HUT73173A - Use of inhibitors of ornitine aminotransferase for the manufacture of a medicament for the treatment of alzheimer's disease and process to prepare (2s,5s)-5-fluoromethylornithine - Google Patents

Description

Az ammónium ion (NH₄+) fontos szerepet játszik a sav-bázis egyensúly kialakításában, azonban amennyiben nagy koncentrációban fordul elő, toxikus. Az ammónium ion a testben számos prekurzorból képződik (nukleinsavak, fehérjék, aminosavak, hexóz-aminok, elsőrendű aminok). Keletkezése különböző reakciók során történik és a testben exogén forrásokból, mint például a táplálkozási fehérjék lebomlásával a bélben baktériumok által okozva is bekerülhet.

A testben keletkező karbamid [CO(NH₂)₂] körülbelül 20%-a a bélbe diffundál, ahol a baktériumok segítségével ammóniává, illetve széndioxiddá alakul át. Az ammóniát a sejtek abszorbeálják, majd a májban karbamiddá alakul vissza ornitin(karbamid) -ciklus segítségével. Az ammónia eltávolításának ez az elsődleges útja. Ebből eredően a máj akut vagy krónikus megbetegedései megakadályozzák, hogy a testből az ammóniát a máj eltávolítsa.

Az ammónia magasabb koncentrációban könnyen áthalad a vér/agy gátló rendszeren, és így encephalopathia (agybetegség) alakulhat ki (az agy degeneratív megbetegedései). A neurogén encephalopathia egyik oka a vizelet-traktus baktériumos fertőzése lehet (például neurogén hólyag). Az ilyen betegségek másik oka lehet az ammónia detoxikálása ami abból ered, hogy akut vagy krónikus máj betegség alakul ki. Ez a betegség hepatogén encephalophathiához vezethet. A betegség egyik jelentős faktora exogén (emésztőrendszeri) ammónia lehet.

Az agyban található ammónia egyéb forrásaiként régen feltételezik, hogy ez lehet fehérje, nukleinsav, aminosav és hexóz-amin. Az elsőrendű-aminok (monoaminok, diaminok és poliaminok) oxidatív deaminálása a glicin hasító rendszeren keresztül a glicin katabolizmusa, a purinok deaminálása és a pirimidinek, valamint a glükózamin-6-foszfát deaminálása egyebek között jól ismerten ammónia képző reakciók, amelyek az agybani ammónia koncentráció állandó értékéhez hozzájárulhatnak.

Az Alzheimer típusú dementia (DAT) egy másik típusú agy lebomlási betegség, amelynek etiológiája nem ismert (habár számos elméletet felállítottak erről a betegségről). A legújabb közlemények szerint nemcsak a DAT betegek agyában mérhető megnövelt ammónia koncentráció, hanem az endogén úton feleslegben keletkezett ammónia is kimutatható [Hoyer, S. és munkatársai, Neurosci. Lett. 117: 358-362 (1990)]. Két közleményt publikáltak, amelyben leírták, hogy DAT betegekben az arteriális ammónia koncentráció jelentősen magasabb, mint a megfelelő kontroll egyedekben [Fisman, M. és munkatársai, Am. J. Phychiatry 142: 71-73 (1985); Fisman, M. és munkatársai, J. Am. Ger. Soc. 37: 1102 (1989)]. Az olyan betegek, akiket DAT betegségben diagnosztizáltak, ugyanakkor nem szenvedtek máj betegségben, illetve vizelet traktus fertőzésben, 208±136 μg ammónia/100 ml plazma koncentrációval rendelkeztek. A normál érték ilyen esetben 20-94 pg/100 ml plazma; a betegek 83%-a a normál határértéken felüli vér ammónia koncentrációt mutatott [Branconnier, R.J. és munkatársai, Am. J. Phychiatry 143: 1313 (1986)]. Az előrehaladott DAT betegségben szenvedő, valamint a klinikailag kezdeti dementia státusban lévő betegekben valamennyi DAT betegség valószínűség, illetve korai állapot esetében leírták, hogy az artéria-vénás ammónia koncentráció között eltérés tapasztalható. Az egészséges önkéntesek esetében az agy ammónia felvétele átlagban 72±7 ng/kg/perc. Ezzel éles ellentétben az előrehaladott DAT betegségben szenvedő betegek agyából az ammónia kibocsátás 27+3 pig/kg/perc. Az olyan betegek esetében, akikről feltételezhető, hogy a DAT betegség korai állapotában vannak, a kibocsátott ammónia mennyiség a keringési rendszerben 256±162 pg/kg/perc érték. Ezek a vizsgálatok feltételezik, hogy az agyban a betegség esetében felesleg mennyiségű ammónia termelődik és ugyanakkor esetenként nem megfelelő ammónia detoxikálás • · · · ···· * · ······ · · · ···· · · · · · «· jár együtt ezzel a jelenséggel [Hoyer, S. és munkatársai, Neurosci. Lett. 117: 358368 (1990)].

Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a DAT betegség kifejlődésében, illetve legalább szimptómái között a hyperammonemia egy fontos faktor. Mint az alábbiakban részletesen ismertetjük, az agyi hyperammonemia befolyásolhatja a DAT betegség jeleként mutatkozó faktorokat.

Agyi hyperammonemia és DAT betegség

a) Szinapsisos átvitel az ammónia intoxikálásban (mérgezésben)

Az ammónia kölcsönhatásba lép a fő inger (glütamát) és a fő inhibiáló (GABA) idegsejt rendszerekkel a gerincesek központi idegrendszerében, amely rendszer a DAT betegségben szenvedő betegekben károsodott.

Kísérleti eredmények alapján kimutatták, hogy számíthatóan az ammónia koncentrációnak növekedése kb. 0,5 pmol/gram/agy értékkel, azaz 2-5-szörös növekedés elegendő ahhoz, hogy az ingerlő és inhibiáló szinaptikus átvitelt megzavarja és encephalopathiát idézzen elő, amely akut ammónia mérgezéssel kapcsolatos [Raabe, W., Neurochem. Pathol. 6: 145-166 (1987)]. A fenti tényből eredően nyilvánvaló, hogy egy igen lassan kifejlődő patogén mechanizmus iniciálható még akkor is, amikor az agy ammónia koncentráció csak kissé magasabb, mint a fiziológiai normál koncentráció.

A glutamát-mediált ingerlő szinaptikus átvitel ammónia okán csökken. Jelenleg még nem biztosan ismert, hogy ez a hatás azzal kapcsolatos-e, hogy a presszinaptikus terminálokon a glütamát hiány jelentkezik.

Az inhibitor szinaptikus transzmisszió ugyancsak csökken ammónia hatására. Ez abból ered, hogy a Cf-függő inhibiáló neuronokat (például GABA neuronokat) hiperpolarizálja az ammónia. Ez a hatás abból ered, hogy a neuronokból a Cl' kiszorítás az ammónia által inhibiált. Ugyanekkor az ammónia csökkenti a Ca⁺⁺ hiper t

polarizáló hatását, illetve a feszültség függő Cl’-áramokat. Mivel a GABA és egyéb inhibiáló neuronok nagy százaléka inhibitor hatást szabályoz, az ammónia megnöveli a neuron ingert „az inhibiálás megszüntetésével”.

b) Csökkentett glükóz felhasználás

A kísérleti és humán betegségek esetében hyperammonemia betegségek kezelésében történő vizsgálatok azt mutatják, hogy az agy glükóz felhasználása nem megfelelő és ezt egyben az energia metabolizmus csökkenése kíséri, továbbá a csillagsejt elváltozás, amelyet „Alzheimer típusú II gliomás állapot” néven jelölnek. Ezeket a tüneteket a DAT betegségben szenvedő agyban felfedezték: a PÉT (pozitron emissziós tomográfia) vizsgálatok kimutatták az agyi glükóz felhasználást és ez alapvetően csökkentett a halántékcsont kéreg területén. A teljes agyi glükóz felhasználás körülbelül 50%-kal csökkent normál értékű oxigénfelvétel mellett a betegség korai kialakulása során, azonban az oxigénfelvétel a DAT betegség kialakulásának későbbi szakaszában ugyancsak csökkent. A DAT betegégben szenvedő betegek esetében az agy energia metabolizmus károsodását, illetve az energia metabolizmusban részt vevő enzimek károsodását számos szakirodalmi közleményben leírták.

c) Glia-funkcióval történő kölcsönhatás

A csillagsejt rendellenességek jellemzőek a DAT betegségre. Megfigyelések alátámasztják, hogy a reaktív csillagsejtek mediálják a neuropatológiai DAT eseményeket, beleértve az extracelluláris β-amiloid fehérje leválást [Frederickson, Neorobiol. Aqinq 13: 239-253 (1992)].

Az ammónia okozta csillagsejt károsodás glutamin-szintetáz aktivitás csökkenéssel jár együtt, illetve bebizonyították, hogy az enzim aktivitása patkányokban körülbelül 15%-kal csökken a portacavalis eltérés miatt [Butterworth, R.F. és munkatársai, J. Neurochem. 51: 486-490 (1988)]. Ezen túlmenően a szintetáz aktivitás fenti t

csökkenése a csillagsejtekben további sérülést okozhat. Kimutatták, hogy a glutamin-szintetáz alapvető szerepet játszik a sejten belüli ammónia, illetve sejten belüli sav-bázis egyensúly kialakításában. Az enzim bármely sérülése, illetve megváltoztatása az ammónia toxicitás többszörösre történő növekesét eredményezi. A fenti vizsgálatok alapján nem meglepő, hogy amennyiben a sejten belüli pH érték növekszik, illetve a csillagsejtek duzzadása megtörténik, az a hyperammonemia feltételek jelenlétét jelzi [Swain, M.S. és munkatársai, Am. J. Physiol. 261: R1491-51496 (1991)].

