HU229967B1 - Eljárás töredezett nukleinsavak szekvenciájának meghatározására - Google Patents

Description

Eljárás töredezett nukleinsswk szekvenciájának meghatározására

A találmány területe

A jelen találmány a molekuláris diagnosztikai területére tartók találmány szekvenáló eljárásokra vonatkozik, amely károsodott degradált) nukieinsavák nukteofíd-sorrendjének hatékony és sát teszik tehetővé, elsősorban biológiai mintákban. A találmány fásokban alkalmazott spacer-molekulákra és az eljárások kiviteles reagens-készletekre is vonatkozik.

néniéit vagy ó azonosítási a fenti eljá-

ti információi hordozó nukielnsavak, a DNS- és RNS-molekuták nukleotld-sorrendjének, szekvenciájának meghatározására sok esetben olyan biológiai minták állnak csak rendelkezésre, melyekben ezek a nukleínsavak összetöredeztek, Leggyakoribb példák erre a diagnosztikai célra eltávolítod daganatos szövetminták, melyeket formaiinnal fixáinak és paraffinba ágyazva tárolnak. Köztudott, hogy már a minták rögzítésekor és a tárolás során Is elkerülhetetlen a mintában lévő nukielnsavak fragmentálódása (széttöredezése). Egyre gyakrabban szükség van az ilyen mintákból kinyert nukielnsavak egyes célzott szakaszai szekvenciájának a meghatározására. Azonban, egy későbbi időpontban történő analízis során ezeknek a niíkielnsavaknak a kimutatása kisméretűknél és mennyiségüknél fogva problémát jelent, A nukleinsav-szekvencia meghatározásának legspecifikusabb módszere a oélszekveneia PCR-raf történő amplifikáiását követő, két irányból történő didezoxiszekvenálás (Sanger-féle didezoxi-szekvenálás vagy lánelermmácíós eljárás).

A molekuláris diagnosztika területén az utóbbi években bekövetkezett robbanásszerű fejlődés azonban inkább a didezoxl-szekvenálástól elférő nuklemsavszekvencia vizsgáló módszerek, igy például a „high resolutlon melting analízis _s; „nexf generálion seguencing” (NGS) technológia, a real-time PCR (RT-PCR) alapú módszerek fejlesztésére fókuszál (lásd pl, Borras E. ef al/, BMC Cancer, 2011 Sep 24, 11:406: Solassol d. etal: int. J. Mot, Sót '2011,12(5):3191-3204: Knapp lüt et al.: Genes, 2010. 1(2):227-243).

...... 'ésl ifejtík a regi a Cikket ságának és érzékenységének a problémáját, de nem ajánlanak megoldást ezeknek a klküszöbőléséFe. Az egyetlen széles körben használt fejlesztés az Ml3 szekvenáló primer kötőhely beépítése a céiszekvenciába egy olyan ampliflkáló primerrel, amelyen túlnyúló („overhang”) szekvencia formájában rajta van az Ml3 primer is (Querings S. ef ah: PLoS One. 2011 May 5; 6(5):el 9601 s. Ez a fejlesztés azonban nern javítja a hatékonyságot és az érzékenységet, csak gazdaságosabbá teszi a szekvenálást. mert nem szükséges minden egyes célszekvenciáboz külön-kölőn szekvenáló púmért beszerezni és a szekvenálásl reakciót külőn-külőn optimalizálni. A másik problémája ennek a széles körben elterjedt módszernek abban all hogy a túlnyúló Mi 3 kötőhellyel meghosszabbított PCR primer hajlamosabb a óiméiképződésre és ez rontja a POR: hatásfokát, ráadásul a hosszú primerek szintézisekor gyakoribbak a primer szintézishibák, pl, delécíok és leszerelek, amelyek zajossá teszik a szekvenciaképet és ezáltal csökkentik a vizsgálat érzékenységét.

A WO 9743449 számú (Hagiwara Kolehi el al.) illetve a WO 9908904 számó (Lto Qiang et at) es a WO 99/84624 számú ÍWailace Andrew el al) közzétételi iratokban Ismertetett technológiáknak az a célja, begy egyetlen szekvenálásl reakció során több célszekvenciát összekapcsolva egyszerre lehessen szekvenálni. Ettől azt az előnyt várták, hoqv a didezoxhszekvenálás költsége csökken, hatékonysága pedig nő. Azonban ezek a technológiák nem terjedtek el a gyakorlatban az alább vázolt problémák miatt, Ezekben a módszerekben az overlap fúziót a célszekvenclák között két külön PCR-reakcíóvai oldották meg. Az elsőben az egyes célszekvenciákat külön-kűlön olyan primerekkel ampliíikáiták, amelyeknek túlnyúló végei a másik célszekvenciával, illetve az ampliflkáló primer szekvenciákkal fednek át, majd a második PCR-reakció során keverték össze egy reakcióba az első PCR-reakció termékeit és fözlonáltatták. Bár a fúziós termék létrejön, a következő problémák lépnek fel; a) az elegyben lévő célszekvenoiák POR amplifikácíója külön-külön is tovább zajlik kompetioiöban a fúziós termékkel, b) hosszú primerekkel a PCR hatékonysága csökken, c) az átfedő primerek dimereket képeznek a fúziós PCR során, ami szekvencia zajt okoz, d) a primerekben lévő szintetikus hibák szintén zajként jelentkeznek a szekvencia kiértékelésekor, e) két külön PCR-reakció miatt az összköltségek sem csökkennek.

A WO 2Ö07/02534Ö sz. közzétételi iratban (Keith S, et ai.) eljárást ismertetnek szekvenciák halmazának zaj- és diszkriminációmentes ampiitikálására, amely két ampiífikációs lépésből áll. Ez a módszer felhasználható kis mennyiségben rendelke3 zésre átló DHS-msWk· rendem elöampiihkálásra. Az így kapott, megnövelt minta mennyiséget későbbi analízisek során jól lehet alkalmazni több oéiszekveocla vizsgalatéra. Azonban ez a technika nem növeli meg a fragmentumok méretét, hanem csak a mennyiségét. Ezáltal a fűi rövid DRS-szekveneíák továbbra sem fognak a szekvenálás! reakcióban részt venni.

A WO 2009/124085 sz. közzétételi iratban (Ohmba d.S. et al.) eljárást ismertetnek zaj csökkentésére nukleinsav-szekvenálási reakcióban. Az eljárás szerint a szekvenálást megelőző amplifíkáclóban keletkező fals láncíermlnáelös termékeket a szekvenálás! reakció során szelektíven degradálják. A rövid szekvenciák szekvenálásáva! kapcsolatos technológiai problémára ez az eljárás nem nyújt megoldást

A dldezoxí-szekvenálásl módszer hátránya, hogy az első 30-50 nukleotid sorrendjének pontos meghatározása nem lehetséges vagy meghatározása mindkét irányból analítikailag rossz minőségű, nehezen értékelhető. A leggyakrabban alkalmazott megoldás erre problémára az, hogy a vizsgálni kívánt szekvenciánál 70-70 bp-ral (prtmerhossz e 50 bpj hosszabb szekvencia-szakaszt ampiifikáloak, így a vizsgálandó szakasz már jó minőségű,

Összetöredezett nukieinsavakat tartalmazó minták esetében a POR célszekvenciájának meghosszabbítása azt eredményezi, hogy csak kevesebb megfelelő méretű nukleinsav kópia áll rendelkezésre a POR amplifikáláshoz. Ilyenkor a kimutatás érzékenysége csökken, sok esetben a kimutatás eredménytelen, vagy ha eredményes, a PCR során nő az alléi diszkrimináció (allé! bias) esélye, azaz, hogy véletlenszerűen csak az egyik szekvencia-variáns amplifíkáiódik. A mutáns és normál alléit egyaránt tartalmazó mintában Ilyenkor gyakori, hogy a mutáns alléi 10ö%~os vagy 0%-os gyakorisággal jelenik meg. Az utóbbi esetnek igen nagy a klinikai jelentősége, hiszen ilyenkor a vizsgálat fals negatív eredményt ad. A kevesebb kiindulási nukleinsav kópiaszám nagyobb ampiifikációs igényt Is jelent, ami növeli a PCR artefactmutációk kialakulásának valószínűségét.

A másik gyakran használt módszer a fenti probléma megoldására a célszekvencián túlnyúló „overhang” primerek használata a PCR amplifikácio során, melynek segítségéve! a rövidebb eélszekvenesa Is hosszabb PCR-terméket hoz létre. Ennek a módszernek az a hátránya, hogy a hosszú primerek szintézisekor sok prímedben előfordul egy-két nukleotid hiba, sok esetben nukleotid-deléció, Az erről a DNS-száiröl készült szekvencia egy nukleotiddal elcsúszott eredményt ad. Az Ilyen elcsúszott szekvenciáié célszekvenciák egymásra vetülve zajossá teszik anaiitlkalíag a. szekvenciaképet („segoence noiee”).

Megoldást jelenthet a fenti problémára, ha a célszekvenelához amphhkáaó után egy legalább 70 bp hosszú DNS-moiekulát Illesztünk.

Két DNS-molekula összeillesztésének egy korábban leid módszere az „overlap extension PCR” (rövidítve: ÖEP), Az US 5.023,171 sz. szabadalomban (Ho Steffan et al.) leírt ÖEP módszer alapja, hogy a hibridizációra kerülő egyszálú DNSek S’-végén található átfedő olígonukleofidok prtmerkénf szolgálnak a DNS-polimeráz szamara a kétszáiú fúziós DNS-molekula létrehozásakor.

SW

It a lka k tra q Líu

A módszer eredeti és legg termék fúziójára kerül sor j es Andrew wallace ( o A módszer két egymást követe PCR-reakeióf alkalmaz. Az első PCR során öszszekötö szekvenciákat tartalmazó primerek alkalmazásával állítják elő az átfedő DNS-szálakab amelyek a második FÜR során egymás primereíkénf szolgálva fúziósainak, Az első PCR során alkalmazott összekötő primerek a 3’-végükőn a templát DNS-sel, míg az S-végükön a szomszédos DNS-sel komplementerek, Ennek a módszernek az a hátránya, hogy a tempiát-szekvencia amplifíkálásakor a szómI primer hatékonyságát, ezzel szédos DNS-sel komplementer 5^; rész nagyban az érzékenység csökken. Továbbá primer-dirnerek képződnek az első PCR során, ami kismennyiségü DNS-mlnták esetében jelentősen rontja a POR hatásfokát. A· képződő p^i!me -dímerek, amennyiben nem kerülnek eltávolításra, ugyanúgy fuzionálnak a második PCR-reakcio során, mint a tempiát-szekveneiáhól képződő DNS-szál. Az így megjelenő, tempfátot-nem-tartatmaző DNS-száíak a szekvenálás során zajt okoznak, A módszerből következik az is, hogy az összekötő prlmerekben előforduló szekvencia-eltérések beépülnek a fúzíönált szálba, leszerelő vagy deledé esetén ez az egész szekvenálásl eléktroferogrammon végigfutó zajként jelenik meg, melynek amplitúdója megegyezik az ínszerciót/delédőt tartalmazö primerek arányával Az említett hátrányok nagyban gátolják az addig kifejlesztett OEP-aiapű módszerek alkalmazását a kismennyiségü és/vagy töredezett nukíelnsav-tartalmú DNS-ek

