HU227707B1 - Dna sequences coding for human ty protein related to interleukin-1 betha converting enzyme - Google Patents

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft

Az interleukia-ΐβ konvertáló eaaismel rokon szerkezetű Ty emberi fehérjét kódoló DNS-szekvenciák

A találmány tárgyát az interieukín-ΐβ konvertáló enzimmel rokon szerkezetű emberi Ty-fehérjét kódoló DNSszekvenciák képezik, valamint a Ty-fehérje, eljárás előállítására, a fehérjét tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint a fehérje gyógyszerként történő alkalmazása.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható ϊϋ-ΐβ-ra reagáló patológiás rendellenességek kezelésére, valamint olyan rendellenességek kezelésére, melyek esetén apoptözís játszódik le.

Az interleukin-ΐβ (IL-ΐβ) egy gyulladást okozó cítokin, amely olyan, többszörös akut vagy krónikus gyulladásos betegségek ontogenezisében játszik szerepet, mint például a reumatoid arthritis, a belek gyulladásos betegségei, vagy a szeptikus sokk (Dinarello és mtsai., Immunoiogical Review, 127, 119-146, (1592) .

Az emberi monociták és makrofágok az IL-l^-t egy 31 kD hosszúságú inaktív prekurzor (ρΙ.Ι.·-ΐβ) formájában szintetizálják. A pIL-lp-nak nincs hagyományos értelemben vett szignálszekvenciája, és a sejt csupán azután tudja hatékonyan szskretální, hogy a 116-os aszparaglusav és a ÍÍ7-es

Aktas zámunk: 851.16 -1748/PA *»# * * ♦ ♦ < * ♦

		.. ·? —	w « χ χ ♦ « « * * « » « « «< <k
alanín	közötti kötés elhass	idt. Ezt a	hasítást, amelynek	so-
rán az	aktív, 17 kD bosszús	ságű IL-Ιβ	keletkezik, egy sp
tikos	enzim, az ínterlsuk:	in-inét a	konvertáló enzim (	ICE)
végzi	•el (Thornherry ss	mtsai.	Natúré, 356, 768-	774 ,
/ ι η n >-< V \ .1 ;·	» Cerreti és mtsai.,	Science,	256, 97-100, (19:9.	2)1-

Ennek az enzimnek emberből és egérből, származö változatát ís jellemezték és klónozták (Nett és mtsai,, Journal of Immunoiogy, 149, 3254-3259» (1992)? Molineaux és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9ö, 1809-1513» (1993) j , Ez egy egyedi císztein-proéeáz amely nem mutat homolőgiát más ismert tiol-proteázokkal. Különösen specifikus ugyanakkor a pIL-Ιβ egyes Asp~X kötéseire.

Az ICE-enzim két alegységből áll, az egyik 20 kD (p20), a másik 10 kD (plö) hosszúságú, ezek együttesen szükségesek az enzimaktivításhoz. Ezek az alegységek a 45 kD hosszúságú proenzim forma (p45j proteolitikus hasítása során keletkeznek. Az ICE enzim maga képes hasítani a saját p45 prekurzorát, vagy a 30 kD-os p.30 formát - amely utóbbi nem tartalmazza a proenzim 119 aminosav hosszúságú Kiterminális részét ~ a p2 0-ből és plO-bői álló aktív forrná-

vá.	A	teljes	p45-szekvenciát	a oehS —e es	aminosav ·
szék	véne	ia	alapj	ián is meghatároz*	ták {Thornherry	és mtsai.,
mint	fent].	r aÓÍ.	emberi ICE-gén	jellemzését i	.s közölték
{Cár	Χ'&ΐ 1.	ÓS	mtsa	d.., Genomíes, 20 ,	468-473» {1994	) )
	A	mi	műnk·	ánk feltárta az	1CE lehetséges	szerepét a

