú magyar szabadalmi leírás). A kapott oxitocinoldatot azután vákuumban betöményítjük, kémhatását pH 5,4-re állítjuk, majd felvisszük egy CM-Sephadex C-25 gyantából készített oszlopra, amelyet előzőleg egyensúlyba hoztunk pH 5,4-es, 0,1 mol/1 koncentrációjú ammónium-acetát-oldattal. Az eluciót ugyanezzel az eluennsel végezzük, az átfolyó oldat elnyelését 280 nm hullámhosszon követjük, és a tiszta frakciókat az elnyelési görbe alapján gyűjtjük össze.The process of the invention can be used to purify synthesized oxytocin by any known method. The final steps of the known oxytocin syntheses are usually the deprotection of the protected nonapeptide Z-Cys (Bzl) -Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys (Bzl) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ resulting in the formation of the nonapeptide chain and the resulting free consist of the oxidative ring closure of oxytocin; the deprotection may be effected in a manner known per se with sodium dissolved in liquid ammonia. If the process of the present invention is used in conjunction with this known oxytocin synthesis route, it is advantageous to carry out a single purification operation on the cation exchange resin even after deprotection, i.e., oxidative ring closure. Cation exchange resin in the purification step is preferably H ⁺ cycle CM-Sephadex. In this case, the protecting groups of the protected nonapeptide are preferably cleaved by reduction with sodium dissolved in liquid ammonia, and after the ammonia has been evaporated, the residue is dissolved in deionized water and the solution is treated with CM-Sephadex C-25 (H ⁺ -cycle). resin to pH 8-9. After filtration of the resin, the solution was diluted with deionized water, adjusted to pH 6.5-6.7 with acetic acid, and oxidation was carried out by air bubbling in the usual manner in the presence of hydrogen peroxide (U.S. Patent No. 151959). The resulting oxytocin solution is then concentrated in vacuo, adjusted to pH 5.4, and applied to a column of CM-Sephadex C-25 resin, previously equilibrated with pH 5.4, 0.1 M ammonium acetate -oldattal. Elution is carried out with the same eluent, the absorbance of the flow solution is monitored at 280 nm, and the pure fractions are collected on the basis of the absorbance curve.

Az így kapott tiszta oxitocinoldat felhasználható közvetlenül koncentrált oldatként, hígítható injekciós készítmények gyártásához vagy bepárlás és liofilizálás után por formájában korlátlan ideig tárolható.The resulting pure oxytocin solution can be used directly as a concentrated solution, for the preparation of dilute injection formulations or, after concentration and lyophilization, may be stored as a powder for an unlimited period.

Az ioncserés tisztítás során az oszlopra felvitt oxitocin biológiai aktivitásban kifejezett összmennyiségének 90%-a nyerhető vissza. A liofilizált oxitocin peptidtartalma 80—90% (a tirozintartalom spektrofotometriás mérése alapján). Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a termék legfeljebb 3% egyéb peptid-típusú szennyezést tartalmaz az oxitocin mellett. A termék pepiiden kívül vizet és ammónium-acetátot tartalmaz.During ion exchange purification, 90% of the total amount of oxytocin on the column expressed in biological activity can be recovered. The peptide content of the lyophilized oxytocin is 80-90% (based on the spectrophotometric measurement of the tyrosine content). According to HPLC, the product contains up to 3% other peptide-type impurities besides oxytocin. In addition to the peptide, the product contains water and ammonium acetate.