A jelen találmány célja, hogy a fent-emh'tett módszerek hátrányait kiküszöbölve az ces ás talóságát növeljük olyan mintákban, amelyekben a nuklelnsavak íragroenláltak,

A fent-vázoít problémák megoldására egy olyan overlap extension PCR-on alapuló technológiát terveztünk, amely a lehető legrövidebb prímerekkel biztosítja rövid PCR'terroékek fúzióját, illetve terveztünk egy mutáció-mentes adapter szekvenciát, amely a szélső POR-fermékhez fuzionálva kitölti a szekvenálás első 30-50 bp alatt képződő zajos szekvenciát anélkül, hogy ebhez hosszú PCR-terméket kellene amplífíkálnl,

A találmány összefoglalása

A találmány szerinti eljárás során; - egyetlen PCP segítségévei - a vizsgálni kívánt célszekvenciához mindkét oldalon olyan hosszú előre elkészített mesterséges távtartó, „spaeer DNS-roolekuiát illesztünk, amely lehetővé teszi, hogy a célszekvencia a szekvenáiö primer bekötési helyétől a zajmentes Sangerleolvasáshoz elegendő távolságra kerüljön, így a módszer tehetővé teszi, hogy a kétirányú Sanger-szekvenálás rövidebb DNS-molekuíákről képes leolvasni ugyanaz! a célszekvenciát, mint a fúziót nem alkalmazó hagyományos eljárás. Mindezt pedig úgy érjük el, hogy a fúziót megelőzően nincs szükség arra, hogy a célszekvenciát lementer szekvenciákat juttassunk, tartalmazó DNS-szálm más DNS-láneeaí azaz olyan prímerekai használjunk, amelyek a templát DHS-sel komplementer szekvencíák mellett a I rontó.

t is tartalmaznak. Külön előny, hogy az adapter DNS a célszekvencia amplifikácíójához használt primer kötőhelyen, illetve attól pár nukleotiddal beljebb hibridízái ezáltal a korábbi amplifikáció során nmernem szer előnyösebb annál is, leszfes, Ezaífal ez a szekvenciákat ligáiással Illesztenénk a

Az ábrák rövid leírása t ábra: Nuklelnsavak szekvenciájának molekulák fúziónáltatásával (talá szerinti eljárás)

2, ábra: A spacer-moiekuia

3, ábra: A fúziós PCR~t megelőző PCR primőrének és a spacer-moíekula hibrídizáci ós helyének elhelyezkedése

4, ábra: A H1N1 influenza vírus Nt-rezisztencia mutációit vizsgáló kétlépcsős PCR eljárás sémája

5, ábra: A találmány szerinti módszer hatékonyságának Igazolása az 1977-2008-ás

H1N1 Ni-rezisztencla mutációinak vizsgálatában 8, ábra: A találmány szerinti módszer hatékonyságának igazolása az új típusú Hl NI

Rí-reztszfencia mutációinak vizsgálatában

7. ábra: Az ismert és a találmány szerinti eljárásban basznál amplikonok szekvenciái az EGFR 21 -es exonjának vizsgálatakor

8. ábra: Az alléi hias faiá szerinti

I történő csökkentésének igazolása

A találmány részletes le írása

A találmány szerinti eljárás során a vizsgálni kívánt célszekvenciához egyetlen PCR segítségével· mindkét oldalról olyan hosszúságú. előzőleg megszintetizált „spaceC-molekulát illesztünk, amely lehetővé teszt, hogy a szefcvenálandő oelszekvencia a primer 3^!-végétől elegendő távolságra kerüljön a zajmentes Sangerleolvasáshoz, így a didezoxi-szekvenálást megelőző ampllfikáció a célszekvenciát csak körülbelül 2 x 20 bp-ral (2 x primerhossz) meghaladó nuklei.nsavrői is végbemehet. Kis kiindulási terápiát nukleínsav-tarialom esetén, a spacer-molekulát illesztő PCR-f megelőzően, a megfelelő templát-kópiaszám biztosítására, a célszekvencia PCR amplifikációjáf elvégezhetjük. Ebhez elegendő olyan primerek használata, amelyek csak a templáltai komplementer szekvenciát tartalmazzák. Ilyen esetben az >. 2 x 30

-ral (2 x primerhossz e 2 χ 10) megampllfikáció a céiszekvenclát csak haladó nukleinsavról is végbemehet.

Kísérteti úton is bizonyítottuk, hogy az ismert didezoxi-szekvenáiáskor szükséges, kétszer 70 bp extra szekvencia ampílfikálása kiváltható egy rövldebb szekvenciával, ezáltal az PCR ampitkon mérete csökkenthető, ami a vártnál is jobban növeli a szekvenálás érzékenységét, azaz a fragmentált, kis mennyiségben jelenlévő, mutációt hordozó ONS-szekveneiák kimutatását, és csökkenti az alléi hias kialakulását olyan DNS-minták esetében, amelyek íormalin-fixáSf szövetekből származnak (lásd 8 példa).

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott spacer-molekula, amely egyszálö vagy kétszálú DNS lehet, a következőket tartalmazza (lásd 2. ábra):

- a célszekvencia egyik végén lévő templát oukléinsavval vagy amplikonnal komplementer szakasz (kb, 20 bp},

- egy legalább 20 bp (de 120 bp-nál kisebb) köztes DNS-szakasz, amely az előbbi szakasszal együtt biztosítja, hogy a szekvenáló primer 3’-vége megfelelő, több mint 40 bp (de 140 bp-nál kisebb) távolságra ke rőt jön a eélszekvencláfól,

- szekvenáló primerre! komplementer szakasz (15-40 bp),

- ampiltikálö printerre! komplementer szakasz (15-40 bp).

A fentiek alapján a találmány egyik szempontjában egy eljárást nyújt töredezett nukleinsavak szekvenciájának meghatározására egy célszekvencia PCR ampiifikáoiöjával és az ezt követő didezoxi-szekvenálással, amely a kővetkező lépéseket tartalmazza:

a) a szekvenálandö nukielnsavat vagy nukleinsavat tartalmazó sejteket elkülönítb) egy PCR-reakciót kivitelezőnk a eélszekvencia fuzionálására és ampliflkálására, amelyben egy vagy több olyan mesterséges spacer-molekuiát alkalmazunk, amely tartalmaz egy, a eélszekvencia egyik végén lévő templát nukleinsawaí komplementer szakaszt, egy legalább 20 bp távtartó szakaszt, egy szekvenáló primőrrel komplementer szakaszt és egy ampiltikálö primerre! komplementer szakaszt, és

c) az így kapott PCR-terméket, adott esetben tisztítás után, szekvenáljuk.

A fenti eljárás egyik előnyös kiviteli módjában a nukielnsavat a biológia! mintából izoláljuk. Egy másik előnyős kiviteli módban ez a) Izolálás! lépés megfelelő polimeráz alkalmazása esetén elhagyható. Egy további előnyös kiviteli módban a nukielnsavat tartalmazó sejteket izoláljuk a biológiai mintából, előnyösen lézer mikrodisszekcióval.

A spacer DNS-moiekuiákat fuzionáltak) PCR-reakciót az 1. ábrán mutatjuk be:

a spacer DNS-molekula és a célszekvenciát tartalmazó DNS-molekulák komplementer 3'-végei hibrídizálnak, Igy a polimeráz felépíti a 2. szálú egyik oldalról fuzionált

DNS-molekulát, Ezzel egyidejűleg mindez végbemegy a célszekvencia másik oldalán is. Az egyszeresen fuzionált DNS-molekulához a másik oldali spacer DNS-molekuia ugyanígy hlbridizál, és létrejön a mindkét oldalról fúziónál* kétszálú DNS-molekuia, amely a fomard és a reverse prímetekkel komplementer szekvenciákat Is tartalmazza, és így egyúttal lehetővé válik a fúziós molekula ampliíikáelóla. Áz ampllfikáló primerek nagy kiindulási koncentrációja biztosítja, hogy az ampllfikáit fúziós szál végső koncentrációja nagymértékben meghaladja a kiindulási és az intermedier molekulák koncentrációját. Végeredményben ebben az esetben a PCR-reakoic egy multiplex reakció, amelyben a fuzionálás ős amplifikáiás egy lépésben történik.

Ha a fúziós PCR-t megelőzően ia alkalmazunk RCR-reakoiót, akkor ezt a reakciót úgy érdemes megtervezni, hogy a primerek S’-végel a terápiát nukleinsav legalább 0-70 bp-ral S'-irányban kijjebb lévő szekvenciával legyenek komplementerek, mint a spacer DHS-mofekula templát-specifikus része itasd 3, abrak így elkerülhető az első PCR során képződött primer-dimerek fúziója a spacer DNS-molekulákkal a fúziós PCR során.

A fentiek alapján a találmány egy másik szempontjában egy eljárást bocsát rendelkezésre töredezett nuklelnsavák szekvenciájának meghatározására egy célszekvencia kétlépcsős PCR ampiitíkációjával és az ezt kővető dldezoxiszakvenálássak amely a következő lépéseket tartalmazza:

a) a szekvenálandő nukíeinsavat vagy nukieinsavat tartalmazó sejteket elkülönítjük egy biológiai mintából,

b) egy első PCRneakciót kivitelezünk a célszekvencia ampíifikálásáta, cl ezt követően egy második PCR-t kivitelezőnk az amplikon fuzionálására és amplíílkálására, amelyben egy vagy főbb olyan mesterséges spacer-molekulát alkalmazunk, amely tartalmaz egy, az amplikonrial komplementer szakaszt, egy legalább 20 bp távtartó szakaszt, egy szekvenáló primőrrel komplementer szakaszt és egy ampllfikáló primőrrel komplementer szakaszt, ahol az. amptlkonnal komplementer szakasznak megfelelő szekvencia a terápiát ÖHSen 0-70 bp-ral távolabb kezdődik 5’-irányban_s mint sz ampllfikáló príménél komplementer szakasz 5’-vége, és

d) az így kapott PCR-tsrméket adott esetben tisztítás után, szekvenáljuk.

A fenti eljárás egyik előnyős kiviteli módjában a nuklsínsavat a biológiai mintából izoláljuk. Egy másik előnyös kiviteli módban az a) izolálás! lépés megfelelő pofímeraz alkalmazásé esetén elhagyható, Egy további előnyös kiviteli módban a nukleinsavat tartalmazó sejteket izoláljuk a biológiai mintából, előnyösen lézer míkrodisszekclóval.

Szükség esetén a b) lépésben az első PCR után egy további nested: PCR-í

A találmány szerinti eljárásokban a szekvenáianöő nukleinsav DNS vagy RNS lehet.

A találmány érteimében a szekvenálandó töredezett nukleínsavon tragmentált DNS-t, RNS-t vagy miRNS-t értünk. A „töredezett nukleinsav” kifejezés a találmány értelmében 30-1 ÖOG bp hosszúságú nukteinsavat, előnyösen 55-300 bp hosszúságú nukteinsavat jelent.