programozott sejthalál vagy apoptózis szabályzásában [Ynan és mtsai., Cell, 75, 641-852, (1993)} . Valóban, az TCS 28 %-os homclóaiát mutat a C. elegánsból származó Ced-3-mai, •-Í amely apoptózísban játszik szerepet, a rágcsáló- eredetű IC.S. szuperexpressziója pedig patkány f ibrobiasztokbanapoptózist vált ki. [Miura és mtsai., Cell, 75, -653-660 (1993)] . Továbbá a crmA-fehérje - egy, az ICE-t gátló viráüs eredetű szerein -- expressziőja transzfaktáit csirkék ganglioneuronjaiban megvédi ezeket a sejteket a növekedési faktor (idegi növekedési faktor) szuppressziója révén indukált, apoptózis okozta sejthaláltól (Gánglíardi és mtsai., Science, 2S3, 82S-828, (1994)3. Ezek a megfigyelések alátámasztják, hogy az. iCS vagy homológjai, -szerepet játszhatnak a programozott sejthalál szabályzásában, különösen- amely programozott sejthalált olyan degeneratív idegi megbetegedések során figyeltek meg mint pl az Ai.zbeimerkór, a Parkinson-kőr vagy az agyi isém-ia [Barinaga M>, .Science, 259, 762, (1993)].

Az ICB-vei rokon -szerkezetű űj fehérjék felfedezése amely fehérjék, szerepet játszanak az IL-Ιβ érésében vagy az apoptözisban - hozzájárulhat űj terápiás vagy diagnosztikai szerek kifejlesztéséhez, amelyek apoptózissal vagy IL-Ιβval kapcsolatba hozható esetekben lennének alkalmazhatók.

A találmány tárgyát képezi egy űj emberi fehérje, a Tv, amely több, ment 70 %-os homológiát mutat a Txfehérjével. A Ty-fehérje képes apoptőzist indukálni a sejtekben, pl transzfektált Cos-sejtekben. A Ty egv prote-áz, amelyik képes intramolekulárisan -önmagát hasítani.

Az allelök és az analógok között vannak olyan, székvencíák, amelyek, egy vagy több aminosav szubsztitúciójával , deléciójával vagy addíciójavai módosítva vannak olyan mértékig, ameddig a kapott termékek megtartják eredeti funkciójukat .

Amikor a találmány szerinti polípeptldet előállítjuk egy gazdasejtben végzett expresszié segítségével, ezt a génsebészetben és a sejt tenyésztésben ismert -eljárások segítségével tesszük.

Az expressziét végrehajthatjuk prokarióta sejtben, pl B. coliban,, vagy eukarióta sejtben, pi Cos sejtben, mely sejtek tartalmazzák a találmány szerinti polipep-tidet kódoló DNS-szekvenciát úgy, hogy azt egy megfelelő promoterszekvencia előzi meg.

A találmány egy előnyös megvalósítási, módja egy eukarióta gazdasejtben végzett expressziőval előállított találmány sz er i nt i po11peptid.

A találmány egy különösen előnyős megvalósítási módja egy találmány szerinti polipeptid, amelynek proteázaktivitása megfelel az IL-Ιβ konvertáló enzim érését elősegítő aktivitásnak. A későbbiekben, leírunk egy példát ennek a meghatározott proteázaktivitásnak a. maghatározására.

A találmány

tárgyát		továbbá egy
rendelkező	és apoptézis	í .induká.lására
idet kódol<	> DNS-szekvenc	iát tartalmazó:

expresszlós vektor, valamint egy, a fenti expressziős vek« <· * *·>·'

promóter	irányítása a
promóter	lehet pl. a 1
promóter,	a β-laktamáz
tősejtek	esetében a pr<
az AD-promóter. Emlős
as SV40	promóter vagy

Az expressziós vektorok olyan ismert vektorok, amelyek lehetővé teszik a fehérje expresszióját egy megfelelő alatt. Prokariőta sejtek esetében a lac-promőter, a trp-promóter,. a tacz promoter vagy a PL--promóter. Él esz.'omőter lehet pl. a PGK-promőter, vagy sejtek esetében, a promóter lehet pl y aden-ovirus promó-terek. Bakulovírus típusú vektorokat is használhatunk rovarsejtekben történő expressziőhoz.