Egyre több bizonyíték van arra, hogy a microglia szerepet játszik a DAT patológiában [McGeer, P.L. és munkatársai, Can. J. Neurol. Sci. 18: 376-379 (1991). Ezeket a sejteket számos degenerációs sejt formációban megtalálhatjuk és általában ezek a szenil lemezkék microglial sejtek vagy sejt képződmények a lemezkékben. Feltételezhető, hogy a microglia burjánzás jelzés értékű az agy esetében, amikor az agy meg akar szabadulni a hulladéksejtektől. Mivel a β-amyloid prekurzor fehérje valószínűleg a microglia területén képződik, ezek a sejtek szerepet játszhatnak a βamyloid fehérje leválásban, mégpedig ezt a folyamatot két úton lehet elképzelni: az idegvégződésű membránok patocitózisa révén, illetve a β-amyloid prekurzor fehérje befoglalás révén.

d) Hyperammonemia és excitotoxicikus aminosavak

Feltehetően a legvalószínűbb eltérés az aminosav szerkezetben a cirrhosis és a DAT betegségben szenvedő beteg esetében a többszörös glutamin koncentráció növekedés, a cirrhosis nagy területen - valamennyi területre kiterjesztetten - azonban nem tapasztalható változás a fenti aminosavak koncentrációjában a DAT betegek agyában. Hasonlóan glutamin koncentráció növekedés nem tapasztalható a cerebrospinalis folyadékban (CSF) DAT betegek esetében. Az aminosavak fenti koncentrációja ugyanakkor a CSF folyadékban kísérleti állatokban megnövelt, amely f

állatok portalis-szisztémiás encephalophathiában szenvednek. A fenti kísérleti eredmények azt jelentik, hogy a DAT betegek agya képtelen a glutamin képződést bizonyos koncentráció fölé növelni és ez egyben azt is jelenti, hogy a DAT agy jelentősen érzékeny még igen kis mértékben megnövelt ammóniaképződés sebessége is. Az ammónia koncentráció megnövekedése okán a 2-oxo-glutarát (glutamát dehidrogenáz által katalizált) reduktív aminálása történhet DAT, illetve hepatogén encephalophathiában szenvedő betegek esetében. Feltehetően a „felesleg” glutamátot az agyból csak glutamin formában távolíthatják el az utóbbi betegség esetében, azonban ez nem tehető meg a DAT betegségben szenvedő agy esetében, mivel ez a betegségben szenvedő agy limitált glutamin szintetáz aktivitással rendelkezik. A 2-oxo-glutarátból származó glutamát képződés egyidőben károsítja az energia metabolizmust, mivel csökkenti a szubsztrát egyensúlyi koncentrációját a trikarbonsavciklusban.

A DAT betegségben szenvedő betegek agyában az azonos korú betegekkel összehasonlítva a glutamát koncentráció alacsonyabb, mivel a glutamáttal-kapcsolatos neuronok hiányoznak, azonban a CSF glutamát koncentrációja a DAT betegségben szenvedő egyedek esetében is megnövelt [Pomara, N. és munkatársai, Am. J. Psychiatry 149: 251-254 (1992)]. Ez a koncentráció megnövelt a májkapu szisztémiás encephalophathiában szenvedő betegek esetében is [Therrien, G. és munkatársai, Metabolic Brain Dis. 6: 65-74 (1991)]. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy a fenti aminosav megnövelt extracelluláris koncentrációja áll fenn. Attól függetlenül, hogy fent leírtuk, hogy a glutamát megnövelt képződése a 2-oxo-glutarát reduktív aminálásával is megtörténhet, az extracelluláris glutamát koncentráció növelése valószínűleg a glutamát felvétel rendellenességéből ered, amely felvétel az idegburok csillagsejtekben megy végbe és ez amiatt következik be, mivelaz ammónia hatására a csillagsejt funkció károsodása történik. Mivel a szakirodalomban bizonyított, hogy a • · · · ···« * · ······ · · · ···· ·· · ·· ·· glutamát neurotoxikus hatása a felvételi helyek inhibiálásával megnövelt, a gliális felvétel mechanizmusának változása fő oka lehet annak, hogy a DAT betegségben szenvedő betegek sejtjeiben ingerlési toxicitás jelentkezik.

A korai stádiumban szenvedő DAT betegek esetében a betegek agyából aszpartát felszabadulás történik, és ez további oka lehet annak, hogy ingerlési toxicitás károsodás lép fel a betegség bizonyos szakaszaiban. Általában 60 éves betegek esetében a betegek normális CSF aszpartát koncentrációval rendelkeznek [Pomara,

N. és munkatársai, Am. J. Psychiatry 149: 251-254 (1992)].

A kísérletek során bizonyítékot szereztek arról, hogy a hippocampus, valamint a kéregreceptorokban glutamát csökkenés történik a DAT agyakban. Hyperammonemia betegségben szenvedő patkányok cerebellum részében mind a nagy- mind a glutamát szubsztráttal szemben alacsony-affinitású kötőhelyek száma csökken. A csökkenés csak az N-metil-D-aszpartát-specifikus kötőhelyeken történik meg, anélkül, hogy bármely változás menne végbe a kainát vagy a quisqualat kötőhelyek vonatkozásában. Ezeket a körülményeket mimézissel előállíthatjuk úgy, hogy a normál állatokból nyert membrán preparátumokat ammónium-acetáttal inkubáljuk. A muscimol (egy GABA receptor antagonista) kötését megnövelhetjük úgy, hogy ugyanilyen kísérleti körülményeket alkalmazunk [Raghavendra Rao, V.L. és munkatársai, Neurosci. Lett. 130: 251-254 (1991)]. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy az ammónia képes arra, hogy a glutamát-, illetve a GABA-függö neuronok funkcióját befolyásolja.

A jelen találmány szerinti vegyületeket leírták a 88400275.9 számú 1988. február 5-én benyújtott európai szabadalmi bejelentésben, amelynek közzétételi száma

O, 326,766. A benyújtott szabadalmi bejelentés az 5-szubsztituált-ornitin-származékok elnevezést viseli, amelyet referenciaként adunk meg. A találmány szerinti vegyü• · ······ ·· ···· ·· · ·· leteket ebben a leírásban úgy adták meg, hogy ezek alkalmasak ornitin hiány kezelésére, illetve ammónia mérgezés kezelésére.

Az ornitin a karbamid ciklus szubsztrátja. A karbamid ciklus alkalmas arra, hogy az ammónium-ionokat karbamidba építsék be, és így a testből eltávolítsák. A jelen találmány szerinti vegyületek inaktiválják az ornitint: [2-oxo-sav-aminotranszferáz (OAT)J. Feltehető, hogy a szövetben található ornitin koncentráció megnövelése, amely az OAT inhibiálásával vagy inaktiválásával történik hosszabb időtartamon át, azt eredményezi, hogy a májban karbamid képződik és feltehetően más szövetekben is ebből eredő eredmény mutatkozik. Ez a kezelés a vér illetve az agy-gerincvelői ammónia koncentráció csökkentését eredményezi. Ezek a vegyületek számos esetben alkalmasak jól ismert humán betegségek kezelésére, amely betegségek megnövelt vér vagy agy-gerincverő folyadék ammónia koncentrációból erednek és amelyek lehetnek például máj cirrhosis, heveny májelégtelenség, illetve vizelet traktus/hólyag fertőzés.

A fenti eredményekkel szemben az DAT típusú betegségekről korábban nem írták le, hogy ezeket előnyösen kezelhetjük az ammónia koncentráció csökkentésével. Ezzel szemben az OAT inhibitorok alkalmazása különösen előnyös eljárást jelent a DAT betegség kezelésében, mivel az Alzheimer betegségben szenvedő betegek többsége normál májfunkcióval rendelkezik. Ennélfogva a találmány szerinti vegyületek alkalmazása a DAT betegség kezelésének új eljárását jelenti.

A találmány tárgya új alkalmazási eljárás a találmány szerinti vegyületek esetében DAT betegség kezelésében. A találmány tárgya továbbá eljárás a találmány szerinti vegyületek enantiomer formájának előállítására, továbbá eljárás a találmány szerinti vegyületek alkalmazására kombinációban, amely alkalmas DAT betegségek kezelésében történő alkalmazására.

«· · · • · · · · · · • · · · • · · • · · · • · · · · ·

A találmány tárgya új eljárás DAT betegség kezelésére OAT inaktiváló vegyületek segítségével, amelyek előnyösen az (I) általános képletű szubsztituált-ornitin-származékok, előnyösebben 5-szubsztituált-ornitin-származékok, ahol az általános képletben R jelentése -CH₂F-csoport, CHF₂-csoport, -CHCIF-csoport, -C^CH-csoport, CH=CH₂-csoport vagy CH=C=CH₂-csoport vagy szteroizomerje vagy gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sója. A DAT betegség kezelése lehet kombinációs terápia, azzal jellemezve, hogy az OAT inhibitor vegyületeket és ezekkel együtt az agy ammónia koncentrációját csökkentő más hatóanyagokat adagolunk a betegnek.

A „DAT-betegség” vagy az „Alzheimer típusú dementia” elnevezések alatt azt értjük, hogy a szerves mentális funkciók és szindrómák fokozatos leromlása történik, amelyben rövid távon, illetve hosszú távon a memória lebomlása valósul meg. A degeneratív dementia lehet enyhe formájú (amelynek során a munka vagy szociális aktivitások csökkennek, azonban önálló élet lehetséges) közepes súlyosságú (bizonyos fokú felügyelet szükséges) vagy súlyos állapotú (folyamatos felügyelet igényelt).

A rövidtávú memória károsodásának jele az, hogy a beteg nem képes új információt elsajátítani, továbbá az, hogy például a beteg képtelen emlékezni 5 perc elteltével három tárgyra. A hosszútávú memóriakárosodás jele az, hogy a beteg képtelen olyan információra emlékezni, amely a múltban ismert volt, illetve például a beteg képtelen emlékezni múltbani személyes információkra, mint például születési helyére, munkahelyére, illetve az előző napon történt eseményekre, stb. vagy képtelen emlékezni szokásosan ismert dolgokra. Jellemző károsodás az absztrakciós gondolkodás elvesztése, az ítélőképesség elvesztése, illetve a személyiség változása vagy más magasabb agykéreg funkciók változása, illetve módosulása.

• · · · · · • · * » ···· * · *·«··· · · · ···· ·· · , φ φ φ

A „beteg elnevezés alatt melegvérű állatokat, mint például patkányt, egeret, kutyát, macskát, tengerimalacot, főemlősöket és embert értünk. A „kezelés” elnevezés alatt, illetve ennek különféle formái alatt azt értjük, hogy a beteg betegségének vagy körülményeinek szimptómáit, illetve ezek okait csökkentjük vagy megakadályozzuk.

A „sztereoizomer” elnevezés alatt bármely adott molekula izomerjeit értjük, amelyek az atomok térbeli elrendezésében különböznek. Ez az izomer lehet tükörképi izomer (enantiomer), geometriai izomer (cisz/transz-izomer), továbbá egynél több királis centrumot tartalmazó izomer, amelyek egymással szemben nem tükörképi izomerek (diasztereo-izomerek). A jelen találmány szerinti eljárásba beleértjük az (I) általános képletü vegyületek racém keverékeit, amelyek négy enantiomert is magukba foglalhatnak és ebbe beleértjük egyetlen enantiomer forma vagy az összes négy enantiomer forma jelenlétét és beleértjük azt, hogy egyetlen enantiomer formát előnyösen alkalmazhatunk a további négy enantiomerrel szemben.

A „kombinációs terápia” elnevezés alatt azt értjük, hogy két vagy több hatóanyag párhuzamos vagy egymást követő adagolását alkalmazzuk. Például a párhuzamos adagolás során adagolhatunk egy dózisformában két vagy több hatóanyagot és az egymást követő adagolás során alkamazhatunk elkülönített dózisformákban különféle időpontokban eltérő hatóanyagokat, illetve ezeket a hatóanyagokat eltérő adagolási úttal is adagolhatjuk.

