IT201600079328A1 - Metodo migliorato per la decontaminazione di materiale biologico mediante partizione e inattivazione - Google Patents
Metodo migliorato per la decontaminazione di materiale biologico mediante partizione e inattivazioneInfo
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Description
DESCRIZIONE
Campo delTinvenzione
L’attuale invenzione si riferisce al campo della decontaminazione di materiali biologici. Si descrive un nuovo procedimento per l’inattivazione di materiali biologici, in particolare di natura virale, batterica o prionica, basato sui principi di partizione e inattivazione.
Stato della tecnica
E’ ben noto che la decontaminazione, in particolare dal virus e batteri o prioni, rappresenta un problema principale per la disinfezione dei materiali biologici. Questo problema sorge particolarmente, ma non esclusivamente, nei passaggi finali dei processi industriali di purificazione di molecole target provenienti da sangue, urina o mezzi di cultura. Infatti, la suscettibilità delle molecole target di origine biologica ai trattamenti chimici o fisici in generale non permette l’uso di procedure di disinfezione spinte, a causa del rischio di danneggiare la molecola target oppure di ridurne l’attività a livelli molto bassi. In particolare è risaputo che l’infezione da virus senza involucro ( non -enveloped) e da prioni rappresenta un problema di difficile soluzione. Nel caso di contaminanti virali, sono disponibili diverse procedure di decontaminazione: queste sono tipicamente differenziate tra procedure di inattivazione o partizione. Esempi di procedure di inattivazione virale sono i trattamenti termici (ad esempio pastorizzazione, liofilizzazione, utilizzo di calore secco), utilizzo di solventi con funzione di detergenti, e trattamento a pH fortemente acido o basico. Esempi di procedure di partizione virale sono i processi di precipitazione (ad esempio in etanolo, polietilene glicol), cromatografia (scambio ionico, affinità, interazione idrofobica, fase inversa) e nanofiltrazione.
Appropriati studi di validazione devono essere condotti per dimostrare efficacia di decontaminazione ottenuta da una procedura di purificazione: questi studi richiedono raggiunta al materiale, all’inizio della procedura, di un quantità nota di agente infettivo (cosiddetto “ spiking ”) ed il rilevamento della presenza di quantità residuali dello stesso agente al termine della procedura; la quantità di agente infettivo aggiunto viene misurata come logaritmo in base 10 e l’efficacia di purificazione viene espressa come numero di riduzione logaritmico per il patogeno. Idealmente, a scopo regolatorio, una procedura di purificazione dovrebbe mostrare un’ efficacia di decontaminazione virale di almeno 12-15 Log. Tale efficacia dovrebbe essere basata su almeno passaggi di purificazione basati su diversi principi. Tuttavia, in diversi processi di purificazione, è difficile ottenere un tale risultato a causa della limitata applicabilità delle suddette procedure su scala industriale o della loro aggressività verso il materiale target.
Ancor più difficile è eliminare la contaminazione prionica, molto meno documentata e recentemente causa di grandi preoccupazioni concernenti la biosicurezza. In effetti, a causa della loro natura e dimensione ridotta, i prioni sfuggono a molti processi di partizione efficaci sui virus, e la loro inattivazione è molto difficile da ottenere. L’esposizione a soluzioni altamente alcaline e la denaturazione indotta da urea sono tra le procedure note per indurre una sostanziale inattivazione dei prioni. Tali procedure risultano purtroppo spesso dannose per il materiale target e sono di difficile applicabilità a livello industriale.
La domanda di brevetto EP-A-1 593 688 descrive una procedura combinata di partizione e inattivazione di materiale biologico: in una provetta per ultracentrifuga si stratificano soluzioni a densità decrescente: urea ad alta densità (fase inferiore inattivante), saccarosio (fase intermedia o “cuscinetto”) e soluzione di materiale biologico da purificare (fase superiore); la provetta viene centrifugata, il materiale contaminante particolato, presente nella · fase superiore, passa attraverso la fase intermedia e raggiunge la fase inferiore dove viene inattivato; la fase superiore così decontaminata viene infine recuperata come surnatante di centrifugazione. Questa procedura presenta il vantaggio di associare tra loro due diversi metodi di decontaminazione (partizione e inattivazione); tuttavia essa è risultata di difficile applicazione pratica e limitata efficacia, soprattutto su scala industriale: infatti il sistema liquido a tre strati composti da soluzioni acquose miscibili separate solo per differenza di densità è alquanto instabile, essendo difficile da realizzare e mantenere e restando facilmente perturbabile a seguito di leggera manipolazione della provetta; ove sviluppato su scala industriale, comporta un elevato scarto di provette con stratificazione insoddisfacente, o in alternativa il riempimento deve essere eseguito molto lentamente ed anche le condizioni di accelerazione e decelerazione del processo di centrifugazione devono essere scelte con cautela per evitare di perturbare la stratificazione.
