HUT51332A - Process for expressing p.falciparum cirkumsporozoita protein by yeast - Google Patents
Process for expressing p.falciparum cirkumsporozoita protein by yeast Download PDFInfo
- Publication number
- HUT51332A HUT51332A HU885096A HU509688A HUT51332A HU T51332 A HUT51332 A HU T51332A HU 885096 A HU885096 A HU 885096A HU 509688 A HU509688 A HU 509688A HU T51332 A HUT51332 A HU T51332A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- vector
- fragment
- host
- falciparum
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 title claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 title claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 101900205473 Plasmodium falciparum Circumsporozoite protein Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 98
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 56
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 claims description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 2
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims 1
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 72
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 240000009188 Phyllostachys vivax Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 101150060644 ARG3 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101100462418 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ARG3 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101100185024 Mus musculus Mslnl gene Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- -1 oxyethylene nitrile Chemical class 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000224028 Plasmodium cynomolgi Species 0.000 description 1
- 101000726057 Plasmodium falciparum Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 101900248052 Plasmodium knowlesi Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100174613 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TDH3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- CETPSERCERDGAM-UHFFFAOYSA-N ceric oxide Chemical compound O=[Ce]=O CETPSERCERDGAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000422 cerium(IV) oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A jelen találmány P.falciparum cirkumsporozoita fehérje kifejezésével foglalkozik élesztőkkel, valamint olyan vakcinával, amely ilyen fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazza.
Számos, nem régi tanulmány azt sugallja, hogy a védő (protektív) immunitást valamely érzékeny gazdaszervezetben Plazmodium adott fajtáinak sporozoita stádiumaival történő fertőzésére olyan antitestek közvetíthetik, amelyeket az adott sporozoita cirkumsporozoita fehérjéjére (CS fehérje) az ilyen gazdaszervezetek termelnek. A jelen találmány lehetővé teszi a P. falciparum humán malária parazita vagy immunogén származéka CS fehérjéjének termelését élesztővel, rekombináns DNS technika segítségével.
Kívánatos az élesztők alkalmazása ilyen P.falciparum CS fehérjék termeléséhez többféle okból, beleértve az endotoxin jól ismert és megbízható fermentációs jellemzőit, amikor az ilyen CS fehérjét élesztőben állítják elő a gram-negatív baktérium-sejtek, mint p. E.coli helyett.
Nussenzweig és munkatársai (4,466,917 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás) egy sporozoita polipeptidet alkottak meg Plasmodium falciparumból, amelyet Pf-44 fehérjének azonosítottak, és leírták ennek klónozását, valamint E.coliban való kifejezését.
Sharma és munkatársai /Science, 228, 279-282 (1985)/ Plasmodium knowlesi cirkumsporozoita fehérje (CS) egy részének kifejezését ismertetik élesztőkkel, egy, az élesztő ··*· ·· ·««· ·· ·· • · · · · · • · ····♦·· a • · · · »···
- 3 alkohol dehidrogenázl gén 5' szabályozó területet tartalmazó kifejező vektort alkalmazva a P.knowlesi CS gén szekvencia 5' felfele területe helyett.
A New York University (WO 84-02922-A számú PCT közzétételi irat, közzétéve 1984. augusztus 2-án) a P.knowlesi CS fehérje ismétlődő egységét kódoló terület egy részének klónozását, és béta-laktamáz és béta-galaktozidáz fúziós termékeik kifejeződését ismerteti E.coliban.
Kemp és munkatársai (W084-02917-t) a P. falciparum vérstádiumából származó CS fehérjét kódoló szekvencia klónozását és E.coliban való kifejezését ismertetik.
Dame és munkatársai /Science 225 , 593 (1984)/ beszámolnak a P. falciparum CS fehérjéje klónozásáról és kifejezéséről E.coliban. A fehérjéről azt írják le, hogy mintegy 412 aminosavat tartalmaz, mintegy 44000 molekulatömeggel. Ez egy tetrapeptid 41 egymás utáni ismétlődését tartalmazza. A CS fehérje ellen képződött monoklonális antitestekhez kötött ismétlődő területből szintetikus 7-, 11- és 15-gyökös peptidek származnak.
Ellis és munkatársai /Natúré 302, 536 (1983)/ beszámolnak béta-laktamáz - P.knowlesi CS fehérje fúziós termék kifejeződéséről E.coliban.
Weber és munkatársai /Molecular and Bacterial Parasitology, 15 , 305-306 81985)/ ismertetik P. falciparum egy brazil törzse E.coliban klónozott CS fehérje génjének alkalmazását vizsgáló mintaként 17 másik P. falciparum törzs szerkezetének elemzésére nukleinsav hibridizálással, és arra a következtetésre jutnak, hogy a CS fehérje gén nagy ·♦»· ·· ·«·« ·« ·· • · · · · · · • · ···· ··· · • · · · · ·· ν· ··· ·· ···· mértékben megőrződött P. falciparumban, vakcina kifejlesztése a CS fehérjével komplikálódik a törzsvariációkkal.
Arnot és ismertetik CS génből célból, könyvtárából és hogy a malária valószínűleg nem munkatársai /Science, 230, P.vivax CS fehérjéjének klónozását, származó hogy
815-818 (1985)/
P. cynomolgi vizsgáló mintákat alkalmazva, abból a klónozott P.vivax genom DNS bakteriofág homológ gént izoláljanak és meghatározzák teljes kódoló szekvenciáját; arra a következtetésre jutottak, hogy a P.vivax CS fehérjének kódoló szekvenciája homológ a P. knowlesi CS génjének szekvenciájával, de nem azonos a P. falciparuméval.
Young és munkatársai /Science, 228, 958-962 (1985)/ ismertetik P. falciparum CS fehérje kifejeződését, amelyet esetleg humán malária vakcinában lehet alkalmazni.
A Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research /W0 84/02917 számú PCT közzétételi irat, nyilvánosságra került 1984. augusztus 2-án) ismertet olyan mesterségesen megalkotott polinukleotid szekvenciákat, amelyek lényegében megfelelnek a P. falciparum mRNS vagy genom DNS részének vagy egészének; ismertetik továbbá az ilyen szekvenciának megfelelő peptideket és az ezek előállításához alkalmas módszereket, valamint egy ilyen peptidet tartalmazó kompozíciót P. falciparum antigén elleni immunválaszok stimulálására emlősökben.
Mazier és munkatársai /Science, 231, 156-159 (1986)/ ismertetik, hogy P. falciparum cirkumsporozoita fehérjék számos rekombináns és szintetikus peptidjével immunizált egerekben keletkező antitesteket értékeltek védő aktivitásra humán hepatocita tenyészet rendszerben.
· »· V
Barr és munkatársai /Modern Approaches to New Vaccines and
AIDS 22. oldal, Cold Spring Harbor, New York, 1986 szeptember 3-14.) ismertetik a P.vivax CS fehérje kódoló szekvencia egy részének kifejeződését S. cerevisiae-val, ahol a nevezett 2/glice raldehid-3 van fuzionálva.
szekvencia élesztő alkohol dehidrogenázfoszfát dehidrogenáz hibrid promotorral Barr és munkatársai bemutatják egy szabályozott hibrid promotor alkalmazását P. vivax CS fehérje kifejeződéséhez. Ennek a promotornak az exakt szerkezete azonban nincs megállapítva. A promotorhoz való fúzióhoz alkalmazott CS gén szekvenciából hiányzik a Cterminális terület, amely egy horgony terület a beiktatáshoz a sejtmembránban. Az exakt határok nincsenek megnevezve. Az sincsen feltárva, vájjon a konstrukcióban alkalmazott génszekvencia tartalmazza-e a szignálszekvenciát, vagy sem.
Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.
Ez a találmány rekombináns DNS vektorra vonatkozik, amely egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy kifejező kontroll szekvenciához és kívánt esetben tartalmaz továbbá egy az élesztőben működőképes replikont, ahol a fenti DNS szekvencia Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéjének kódoló szekvenciáját tartalmazza.
A jelen találmány egy rekombináns DNS vektorral transzformált élesztő gazdasejtre is vonatkozik, ahol az említett vektor egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy kifejező kontroll szekvenciához, és ·**· · · ··*· * · • · · · · • · · ♦ · · · « • · · · · ♦ · »· · · ··· · · • ♦ ♦ · kívánt esetben tartalmaz továbbá egy, az említett gazdasejtben. működőképes replikont, ahol a fenti DNS szekvencia Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéinek kódoló szekvenciáját tartalmazza. Ez a találmány ilyen transzformált gazdasejtek előállítási eljárására is vonatkozik, amely eljárás egy élesztő gazdasejt transzformálásából áll ilyen rekombináns vektorral.
A jelen találmány foglalkozik Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéje előállítási eljárásával is, amely eljárás magában foglalja egy rekombináns DNS vektorral transzformált élesztő gazdasejt tenyésztését megfelelő tenyésztő tápközegben és az ilyen fehérje izolálását egy ilyen gazdaszervezet tenyészet-lizátumából, ahol az említett vektor egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy kifejező kontroll szekvenciához és kívánt esetben tartalmaz továbbá egy, az említett gazdasejtben működőképes replikont, ahol a fenti DNS szekvencia Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéinek kódoló szekvenciáját tartalmazza. Ez a találmány vonatkozik az így előállított fehérjére is, valamint olyan vakcinára, amely egy ilyen fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazza.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. ábra a pRIT10162 előállítását bemutató folyamatábra.
A 2. ábra a pRIT10172, pRIT12570 és pRIT12569 plazmidok restrikciós endonukleázos térképe.
A 3. ábra a pRIT12290 restrikciós endonukleázos térképe.