K gazdasejtek .lehetnek pl. prokariőta sejtek, vagy eukaríóta sejtek. Prokariőta sejtek, pl az B. coli sejtek, a Bacíllus és- a Btreptomyces törzsek sejtjei. Az eukaríóta gazdasejtek lehetnek pl. -az élesztő sejtjei vagy fejlettebb szervezetekéi, pl emlős- vagy rovarsejbek, Emlőssejtek, pl. a fibrofolasztok, mint pl a hörcsög CHO vagy BHK-sejtek, vagy majom Cos-sejtek. 'Rovarsejtek, pl az Sf9-sejtek..

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti polípeptid elleni antitestek.

A találmány szerinti poliklonális vagy monokionáíis antitesteket ismert eljárások szerint állíthatjuk elő, és alkalmazhatók pl. a Tv-fehérje kimutatása során, pl SLiSAtesstben («sn-zyme Linked Immunosorbent Assay⁸, enzimkapcsolt immuno-szorbens vizsgálati eljárási valamint diagnosztikai. szerekként.

így tehát a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polipeptidek., gyógyhatású anyagként is.

♦ X

A találmány oltalmi körébe tartoznak gyógyászati készítmények,, amelyek hatóanyagként egy - fent meghatározott - gyógyhatású anyagot tartalmaznak és közelebbről a a találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, amelyek az l'L-Ι,β termelését vagy az apoptózist szabályozzák.

A hatóanyagot a szokásos adalékanyagokkal állíthatjuk össze a fenti gyógyászati készítmények előállítása során, A készítményeket beadhatjuk parenterálisan, orálisan, vagy helyileg.

A találmány szerinti polipeptidek lehetővé teszik, hogy célul tűzzük kí ezen polipeptidek inhibitorai alkotta űj terápiás szerek létrehozását, valamint gyógyszerként való alkalmazásukat pl autoimmun betegségekhez, szeptikus sokkhoz vagy neurodegenerafcív betegségekhez társuló gyulladások kezeléséhen.

A hiforidizálást elvégezhetjük pl. egy olyan pufferben, amelyik SxSSC-t, IQxDenhardtct, 100 pg/ml lazacspermium eredetű DNS-t, 1 % SDS-t tartalmaz, SS °C-on, egy éjszakán át. A mosásokat ezután egy olyan pufferben végezhetjük el pl., amelyik IxSSC-t és 0,1 % SBS-t tartalmaz, 60 °C-on 30 percig, kétszer megismételve.

A találmány tárgyát képezi közelebbről egy DNSszekvencia, amelyik egy apoptózis indükálására képes és proteáz aktivitással bíró polipeptidet kódol, és amelynek nukleot ídszekvenoiáj a megegyezik a 22-es azonosítószámon, megadott szekvenciával, még közelebbről a 22-es azonosító·*?

* X » Φ X ·# » g » « # * 4 ♦ * * * « *·«*·.».

♦ X* ** 4 számon megadott szekvencia 109. nukleotidjavai kezdődő és 1105. nukleotiájával végződő szakaszának szekvenciájával.

A fenti,, 22-es azonos!kószámon megadott» 354 aminosavbői álló fehérjét kódoló szekvencia egy -cDNS-szekvencia, amelyet pl PCS-rel végzett amplifikáciöval nyerhetünk, emberi lépfoől vagy méhlepényből származó cDNS-böl, a Tx cDNSszekvenciáfoől (l-es azonosítőszámon megadott szekvencia) származtatott oligonukleoti.dok segítségével. Az előállításra részletes példát adunk meg a kísérleti részben. A 22-es azonos!tőszámon megadott szekvencia ismerete lehetővé teszi a találmány szerinti megoldás reprodukálását ismert eljárások alkalmazásával, amely eljárások a kémiai szintézis vagy génkönyvtárak illetve cDNS-könyvtárak - oligonukleotid. próbák segítségével hibridizációs módszerekkel végzett sz-krínelésének tárgykörébe tartoznak.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy apoptőzís indukálására képes és proteáz aktivitással bíró emberi poíipeptid, amelynek -amínosav-szekvenciája megegyezik a 2.3as azonosítőszámon megadott szekvenciával, és Ty-fehérje a megnevezése.

