JP6876785B2 - 単分子配列決定のための一本鎖環状dnaライブラリーを生成するための方法 - Google Patents
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Description
[0012] 以下の定義は、本開示の理解を助ける。
(a)標的核酸を含む試料を提供し;
(b)試料を少なくとも1つの二重鎖領域および少なくとも1つの非二重鎖領域を形成する2つの鎖を含むアダプター分子と接触させ、その非二重鎖領域は、少なくとも1つのユニバーサルプライマー結合部位を含み;そして
(c)アダプター分子を標的核酸にライゲーションして少なくとも1つのユニバーサルプライマー結合部位を有する非二重鎖領域を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する。
その方法は、さらに以下の工程を含むことができる:
(d)ジョイント分子をDNAポリメラーゼ(鎖置換ポリメラーゼであることができる)およびプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させ;そして
(e)合成による配列決定によりユニバーサルプライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定する。
(a)標的核酸を含む試料を提供し;
(b)試料を、二重鎖を形成する2つの鎖を含むアダプター分子と接触させ、ここで、それぞれの鎖は、ユニバーサルプライマー結合部位を含み;そして
(c)アダプター分子を標的核酸にライゲーションして2つのユニバーサルプライマー結合部位を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する。
方法は、さらに以下の工程を含むことができる:
(d)ジョイント分子をDNAポリメラーゼおよびプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させ;そして
(e)合成による配列決定によりユニバーサルプライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定する。
[0063] この実験において、二本鎖標的DNAが、得られる。DNAは、インビトロで適切な大きさに断片化されるか、または天然に断片化されている。アダプターは、それぞれの鎖の上にプライマー結合部位を含む二本鎖分子である(図3)。アダプターおよび標的核酸分子は、単一のアダプターのそれぞれの鋳型へのライゲーションを有利にする200/1の相対濃度で存在する。標的核酸の両方の末端は、核酸ポリメラーゼにより埋められて平滑にされている。場合により、一種類のヌクレオチドが、アダプターの3’末端に付加され、相補的な一種類のヌクレオチドが、標的DNAに付加される。これらの工程は、KAPA HyperPlusキット(Kapa Biosystems、マサチューセッツ州ウィルミントン)を用いて実施される。単一のアダプターが、ジョイント分子を作製するためにそれぞれの標的DNAにライゲーションされる。単一の配列決定プライマーが、アダプターの両方の鎖上の同じプライマー結合部位に相補的であり、または2つの結合部位は、異なっており、それぞれは、2つのプライマーの一方に相補的である。配列決定は、配列決定機器の製造業者により意図されるように進行する。配列決定データは、UIDにより同定されるような同じ元の分子の一部の(全てではないが)コピー中に存在する配列決定バリエーションを排除することにより、エラーに関して修正される。配列決定データは、アダプター中に存在する2つのUIDを合わせることにより同定される単一の標的分子の両方の鎖からの配列データを用いてコンセンサス配列を得ることにより、さらに修正される。
[0064] この実験において、二本鎖標的DNAが、得られる。アダプターは、一本鎖領域に隣接する2つの二本鎖領域を有する二本鎖分子であり、ここで、それぞれの鎖は、ステムループ構造を形成している(図4)。アダプターおよび標的核酸は、実施例1において記載されたように処理およびライゲーションされる。単一のアダプターが、ジョイント分子を作製するためにそれぞれの標的DNAにライゲーションされる。単一の配列決定プライマーが、アダプターの両方の鎖のループ部分中の同じプライマー結合部位に相補的であり、または2つの結合部位は、異なっており、それぞれは、2つのプライマーの一方に相補的である。配列決定は、配列決定機器の製造業者により意図されるように進行する。
[0066] この実験において、二本鎖標的DNAが、得られる。アダプターは、鎖が互いにハイブリダイズしていない一本鎖領域に隣接する2つの二本鎖領域を有する二本鎖分子である(図5)。アダプターおよび標的核酸は、実施例1において記載されたように処理およびライゲーションされる。単一のアダプターが、ジョイント分子を作製するためにそれぞれの標的DNAにライゲーションされる。単一の配列決定プライマーが、アダプターの両方の鎖のハイブリダイズしていない部分中の同じプライマー結合部位に相補的であり、または2つの結合部位は、異なっており、それぞれは、2つのプライマーの一方に相補的である。配列決定は、配列決定機器の製造業者により意図されるように進行する。
102 標的核酸
104 環状分子
108 二本鎖DNA断片
108a プラス鎖
108b マイナス鎖
110 第1スプリントオリゴ
112 末端
114 環化された生成物
116 第2スプリントオリゴ
118 末端
120 環化された生成物
122 二本鎖DNA断片
122a プラス鎖