Viceversa, un’ eliminazione completa dello strato intermedio potrebbe darebbe luogo ad un sistema bi-strato più semplice, con due soluzioni maggiormente differenziabili tra loro in quanto a densità, migliorando globalmente la stabilità del sistema; tuttavia in questo caso si esporrebbe il materiale biologico al contatto diretto con la soluzione denaturante, così che l’eventuale aumento di resa legato alla maggiore stabilità del sistema bi-strato potrebbe essere compromesso da una riduzione indesiderata di attività del materiale biologico.
Infine, la ricerca di fasi intermedie alternative al saccarosio, ad es. in grado di formare ima fase intermedia più discontinua con le fasi confinanti non è facile da perseguire: infatti la maggiore discontinuità tra una fase l’altra comporta il rischio di ridurre la libertà di migrazione del materiale batterico/ virale /prionico attraverso le diverse fasi, limitandone il movimento verso la soluzione inattivante inferiore; inoltre la ricerca di sostanze diverse dal saccarosio (ad es. sostanze di sintesi, solventi, ecc.) è ulteriormente limitata dal fatto che l’impiego di sostanze non naturali può risultare nocivo alla stabilità/ attività del materiale biologico.
Alla luce delle soluzioni fin qui ottenute e dei loro limiti, resta dunque sentita la necessità di nuovi processi di decontaminazione di materiali biologici che siano più semplici e rapidi da realizzare, specialmente su scala industriale, che permettano una decontaminazione efficace del materiale biologico, evitino una perdita di attività di quest’ultimo e ne permettano il recupero con elevata resa.
SOMMARIO
La Richiedente ha ora messo a punto un nuovo procedimento di decontaminazione di un materiale biologico che risponde efficacemente alle suddette necessità. Il procedimento comprende essenzialmente la formazione di un sistema liquido a tre strati sovrapposti (a-b-c), tra loro distinti per caratteristiche di densità e/o miscibilità; lo strato superiore (a) comprende una soluzione acquosa del materiale biologico da decontaminare; lo strato inferiore (c) comprende la soluzione inattivante detti virus, prioni o batteri; l'invenzione si basa principalmente sull'individuazione di un nuovo strato intermedio (b), posto tra detti strati inferiore e superiore, in grado di massimizzare la stabilità del sistema tri-strato in tutte le fasi del processo di decontaminazione {ovvero durante allestimento del sistema a tre strati, durante il suo trasferimento nell'impianto di centrifugazione, durante la centrifugazione, e durante la fase di recupero del sunatante proteico), senza in alcun modo limitare il trasferimento del contaminante verso lo strato inferiore, e senza conseguenze avverse sulla stabilità del materiale biologico sottoposto al processo. Nel processo dell'invenzione, i tre suddetti strati presentano densità differenziate, nell’ordine: (a) < (b) < (c); lo strato intermedio è costituito da uno solvente organico (o da una miscela di tali solventi), immiscibile almeno con lo strato superiore. L’invenzione prevede l’uso di alcuni solventi organici preferiti, vantaggiosamente utilizzabili entro specifiche proporzioni volumetriche. L’invenzione fornisce inoltre specifiche indicazioni circa la differenza di densità tra gli strati, in particolare tra lo strato (a) e (b), utili per garantire la stabilità del sistema e, allo stesso tempo, salvaguardare l’efficacia di decontaminazione e l’attività biologica del materiale sottoposto a decontaminazione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Ai sensi della presente invenzione, il termine “partizione” si riferisce alla separazione di un componente particolato (agente contaminante) da una fase liquida (soluzione di materiale biologico) che li contiene. Il termine “inattivazione” si riferisce alla riduzione o eliminazione dell’attività di detti agenti contaminanti.
Ai sensi della presente invenzione il termine “immiscibile”, riferito alla immiscibilità tra due strati liquidi, è inteso in senso ampio a definire strati liquidi che, a causa di un differente grado di idro/lipofilia, densità e/o tensione superficiale, mantengono sempre una chiara separazione di fase (a condizioni di temperatura e pressione ambientali ed in condizioni di risposo): ove eventualmente sottoposti a sollecitazioni meccaniche (agitazione, mescolamento, centrifugazione, ecc.), tali strati non si omogeneizzano stabilmente tra loro, ma riformano interamente l’originale separazione e stratificazione bi-fasica dopo opportuno periodo di riposo.