A 4. ábra a pRIT12570 előállítását bemutató folyamatábra.
·· ·«·· ·· ··»· ·· • · · · · • · · ·♦· ··· ···· · ♦ · · ·· ·· ·· · · · · · ·
Az 5. ábra a pMC200 restrikciós endonukleázos térképe.
Az 1A. ábra vázlatos restrikciós térkép, amely a /(_mPfl klón szekvenciaelemzési stratégiáját mutatja be.
A 2A. ábra a P.falciparumból származó CS fehérje gén nukleotid szekvenciáját mutatja be.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.
A Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéje kifejezés az immun-domináns felületi antigént jelenti a Plasmodium falciparum sporozoitán (CS fehérje).
A Plasmodium falciparum CS fehérje kódoló szekvenciát ismertetik Dame és munkatársai /Science 225, 593-599 (1984)/.
Ahogyan itt használjuk, a cirkumsporozoita fehérje, CS vagy CS fehérje magában foglalja mind a teljes hosszúságú Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjét, mind bármely cirkumsporozoita következőket cirkumsporozoita hosszúságú CS fragmentuma által fragmentumainak megőrzi védő származékát. A immunogén (a) a bármely kódoló
Plasmodium származéka Plasmodium származékát szekvencia falciparum kifejezés a falciparum , pl. a teljes valamely alimmunogén fehérje jelenti: fehérje fehérje kódolt származék, vagy egymás melletti alsorozata által kódolt származék, amely immunogén aktivitását, vagy (b) a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérje módosított kódoló szekvenciájából származó bármely fehérje, amely megőrzi védő immunogén aktivitását. Az ilyen immunogén származékokat «··· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · ··· ··· · ··*· ·♦·· · ·· ·· · ·* «··· hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. Botstein és munkatársai módszerével /Science 229, 1193 (1985)/. A
P.falciparum CS fehérje kódoló szekvenciáinak': néhány immunogén szintetikus származékát ismertetik Ballou és munkatársai /Science 228, 996-999 (1985)/.
A jelen találmány szerinti rekombináns vektor magában foglal egy DNS molekulát operatívan összekapcsolva egy kifejezés szabályozó szekvenciával, és kívánt esetben magában foglal még egy olyan replikont, amely működőképes élesztőkben; a fentebb nevezett DNS molekula a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéjének kódoló szekvenciáját tartalmazza. A replikon kifejezés a DNS-nek azt a minimális területét jelenti, amely úgy működik, hogy az ilyen rekombináns vektort megtartsa a vele transzformált élesztő gazda-mikroorganizmusban. Az ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. A kifejezés szabályozó szekvencia kifejezés bármely olyan területet jelent, amely szabályozza egy strukturgén kódoló szekvenciájának az átírását. Az ilyen kifejezés szabályozó szekvenciák jól ismertek a szakterületen. Az előnyös kifejezés szabályozó szekvenciák között találjuk az élesztő gliceraldehid-3Pdehidrogenáz gén (TDH3) promotort és az élesztő ornitin karbamoil transzferáz gén (ARG3) átírás terminációs területet. További hasznos kifejezés szabályozó szekvenciák vagy területek lehetnek azok, amelyek a glikolitikus út élesztő-génjéből származnak, pl. az enolázt, aldolázt, és foszfoglicerát kinázt kódoló gének; az élesztő alkohol dehidrogenáz gén; és általában azok a gének, amelyek a katabolizmusban részt vesznek, pl. az argináz gén. Az ilyen ·»·· ♦·»· ·· • 9 • · ·· ···
Λ • 99 • · · ··· ♦ • · · • · ·«· ·
Plasmodium beiktatásával már tartalmaz vektorokat hagyományos technikákkal lehet előállítani, falciparum CS kódoló szekvenciájának megfelelő fázisban egy olyan vektorba, amely egy replikont és egy kifejezés szabályozó szekvenciát olyan módon, hogy a DNS molekula hozzákapcsolva az ilyen kifejezés szabályozó Egy alkalmas vektor, lehet iktatni, lehet replikálódni és cerevisiae-ben, és Számos más élesztő transzformálás olyan replikációs szekvencia normálisan a jelen találmány szerinti DNS molekula extrakromoszomális fenntartását eredményezi plazmidként. Az ilyen replikonok olyan plazmid élesztőben a CS
YEpl3 mind operatívan van szekvenciához.
kódoló plazmid, E.coliban, mint ingázó szekvenciát be amely képes mind S. vektor.
amelybe pl. az fennmaradni ezért úgy ismert, vektor is ismeretes és hozzáférhető. A vektorokkal, amelyek autonóm (replikon) funkciót tartalmaznak, jól ismertek a szakterületeken. A transzformálás nem tartalmaznak a DNS molekula vektorokkal, működőképes eredményezheti a előnyösen olyan beépülését molekulát
Saccharomyces nemzetség cerevisiae-ben kifejezésre amelyek replikonokat, kromoszomális DNS-be. A DNS vektorba ligáljuk, amely a élesztőiben, elsősorban S. képes.
A DNS hasítását alkalmazott fragmentumok találmányban állítsuk elő, molekuláknak a beiktatását abból a fragmentumokat abból a célból rekombináns ezeknek a
DNS ligálását alkalmazott valamint célból, hogy a jelen találmányban állítsuk elő, az ilyen , hogy a jelen DNS molekulákat rekombináns DNS mikroorganizmusokba ismert pl. olyan technikákkal, technikákkal hajtjuk végre, • ·· amelyeket a jelen bejelentésben korábban idézett és később idézendő referenciák tartalmaznak. A körülményeket úgy választjuk meg, hogy elkerüljük a DNS és az enzimek denaturálódását. így pl. a pH-t olyan módon pufferoljuk, hogy mintegy 7,0 és 11,0 között maradjon, és a hőmérsékletet is 60 °C alatt tartjuk. A hasítást előnyösen 30-40 °C közti hőmérséklettartományban végezzük és a ligálást 0-10 °C közti hőmérséklettartományban hajtjuk végre. A jelen találmány kivitelezésében alkalmazott restrikciós enzimek és ligázok kereskedelmi forgalomban hozzáférhetők és az ezekkel együtt kapott instrukciókkal összhangban alkalmazzuk ezeket. Ligázként a T4 ligáz az előnyös.
A különböző fragmentumokat és végső konstrukciókat hagyományos módokon lehet egyesíteni. Sok esetben a géneket izoláljuk, restrikciós térképezésüket és szekvenciaelemzéseket elvégezzük. Eddig a mértékig ki lehet választani a szóban forgó szekvenciát, pl. a CS fehérje kódoló szekvenciát a gén hasításával, szükség esetén további manipulációt is alkalmazva, pl. levágást Bal31-gyel, in vitro mutagenezist, primer helyreállítást, stb., hogy kívánt méretű fragmentumot kapjunk, amely tartalmazza a kívánt szekvenciát és megfelelő végekkel rendelkezik. Kapcsolókat (linkereket) és adaptereket alkalmazhatunk a szekvenciák egyesítésénél, valamint az elveszett szekvenciák helyettesítésénél, ahol a restrikciós hely a szóban forgó területen belül van. A különböző fragmentumokat, amelyeket izolálunk, elektroforézissel és elektroelucióval tisztíthatjuk, ligálhatjuk más szekvenciákhoz, klónozhatjuk, újra izolálhatjuk és tovább manipulálhatjuk.
···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · ··· ··· · ···· · · · · ·· ·· ··· ·· ····
- 11 A kifejezés szabályozó szekvenciák alkalmazása a CS fehérje kódoló szekvencia átírásának szabályozására lehetővé teszi a gazdasejtek növesztését nagy sűrűséggel a CS fehérje kódoló szekvencia kifejezése nélkül vagy csak alacsony szintű kifejezésével, majd a kifejezés indukálását a környezeti körülmények megváltoztatásával, pl. tápközeg, hőmérséklet, stb. megváltoztatásával.
így pl. a GAL4 szabályozó területtel rendelkező élesztősejteket tápanyagban dús tápközegben lehet növeszteni, glicerin/íe jsav kombinációjú tápközegben nagy sűrűségig, pl. középső vagy késői lóg fázisig, majd ezt a szénforrás átváltása követi galaktózra. A PH05 szabályozásnál a sejteket nagy foszfátkoncentrációnál (0,ΙΟ,5 mmól/1) lehet növeszteni. A hőmérséklet-érzékenységnél a sejteket 25 °C és 37 °C közti hőmérséklettartományban lehet növeszteni, majd a hőmérsékletet megfelelően változtatni kell 5-20 °C közti hőmérséklettartományba. A gazdaszervezetnek rendelkeznie kell a szabályozó rendszerrel az alkalmazott szabályozó területtel társulva.
A CS fehérje kódoló szekvencia fuzionálását a kifejezésszabályozóval intermedier vektorok alkalmazásával hajthatjuk végre, vagy egy másik módszer szerint a kódoló szekvenciát közvetlenül be lehet iktatni egy olyan vektorba, amely a kifejezés szabályozó szekvenciát tartalmazza. A CS fehérje kódoló szekvencia előnyösen úgy van elhelyezve a kifejezés szabályozó szekvenciához viszonyítva, hogy a CS fehérje kódoló szekvencia kifejezése révén szintetizált fehérje • · · · · · · • · · ··· ··· · ···· ···· ·· ·· ··· ·· ···· mentes legyen a fölösleges aminosavgyököktől.