A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy találmány szerinti poíipeptid, amelyik a 23-as azonosítószámon megadott szekvenciát kódoló DNS egy gazdasejtben végzett, ex.presszá.ltatásával állítunk elő.

A találmány tárgyát képezik továbbá gazdasej tek. es expressziős vektorok, amelyek lehetővé teszik a Ty-fehérje ··*>

expres szál tat á sát, és amelyekre, a fentiekben példákat mutattunk be,

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás, azzal jellemezve, hogy a Ty-fehérjét a 23-as azonos!tőszámon megadott amínosav-szekveneiát kódoló DBS-se 1 transzformált -gazdasej tekben expresszáltatj uk,

A találmány tárgyát képezik továbbá a Ty-fehérje elleni polikl-onális és monok! ónál Is antitestek.

A találmány tárgyát képezik továbbá gyógyászati készítmények, amelyek a Ty fehérjét hatóanyagként tartalmazzák .

A következőkben ismertetjük a találmányi leíráshoz csatolt ábrákat, amelyek a találmány szerinti megoldás egyes megvalósítási módjait szemléltetik.:

Az 1. ábra bemutatja as- IGE-vel homológ szekvenciák kimutatását emberi genomi DNS-ben Southern Biot technikával, amely genomi DNS FBMC-ből (perifériás vér mononukleáris sejtjei, peripheral blood. mononuklear cells”) származik, és a következő restrikciós enzimekkel emésztettük: Bgllí (A sáv), PstI (B sáv), Hindii! (C sáv), SamHi (D sav). A kimutatást egy -~?~vel jelölt az !CS δ. exonjáből s-zármaző próba segítségével végrehajtott hibridizációval végeztük,

A 2. ábra bemutatja a T2-gén 6, exonjának nukleofcidsz.ekvenciáját {5-ős azonos!tőszámon megadott szekvencia) .

A 3. ábra bemutatja a Tx-cDN'S nukleotidszekven-ciáját íl-es azon-osí tőszámon meg adott szekvencia) és a megfelelő ♦ * : . -•r aminosav-szekvenciát {2-es azonosítószámon megadott szekvencia) .

A 4. ábra bemutatja a 7x-mRNS kimutatását Northern Slot technikával 1 épből (A sáv) , csecsemőmirigyből ÍB sav) , prosztatából <C sáv), heréből ÍD sáv), petefészekből (B sáv), vékonybélből (F sáv), vastagbélből (G sáv), perifériális leukocitákből (H sáv) származó szövetekből. A kimutatást -²P~vel jelölt Tx exon 6 próbával való hibridizációval végeztük el.

Az 5. ábra bemutatja az érett IL-ΐβ szekrécióját Cos1-sejtekben, amelyek konstitutívan tartalmazzák a ρΐΰ-ΐβ-t, és transzfektálva vannak XCEp45-öt (2. sáv) vagy Tx-et (3. sáv) tartalmazó poDI»-SRalpba2 96 vektorral, vagy a pcDL·-

Skalpba 25	•S vektorral önmagába	/ A H 5 ¾ -	v> , a pcDNAI/Amp	vek-
tr>rr^'S ör	magában. óS. sáv),	vagy Tx~	•et (6. sáv) íl	let. ve
ICSpoO-at	(7. sáv) tartalmazó	pcDNAl/á	.mp vektorral, mi	ndezt

pedig egy	DNS nélküli	kontroll kultúrává	1 hason!ítettük
össze (1. s	áv). Az érett	Σΰ-ΐβ-t a sejtfelí	ílűssőban pg/ml~
ben mértük	ELISA alkal	ma zá s áva1 (A: 16	órán keresztül
inkubálva; 3	B: 24 órán. kei	resztül inkubálva) .
A 6.	ábra bemutat	ja a p30 ICE-prek	urzor hasítását