Il termine “parzialmente miscibile”, riferito alla miscibilità tra due o più strati liquidi, è qui inteso a definire strati che, a causa di un simile grado di idro/lipofilia, densità e/o tensione superficiale, non presentano una netta separazione di fase (a condizioni di temperatura e pressione ambientali ed in condizione di riposo): ove eventualmente sottoposti a sollecitazioni fisiche o meccaniche (agitazione, mescolamento, centrifugazione, ecc.), tali stati si omogeneizzano parzialmente tra loro in modo stabile, così che anche dopo opportuno periodo di riposo l’originale separazione e stratificazione non si ri-forma, quanto meno totalmente, ovvero le due fasi restano almeno in parte mescolate e/o interpenetrate tra loro.
II materiale biologico utilizzabile nell’attuale processo non presenta alcuna limitazione dal punto di vista della struttura chimica e/ o attività biologica. L’unica limitazione è che esso sia solubile (o reso solubile mediante opportuni eccipienti) in acqua o soluzione acquosa: ciò è indispensabile poiché l’attuale processo di partizione si basa sulla separabilità di contaminanti particolati (virus, prioni o batteri), precipitabili per centrifugazione dal materiale biologico disciolto in soluzione, quest’ultimo essendo recuperabile come sumatante. Materiali biologici di particolare interesse sono quelli appartenenti ad una o più tra le classi degli aminoacidi, proteine, enzimi, ormoni, citochine, co-fattori, vitamine, mediatori chimici, ecc. Esempi preferiti di tali materiali sono FHS, LH, hCG, testosterone, progesterone, estradiolo, ormone tiroideo T3 e/o T4, insulina, glucagone, gastrina, somatostatina, somatotropina, ormone della crescita, prolattina, renina, angiotensinogeno, angiotensina, gonadotropina, cortisolo, ormone adenocorticotropo (ACTH), amminoacidi modificati, L-DOPA, dopamina, adrenalina, noradrenalina, serotonina, istamina, GABA, loro derivati, ecc.. Materiali biologici particolarmente preferiti sono FHS, LH, hCG, ormone tiroideo T3 e/o T4, progesterone e testosterone. Il materiale biologico può essere anche un liquido fisiologico contenente molecole target in esso disciolte o solubili, che si intendono recuperare separatamente dal particolato presente; esempi di liquidi fisiologici sono sangue, plasma, urine, liquido amniotico, liquido cefalo-rachidiano, ecc.
I contaminanti separabili dal materiale biologico nel presente processo, sono contaminanti particolati, tipicamente virus, prioni o batteri. Il termine “contaminante” si estende tuttavia a qualunque altro particolato possibilmente associato al materiale biologico, anche se non necessariamente tossico per l’uomo o l’animale (ad es. materiali in sospensione, polveri, ecc.); tali particolati sono comunque indesiderati in quanto, ove contenuti nel prodotto biologico finale, ne riducono il titolo.
Lo strato superiore (a) utilizzato nella presente invenzione è costituito da una soluzione acquosa del materiale biologico prescelto. Dipendentemente dal grado di solubilità in acqua di detti materiali, la soluzione costituente lo strato (a) potrà eventualmente contenere eccipienti solubilizzanti; ulteriori esempi di eccipienti utilizzabili sono agenti tampone e regolatori di tonicità, utili per ottimizzare le condizioni di conservazione in soluzione del particolare materiale biologico prescelto; tali eccipienti, meramente facoltativi, non sono in alcun modo indispensabili per stabilizzare il materiale biologico rispetto al suo contatto con lo strato intermedio (b); è stato infatti verificato sperimentalmente dalla Richiedente che lo strato intermedio realizzato secondo la presente invenzione non modifica in alcun modo l’attività del materiale biologico nello strato confinante (a). Sostanze ioniche come ad esempio cloruro di sodio o glicerolo, possono essere utilizzate come correttore di densità.
Lo strato (a) è quello con densità più bassa, così da essere stratiiicabile sulla superficie superiore del sistema a tre strati; fatta salva questa condizione, non vi sono valori assoluti di densità per questo strato; tuttavia, trattandosi di soluzioni acquose, la densità sarà in molti casi vicina ovvero di poco superiore a quella dell’acqua; riferimenti orientativi per la densità dello strato (a) sono compresi tra 1.001 e 1.050; valori superiori restano possibili, dipendentemente dal tipo di materiale biologico (ad es. liquido fisiologico) utilizzato.