Az eljárás minőén olyan esetben előnyösen alkalmazható, amikor a DNSszakasz, amelynek nukleotid-szekvenciáját meg akarjuk határozni, nem olyan DNSmolekula része, amely legalább 70 bp-al hosszabb, mint a célszakasz. Tehát, ha egy 100 bp hosszú DNS- vagy RNS-szakasz szekvenciáját akarjuk meghatározni, akkor az egy minimum 240 bp hosszú DNS-rtarab közepén; kell elhelyezkednie, hogy az ismert módszerekkel szekvenálni tehessen. Egy 200 bp hosszú szekvenálandó szakasz egy minimum 340 bp hosszé szakasz közepén kell, hogy legyen. Felső határt csak a didezoxi-szekvenálás technikai korlátja jelenti, ami kb, 1000 bp,

A biológiai minta alatt blopszlákat, szövetmintákat, citológiai keneteket, vérmintákat, aszcitesz folyadékot, gerincvelőt, vizeletet, stb, értőnk. A találmány szerinti eljárásokhoz előnyösek a szövetminták. A nukteínsav-rnínta származhat emberi, állati vagy növényi szövetből vagy sejtből. Különösen előnyösen a módszer alkalmazása egy olyan biológiai minta esetén, amelyben a nukleinsav-fragmensek mérete különböze és mennyisége is kevés, ilyenkor a célszekvencia méretének csökkentése arányában jelentősen növeljük a terápiáiként rendelkezésre álló DNS-fragmensek számát. Ilyen alkalmazásra példa a szövettani minták vagy citológiai minták olyan feldől· gozása, amikor lézer mikrodisszekoios mikroszkóppal juttatunk egy-két, egy-két száz vagy egy-két ezer sejfnyl nukteinsavat a vizsgálócsőbe, amelyből ezután a nukteínsavat vagy elkülönítjük vagy közvetlenül PCR-ampliflkáljuk.

A spacer DNS-moiekulát etlndlg a célszekvenciának megfelelően, amelyet előre ismernünk kell, megszintetizáljuk vagy megszlnfetizáltetjuk. A spaoer-molekuia a tent-megadortakon túlmenően tartalmazhat amplifikálő primer-kötőhelyei, NT13 kötőhelyet és a eélszekvenciával átfedő kötőhelyet.

A találmány szerinti szekvenáló eljárás egyik kiviteli módiéban tornázd és reverse spacer-molekulákat alkalmazunk, melyeket az alábbi módon állíthatunk elő. A iötward spacer-motekuiák vázának a :pCR24-TÖRO vektor (Invitrogen) M13F primer környéki részeit, a re verse spacer-molekulák vázának pedig a pENTR/HI/TÖ' vektor (Invitrogen) M13R primer környéki részeit használjuk. Két oldalról ehhez a vázhoz illesztjük OEP-et alkalmazva a diagnosztikai rendszerekre specifikus szekvenciákat. A spacer-vázhoz az Ι7Γ13F vagy R primőrtől 3' irányba a templáttal komplementer szakaszt, majd ezen túl további nukleotídokat Illesztünk. amelyek: a későbbi restrikciós hasításhoz szükségesek. A spacer-váz másik oldalára az előző oldalival megegyező restrikciós enzim hasítási hely kialakításához szükséges szekvenciákat illesztjük. Az így előállított mesterséges szekvenciákat CionedET1.2 PCR Cloníng Kittel: (Fermentas) és Topíö baktériummal klónozzuk. A szekvenciát Igazoltan tartalmazó klónból történő vektor-izolálást követően, restrikciós enzimes hasítással és gélizolálással állítjuk elő a spacer-molekulákaí. A két H1N1 influenza diagnosztikus rendszerhez csak fotwsrd spacerekef, a KRAS és EGFR diagnosztikai rendszerekhez forward: és reverse: spacer-molekulákat használtunk.

A találmány szerinti eljárások mindegyikében kivitelezünk egy PCR-t, amelyben a spaoer-molekulákat a célszekvenciákkal fúzionáifaíjuk. Ehhez a reakeloefagynek a golímeráz működéséhez szükséges komponenseken kívül a következő összetevőket kell tartalmaznia: a célszekvencia végeihez fuzionáló spacer-molekulákat az amplifikálö primereknéi kisebb mennyiségben; és a fúziónak molekulát, amplifikálö forward és reverse primereket

Ha a fúziós tépést megelőzően a eéiszekvenciákat elöamplíflkál)uk egy vagy

PCR-reakeiŐbao, akkor ebben az esetben a fúziót az így előállított ampllkonokon végezzük el, Egyik előnyös kiviteli módban mindkét oldalról spacermoíekulát fuzionáltatunk az ampiíkonokhoz (lásd 1-3. példa), így ezekre a rendszerekre érvényes az 1. ábra. Egy másik előnyös kiviteli módban, például: az influenza neuraminidáz gén vizsgálata során, a fúzió csak az egyik oldalon történik (lásd 4. ábra), a másik oldalon overlap fúziót végzünk a 2 neuraminidáz génrégió között átfedő szekvenciákkal, melyeket a másik régióba túlnyúló primerekkel hoztunk létre még a fúziót megelőző PCR ampliflkálás során (lásd 4-5. példa).

A fözsonáló és am pliflkálö POR során kapott terméket ezt követően közvetlenül vagy tisztítás után szekvenáljuk, Kívánt esetben a PCR-terméket Ismert módon latjuk, pl etanofos kicsapásssaf, szillkaoszfoppal XTermlnátor® segítségével.

A szekvenálást önmagában Ismert módon végezzük,

A találmány szerinti módszer az. alábbi előnyökkel rendelkezik a technika állásából ismert eljárásokhoz képest;

1) Érzékenység növelése: a hagyományos, hosszabb p:MS;-szskaszbóf kiinduló eljárással szemben ezt azáltal épük el, hogy a szekvencia-vizsgálathoz szükséges templat me á nevel;

tikezésre álló fragmensek számát, Az átfedő pnmereket használó módszerekhez képest az érzékenység azáltal javul, hogy az előbbi módszerekkel szemben, fit nem szükséges a céiszekvenclát tartalmazó DNS szálra más DNS lánccal komplementer szekvenciákat juttatni Az Ilyen átfedő (overhang) primerek alkalmazása ugyanis, bár a kiinduláskor szükséges templát méretét szintén csökkenti a fokozott: dlmer-képzésí hajlam miatt, rontja a PCR: hatásfokát.

2) Alléi blas csökkentése: szintén a szekvencia-vizsgálathoz szükséges templát méretének csökkentésével és így a rendelkezésre álló DNS-íragmensek számának növelésével magyarázható, vagyis csökken annak esélye, hogy az egyszerre előforduló több szekvencia-variáns közül, véletlenszerűen csak az egyik amplif lká lód ik,

3} Artefact mutációk előfordulásának csökkenése; A szekvencia-vizsgálathoz szükséges templát méretének csökkentésével együtt iáró DNS-fragmens-szám emelkedés a szükséges ampltíikáeió mértékét Is csökkenti, Nlindez a polimeráz-bibák előfordulásának esélyét is csökkenti,

4) Zaj csökkentés: átfedő primerek alkalmazásakor, az ezekben a phmerekben megjelenő szekvencia-eltérések beépülnek a fúziós termékbe, Inszerció vagy deiéoió esetén ez az egész szekvenálásl elektroíerogr&mmon végigfutó zajként jelenik meg, melynek amplitúdója megegyezik, az ínszercíőtzdetéefoí tartalmazó primerek arányával Az átfedő primerek alkotta dímerek ugyanúgy fuzionálnak a 2, POR reakció során, mint a templát szekvenciából képződő DNS szál Az így megjelenő, templáfot nem-tartalmazó fuzionált DNS szálak a szekvenálás során szintén zajt okoznak. A. találmány szerinti eljárással mindkét jelenség: előfordulását kiiktatjuk, jelentős zajcsökkentést érve el, A space r-mole kólák baktérium klánokban történő előállításával kizárható a bennük lévő különböző szekvencia-variánsok előfordulása, A spacer12 molekula hibridizációs helyének megfeleld megválasztásával pedig a célszekvencía nélküli reakcíöterroékek fúzióját akadályozzuk meg,

A találmány szerinti eljárás számos területen alkalmazható. Egyik alkalmazási területe génszekvenciák azonosítása töredezett DNS-t tartalmazó növényi, állati vagy emberi szövetmintákban, így például a találmány szennti eljárássá! kimutathatók a Hl Ni influenza neuraminidáz génjének mutációi, melyek alapján a terápia tervezhető,

A találmány továbbá olyan töredezett nuklelnsavak nnkleötid-szekvenoiájának meghatározására szolgál, amelyek adott esetben mutációkat tartalmaznak és ezek a pontos szekvenálással megbízhatóan kimutathatók. Ennek egyik tipikus területe a mutációk kimutatása daganatszövetből származó fragmentáíódott DNS-mintákban.

A találmány szerinti szekvenáló eljárás különösen alkalmas formaiinnal fixált, tárolt, és ennek következtében károsodott, töredezett nukleinsavat tartalmazó szövetminták megbízható vizsgálatára. Ennek tipikus felhasználási területe a rák diagnosztikája, a kezelés módját befolyásoló genetikai markerek azonosítása. Ezekre példaként szolgálnak, de nem korlátozó jelleggel az EGFR 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonjában előforduló ismert mutációk, a KRAS, HRAS és NRAS 2-os, 3-as és

4-es exonjának mutációi, a BRAF 11-es és 15-ös exonjában előforduló mutációk, a HER2 19-es es 2Ö-as exonjának mutációi, a PI3KCA gén 1-es, 9-es es 20-as exonjában előforduló mutációk, KIT S~es, 11-es,13-as es 1?~es exonjának mutációi, a POGFR-A 12~e$, 14-es és 18-as exonjában előforduló mutációk és az ALK gén 20as, 22-es,. 23-as, 24-es és 2S-ös exonjának mutációi.

A találmány egy további szempontjában reagenskészletekre (kit) vonatkozik a találmány szerinti eljárások kivitelezéséhez, A találmány szennti reagenskeszlef az egy PCR-t alkalmazó találmány szerinti eljáráshoz a használati utasításon kívül a kővetkezőket tartalmazhatja; egy vagy több spacer-molekula; vagy egy vagy több spacer-molekuía és amplifikáló primerek. Kívánt esetben a reagenskészlet tartalmazhatja a POR kivitelezéséhez szükséoes polimerázf és reagenseket is.

A reagenskészlet a találmány szerinti több PCR~f alkalmazó eljáráshoz a használati utasításon kívül a következőket tartalmazhatja: egy vagy több spacermolekula; vagy egy vagy több spacer-molekula és amplifikáló primerek a fuzionáló

-hoz;

PCR-hoz és amplifikáló primerek az első iiflkáló

-hoz. Kívánt esető spacer-molekula, amphíikálé primerek a fuzionáló feágenskesziet tartalmazhatja a pöfimerázokat és reagenseket Is.

A találmányt az alábbi példákkal részletesen ismertetjük, anélkül, bármi módon korlátoznak az oltalmi kört.

