HUT58804A

HUT58804A - Process for producing pneumolysine mutants and pneumococcus vaccines

Info

Publication number: HUT58804A
Application number: HU90433A
Authority: HU
Inventors: James Cleland Paton; David John Hansman; Graham John Boulnois; Peter William Andrew; Timothy John Mitchell; John Arthur Walker
Original assignee: James Cleland Paton; David John Hansman; Graham John Boulnois; Peter William Andrew; Timothy John Mitchell; John Arthur Walker
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1992-03-30
Also published as: FI103122B; BG51358A3; NO912226D0; MC2178A1; JPH04503948A; EP0449856A1; DK173629B1; CA2005704C; CA2005704A1; NO912226L; FI912878A0; EP0449856B1; WO1990006951A1; DK115591A; AU626961B2; AU4756490A; FI103122B1; ATE205534T1; DE68929323T2; RU2121481C1

Description

A találmány tárgya pneumolizin mutánsok és ezekkel előállított pneumococcus vakcinák.

A Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) fontos patogén, amely elterjedt körben okoz olyan megbetegedéseket, mint például a tüdőgyulladás, a meningitis és a bacteraemia. A pneumococcus okozta tüdőgyulladás még olyan területeken is 19 %-os mortalitással jár kórházban lévő betegeknél, ahol az antibiotikus terápia szabadon hozzáférhető, és ez az érték a bacteraemiá-ban szenvedő betegeknél 30 - 40 %-ra nő. Ezt a magas mortalitási arányt az Amerikai Egyesült Államokból közölték, ahol a tüdőgyulladás, amelynek legszokásosabb okozója a S. pneumoniae, a halált okozó megbetegedések rangsorában az ötödik. Valójában, ebben az országban a halált okozó betegségek rangsorának első 10 képviselője között a tüdőgyulladás az egyetlen fertőző betegség. Az Amerikai Egyesült Államokban a pneumococcus okozta meningitis mortalitási aránya 13 - 45 %. A fejlődő országokban évente 3 milliónál több gyermek hal meg 5 éves kora előtt tüdőgyulladásban, amelynek ismét a S. pneumoniae a leggyakoribb előidézője. A S. pneumoniae okozója továbbá kevésbé súlyos, de nagy számban előforduló fertőzéseknek is, például a középfülgyulladásnak és a melléküreggyulladásnak, amelyek jelentős kihatással vannak a fejlett országok egészségügyi ellátásának költségeire. A középfülgyulladás különösen fontos megbetegedés fiatal gyermekeknél, a melléküreggyulladás mind gyermekeket, mind felnőtteket érint.

Az 1970-es évek végén egy vakcinát engedélyeztek súlyos fertőzések, különösen bakteriális tüdőgyulladás megelőzésére és • · · · · ····· · ···· · ·· · · bizonyos csoportoknak, például a lép eltávolításon átesetteknek és fiatal gyermekeknek a védelmére, akik különösen fogékonyak heveny pneumococcus-os megbetegedésekre. A vakcina tisztított kapszuláris poliszacharidokból áll, amelyek a pneumococcusok felületi antigénjei közül a legfontosabbak. Azonban, a S. pneumoniae szerotípusainak (amelyekből 83 létezik) mindegyike szerkezetileg különböző kapszuláris poliszachariddal bír, így az egy szerotípussal szemben végzett immunizálás nem hoz létre semmiféle védelmet a többi szerotípus többsége ellen. A jelenleg Ausztráliában engedélyezett vakcina a 23 leggyakoribb szerotípusból tisztított poliszacharidokat tartalmazza, ez az Ausztráliában előforduló pneumococcus fertőzések mintegy 90 %-a ellen véd.