Lo strato intermedio (b) è costituito da un solvente organico, o più solventi organici (intermiscibili) miscelati tra loro; tali solventi (o loro miscele) devono essere immiscibili con la soluzione acquosa dello strato (a) ed inoltre presentare una densità intermedia tra quelle degli strati (a) e (c), così da permetterne l’opportuna stratificazione intermedia. Vantaggiosamente, lo strato (b) presenta una densità di almeno 0.025 mg/mL superiore a quella dello strato (a); è stato infatti sperimentalmente verificato dalla Richiedente che una tale differenza di densità è sufficiente a garantire una separazione stabile dello strato (a) dai rimanenti strati del sistema tri-strato; non vi è invece un limite specifico superiore per la differenza di densità tra gli strati (a) e (b), tenendo conto che ogni maggiore differenza di densità stabilizza ulteriormente il sistema nelle diverse fasi di processo; un utile valore di riferimento superiore per la suddetta differenza di densità è di circa 0.3 mg/mL; di conseguenza, la differenza di densità tra (a) e (b) si situa, preferibilmente, tra 0.030 e 0.3 mg/mL. Resta inteso che il valore massimo di densità scelto per lo strato (b) dovrà essere sempre inferiore a quello scelto per lo strato (c). Fatte salve le condizioni di cui sopra, intervalli non-limitativi di riferimento di densità (valori assoluti) per lo strato (b) sono compresi tra 1.07 e 1.20.
Rispetto all’impiego di solventi singoli, l’utilizzo di una miscela di solventi nello strato (b) presenta il vantaggio di una più facile modulabilità delle caratteristiche di densità. Risultati vantaggiosi sono ottenibili mescolando un solvente organico ad alta densità con un solvente organico a bassa densità in proporzioni appropriate per ottenere una densità intermedia rispetto alla soluzione inattivante e la soluzione da decontaminare. Preferibilmente è possibile impiegare, quale costituente dello strato (b), una miscela di un solvente organico alifatico alogenato con un solvente organico aromatico, tali solventi essendo presenti nelle rispettive proporzioni volumetriche tra 1:0,5 e 1: 4, o preferibilmente tra 1:0,8 e 1:3. Esempi preferiti di solventi organici alitatici alogenati sono: cloruro di metile, cloruro di metilene, cloroformio, tetracloruro di carbonio; esempi preferiti di solventi organici aromatici sono benzene, toluene, C2-4-alchilbenzene (ad es. etilbenzene, propilbenzene e loro isomeri), xilene, e loro derivati. Solventi particolarmente preferiti sono cloroformio e toluene; esempi non limitativi delle loro miscele sono quelle realizzate nelle proporzioni 1: 1, 1: 1,5 e 1:2.
La Richiedente ha inoltre verificato se il contatto della fase (a) con i solventi organici della fase (b) potesse comportare una parziale denaturazione del materiale biologico, con eventuale riduzione indesiderata della sua attività. Tali prove hanno dato esito del tutto negativo, mostrando che la fase (b), pur essendo fortemente dissimile della fase (a) (ottimizzata per la conservazione del biologico) non comporta alcun pregiudizio all’attività di tale materiale.
Lo strato inferiore (c) è costituito da una soluzione con densità superiore a quella degli strati (a) e (b); esso contiene una sostanza in grado di inattivare il particolato virale, prionico o batterico che, a seguito della centrifugazione, viene a contatto con questo strato. Non vi è limite alla scelta della sostanza inattivante: essa può essere convenientemente scelta tra quelle comunemente note nei processi di decontaminazione per inattivazione; vantaggiosamente si utilizza una sostanza che inoltre conferisce allo strato (c) la densità desiderata: esempi di tali sostanze sono soluzioni fortemente concentrate di urea, o di un idrossido alcalino quale ad es. NaOH. Esempi preferiti sono soluzioni di urea a concentrazione almeno 6M e pH di almeno 8.0, o di idrossido alcalino ad una concentrazione di almeno 0.5 M; non vi sono limiti specifici massimi di concentrazione o pH per tali soluzioni, considerato che ogni aumento di concentrazione (o alcalinità) migliora ulteriormente il potere inattivante dello strato (c); tuttavia intervalli utili per la soluzione di urea sono compresi tra 7M e 9M, con pH compreso tra 8.0 e 11.0, preferibilmente pari a circa 9.5; intervalli utili per la soluzione di NaOH sono compresi tra 1M e 2M. Le soluzioni inattivanti, ad es. di urea, possono contenere un opportuno agente tampone, ad es. Tris-Cl per mantenere il pH nell’intervallo desiderato; possono inoltre contenere opportuni agenti interferenti con ponti disolfuro (ad es. ditiotreitolo), così da favorire la denaturazione della componente proteica dei contaminanti. Correttori di densità, ad es. NaCl. NaBr o glicerolo possono essere eventualmente utilizzati (così come anche nelle fasi (a) e/o (b) ovunque desiderato).