Példák;

A találmány szerinti eljárást δ nukleinsav-szekvenela amplifíkálásén és szekvenálásán keresztül szemléltetjük, 3 esetben emberi génszakasz vizsgálata veit a cetek. A KRAS 2 exonját és az EBRR 19-es és 21-es emujának - az előforduló mutációk miatt - legrelevánsabb régióit kívántuk vizsgálói. Ezen vizsgálatok esetében a kiindulási nukleinsav DNS veit. Eljárásunkkal vszsgáll másik két génszakasz az influenza neuraminidáz génjének két olyan szakasza volt, melynek mutációi a ző neuraminidáz-gátlókkal (NI) szembeni eltérő mértékű rezisztenciával összefüggésbe. RNS vírusról lévén szó, a vizsgálat tempiátjaként itt az RNS szolgált. A H1N1 influenza gyógyszerhatást befolyásoló génréglóínak vizsgálatának megtervezésekor az 1977-től 2005-ig előforduló Hí Ni Influenza vírusok génszekvenciáiboi indultunk ki. Az így beállított assay az. 1977-től 2008-ig előforduló összes influenza detektálására képes, A 2009-ben megjelent új típusú H1NÍ influenza 337 variánsának neuraminidáz génjét megvizsgálva a korábbi variánsoktól nagyfokú eltérést tapasztaltunk. Ezért a 337 génszekvencíát felhasználva az új típusú H1N1 Influenza kimutatására optimalizált assayt terveztünk, amely a primerelcben és a spaeer templát-specifikus részeiben tartalmaz néhány nukleotidnyí eltérést a 2008-as MINI assay összetevőihez képest,

A találmány szerinti eljáráson alapúié diagnosztikus rendszerek paramétere? az 1, táblázatban mutatjuk be.

		la:	'MMw	Ípscsriáíw	ampákon ho-szá	:„·;<·,a$:-, ní.'Sjsiasax 8S5S2Í:	WsfeiSRöitósífaJil· ntá&nsav hasisa Íálifís íírffiétteífí
·, ί	KfíAS svon ,>	üartelápism:	3S5	síBStSí öísSaíró?	128	Sbff	»Sp-	2S2bfj
L i	56R ÍSKW 19	Hornt·	í>f«	SSÖSlíÍisíÍ3:rí?	M?	Hí;?·	77 bp	bp
X	lÜÍR SiOf'. 21	•«eme Sapiens	sas	ra»rf8sísSSa:sí!	287	888?	S&iís	79SSP
4: ;		Itmotti v3í;ííW;í	:«915	cíwlsWí'sf	Wíi*	«V	ö?:sft
5.		Ü· ÍÍÖUSU rfi&i W ivStfiS	S9S	sgyfcsS&Rs		;.?Ssp	iVbjs	aSáls

1, táblázat Az s//áráaon,ken e/apo/ó d/agnoszákus rendszerek paramétere/. Az /náe~ enza esetében a *~pa/ ,/e/ö/t W-íí őp-nyf szekvene/a nem a t&mplátróí amplífikálódik, hanem a más/k pénrég/óba tönyúfd szekvenciákat tarfafeaze pnrnerekkef fbzfooá/é14

Epace mmofekufák efőáiOása; A. diagnosztikai rendszerhez egy forward és egy reverse spacer molekulát állítottunk elő: „spacer'^>-t. A forward spacer molekulák vázának a pCR2,1-TQPQ vektor (Invitrogen) M13F primer környéki részeit, a reverse spacer molekulák vázának pedig a pENTR/HDTO vektor (Invitrogen) M13R primer környéki részest használtuk,

A pCR2,1-TQPO vektor forward spacer molekulák vázául szolgáld, SEQ ID MO: 1 szerinti szekvenciája (104 bp, a szürkén satírozott rész a forward ampllfikáló primőrnek megfelelő szakasz, fekete alapon fehér hetükkel jelölt rész az. M13F szekvenáló prlmernek: megfelelő szekvencia):

rVf-ATTÁAGGGGGGrAACXiC'CAGGóWTZCCCAGrCACGAGGT AATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAAT’IWSCC-CTCTAG

AAAACGACGGCCAGI

A pENTR/Hl/TÖ vektor reverse spacer molekulák vázául szolgáló, SEQ ID MO: 2 szennti szekvenciája (110 bp, a szürkén satírozott rész a reverse ampllfikáló primernek megfelelő szakasz, fekete alapon fehér hetükkel jelölt rész az Mf 3R prlmernek megfelelő szekvencia):

GTG-G\:GA0-GTAACATG;v5AGATT-T^?rGAGACACGGGCCAGAGC?GC^M^^^MOgM ^.ITAATACGZiCTGACTATAöGGGATATCAGCTGGATGGGAAATAATG Két oldalról ehhez a vázhoz illesztettük QEP-et alkalmazva a diagnosztikai rendszerekre specifikus szekvenciákat. A vektor-szekvenciához az M13F vagy R primertel 3’ irányba a KRAS génnel komplementer szakaszt, majd ezen túl további nukleotidoksf illesztettünk, amelyek a későbbi restrikciós hasításhoz szükségesek, A forward spacer molekulák esetében ehhez az alábbi reverse prímért (SEQ ID MO; 3) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az KRAS génrészlettei egyező szekvencia, dőlt betűvel: a pCR2,l-7ÖPÖ vektor-szekvenciával komplemenler szakasz):

GATGGCCACAAGTTTAGATTGAGTCAÓGTTATAATCTAGAGgGGCCAZlTlWG

A reverse spacer molekulák esetében: ehhez az alábbi reverse prímért (SEQ ID MO:

4) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az

KRAS génrészlettel komplementer szakasz, dőlt betűvel: a pENTR/Hí/TÖ vektorrésszel egyező szekvencia):

GAlOeAAGAGTGCCTTGACGATACCWAGTTGGCATCCAGCTG

A spacer molekulaváz másik (53 oldalára az előző oldalival megegyező restrikciós enzim hasítási hely kialakításához szükséges szekvenciákat illesztettünk. A forwmd spacer molekulák esetében ehhez az alábbi forward prímért (SEQ ID NÖ; 5) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, dőlt betűvel; a pCR.2,1TOPO vektor-résszel egyező szekvencia)'.

CTPOGCCAGCGATTAAGríGGO-TAACGC

A reverse spacer molekulák esetében ehhez az alábbi forward; prímért (SEQ ID NO: 6) használtuk (szürkén satírozva; a restrikciós enzim hasító helye, dőli betűvel: a pENTR/H1/TO veMonrésszei komplementer szekvencia):

ezil||ll||G

Az illesztéseket a forward és a reverse spaeer-molekuíák esetében külön-külön PCRben végeztük. A két reakció csak az alkalmazott primerekben különbözött egymástól Az ampílfíkáslót a pCRS-VTÖPÖ, illetve pENTR/H1/TO vektorokat tartalmazó oldatokban végeztük, AccuPríme Taq HIFI DNS polímerázt (invitrogen, 0,02 U/pl), Ix-es t-es AccuPríme PCR puffért és 0,4 /vM koncentrációjú forward és reverse primereket alkalmazva. A POR az alábbi ciklusokat tartalmazta:

1. Ciklus: (Ixj	1. lépés	64sü 1 ρ OOmp
2, cAlus-.DOx)	1. lépés 2. lépés	94;'C· üp 20mp 63“C0p 20mp
Minden ciklust kő	vetően ez a ciklus 0,68 3. lépés	Ű-ka 1 csökkent 68“C Op 40mp
3. cikius:(30x)	1. lépés 2. lépés 3. lépés	94'C Op 20mp 63cC Op 20mp 68'C Op 40mp
4. cíkius:(30xj	1. lépés	6S':C Sp OOmp
5. ciklus:(1 x)	1. l épés	4°C ®

Az így előállított mesterséges szekvenciákat ClonedET1.2 PCR Cloníno főttel (Fermenfas) és Top10 baktériummal (Invstrogen) klönoztuk. A spacer molekulákat tartalmazó pdETI.2 vektorokat MidiPrep-pei izoláltuk. A forward spacer molekulát Mlu Nk reverse spacer molekulát Ávlll restrikciós enzimmel (mindkettő Roche, 0,4U/pi 16 órán ár 37°C~on Inkubálva) vágtuk ki a vektorból E-Gel SizeSelect (invitrogen) rendszert alkalmazva, a spacer-molekulákat gélből Izoláltuk.

A restrikciós hasítást követően létrejött íorward spacer-moíekufa szekvenciája (SEQ 10 NO; 7) (137 bp, a szürkén satírozott rész a íorward ampllíikáló primőrnek megfelelő rész, fekete alapon fehér betűkkel jelölt rész az W113F szekvenáló primemék megfelelő szakasz, az aláhúzott a KRAS gén egy részletével komplementer szekvencia):

ISSAAGTGTAATAGGACTCACTATAGGGCGAATTGGCeCCTCGAGATTAr&AGAttXIACTGAA

TATAAACTTGTGG

A restrikciós hasítást követően létrejött reverse spacer-molekuia szekvenciája (SEQ ID NO: 8) (134 bp, a szürkén satírozott rész a reverse ampiiflkáío primernek megfelelő rész, fekete alapon fehér betűkkel jelölt rész az M13R szekvenáló primernek megfelelő szakasz, aláhúzott betűvel KRAS gén egy részletével komplementer szekvenGTGCAATGTtWCZVfCAGAGATTyTGAGhGAOGGGCGAGAGCTGG^^BBWW^ggM ||STAATAGGACTGAGyA?AöGGGA7ATGAGCTGGA7GGCAAA7AATGGTATCGTCAAGGCA

GTCTTGG

in-íixált mintából izolált, töredezett DNS-t tartalmazó mintákon a fúziót megelőzően PCR ampüíikáciől végeztünk. A PCR körülményei megegyeztek a spacer molekula eiőálirtásánál használt reakeioévaL Aforward primer szekvenciája (SEQ ID NO: 9):

GACATGTTCTAATATA.GTCACATTTTCATTA.TT, a reverse primer szekvenciája (SEQ ID

10): TCTGAATTAGCGGTATGGTCAAGG VOtt.