- 12 A jelen találmány foglalkozik az ilyen rekombináns vektorral transzformált élesztő gazdasejtekkel és az ilyen gazdasejtek előállításának módszerével is. Az ilyen transzformálást hagyományos technikákkal hajtjuk végre, pl. Ito és munkatársai módszerével /J. Bacter. 153, 163-168 (1983)/. Az előnyös élesztő gazdasejtek között találjuk azokat, amelyek a Saccharomyces nemzetségbe tartoznak, és különösen azokat, amelyek a Saccharomyces cerevisiae fajba tartoznak.
A jelen találmány foglalkozik a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérje előállításának eljárásával is; az eljárás abban áll, hogy a jelen találmány szerinti transzformált élesztő sejteket megfelelő tenyésztő tápközegben tenyésztjük, és a fehérjét az ilyen gazdasejtek tenyészetének lizátumából kinyerjük. A megfelelő tenyésztő tápközeg olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a transzformált gazdaszervezetet a túlélésre és amely képessé teszi az ilyen ^gazdaszervezetet arra is, hogy a CS fehérjét kinyerhető mennyiségben szakterületen felhasználandó jártasak, tenyésztő kifejezze. Azok, akik a méltányolni tudják, hogy a tápközeg függ a alkalmazott gazdasejttől.
CS fehérje izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészetének lizátumából hagyományos fehérje-izolálási technikákkal hajthatjuk végre.
A jelen találmány foglalkozik olyan vakcinával is, amely a jelen találmány eljárásával előállított P. falciparum CS fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazza. Az • · · ·
- 13 immunprotektív kifejezés azt jelenti, hogy a jelen találmány szerinti CS fehérjéből elegendő mennyiséget adunk be ahhoz egy fertőzött emberi gazdaszervezetbe, hogy megfelelő védő antitest válasz keletkezzék az ez utáni P.falciparum parazita fertőzések ellen. A jelen találmány szerinti vakcinában a jelen találmány szerinti polipeptid vizes oldatát, vagyis a jelen találmány szerinti transzformált élesztő gazdasejtek által kifejezett P.falciparum CS fehérje vizes oldatát, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolva, közvetlenül alkalmazhatjuk. Egy másik módszer szerint a polipeptidet, előzetes liofilezéssel vagy a nélkül, összeverhetjük bármilyen ismert adjuvánssal, vagy abszorbeálhatjuk ezekre. Az ilyen adjuvánsok között találjuk többek között az alumínium-hidroxidot, a muramil-dipeptidet és a szaponinokat, pl. a Quil A-t. Példaként felhozott további változat lehet az, hogy a polipeptidet mikrorészecskékbe burkoljuk, pl. liposzómákba. Egy példaként felhozott még további változat szerint a polipeptidet immunstimuláló makromolekulához konjugáljuk, pl. elölt Bordatella vagy tetanusz toxoidhoz.
Vakcina-készítményekről általában írnak az alábbi kiadványban: New Trends and Developments in Vaccines, szerkesztők: Voller és munkatársai, kiadó: University Park Press, Baltimore, Maryland, USA (1978). A liposzómákkal való beburkolásról ír pl. Fullerton a 4,235,877 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban. Fehérjék konjugálását makromolekulákhoz ismertetik pl. Likhite (4,372,945 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint Armor és munkatársai • · · · • · • ·
- 14 (4,474,757 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentés). A Quil A alkalmazását ismertetik pl. Dalsgaard és munkatársai /Acta Vet. Scand. 18. kötet, 349. oldal (1977)/.
Az élesztő-eredetű P.falciparum CS fehérje mennyiségét, amely az egyes vakcina-adagokban jelen van, úgy választjuk meg, mint azt a mennyiséget, amely immunprotektív választ indukál a nélkül, hogy jelentős káros mellékhatásokat indukálna. Az ilyen mennyiség változhat attól függően, hogy milyen adott polipeptidet alkalmazunk és a vakcina van-e adjuválva vagy nincs. Általában az várható, hogy az egyes dózisok 1-1000 ^g, előnyösen 10-200 ^tg polipeptidet tartalmaznak. Egy adott vakcina optimális mennyiségét standard tanulmányokkal lehet megállapítani, beleértve az antitest titerek és más válaszok megfigyelését a betegben. Az induló vakcinálást követően a betegek előnyösen emlékeztető oltást is kapnak mintegy 4 hét múlva, ezt követik ismételt emlékeztető oltások minden hat hónapban mindaddig, amig a fertőzés kockázata fennáll.
PÉLDÁK
Az alábbi példák csupán a találmány bemutatásának célját szolgálják, és nem korlátozó jellegűek. Az összes hőmérséklet Celsius fokban van megadva. A DNS manipulációkban alkalmazott enzimeket a Bethesda Research Laboratories-től, a New England Biolabs-tól és/vagy a Boehringertől szerezzük be, és a szállító útmutatásai szerint alkalmazzuk ezeket.
- 15 A példákban az alábbi rövidítéseket alkalmazhatjuk:
YNB: élesztő nitrogén bázis aminosavak nélkül (Difco Láb), 0,675%, amely 2% glükózt tartalmaz
PBS: foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat (pH 7,4) 8,0 gramm NaCl
0,2 gramm KC1
1,15 gramm Na2HP04
0,2 gramm KH2PO4
0,1 gramm CaC12
0,1 gramm MgCl2 . 6Η20 (literenként)
BSA: szarvasmarha szérum albumin (A 4378, Sigma)
L-tápközeg 10 gramm tripton gramm NaCl gramm élesztőkivonat ml 0,1 mól/literes MgSO^.
Ehhez autoklávozás után tiamid (1 mg/ml) aszeptikus oldatának 5 ml-ét adjuk. A szilárd tápközeghez 15 g agart adunk literenként
X-gal: 5-bróm-4-klór-indolil-/3 -D-galaktopiranozid.
A példa. A pRIT10167 plazmid megalkotása
A kiindulási anyag a p6y plazmid, amely a TDH3 kódoló élesztő gén DNS 2,1 kb-s HindlII fragmentumát tartalmazza pBR322-be klónozva. A pBR322-t Bolivár és munkatársai írták le /Gene, 2_, 95-113 (1977)/. A p6y plazmidot Musti és munkatársai alkották meg és jellemezték /Gene, 25 , 133 (1983)/, ezt mi Dr.Rosenberg M.-től (National Institute of
- 16 Health) kaptuk. A HindlII fragmentumot újra klónozzuk egy olyan pBR322 származékba, amelyben az EcoRI hely el van roncsolva, hogy a pRIT10164 plazmidot kapjuk meg (nem feltétlenül szükségszerű művelet^. Az alábbi manipulációkat hajtjuk végre, hogy egy BamHI helyet alkossunk meg a TDH3 kódoló szekvencia ATG kodonjának G gyökénél elhelyezve, és egy olyan HindlII BamHI DNS fragmentumot kapjunk TDH3 promotor aktivitással, amelyben a TDH3 szekvenciák épek és változatlanok a manipuláció során. A pRIT10164 DNS-t, amelyet a fentiek szerint állítunk elő, CsCl-etídium-bromid sűrűséggradiens centrifugálás két ciklusával tisztítjuk, lényegében úgy, ahogyan ezt Kahn és munkatársai leírták /Methods in Enzimology 68 , 268 (1979)/. 150^g pRIT 10164 DNS-t emésztünk teljességig 75 egység Xbal endonukleázzal, extraháljuk fenollal és éterrel, etanollal kicsapjuk, és a DNS-t újra szuszpendáljuk 0,01 mól/1 trometamin, HCl pufferban 1 vK9//l· 1 koncentrációban. Ennek az Xbal-gyel kezelt DNS-nek 20 ^cg-ját Bal31 nukleázzal kezeljük, hogy levágjuk a DNS 61 bázispárját az ATG kodon és az Xbal hely között. A Bal31-gyel végzett emésztéseket 30 °C hőmérsékleten hajtjuk végre, 1-3 percen át, olyan pufferban, amely 60 mmól/1 NaCl-t, 12 mmól/1 CaC^-t, 12 mmól/1 Mg CI2t, 1 mmól/1 EDTA-t, 20 mmól/1 trometamin. HCl-t tartalmaz (pH3,l); az eljárásban 1 egység Bal31 nukleázt alkalmazunk
20^tg DNS-re, 200 végső reakciótérfogatban.
Az enzimreakciót etilén-bisz (oxi-etilén-nitrilo) tetraecetsav (EGTA) hozzáadásával állítjuk le, hogy ennek végső koncentrációja 20 mmól/1 legyen, és a mintákat azonos • ·
- 17 térfogatnyi fenollal, majd éterrel extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az egyes DNS mintákat újra szuszpendáljuk 20/11 10 mmól/l-es trometamin-HCl pufferban (pH 7,5). A Bal31 emésztés mértékét úgy mérjük, hogy az egyes DNS mintákból mintegy 2,5 /Lg-ot emésztünk Hpal endonukleázzal és a HpalXbal fragmentumok méretét összehasonlítjuk a pRIT10164-ből származó 335 bp-s Hpal-Xbal fragmentummal. A Bal31-gyel végzett 2 perces emésztésről úgy találjuk, hogy mintegy 4188 nukleotidot távolít el a pRIT10164 Xbal-Hpal fragmentumáról.
Ez az eredmény távolítódott el felé. 5/t g, 2 emésztünk BamHI azt jelzi, hogy hasonló számú bázispár a másik Xbal túlnyúlásról is az ATG kodon perces Bal31 emésztésből kinyert DNS-t endonukleázzal, extraháljuk fenollal, és etanolos kicsapással kinyerjük. Ebből a DNS-ből 2,3 g-ot kezelünk 5 egység T4 DNS ligázzal, és a ligálási keverék felét alkalmazzuk E.coli K12 MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, Cohen és munkatársai módszere szerint /Proc. Natl. Acad. Sci. 69., 2110 (1972)/. A transzformált E.coli populáció 1 ml-ét hígítjuk 350 ml-re 200i/vtg/ml ampicillint is tartalmazó L-tápközeggel, és az így létrejött tenyészetből a teljes plazmid DNS-t tisztítjuk.