Cos-1-sejtekben. A sejteket pcDL-SRelpha296 vektorral önmagában (A sáv) vagy jelölt mutáns T?-lCSp30C285S-t tartalmazó pcDL-SRalpha296 vektorral (B sáv) transzfekt ál tünk, vagy kotranszfekfcáltunk a jelölt mutáns T7-ICBp30C2S5S-t tartalmazó? pcDL-SRalphaáSS vektorral és a vektorral, amely ICSpló-at (C sáv) vagy ICBp45-ct (D sáv) vagy Tx-et (B sáv) tartalmazott. A detektálást Western biot alkalmazásával,

*>· anfci-T7 antitestekkel végeztük el, a kontroll a csupán Txet tartalmazó pcDL~SRal.pha29ö vektorral végzett transzfekelónak felelt meg (F sáv) .

A '7, ábra mutatja be a Tx-fehérje által indukált

apoptöz	:ist Cos-1	sej te	kben, amelye	Aet poBIi-S	txalphaz96 vek-
torral	önmagában	(7S) ,	valamint Ib	r-et (7C) ,	vagy ICEp45-öfc
(7Ώ} t·	artalmaző	pcDL ··	SRa.lpha2.96	vektorral	fertőztünk, a
kontrol	1 pedig e=	gy DNS	nélküli kul	túra volt	(7A) . A felve-

telek 22 órás tenyésztési idő után készültek, 400-szoros nagyi t ásban.

	A S. ábra mutatja	,be	a Cos-1-sej t ek DNS-	ét. I	ízeket a
Cos-1 -	-se j fc eket ICSp 95-öt	( ö	sáv) vagy Tx-et (C	Sáv)	tártál-
ma zó	vagy p cBB - SRa 1 pha:	296	vektorraI t ranszfek	bál tu	ck, vagy

csupán a vektorral magával (D sáv), a kontroll pedig a DNS nélküli kultúra volt (A sáv). A detektálást BET-tel festve végeztük el, agarőz gélen történt migráció után, a kővetkező DMS-méretet jelző ma.rkerekkel; HindiiI-mai emésztett lambdafag (MI) és HindiII-mai emésztett <XDQ?4~fág (M2) .

A 9. ábra mutatja be a. Ty (T?TYAé?C245S) mutáns fehérje hasadását Cos-I-sejtekben. A. sejteket pc.DL-u3Ralpha2.96 vektorral önmagában (B sáv) , vagy a pcDNAI/Amp vektorral önmagában (C sáv), vagy pT7T¥A67C245S vektorral transzfektéitűk, vagy kotranszfekfcáltuk a pT7TY vektorral és a pT7TYA67C24 5S vektorral (F sáv: 23 óra és G sáv; 43 óra) . A. detektálást Western biot technikával végeztük el, a kontroll pedig a DbJS nélküli kultúra volt (A sáv) , valamint molekulasúly markerek (B sáv, nem-detektálható).

*·*»» .* s

X * ♦ Φ » > X ·>* <*«· 4

Az alábbi példák segítségével a találmány szerinti megoldást részletesebben is ismertetjük, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre. korlátoznánk:

I. Példa A Tx-szekvencia azonosítása

A., Az emberi ICS-vei homológ gének meg t al á lása

Az ICS-vei homológ géneket Southern biot segítségével, az ICS-gén 6. exonjának megfelelő DNS-próba alkalmazásával azonosítottuk.

a.) Az ICS 6. exonjának megfelelő próba elkészítése.

Az emberi ICS S. exonjának határait az emberi ICS-gén teljes exon/intron szerveződésével együtt közölték (Cerretx és mtsai., mint fent}. A δ. exon (235 bp) megfelel a leírt ICSpéS eDNS-szekvencia S35~86S~ig terjedő nukleotidjainak [Thomberry és mtsai.,· mint fent}.