Nem mondható tökéletesnek a védelem azon szerotípusok ellen sem, amelyeket a vakcina tartalmaz, és megjelent néhány közlemény arra vonatkozóan, hogy súlyos, esetenként végzetes fertőzések fordultak elő vakcináit nagy rizikójú egyéneknél. A vakcina hatékonysága gyengébb fiatal gyermekeknél, néhány vizsgálat, köztük egy Adelaide-ben lefolytatott is, azt mutatja, hogy a létező készítmények ebben a körben klinikailag kevéssé hatásosak, vagy hatásuk ki sem mutatható. A vakcinának ez a nyilvánvaló hatástalansága azzal kapcsolatos, hogy az 5 év alatti korú gyermekeknél bizonyos Pneumococcus poliszacharidok immunogenitása gyenge. Kimutattuk, hogy az antitest válasz különösen gyenge az iránt az öt szerotípus iránt, amelyek a gyermekek körében szokásosan megbetegedést okoznak (6, 14, 18, 19 és 23 típus). Az ezekre a • · · · • · · ♦ · · · • · · ··♦ · · · • · · · · ····· · • · · · · ·· · ·

- 4 pneumococcus poliszacharidokra adott antitest válasz valójában a 8 év fölötti gyermekek esetén is csak megközelíti a vakcinálás idején a felnőtteknél jelentkező szintet.

A fentieket figyelembe véve a fiatal gyermekek pneumococcus fertőzésektől való védelmére olyan vakcina látszik szükségesnek, amely a kapszuláris poliszacharidoktól eltérő más antigéneket tartalmaz. Egy ilyen antigén lehet a pneumolizin, amely egy olyan protein toxin, amelyet minden virulens S. pneumoniae izolátum termel. Egereknek ezzel a fehérjével történt immunizálása esetén a pneumococcus fertőzésekkel szemben bizonyos mértékű védettség észlelhető.

Nehézséget jelent azonban az, hogy a pneumolizin emberre toxikus. A pneumolizint tartalmazó vakcinának lényegében nem-toxikusnak kell lennie. Azonban, ha a pneumolizint a jelenleg alkalmazott módszerekkel nem-toxikussá tennénk, az valószínűleg úgy változtatná meg a fehérje alapkonfigurációját, hogy immunogén szempontból eltérővé válna a natív vagy vad-típusú pneumolizintői. A natív pneumolizintői immunogén szempontból különböző megváltoztatott protein által kiváltott immunválasz csökkent védőkapacitást jelenthetne, vagy egyáltalán nem nyújtana védelmet. A feladat nehézsége tehát abban áll, hogy olyan megváltoztatott pneumolizint állítsunk elő, amely nem toxikus, és amely egyidejűleg immunogén szempontból eléggé hasonló a toxikus formához ahhoz, hogy a védő immunválaszt kiváltsa.

A fenti jellemzőkkel bíró megváltoztatott pneumolizin azután számos módon alkalmazható vakcinában. így a megváltoztatott pneumolizin alkalmazható önmagában immunizálásra, vagy más • · · · · · · • ·· · · · · · · • ···· ····· · ···· · · · · · megoldás szerint a megváltoztatott pneumolizin pneumococcus poliszacharidhoz köthető, vagy ismét más megoldás szerint olyan vakcinába vihető be, amelyben a pneumococcus poliszacharid egy másik fehérjéhez van kötve, és a megváltoztatott pneumolizin csak nem-kötött formában van jelen. Más megoldás szerint a pneumococcus poliszacharid és a pneumolizin mindegyike nem-kötött formában használható.

Tágan meghatározva a találmány tárgya egy megváltoztatott pneumolizin, amely lényegében nem-toxikus, és amely képes arra, hogy immunválaszt váltson ki olyan állatban, amely a vad-típusú pneumolizinre reakciót ad.

Előnyösen a megváltoztatott pneumolizin a vad-típusú pneumolizinhez képest csökkent komplement-kötő aktivitással bír. A komplement-kötő aktivitás csökkenése azt eredményezi, hogy,a vakcina beadásának helyén kisebb mértékű gyulladás jön létre.

Előnyösen a megváltoztatott pneumolizin csökkent Fc-kötő aktivitással bíró a vad-típusú pneumolizinhez képest. Az Fc-kötő aktivitás csökkenése azzal jár, hogy a vakcina beadásának helyén kisebb mértékű gyulladás jön létre.

Előnyösen a megváltoztatott pneumolizin a vad-típusú pneumolizintői abban különbözik, hogy egy vagy több aminosavját helyettesítjük.

A pneumolizin a vad-típusú pneumolizinhez képest eltérhet abban, hogy a vad-típusú pneumolizin 367, 384, 385, 428, 433 vagy 435 helyén vagy ezen helyek közül több helyen előforduló aminosavat helyettesítünk, eltávolítunk vagy blokkolunk.