Ezt a plazmid DNS-t , amely Bal31-gyel indukált mintegy 40-80 bázispár-hiányban szenvedő plazmid-molekulák populációját tartalmazza, egymás után emésztjük 75 egység HindlII endonukleázzal és 96 egység BamHI endonukleázzal, hogy DNS fragmentumokat bocsássunk ki azokból a plazmidokból, amelyekben előzőleg egy BamHI helyet alkottunk • · ···· ··· · • · · · · · · meg a fentebb leírt kezelések utánt vagyis ahol Bal31 emésztés egy G gyöknél fejeződött be. Ezt a DNS emésztményt 1%-os preparatív agaróz gélen futtatjuk, és az 110-1000 bp közti méretnek megfelelő kívánt HindiII-BamHI fragmentumokat a gélből két szeletben kivágjuk, az egyik mintegy 1070 bp-s, a másik mintegy 1030 bp-s DNS-nek felel meg. A DNS-t a két agaróz gél szeletből kinyerjük, a kinyerést olyan módon végezve, hogy fagyasztás-felengedtetés két ciklusát végezzük és ezt nagy sebességű centrifugálás követi, hogy az agarózt üledékbe vigyük. A felülúszó folyadékot Millipore GV Millex szűrőn át leszűrjük, és a DNS-t etanolos kicsapás két menetével kinyerjük, majd 20^tl 0,01 mól/l-es trometamin-HCl pufferban (pH 7,5) újra szuszpendáljuk.
Az agaróz gél elektroforézis elemzése és az összehasonlítás a pRIT10164 DNS HindlII+Xbal emésztményével és a fág DNS HindlII+EcoRI emésztményéből kapott fragmentumokkal azt mutatja, hogy HindlII-BamHI fragmentumok két elkülönült populációját kapjuk, egyet mintegy 1070 bp becsült mérettel, és egyet mintegy 1030 bp mérettel, míg a pRIT 10164-ből származó szülő HindlII-Xbal fragmentum mérete 1120 bp. Az 1030 bp-s HindlII-BamHI fragmentum populációból mintegy 100 ng-ot ligálunk 200 ng pUC9 plazmiddal, amelyet előzőleg HindlII és BamHI endonukleázokkal emésztettünk és alkálikus foszfatázzal kezeltünk (lásd: Shine: 4,264,731 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), és a ligálási keveréket alkalmazzuk E.coli JM103 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ahol a szelekciót ampicillin rezisztenciával végezzük. Az E.coli JM103 törzs transzformálását Cohen és munkatársai módszerével (fentebb • · idézett munka) hajtjuk végre.
Mind a pUC9 vektor plazmidot, mind a befogadó E.coli 3M103 törzset leírták Vieira és Messing /Gene, 19 , 259 (1982)/, ezeket Messing 3.-tői kaptuk meg (University of Minnesota). A pUC9 vektor kereskedelmi forgalomban beszerezhető az Amersham-tól (Buckinghamshire, Egyesült Királyság) és a Pharmacia-tól (Uppsala, Svédország). Az E.coli JM1O3 törzs általában beszerezhető Messing 3.-tői (University of Minnesota). Egy másik E.coli törzset lehet beszerezni az E.coli 3M103 törzs jellemzőivel, vagyis a 3M101-et, az American Type Culture Collectiontól (ATCC, Rockville, Maryland), ATCC 33876 letéti számon, és ezt is lehet alkalmazni gazdaszervezetként. Milliliterenként 400 ampicillin-rezisztens telepet kapunk és ebből 98-at vizsgálunk meg X-gal-t tartalmazó tápközegen. Ezek közül 95 fehér, jelezve az idegen DNS fragmentum sikeres beiktatását a HindlII és BamHI helyek közé a vektorban.
Az egyes transzformáns telepekből plazmidokat készítünk kis léptékű eljárással /Bimbóim és Doly ; Nucl.Acid Rés. 7_, 1513 (1979)/ a plazmid sokszorozása után spektinomicin (150 vM.g/ml) hozzáadása révén a növekedő tenyészethez.
A rekombináns plazmidokat 7,5%-os akrilamid gélen elemezzük
Avall és BamHI endonukleázokkal végzett kettős emésztéssel és összehasonlítjuk kódoló területét fragmentumokkal. Egy megfelelő AvalI-BamHI a pRIT10164 promotor-N-terminálist tartalmazó 450 bp-s Avall-Xbal20-90 bázispárok közti kiiktatásnak fragmentum vanxjelen a megvizsgált 36 ···· · · ···· · · ·· • · · · · · · • · ···· ··· · ···· a · · • · · · ··· · · «·»·
- 20 plazmidból 35-ben, amikor összehasonlítjuk pRIT10164-gyel. Három plazmidot választunk ki további tanulmányozásra: egyet mintegy 80 bázispáros kiiktatással (pRIT10166), egyet 50 bázispáros kiiktatással (pRIT10167, I. ábra), és egyet 45 bázispáros kiiktatással (pRIT10165). Plazmid DNS-t készítünk CsCl-etidium-bromid sűrűség-gradiens centrifugálással és mindegyikből 25 ^g-ot emésztünk EcoRI-gyel. Az EcoRI túlnyúlásokat ^-^P-ATP-vel jelezzük kinázos cserével és az egyes plazmidokból nukleotidszekvenciáját módszerével /Methods a HindlII-EcoRI fragmentumok
Maxam és Gilbert kémiai módosítási in Enzimology, 65 , 499 (1980)/ határozzuk meg. Az egyes rekombináns plazmidok pUC9 vektor részében jelen lévő EcoRI hely jelzése és az ebből a helyből végzett szekvenciaelemzés a kényelmes módja a szomszédos
BamHI hely körüli szekvencia meghatározásának, amely a kiiktatás végét jelzi a TDH3 DNS fragmentumban. Ez a szekvenciaelemzés azt mutatja, hogy a pRIT10166 plazmidban a BamHI hely újra kialakult az ATG kodontól 25 bázispárral fölfelé levő 5' nem-transzlatált területben elhelyezkedő G gyöknél; a pRIT10165-ben a BamHI hely a harmadik kodon második bázisánál helyezkedik el; és a pRIT10167-ben a BamHI hely az ATG kodon G gyökénél helyezkedik el.
A pRIT10167-ben így megalkotott TDH3 DNS HindiII-BamHI fragmentuma változatlan formában tartalmazza az összes olyan szekvenciát, amely szükséges a TDH3 promotor aktivitáshoz.
B példa. pRIT10172 vektor megalkotása.
A pRIT10167 1050 bp-s HindlII-BamHI TDH3 DNS beiktatást, • ·· · • · · · • ·
- 21 amelyet az A. példában leírtak szerint állítottunk elő, újra klónozzuk YEpl3 ingázó vektorba /amelyet Broach és munkatársai írtak le: Gene, 8_, 121 (1979)/ a vektor 2 mikronos DNS részében levő HindlII hely és a BamHI hely közé, hogy megkapjuk a pRIT 12159 rekombináns plazmidot. A pRIT12159 DNS-t azután Xbal és BamHI endonukleázokkal emésztjük és az így létrejött 1650 bp-s fragmentumot ligáljuk az ARG3 promotort tartalmazó hasonló Xbal-BamHI fragmentum helyébe a pRIT10774-en. A pRIT10774 plazmidot az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: Cabezon és munkatársai: 575,122 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentés/ bejelentve 1984. január 30-án; ez a plazmid tartalmazza az YEpl3 replikont, amelyből a természetes vektor BamHI és Xhol helyei in vitro manipulációval ki lettek iktatva, valamint egy 1470 bp-s HindlII-BamHI beiktatást, amely az ARG3 promotor területet tartalmazza, és egy 1150 bp-s BamHI-HindlII fragmentumot, amely az ARG3 átírás terminációs területet tartalmazza.
Az ARG3 promotor beiktatás helyettesítése TDH3 promotorral a pRIT10774-ben alakítja ki a pRIT10172 plazmidot, amely ennek megfelelően egy egyedi BamHI helyet tartalmaz a TDH3 promotor beiktatás ATG kodonjánál elhelyezve, és az 1150 Ορε BamHI-HindlII ARG3 DNS fragmentumon levő, átírásbefejezésre szolgáló funkcionális szignált megelőzve. Az idegen gént ennél fogva ennél a helynél lehet klónozni. Ezen kívül a két DNS beiktatás HindlII helyekkel van kötve, amely lehetővé teszi a kifejező egység modul (kazetta) eltávolítását 2200 bp-s HindlII fragmentumként más vektorokba való beiktatáshoz. A 2. ábra a pRIT10172 ···· ·· • · · · ·· • · • · · · · · · • · ···· ··· · ♦ · · · · · · ·· ·· ··· ·· ···«
- 22 restrikciós endonukleázos térképe.