A PCR eredményeként az alábbi 120 bp hosszú amplikon (SEQ ID NO: 11/képződött (szürkén satírozva a íorward primernek megfelelő és a reverse primerref komplementer szekvenciák, aláhúzva: a íorward spacer molekula templátspecifikus részének megfelelő és a reverse spacer molekula templátspecifikus részével komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér betűkkel: a legjelentősebb KRAS mutációk helyei):

GAGATGGTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTyATTATAAGATGACTGfekTATfekAGTT

GrrGG7AGTTGG^AGCTÍ|7^GTAGGCfi.AGAGTGCCT^Í7GACCATACAGe7AAⁱrTGAGA

Spacer-mo/eku/ák fezfená/fefesa: A íorward és a reverse spacer-molekulákat PCR alkalmazásával fuzioná Itattuk az előző ltott ampllkonnal. A PCR-oldat az amplikonokon kívül az alábbi összetevőket tartalmazta·. AccuPhme Tag HIFI ÖNSpolimerází (Invitrogen, 0,02 Ufel), Ix-es l-es AccuPhme PCR puffért ás 0,4 pM kon17 centrációjú forward prímért (SEQ ID NO: 12) (attaagttgggtaacgccagggttt) és reverse prímért (SEQ ID NO: 13) (agattttgagac.acgggccag?\), forward és reverse -meleky lakat A PCR-okfat összeáll Másakor a térfogat egyik ötödet az. snokat tartalmazó PCR-oidat WOx-os hígítása, egy másik ötödét pedig a spacer-moíekuíák géi-izoiátuma adta. A PCR-oidat tehát -0,012 pM-nyl forward és ugyanennyi reverse spacer-t tartalmazott. A PCR az alá t tartalmazta:

1, ciklus:(1x)

2, cíkkjs:(Sx)

3, ciklus:(35>

4. cikluséi x)

5. ciklus:(1x)

1, lépés

1, lépés

2, lépés

3, lépés

1. lépés

2. lépés

3. lépés 1. lépés 1. lépés

57°C Op 30mp 6S°C 1p OOmp 94°C Op 30mp 62°C Op 30mp 68C 1p OOmp 68^ÖC 10p OOmp 4*0’

A reakció során, amennyiben a vizsgált minta KRAS-génszakasza kiinduláskor nem tartalmazott mutációt az alábbi 288 bp hosszá fúziós termék (SEQ ID NO: 14) keletkézen (szürkén satírozva a forward prímemek megfelelő és a reverse prtmerref komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér dót hetükkel: az M13E szekvenálő pőmemek megfelelő, illetve az MISE prlmerrel komplementer szekvenciák, aláhúzva: a forward spacer-molekula tempiátspeeifikos részének megfelelő és a reverse spaoer-molekula templátspeeiíikus részével komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér normál betűkkel: a legjelentősebb KRAS mutációk helyei):

ATTAAGTW'3GTAACdO^A?OmTTTCCC.?<4TCACQACGTSieSei^SSSöArt-T ηη/'-Γρ \ x ·-:* -a .-'yx x, A. ►'-'•’Τ'Ά nn Λ >v<rw^j A A ·_Λ ,-p_:v< -A <;». y>,· y. x a A A.RX7vrtt A i Vri .( i Ainub’\JVUAíü λ L. i 1 £ I

CTTGZGG^,f7\G^tr^frGGÁGC'I^^T^^CG'TAGGCAAGAGTGCC’TTGACGATACCATTA.T^Ír^!t¹GCCA^,T

IggagoIIII

ATGGTCATAGCTÖTS'TCCTi

CCAGCTGATATCCCCTATAGTCAGTCGTATTAC

GCCCGTGTCTCAAAA^GT

A fúziós fennek szekvená/ása; A fúziós terméket a PCR-t követően Exo-SAP-IT (USB) enzlmkeverékket tisztítottuk, majd kétirányú terminálé reakciót végeztünk BígDye Terminalor v3.1 Seguencing Kitel (Applied Bíosystems) és M13F prímért (SEQ

ID NO: 18) (tgtaaaacgacggccagt), illetve M13R prímért (SEQ ID NO: 16) (caggaaacágcbatöag) alkalmam, A terminálő reakció termékét BigDye XTermlnator (Applied Blosystems) kit segítségével tisztítottuk, majd a DNSszekvenciái ABi Prism 3130 Geneöc Analyzer (Applied Biosysíems) készüléken végzett kapilláris-elekfrotorézissei olvastuk le.

Ei paraffinba ágyazott formaiin fixáit mintából Izolált, töredezett DNS-t tartalmazó izolátum esetében sikeresen elvégeztük a szekveneia-vizsgáíatet.

tata

Spaeer rno/ekufak e^áOása; A diagnosztikai rendszerhez itt is egy forward es egy reverse spaoer-rnoíekuiát állítottunk ele, az első példában leírt módon, az alábbi módosításokkal. Az QEP reakció során a forward spaeer-molekulák esetében az M13F primőrtől 3’ Irányba az EGER génnel komplementer szakaszt és a restrikciós hasításhoz szükségesek további nukieetidokat az alábbi reverse primőrre! (8EG: ÍD NO: 17): illesztettük a pCR2.1-TORQ vektor-szekvenciához (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az EGFR génréazlettei egyező szekvencia, dőlt betűvel: a vektor-szekvenciával komplementer szakasz):

GAGTTAACTTTCTGAC€T?CTGGGATCCACTAGAGGGCC3AATV^:CGG

A reverse spaeer-molekulák esetében ehhez az alábbi reverse primer! (SEQ ID NO: 18) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az EGFR génrészlettel komplementer szakasz, dóit betűvel: a pENTR/Ht/TO vektorrésszel egyező szekvencia):

GACAGCTGCTGTGCTGTGTGOGGG^;rr3A^fr3^:ATyTGCCAyCC^igTG Utóbbi printerrel a pENTR/Hh-TO vektorban található egyik guanint a molekulában citozinra (az előbbi szekvenciában fekete alapon fehér betüve cseréltük, hogy az itt lévő CAGCTG restrikciós hasítási helyet megszüntessük i jelölve) lk, megyozva így a spacer-moiekuia olA forward spaeer-molekulák esetében a pCR2.1-TOPQ vektor-szekvencia dalára a restrikciós enzim hasítási hely kialakításához az alábbi forward primőrt (SEQ ID NO:19) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, dőlt betűvel; a vektor-résszel egyező szekvencia):

CTGTGAAGGCGATGyutGTGGGGAkSCGC

A reverse spacer-molekulák esetében ehhez az alábbi forward prímért (SE¹ 20) használtak (szőrkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, dőlt betűvel: a pENTR/HI ZTQ vektor-résszel komplementer szekvencia);

CTCAGCT^dTÖCAATörAACATCAŐAÖATTTK?

A resthkcös hasításhoz a forward spacer-molekula esetében a Hpal enzimet, a reverse spacer molekula esetében a PvoII enzimet használtok,

A restrikciós hasítást követően létrejött forward spacer-molekula szekvenciája (SEQ IÖ NÖ; 21) (1.31 bp, a szü rkén satírozott rész a forward amplffikálö primőrnek mer lelő rész, fekete alapon fehér hetükkel jelölt rész az M13F szekvenáló megfelelő szakasz, aláhúzott betűvel EGER gén egy részletével komplementer szekvencia):

AACGCGÁT1 AAGGTGÖGGAACGCCAGÖGTTTGGGCAGTCZ^CCACG jgGAATTGTAATACGACGCACTATAGGGCGAATTGGG€CCTCTAG?GGA?CCCAGAAGG?GA

GAAAGTT

A restrikciós hasítást követően létrejött reverse spaeer-moiekula szekvenciája (SEQ IÖ MO: 22) (133 bp, a szürkén satírozott rész: a reverse emplifikálö primőrnek megfelelő rész, fekete alapon fehér hetükkel; az M13R szekvenáló primőrnek megfelelő szakasz, aláhúzott betűvel: az EGER gén egy részletével komplementer szekvencia, fekete alapon fehér dóit befő: a vektor szekvenciában az OEP során kicserélt nukleotidk t'GGGTGCZGrTG tFWCAOCAGAGATGTTGAGAG AGGGQOCAGAGCTGr jGTAATACGACTCAGTÁTAGGGGATATGÁGSTGGArrGGCAaATAATGACCGCCACACA GGA4AGCAG

Fúz/bf n ampOtádő; A paraffinba ágyazott formalin-fixált mintából izolált, töredezett DNS-t tartalmazó mintákon, a fúziót megelőzően PCR arnplifíkációt végeztünk, A PCR csak a használt primereket illetően különbözött az első példában alkalmazott reakciótól, A förward primer szekvenciája: tctctstcatagggactctgga

GCCATGGACCCCCACAC (SEQ ID NO: 23), a reverse

MO; 24) volt, A PCR eredményeként az alábbi 147 bp hosszú amplikon (SEQ ID NO:

25) képződött (szürkén satírozva a forward primőrnek megfelelő és a reverse primerrel komplementer szekvenciák, aláhúzva; a forward spacer-mplekula templátspecifikus részének megfelelő és a reverse spaeer-mofekuia temptátspeclfikus ré20 szével komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér betűkkel: a legjelentősebb EGFR 19-es exon mutációk által érintett helyek):

TCkteTGTCArtG^GGACTCTGGA3CGCAGAAGGTGAGAAAGTGAAAATTCGCGTCGCGATCg ^CGAGGGGAGTTTCTGGT

GAATTAAGAGAAGCA

GC T'GTGTGGGGGTCCATGGCC

Spacer mp/ekp/ák· fuzíonáftatása: A spacer mateké leírt PCR reakciót alkalmaztuk a fúzió során génszakasza nem tartalmazott mutációt, az alá ve, az első pet flben a minta vizsgált EGER1 315 be hosszú fúziós termék (SEÖ ID NO: 28} keletkezett (szurkán satírozva a forward primernek megfelelő és a reverse primőrrel komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér dőlt betűkkel: az

M13F szekvenálő primernek megfelelő, illetve az MÓR prímemet komplementer szekvenciák, aláhúzva: a íorward spacer molekula templátspecífikus részének megfelelő és a reverse spacer molekula templátspecífikus részével komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér normái betűkkel: a legjelentősebb EGFR mutációk által érintett helyek):

ATT\A?tGTTGGGTAA.GGGC.AGGG^Í?T^:r':rc:CCAGTr:AGGACG''ll^gSMMM^^R<S:-Gv^,r

TGTAATACÖACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGT

Oztcgatgtgagtttg^gctttggtcwtgggggtcattatttgccatccacgtgatatcc

CCT.ATAGTGAGTGGTATTA

AGCTCTGGCCGGTG'TCTCtkA

AATCT

A fez/ós termék szék verte,'ása: A szekvencia-analízis az 1. példában leirt módon tör10 paraffinba ágyazott íprmáltn fixált mintából Izolált, töredezett DNS-t tartalmazó Izolálom esetében sikeresen elvégeztük a szekvencia-vizsgálatot.

.á£dááZzE?Gfekutek_c/öákdasa; A diagnosztikai reverse spacer-molekulát állítottunk aló, az első :t ts egy íorward es egy teírt módon, az alábbi módosításckkak Az OEP reakció során a forward spacer-molekulák esetében ez Mi3F primertőí 3’ irányba az EGFR génnel komplementer szakaszt és a restrikciós hasításhoz szükségesek további nukleotldokat az alábbi reverse príménél (SEQ ID NO: 27) illesztettük a pCR2,1 -TÖRŐ vektor-szekvenciához (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az EGER génrészlettel egyező szekvencia, dőlt betűvel: a vektor-szekvenciával komplementer szakasz):

GAGGGGGCGCTGGGCAAAATGTGTGATCTTGACATGGC7AGAGGGCCCAA^mGC A reverse spacer-molekoiák esetében ehhez az alábbi reverse prímért (SEQ ID NO: 23) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az EGFR génrészlettel komplementer szakasz, dőlt betűvel: a pENTR/HI/Tö vektorrésszel egyező szekvencia):

CT^WGGATGCAGAAGGAGGCAAAGGTGGOTGGáGCGOAZAGCC

A forward spaoer-molekólák esetében a pOR2,1-TGFÖ vektor-szekvencia másik oldalára a restrikciós enzim hasítási hely kialakításához az alábbi forward prímért (SEQ IP NO: 23) használtuk (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, dőlt betűvel: a vektor-résszel egyező szekvencia):

CTGCGGCCGCTGGCCAGCGATWiGTWGGAaACGC

A reverse spacer-molekulák esetében ehhez az alábbi forward prímért (SEQ· ID NO: 30) használtok (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, dőlt betűvel: a pENTR/H 1ZTO vektor-résszel komplementer szekvencia):