A találmány szerinti eljárással tisztított oxitocin a szokásos gyógyszerkészítmények alakjában kerülhet gyógyászati felhasználásra. Az ilyen gyógyszerkészítmények az oxitocint enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szerves vagy szervetlen vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilízátuinok, mikoris vivőanyagként a peptiddel nem reagáló vegyületek, például mannit, tejcukor, keményítő jöhetnek számításba, lehetnek továbbá oldatok és szuszpenziók, amelyek különböző semleges tartósító cs stabailizáló segédanyagokat is tartalmaznak. Előnyösek azok a gyógyszerkészítmények, amelyek az oxitocint komplex alakjában tartalmazzák, mivel ez elhúzódó hatást nyújt a készítménynek.The oxytocin purified by the process of the present invention may be used in the form of standard pharmaceutical compositions. Such pharmaceutical compositions contain oxytocin in an organic or inorganic carrier suitable for enteral or parenteral administration. Thus, the pharmaceutical compositions may be solid lyophilisates, such as, for example, non-peptide-reactive compounds such as mannitol, milk sugar, starch, and solutions and suspensions containing various neutral preservative adjuvants. Pharmaceutical compositions containing oxytocin in a complex form are preferred because they provide a sustained action.

A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példa szemlélteti.A practical embodiment of the process of the invention is illustrated by the following example.

A példában a peptidszármazék jelölésére használt rövidítések az IUPAC-IUB által ajánlottak [J. Bioi. Chem. 247, 977 1972]. Az aminosavak mind L-antipódok. Egyéb rövidítések: Z = N-benziloxikarbonil, Bzl = S-benzil.Abbreviations used in this example to denote a peptide derivative are recommended by IUPAC-IUB [J. Biol. Chem. 247, 977 1972]. All amino acids are L-antipodes. Other abbreviations: Z = N-benzyloxycarbonyl, Bzl = S-benzyl.

A fajlagos optikai forgatóképesség mérése Perkin Elmer 141 számkijelzésű fotoelektromos polariméteren történt. Az oxitocin tirozintartalmának meghatározását 0,1 mol/l-es nátrium-hidroxid-oldatban végeztük 294 nm hullámhosszon, Pye-Unicam SP 1800 UV-spektrofotométerrel. A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Hewlett-Packard 1081 A típusú, Schöffel 770 változtatható hullámhosszú detektorral, Roadyne 7010 loop-injektorral és KUTESZ 185 típusú kétcsatornás írószerkezettel ellátott berendezésben végeztük. Az elválasztáshoz Nucleosil 10 Cu (Chrom pack Β. V.) 250 mm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet használtunk. Az elválasztást A:B = 2:3 eleggyel végeztük (A = metanol :acetonitril = 5:1; B = pH 2,2-es Mcllvain pufferoldat tízszerezésre hígítva, és nátrium-szulfáttal 0,1 mol/1 koncentrációjúra állítva). 500 ;tl oxitocinoldatot fecskendeztünk a rendszerbe, és a mérést 1 ml/perc áramlási sebességgel végeztük, 210 nm-en detektálva az oldat elnyelését. Értékelésre a külső standard módszert használtuk. Standardként olyan többszörösen tisztított oxitocint használtunk, amelynek biológiai aktivitását előzőleg meghatároztuk.Specific optical rotation was measured on a Perkin Elmer 141-digit photoelectric polarimeter. Oxytocin tyrosine content was determined in 0.1 M sodium hydroxide solution at 294 nm using a Pye-Unicam SP 1800 UV spectrophotometer. HPLC measurements were performed on a Hewlett-Packard 1081 A type Schöffel 770 variable wavelength detector, a Roadyne 7010 loop injector and a KUTESZ 185 dual channel recorder. Nucleosil 10 Cu (Chrom pack Β. V.) 250 mm long, 4.6 mm internal diameter was used for separation. Separation was carried out with A: B = 2: 3 (A = methanol: acetonitrile = 5: 1; B = pH 2.2 Mcllvain buffer diluted ten-fold and adjusted to 0.1 M sodium sulfate). 500 µl of oxytocin solution was injected into the system and the measurement was carried out at a flow rate of 1 ml / min and the absorbance of the solution was detected at 210 nm. The external standard method was used for evaluation. Multiple purified oxytocin was used as a standard whose biological activity was previously determined.