A kombinációs terápiában a találmány szerinti vegyülettel együttesen alkalmazható bármely hatóanyag olyan anyag lehet, amely alkalmas DAT betegség kezelésében történő felhasználásra. Előnyösen alkalmazható hatóanyagok lehetnek azok, amelyek a DAT betegségben szenvedő egyedek esetében az ammónia-koncentrációt az agyban csökkentik. Például a karbamid-cikluson keresztül az ammónia kiválasztást elősegítő hatóanyagok, mint például ornitin, citrulline és arginin is alkal·· ·««* « »·«« ·· • · · · · · • · · · «··« • · ·····« ·« · ···· ·· · ,, mázhatok. Előnyös hatóanyagok, amelyek valószínűleg a karbamid ciklustól függetlenül csökkentik az agy ammónia-koncentrációját, ugyancsak alkalmazhatók és ezek lehetnek például az L-acetil-carnitine és az L-carnitine.

Mint valamennyi eljárásban, előnyös megvalósítási módokat alkalmazhatunk.

A jelen találmány szerinti eljárásban előnyös, amennyiben a vegyületben R jelentése CH₂F képletű csoport (az EP 326 766 számú szabadalmi bejelentés 1. példája), illetve legelőnyösebben egy olyan enantiomert alkalmazunk, amely valószínűleg az (S/S)-2,5-diamino-6-fluor-hexánsav.

1. példa

2-5-diamino-6-fluor-hexánsavat állítunk elő a 326 766 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt eljárásnak megfeleően. Az enantiomer izomereket megfelelő eljárás, mint például HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) vagy más eljárások segítségével választjuk el egymástól.

(2R,5R) és (2S,5S)-metil-3-amino-2-piperidon-6-karboxilát 2,5-diazabiciklo-(2.2.2)-oktán-3,6-diont [J. Med. Chem. 1974, 17, 481-487,

P.A. Sturm. D.W. Henry, Fonálféreg ellenes szerek. Diazabíciklo-oktán és diazabiciklo-heptán vegyületek, mint dietil-karbamazin áthidalt analógok] (10,75 g, 0,0768 mól), 560 ml (0,27 mól) sósav vízmentes metanolban készült oldatában oldjuk. Az elegyet 18 órán át 20°C hőmérsékleten keverjük, majd 21,5 g (0,082 mól) ezüstkarbonát adagolásával semlegesítjük. A reakcióelegyet ezután celite szűrési segédanyagon leszűrjük, majd az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot éjszakán át szárítjuk. A címbeli vegyület fehér szilárd anyag, 12,8 g (97% termelés).

¹H NMR spektrum (360 MHz, DC₃OD) δ ppm: 3,85 (m, 1H, CHCOO); 3.55 (m, 1H,

CHNH₂); 3.40 (s, 3H, CH₃); 1.9 és 1.4 (2m, 2x2H CH₂CH₂).

·· ·νν·

MS spektrum: mono-TFA származékok: m/e = 269 (MH⁺); 286 (MNH₄ ⁺)

Királis GC spektrum: 145°C, 1 bar H₂, TFA származékok csúcs: 15.63 perc és 16.64 perc.

(2R,5R) és (2S,5S)-metil-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon-6-karboxilát

10,2 g (0,075 mól) fenilecetsav, 13,5 g (0,075 mól) diciklohexil-karbodiimid,

7,2 ml (0,061 mól) piridin és 0,9 g (0,0073 mól) 4-(dimetil-amino)-piridin 400 ml vízmentes diklórmetánban készült elegyéhez 12,8 g (0,0744 mól) (2R,5R) és (2S,5S)-metil-3-amino-2-piperidon-6-karboxilát reagenst adagolunk. A reakcióelegyet 20°C hőmérsékleten 24 órán át keverjük, majd a képződött diciklohexil-karbamidot leszűrjük és a szűrletet bepároljuk. A maradékot gyorskromatográfia segítségével szilikagélen metanol/etilacetát 5/95 eluens alkalmazásával tisztítjuk. A címbeli vegyületet szilárd anyagként nyerjük (19,61 g, 93% termelés).

¹H NMR spektrum (200 MHz, CD₃OD) δ ppm: 7,87 (m, 5H, Ph); 6.55 (d, 1H, NH);

6.40 (s, 1H, NH-1); 4.35 (m, 1H, H-3); 4.12 (m, 1H, H-6); 3.77 (s, 3H, COOMe); 3.54 (s, 2H, COCH₂Ph); 2.5 (m, 1H, H-4A); 2.2 (m, 2H, H-5); 1.5 (m, 1H, H-4B).

HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia): Chiralpak AD, 250x4.6 mm, 21 °C, EtOH/MeOH/heptán: 25/45/30, 1 ml/perc, 210 nm, csúcs: 7.26 perc és 12.51 perc.

Elemanalízis a C₁₅H₁₈N₂O₄ képlet alapján (290.31): számított: C, 62.06; H, 6.25; N, 9.65;

mért: C, 62.50; H, 6.26; N, 9.73.

O.p.; 138°C.

(2R,5R) és (2S,5S)-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon-6-metilalkohol

1,451 g (0,005 mól) (2R,5R) és (2S,5S)-metil-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon-6-karboxilát vízmentes 50 ml dietiléterben készült szuszpenziójához, illetve 12,5 ml tetrahidrofurán elegyéhez 0,109 ml (0,005 mól) lítium-bórhidridet, továbbá 0,5 ml ·· »··« · «« • · · '· « ···· • * * «·· * · · · • ·» * « « (1m, 0,0005 mól) lítium-tri-szek-butil-bórhidridet adagolunk. A reakcióelegyet 12 órán át visszafolyatás melleti hőmérsékleten forraljuk, majd az elegyhez 5 ml metanolt adagolunk. Ezt követően az oldószereket elpárologtatjuk, majd a maradékot gyorskromatográfia segítségével szilikagélen metanol/etilacetát 8/92 eluens alkalmazásával tisztítjuk. A kapott terméket átkristályosítjuk, és így fehér szilárd címbeli vegyületet nyerünk (2,275 g, 97% termelés).

¹H NMR spektrum (200 MHz, CD₃OD) δ ppm: 7.7 (m, 5H, ph); 4.05 (m, 1H, H-3); 3.25 (m, 3H, CHCH₂O); 1.55 (m, 4H, H-4, H-5).

HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia): Chiralpak AD, 250x4.6 mm, 21 °C, etanol/heptán: 60/40, 1 ml/perc 210 nm csúcs: 5.37 perc és 6.48 perc.

Elemanalízis eredmények a C₁₄H₁₈N₂O₂ képlet alapján (262.311): számított: C, 64.11; H, 6.92; N. 10.68;

mért: C, 64.12; H, 6.86; N. 10.68.

O.p.: 158°C.

(2R,5R) és (2S,5S)-6-(fluor-metil)-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon-6-metilalkohol

52,4 mg (0,2 mmol) (2R,5R) és (2S,5S)-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon-6-metilalkohol 5 ml vízmentes diklórmentánban készült szuszpenzióját -78°C hőmérsékletre hütjük. Ezt követően az elegyhez lassan hozzáadagolunk 53,2 g (0,4 ml, 0,4 mmol) dimetil-amino-kén-trifluoridot. A reakcióelegyet 5 percen át -78°C hőmérsékleten keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és ezen a hőmérsékleten további 16 órán át keverjük. Ezután a reakciót jeges víz hozzáadagolással leállítjuk. A szerves fázist 25 ml diklórmetánnal hígítjuk, majd vízzel mossuk. A szerves oldatot ezután nátrium-szulfáton megszárítjuk, leszűrjük, majd az oldószert elpárologtatjuk. A maradékot gyorskromatográfia segítségével semleges aluminium-oxid • · · • ··· ···· • · «····· ·· ··«· ·· « · · ·· 15

III aktivitású oszlopon tisztítjuk, eluensként metilalkohol/etilacetát 8/92 elegyet alkalmazunk. A kapott terméket kloroform/pentán oldószerelegyböl átkristályosítjuk, és így fehér kristályos címbeli vegyületet nyerünk (0,024 g, 45% termelés).

¹H NMR spektrum (360 MHz, CD₃OD) δ ppm: 7.3 (m, 5H, C₆H₅); 6.47 (d, 1H; NHCOCH₂Ph); 6.27 (s, 1H, NH); 4.35 (dAB, H_A, JH_AF = 46.4 Hz), 4.33 (dAB, 1H, JH_bF = 47.33 Hz); 4.24 (m, 1H, H-3); 3.75 (m, 1H, H-6); 3.6 (s, 2H, CH₂Ph); 2.42 (m, 1H,H₂).

¹⁹F NMR spektrum (338.8 MHz, CHCI₃) δ ppm: -62.82 (dt, JHF = 46.8 Hz).

HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia): Chiralpak AD, 250x4.6 mm, 21 °C, etanol/heptán: 60/40, 0.5 ml/perc 210 nm.

csúcs: 12.8 perc és 14.8 perc.

Elemanalízis eredmények a C₁₄H₁₇N₂O₂F képlet alapján (264.30): számított: C, 63.62; H, 6.48; N, 10.60;

mért: C, 63.17; H, 6.56; N, 10.52.

(2R,5R) és (2S,5S)-6-fluor-metil-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon és (2S,5S)-6-(fluor-metil)-3-amino-2-piperidon

0,097 g (0,37 mmol) (2R,5R) és (2S,5S)-6-(fluor-metil)-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon 11 ml (0,1 M) pH 7,0 foszfát-pufferben készült oldtát készítjük el, majd az oldathoz 0,040 g nedves penicillin-acilázt adagolunk. Az elegyet 30 percen át keverjük, majd az enzimet leszűrjük és az oldatot diklórmetánnal mosuk, és így 0,057 g (2R,5R)-6-(fluor-metil)-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon vegyületet eltávolítunk. A vizes fázist bepároljuk, és így 0,023 g fehér szilárd (2S,5S)-6-(fluor-metil)-3-amino-2piperidont nyerünk.

HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia): Chiralpak AD, 250x4.6 mm, 21 °C, etanol/heptán: 60/40; 0,5 ml/perc, 210 nm.

csúcs: 14.8 perc.

• · ····· ···· · · • · · · · • · · · ···· • · »····· ·· ··· ·· · · · · ♦ (2S,5S)-6-fluor-2,5-diamino-hexánsav, dihidroklorid és [(2S,5S)-5-(fluor-metilj-ornitin, dihidrokloridl

0,020 g (0,17 mmol) (2S,5S)-6-(fluor-metil)-3-amino-2-piperidon 1 ml 6n sósavban készült oldatát 7,5 órán át visszafolyatás melletti hőmérsékleten forraljuk. Ezután az oldatot 2 ml vízzel hígítjuk, majd 4x4 ml diklórmetánnal mossuk. A vizes fázist bepároljuk és a maradékot metanol/dietiléter oldószerelegyből átkristályosítjuk. A címbeli vegyület fehér kristályos anyag (15 mg, 82% termelés).