Diversamente dall’interfaccia tra gli strati (a) e (b), l’interfaccia tra gli strati (b) e (c) non presenta una criticità particolare, ovvero non è richiesto che gli strati (b) e (c) si differenzino fortemente in termini di densità; ai sensi dell’invenzione è infatti sufficiente la realizzazione di una minima separazione tra le fasi costituenti gli strati (b) e (c); tale scarsa separazione non rappresenta un limite ma, al contrario, un ulteriore vantaggio: essa infatti facilita il passaggio, in fase di centrifugazione, del particolato virale, prionico o batterico, dallo strato intermedio (b) verso lo strato (c) ove ha luogo la reazione di inattivazione un eventuale mescolamento parziale delle fasi (b) e (c) a seguito di centrifugazione, quand’anche permanente, non costituisce un problema per l’invenzione dato che tali fasi costituiscono lo scarto di processo; viceversa, il materiale biologico decontaminato rimane nello strato (a): quest’ultimo resta stabilmente separato dopo la centrifugazione ed è facilmente recuperabile come fase superiore surnatante; anche un eventuale riflusso indesiderato del materiale contaminante verso lo strato (a) resta impedito grazie alla differenza di miscibilità/ densità imposte tra lo strato (a) ed i rimanenti due strati.
Fatte salve le suddette condizioni, intervalli non- limitativi di riferimento di densità (valori assoluti) per lo strato (c) sono compresi tra 1.08 e 1.30.
II processo di partizione /inattivazione viene messo in atto mediante i seguenti passaggi:
(i) in un tubo per ultracentrifuga, stratificare progressivamente gli strati (c),(b),(a);
(ii) sottoporre a centrifugazione il tubo preparato in (i);
(iii) recuperare lo strato (a) quale srnatante di centrifugazione, contenente il materiale biologico decontaminato.
I passaggi (i) e (iii) sono convenientemente realizzabili con l’utilizzo di una siringa o con un equivalente dispositivo di riempimento /aspirazione, preferibilmente sviluppato per l’impiego su scala industriale. I tubi da ultracentrifuga sono selezionabili tra quelli commercialmente disponibili, con preferenza per quelli con superimi interne inerti ai solventi organici, ad es. superimi interne in teflon. Il passaggio (ii) viene effettuato centrifugando entro ampi valori di G e di tempo (tipicamente in un intervallo compreso tra 50000 e 70000 G, per un tempo compreso tra 30 minuti e 2 ore); deviazioni da questi valori restano possibili in funzione delle caratteristiche specifiche del materiale biologico utilizzato, e del suo presumibile carico di contaminanti. Durante la ultracentrifugazione i contaminanti particolati contenuti nel prodotto biologico ed originalmente presenti nella soluzione dello strato (a), a causa della loro massa, sono attirati verso il fondo del tubo da ultracentrifuga ovvero attraversano lo strato (b) e si raccolgono nello strato (c) ove vengono inattivati per contatto con la soluzione inattivante ivi contenuta; dipendentemente dalle condizioni di centrifugazione adottate, i contaminanti possono rimanere sospesi nello strato (c) o raccogliersi sul fondo del tubo in forma di precipitato o pellett. Il processo di decontaminazione termina con l’aspirazione del surnatante di centrifugazione contenente la soluzione del prodotto biologico decontaminato; esso può quindi essere conservato in forma di soluzione, liquida o congelata, oppure può essere recuperato in forma solida mediante allontanamento della fase liquida; a tal fine si utilizzano preferibilmente procedure con basso impatto (ad es. liofilizzazione o lenta evaporazione) al fine di preservare l’attività del prodotto biologico; condizioni più rapide /drastiche, as es. ebollizione, possono essere adottate nel caso di prodotti biologici sufficientemente stabili.
In sintesi, la presente invenzione ha permesso di migliorare significativamente i processi noti di partizione e inattivazione, ottenendo un procedimento facilmente implementabile su scala industriale, con una elevata resa produttiva, altamente rispettoso dell’attività biologica del materiale da decontaminare. In particolare, la realizzazione dello strato intermedio con le caratteristiche descritte per l’invenzione ha permesso di realizzare un sistema trifasico stratificato particolarmente stabile, che non si oppone in alcun modo alla migrazione del particolato virale, prionico o batterico verso la fase inferiore durante la centrifugazione; in particolare, grazie alle caratteristiche di non miscibilità della fase intermedia, questa può avere una densità di pochissimo superiore alla densità dello strato superiore contenente il prodotto, risultando in un’ancor più facile migrazione delle particelle batteriche/ virali/ prioniche verso la fase inattivante sottostante; lo stesso strato intermedio, pur fortemente non-affine alla soluzione di materiale biologico, non comporta danno all’attività biologica di quest’ultimo.