A találmány tárgya továbbá egy vakcina, amely egy megvál• · • · · · · ♦ · • · · ··· · · · • ···· · ·♦·· · ···· · ·· · *

- 6 toztatott pneumolizint tartalmaz, amely megváltoztatott pneumolizin nem-toxikus és képes arra, hogy immunválaszt váltson ki olyan állatból, amely a vad-típusú pneumolizinre reagál.

Előnyösen a vakcina a megváltoztatott pneumolizinnel kapcsolt kapszuláris poliszacharid anyagot tartalmaz.

A kapszuláris anyag származhat a 6A, 6B, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 15B, 17F, 20, 22F és 33F Streptococcus pneumoniae szerotípusok közül egyből vagy többől.

Ebben a megvalósítási formában azok a szerotípusok, amelyek szokásosan a gyermekek megbetegedésével kapcsolatosak, és amelyek iránt a gyermekek immunválasza gyenge, specifikusan megcélozhatók (azaz a 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F és 23F dán szerotípusok). Használhatók azonban a konjugátok szintetizálására más, a 23 értékű Merek Sharp és Dohme vakcinában (Pneumovax 23) jelenlévő más szokásos szerotípusok is (azaz az 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 15B, 17F, 20, 22F és 33F) vagy valójában bármely más szerotípus. Bármely pneumococcus poliszacharidnak a fehérje hordozóhoz való kötése jó T-sejt függő immunogenitást biztosít gyermekeknél, így védő szintű antipoliszacharid antitest termelődik.

A megváltoztatott pneumolizin kapszuláris anyaggal való kombinálása különleges mértékű védelmet biztosít, különösen a S. pneumoniae olya szerotípusai ellen, amelyek poliszacharidjai a létező vakcina készítményekben nincsenek benne.

A vakcinát előnyösen szubkután injekció formájában adjuk be segédanyag nélkül'megengedett segédanyaggal, például alumínium7 ·♦ · ·♦ · ··· • · · · · · • · · ····· · • ··· · ····· · ···· · ·· · * oxid-géllel.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns klón, amely egy replikont és egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy megváltoztatott pneumolizint kódol, amely megváltoztatott pneumolizin nem toxikus és képes arra, hogy a vad-típusú pneumolizinre reagáló állatban immunválaszt váltson ki.

A találmány tárgyát képezi továbbá a megváltoztatott pneumolizin előállítási eljárása, amely magában foglalja a megváltoztatott pneumolizin tisztítását egy olyan expressziős rendszerből, amely egy a megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns kiónt tartalmaz, ahol a megváltoztatott pneumolizin lényegében nem toxikus és képes arra, hogy a vadtípusú pneumolizinre reagáló állatban immunválaszt váltson ki.

Előnyösen az expressziós rendszer egy olyan gazdasejt tenyészet, amely a megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns kiónt magában foglalja.

A találmány tárgyát képezi továbbá a vakcina termelésére szolgáló eljárás, amely a következő lépéseket foglalja magában: a megváltoztatott pneumolizint kódoló rekombináns klón megsokszorozása, a klónozott anyag transzkripciójának és transzlációjának kiváltása, a megváltoztatott pneumolizin tisztítása, és a kapszuláris poliszacharidnak a megváltoztatott pneumolizinnel való kapcsolása, ahol a megváltoztatott pneumolizin toxikus hatása lényegében csökkent a vad-típusú pneumolizinéhez képest.

A találmány egyes megvalósítási módjait a következőkben a jobb érthetőség kedvéért az ábrákra való hivatkozással írjuk le.

Az 1. ábrán a vad-típusú pneumolizint kódoló gén DNS ·· · ·· · · · · · • · · · · · · ··· ····· · • ···· · ♦ ♦ · · · • · · · · · « · 4 szekvenciáját mutatjuk be. Az ábrán az Atg start kodont aláhúzás jelöli.

A 2. ábrán a pneumolizin génnek expressziós vektorba való klónozására alkalmazott, vad típusú pneumolizint kódoló megváltoztatott gén DNS szekvenciáját mutatjuk be. Aláhúzással jelöljük a start kodonnál bevezetett Ncol restrikciós helyet.

A 3. ábrán a vad-típusú pneumolizint kódoló gén DNS szekvenciájából leszármaztatott aminosav szekvenciát mutatjuk be.