I. PÉLDA
A FELTÉTELEZETT SZIGNÁL SZEKVENCIÁJA NÉLKÜLI P.FALCIPARUM CIRKUMSPOROZOITA FEHÉRJE KÚDOLÚ SZEKVENCIA KIFEJEZŐDÉSE ÉLESZTŐBEN
A. pRIT12570 és pRIT12569 plazmidok megalkotása
A WR201 plazmidot a Walter Reed Army Institute of Researchtól kapjuk, ez a ^mPfl-ből származó 2,3 kilobázisos (kb) EcoRI fragmentum beiktatásának /lásd Dame és munkatársai: Science 225 , 593-599 (1984)/ eredménye pUC8 vektorba, a fenti fragmentum tartalmazza a teljes Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérje gént. Az 1A. ábra mutatja aiXmPfl klón vázlatos restrikciós térképét és szekvenciaelemzési statisztikáját. Az ábrában bemutatott restrikciós enzimes hasítási helyek pozícióit a szekvenciából határozzuk meg és emésztéssel igazoljuk az alábbi enzimekkel: A, Avall; Ac, AccI; B, BstnI; D, Dral; Dd, Ddel; F, Foki; N, Ndel; R, Rsaí; S, Stul; T, TthlII, Tq, Taql; X, XhoII. Nyilak jelzik a meghatározott szekvenciák origóját, irányát és kiterjedését. A CS fehérje kódoló területet vastag vonal mutatja.
A 2A. ábra a P.falciparumból származó CS fehérje gén szekvenciáját mutatja be. A CS fehérje gén nukleotid szekvenciáját ^mPfl-ben mutatjuk be. A pUC8-at Vieira és munkatársai mutatják be /Gene, 19 , 259 (1982)/. A pUC8 vektor kereskedelmi forgalomban kapható az Amershamtól ···· · · ···· ·· · · • · · · · · · • · ···· ··· · • · · · · · · · • · ·· ··· ·· · · · ·
- 23 (Buckenghamshire, Egyesült Királyság) és a Pharmaciától (Piscataway, New Yersey, USA, és Uppsala, Svédország). A WR201 plazmid egy 1215 bázispáros (bp) Stul-Rsal fragmentumát, amely a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvenciát tartalmazza a CS fehérje kódoló szekvencia első 52 bp-ja nélkül, elektroelucióval tisztítjuk 7,5%-os poliakrilamid elektroforézis gélről. Az Stul restrikciós endonukleáz a CS fehérje gént aszekvencia 18. kodonjánál hasítja. Mivel a CS fehérje első 16 aminosavának szekvenciája jellemző egy hasított szignál peptidre /Dame és munkatársai: Science, 225, 593-599 (1984)/, ezek az aminosavak vélhetően nincsenek jelen a sporozoitában lévő érett CS fehérjéken.
így a WR201 plazmid 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumának kódolnia kell a szekvenciából előre várt érett CS fehérje egészét az első két aminosav kivételével. Ezt a tompa végű Stul-Rsal fragmentumot fuzionáljuk, fázisban, a pRIT10172 élesztő kifejező vektor DNS polimerázzal helyreállított BamHI helyével szomszédos transzlációs iniciációs kodonhoz, amelyet úgy készítünk, ahogyan a 8. példában leírjuk (a betöltött BamHI hely ligálása az Stul helyhez átalakítja a
BamHI helyet). A pRIT10172 plazmid
DNS-ét BamHI endonukleázzal emésztjük, E.coli DNS (Klenow-fragmentum) kezeljük, fenollal polimerázl-gyel extraháljuk és etanolos kicsapással kinyerjük* 0,4ui<g-ot ebből a DNS-ből összekeverünk 0,2^g, fentebb leírt, WR201-ből származó 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentummal, kezeljük T4 DNS ligázzal, és a ligálási keveréket alkalmazzuk E.coli K12 MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ahol a sejteket ·· • · · · · · · • · ······· · ···· ···· ·· ·· ··· · · ····
- 24 Cohen és munkatársai módszere szerint készítjük elő /Proc.Natl.Acad.Sci. USA 69., 2110 (1972)/. 1200 telepet vizsgálunk át telephibridizációs módszerrel /Grunstein és Hogness, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 72 , 3961 (1975)/ Whatman 541 szűrőkön, vizsgáló mintaként hézag (nick) transzlációval ^2p rádió-jelzett Stul-Rsal fragmentumot alkalmazva. A kiónok 20%-a pozitív jelet ad a vizsgáló mintával. A pozitív telepekből 28 plazmidot állítunk elő kisléptékű eljárással /Bimbóim és munkatársai: Nucleic Acids Research, 7_, 1513 (1979)/. A Stul-Rsal fragmentum orientációját BamHI és Sáli endonukleázokkal végzett kettős emésztéssel vizsgáljuk. A plazmidok közül 7 plazmid rendelkezik a korrekt orientációban lévő fragmentummal (az egyik az, amelyet pRIT12570-nek nevezünk, lásd a 2. ábrát) és 12 plazmid rendelkezik a rossz orientációban lévő fragmentummal (az egyik az, amelyet pRIT 12569-nek nevezünk, lásd a 2. ábrát). A 4. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT12570 készítését mutatja be.
A pRIT12570, pRIT12569 és pRIT10172 plazmidokat az alábbi élesztősejtekbe vezetjük be: Saccharomyces cerevisiae DC5 (leu2-3, leu2-112, his 3, can 1-11) és Saccharomyces cerevisiae 10S44C (leu2-3, leu2-112, pep4-3) (ezeket Crabeel M.-től kapjuk, Ceria Institute, Anderlecht, Belgium), a bevezetést lítium-acetáttal kezelt sejtek transzformálásával /Ito és munkatársai: J.Bacterial. 153, 163-168 (1983)/ és leucin függetlenségre végzett szelekcióval hajtjuk végre. Az ezzel a konstrukcióval várt fehérje az érett P.falciparum CS fehérje 394 ' aminosavát tartalmazza három aminosavhoz (MetAsp-Pro-) fuzionálva Nh^-terminálisánál, ezek a vektor (pRIT ·*·· ·· *··· ·· ·· • · · · » · · • · ···· ··· · ···· ···· ·· ·· ··· «· ····
- 25 10172) szekvenciájából cerevisiae 10S44C törzset Culture Collection-nál
Szerződés
18-án, ATCC DC5 törzset Collection-nál szabályaival
Budapesti augusztus cerevisiae Culture Szerződés számon.
származnak. A Saccharomyces deponáltuk az American Type (ATCC, Rockville, Maryland, USA) a szabályaival összhangban, 1986. 20819 letéti számon. A Saccharomyces is deponáltuk 1982. június összhangban, az American Type
2-án, a Budapesti
ATCC 20630 letéti
B. P.falciparum cirkumsporozoita fehérje szintézise élesztőben.
Saccharomyces pRIT12570, tartalmaznak, állítottunk tápközegben, hisztidin, vagy immunfolt-képzési Anal. Anal.
cerevisiae DC5 vagy 10S44C törzseket, amelyek pRIT12569 vagy pRIT10172 plazmidokat és amelyeket a korábbiakban leírtak szerint elő, külön-külön növesztünk folyékony amelyből hiányzik a leucin (YNB + 80 ^víg/ml YNB). A CS fehérje szekvenciákat fehérje technikával azonosítjuk /lásd Burnette: 195-203 (1981); Gershoni és Palade:
1-15 (1983); Towbin és Gordon: 3.
Biochem. 112,
Biochem. 131,
Immunoi. Methods 72 , 313-340 (1984)/, öt olyan monoklonális a.ntitest keverékét alkalmazva, amelyek CS fehérje ellen irányulnak /Dame xés munkatársai: Science, 225, 593 599 (1984)/. A fehérjék elektro-foltképzése után nitro^cellulóz szűrőn (Schleicher and Schüll, 0,45 ,/4) /Towbin és munkatársai: Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 76 , 4350-4354 (1979)/ a szűrőt előinkubáljuk egy órán át 37 °C hőmérsékleten 3% • · · · • · • · · · · · · • · ···· «·· · *«·« · · · · • · · · ··· · · ···· zselatinnal PBS-ben. Ezt követően a szűrőt ötször mossuk 5-5 percig 0,1% Tween 20-at (polioxietilén szorbitán monolaurát) tartalmazó PBS-sel ., és a lemezt egy órán át kezeljük szobahőmérsékleten öt monoklonális antitest keverékével, amelyek CS fehérje ellen irányulnak /Dame és munkatársai: Science, 225, 593-599 (1984)/, a keverék 1% zselatint tartalmazó PBS-ben van. A szűrőlemezeket ötször mossuk 5-5 percig 0,1% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel, és egy második biotinilezett birka anti-egér antitestet (Amersham) adunk hozzá 1% zselatint tartalmazó PBS-ben, és egy órán át tartjuk szobahőmérsékleten. A lemezeket ismét ötször mossuk
5-5 percig 0,1% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel, és 30 percen át inkubáljuk szobahőmérsékleten sztreptavidin-biotinilezett torma-peroxidáz (HRP) komplex-szel. A lemezeket ismét mossuk háromszor 5-5 percig 0,1% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel, és végül 30 (,<1 H202~vel és HRP Color Development reagenssel /amely 4-klór-l-naftolt tartalmaz (BioRad)z 30 mg 10 ml metanolban/ 50 ml PBS-ben inkubáljuk. Az antigének molekulatömegét az alábbi előfestett fehérje markerekből becsüljük meg: ovalbumin, alfa-kimotripszinogén, bétalaktoglobin, lizozim, citokróm-c XBRL).
A pRIT12570-et tartalmazó sejtekből származó fehérjékre fajlagos immunreakció olyan fehérje-fajtát mutat, amelynek molekulatömege a 30000 és 50000 dalton közti tartományban van. Ez azt /mutatja, hogy az élesztő által kifejezett, P.falciparum CS-sel rokon termék heterogén. Ezekből a heterogén anyagokból többet találunk a 10S44C-vel transzformált sejtekből származó fehérjék között, mint a DC5-tel transzformált sejtekből származó fehérjék között.