¹H NMR spektrum (360 MHz, CD₃OD) δ ppm: 4.4 (m, 2H, CH₂F); 3.8 (m, 1H, H-2);

3.3 (m, 1H, H-5); 1.7 (m, 4H, CH₂CH₂).

¹⁹F NMR spektrum (338.8 MHz, CHCI₃) δ ppm: -69.15 (dt, ³J=23 Hz, ²J=47 Hz).

2. példa

A találmány szerinti vegyületekkel végzett kezelés hatásosságát vizsgáltuk.

Vénás vérben ebből a célból a vér ammónia koncentrációját mértük ammónia specifikus elektród alkalmazásával a H. F. Proelss és munkatársai, Clin. Chem. 19: 11621169 (1973) közleményben leírt eljárásnak megfelelően, amely közleményt referenciaként adunk meg. Abból a célból, hogy a kötött ammónia hidrolitikus eljárással történő felszabadulását minimiálisra csökkentsük, a vérmintákat közvetlenül a mintavétel során 0°C hőmérsékletre hűtöttük és proteinmentesítettük úgy, hogy egyenlő térfogatú 0,4m perklórsavval elegyítettük. A keveréket 1:1 arányban 0,2m perklórsavval hígítottuk és ezután a fehérjéket centrifugálással elválasztottuk. Az ammónia koncentráció a tiszta felúszóban az alábbi eljárással határozható meg: 0,5 ml mintát elegyítettünk szobahőmérsékleten 20 μΙ 10m nátrium-hidroxid oldattal. Az elegybe ammónium specifikus elektródot merítettünk (mint például az Orion Research Inc., Cambridge, Mass. terméke). Ezután az ammónia által okozott feszültséget mértük.

·· ····· ···· ·· • · · « · • «·· ···· • · ······ ·· ··· ·« « · · · ·

Az ammónia specifikus elektród kalibrálásához ismert koncentrációjú ammónium-klorid oldatokat alkalmaztunk.

3. példa

A találmány szerinti vegyületek aktivitása, amellyel a β-amiloid plague keletkezését megakadályozzák vagy csökkentik, ebből eredően alkalmazhatók senile dementia Alzheimer típusú betegség kezelésére vagy más olyan betegségek kezelésére, amely β-amiloid plaque képződéssel jár együtt, mint például Down szindróma, kimutatható különféle in vitro és in vivő β-amiloid plaque képződés modelleken. Például a találmány szerinti vegyületek képességét a β-amiloid leválások megakadályozására vagy csökkentésére kimutathatjuk számos sejtes és sejtmentes in vitro eljárással, amelyeket az alábbiakban 1-3. tesztvizsgálatként írunk le. Ezek a tesztvizsgálatok azt a tényt használják ki, hogy természetes β-ΑΡΡ expresszálódik sejtek által és ezt feldolgozzák 11-12 KDa C-terminális fragmensek előállítására, illetve βamiloid képzésre. Az endogén β-ΑΡΡ expresszálást elősegíthetjük kívánt esetben úgy, hogy a β-ΑΡΡ cDNS szekvenciákat, például β-ΑΡΡ (751) szekvenciát ültetünk a sejtekbe standard eljárás segítségével.

In vitro tesztvizsgálatok

1. tesztvizsgálat: Immun-csapadék képzés

Sejtek: CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary; kínai hörcsög ovárium; ATCC eredetű) sejtvonalakat stabilan átültettünk úgy, hogy nagy mennyisűg βΑΡΡ-695-t expresszáljon, majd ezt a sejtvonalat „CP-6-36” néven a β-ΑΡΡ leválások szkrinelésére alkalmaztuk. Más emlős tenyésztett sejtvonalak ugyancsak alkalmazhatók ebben a tesztvizsgálatban. Például alkalmazható a humán neuron sejtvonal SK-N-ML (ATCC eredetű) és igen jó eredményeket ad ugyanilyen tesztvizsgálati körűimé• · · · nyék alkalmazásával. A βΑΡΡ-695-el történő átültetés nem szükséges feltétele a βΑ4 termelésnek; ez csak megnöveli a βΑ4 jelet. A teszvizsgálat során CP-6-36 sejteket kis sűrűséggel 10 cm méretű petricsészékbe oltottunk, majd a tenyészetet 2-4 napon át összefüggő monoréteget képző tenyészetté növesztettük (körülbelül 1,5x10⁷ sejt/petricsésze). Az inkubálást 37°C hőmérsékleten 5% CO₂ inkubátorban végeztük. A táptalaj DMEM 21/Coon F12 (1:1) + 10% FBS (magzati marhaszérum) + 50 U/ml penicillin és 50 μ/ml sztreptomicin tartalmú.

Kezelés: Valamennyi találmány szerinti vegyületet kezdetben CP-6-36 sejteken 200 prnol dózisban szkrineltünk. A tesztvizsgálat végrehajtása előtt mindenegyes vegyület 20 mmol tárolt mennyiségét állítottuk elő úgy, hogy egy sejttenyészeti tisztaságú DMSO (dimetil-szulfoxid) oldószert alkalmaztunk. Ezt követően mindenegyes 20 mmol tárolt vegyületet 100-szoros mennyiségre hígítottunk szérummentes EMEM közeggel, amelyben nem található cisztein és metionin aminosav („Cys-/Met- EMEM'j, így a vizsgált vegyületből a közegben 200 μιτιοΙ végső koncentrációt állítottunk elő. A tesztvizsgálat megkedzése előtt a sejteket „éheztettük cisztein és metionin vonatkozásában úgy, hogy a sejt monorétegeket 3x3 ml/petricsésze Cys-/met- EMEM táptalajjal mostuk. Ezt követően a sejttenyészetet 37°C hőmérsékleten 5% CO₂ alkalmazásával 3 ml/petricsésze azonos táptalajon 15 percen át inkubáltuk. Ezt a táptalajt a petricsészékből kiszívtuk, majd a találmány szerinti vegyületet 200 prnol mennyiségben tartalmazó táptalajt adagoltunk a petricsészékbe 3 ml/petricsésze mennyiségben. Ezeket a lemezeket, illetve a „kontroll” petricsészéket (amelyekben 3 ml/petricsésze Cys-/Met- EMEM táptalaj található, amely 1% dimetil-szulfoxidot tartalmaz és nem tartalmaz tesztvizsgálatnak alávetett vegyületet) inkubáltuk a fentiek szerint 15 percen át. Ezt a közeget ezután a petricsészékből kiszívtuk és mindenegyes petricsészébe további 3 ml előző lépésben nyert táptalajt ·· ····· ···· ·· « · · · · · • ··· ···· • · ······ 9 · · • ·· · ·· · ·· ·· adagoltunk, amely ez esetben ³⁵S-transz jelzett (³⁵-S-jelzett cisztein és metionin) tartalmú volt. Az adagolást körülbelül 150 gCi/ml mennyiségben végeztük. A sejteket a fenti körülmények között 4 órán át inkubáltuk.

Sejt begyűjtés: 4 óra jelzési periódus elteltével a sejteket mikroszkóp alatt minden szempontból megvizsgáltuk és ellenőriztük, hogy a vegyületek nagybani toxicitás hatása milyen mértékű. Ezt követően a sejteket tartalmazó petricsészéket jégre helyeztük. Mindenegyes petricsészéből a kondicionált közeget 15 ml kúpos csavaros tetejű csőbe vittük, majd 2000 ford/perc érték mellett 10 percen át centrifugáltuk. Ezt követően hasonló csövekbe állni hagytuk és valamennyi labdacsként kiváló sejtet eldobtuk. A jelzett sejt monorétegeket 3x2 ml/petricsésze foszfát puffereit fiziológiás sóoldattal (PBS) mostuk, majd ezt követően a sejteket 1 ml pufferrel elegyítettük, amely elősegíti a sejt lebontást (lizist) (5% Triton X-114; 20 mmol Tris, pH 7,5;

300 mmol NaCI; proteáz inhibitorok). A puffer petricsészéhez történő adagolása után az elegyet 10 percet át jégen inkubáltuk. A sejt lizátumot a petricsészékről lekapartuk, majd 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövekbe vittük. A lizátot ezt követően ultrahangos keverésnek vetettük alá jégen 4 perc időtartamon át, majd a mikrocentrifugában 10 percen át nagy sebességgel centrifugáltuk. Ezt követően 15 ml-es kúpos csavaros tetejű csövekbe vittük és a labdacsot, illetve a sejtroncsolt maradékot eldobtuk.

Immun-csapadék leválasztás: Az immun-csapadék képzése céljából a fent gyűjtött lizátumot 5 ml 1 x RIPA pufferrel elegyítettük (10 mmol Tris; pH 8.0; 150 mmol NaCI; 0.125% NaN₃; 1% Triton X-100; 1% deoxi-kolát; 0.1 SDS). A kondicionált közegű mintákat hígítás nélkül immunlecsapásnak vetettük alá. A kondicionált közeget, illetve a lizátumot először áttetszővé alakítottuk 5 μΙ normál nyúlszérum adagolásával, majd ezt követően a minták 10 percen át szobahőmérsékleten történő rázatásával. Ezután a mintákhoz 100 μΙ 10%-os fehérje A-Sepharose-t (PÁS) adagoltunk RIPA pufferben. Az elegyet ezt követően 1,5 órán át szobahőmérsékleten rázattuk. Ezután a mintákat 3000 ford/perc érték mellett centrifugáltuk, majd a felúszót új 15 ml térfogatú csövekbe vittök át. Az előtisztított lizátumot ezután immunlecsapásnak vetettük alá 30 μΙ antitest adagolásával, amely antitest felismeri az egyes csövekben a βΑΡΡ karboxil-terminális csoportot. Az adagolás után az elegyeket 10 percen át szobahőmérsékleten rázattuk, majd az elegyekhez 100 μΙ 10%-os PÁS oldatot adagolunk és a rázatást szobahőmérsékleten 1,5 órán át folytattuk. Az előtisztított kondicionált közeg mintákat azonos módon immunlecsapásnak vetettük alá, azonban ebben az esetben 45 μΙ olyan antitestet adagoltunk a mintákhoz, amely a βΑ4 szerkezeti egységeket felismeri és nem a karboxil-terminális csoporthoz kötődő antitestet adagoltuk. Valamennyi mintát ezt követően 1 percen át 3000 ford/perc érték mellett centrifugáltuk és a PAS-antitest komplex labdacsokat, illetve a kapott labdacsokat alaposan kimostuk; négy alkalommal magas sótartalmú pufferrel (50 mmol Tris; pH 7,5; 500 mmol MaCI; 5 mmol EDTA; 0,5% Nonidet P-40), majd háromszor kis sótartalmú pufferrel (50 mmol Tris; pH 7,5; 150 mmol NaCI; 5 mmol EDTA; 0,5 Nonidet P-40) és végül két alkalommal 10 mmol Tris pufferrel pH 7,5 mostuk.