Az alábbi példában a találmány szerinti tisztítási eljárást a 151959 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett oxitocin-szintézissel kapcsolatban ismertetjük, megjegyezzük azonban a példa b) szakaszában leírt tisztítási eljárás bármely más úton előállított nyers oxitocinoldattal ugyanígy lefolytatható.In the following example, the purification process of the present invention is described in connection with the oxytocin synthesis described in Hungarian Patent No. 151959, but it is noted that the purification procedure described in part b) of the example can be carried out in the same manner with crude oxytocin solution.

-3183 675-3183 675

PéldaExample

a) 150 g (113 mmol) Z-Cys(Bzl)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-GIy-NH₂-ot ismert módon redukálunk fémnátriummal cseppfolyós ammóniában. Az ammónia elpárologtatása után a maradékot 20 1 ionmentes vízben oldjuk, és az oldatot kb. 500 g H⁺-ciklusú Sephadex C-25 (Pharmacia) gyantával ioncseréljük pH 8-9-re. A gyanta kiszűrése után a szürletet 120 1-rc hígítjuk ionmentes vízzel, kémhatását ecetsavval pH 6,5—6,7-re állítjuk, majd hidrogén-peroxid jelenlétében a szokásos módon (151959 számú magyar szabadalmi leírás) végezzük az oxidációt levegőátbuborékoltatással. Az így kapott nyers oxitocin oldat összesen 35—36 millió NE oxitocint tartalmaz biológiai értékmérés alapján.a) Z-Cys (Bzl) -Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys (Bzl) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ (150 g, 113 mmol) is reduced in a known manner with sodium metal in liquid ammonia. After evaporation of the ammonia, the residue is dissolved in 20 L of deionized water and the solution is stirred for ca. 500 g of H ⁺ -cyclic Sephadex C-25 (Pharmacia) resin was ion exchanged to pH 8-9. After filtration of the resin, the filtrate was diluted with 120 L of deionized water, adjusted to pH 6.5-6.7 with acetic acid, and then oxidized by air bubbling in the usual manner (U.S. Patent No. 151959) in the presence of hydrogen peroxide. The resulting crude oxytocin solution contains a total of 35-36 million IU oxytocin based on bioassay.

b) A nyers oxitocinoldatot vákuumban 40 °C hőmérsékletű vízfürdőn 2,0-2,5 1-re betöményítjük, kémhatását ecetsavval pH 5,4-re állítjuk, majd a nem oldódó csapadékot szűréssel eltávolítjuk és a szürletet az alábbi módon elkészített oszlopra visszük.b) Concentrate the crude oxytocin solution in vacuo in a water bath at 40 ° C to 2.0-2.5 L, adjust the pH to 5.4 with acetic acid, remove the insoluble precipitate by filtration and apply the filtrate to a column prepared as follows.

3,6 kg H⁺-ciklusú CM-Sephadcx C-25 gyantát 48 órán keresztül 0,1 mol/l koncentrációjú, 5,4 pH-értékű ammónium-acetát-oldatban duzzasztunk. A szuszpenziót betőltjük egy 215 mm átmérőjű, 1000 mm hosszú K 215/100 Pharmacia oszlopba, és a tölteten 2 órán keresztül a fenti pufferoidatot áramoltatjuk Braun und Lübbe (Salzburg) N-SM 31 típusú szabályozható sebességű adagolószivattyúval.3.6 kg H ⁺ -ciklusú CM-Sephadex C-25 resin was swelled with 0.1 mol / l, pH 5.4 ammonium acetate solution for 48 hours. The slurry was loaded onto a 215 mm diameter 1000 mm long K 215/100 Pharmacia column and the above buffer solution was flushed with a N-SM 31 variable speed metering pump from Braun und Lübbe (Salzburg) for 2 hours.