A 4. ábrán olyan pneumolizin aminosav-szekvenciáját mutatjuk be, amelyen hely-specifikus mutáció révén bevitt aminosav helyettesítés látható.

Az embernek való beadásra alkalmas nem-toxikus pneumolizin-származékok létrehozására rekombináns DNS eljárást alkalmazunk. Ennek elérésére a pneumolizint kódoló S. pneumoniae gént

Escherichia coli-ba klónozunk, és teljes DNS szekvenciáját meghatározzuk. A DNS szekvenciát az 1. ábrán, az ebből leszármaztatott aminosav szekvenciát a 3. ábrán mutatjuk be.

A pneumolizin gén három tartományát tettük ki oligonukleotiddal irányított mutációnak. Az első tartomány a protein szekvencia 427-437-es aminosavjait kódolja, a 3. ábrán ezt a tartományt aláhúzással jelöljük. Ez a 11 aminosavból álló szekvencia teljes homológiát mutat más rokon tiol-aktivált toxinok hasonló tartományaival, így feltehető, hogy ez a tartomány felelős a hemolitikus hatásért, és ennek folytán a toxin toxikus hatásáért. A másik két tartomány a 257 - 297 és a 368 - 397 számú aminosavakat kódoló tartományok, ezeket a 3. ábrán ugyancsak aláhúzással jelöljük. A toxinnak ez a két «*· ·«· « · * · ···««· · • ·· · 9 · · · * • ···· · ·· ·· · ···· · · · · ·

- 9 tartománya aminosav-szekvenciáját tekintve lényegében homológ a humán C-reaktív proteinnel (CRP), ebből következően feltehetően a pneumolizinnék azért a képességéért felelős, hogy az immunglobulinok Fc tartományához kötődik, és hogy komplementet aktivál. A pneumolizin génben 15 különböző mutációt hoztunk létre, amely egyetlen aminosav helyettesítést eredményez, amint az a 4. ábrán látható. Annak érdekében, hogy a megváltoztatott pneumolizin szerkezetét megőrizzük, konzervatív helyettesítéseket végeztünk úgy, hogy az aminosavakat hasonló természetű aminosavakkal helyettesítettük.

A hemolitikus aktivitásban érintett tartományok, a Cys428->Gly, Cys₄₂8->Ser, Trp₄33~>Phe, Glu₄3₄->Asp és Trp₄35~>Phe, mindegyike csökkenti a hemolitikus aktivitást rendre 97, 90, 99, 75 illetve 90 % értékkel. Az ebben a tartományban végrehajtott egyéb mutációk (Cys₄28“>Ala, Glu₄3₄-Gln és Trp₄3₆->Phe) nem érintik a hemolitikus aktivitást. A toxinnak egy olyan másik tartományán mutációt kiváltva, amelyről feltételezhető, hogy a cél sejt membránokhoz való kötődésért felelős, ugyancsak befolyásolja a protein hemolitikus aktivitását. Ez a helyettesítés, a His367~>Arg, teljesen meggátolja a hemolitikus aktivitást. Az, hogy a His3g7->Arg helyettesítés nagyobb gátlást hoz létre a hemolitikus aktivitásban, mint a hemolitikus aktivitásért felelősnek tartott 11 aminosavból álló tartományban megvalósított helyettesítés, nem várt eredmény.

A CRP-szerű tartományokban létrejövő mutációkat vizsgáltuk a komplement aktiválásra való képesség szempontjából. A Trp₃7g->Phe, Tyr₃₈₄->Phe, Asp₃₈5->Asn és Trp₃₉7->Phe mutációk • · · « • · · 4 < ♦ « ··· «·««· · • ·««· · ·*·· · ···· « · · ♦ ·

- 10 esetén a komplement aktiválás rendre 20, 70, 100, illetve 15 %kai csökkent. A CRP-szerű tartományban bekövetkezett, a 4. ábrán bemutatott egyéb mutációk nem csökkentik a komplement aktiválást.

Fontos, hogy a fenti mutációk akár a hemolitikus aktivitást, akár a komplement aktiválást érintik, nem rontják a protein immunogén tulajdonságát a natív vagy vad-típusú pneumolysinhez viszonyítva.