Gél elektroforézis: A mosott labdacsokat 5 percen át 50 μΙ 2 x Laemmli gél terhelő pufferben visszafolyatás mellett forraltuk. Ezek a minták, valamint molekulatömegük jelzői 16,5%-os SDS-poliakril-amid gélben helyeztük, amely Tris/Tricin tartó pufferrel ellátott. A gélt 90V érték mellett körülbelül 18-20 órán át elektroforézisnek vetettük alá, majd 20% metanol/20% ecetsavban fixáltuk és 2 órán át 65°C hőmérsékleten szűrőpapíron szárítottuk. Ezt követően autoradiográfia segítségével az eredményeket előhívtuk.

Analízis: Az eredményeket az autoradiogram analízisével nyertük. Pozitív hatású vegyületnek tekintettük azt a vegyületet, amely inhibiálja a 4 kDa βΑ4 fehérje ··«·· ···· «· • · · · · · • ··· ···· • · ······ ·· · ···· ·· · ·· ·· kötést a kontroll mintával szemben és amely növeli a 9-12 kDa C-terminális fehérje kötést koncentrációját a mintával szemben. A βΑ4 inhibiálást vagy a C-terminális kötések megnövelését számszerűsíthettük úgy, hogy a kötéseket denzitometria segítségével szkenneltük, a szkennelést a normál kontroll kötésekre vonatkoztatva normalizáltuk. Negatívan ható vegyület az a vegyület, amely nem mutat változást a 4 kDa βΑ4 vagy 9-12 kDa-terminális fehérje kötések esetében a kontroll mintákkal összehasonlítva.

További tesztvizsgálat: Amennyiben valamely vegyületről megállapítottuk, hogy aktív hatású, (azaz jelentősen inhibiálta a 4 kDa βΑ4 képződést és ugyanekkor növelte a C-terminális fragmenseket gél analízis alapján) a vegyülettel dózis-válasz függvény tesztvizsgálatot hajtottunk végre és meghatároztuk a vegyület legkisebb dózis értékét, amely ahhoz szükséges, hogy a fenti hatást kifejtse. A dózis érték jellemzően általában 12,5-300 pmol és attól eltekintve, hogy a dózis értéke változik, a tesztvizsgálatot a fentieknek megfelelően hajtottuk végre. Amennyiben a vegyületről csak azt mutattuk ki, hogy igen kismértékben aktív vagy egyáltalán nem aktív, a vizsgálatot magasabb dózis, jellemzően 400 μΓποΙ dózis alkalmazásával megismételtük. Amennyiben a vegyületről kimutattuk, hogy toxikus (például a mikroszkóp alatti vizsgálat során a sejtek nem egészségesnek mutatkoztak vagy a lizát nem tartalmazott gél analízis után jelzett vegyületet) a vegyületet kisebb dózis, például 25, 50 és 100 pmol dózis alkalmazásával újra tesztvizsgálatnak vetettük alá abból a célból, hogy meghatározzuk, hogy a vegyület nem toxikus dózisának hatása milyen értékű.

2. tesztvizsgálat: Radioimmum-tesztvizsqálat

Az RIA (radioimmun-tesztvizsgálat) közegének előállítása és Sepak concentrációja

Tenyésztett emlőssejtek, mint például kínai hörcsöt ovárium (CHO) sejtek vagy humán neuron SK-N-ML sejtek β-amiloidot termelnek és ezt a pepiidet a te* • · «·*· · • · · · • · nyésztési közegbe szekrécióval kiválasztják. Amennyiben a sejteket a β-amiloid képződés potenciális inhibitoraival kezeljük, a kezelt sejtek táptalajában nem található β-amiloid. Mint az 1. tesztvizsgálat esetében is, különféle dózisú inhibiáló vegyületeket vizsgálhatunk, amelyek dózisa 200 pmol értéktől kezdődhet. A CHO sejtek esetében vad típusú és β-ΑΡΡ695 sejteket transzferáltnk. 10 cm méretű lemezeket alkalmaztunk és ezeket 2 ml EMEM (szérummentes) táptalajjal 4-6 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáltuk az inhibiáló vegyületek jelenlétében vagy ezek jelenléte nélkül, majd a kapott eredményt értékeltük. A táptalajt eltávolítottuk, majd 10 percen át 1500 ford/perc értéken centrifugáltuk (Sorvall RT6000B készüléken). így valamennyi sejtet/sejt töredéket eltávolítottunk. A közeget ezt követően vagy közvetlenül felhasználtuk vagy -20°C hőmérséklet értéken tároltuk.

A Sepak C18 lépést abból a célból hajtottuk végre, hogy a sókat és egyéb nem kívánatos szennyezéseket eltávolítsuk, valamint a β-amiloid peptideket koncentráljuk. 2 ml térfogatú táptalaj mintát vezettünk keresztül 18 Sepak patronon, majd a patront 2 ml 5%-os CH₃CN tartalmú 0,1 %-os TFA (trifluor-ecetsav) oldattal mostuk. Az átfolyt anyagot, illetve az 5%-os CH₃CN segítségével végzett mosás mosófolyadékát eldobtuk. Ezután a patront 2 ml 25% CH₃CN tartalmú 0,1 %-os TFA oldattal eluáltuk, majd 2 ml 50% CH₃CN tartalmú 0,1 %-os TFA oldattal eluáljuk. Mindkét eluált anyagot gyűjtöttük és gyors vákuumszárítóval szárítottuk, majd a maradékot 125 pl - 250 pl közötti térfogatú 10%-os vizes izopropanol oldatban oldottuk, és így ezt követően RIA (radio-immun tesztvizsgálat) végeztünk. A 25% CH₃CN segítségével nyert frakció a közegből származó fenol-vörös legnagyobb részét tartalmazta, azonban nem tartalmazott β-amiloid pepiidet. Az 50%-os CH₃CN segítségével nyert frakció a β-amiloid peptideket tartalmazta.

·· ···· · ···· ·· • 9 9 9 9 • 9 · · 9 9 99 · «····· ·· · ··· ·· · ·· ·· ¹²⁵l-jelzett-B-amiloid 1-40 előállítása és HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfiás) tisztítása: Szintetikus β-amiloid 1-40 vegyületet (10 pg) ¹²⁵l-jelzéssel láttunk el (1mCi) Khloramin T eljárás segítségével. A reakciót szobahőmérsékleten hajtottuk végre. Eppendorf csőben 10 μΙ ¹²⁵l reagenst (1 mCi NaOH-oldatban) adagoltunk 10 μΙ B-amiloid 1-40 vegyület (1 mg/ml 20%-os izopropanolban) és 80 μΙ 0,01 m Na-foszfát pH 7,4 puffer elegyéhez, majd a keveréket elegyítettük. A reakciót 30 μΙ Chloramin-T (1 mg/ml 0,1m Na-foszfát pufferben pH 7,4) adagolásával iniciáltuk, majd a keveréket elegyítettük és 1 percen át inkubáltuk. A reakciót 150 μΙ Na-metabiszulfit (2 mg/ml, 0,1m Na-foszfát pufferben pH 7,4) adagolásával leállítottuk.

A 280 μΙ reakcióelegyet azonos térfogatú vízzel hígítottuk, majd Sepak C18 patronon vezettük át, és így a jelzett pepiidet elválasztjuk. A Sepak patront 2x5%-os CH₃CN oldattal (egyenként 1 ml) mostuk, majd 3x50%-os CH₃CN oldattal (1 ml egyenként) mostuk. Ezt követően a patront 2x95%-os CH₃CN (1 ml egyenként) oldattal mostuk. Valamennyi jelzett peptid eluálódik az első 50%-os CH₃CN segítségével végzett eluálás során. Ezt az eluátumot -70°C hőmérsékleten tároltuk és az RIA (radioimmun tesztvizsgálat) céljára HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) segítségével tisztítottuk.

A jelzett pepiidet reverz fázisú HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) segítségével tisztítottuk C8 patronon (4,6 mm x 3 cm, Brownlee). Az oszlopot lineáris gradiens eluens alkalmazásával eluáltuk, amely eluens 5%-45% CH₃CN tartalmú 0,1 TFA (trifluor-ecetsav) oldatban. Az elúciót 30 percen át végeztük 0,5 ml/perc áramlási sebességgel. 0,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk, majd ezeket számláltuk. A jelzett pepiidet tartalmazó frakciókat ezt követően egyesítettük, majd -20°C hőmérsékleten tároltuk és 3 napon belül RIA (radioimmun tesztvizsgálat) vizsgálatban fel használtuk.

Radioimmun-tesztvizsgálat: Az RIA (radioimmun-tesztvizsgálatban) alkalmazott pufferek az alábbiak:

1) RIA puffer: 0,1 mól Na-foszfát, pH 7,4, amely 0,1% BSA és 0,1% Triton-X-100 tartalmú.

2) Minta puffer: 10% izopropanol vízben készült oldatai.

3) Nyomjelző puffer: 0,2m Na-foszfát, pH 7,4, amely 0,1% BSA tartalmú 0,1 %-os Triton-X-100 pufferben.

A β-amiloid specifikus antitestek olyan hígításban alkalmazottak, ahol körülbelül a jelzett peptid 30%-a kötött a kompetitív ligandum jelenléte nélkül. Az antitestek hígításait RIA pufferben képeztük. Az RIA vizsgálatban alkalmazott antitestek három különféle szérumban keletkezett antitestek, amelyek a humán β-amiloid 1-40 szintetikus pepiiddel szemben működnek (BA#1, BA#2 és 6514). A BA#1 antitestet 1/900 végső hígításban, a BA#2 antitestet 1/1600 végső hígításban, illetve a 6514 antitestet 1/2500 végső hígításban alkalmaztuk. A HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) segítségével tisztított jelzett pepiidet a nyomjelző pufferrel olyan mértékben hígítottuk, hogy 50 μΙ térfogatban körülbelül 7000-9000 cpm értéket érjünk el. A teljes helyettesítést magas koncentrációjú (2,5 μίτιοΙ) β-amiloid 1-40 jelenlétében végeztük. A β-amiloid 1-40 standardokat azonos pufferben állítottuk elő. A minta térfogata 200 μΙ. Az alábbi komponenseket adagoltuk az alábbi sorrendben:

100 μΙ Ab-RIA pufferben μΙ ismeretlen minta vagy standard vagy TD mintapufferben μΙ jelzett peptid (7000-9000 cpm a nyomjelző pufferben).

A mintákat elegyítettük, majd 4°C hőmérsékleten éjszakán át inkubáltuk. A szabad jelző anyagot a kötött jelző anyagtól úgy választottuk el, hogy a tesztvizsgálatot polietilén-glikol aladolásával (PEG) blokkoltuk. Valamennyi tesztvizsgálati csőbe • · • · · · · · ·· • « 9 ···· · · · · ······ · ·· ·* μΙ normál nyúl szérumot adagoltunk, majd ezt követően 800 μΙ PEG (molekulatömeg 6000-8000, 15,8%-os koncentráció RIA pufferben) adagoltunk. A mintákat 10 percen át 4°C hőmérsékleten inkubáltuk, majd 3200 ford/perc érték mellett 20 percen át centrifugáltuk (Sorvall, RT600B). A felúszót leszívjuk, majd a labdacsokat gamma számlálóval számláltuk.