GATGGCCAGTGCAATGTZfeGAGCAGAGAGTTGG

A resínkeős hasításhoz a mindkét oldali spacer-molekola esetében az lüííeNi enzimet használtuk,

A restrikciós hasítást kővetően létrejött íorward spacer-molekula szekvenciája (SEO ID NO: 31) (131 bp, a szürkén satírozott rész a forward ampíifikálő prímernek megfelelő; rész, fekete alapon fehér betűkkel jelölt rész az M13F szekvenáió prímernek megfelelő szakasz, aláhúzott betűvel EGER gén egy részletével komplementer szekvencia):

CCAGrlCfeTmAAGTTGGGTJBvCGGGAGGGTmpTCCCAGTCAGGACG'TM^MgjMiM g5AATTGTAAT.AGGACTCACTATaGGGCGAA?TGGGCCGTCTAGGCATG7CAAGA7CACAG

ATTT7GGA restrikciós hasítást követően létrejött reverse spacenmolekula szekvenciája (SEQ

ID NO: 32) (127 bp, a szűrkén satírozott rész; a reverse ampiíhkáló prímernek megfe22 lelő rész, fekete alapon fehér betűkkel; az M13R szekvenáló primőrnek megfelelő szakasz, aláhúzott betűvel; az EGFR gén egy részletével komplementer szekvencia);

CGAGI'GeAATGTAACATCAGiiiilliBiBeBiiOGBWGC'tGCi

HA Lóvkcíivi OAű. λ Al Α\-^ίρΛ>ΑÍ7*i-á CAGk- A i-Π AskA- λΛ.Λ.. j. 1-u A ksVM

A O\.ő

Fúz/óf megelőző PCR emplifÍkááó: A paraffinba ágyazott formalin-ílxált mintából izolált, töredezett DNS-t tartalmazó mintákon, a fúziót megelőzően PCR amplifikációt végeztünk, A PCR csak a használt primereket illetően különbözött az első példában alkalmazott reakciótól. A forward primer szekvenciája: gaaaacaccgcaggatgtg (SEC ID NO: 33), a reverse primer szekvenciája: aaaggcacctccttactttgc (SEC ID no, 34) volt. A PCR eredményeként az alábbi 107 bp hosszó amplikon (SEQ ID NG: 35) képződött (szürkén satírozva a forward primőrnek megfelelő és a reverse primerrel komplementer szekvenciák, aláhúzva: a forward spacor-molekula eeiílkus részének megfelelő és a reverse spaoer- molekula tátspeciflkus részével komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér betűkkel;

a legjelentősebb EGFR 21-es exonban lévő mutációk helyei);

gaaaacagcggagcatgtcaagai'cacagattttgggcBggcca.aacígctgggtgcggaag ΑΟΑΑΑαΑΑΤΑΰ€ΑΤ00ΑδΑ^0^^ΒβίΒΐΙΙΙΙβ|||βΙ

Oafása; A spaeer-molékulákst kicserélve, az első példában leirt PCR reakciót alkalmaztuk a fúzió során. Amennyiben a minta vizsgáit EGFRgénszakasza nem tartalmazott mutációt, az alábbi 288 bp hosszú fúziós termék (SEQ ID NG: 26) keletkezett (szürkén satírozva a forward primernek megfelelő és a reverse primerrel komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér dőlt betűkkel; az M13F szekvenáló primernek megfelelő, illetve az M13R primőrrel komplementer szekvenciák, aláhúzva: a forward: spacer molekula tempfátspeciflkus részének megfelelő és a. reverse spacer-molektra templáfspeeifikus részével komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér normál betűkkel: a legjelentősebb EGFR mutációk által érintett helyek):

ATTáUkGTTGCklTAACGGCAG^TTTTGCCAGTCAGGA.C^^rg^M^ggr^MlíSART

GGTAATACGAGTGACTATAGGGGGAAPGGGGGGCTCTAGGCAmGTCAAGATCACAGATTTTG

GQCSgGCCAAACSgCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAA.GTTGCC'

ATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAC

3CAGCTC

TÖGCCCGTGTC7CA?^ATCT

A álz/os termék szekvená/ása: A szekvencia-analízis az 1, példában leírt módon történ f.

paraffinba ágyazott formaíin fixált mintából Izolált, töredezett DNS-t tartalmazó izolálom esetében sikeresen elvégeztük a szekvencia-vizsgálatot.

A Hl Nt influenza gyógyszerhafásf befolyásoló génréglóínák vizsgálatának megtervezésekor az 1977-től 2005-ig előforduló H1N1 influenza vírusok génszekvenciáiból Indultunk ki. Az, így beállított assay az 1977401 2008-lg előforduló összes Influenza detektálására képes. Míg az első 3 példa esetben mindkét oldalról spaoer-t fuzionálfaliunk az am pl ikonokhoz (így ezekre a rendszerekre érvényes az 1, ábra), az influenza neuramlnídáz génjének vizsgálata során ez: csak az egyik oldalról történt még (ezt a 4. ábra szemlélteti). A másik oldalon overlap fúziót végeztünk a 2 neuramlnídáz génrégiö között átfedő szekvenciákkal, melyeket a másik régióba túlnyúló prímerekkel hoztunk létre, még a fúziót megelőző PCR ampliflkálás során.

A spaeer molekula előállítása: A diagnosztikai rendszerhez itt egy forward spaeer molekulát állítottunk elő, az első példában leírt módon, az alábbi módosításokkal. Az ÖEP reakció során az M13F primerfől 3^S Irányba az NA génnel komplementer szakaszt és a restrikciós hasításhoz szükségesek további nukleotidokat az alábbi reverse primerrel (SEQ ID NO:37) illesztettük a pCR2,1-TOPÖ vektor-szekvenciához (szürkén satírozva: a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az NA génrészlettel egyező szekvencia, dőlt betűkkel: a vektor-szekvenciával komplementer szakasz); GATTTAAAAACATCTCCTTTGGAGCC CTAGAGGGCCCAA TTGGG

A pCR2,1-TOPO vektor-szekvencia másik oldalára a restrikciós enzim hasítási hely kialakításához az alábbi forward prímed (SEQ ID NO;38) használtuk (szürkén sati'~ rozva: a restrikciós enzim hasáé helye, dőlt betűkkel: a vektor-résszel egyező szekvencia);

CATTTAAAGCÖA/J’Z’AAGTTGGGr.AACűC

A restrikciós hasításhoz a Orsi enzimet használtük, A gél-izolálás során a -6//g (4 weil) spacer molekulát egyedül gyűjtöttük be az 1 ml vizes oldatba.

A restrikciós hasítást követően létrejött spacer molekula szekvenciája (SEG ID NO: 39) (128 bp, a szürkén satírozott rész a torward ampllfikáló primernek megfelelő rész, fekete alapon fehér betűkkel jelölt rész az M13F szekvenáló primernek megfelelő szakasz, aláhúzva az HA gén egy részletével komplementer szekvencia): .Vfo.GCGATTAAGTTOÖGTAlkCGCCAGGSTTTTCCCzSGTC/SC.GACGT^illlllllg^g IjGAATTGTAATACGÁeTeACTATAGGGCGAATTGGGGeCTCTAGGGCTCeAAAGGAGATGT

Fúziót mepe/ező PCR amp^káefó; Áz RNS izolálását követően, RT-PCR-t alkalmaztunk. A Gíagen cég GneStep RT-PCR Klt-jét használva, a reakció-oldat 1 x-es koncentrációjú puffért, egyenként 400 /ΛΊ dNTP-t, ö,Q4/Ayu! enzim mixel, 0,6-0,6 /Al forward és reverse prímért, 0,1 U/pi RHasin Píus RNAse lnhibíiorf-1 (Promega) tartalmazod. Az RT-PCR az alábbi eíktosokaf tartalmazta:

1, ciklusúi x) 2. clklus;(1 x)	1, lépés	Ső'C 30p Oömp 9SöClSpÖÖmp
3. clklus;(40x)	1, lépés	94°C Op 3ömp
	2. lépés	56°C Op 30mp
	3. lépés	?4C Op 45mp
4. ciklusúi x)	1, lépés	?2°C top Oömp
5. ciklusúi x)	ί 5 >	4cC *

Az NA gén két régióját külön reakcióban amplífikáltuk. Az első génrégró areplífikáelőja során az alábbi primereket használtuk:

ard: AAGACAACAGCATAAGAATGGGGTGe (SEG IG NO Reverse (vastag dőlt betűvel: a másik gén régióval kompi CTATTSATTTGGiAGCTTGACCTAGAGGACASCTCAtTA (SEG emeuter rész): tO NO: 41) ,vard

A második génrégió amplifikáeiöja során használt primerek:

lóit betűvel: az első génréglöval komplementer HAATCAATAGAGT-TGAATCCACCCAAT (SEG IO ; GGATTGTCACCGAACACTCGACT (SEG ÍD NO

Ας első génrégfő amplifikációjának eredményeként az

Bkon (SEQ ID NO: 44) képződött (a Solomon lsSands/3/2006 vírus >~et élő es a reverse pnvé ve; szürkén satírozva a merre! komplementer szekvenciák,, vastag dőlt betűvel: a lementer rész aláhúzva: a spacer molekula tempiátspeciíikus részének megfelelő szekvenciák, fekete alapon fehér betűkkel: a legjelentősebb neuraminidáz-gáifókkai szembeni rezisztenciát okozó mutációk helyei):

AAGACÁACAGCATAAgMTT^TCCAAAGGAGATGTTTTTGTCATAAGTlS^iCCTTTCA'rA

TCATGTTCTCACTTGGAATGCAGAACCTTTTTTCTGACCCAAGGTGCTCTATTÁAATGACAA.