Az ICE ¢, exonjának megfelelő próbát PCR-rel amplífikáivá készítettük a következő oligonukleotidok segítségével ;

ICS 6.5: ACATCACTAC AGAGCTCGAC (3-as azonosítószámon 'megado 11 szekvenci a}

ICS 6,3; CACCACGGCA GCCCTGGATG (4-es azonosítószámon megadott szekven c ia) amelyeket a közölt adatok felhasználásával választottunk ki [Thornfeerry és mtsai-, mint. fent], megssintetizáltuk őket, és RT-PCR segítségével emberi vér monocitálból származó RNS amplifikálására alkalmaztuk. Az RNS-fc RNA^ reagenskéssiet (BioProbe) segítségével tisztítottuk. Az amplifikálást a « «

- 1.

’d ·« ♦ * * ? * * • φ « kővetkező körülmények között végeztük: enzimként ^!,üiotaq^<! polimerézt használtunk (B'io-Probe) , 30 ciklust végeztünk (94 °C, Iperc; 00 »C, I perc; 72 °C, 1 perc) , az alkalmazott

PCR-készülék egy GeneAmp PCRsystem 9S0öⁿ~as modell volt (Perkin Elmer).

A kapott 6. exon DNS-fc centrifugálással tisztítottuk egy Spin X oszlopon (Costar) és ³²P~vel jelöltük az üliigeiahsiiing reagenskészlet (Pharmacia Biotech) segítségével az ün rancte priming” technikát alkalmazva.

b._) Hibridizálás genomi eredetű DNS-hez; Southern biot

A kapott radioaktivan jelölt ICE €. exonjának megfelelő próbát hibridizációs próbaként alkalmaztuk emberi genomi DNS-en.

Az emberi genomi DNS-t perifériás vér mononukleáris sejtjeiből (PBMC) állítottuk elő TurfooGen reagenskészlettel (Imvitrogen) , majd sorrendben SglII, Peti, Hindin, valamint BamKI restrikciós enzimekkel emésztettük (Boehringer-Mannheim) IxTAE-ben, 0,9 %-os agarőzgélben elektroforetizáltuk, átvittük egy nylon «GensScreen Plus membránra (NEM üupont), majd az ICB S. exonjának megfelelő próbával h. i fo r id i z á 11 a 11 u k .

A hibridizálási körülmények ugyanazok voltak, amelyeket Maniatis és mtsai. közöltek (Id fent], azaz. 'SxSSP, lOx Denbardt, 100 pg/ml kettősszálű DNS, 1 % SDS, SS ^eC-on, egy éjszakán át, majd ezután a mosásokat egy olyan pufferben végeztük el, amelyik 2x.SSC-t és 0,05 % SDS-t tartalmazott, szobahőmérsékleten 30 percig, majd l.xS.SC-t és 0,1 % SDS-t »*** «Γ« 9 « ♦ Κ * * « h> i *«„’ °ι· tartalmazó- pufferben. €S °C-on 30 percig, ami megfelel a .nagy szigorúsággal megszabott feltételeknek. A mosőpuffért a következő tőrzsoldatokból készítettük:

POxSSC: nátrium-kloríd 3M-os vizes oldata, amely 0.3 M nátrium-citrátot tartalmaz.

·% SDS: nátrium-dodecílszulfáf vizes oldata.

Mosás után a membránt Hyperf ilm-KP filmmel (Amershara) exponáltuk.

Amint az 1. ábrán látható,, minden egyes restrikciós enzimmel történt hasítás esetén három vagy négy különböző csík látható az eltérő méretű DNS-fragmenseknek megfelelően, amelyek közöl egyesek megfelelnek az IGE-vei nagyfokú homológiát mutató géneknek, de különbőznek az 1CB-géntől, hiszen egyetlen gén csupán, egy vagy legfeljebb két különböző csíkot mutathat egy egyetlen exonnak megfelelő próbával végzett hibridézálás során.