Analízis: Az antitest kötődés eredményeit a jelzett β-amiloid jelző vegyület helyettesítésével mértük. Pozitív eredménynek tekintjük, amennyiben a jelzett vegyület helyettesítését nem tapasztaltuk, azaz amennyiben a kapott táptalaj nem tartalmazott szekrécióval kiválasztott β-amiloidot, amely azt jelenti, hogy a tesztvizsgálatnak alávetett vegyület hatásos a β-amiloid termelés inhibiálásában. Negatív eredménynek tekintjük azt, amennyiben a jelző vegyület helyettesítése megtörtént az antitest kötődés során és ez ekvivalens volt a nem kezelt kontroll sejtek esetében tapasztalt értékekkel.

Az aktív vegyület azonosítására enzim kötött immun-szendvics tesztvizsgálatot (EUSA) is alkalmazhatunk. Tenyésztett emlőssejteket (mint például CHO CP-6 vagy SK-N-MC), amelyek β-amiloid fehérjét termelnek, állítottunk elő és az 1. tesztvizsgálat szerinti eljárásnak megfelelően a találmány szerinti vegyületekkel kezeltük azzal a különbséggel, hogy a sejt fehérje radiojelzését eltávolítottuk. A kezelt sejttenyészetből kondicionált táptalajt gyűjtöttünk, majd a sejt törmeléket kis sebességű centrifugálás segítségével ebből eltávolítottuk. A kondicionált táptalajt ezután 96 üreges EUSA lemezen tesztvizsgálatnak vetettük alá β-amiloid-specifikus antitestek alkalmazásával. Az egyik β-amiloid antitest, mint befogó reagens szerepelt a táptalaj mintákban jelenlevő β-amiloid megkötésére. Egy másik β-amiloid-specifikus antitest a β-amiloid fehérjén felismerte a különféle epitop helyeket és ez mint detektor komplex játszott szerepet. A második β-amiloid antitest konjugálódott biotinnal, amely strept-avidin segítségével detektálható. Egy harmadik antitestet, amely torma •v «V4« · peroxidázhoz kötött abból a célból alkalmaztunk, hogy a β-θίτιίΙοίό^ηίίίΘεΡείΓβρί: :avidin komplexet detektálja. Orto-fenilén-diamin szubsztrát + H₂O₂ és citrát-foszfát pH 5 puffer adagolása lehetővé tette, hogy a peroxidáz aktivitás kifejlődjön és ezt kolorimetriás méréssel a keverék változásával mérhettük OD^490nm érték mellett. Jellemzően háromszoros higítássorozatot készítünk mindenegyes táptalaj mintából a 96 üreges lemezen a standardon kívül, amely szintetikus β-amiloid 1-40 protein. Pozitív eredménynek azt tekintettük, amennyiben reaktivitás nem mutatkozott vagy igen kicsi reaktivitást tapasztaltunk, azaz az OD^490nm értéknél az abszorpció a β-amiloid fehérje hiányát jelezte a táptalaj mintában, mivel a tesztvizsgálatnak alávetett vegyület inhibiáló hatást fejtett ki. A részben aktív inhibitor vegyületek valamennyi aktivitást mutattak oD^490nm abszorpcióban, azonban ez a mért érték a nem kezelt sejtek kontroll táptalaj mintáival nem azonos. Pontos mennyiségi meghatározást végezhetünk úgy, hogy aminta értékeket összehasonlítottuk a standard értékekkel.

In vivő tesztvizsgálatok

A találmány szerinti vegyületek aktivitását a β-amiloid plague akkumuláció csökkentésében transzgén egér modellben mutathatjuk ki, amely β-amiloid plakk akkumulációban szenved, illetve kutya modellben vizsgálhatjuk olyan kutyák esetében, amelyek természetesen genetikus úton hajlamosak β-amiloid plakk képzésére. Transzgén egereket írtak le, amelyek a neruon sejtekben humán β-ΑΡΡ (7519) vagy β-ΑΡΡ (770) sejteket expresszálnak túlzott mennyiségben és hisztopatológiai jeleket mutattak, amelyek Alzheimer betegséggel kapcsolatosak, például a PCT/US91/04447 számú szabadalmi bejelentésben. A fenti állati modellek esetében a hisztopatolótia és/vagy β-amiloid leválással kapcsolatos szimptómák, mint például memóriavesztés csökkentése alkalmazható arra, hogy kimutassuk a találmány szerinti vegyületek alkalmasságát arra, hogy a β-amiloid plakk képződéséből eredő terápiás körűimé27 • · ····· ···· ·· • · · · · · • ··· ···· • · ······ «· · ♦ ·· · ·· · ·· · nyék, mint például Alzheimer betegsék kezelésére, illetve a Down szindrómával kapcsolatos memóriavesztés kezelésére alkalmasak.

Mivel a transzgén egerek hisztopatológiája idősebb korban gyakoribb, 2 hónapos egereket alkalmaztunk. Az alkalmazott két hónapos állatok minimális patológiai jelenséggel rendelkeztek, amely az inhibitor hatóanyag jelenléte nélkül azonnal növekedett volna. Valamennyi kísérletben alkalmazott állat egyetlen tiszta pedigrés ágyból származott. Az egerek egyik csoportja (n = 12) csak hatóanyaggal kezelt; második egér állatcsoport (n = 12) alacsony dózisú hatóanyaggal is kezelt; és egy harmadik állatcsoport (n = 12) közepes dózissal kezelt; végül egy negyedik állatcsoport (n = 12) magas dózisú hatóanyaggal kezelt volt. Az alkalmazott dózist a fenti kísérletekben úgy határoztuk meg, hogy megmértük a testtömeget, az alkalmazott vegyület fél élettartamát, stb. Ideális esetben az egyes egereket több hónapon át kezeltük. A hatóanyag vegyület kezelését injektálás, orális adagolás, illetve beültetett forma segítségével végeztük, amely esetében a kibocsátás megfelelő sebességű, stb. és ezt a vegyület profiljának megfelelően határoztuk meg. A kezelés eredményeit immuno-hisztokémia segítségével határoztuk meg, amelynek során meghatároztuk a β-amiloid immunoreaktív leválások gyakoriságát az agy coronalis középvonal kiválasztások esetében egy olyan gyakorlott vizsgáló alkalmazásával, aki a kísérleti kezelésről nem tájékoztatott. Egyéb patológia jelzés lehet az Alz50 immunoreaktivitás, amelyek ugyanilyen számú agyszövet szekció megjelenésének gyakoriságával számszerüsíthetünk az összes tanulmányban alkalmazott egér esetében. Az adott találmány szerinti hatóanyag pozitív hatása azt jelzi, hogy a patológia jelző értékek nem jelentkeznek, illetve ezeknek gyakorisága csökkentett. A fiziológiai és/vagy viselkedési korreláció a β-amiloid transzgén egerekben ugyancsak alkalmazható a hatóanyag hatásának bizonyítására.

τ • · V · · · · ···· ·· * · · · · · • ··· « · · · • · ······ · · ·

Bizonyos kutyafajtákról kimutatták, hogy β-amiloid akkumulációt mutatnak [Giaccone és munkatársai, Neuroscience Letters Vol. 114, 178-183 (1990)]. Az időskorú nem-humán főemlősök β-amiloid patológiát mutatnak, illetve memóriavesztést is jeleznek [Cork és munkatársai, American Journal of Patholoqy, Vol. 137, 13831392 (1990); Podlisny és munkatársai, American Journal of Patholoqy, Vol. 138, 1423-1425 (1991)]. A kutyafajtákkal és a nem-humán főemlősökkel végzett kísérletek valószínűleg kissé eltérő kísérleti körülményeket követnek a találmány szerinti hatóanyag alkalmazásával, amely alkalmazás hosszabb idejű.

4. példa

A találmány szerinti vegyületeket alkalmazó kezelés hatásosságának vizsgálata céljából a kognitív és nem-kognitív viselkedés rendellenességeit vizsgáltuk DAT betegekben az ún. ADAS (Alzheimer betegség megállapítási skála) vizsgálat segítségével a [W. G. Rosen és munkatársai, Am. J. Psychiatry 141: 1356-1364 (1984)] közlemény szerinti eljárásnak megfelelően, amelyet referenciaként adunk meg. A kognitív funkció csak 17 esetben vizsgálható. Ezek a memória funkciók, a nyelv funkciók és a fogalomalkotási prakszis, továbbá a konstruktív prakszis. A nem-kognitív viselkedést 23 egységben vizsgálhatjuk, illetve sorolhatjuk be, amelyek például a hangulat állapot (depresszió vagy szorongás), a vegetatív szimptómák, a szocializáció képessége, a kooperáció, a napi élet végrehajtásának iniciálása, a pszichotikus szimptómák, a motoros aktivitás, az idegesség vagy túlzott mozgás, a koncentráció, illetve az éjszakai illetve reggeli zavartság.

* ·

5. példa

A példában leírjuk az eljárásokat, amelyek alkalmasak arra, hogy meghatározzuk milyen egyéb hatóanyagok alkalmasak kombinációs terápiában történő alkalmazásra a találmány szerinti vegyülettel, illetve melyek alkalmasak önálló alkalmazásra.

Anyagok és eljárások:

Vegyszerek:

A szokásos laboratóriumi vegyszereket a Baker Chemical (Deventer, The Netherland) vagy Merek (Darmstadt, Germany) szerezzük be. Az L-carnitin, az L-acetil-carnitin, az N-acetin-L-glutamát és az aminosavak, mint például L-ornitin, L-arginin és L-citrullin a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) cégtől szerezhetők be. Az 5-fluor-metil-ornitin.2HCI.H₂O (5FMOrn) a találmány szerinti vegyület [(+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,b]cikloheptén-5,10-imin] a Bioblock Scientific (lllkirch, Francé) terméke. Az (R)-4-oxo-5-foszfono-norvalin a [Whitten és munkatársai, J. Med. Chem. (1990) 11:2961-2963] közlemény szerint állítható elő és a Marion Merrell Dow Inc. állítja elő.

Laboratóriumi állatok:

Nőstény CD1 egereket (Charles River, St. Aubin-les-Elbeuf, Francé) alkalmaztunk, amelyeket tizes csoportokban standardizált körülmények között tartottunk (vizet és standard rágcsáló ételt kívánságig adagoltunk, az állatokat 22°C értéken 60°C relatív nedvességtartalmú levegőben 12 óra fény és 12 óra sötétség ciklusok alkalmazásával tartottuk).