122b マイナス鎖
124 アダプター
126 二本鎖環状分子
128 プライマー結合部位
130 アダプター
130a 第1鎖
130b 第2鎖
132 ステムループ二次構造
134 二本鎖領域
136 一本鎖領域
138 プライマー結合部位
140 二本鎖DNA断片
140a プラス鎖
140b マイナス鎖
142 二本鎖分子
144 アダプター
144a 鎖
144b 鎖
146 二本鎖領域
148 一本鎖領域
150 二本鎖DNA断片
150a プラス鎖
150b マイナス鎖
152 二本鎖分子
Claims (13)
- 配列決定のための標的核酸を調製する方法であって、以下:
(a)該標的核酸を含む試料を提供する工程;
(b)該試料を少なくとも1つの二重鎖領域および少なくとも1つの非二重鎖領域を形成する2つの鎖を含むアダプター分子と接触させる工程、ここで該非二重鎖領域は少なくとも1つのユニバーサルプライマー結合部位を含むものであり、該アダプターが、少なくとも1つのステムループ構造に隣接する2つの二重鎖領域を含み、それぞれの構造が二重鎖ステム領域および非二重鎖ループ領域を含むものである;ならびに、
(c)該アダプター分子を該標的核酸にライゲーションして少なくとも1つのユニバーサルプライマー結合部位を有する非二重鎖領域を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する工程;
を含む、前記方法。 - さらに以下:
(d)該ジョイント分子を、好ましくは鎖置換ポリメラーゼであるDNAポリメラーゼおよび該プライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させる工程;ならびに、
(e)合成による配列決定により該ユニバーサルプライマーを伸長し、それにより該標的核酸の配列を決定する工程;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 該アダプターのそれぞれの鎖が1つのプライマー結合部位を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 工程b)の前に、該標的核酸の3’末端にヌクレオチドを、そして該アダプター分子の3’末端に相補的ヌクレオチドを、鋳型に無関係な様式で付加し、それにより突出末端を作り出す工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)の前に、該標的核酸および該アダプター分子を制限エンドヌクレアーゼで消化して適合する突出末端を生成する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)の前に、該標的核酸および該アダプター分子の3’末端をエキソヌクレアーゼで消化する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 該標的核酸および該アダプター分子がウラシル塩基を含有し、工程b)の前に該標的核酸および該アダプター分子を、ウラシル−DNA−グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼVIIIと接触させる工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 該アダプターが1以上のバーコード、好ましくはユニーク識別子(UID)、多重識別子(MID)またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 配列決定のための標的核酸を調製する方法であって、以下:
(a)該標的核酸を含む試料を提供する工程;
(b)該試料を、二重鎖を形成する2つの鎖を含むアダプター分子と接触させる工程、ここでそれぞれの鎖はユニバーサルプライマー結合部位を含むものであり、該アダプターが、少なくとも1つのステムループ構造に隣接する2つの二重鎖領域を含み、それぞれの構造が二重鎖ステム領域および非二重鎖ループ領域を含むものである;ならびに、
(c)該アダプター分子を該標的核酸にライゲーションして2つのユニバーサルプライマー結合部位を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する工程;
を含む、前記方法。 - さらに以下:
(d)該ジョイント分子をDNAポリメラーゼおよび該プライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させる工程;ならびに、
(e)合成による配列決定により該ユニバーサルプライマーを伸長し、それにより該標的核酸の配列を決定する工程;
を含む、請求項9に記載の方法。 - 標的核酸を配列決定するための組成物であって、2つの鎖を含むアダプターにライゲーションされた該標的核酸からなる二本鎖環状分子を含み、該鎖が少なくとも1つの二重鎖領域および少なくとも1つの非二重鎖領域を形成しており、該非二重鎖領域中のそれぞれの鎖がユニバーサルプライマー結合部位を含有し、該アダプターが、少なくとも1つのステムループ構造に隣接する2つの二重鎖領域を含み、それぞれの構造が二重鎖ステム領域および非二重鎖ループ領域を含むものである、前記組成物。
- さらにユニバーサルプライマーを含む、請求項11に記載の組成物。
- さらに鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼを含む、請求項11または12に記載の組成物。
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