»··· ·· ···« ·· • · · · · • · ···· ··· • · · · · · · ·· · · ··· ·· • ·· ·
- 27 II. PÉLDA
Antitest-válasz - ELISA; P.falciparum CS fehérjét termelő élesztők elleni antiszérumok CS reaktivitása; Hepatocita blokkolás
A jelen találmány módszere szerint élesztővel készített
P.falciparum CS polipeptidet immunogenicitása alapján értékelhetjük azzal a módszerrel, amelyet Ballou és munkatársai körvonalaztak (699,116 bejelentési számú amerikai egyesült teljes leírását bejelentésbe).
államokbeli szabadalmi bejelentés; ennek referenciaként építjük be a jelen
III. PÉLDA
Élesztő által kifejezett P.falciparum CS fehérjét tartalmazó vakcina
Egy, a jelen találmány bemutatását szolgáló vakcinát állíthatunk elő a következőképpen: 3%-os aluminium-hidroxid pufferolt, vizes oldatához (10 mmól/1 nátrium-foszfát, 150 mmól/1 NaCl, pH6,8, szűréssel sterilizálva) a jelen találmány szerinti élesztő eredetű P.falciparum CS polipeptidet hozzáadjuk hasonló pufferban keverés közben, lOO^g/ml polipeptid .és 0,5 mg/ml alumínium (Al^ + ) végső koncentrációig. A pH-t 6,8 értéken tartjuk fenn. A keveréket egy éjszakán 0 °C hőmérsékleten tartjuk. Timerozált adunk hozzá 0,0005% végső koncentrációig. A pH-t ellenőrizzük, és ha szükséges, 6,8 értékre beállítjuk.
···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ···· ··· · «··· ···· ·· ·· ··· ·· ····
IV. PÉLDA
Vektorok megalkotása a P. falciparum CS fehérje tetrapeptid ismétlődés____terület immunogén részek kifejeződéséhez élesztőben
A. pRIT12290 megalkotása
A pRIT10167-ből származó, 1050 bp-s HindiII-EcoRI fragmentumot (I.ábra), amelyet az A példában leírtak szerint készítünk el, és amely tartalmazza a HindlII-BamHI TDH3 promotor fragmentumot a pUC9 polilinker BamHI-Smal-EcoRI részével együtt, újra klónozzuk egy pBR322 származék plazmid HindlII és EcoRI helyei között, ahol plazmidból előzőleg kiiktattuk a BamHI helyet T4 DNS polimerázzal végzett betöltéssel és újra ligálással. Az így létrejött rekombináns plazmidot pRIT12176-nak nevezzük.
A pRIT10158 plazmid DNS-t (I.ábra), amelyet az alábbi V. példában leírtak szerint állítunk elő, EcoRI endonukleázzal emésztjük, és T4 DNS polimerázzal kezeljük, hogy betöltsük az EcoRI egyedi szál túlnyúlásokat. Ezt a készítményt tovább emésztjük Clal endonukleázzal. A pRIT10158 DNS további mintáját Clal és HaelII endonukleázokkal emésztjük, és egy 1150 bp-s Clal-HaelII fragmentumot nyerünk ki preparatív gélelektroforézissel ég elektroelucióval, ez a fragmentum hordozza az ARG3 gén transzkripciós terminációs kodonját. Ezt a fragmentumot ligáljuk EcoRI-gyel, T4 DNS polimerázzal és Clal-gyel kezelt pRIT10158 DNS-sel, és a ligálási keveréket alkalmazzuk E.coli MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ahol sejteket Cohen és ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · » • · · ··· ··· · ···· · · · · ·« ·· 999 99 9999
- 29 munkatársai (fentebb idézett munka) szerint készítjük elő; a szelekciót ampicillin rezisztenciára végezzük. A transzformált telepekből egy pRIT10162-nek nevezett plazmidot izolálunk, amelyben a Clal-HaelII ARG3 átírás terminációs fragmentum van beiktatva a pRIT10158-ban a Clal és a betöltött EcoRI helyek közé, ,és amelyben az EcoRI hely újra ki van alakítva. Az 1. ábra olyan folyamatábra, amely bemutatja a pRIT10162 előállítását. A pRIT10162 plazmid DNSt EcoRI és PstI endonukleázokkal emésztjük, összekeverjük a fentiekben leírtak szerint előállított (és szintén EcoRI és PstI endonukleázokkal emésztett) pRIT12176 plazmid DNS-sel, és a keveréket ligáljuk, majd E.coli K12 MM294 törzs transzformálására használjuk fel, ampicillin rezisztenciát alkalmazva, Cohen és munkatársai korábban idézett módszerei szerint. Egy plazmidot, a pRIT12208-at nyerjük ki ennek a transzformációnak egy telepéből, amelyben a pRIT12176-ból származó nagy, 4630 bp-s EcoRI-PstI fragmentum ligáivá van a pRIT10162-ből származó kis, 1930 bp-s EcoRI-PstI fragmentumhoz, és amelyben az ARG3 átírás terminális terület most a TDH3 promotor mellett helyezkedik el. Az ARG3 és TDH3 DNS területeket ki lehet metszeni a pRIT12208-ból egyedi 2200 bp-s fragmentumként HindlII endonukleázzal végzett emésztéssel. Abból a célból, hogy ennek a fragmentumnak a másik orientációját kapjuk meg a vektor szekvenciák szempontjából, a pRIT12208-ból származó 2200 bp-s HindlII fragmentumot újra klónozzuk egy pBR322 származék plazmid HindlII helyébe, amely plazmidban a természetes EcoRI és BamHl helyek ki lettek iktatva T4 DNS polimerázzal végzett betöltéssel és újra ligálással. Az így létrejött plazmidot, amelyben a 2200 bp-s HindlII fragmentum az ellenkező • ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · ♦ · · ··· · • t · · · · · ♦ • · ·· ··· ·· · · · · orientációban van beiktatva a vektor szekvenciák szempontjából a pRIT12208-hoz hasonlítva, pRIT12290-nek nevezzük. A 3. ábra a pRIT12290 restrikciós endonukleázos hasítási térképe. Mind a p.RIT12208, mind a pRIT12290 vektorokban terminációs a TDH3 promotor fragmentum és az ARG3 átírásfragmentum egyedi , BamHI, Smal és EcoRI restrikciós helyekkel van elkülönítve, amely helyek alkalmasak kódoló szekvenciákat hordozó DNS fragmentumok klónozására; a promotor és átírás-terminációs területeket egy 2200 bp-s HindlII fragmentummal együtt ki lehet metszeni modul-ként vagy kazetta-ként más vektorokba való átvitelhez.
A BamHI hely különösen hasznos, mivel ez a TDH3 gén ATG kodonjánál helyezkedik el és így lehet alkalmazni más gének fúziójához a TDH3 promotorhoz abból a célból, hogy ezek élesztőben kifejeződjenek, amint alább példákkal is bemutatjuk. Az ilyen fúziós termékeket pRIT12208 vagy pRIT12290 származékokból lehet kinyerni kazetták vagy modulok formájában HindlII endonukleázzal végzett emésztéssel vagy más olyan restrikciós enzimek hasításával, amelyek hasítanak a szegélyező restrikciós helyeken.
B. Szintetikus kapcsolót (linkért) tartalmazó plazmid megalkotása P. falciparum CS fehérje tetrapeptid ismétlődő terület egy részének bevezetésével
A pRIT12290 plazmidot, amelyet a fenti A részben leírtak szerint állítottunk elő, emésztjük BamHI és EcoRI endonukleázokkal és összekeverjük egy szintetikus DNS • · • ·
fragmentummal, amelynek összetétele az alábbi:
5' GATCCTTAAG 3'
GAATTCTTA
A fragmentumok keverékét összeforrasztjuk és T4 DNS ligázzal ligáljuk, és E.coli MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására alkalmazzuk, ampicillin-rezisztenciát alkalmazva, hagyományos technikák szerint. Egyedi telepekből készített plazmidokat vizsgálunk egyedi EcoRI és BamHI endonukleáz restrikciós helyek jelenléte és egy Smal hely távollétére, amely eredetileg jelen van az eredeti pRIT1229O vektorban, de nincs jelen a kívánt rekombinánsban. A kiválasztott plazmid korrekt voltát DNS szekvenciaelemzéssel igazolhatjuk. A szintetikus DNS fragmentum beiktatása helyreállít egy BamHI helyet a TDH3 ATG kodont követően és egy stop kodont (TAA) szolgáltat az ATG kodonnal fázisban. Egy ilyen plazmid megalkotásának az a célja, hogy megfelelő vektort alkossunk meg a P.falciparum CS fehérje tetrapeptid ismétlődő egység terület 192 bázispáros részének fúziójához a TDH3 promotor területhez és egy stop kodont szolgáltassunk közvetlenül 3' felé egy ilyen kódoló területtől.
C. A P.falciparum CS fehérje tetrapeptid ismétlődő terület 192 bázispáros részét tartalmazó plazmid megalkotása
A WR201 plazmid 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumát, amelyet az
I. példában leírtak szerint tisztítottunk, és amely tartalmazza a CS fehérje kódoló szekvenciát az első 52 bp
nélkül, emésztjük Sau3A-val, hogy olyan kisebb fragmentumokat alakítsunk ki, amelyek magukban foglalnak, többek között, egy olyan 192 bp-s Sau3A fragmentumot, amely a CS fehérje 16 tetrapeptides ismétlődéseit kódolja . A fenti B rész szerinti módosított pRIT12290 vektor BamHI helye, amely az ATG iniciációs kodonnál helyezkedik el, fázisban van a P.falciparum CS fehérje ismétlődő epitópjának Sau3A helyével.