8·, Az IGE-vei homológ gének klónozása

a.) Az IGE-vei homológ genc-ml szekvenciák klónozása

Annak érdekében, hogy a fentiek szerint kapott különböző DNS -fragmenseket azonosítsuk, a perifériás vér mononukleáris sejtjeiből (PBMC) kivont és Hindin restrikciós enzimmel (Boehringer-Mannheim) emésztett emberi genomi DNS-fragmenseket 1,5 %-os agaró zgélben, IxTAE -ben preparatív elektroforézissei elválasztottuk, Mániátis és mtsai. (mint fent] által közölt körülmények között. A gélt 20 frakcióra vágtuk azon a területen, amely 2,3 kb-nál kisebb molekulasúlynak felel meg, majd minden egyes frakcióról elualt DNS-fc PCR alkalmazásával araplíSikáltuk a fent * ·:** φ« * » « ο * « Φ ♦ ί * * φ * * * * * « ♦ **$« * φφ ** φ leírt ICS S. 5 <3~as azonos! tő számon megadott szekvencia) és XCE 6.3 (4-es asonosítóssámon megadott szekvencia) oiigonukleotídokat alkalmazva. Az amplifikéiás körülményei a kővetkezők voltak: S4 «C, Iperc; 55 ’C, 1 perc; 72 °C, 1 perc, 30 ciklus, BioTaq* polimeráz.

A 20 frakció közöl a PCR alkaimazásával végzett aroplifikáciő során a legjobb eredményt mutató nyolcat használtuk fel a továbbiakban. Az -ampl ifikéit anyagot T4-I5NSligáz enzim segítségével pCR II .-vektorba klónoztuk a forgalmazó utasításait követve ^RTA” klónozó reagenskészlettel (Invitrogen), majd Sanger módszerével megszekvenáltűk szekvenéz enzimmel Maorophor elektroforézis készüléket (Pharmacia System) alkalmazva. A meghatározott szekvenciákat a <303 szoftver segítségével analizáltuk (Devereux és mtsaí., Nncleic Acid Research, 12, 387-395., (1984)]

A kapott nukleotidszekvenciák között azonosítottunk egv T2-nek nevezett szekvenciát, melynek nukleotidiai 92 %~ bán azonosak voltak az ICE 6. exonjának megfelelő· szekvenciával .

A T2-nukleotidszekvencia nyílt leolvasási fázisa szinte· kizárólag az XCS 6. exonjáből áll .(5-ős· azonosítószámon megadott -szekvencia, 2. ábra), ami azt jelenti, hogy megkísérelhetjük azonosítani a 72--fehérjét kódoló hírvivő RNS (messenger RNS, mRNS) nukleonidszekvenciáját, és a 72-nek megfelelő cDNS-t klónozni.

b,} Az XCS-yel homológ oDNS klónozása

A teljes RNS-t reagenskészlet (BioProbe) segítségével izoláltuk és tisztítottuk vagy EPS-se.1 18 órán ke«* *$ «« *« ♦ Λ ** resztül aktíváit monocifcákből vagy méhlepényből vagy perifériás vérből izolált mononukleáris sejtekből. Minden egyes megfelelő cDNS-t poli-öT oligonukleotid és a ”GeneAmp RNA PCP” reagenskészlet (Perkin Elmer) reverz t rans zkri.pt áz enzime segresegevei szintet.x-zaitunk. meg a rorgaímazo· utasításait követve, majd PCR alkalmazásával ampiifikéitűk őket a kővetkező oiigonukleotidok felhasználásával:

Τ2.Ά: CTACAGAGGÍGGAGGCATTTGCT (6-os azonosífőszámon megadott szekvencia), amelyet a T2 6. exonjét kódoló szekvenciából választottunk kí úgy, hogy specifikusan amplífikáijnnk egy T2-re igen, de az ICE-re nem jellemző szekvenciát, és az

1034 5.3 TTAATGTCCTGGGAAGAGGTAGAA (7-es azonosítőszámon megadott szekvencia), amelyet az 1CE cDMS-e kódoló régiójának 3 ’ -végéről választottunk ki (komplementer szál).

Egy kb. 600 bp hosszúságú, fragmens fc kaptunk, sorban mind a három RNS-preparátumból, az ampiifikálást a kővetkező feltételek között végezve el: 94 ^eC, 30 s; 60 «C, 30 s;

72: % 3 0 S, 3 0 ciklus

GoneAmn RNA PCP:» reagens készlettel. (Perkin Elmer) . A fragmenst a ®TA^R klónozó reagenskészlet. (lnv.it rogen) alkalmazáséval klónoztuk, és a fent leírtak szerint szekvenáltuk meg. Az így meghatározott nukleotidszekvenoia nem a várt T2~c.DNS~nek felelt meg, hanem egy űj cGNS-nek, amelyet Tx-nek neveztünk el.