A hatóanyag dózishatárai és ammónium-acetáttal végzett intoxikálás:

Az egereket IP adagolással 5-fluor-metil-ornitinnel általában a 13 vagy 15 mmol/kg ammónium-acetát i.p. injektálás előtt előkezeltük (1,00 g sorrendben 1,15 g f

τ • · ····· · ·♦· ·· • · · · · · • ··· ···· • · »····· * · · ··«· ·« · ·· ·· ml vízben; 0,1 ml/10 g testtömeg). Az aminosavakat, illetve az egyéb vegyületeket szubkután (s.c.) úton adagoltuk, általában 1 órával az intoxikáció előtt, amelyet ammónium-acetáttal végztünk (az ettől eltérő kezeléseket a táblázatok jeleiben megadjuk).

Az intoxikálás után, amelyet ammónium-acetáttal végeztünk, rángásos (clonusos) görcsöket, az egyenes járás reflex megszűnését, kómát, illetve a hátsó végtag tónusos kinyúlását tapasztaltuk. A túlélők 2 órával az intoxikálás után normális viselkedést mutatnak.

Szövet preparálás:

Az egereket lefejezéssel elpusztítottuk és az agyakat gyorsan (kevesebb mint 10 másodperc idő alatt) izoláltuk, majd folyékony nitrogénben fagyasztottuk és -80°C hőmérsékleten tároltuk az analízis időpontjáig a fagyasztott agyakból. Az ammónia, a glutamin és a glutamát meghatározására az agyat homogenizáltuk 10 térfogatnyi jéggel hűtött 0,2m perklórsavban. 1 óra 2°C hőmérsékleten történő tárolás után a homogenátumokat centrifugáltuk, majd a felúszót azonos napon tesztvizsgálatnak vetrzzük alá. Abból a célból, hogy a glutamin vagy más hidrolizálható és kibocsátható ammónia formák hidrolízisét csökkentsük, ezt a vizsgálatot még aznap végeztük.

Aminosav és ammónia:

A perklórsav glutamin és glutamát tartalmának meghatározása céljából az agy extraktum alikvot részeit izokratikus elúció alkalmazásával a korábban közölt reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) eljárás szerint (Seiler és Knödgen, 1985) elválasztottuk. Az ammónia meghatározás céljából ammónia szelektív elektródot (Orion Research Inc., Cambridge, USA) alkalmaztunk. Standard ammónium-klorid oldatokat állítottunk elő az egyes mintasorozatok kalibrációs görbéinek képzése céljából. (A részleteket lásd Seiler és munkatársai, 1992 közleményében).

• · · . táblázat: 13 mmol/kg (i.p.) ammónium-acetát intoxikálással szembeni védés aminosavak segítségével, illetve rokon vegyületekc ra

-o Ό 'Cü c lei E o

-XI

Έ o E

M— φ c

M—* ’c

1____ o

Φ E

I

ΙΟ

ΜΙ

LO

CD

Ő

E x in φ > φ c

-Q J*.

Z3 o 05 E c O Φ Őri

Százalék túlélők

A. Egyetlen hatóanyaggal történő kezelés

o

90

1 90 I

100

90 I

40 |

o

o

30 I

B. Kombinált kezelés 5 μιτιοΙ/kg 5FMorn alkalmazásával

40* I

80*

20 I

60* I

100*

Százalék állatokban mutatott tónusos görcs

100

20

o

o

o

I 70 I

06

90 I

70 I

| 09

30

40 I

50 I

40

Egyenes járás reflex veszteség

100

06

1 80 |

70

I 70 I

I 06 I

o o

I 06 |

o o

I 09

06

1 06

o o

06

Dózis mmol/kg

1

o

o

m

co

0,75 |

m

lo

m

1

0,75

m

LD T““

in

Hatóanyag

Hordozóanyag (3% NaHCO3)

L-ornitin

| L-arginin |

L-citrullin

N-acetil-L-glutamát

| L-karnitin |

| L-acetil-karnitin |

| Fiziológiás sóoldat |

L-citrullin

| N-acetil-L-glutamát |

| L-karnitin |

L-acetil-karnitin |

• ·

I φ 4—' _Φ Ο >4

CD

Φ >

C

Ο -X ο

φ > φ φ

> -φ

CD 'Φ

Φ

Φ

-X Φ > Φ φ Ο c

Ε ra φ φ σ -φ >

c φ JD Ε φ Ν

Φ

Φ Φ Φ ^φ Φ -X

X Ο Μ—*

C 'φ ·*—· φ U φ ι Ε ZJ ’c Ό Ε Ε φ

Q.

Φ η

φ

Ο) φ

Ε c ο φ Jxí cn ο ε ε co φ Ν 'Φ .Ώ Φ

Százalék túlélők

A. Egyetlen hatóanyaggal történő kezelés

o

I 06 |

06

o o

I 06 ι

40

o

o

I 30 I

B. Kombinált kezelés 5 μηιοΙ/kg 5FMorn alkalmazásával

,0b

* o co

20 1

•K O O

100* |

Százalék állatokban mutatott tónusos görcs

100

20 I

o

o

o v-

70

I 06 |

I 06 I

I 70 ..... I

09

30 I

40 1

1 50 |

I 40

Egyenes járás reflex veszteség

100

I 06 |

o co

I 70 I

I 70 I

06

I 100 I

I 90 I

| 100 I

09

06\

1 06

o o

06

Dózis mmol/kg

o

o

LD

co

0,75

in

in

in

1

0,75 I

m

LO T“

m

Hatóanyag

Hordozóanyag (3% NaHC03)

I L-ornitin I

L-arginin

| L-citrullin

I N-acetil-L-glutamát I

| L-karnitin |

| L-acetil-karnitin |

Fiziológiás sóoldat

I L-citrullin 1

I N-acetil-L-glutamát 1

| L-karnitin |

L-acetil-karnitin

t

2. táblázat: Egér intoxikálása 15 mmol/kg (i.p.) ammónium-acetáttal. 0,1 mmol/kg 5-fluor-metil-ornitinnel (5FMOrn) és egyéb amCO ω -ro ra ω -Φ

Φ

Φ N CD Φ >

.x o cd 05 >> c <5 '05

N ’c

O

CD

4—· c

(Λ 'Φ '05 ’x o c

.x ’c o E

Túlélő állatok	0 2 (0-10)a	o o	o o T- CXJ	o o	* o o CD	♦ o o CD	o o
Állatok százaléka az irányítású reflex elvesztésében anélkül, hogy tonicus görcsöt mutatnának	0 2 (0-10)a	o o	0 20	o o	0 40	° s	o o
Állatok százaléka, amelyek tonicus görcsöt mutatnak az irányítási reflex elvesztése után	Cü o CO ο ó JD CO CD	o o CO b-	100 80	o o CD b··	09 0	100 50	o o b- b-
Állatok százaléka, amelyek tonicus görcsöt mutatnak az irányítási reflex elvesztése előtt	ra O Ο 1 o o r- LD CO	o o b- CO	o o	o o co	o o o	o o	o o co co
Kezelés	Nincs kezelés 5FM0rn	L-citrullin (5 mmol/kg) 5FM0rn + L-citrullin	L-ornitin (10 mmol/kg) 5FM0rn + L-ornitin	L-arginin (10 mmol/kg) 5FM0rn + L-arginin	L-carnitin (15 mmol/kg) 5FM0rn + L-karnitin	L-acetil-karbinit (15 mmol/kg) 5FM0rn + L-acetil- -karnitin	N-acetil L-glutamát (5 mmol/kg) 5FM0rn + N-acetil-L- -glutamát

····· ···· · · • · · · • « · · ··· • ······ ·· · ·· · ·· ·· pmol/kg 5FM0rn kezelt (i.p.) vagy fiziológiai sóoldattal kezelt 10 CD1 egérből álló csoportokat (nőstényt) 22±3 g testtömegü, alkalmaztunk. 15 órával később a fent említett hatóanyagot 3%-os MaHC0₃ oldatban oldott mennyiségét szub-kután úton adagoltuk, majd 1 órával később 13 mmol/kg ammónium-acetátot (víz-ben) injektálunk intrapetitoneális úton.

A * jelzés azt jelzi, hogy statisztikusan jelentős eltérés (p < 0,05) mutatkozik az egyetlen hatóanyag, illetve a kombinációs kezelés alkalmazása között [nem parametrikus statisztika (Siegel, 1956)].

f • · • · • β

• · · · • ·

ft • · ·

I

E ra _Q •Φ >> cd φ ω Φ

Φ c c » 'c o t

Φ E !

L— o Ώ ΜΙ LO

CD Uí ö E E ro •4—* '05

Φ o 05 i

E

Z) c o

E E 05

Q.

CD -X ö E E

LC ra cd '05 '05 _X

X o c

Φ CD

1X1

CÜ N '05

-Ű '05

OÍ cd '05

-£Z

CD 0

Φ N Φ

O

Φ

Φ N CD 'Φ >

rö se o CD 05 >> C •O •05

N

C o CD 05

C ro > CD '05

X o 4—· c

Z3 -X ro 'c •o

E

f

·· ···« · ···♦ ·· • · · · · · • ··· · · ·* • · ······ ·· •··· ·· · · · ·· φ

Ε

I

L_ o _0 *4— <

ΙΓ5 φ '05 4—<

c '05

Φ o CD ro Ό ·+—·

4—»

Φ o 05 ι E ’c Ό E E 05 φ o o L Φ CL

O

Φ Ο

Φ Ν Φ ΖΖ Ό

Φ ίθ

C 'φ :Ο

* * ο ο +1 05

CO ο

* * CO Ο ο’ +1 bCO ο

E '05

E φ

Φ c

E ·+·· _0

Φ

Ζέ

Φ _Φ Ο >.

Φ > t

Φ

Ε

Φ 'Ο 05

Ν ’c

Ο

C φ

'05

X Ο •4—♦

C

ο +1 05 * 00 θ' +1

LO

* *

CO ο

+1

CN co‘

Ο ο +1 +ι

C0 °° <

CO ο~ +1 05 οο * * St ο“ +1

C0 r<

C O

E

E

C 05 >>

Φ

0)

LL1 ’c Ό Ε Ε 05 φ .X

-Ű 'Φ >ϊ

Φ

Φ 'Φ

.05 ’c Ό Ε Ε <

ο +1 05 ο ιο ο

+1 οί

* ♦ ο +1 04 * + 05 ο’ +1 st

N ra .Q fü co

Φ

C C ~4—¹ ’c ϊ_ ο

I

i

0,1 mmol/kg dózis 5-fluor-metil-ornitint adagoltunk i.p. úton 16 órával, mielőtt 8 mmol/kg ammónium-acetátos kezelést végeztünk (i.p.). Az aminosavakat és hasonló vegyületeket szubkután úton 1 órával az ammónium-acetát kezelés előtt adagoltuk. Az állatokat az ammónium-acetát adagolás után 10 perccel lefejezéssel elpusztítottuk.

(a) Ezen állatok kivételével valamennyi más állatcsoport 8 mmol/kg ammónium-acetát kezelést kapott.

* Statisztikusan jelentős eltérés (p < 0,05) az ammónium-acetáttal kezelt „kontroll” csoport és a hatóanyaggal előkezelt csoport között.