Ennek a plazmidnak a DNS-ét BamHI endonukleázzal emésztjük, fenollal extraháljuk és etanolos kicsapással kinyerjük. Ebből a DNS-ből 0,2,/vg-ot összekeverünk a fentebb leírtak szerint készített Stul-Rsal fragmentum Sau3A emésztményének
0,1-0,2 M_g-jával, kezeljük T4 u keveréket alkalmazzuk E.coli
DNS ligázzal és a ligálási
MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ampicillin rezisztenciát hasznosítva, hagyományos technikák szerint. Az egyes transzformánsokból plazmidokat készítünk és elemezzük 7,5V os akrilamid-gélen BamHI és EcoRI endonukleázokkal végzett kettős emésztés után, és összehasonlítjuk a szülő vektorral, az Stul-Rsal CS gén fragmentum Sau3A emésztményével és megfelelő molekulatömegű markerekkel, pl. Xxl74 DNS HaelII emésztményével.
A 200 bp-s BamHI-EcoRI beiktatott fragmentumot tartalmazó plazmidok megfelelnek a 192 bp-s Sau3A fragmentum beiktatásának a kívánt orientációban a CS kódoló szekvencia fúziójához az ATG iniciációs kodonhoz. A 192 bp-s Sau3A fragmentum beiktatása a kívánt orientációban helyreállítja a BamHI helyet az ATG kodonnál.
• · · ·
- 33 Ezen kívül egy ilyen plazmid emésztése Sau3A-val felszabadít egy ugyanolyan méretű, 192 bp-s fragmentumot, mint amelyet a Stul-Rsa fragmentum emésztéséből kapunk, amely tartalmazza a CS fehérje ismétlődő epitopot. Ez a konstrukció tartalmaz egy 67 aminosavas nyitott leolvasó keretet, amely a TDH3 promotor határvonalánál lévő ATG kodonnál indul, és a CS ismétlődő epitop beiktatásán keresztül a bevezetett szintetikus DNS fragmentumban lévő TAA kodonig terjed, amely közvetlenül 3' felé van a Sau3A helytől és 5' felé van az EcoRI helytől. A konstrukció korrekt voltát DNS szekvenciaelemzéssel lehet igazolni, és a plazmid emésztése HindlII endonukleázzal egy 2390 bp-s HindlII fragmentumot szabadít fel, amely tartalmazza a TDH3 promotort, a CS ismétlődő epitópot és az ARG3 terminációs területet. Ezt a HindlII fragmentumot lehet újra klónozni bármilyen alkalmas élesztő vektorral, pl. YEpl3-mal, és be lehet vezetni élesztőbe hagyományos technikák szerint.
A plazmidot emészthetjük BamHI endonukleázzal és összekeverhetjük és ligálhatjuk ismét a Stul-Rsal CS ismétlődő epitóp fragmentum Sau3A emésztményével, hogy bevezessük az epitóp egy olyan sorba kapcsolt (tandem) kópiáját, amely fázisban van az első kópiával, és mint korábban, helyreállít egy BamHI helyet az ATG kodonnál, feltéve, hogy a beiktatás orientációja korrekt. Ezt a folyamatot lehet ismételni, hogy felépítsük a 192 bp-s epitóp fragmentum ismétlődéseinek olyan sorozatát, amely két, három, négy, stb. egymást követő (tandem) kópiát tartalmaz. Ez a folyamat növeli a nyitott leolvasó keret hosszát, és fokozatosan nagyobb fehérjéket eredményez, • · ···· ··· · ··*· ♦ · · · • · · · ··· ·» ····
- 34 amelyek 131, 195, és 259 aminosavat tartalmaznak.
Ezeknek a konstrukcióknak az emésztése HindlII endonukleázzal fokozatosan nagyobb fragmentumokat szabadít fel, amelyek a kifejező kazettákat tartalmazzák, amelyeket újra lehet klónozni megfelelő élesztő vektorokba transzformáláshoz és élesztőbe való bevezetéshez ismert módszerekkel, pl. olyanokkal, amelyeket az I. példában leírtunk.
V. PÉLDA
PRIT1O158 plazmid megalkotása
A pMC2300 plazmidból (amely korlátozás nélkül rendelkezésre áll az American Type Culture Collection-nál, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, ATCC 39131 letéti számon) kapott 3300 bp-s HindlII fragmentumot, amelyet Crabeel M. és munkatársai írnak le /EMBO 3. 2_, 205-212 (1983)/, újra klónozzuk egy pBR322 származék plazmidba, amelyből előzőleg a természetes EcoRI hely ki lett iktatva T4 DNS polimerázzal végzett betöltéssel és újra ligálással. Az így létrejött rekombináns plazmidot, a pRIT10158-at (I.ábra) kiválasztjuk, amelyben a HindlII ARG3 gén beiktatás az ARG3 gén 3' területével rendelkezik a Clal hely közvetlen közelében a módosított pBR322 vektorban. Az 5. ábra a pMC200 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
Bár a fentiekben teljes mértékben leírtuk a találmányt és összes előnyös kiviteli módját, fel kell hívnunk a figyelmet, hogy a találmány nem korlátozódik kizárólag az itt leírt példákra, hanem magában foglal minden olyan módosítást is, amelyek belül vannak az ezután következő igénypontok oltalmi körén.
Claims (41)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Rekombináns DNS vektor, amely egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy kifejezés szabályozó szekvenciához, azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéjét kódoló szekvenciáját tartalmazza.
- 2. Az 1. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy tartalmaz még egy replikont is, amely működőképes élesztőben.
- 3. Az 1. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy a kifejezés szabályozó szekvencia az élesztő gliceraldehid-3Pdehidrogenáz (TDH3) promotort tartalmazza.
- 4. A 3. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy a kifejezés szabályozó szekvencia tartalmazza még az ARG3 átírás terminációs területét is.
- 5. A 4. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy a WR201-nek 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumát tartalmazza, amelyben benne van a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvencia, mintegy 50 első bp-ja nélkül.
- 6. Az 5. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy ez a pRIT1257O vektor.
- 7. A 4. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy- tartalmazza a P.falciparum CS fehérje 16 tetrapeptides is···· · · ···· ·· · · • · · · · · · • · ···· ··· · ···« ···· • « · · ··· · · · · · ·- 37 métlődéseit kódoló 192 bp-s Sau3A fragmentumot, amely aWR201 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumának Sau3A emésztéséből származik, ahol a nevezett Stul-Rsal fragmentum tartalmazza a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvenciát, mintegy 50 első bp-ja nélkül,- vagy tartalmazza az ilyen 192 bp-s Sau3A fragmentum két, három, négy, vagy több egymás melletti kópiáját.
- 8. Élesztő gazdasejt rekombináns DNS vektorral transzformálva, ahol az említett vektor egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy kifejezés szabályozó szekvenciához, azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéjének kódoló szekvenciáját tartalmazza.
- 9. A 8. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a vektor tartalmaz még egy replikont is, amely működőképes élesztőben.
- 10. A 8. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a kifejezés szabályozó szekvencia az élesztő gliceraldehid-3P-dehidrogenáz (TDH3) promotort tartalmazza.
- 11. A 10. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a kifejezés szabályozó szekvencia tartalmazza még az ARG3 átírás terminációs területét is.
- 12. A 11. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a vektor tartalmazza a WR201-nek 1215 bp-s- 38 Stul-Rsal fragmentumát, amelyben benne van a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvencia, mintegy 50 első bp-ja nélkül.
- 13. A 12. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a vektor a pRIT12570 vektor.
- 14. A 11. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a vektor- tartalmazza a P.falciparum CS fehérje 16 tetrapeptides ismétlődéseit kódoló 192 bp Sau3A fragmentumot, amely a WR201 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumának Sau3A emésztéséből származik, ahol a nevezett Stul-Rsal fragmentum tartalmazza a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvenciát mintegy 50 első bp-ja nélkül,- vagy tartalmazza az ilyen 192 bp-s Sau3A fragmentum két, három, vagy négy, vagy több egymás melletti kópiáját.
- 15. A 8. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a Saccharomyces nemzetségbe tartozik.
- 16. A 15. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a S.cerevisiae fajhoz tartozik.
- 17. A 16. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy ez a S.cerevisiae DC5 vagy 10S44C törzs.
- 18. Eljárás rekombináns DNS vektorral transzformált élesztő gazdaszervezet előállítására, ahol az említett vektor egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy • · • ·· ···· ·· • · · · · • · ··· ··· • · · · · • · · · · ♦ ·- 39 kifejezés szabályozó szekvenciához, azzal jellemezve, hogy DNS fehérjéjét szekvencia a Plasmodium kódoló szekvenciáját tartalmazza
- 19. A 18. a vektor élesztőben igénypont tartalmaz falciparum szerinti eljárás azzal még egy replikont is, acirkumsporozoita jellemezve, hogy amely működőképes szerinti eljárás azzal a kifejezés szabályozó szekvencia az élesztő gliceraldehid3P-dehidrogenáz (TDH32) promotort tartalmazza.
- 20.A 18.igénypont jellemezve, hogy
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, a kifejezés szabályozó szekvencia tartalmazza még az átírás szabályozó terminációs területét hogyARG321.
- 22. A a vektor tartalmazza, kódoló igénypont szerinti a1215 benne szekvencia, mintegy 5Q22.