így, bár a His₃g7->Arg mutáció előnyös a hemolitikus aktivitás csökkentése szempontjából, két vagy több, a hemolitikus aktivitást érintő mutáció révén is igen nagy mértékű hemolitikus aktivitás csökkenés érhető el. Hasonló módon, a komplement aktiválás szempontjából előnyös mutáció az Asp3g5~>Asn, azonban két vagy több más mutáns, amely kisebb mértékben csökkenti az aktivitást, ugyancsak alkalmas.

A vakcina készítésre alkalmazott pneumolysin származék egy előnyös megvalósítási mód szerint a fenti mutációk közül bizonyosakat tartalmaz, amelyek eredményeként a protein nem képes a komplement aktiválására, és emellett zéró hemolitikus aktivitással bír. Ilyen kombinációk az alábbiak:

1) His3₆7~>Arg + Asp₃₈₅->Asn,

2) His₃₆₇->Arg + Asp₃₈₅->Asn + vagy Cys₄₂8“>Gly vagy

Trp₄₃₃->Phe

3) Asp₃₈₅->Asn + Cys₄₂₈->Gly + Trp₄₃₃->Phe

A fentiek előnyös kombinációk, azonban meg kell jegyeznünk, hogy más mutáció kombinációk is alkalmazhatók vakcina készítésre alkalmas megváltoztatott pneumolysin előállítására. Továbbá, a ♦ · » ···»« « • »··· * ««·· · Ut« « · β * · megváltoztatott pneumolizin tartalmazhatja az egyedi mutációk bármelyikét, amely kellően csökkenti az aktivitást.

A megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS-ből a megváltoztatott pneumolizin magas szintű kifejezése a szokásosan alkalmazott eljárások bármelyikével megvalósítható, köztük prokariota gazdaszervezetben való kifejezéssel, amely esetben a DNS-t a számos, jelenleg hozzáférhető expressziós vektor valamelyikébe klónozzuk, vagy a gazdaszervezet kromoszómájába megfelelően klónozzuk; eukarióta gazdaszervezetben való kifejezéssel, amely esetben a DNS-t megfelelően klónozzuk egy expressziós vektorba vagy a gazdaszervezet kromoszómájába; vagy alkalmazhatunk egy in vitro expressziós rendszert, például olyat, amely a megváltoztatott pneumolizin expressziójához szükséges tisztított komponenseket tartalmazza.

A mutációval létrehozott pneumolizin gén magas szintű expressziója érdekében azt a PKK233-2 vektorba klónoztuk Escherichia coli-ban vagy más hasonló prokariotában való expresszió céljára. Ez a vektor ampicillin és tetraciklin rezisztens géneket tartalmaz, a trc promoter (amely IPTG-dal izopropil-B-D-tiogalaktopiranozid - szabályozható) és a lac Z riboszóma-kötő hely szomszédos egy Ncol restrikciós helyet tartalmazó ATG iniciátor kodonnal. Az iniciátor kodontól közvetlenül 3' irányban vannak a Pstl és Hindin restrikciós helyek, ezt követi egy erős TiT₂ transzkripciós terminátor. A pneumolizint kódoló szekvencia 5' végén oligonukleotiddal irányított mutagenezissei Ncol restrikciós helyet hoztunk létre a PKK233-2 vektorba való beépítést megelőzően, amint az a 2.

• · • · · · • ·· ····· * • ···· ····· · ···· · ·· · ·

- 12 ábrán látható. Ez képessé tette a megváltoztatott pneumolizin gén közelebbi végét arra, hogy a pKK233-2 vektor Ncol helyébe klónozható legyen; a megváltoztatott gén távolabbi végének a pKK233-2 vektor kompatibilis helyébe való beillesztésére a pneumolizin terminátor kodontól 3' irányban mintegy 80 bázisnyira lévő Hindin helyet használtuk. A mutáns pneumolizin-származék azonban számos nagy expresszióval bíró vektorrendszer bármelyikébe klónozható.