L’invenzione viene ora descritta mediante i seguenti esempi non limitativi.
ESEMPI
Esempio 1 : Preparazione fase inattivante (strato (c)) Sono state preparate soluzioni inattivanti a base di urea o NaOH.
Le soluzioni di urea contenevano ulteriormente un tampone 0.5M Tris-C1 a pH 9.5, ditiotreitolo (DTT, conc. lOmM) ed eventualmente NaBr come correttore di densità.
Le soluzioni di NaOH sono state realizzate utilizzando NaOH 1M e glicerolo come correttore di densità.
Tab. 1 Soluzioni inattivanti
Soluzione Densità a 20<D>C 8M Urea, 0.5M Tris-Cl 10 mM DTT pH 9.5 1.1407 8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 mM DTT, 1M NaBr pH
9.5 1.2174 8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 mM DTT, 1.2M NaBr pH
9.5 1.2283 8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 mM DTT, 1.5M NaBr pH
9.5 1.2514 8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 mM DTT, 1.7M NaBr pH
9.5 1.2637 8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 mM DTT, 2M NaBr pH
9.5 1.2903 1M NaOH in 25% (v/v) Glicerolo 1.095 1M NaOH in 30% (v/v) Glicerolo 1.11 1M NaOH in 40% (v/v) Glicerolo 1.1395
Esempio 2: Preparazione fase intermedia (strato (b)) Sono state realizzate soluzioni a base di cloroformio e toluene, nelle proporzioni 1:1, 1:1,5 e 1:2
Tab. 2 Soluzioni intermedie
Soluzione Densità a 20°C Cloroformio 1.46 Toluene 0.863 Cloroformio:Toluene= 1 : 1 1.178 Cloroformio :Toluene= 1:1.5 1.116 Cloroformio:Toluene= 1 :2 1.074
Cloroformio punto ebolliz. 61°C
Toluene punto ebolliz. 110°C
Come riferimento sono state inoltre preparate soluzioni acquose intermedie basate su soluzioni acquose di saccarosio, seguendo gli insegnamenti della tecnica nota (EP 1 593 688).
Tab. 3 Soluzioni intermedie con saccarosio (riferimento)
Soluzione Densità a 10°C Densità a 20°C 10% w/v saccarosio in
acqua 1.041 1.038
20% w/v saccarosio in
acqua 1.085 1.081
30% w/v saccarosio in
acqua 1.133 1.127
40% w/v saccarosio in
acqua 1.183 1.176
La modulazione della densità ha richiesto l’impiego di massicce quantità di saccarosio, ottenendo soluzioni fortemente concentrate, poco adatte al contatto con soluzioni contenenti molecole di interesse biologico.
Esempio 3: Preparazione della soluzione di materiale biologico (strato (a))
Quale materiale biologico di riferimento sono state realizzate soluzioni di albumina serica bovina (BSA), con concentrazioni da 5 a 20 mg/mL, con o senza NaCl. Le soluzioni ottenute presentavano le seguenti caratteristiche.
Tab. 4 Soluzioni proteiche
Soluzione Densità a 20 °C BSA 5mg/ml in acqua 1.001
BSA 10mg/ml in acqua 1.002
BSA 20mg/ml in acqua 1.005
BSA 5mg/ml in 1M NaCl 1.043
BSA 10mg/ml in 1M NaCl 1.045 BSA 20mg/ml in 1M NaCl 1.045
BSA 5mg/ml in 2M NaCl 1.079
BSA 10mg/ml in 2M NaCl 1.081
BSA 20mg/ml in 2M NaCl 1.081
E’ stata quindi verificata l’effettiva stratiflcabilità delle soluzioni ottenute, su quelle dello strato (b) descritte nell’esempio precedente.