- 23. A a vektor aWR201-nek amelyben igénypont pRIT12570 szerinti vektor.igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, bp-s Stul-Rsal fragmentumát van a P.falciparum CS fehérje első bp-ja nélkül.hogy eljárás azzal jellemezve, hogy
- 24. A 21.a vektor- tartalmazza a P.falciparum CS fehérje 16 tetrapeptides ismétlődéseit kódoló 192 bp-s Sau3A fragmentumot, amely a WR201 1215 bp-s emésztéséből származik, eljárás azzal jellemezve, hogyStul-Rsal fragmentumának Sau3A ahol a nevezett Stul-Rsal fragmentum *··· ·· ···· ·· ·· • · · · · · * • · ···· · ·♦ · ···· *··· • « ·· ··· 9· · · · ·- 40 tartalmazza a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvenciát mintegy 50 első bp-ja nélkül,- vagy tartalmazza az ilyen 192 bp-s Sau3A fragmentum két, három, négy, vagy több egymás melletti kópiáját.
- 25. A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a Saccharomyces nemzetséghez tartozik.
- 26. A 25. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a S.cerevisiae fajhoz tartozik.
- 27. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet S.cerevisiae DC5 vagy 10S44C.
- 28. Eljárás Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéjének előállítására, amely eljárás magában foglalja egy rekombináns DNS vektorral transzformált élesztő gazdasejt tenyésztését megfelelő tenyésztő tápközegben és az ilyen fehérje kinyerését egy ilyen gazdaszervezet tenyészetének lizátumából, ahol az említett vektor egy DNS szekvenciát tartalmaz operatívan hozzákapcsolva egy kifejezés szabályozó szekvenciához, azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéjét kódoló szekvenciáját tartalmazza.
- 29. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vektor tartalmaz még egy replikont is, amely működőképes élesztőben.• ·
- 30. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kifejezés szabályozó szekvencia az élesztő gliceraldehid3P-dehidrogenáz (TDH3) promotort tartalmazza.
- 31. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kifejezés szabályozó szekvencia tartalmazza még az ARG3 átírás-terminációs területét is.
- 32. A 31. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vektor tartalmazza a WR201-nek 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumát, amelyben benne van a P.falciparum CS fehérjekódoló szekvencia, mintegy 50 első bp-ja nélkül.
- 33. A 32. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vektor a pRIT12750 vektor.
- 34. A 32. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vektor tartalmaz egy 192 bp-s Sau3A fragmentumot, amely a P.falciparum CS fehérje 16 tetrapeptid ismétlődését kódolja, ahol a fenti fragmentum a WR201 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumának Sau3A emésztéséből származik, amely Stul-Rsal fragmentum tartalmazza a P.falciparum CS fehérje kódoló szekvenciáját az első mintegy 50 bp-ja nélkül.
- 35. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a Saccharomyces nemzetségbe tartozik.
- 36. A 35. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a S.cerevisiae fajba tartozik.* « • · ·
- 37. A 36. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy * a gazdaszervezet S.cerevisiae DC5 vagy 10S44C törzs.«
- 38. Fehérje azzal jellemezve, hogy a 26-33. igénypontok bármelyike szerint állítjuk elő.
- 39. Vakcina azzal jellemezve, hogy a 38. igénypont szerinti fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazza.
- 40. A 39. igénypont szerinti vakcina azzal jellemezve, hogy 1-lOOOjfg fehérjét tartalmaz.
- 41. A 40. igénypont szerinti fehérje azzal jellemezve, hogy 10-200(/4.9 fehérjét tartalmaz.KÖZZÉTÉTELIPÉLDÁNY pUC9-en klonozott TDH 3 • · ·· promotor fragmentum.BamHI hely az ATG (ATGGATCC)-nélACC I .BamH l ,CU IE....EcoR IIIIΗρ,.Ηρ» IS..X...xn,Restrikciós enzimek jelei A.a c ve-ktor szekvenciák klónozott fragmentumok pMC200-ból származó , 3300bp-s ARG 3 gén fragmentum üjraklónozása olyan pBR322-ben, amelyből az EcoRI hely ki van iktatva.Sál I Xba I xno I pRIT10158B1Π1150 bp-s Clal-Hae fragmentum klónozása EcoR l-gyel, T4 DNS polimerázzal és Clal-gyel kezelt plazmidon
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US879187A | 1987-01-30 | 1987-01-30 | |
| PCT/BE1988/000002 WO1988005817A1 (en) | 1987-01-30 | 1988-01-25 | Expression of the p. falciparum circumsporozoite protein by yeast |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT51332A true HUT51332A (en) | 1990-04-28 |
Family
ID=21733689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU885096A HUT51332A (en) | 1987-01-30 | 1988-01-25 | Process for expressing p.falciparum cirkumsporozoita protein by yeast |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0278941A1 (hu) |
| KR (1) | KR890700661A (hu) |
| AU (1) | AU1092588A (hu) |
| DK (1) | DK36988A (hu) |
| FI (1) | FI884485A0 (hu) |
| HU (1) | HUT51332A (hu) |
| PT (1) | PT86639A (hu) |
| WO (1) | WO1988005817A1 (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU625713B2 (en) * | 1988-02-19 | 1992-07-16 | Microgenesys, Inc. | Method for producing recombinant protein derived from the circumsporozoite gene of plasmodium falciparum |
| WO1990007006A1 (en) * | 1988-12-21 | 1990-06-28 | Smithkline Biologicals | Expression of the plasmodium circumsporozoite protein in insect cells |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| CA2037151A1 (en) * | 1990-03-23 | 1991-09-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Plasmodium sporozoite antigen |
| US5736358A (en) * | 1991-05-17 | 1998-04-07 | Rmf Dictagene S.A. | Dictyostelid expression vector and method for expressing a desired protein |
| NL9100869A (nl) * | 1991-05-17 | 1992-12-16 | Univ Lausanne | Dictyostelide expressievector en werkwijze voor het tot expressie brengen van een gewenst eiwit. |
| GB9724531D0 (en) | 1997-11-19 | 1998-01-21 | Smithkline Biolog | Novel compounds |
| WO2005063805A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-14 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antibodies against the amino terminus region of circumsporozoite protein prevent the onset of malaria infection |
| US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA8410063B (en) * | 1984-01-30 | 1985-10-30 | Smith Kline Rit | Expression of human alpha-1-antitrypsin in yeast |
| EP0175261B1 (en) * | 1984-09-12 | 1991-12-11 | Chiron Corporation | Hybrid particle immunogens |
| NZ215023A (en) * | 1985-02-07 | 1989-07-27 | Smithkline Beckman Corp | Vaccine against plasmodium falciparum and antigenic peptides |
-
1988
- 1988-01-25 WO PCT/BE1988/000002 patent/WO1988005817A1/en active Application Filing
- 1988-01-25 EP EP88870009A patent/EP0278941A1/en not_active Withdrawn
- 1988-01-25 HU HU885096A patent/HUT51332A/hu unknown
- 1988-01-26 DK DK036988A patent/DK36988A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-01-27 PT PT86639A patent/PT86639A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-01-28 AU AU10925/88A patent/AU1092588A/en not_active Abandoned
- 1988-09-28 KR KR1019880701185A patent/KR890700661A/ko not_active Application Discontinuation
- 1988-09-29 FI FI884485A patent/FI884485A0/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR890700661A (ko) | 1989-04-26 |
| DK36988A (da) | 1988-07-31 |
| WO1988005817A1 (en) | 1988-08-11 |
| FI884485A (fi) | 1988-09-29 |
| AU1092588A (en) | 1988-08-04 |
| EP0278941A1 (en) | 1988-08-17 |
| FI884485A0 (fi) | 1988-09-29 |
| DK36988D0 (da) | 1988-01-26 |
| PT86639A (pt) | 1989-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5112749A (en) | Vaccines for the malaria circumsporozoite protein | |
| AU653387B2 (en) | Antigen-presenting chimaeric protein | |
| EP0267204B1 (en) | Immunopotentiation | |
| Sugiyama et al. | Production of recombinant SERA proteins of Plasmodium falciparum in Escherichia coli by using synthetic genes | |
| US5403581A (en) | Coccidiosis vaccines | |
| HUT51332A (en) | Process for expressing p.falciparum cirkumsporozoita protein by yeast | |
| JP3023997B2 (ja) | 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原 | |
| EP0223711B1 (en) | Protective synthetic peptide against malaria and encoding gene | |
| EP0357208A1 (en) | Salmonella transformant capable of expression of heterologous genes and useful as a recombinant vaccine | |
| EP1357128B1 (en) | The preparation and usage of plasmodium fusion antigen | |
| IE904412A1 (en) | Malaria vaccine | |
| US5395614A (en) | Protective Plasmodium falciparum hybrid proteins which contain part-sequences of the malaria antigens HRPII and SERP, the preparation and use thereof | |
| EP0474891A1 (en) | Vectors for expression of malarial antigens on the surface of Salmonella vaccine strains | |
| AU635737B2 (en) | Malaria vaccine | |
| EP0250261A1 (en) | Vaccines containing epitopes of both the CSP and a blood stage antigen of a plasmodium parasite | |
| AU619443B2 (en) | Immunopotentiation | |
| US5976839A (en) | Immunopotentiation through covalent linkage between immunogen and immunopotentiating molecules | |
| JPS63283586A (ja) | 酵母によるピー・ファルシパルム・サーカムスポロゾイトタンパク質の発現 | |
| AU617402B2 (en) | Vaccines for malaria | |
| NO884304L (no) | Ekspresjon av plasmodium falciparum circumsporozoitt-protein hos gjaer. | |
| Sandhu et al. | Expression of the merozoite surface protein gp195 in vaccinia virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC9 | Refusal of application |