** Statisztikusan jelentős eltérés (p < 0,05) egyetlen hatóanyagot kapott csoport, illetve a hatóanyag kombinációt, azaz az 5FMOrn kombinációt kapott csoport között (Student t-tesztvizsgálat).

A terápiás farmakológiai adagolás céljára az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós só formában adagoljuk. Természetesen a vegyületek hatásos dózisa változó lehet, mindenegyes vegyület adott hatásosságának függvényében, továbbá a kezelendő betegség típusától és súlyosságától függően, valamint az adott kezelt beteg típusától függően. Általában a hatásos dózis a találmány szerinti vegyületböl körülbelül 0,01 mg - körülbelül 20 mg/kg testtömeg/nap, amennyiben az (I) általános képletü vegyületet szisztémás úton adagoljuk. A terápiát általában kisebb dózisokkal kezdjük. A dózist adagolhatjuk orálisan, szilárd dózisformákban, például kapszula, tabletta vagy por, vagy folyadék formákban, például oldat vagy szuszpenzió formában. A vegyületek továbbá adagolhatok parenterálisan, injekció formában, amely forma lehet steril oldat vagy szuszpenzió. Kombinációs terápia esetében a terápiás hatóanyagokat párhuzamosan vagy egymást követően adagolhatjuk és az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen körülbelül 0,1 mg - körülbelül 100 mg/kg testtömeg/nap dózisban adagoljuk.

> * ♦

A találmány szerinti eljárás végrehajtása során az (I) általános képletü vegyületeket és/vagy a kombinációs terápia esetében a terápiás hatóanyagokat előnyösen gyógyszerkészítmény formában adagoljuk, amely gyógyszerkészítmény gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és körülbelül 5 - körülbelül 90 tömeg% mennyiség közötti találmány szerinti hatóanyagot vagy ennek gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazza. A „gyógyszerészeti hordozóanyag” elnevezés alatt ismert gyógyszerészeti kiszerelő anyagokat értünk, amelyeket általában gyógyszerészetileg aktív vegyületek formulálásában alkalmaznak abból a célból, hogy ezeket a vegyületeket állatoknak adagolják, és amely anyagok lényegében nem toxikusak, valamint a felhasználás során nem válnak toxikussá, ezenkívül érzékenységet sem okoznak. A találmány szerinti készítményeket ismert eljárásokkal a tabletta, kapszula, elixir, szirup, emulzió, diszperzió és nedvesíthető, valamint pezsgő porok előállításában alkalmazott eljárásokkal készíthetjük és ezek a készítmények alkalmas adott típusú készítményben szokásosan használt kiszerelőanyagokat tartalmazhatnak.

A találmány szerinti vegyületek előnyös adagolási útja az orális adagolás. Orális adagolás céljára a találmány szerinti vegyületeket szilárd vagy folyadék készítménnyé alakíthatjuk, amelyek lehetnek például kapszula, pilula, tabletta, pirula, labdacs, olvadék, por, oldat, szuszpenzió vagy emulzió formák. A szilárd egységdózis formák lehetnek kapszula formák, amelyek lehetnek szokásos kemény vagy lágy zselatin típusú kapszulák és amelyek például felületaktív anyagokat, kenőanyagokat, inért töltőanyagokat, mint például laktózt, szukrózt, kálcium-foszfátot és kukoricakeményítőt is tartalmazhatnak. Más eljárás szerint a találmány szerinti vegyületeket tabletta formává alakíthatjuk szokásos tabletta alapanyagokkal, amely lehet például laktóz, szukróz és kukoricakeményítő, továbbá a tablettában alkalmazhatunk kötőanyagokat, mint például akáciát, kukoricakeményítőt vagy zselatint, dezintegráló szereket, amelyek elősegítik az adagolás után a tabletta feloldódását, illetve tördelő• · · · · · • · · · · ··· • · »··«·· » · * 9··· ·· · · ♦ · · lt£>

dósét, mint például burgonyakeményítöt, alginsavat, kukoricakeményítöt és guar gumit, továbbá kenőanyagokat, amelyek javítják a tabletta granulátum folyóképességét és megakadályozzák a tabletta anyag tablettázó prés formához történő tapadását, mint például talkumot, sztearinsavat vagy magnézium-kálcium- vagy cink-sztearátot, színezőanyagokat, festékeket és ízesítőanyagokat, amelyek elősegítik a tabletta esztétikai megjelenését, illetve a beteg számára ezeket elfogadható alakítják. Alkalmas orális folyékony dózisformák előállítására használható kiszerelőanyagok lehetnek higítóanyagok, mint például víz és alkoholok, például etanol, benzilalkohol és polietilén-alkoholok és ezek a készítmények tartalmazhatnak kívánt esetben gyógyszerészetileg elfogadható felületaktív anyagokat, szuszpendálószereket vagy emulgeáló szereket is.

A találmány szerinti vegyületek továbbá adagolhatok parenterális úton is, amely lehet például szubkután, intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális út. Ilyen adagolás során a találmány szerinti vegyület injektálható dózisát állítjuk elő gyógyszerészetileg elfogadható higítóanyaggal vagy valamely gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal, amely lehet steril folyadék vagy folyadék keverék, mint például víz, fiziológiás sóoldat, vizes dextróz oldat és hasonló cukor oldatok, valamely alkohol, mint például etanol, izopropanol vagy hexadecil-alkohol, glikolok, mint például polietilén-glikol vagy propilén-glikol, glicerol-ketálok, mint például 2,2-dimetil-1,3-dioxolán-4-metanol, továbbá éterek, mint például polietilén-glikol 400, valamely olaj, mint például zsírsav, zsírsav-észter vagy glicerid vagy valamely acetilezett zsírsav-glicerid és ezek a készítmények kívánt esetben tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható felületaktív anyagokat, mint például szappant vagy valamely mosószert, szuszpendálószereket, mint például pektint, karbomereket, metil-cellulózt, hidroxi-propil-metil-cellulózt vagy karboxi-metil-cellulózt vagy emulzifikáló szereket és egyéb gyógyszerészetileg elfogadható adalékanyagokat. A talál,⁴ ‘ «»·« ·· ···· · • · · · V · « · · · V · ·· • « · ···· · · · · ···« ·· · «* ·· gü etilénoxid és hidrofób bázis adduktok, amelyeket propilén-oxid és propilén-glikol kondenzációval állathatunk elő.

A találmány szerinti vegyületek továbbá helyileg is adagolhatok. Ezt az adagolást egyszerűen úgy végezhetjük, hogy az adagolandó vegyületböl oldatot készítünk, előnyösen olyan oldószer alkalmazásával, amely ismerten elősegíti a transzdermális abszorpciót. Ilyen oldószer lehet az etanol vagy a dimetil-szulfoxid (DMSO) és ezekben a készítményekben kívánt esetben egyéb kiszerelőanyagokat alkalmazhatunk vagy ezeket el is hagyhatjuk. Előnyös helyi alkalmazást úgy végezhetünk, hogy tapasz formát alkalmazunk, amely tapasz lehet tartályos vagy pedig porózus membrán típusú vagy szilárd mátrix típusú tapasz.

A 3,742,951 számú, a 3,797,494 számú, a 3,996,934 számú és a 4,031,894 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben néhány alkalmas transzdermális eszközt leírtak. Ezek az eszközök általában egy hátsó tagot tartalmaznak, amely az egyik felületüket meghatározza, továbbá tartalmaznak egy aktív hatóanyag számára permeábilis tapadó réteget, amely a másik felületüket adja és legalább egy tartályt tartalmaznak, amely az aktív hatóanyagot tartalmazza és amely a két felület között helyezkedik el. Más megvalósítás szerint az aktív hatóanyag számos, a permeábilis tapadórétegben elhelyezkedő mikrokapszulában található. Mindkét esetben az aktív hatóanyag folyamatosan kerül ki a tartályból vagy a mikrokapszulákból egy membránon keresztül az aktív hatóanyag számára permebális tapadó rétegen át, amely réteg a bőrrel vagy a nyálkahártyával van kontaktusban. Amennyiben az aktív hatóanyag a bőrön keresztül abszorbeálódik, szabályozott és előre meghatározott aktív hatóanyag áram adagolható a betegnek. A mikrokapszulák esetében a kapszula képző anyag egyben membránként is szerepelhet.

Más transzdermálisi adagolás eszköz esetében a találmány szerinti vegyieteket úgy adagoljuk, hogy a gyógyszerészetileg elfogadható aktív hatóanyag egy ·· ν·« · · »* • · · · · · e · · · «··« • < W ···· * · 9 · ···· ·· · ·« ·· álmátrixban található, amelyből kívánt és tervezett mértékben fokozatos módon konstans és szabályozott sebességgel kerül kibocsátásra. A mátrix permeábilis és a találmány szerinti vegyületet diffúzió vagy mikropórusokban történő áram segítségével bocsátja ki. A kibocsátás sebessége szabályozott. Ilyen membránt nem igénylő rendszert írtak le a 3,921,636 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben. A rendszerekben legalább két típusú kibocsátás lehetséges. Amennyiben a mátrix nem porózus, akkor diffúzióval történő kibocsátás megy végbe. A gyógyszerészetileg hatékony vegyület oldódik és diffundál a mátrix belsejében, illetve a mátrixon keresztül. A mikropórus árammal történő kibocsátás akkor történik, amikor a gyógyszerészetileg hatásos vegyületeket valamely folyékony fázison keresztül a mátrix pórusaiban diffúzióval szállítjuk.

Claims (6)

1. ···· ·· ♦ ·· »·

   SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Az (I) általános képletű vegyületnek vagy gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sójának vagy sztereoizomerjének felhasználása, ahol az általános képletben R jelentése -CH₂F-csoport, -CHF₂-csoport, -CHCIF-csoport, -C=CH-csoport, -CH=CH₂-csoport vagy -CH=C=CH₂ csoport, kívánt esetben gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal kombinációban, Alzheimer típusú dementia kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület felhasználása, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyület 2,5-diamino-6-fluor-hexánsav, ennek enantiomerjei vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói.
3. 3. A 2. igénypont szerinti vegyület felhasználása, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyület (S/S)-2,5-diamino-6-fluor-hexánsav.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti vegyület felhasználása kombinációs terápiában valamely olyan hatóanyaggal, amely a DAT betegek agyában az ammónia-koncentrációt csökkenti.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti vegyület felhasználása kombinációs terápiában megfelelő mennyiségű L-carnitin vagy L-acetil-carnitin alkalmazásával.
6. 6. Eljárás (2S,5S)-5-fluor-metil-ornitin előállítására, azzal jellemezve, hogy

   - (2R,5R)- és (2S,5S)-6-fluor-metil-3-(fenil-acetil)-amino-2-piperidon valamely oldatához elegendő mennyiségű nedves penicillin-acilázt adagolunk, és

   - az oldatból kinyert (2S,5S)-6-(fluor-metil)-3-amino-2-piperidonhoz megfelelő mennyiségű savat adagolunk.