ACvVimCAAATGGGACCGS’AAAr^^^gAGTCCIGGVrAGGACCTTAATGAGCTGTCCTCTAG

GGGAJáGCTCCAAATCA&TAG

A második génrégió ampíííikációjának eredményeként az alábbi 196 bp bosszú ampllkon (SEQ ID NO: 45} képződött (a Solomon ls!and$/3/20Öő vírus PN-S-ét templátként véve; szürkén satírozva a forward primernek megfelelő és a reverse prímeméi k lementer szekvenciák, vastag dőlt betűvel: a másik génrégióval komplementer rész, fekete alapon fehér betűkkel: a legjelentősebb neuramlnldáz-gátlókkal szembeni rezisztenciát okozó mutációk helyei):

^TGAA^CTCeAíáAOCAATAGAGTGGAATGCkX’CCAATTTT^gTATGAGGAATGTS’CCTG'r

TACCCAGACACTGGCACAGTGATGTGTGTATGCSjKBGMjSSfeGGCATGGTTCA&ATCGACC

T?GGGTGT€T?TT;<aTG.AAAAC?TGGAT^:IATCAAATAGGATACATCTGCAG'TGGAGTOTGG

GTGZvCAATGC

Spacer mo/eáu/e és a két pénréq/ó amp&kon/ámak (nzfoná/fafeha; A fúziót megvalósító PCR-oldát AccuPrime Tag HIFI DNS polimerázt (Invitrogen, 0,02 U/pl), Ix-es ί-es AccuPrime PCR puffért és 0,4 pM koncentrációjú forward prímért (SEQ ID NO: 46) (ATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTT) és reverse prímért (SEQ ID NO: 47) (cactccactgcagatgtatcctattt) tartalmazott, A térfogat egyik ötödét az. egyik génréglo ampiíkonjaít, egy másik ötödét a másik génréglo ampiíkonjaít tartalmazó PCR oldat fÖÖx-os hígítása, a harmadik ötödét pedig: a spacer molekulák gélizofátema adta. A Solomon lsNnds/3/2006 vírus RNS-ét templátként véve, amennyiben a minta nem tartalmazott Nl-rezisztencia mutációt, az alábbi 448 bp hosszú fúziós termék (SEQ ID NQ: 48) keletkezett (szürkén satírozva: a forward primőrnek megfelelő és a reverse pumerrel komplementer szekvenciák, fekete alapon fehér dőlt betűkkel: az M13F szekvenáiő primernek megfelelő szekvencia, aláhúzva; a forward spacer molekula tempfátspecifikus részének megfelelő szekvencia, fekete alapon fehér normál betűkkel: a legjelentősebb neuramínidáz-gáflókkal szembeni rezisztenciát okozo mutációk helyéi):

ATT^C^C^TAACvXOTGSOTTTCCCAGCCACGAC'ÍTHBBBBIHHBB⁰^'

TGTxAATACGAC^:rCACTATAGGGCGAAT^fPGG^!GCCCTCG'AGGGCTCGAA,AGGAGATG^,TT7T7G7 cataaga!

gCCTTTCATATCATGTTCTCACTTGGAATGCAGAACeWTTTTCTGACCCAAG GTGGTgTATTAAATGACAAAGAT7GAAATGGGACCG^:rASAGgMÍfe.GTCCTTATAGGACC TTAATGAGCTÖTGCGCTAGGTGAAGCTCCAAATCAATAGAGTTGAATGCAGGCAATTTT TATGAG(SAATgTTCCTGTTACCCAGACAC?GGCACAGTCATGTGTGTATGcMbA<^BSTG GCATGGTTC,4AATCGACCTTGGGTG7C?TTTAATC;G7GN?TTGGAT7ATCAAATAGGATAGA

Λ X, i. Wk-itw ~ b-JÍ-iW i Ό .4 fuz/ós termek szekvená/ása: A íerward irányú terminálé reakciót az M13F primerrel. míg a reverse irányút a termék fúziója során használt reverse primőrrel végezi

-analízis egyéb kondíciói megegyeztek az 1. példában leír

A szekvencia-vizsgálat működésének hatékonyságát 4 influenzavírust tartalmazó mintán ellenőriztük: 2 köpetet vizsgáltunk (nomenklatúránk szerint; ATI és AT minta), amelyeket 2008 elején vételeztünk 2, az akkori (a 2000-os salamon-szlgeteki vírus-variáns által okozott) influenzajárványban fertőződött betegből, A 3, és a 4 minta az Omninvest cég által előállított, Fiúval AB és Fiúval P injekció, amely embriónál tyúktojáson eiszaporított három, illetve egy influenzatörzs tisztított és koncentrált, formaldehiddel inaktivált, aluminiumfoszfát gélhez, adszorbeált szuszpenziója. A Fiúval AB egy 2007-es H1N1-es (A/Brisbane/59/2007), egy 2007-es H3N2~es {A/Uruguay/716/2007) és egy 2008-as tnfuenza 8 törzset tartalmaz, A Fiúval P egy új típusú Hl NI influenza A vírust (A/Csíifornia/7/2QÖ9) tartalmaz.

Míg a 2009~es influenza esetében a fúziót megelőző RT-PCR sikertelen volt, mindhárom 2008-Pan vagy azelőtt Izolált H1N1 vírust tartalmazó minta esetében hatékonyan működött (5. ábra). Mindhárom esetben a fúzió is sikeresen lezajlott. A Fiúval AB-s minta esetében a fuzionált génszakaszok szekvenciája teljes mértékben megegyezett - az NCBI adatbázisból letöltött - A/Brisbane/59/200? neuramlnidáz génjének megfelelő génrégióinak bázissorrendjével. Az ÁTL és az AT minta esetében nagy volt - szintén az NCBI adatbázisból letöltött - az AZSolomon lslands/3/2006 neuraminidáz génjével a homológla, csak néhány nukleotidnyi eltérést tapasztaltunk.

amely nem érintették a neuraminidáz gáttó (Ni) rezisztencávaí összefüg;e hozott hot

A 2009-ben megjelent új típusú H1N1 Influenza 337 variánsának neuraminidáz génjét megvizsgálva a korábbi variánsoktól nagyfoké eltérést tapasztaltunk, Ezért a 337 génszekvenciát felhasználva az új típusú H1N1 influenza kimutatására optimalizált assayt terveztünk, amely csak a primerekben és a spacer templátspecifikus részeiben tartalmaz néhány nukleotidnyi eltérést az előbbi példában leírt vizsgálathoz képest.

A spacer mo/eku/a e/őá/tításs: Az ÖEP reakció során az M13F primertől 3’ irányba az NA génnel komplementer szakaszt és a restrikciós hasításhoz szükséges további nukleotidokat az alábbi reverse primerre! (SEQ ID NO: 49) Illesztettük a pCR2.1TOPO vektor-szekvenciához (szürkén; satírozva; a restrikciós enzim hasító helye, aláhúzva: az NA génrészfettei: egyező szekvencia, dóit betűvel: a vektorszekvenciával komplementer szakasz);

GATtb.VGKCACATGCOCCl ZuGAACCC'rA<?AGG?CCC.-t-dTeJC Iára a

A pCR2,t-TOPO vektor-szekvencia másik oldalara a restrikciós enzim kialakításához használt primer, Illetve a spacer molekula előállításának sel megegyeztek a 4. példában leírtakkal

A restrikciós hasítást kővetően létrejött spacer molekula szekvenciája (SEQ ID 50) (128 bp, a szürkén satírozott rész a forward ampllfikálő primőrnek megfelelő rész, fekete alapon fehér betűkkel jelölt rész az M13F szekvenáló primernek megfelelő szakasz, aláhúzott betűkkel sz NA gén egy részletévei komplementer szekvenAAA,GCG.A7iódkdTTr?CkW.AS<GGCCAGGGTTTTGCCAGTCAC<.AAC:G^Ír|eiili^Heil ||GAAT7G:TAATAGGAC4'GACTATAGGGCGAA7TGGGGCeTGTAGGGTTCMAAGGíXíGATGT

GTTT

Foz/ót mepe/őző RCR amp/iékáoló: Az RNS izoiátumon végzett RT-PCR csak a használt primereket illetően különbözött az első példában alkalmazott reakcióktól

Áz első génrégió ampllfíkáeioja sörén az alábbi primereket használtuk;

Forwaró: AAAGACAACÁGGATAÁGAATCGGTTCCÁ (SEQ © NO: 51}

Reverse (vastag dőlt betűvel: a másik génrégióval komplementer rész);

ÍGAA.CTTCA.CCAATAGGACAGCTCATTA (SEQ IQ Ní

A második génrégió ampiif ikáciőja során használt primerek·, forward (vastag dóit betűvel: az első gén régióval komplementer rész):

GkSZ^AASTTCCAAATCAGTCGAAATGAATGGGCC

Reverse: ggattgtctccgaaaatgcCzXCT (SEQ ID NO: 54)

Az első génrégió ampilílkgelőjának eredményeként az alábbi 207 bp hosszú amplikon (SEQ ID NQ: 55) képződéit (a Cahfornía/07/2009 vaus RNS-ét templátkénf véve: szürkén satírozva a forward primőrnek megfelelő és a reverse primerrei komplementer szekvenciák, vastag dőlt betűvel: a másik génrégíóval komplementer rész, aláhúzva: a spacer molekula templátspecifikus részének megfelelő szekvenciák, fekete alapon fehér betűkkel: a legjelentősebb neuramínidáz-gátlőkkal szomneni rezisztenciát okozó mutációk helyei):

AAAGAC2>ACAG^frGTAAGAATCGGT7GCAAGGGGŰATG?GT7?GTCA?AAGCgiCCA?TCA?

ATCATGGTCGCCCTTGíSAATGCAGAACCTTCTTCTTGACGGAAGGGGCCTTGCTAAATGACÁ

AACATT-CCtoVrGGAAGCATTAAA^^WlAGCCCATATCGAAGCCTAATGAGCZGTGCTATT

A második génréglc amplitlkáciojának eredményeként az alábbi 196 bp hosszú amplikon (SEQ ID NQ; 55) képződött (a Calífornia/07/2009 vírus RNS-ét fempláfként véve; szürkén satírozva a forward primőrnek megfelelő és a reverse primerrei komplementer szekvenciák, vastag dőlt betűvel: a másik génrégióval komplementer rész, fekete alapon fehér betűkkel: a legjelentősebb neuramínidáz-gátlókkal szembeni rezisztenciát okozó mutációk helyei):

rWdAArgTTCgAAATCAGTGGAAAGGAATCmCGCTAATTAllMTAZGAGGAATGCTGCGGT

T%rCCTGATTGTAGTGAAATCACA?G?GTGTGC^feA4^STGGCATGGCGGGAATGGAGC

GTGGGTGTeTTrGAACGAGAATCGGGAATAGGAGATAGGATAGATATGClI^^lllllli

ŰAGACAATCC mo/e.k,o7a és érnépté ampBon/á/oak fbztenaitetasa; A fúziót megvalósító PCR csak a reverse prímért (aatgcgactgcagatgtatgctatcg) (SEQ ID NO:

57) illetően különbözött az 4. példában használttól. A Californía/07/2003 vírus RNSét templátkénf véve, amennyiben a minta nem tartalmazott NI-rezisztencia mutációt, az alábbi 448 bp hosszú fúziós termék (SEQ ID NO: 58) keletkezeti (szürkén satírozva: a forward primőrnek megfelelő és a reverse primerrei komplementer szekvencl.

fekete alapon fehér dőlt betűkkel: az M13F szekvenáló primőrnek megfelelő szekvencia, aláhúzva: a fc-rward spacer molekula femplátspeclfikus részének megfelelő szekvencia, fekete alapon fehér normál betűkkel: a legjelentősebb neuramlnidázgátlókkai szembeni rezisztenciát okozó mutációk helyei):

TGTAATrXCŰACTCACTATAGGGCöAATTGGGCCCTCTAGGGTTCCAAaSGGGATGTGTTrGT CATAAC

ΟθηθΟΤΤΟΟ^!ΓΑΆΑΤ(;ΑΓΑΆΑΟΑ?ΤΖΟΑΆ?η··;ΑΑ<·Λ::ΑΤΤΑΆΑ»^^ΆΟΓΟΓ:ΑΊ7·ητ:ΟΑΆ€0

GTAA7GAGCTGTGCGA7TGGTGAAG7C'eCAAATC:AGTCGAAATGAATGCCCGTAATTAT|||:

GArGAGGAATGCTCCTG?TATGCTGA?TGTAGGC:AA?G^;CACATGTGTGTGC^feAG^^TG

GCATGGCTGGAATCGAGCGTGGGTGTGTTTCAACICHWZGkTCTGGAATATCAGATAGGATACA

TATGCAG'XSGGGATT .A fuz/os rermék szekveoá/ása: A forward irányú termináló reakciót az M13F primerrel, míg a reverse irányút a termék felőle során használt reverse primerrel végeztük. A szekvencia-analízis egyéb kondíciói megegyeztek az 1. példában leírtakkal.