A pneumolizin mutánst a következő módon készítjük: a fenti rekombináns plazmidot befogadó E. coli sejteket először 9 literes, a megfelelő antibiotikummal kiegészített Luria Bertán (vagy bármely más megfelelő) tápközegben tenyésztünk 37 °C hőmérsékleten levegőztetéssel. Amikor a tenyészet a szaporodás logaritmusos fázisának késői szakaszát eléri, IPTG-t adunk hozzá 20 gmól/l végkoncentrációnak megfelelő mennyiségben (hogy a megváltoztatott pneumolizin gén expresszióját indukáljuk), és az inkubálást további 2-3 órán át folytatjuk.

A sejteket ezután centrifugálással vagy ultraszűréssel összegyűtjük, EDTA-val és lizozimmal való kezeléssel lizáljuk, majd ultrahanggal kezeljük vagy egy francia nyomáskamrában roncsoljuk. A sejttörmelékeket centrifugálással eltávolítjuk, az extraktumot 10 mmól/l-es pH = 7,0-as nátrium-foszfáttal szemben kimerítően dializáljuk. Az anyagot ezután DEAE-cellulóz-oszlopra visszük, eluensként pH = 7,0-as nátrium-foszfátot alkalmazunk 10 - 250 mmól/1 közötti gradiensben. A pneumolizin származék legmagasabb szintjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, ultraszűréssel töményítjük, majd Sephacryl S-200 oszlopra • ·

- 13 visszük. Kifejlesztőszerként pH = 7,O-as, 50 mmól/l-es nátriumfoszfátot alkalmazunk, és ismét azokat a frakciókat gyűjtjük össze, amelyekben legmagasabb a pneumolizin mennyisége, az összegyűjtött frakciókat ultraszűréssel besűrítjük, és -15 °C hőmérsékleten 50 %-os glicerinben tároljuk. A végtermék tisztasága SDS-poliakrilamid-gél elektroforézis bizonysága alapján 95 % feletti. Egy másik, ugyancsak használható tisztítási mód a hidrofób interakciós kromatográfia fenil-Sepharose tölteten. Megjegyezzük azonban, hogy ez a megváltoztatott pneumolizin tisztítására csak egy eljárás, más alternatív eljárások (köztük nagynyomású folyadékkromatográfia) ugyancsak alkalmazható.

Ezt a tisztított megváltoztatott pneumolizint vakcinaként megfelelő szintben adagolhatjuk önmagában vagy más antigénekkel kombinálva. A megoldások egyike szerint a pneumolizin az előzőekben leírt pneumococcus törzsek közül egyből vagy többől származó poliszachariddal kapcsolható.

A mutáns pneumolizin különböző szerotípusú poliszacharidokhoz kapcsolható számos eljárással. Ezek egyike aktivált poliszacharid előállítása tiszta poliszacharidnak (kereskedelmi forgalomban beszerzett) cianogén-bromiddal és adipinsav-dihidraziddal (ADH) való kezelése. Ezt követően az ADH-poliszacharidőt a mutáns pneumolizinnel l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrogén-klorid jelenlétében egyesítjük. A konjugált anyagot a reagensektől Sepharose CL-4B kromatográfiás eljárással választjuk el.

Más megoldás szerint a poliszacharid - mutáns pneumolizin konjugát előállítható bifunkciós reagensek, például N-szuk- 14 cinimidil-6-(4'-azido-2·-nitro-fenil-amino)-hexanoát (SANPAH) alkalmazásával. Foszfáttal pufférőit sóoldatban oldott tiszta poliszacharidot reagáltatunk erős fehér fényforrás jelenlétében SANPAH-tal. A reageálatlan SANPAH-ot ezután az aktivált poliszacharidtól Sephadex G-50 tölteten való kromatografálással választjuk el. Az aktivált poliszacharidot ezután 0,2 mól/l-es pH = 8,5-es borátpufferben kapcsoljuk össze a mutáns pneumolizinnel. Minden feleslegben lévő reakcióképes csoportot ezután lizinnel blokkolunk, és a poliszacharid-protein konjugátot a többi reagenstől Sepharose CL-4B tölteten való kromatografálással választjuk el. A konjugát előállítható ciano-bór-hidriddel végrehajtott reduktív aminálással is.

Más megoldás szerint egy más protein, például inaktivált tetanusz toxin kapcsolható a kívánt poliszachariddal, és a megváltoztatott pneumolizin a vakcinához kötetlen formában adható hozzá.