Az így egyensúlyba hozott oszlopra felvisszük a fenti oxitocinoldatot, és az eluciót 20 órán keresztül végezzük a fenti pufferoldattal 3,6 1/óra áramlási sebességgel. Az oldat elnyelését 280 nm-en detektáljuk LKB Uvicord II típusú átfolyásos küvettás fotométeren. A 15 perces időközökben szedett frakciókból az elnyelési görbe alapján gyűjtjük össze a tiszta oxitocint tartalmazókat.. Ezeket homogenizáljuk, majd vagy oldatként használjuk fel a kapott alakban, vagy hígítás után injekciós készítmények gyártására alkalmazzuk őket, vagy pedig liofilizálva port készítünk belőlük. Ha a liofilízálás előtt számított mennyiségű szerves savat adunk az oldathoz, úgy a liofilizált oxitocint a megfelelő só alakjában kapjuk.The above equilibrated column is loaded with the above oxytocin solution and eluted for 20 hours with the above buffer solution at a flow rate of 3.6 L / h. Absorption of the solution was detected at 280 nm on a LKB Uvicord Type II flow cuvette photometer. From the fractions collected at 15 minute intervals, the pure oxytocin-containing fractions are collected on the basis of the absorbance curve. They are homogenized and either used as a solution in the form obtained, or after dilution for preparation of injectables or lyophilized to form a powder. Addition of calculated amounts of organic acid prior to lyophilization results in lyophilized oxytocin in the form of the corresponding salt.

A fenti mennyiségű nyers szintetikus oxitocinból a tisztítás során összesen 32 millió NE oxitocint kapunk. Ebből liofilizálással 71—80 g (400—450 i0 NE/mg) légszáraz oxitocin állítható elő, amelynek peptidtartalma 80—90% (a tirozintartalom spektrofotometriás meghatározása alapján). A többi viz és ammónium-acetát, amelyek mennyiségét gázkromatográfiásán lehet meghatározni, az utóbbit ecetsav 15 alakjában. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a liofilizátum legfeljebb 3% egyéb peptidet tartalmaz az oxitocin mellett. A termék fajlagos forgatóképessége a peptidtartalomtól függően (or]t)⁴ = —24,6—27,2° (c = 0,49, 1 mol/l ecetsav), amiPurification of the above amount of crude synthetic oxytocin yields a total of 32 million IU oxytocin. From this lyophilization yields 71-80 g (400-450 IU / mg) air-dry oxytocin with a peptide content of 80-90% (as determined by spectrophotometric determination of the tyrosine content). The remaining water and ammonium acetate, the amount of which can be determined by gas chromatography, are in the form of acetic acid. According to HPLC analysis, the lyophilisate contains up to 3% other peptides besides oxytocin. The specific rotation of the product depending peptidtartalomtól (or] t) ⁴ = -24,6-27,2 ° (c = 0.49, 1 mole / l acetic acid), which

2° jól megegyezik az irodalmi adatokkal.2 ° agrees well with literature data.

Claims (1)

Szabadalmi igénypontA patent claim Eljárás szintetikusan előállított nyers oxitocin tisztítására, azzal jellemezve, hogy a szintézis utolsó kémiai művelete előtt már ioncserével tisztított oxitocin oldatát kationcserélő gyantából — előnyösen gyengén 30 savanyú, karboximetil-csoporttal módosított, térhálósított dextrán-gyantából — készített oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg 5 és 6 közötti, előnyösen 4,4 pH-értékű, 0,05—0,25 mol/l — előnyösen 0,1 mol/l — koncentrációjú ammóniumacetát-oldattal 35 egyensúlyba hoztunk, majd az oxitocint ugyanezen oldattal eluáljuk és kívánt esetben az oszlopot ugyanezzel az oldattal történő mosással regeneráljuk.A process for the purification of synthetically produced crude oxytocin, characterized in that, prior to the final chemical step of the synthesis, a solution of oxytocin, which has already been ion-exchanged, is recycled onto a column of of ammonium acetate, preferably pH 4.4, 0.05-0.25 mol / l, preferably 0.1 mol / l, and then elute the oxytocin with the same solution and, if desired, the column with the same solution. solution. ábra nincsno figure