Tab. 5 Verifica stratificazione tra soluzione proteica e soluzione intermedia
Soluz, intermedia Composiz. soluz. proteica Aspetto dopo ce ntrifugazio ne Clorof:Toluene= 1 : 1 20 mg/ mi BSA in acqua OK
Clorof:Toluene= 1 : 1 20 mg/ mi BSA in 2M NaCl OK
Clorof:Toluene= 1:1.5 20 mg/ mi BSA in acqua OK
Clorof:Toluene= 1: 1.5 20 mg/ mi BSA in 2M NaCl OK
Clorof:Toluene= 1: 1.5 20 mg/ml BSA in 1M NaCl OK
ClorobToluene :2 20 mg/ml BSA in 2M NaCl NO
Clorof:Toluene= 1:2 20 mg/ml BSA in 1M NaCl OK
20 mg/ml BSA in 0.1M Na OK
Clorof:Toluene= 1 : 2 Fosfato, 1M NaCl pH 7.2
20 mg/ml BSA in 0.1M Na OK
Clorof:Toluene= 1 : 2 Fosfato, 0.5M NaCl pH 7.2
OK = ripartizione come voluto
NO= la soluzione proteica è più densa della fase intermedia e va sotto.
Tab. 6 Verifica stratificazione tra soluzione intermedia e soluzione inattivante
Soluzione inattivante SoÌuz. intermedia Aspetto dopo centrifugazione 1M NaOH in 25% (v/v) Clorof:Toluene= 1 : 1 NO Glicerolo
1M NaOH in 25% (v/v) Clorof:Toluene= 1:1.5 NO Glicerolo
1M NaOH in 25% (v/v) Clorof:Toluene= 1:2 OK Glicerolo
1M NaOH in 30% (v/v) ClorofiToluene^ 1 : 1 NO Glicerolo
1M NaOH in 30% (v/v) Clorof:Toluene= 1:1.5 NO Glicerolo
1M NaOH in 30% (v/v) Clorof:Toluene<~>1:2 OK Glicerolo
1M NaOH in 40% % (v/v) ClorofcToluene^ 1 : 1 NO Glicerolo
1M NaOH in 40% % (v/v) Clorof:Toluene= 1:1.5 OK Glicerolo
1M NaOH in 40% % (v/v) Clorof:Toluene= 1:2 OK Glicerolo
8M Urea, 0.5M Tris-Cl 10 Clorof:Toluene= 1 : 1 NO mM DTT pH 9.5
8M Urea, 0.5M Tris-Cl 10 Clorof:Toluene= 1: 1.5 OK mM DTT pH 9.5
8M Urea, 0.5M Tris-Cl 10 Clorof :Toluene= 1 : 2 OK mM DTT pH 9.5
8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 Clorof:Toluene= 1 : 1 OK mM DTT, 1M NaBr pH 9.5
8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 Clorof :Toluene= 1: 1.5 OK mM DTT, 1M NaBr pH 9.5
8M Urea, 0.5M Tris-Cl, 10 Clorof:Toluene= 1 :2 OK mM DTT, 1M NaBr pH 9.5
Esempio 4 Verifica dell’attività biologica
Per verificare se il contatto prolungato all’interfaccia tra la fase acquosa proteica (a) e la fase organica intermedia (b) potesse compromettere l’attività dellVSH sono state preparate varie provettine con la soluzione intermedia (b), sulla quale sono state stratificate le varie soluzioni di FSH. I campioni sono stati incubati in frigorifero per 18 h e successivamente ne è stata determinata l’attività FSH in confronto con l’attività iniziale di ogni soluzione. Il dettaglio delle soluzioni ed il recupero di FSH è mostrato nella seguente tabella.
Tab. 7 Valutazione di attività FSH dopo 18 ore di contatto con la fase organica di cloro formio /toluene
Fase organica Composizione della % FSH intermedia soluzione di FSH recuperata dopo 18h di contatto con la fase organica Cloroformio:Toluene= 1 : 1 60 U/ml FSH in acqua 126% Cloroformio :Toluene= 1 : 1 60 U/ml FSH in 1M 95% NaCl
Cloroformio :Toluene= 1 : 1 60 U/ml FSH in 2M 98% NaCl
Cloro formio :Toluene=l : 1 60 U/ml FSH , 10 99% mg/ mi BSA
Cloroformio :Toluene= 1 : 1 60 U/ml FSH, 10 mg/ml 102%
BSA, 1M NaCl
Cloroformio :Toluene= 1 : 1 60 U/ml FSH, 10 mg/ml 102%
BSA, 2M NaCl
Cloroformio :Toluene= 1:1.5 60 U/ml FSH in acqua 100% Cloroformio :Toluene= 1:1.5 60 U/ml FSH in 1M 100% NaCl
Cloroformio :Toluene= 1: 1.5 60 U /mi FSH , 10 104%
mg/ mi BSA
Cloro formio :Toluene=l: 1.5 60 U/ml FSH, 10 mg/ml 101%
BSA, 1M NaCl
Cloroformio:Toluene= 1 :2 60 U/ml FSH in acqua 98%
Cloroformio:Toluene= 1 :2 60 U/ml FSH in 1M 97%
NaCl
Cloroformio :Toluene= 1 : 2 60 U/ml FSH , 10 108%
mg/ml BSA
Cloroformio ; Toluene = 1 : 2 60 U/ml FSH, 10 mg/ml 106%
BSA, 1M NaCl
Abbreviazioni: NaOH=Sodio idrato; NaCl^Sodio cloruro; NaBr=Sodio Bromuro; DTT= Dithiothreitolo; Tris=tri(idrossimetilaminometano); BSA: Bovine Serum Albumin.