A fentiekben a találmány legjobb megvalósítási módját írtuk le korlátozó szándék nélkül.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Lényegében nem-toxikus megváltoztatott pneumolizin, amely képes arra, hogy vad-típusú pneumolizinre reagáló állatokban immunválaszt váltson ki.
2. Az 1. igénypont szerinti megváltoztatott pneumolizin, azzal jellemezve, hogy komplement kötő aktivitása a vad-típusú pneumolizinhez mérten csökkent.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti megváltoztatott pneumolizin, azzal jellemezve, hogy Fc kötő aktivitása a vadtípusú pneumolizinhez képest csökkent.
4. Az 1.-3. igénypontok bármelyike szerinti megváltoztatott pneumolizin, azzal jellemezve, hogy a vad-típusú pneumolizintői egy vagy több aminosav helyettesítésében tér el.

5. Megváltoztatott pneumolizin, amely az alábbi aminosav szenvenciával bír:

Met Alá Asn Lys Alá Val Asn Asp Phe Ile Leu Alá Met 1 Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His 11 Gin Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe Ile 21 Lys Glu Gly Asn Gin Leu Pro Asp Glu Phe 31 Val Val Ile Glu Arg Lys Lys Arg Ser Leu 41 Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr 51 Alá Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly 61 Alá Leu Leu Val Val Asp Glu Thr Leu Leu 71 Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Alá Val Asp 81 Arg Alá Pro Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu 91 Pro Gly Leu Alá Ser Ser Asp Ser Phe Leu 101 Gin Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val 111 Arg Gly Alá Val Asn Asp Leu Leu Alá Lys 121 Trp His Gin Asp Tyr Gly Gin Val Asn Asn 131 141

• · • · • · · • · · ·· ····

Val Pro Alá Arg Met Gin Tyr Glu Lys 151 Ile Thr Alá His Ser Met Glu Gin Leu 161 Lys val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys 171 Thr Gly Asn Ser Leu Asp Ile Asp Phe Asn 181 Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gin Ile Gin 191 Ile Val Asn Phe Lys Gin Ile Tyr Tyr Thr 201 Val Ser Val Asp Alá Val Lys Asn Pro Gly 211 Asp Val Phe Gin Asp Thr Val Thr Val Glu 221 Asp Leu Lys Gin Arg Gly Ile Ser Alá Glu 231 Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val Alá 241 Tyr Gly Arg Gin Val Tyr Leu Lys Leu Glu 251 Thr Thr Ser Lys Ser Asp Glu Val Glu Alá 261 Alá Phe Glu Alá Leu Ile Lys Gly Val Lys 271 Val Alá Pro Gin Thr Glu Trp Lys Gin Ile 281 Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys Alá Val Ile 291 Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Alá Arg 301 Val Val Thr Gly Lys Val Asp Met Val Glu 311 Asp Leu Ile Gin Glu Gly Ser Arg Phe Thr 321 Alá Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr 331 Thr Thr Ser Phe Leu Arg Asp Asn Val Val 341 Alá Thr Phe Gin Asn Ser Thr Asp Tyr Val 351 Glu Thr Lys Val Thr Alá Tyr Arg Asn Gly 361 Asp Leu Leu Leu Asp ^R1 Ser Gly Alá Tyr 371 Val Alá Gin Tyr Tyr Ile Thr R2 Asp Glu 381 Leu Ser ^r3 r₄ His Gin Gly Lys Glu Val 391 Leu Thr Pro Lys Alá ^r5 Asp Arg Asn Gly 401 Gin Asp Leu Thr Alá His Phe Thr Thr Ser 411 Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu 421 Ser Val Lys Ile Arg Glu Re Thr Gly Leu 431 Alá ^r7 ^r8 Rg Trp Arg Thr Val Tyr Gly 441 Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg 451 Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr 461 Pro Gin Val Glu Asp Lys Val

Glu Asn Asp

471 • · 4 • · 4 4 4 4· ··· ··· · ·4 • ···· ·«···4 ···· · ·· · *

- 17 ahol R_x jelentése His vagy Arg, R₂ jelentése Trp vagy Phe, R3 jelentése Tyr vagy Phe, R4 jelentése Asp vagy Asn, R5 jelentése Trp vagy Phe, R₆ jelentése Cys, Gly vagy Ser, R₇ jelentése Trp vagy Phe, Rg jelentése Glu vagy Asp, Rg jelentése Trp vagy Phe, és ahol az Rj., Rg, R7, Rg és Rg csoportok közül legalább egynek a jelentése a vad-típusú pneumolizinétól eltérő.