Az új típusú H1N1 neuraminidáz génrégióit vizsgáló módszert az Omnimvest cég által előállított Fiúval P oltásból izolált RNS esetében teszteltük. Az oltás az új típusú A/Caiiíorraa/7/2Qö9-es vírus inaktivált tormáját tartalmazta. A vizsgálati módszer ez esetben is hatékonyan működött (6. ábra). A fúziós termék vírus-specifikus szekvenciái megegyeztek - az NCBI adatbázisból letöltött - A/California/7/2009 neuraminidáz génjének megfelelő génrégióinak bázissorrendjével.

A találmány szerinti módszer esetében az allét bias csökkenését, és ezzel együtt a szenzitivitás növelését az alábbi modellen sikerült igazolnunk.

Módszer:

Patoiógusi szakvélemény alapján 30% tumor-arányt tartalmazó FFPE-mlnÍáböl DNSi izoláltunk. A mintában 2 független (hagyományos) PCR reakciót követő szekvenciaanalízissel detektáltuk az EGFR gén 21?-es exonjának 2573T>G=LS58R pontrnutacsójáí fa mutáns alléi átlagos gyakorisága 50% volt). A mintát a hagyomáegylépcsős g (a ΙΟχ-ére) hígrtotfok, A hígított mintán a hagyományos (normál PCR-t követő nested PCR) és a találmány szerinti új módszerrel fe 10-10 párhuzamos mutációs vizsgálatot végeztünk.

A hagyományos PCR során az első ampffikáció során az alábbi primereket alkalmaztuk: forward: tact-tggaggaccgtcgcttg (SEQ ID NO',59), reverse (SEQ IO NO: 60): ggzgcctggtgtcaggaaaaL· A reakciót kővetően az oldatot a 25x-ére hígítottuk, maid a nested PCR-elegy ötödének megfelelő térfogatban alkalmaztuk. A nested PCR során az alábbi primereket alkalmaztuk; forward (SEQ ID NO: 61): AGCCRGGAAGGTACTGGTGAAAAC, reverse: GCTGGCTGACCTAAAGCCACCT (SEQ ID NO: 62). Minőkét PCP oldata az egyéb paramétereket illetően megegyezett az 1. példa spacer-molekula előállításánál leírtakkal. Az új módszerrel történt vizsgálatok során a 3. példában leírtak szerint jártunk el. A két módszerrel előállított amptíkonok szekvenciái az 7, ábrán láthatóak, A két módszer végtermékeinek szekvenálása megegyezett Az allélvariánsek jelintenzitását az eléktro-forogrammokról leolvasott értékek adták.

Az esszehasoniltó-vizsgáiat eredményei a 8, ábrán láthatóak, A hagyományos nested PCR során az első PCR-t követően 8/10 csőbén volt gélképen látható termék, a nested PCR mind a 10 csőben gélképen látható terméket eredményezett. Az új technikát alkalmazva az eloamplifikációs PCR után mind a 10 csőben gélképen látható termék keletkezett. Mind a 10 terméket, sikeresen fuzionáltattuk a 2. lépcsőben.

A 2 módszer 10-10 termékét mindkét irányból sikeresen szekvenáltuk, A hagyományos módszerrel 5/10 esetben jelent meg (4 esetben 100%-os allél-arányban) a mutáció, a szenzitivitás tehát itt 56% volt, A mutáns jel allél-aránya átlagosan 42%, az arány szórása 50% volt. Az új módszerrel a mutáció 9/10 esetben jelent meg, ami 90%-os szenzitivitásnak felelt meg. Míg a mutáns jel átlagos allél-aránya itt is 42% volt, az arány szórása már csak 23% volt.

Claims (19)

1. Szabadalmi Igénypontok

   1. Eljárás töredezett nuklelnsavak szekvenciájának meghatározására egy eélszekvenola POR ampilttkáclöjával és az ezt követő dldezoxl-szekvenálással, amely a következő lépeseket tartalmazza;

   aj a szekvenálandö nokleinsavaí vagy nukleínsavaí tartalmazó sejteket elkülönítjük egy biológiai mintából

   e) sgy FCR-reakelöl kivitelezőnk a célszekvencía fuzionálására és empllttkálására, amelyben egy vagy több olyan mesterséges, 70-220 bp hosszúsága spaoenmoiekoiát alkalmazunk, amely 73 Irányban egymást komio-m egm ·-. mugatta kommemenk·' szak-mm, egv isgaiabo 3e legfeljebb 120 ep távtartó szakaszt, egy szekvenáló primerrel komplementer szakaszt és egy ampiíííkáíő primerrel komplementer szakaszt tartalmaz, és el az így kapott PCAttermékek adott esetben tisztítás után, szekvenáíiuk.
2. 2, Az 1, Igénypont szerinti eljárás, ahol a b) lépésben olyan spacer molekulát alkalmazónk, amelyben a templáttal komplementer szakasz 20-30 bp, a szekvenáló príménél komplementer szakasz 15-40 bp és az amplifikáló príménél komplemenier szakasz 15-40 bp Hosszúságú.
3. 3. Eljárás töredezett nuklelnsavak azonosítására egy eéiszekvencla kétlépcsős PCA ampíifikáeiöjávaí és az ezt követő őldezoxl-szekvenálással, amely a következő lépéseket tartalmazza:

   aj a szekvenálande nuklelnsavat vagy nuklelnsavat tartalmazó sejteket elkülönítjük egy biológiai mintából.

   b) egy első PCRneakrzot kivitelezünk a célszekvencía amplltlkáiására, sj ezt követően egy második PCR-t kivitelezünk az amsükön fuzionálására és ampükkálására. amelyben egy vagy több olyan mesterséges, 70-220 bp hosszú epaeer ÖNS-molekulát alkalmazunk, amely ö'm' Irányban egymást követően egy, az amplikonnai komplementer szakaszt, agy legalább 20 legfeljebb 120 bp távtartó szakaszt, egy szekvenátő primőrrel komplementer szakaszt és sgy amplifikáló primerrel komplementer szakaszt tartalmaz, ahol az ampiAonnai kompiemenfer szakasznak megfelelő szekvemna ö'-vége a templát ölMS-en Ö-7ö öp-rai távolabb kezdődik S’-kényban, mini az amplifikáló prlrnerrei komplementer szakasz ö'-vége, és dl az Így kapott PCiá-termékeh adott esetben tisztítás után. szekvenaüuk.
4. 4. A 3 igénypont szerinti eljárás, ahol a ej lépesben olyan spacer molekulát alkalmazunk. amelyben a templállai komplementer szakasz 20-30 bp. a szekvenáló primőrrel komplementer szakasz 15-40 bp és az ampllhkáSö prlmerrei komplementer szakasz 15-40 op hosszúságú.

   5, Az 1. vagy 3, Igénypont szerinti eljárás, ahol az a j lépésben a szekvenálandö nukleinsav Iz omlása elhagyható. 6. Az 1. vagy 3 igénypont ezer inti eljárás, abof az a ) lépésben a s ze kvená 1 a ndö n oki e irma va t Izoláljuk a biológiai mintából 7. Az 1. vagy 3, igénypont szerinti eljárás, ahol az a ) lépésben a

   szekvenáíandó nuklelnsavat tartalmazó sejteket különbjük el a biológiai mintából
5. 8. A 7. Igénypont szennti eljárás, amelyben az elknienitést lézer mlkrodisszekclöval végezzük,
6. 9. Az 1. vagy 3 Igénypont szennti eljárás, ahol a bt vagy ej lépésben alkalmazott spaser-molekala egyszálb vagy kétszáló: DNS.
7. 10. Az 1. vagy 3. Igénypont szerinti eljárás, ahol a bj vagy c) tépésben egyetlen spaoemmoieteiát alkalmazunk.
8. 11 Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a bt vagy ej lépésben két, egy tonnám és egy reverse spacer-nvdekulal alkalmazunk.
9. 12. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a b) lépésben egy második, nesied PCR-t Is kivitelezünk.

   10. Az = -12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a d> lépésben a szekvenálást a PCRAermek Usztkása étén végezzük.
10. 14, Spaoer-moleknia az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljáráshoz, amely 70 - 220 bp hosszúságú és 3^S-5^S irányban egymást követően tartalmaz:

    -- egy, a eétszekvenola egyik vegén iává tompját nuklelnsavval vagy amplikonnat komplementer szakaszt (20-30 bp), egy legalább 20 -· legfeljebb 120 bp távtartó DNS-szakaszt. amely az előbb; szakasszal együtt biztosítja, hogy a szekvenáló primer S’-vége megfeleld, több * ν \ ο ' η ^Λ r a a χ e- ?' t \ ? mm \ m ? . ?' e r

    - egy szekvenáló primőrrel komplementer szakaszt (
11. 15-40 bp) és

    - egy amptlflkáló prlmerrei komplementer szakaszt (15-40 bp), ;o. A 14. igénypont szenna spaoer-melekola, amely egyszála vagy keiszálü
12. 16. A 14. vagy 15, igénypont szerinti spaoenmoíekuia, amely forward vagy reverse «pacet-moiekula,
13. 17, Az 1-13. igénypernek bármelyike szerinti eljárás alkalmazásé génszenvekoták azonosítására töredezett DNS-t tartalmazó növényi, általi vagy e mbe ri szövőim ínfákban.
14. 18, A 17. igénypont szerinti alkalmazás HI.Nt influenza neoramírtidáz génjének azonosítására töredezett DNS-t tartalmazd emberi szövetmintában.
15. 19. Az 1-13, igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása meláoíök azonosítására öenenelszövelböl származó töredezett DbíS-míntákban,

    94 A Ά igenvpont sze; rt> mknim,mas kRA$ '-es omoröuv mutációk azonosítására,
16. 21 A 19, igénypont szenntl alkalmazás 3GFR 19-®s és/vagy 21 -es exomában előforduló műtérnek azonosítására,
17. 22. A 19, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a DNS-mmtak formailnnai nxáií sző ve le kböl sza rmazna k.
18. 23. Reagenskészíet az 1, Igénypont szerinti eljárás kivitelezésére, amely a használati utasítással együtt a kővetkezőket tartalmazza;

    - egy vagy több 14. igénypont szerinti spacenmoíekulát; vagy

    - egy vagy több 14, Igénypont szerinti spacermioiekuísí és amnkíikáio prlmereket a PCR-boz;: és adott esőiben a PCR kivitelezéséhez szükséges peilmerázl és reagenseket.
19. 24. Reagenskészíet a 3, igénypont szerinti eljárás kivitelezésére, amely a használati utasítással együtt a kővetkezőket tartalmazza;

    • 49? vagy több 14. Igénypont szerinti spacer-moiekeíát: vagy egy vagy több 14. igénypont szerinti spacoi-molekulát és ampilfíkátö prlmereket a fuzionáló PCR-boz; vagy

    - egy vagy több 14, Igénypont szenntl spacer-moiekuiát amplmkálo prlmereket a fuzionáló PCR-boz és ampllflkálö prlmereket az első ampllfikálö PCR-boz; és aöoti esetben a PCR-reakeiokhoz szükséges poíímetázokai és reagenseket.