Dalla tabella sopra esposta si evince che ΙΤΈΗ non ha subito danni (le variazioni di poche unità percentuali in più o in meno sono insite nel tipo di test effettuato).
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la decontaminazione di un materiale biologico da contaminanti virali, prionici e/o batterici, comprendente il centrifugare un sistema liquido a tre strati comprendente: (a) uno strato superiore comprendente una soluzione acquosa del materiale biologico da decontaminare; (b) uno strato intermedio comprendente uno o più solventi organici; (c) uno strato inferiore comprendente una soluzione inattivante per detti contaminanti, dove detti strati hanno densità differenziate, nell’ordine: (a) < (b) < (c), e dove lo strato (b) è immiscibile con lo strato (a).
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove gli strati (a) e (b) presentano una differenza di densità di almeno 0.025 g/mL.
- 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-2, dove gli strati (a) e (b) presentano una differenza di densità compresa tra 0.030 e 0.3 g/mL.
- 4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-3, dove lo strato (a) comprende un correttore di densità. 5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-4, dove lo strato (b) è una miscela di un solvente organico alifatico alogenato con un solvente organico aromatico, in proporzioni volumetriche comprese tra 1:0,5 e 1:4, preferibilmente tra 1:0,8 e 1:3. 6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-5, dove il solvente organico alifatico alogenato è scelto tra cloruro di metile, cloruro di metilene, cloroformio e tetracloruro di carbonio, ed il solvente organico aromatico è scelto tra toluene, C2-4-alchilbenzene, xilene, benzene, e loro derivati. 7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-6 dove lo strato intermedio (b) è parzialmente miscibile con lo strato (c). 8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7, dove lo strato (c) è una soluzione di urea avente concentrazione almeno 6M, oppure una soluzione di un idrossido alcalino o alcalino terroso avente alla concentrazione di almeno 0.
- 5 M. 9. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-8, dove lo strato (b) è una miscela di cloroformio e toluene e/o lo strato (c) comprende uno o più tra: ditiotreitolo, urea, bromuro di sodio, cloruro di sodio, ioduro di sodio, ed un agente che conferisce a detta miscela un pH compreso tra 8 e 11. 10. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-9, dove il materiale biologico appartiene ad una o più tra le classi degli aminoacidi, proteine, enzimi, ormoni. 11. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-10, dove il materiale biologico è scelto tra FHS, LH, hCG, testosterone, progesterone, estradiolo, ormone tiroideo T3 e/o T4, insulina, glucagone, gastrina, somato statina, somatotropina, ormone della crescita, prolattina, renina, angiotensinogeno, angiotensina, gonadotr opina, cortisolo, ormone adenocorticotropo (ACTH), amminoacidi modificati, L-DOPA, dopamina, adrenalina, noradrenalina, serotonina, istamina, GABA e loro derivati. 12. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-11, dove una o più tra le seguenti condizioni sono soddisfatte: lo strato (a) comprende: detto materiale biologico ad una concentrazione compresa tra 1 e 100 mg/mL, un agente tampone che conferisce allo strato un pH compreso tra 6,5 e 8,0; lo strato (b) è una miscela di cloroformio e toluene in proporzioni volumetriche comprese tra 1:0,5 e 1:4; lo strato (c) è una soluzione di urea a molarità compresa tra 7M e 9M, comprendente ditiotreitolo, NaBr, ed un agente tampone che conferisce allo strato un pH compreso tra 8.0 e 11.0. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, dove una o più tra le seguenti condizioni sono soddisfatte: lo strato (a) comprende: detto materiale biologico ad una concentrazione compresa 10 e 50 mg/mL, un agente tampone che conferisce allo strato un pH compreso tra 7 e 7,5; lo strato (b) è una miscela di cloroformio e toluene in proporzioni volumetriche comprese tra 1:0,8 e 1:3; lo strato (c) è una soluzione di urea a molarità 8M, comprendente ditioeritrolo, NaBr, ed un agente tampone che conferisce allo strato un pH compreso tra 8 e 11.
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