6. Az 5. igénypont szerinti megváltoztatott pneumolizin, azzal jellemezve, hogy képletében R^ jelentése Arg, R₂ jelentése Trp, R3 jelentése Tyr, R4 jelentése Asn, R₅ jelentése Trp, R₆jelentése Cys, R₇ jelentése Trp, Rg jelentése Glu és Rg jelentése Trp.
7. Megváltoztatott pneumolizint tartalmazó vakcina, azzal jellemezve, hogy a pneumolizin nem-toxikus, és képes arra, hogy vad-típusú pneumolizirere reagáló állatokban immunválaszt váltson ki.
8. A 7. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a

2-6. igénypontok bármelyike szerinti megváltozatott pneumolizint tartalmazza.
9. Protein hordozóanyaggal kapcsolt kapszuláris poliszacharid anyagot és nem-kapcsolt protein anyagot tartalmazó vakcina, ahol a kapszuláris poliszacharid anyag egy vagy több Streptococcus pneumoniae szerotípusból származó, és a nem-kapcsolt protein anyag megváltoztatott pneumolizin, amely megváltoztatott pneumolizin nem-toxikus, és képes arra, hogy vad-típusú pneumolizinre reagáló állatokból immunválaszt váltson ki.
10. A 9. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy kapszuláris anyaga a Streptococcus pneumoniae 6A, 6B, 14, 18C, ·· « · · · ···· • · · · · · · ··· ····· · • ···· ····· · ·«·· · · · · *

19Α, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9Ν, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F és 33F szerotípusok közül egyből vagy többől származik.
11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a 2.-6. igénypontok bármelyike szerinti megváltoztatott pneumolizint tartalmazza.
12. Vakcina, azzal jellemezve, hogy protein hordozóanyaggal kapcsolt kapszuláris poliszacharid anyagot tartalmaz, amely kapszuláris poliszacharid anyag Streptococcus pneumoniae szerotípusok közül egyből vagy többől származik, és a protein hordozó egy megváltoztatott pneumolizin, amely megváltoztatott pneumolizin nem-toxikus, és képes arra, hogy vad-típusú pneumolizinre reagáló állatokból immunválaszt váltson ki.
13. A 12. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy kapszuláris anyaga a Streptococcus pneumoniae 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 15B, 17F, 20, 22F és 33F szerotípusok közül egyből vagy többől származik.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti megváltoztatott pneumolizint tartalmazza.
15. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS szekvenciát tartalmazó rekombináns plazmid.
16. A 9. igénypont szerinti rekombináns plazmidot tartalmazó hibrid gazdasejt, ahol a rekombináns plazmid a megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS-nak a gazdasejten belüli expressziójára ··· · · • · · · · szolgáló indukálható expressziós szabályozást tartalmaz.
17. Eljárás megváltoztatott pneumolizin előállítására, azzal jellemezve, hogy a megváltoztatott pneumolizint egy olyan expressziós rendszerből tisztítjuk, amely egy olyan megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot tartalmaz, amely pneumolizin lényegében nem-toxikus és képes arra, hogy a vad-típusú pneumolizinre reagáló állatokban immunválaszt váltson ki.
18. Eljárás megváltoztatott pneumolizin előállítására, azzal jellemezve, hogy a megváltoztatott pneumolizint olyan gazdasejt tenyészetből tisztítjuk, amely egy olyan megváltoztatott pneumolizint kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns kiónt foglal magában, amely pneumolizin lényegében nem-toxikus és képes arra, hogy vad-típusú pneumolizinre reagáló állatokban immunválaszt váltson ki.
19. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megváltoztatott pneumolizint kódoló rekombináns kiónt sokszorozunk, a klónozott anyag transzkripcióját és transzlációját indukáljuk, a megváltoztatott pneumolizint tisztítjuk és a megváltoztatott pneumolizint kapszuláris poliszachariddal kapcsoljuk, ahol a megváltoztatott pneumolizin toxikus hatása a vadtípusú pneumolizinéhez képest lényegesen csökkent.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti megváltoztatott pneumolizint alkalmazzuk.