Tx-cDNS azonosítása

a.) A Tx-cDNS konszerzusszekvenciéjának meghatározása

A Tx cDMS-e 3’- és 5'-végeinek nukleotidszekvenciáját méhlepényből származó cDNS-ből. űn rögzített (anchored) PCR-módszerrel kaptuk meg.

A Tx cDNS-e 5'-végét a Race-Ready cGRS-reagenskésziet (Humán Quiek-Clom eDNA) (Clontech) alkalmazásával, és a következő oligonukleotidok segítségével amplifikáltuk:

TxPCRSA; GAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A (a 8-as azonosítószámon, megadott szekvencia)

TxRCRSB; GTCTGAGCCA CAGTTGCCCA C (a 9-es azonositöszáwon megadott szekvencia).

A Tx cDlíS-e 3' -végét a Race System reagenskészlet (Gibco-BRL) alkalmazáséval és a következő oligonukleotidok segítségével amplifikáitűk:

TxA:· AACTGTGCAT GATGAGA (a 10-es azonosítószámon megadót t szekvenoi a)

TxB: AGATGCTGTG TACAAGACC (a 11-es azonos!tőszámon megadott szekvencia) .

Szt a két megfelelő lánc indító-párt a fent leírtak szerint kapott részleges Tx-szekvencia alapján határoztuk rneg.

A kapott ampli fikáit fragmenseket a ^Í!TA klónozó reagenskéssiet (Invítrogen) felhasználásával klónoztuk, és a fent leírtak szerint szekvenáltuk.

A. nukleotidszekveneíák helyességéről a fent megadott TxA (a 10-es azonosítószámon megadott szekvencia) és a TxB (a Il-es azonosífőszámon megadott szekvencia) oligonukleotidok, valamint a következő cligonukleotidokkal segítségével bizonyosodtunk meg:

TxC: GCCTGGACAA TGATGAC (a 22-es azonosítő-számon mega dót t s zekvenci a)

TxD: TGATGAAGA.T AGAGCCC (a 13-as azonosífőszámon megadott szekvencia)

Txl; CGGÖTCATGG CAGACTG (a 14-es azonosítőszómon megadó t1 szekvenc ia)

Tx2: GTTTGAAGAA GCATTTG (a 15-ős azonos ít ős sámon megadott szekvencia)

Tx3CCTGAGTCAG GAGAATC (a 16-os azonosítőszámon megadott szekvencia)

Tx4; AGTCTCAGGA ATTCTTC (a 17-es azonosítószámon megadott szekvencia.)

TxS: AGCTGACTTT GACATCA (a 18-as azonosí tőszómon megadott szekvencia)

TxS;- GCGCTGACTG CATATCC (a 19-e-s azonosífőszámon megadott s zekvencie) amelyeket a Tx kódoló szekvenciájából választottunk ki (kódoló szál vagy komplementer szál).

Az összes kapott szekvenciát összeállítva kapjuk meg a Tx-cDNS konszenzus-nukleotidszekvsnciáját {az 1-es azonosítőszámon megadott szekvencia)., amit a 3. ábrán mutatunk be. As így mégha távozott szekvencia 1181 nukleotidből áll, és egy poliadenilációs szekvenciával fejeződik be. Nyílt leolvasási kerete egy metionin ini-cíáciős kódommal kezdődik a 42. nukle-otidnál, és egy termináciős kódomnál fejeződik be az Xl?2~es nmkieotidnál. Az eredmény egy 1131 nukleotidből áldó nyílt leolvasási keret, amely egy 377 aminosavból álló fehérjét kódol.

b.) A Tx-cDN'S kódoló· régiójának klónozása

A Tx~cDNS kódoló régióját (az 1-es a zonosí tőszámon, megadott szekvencia) RT-PCR-rel ampl i fikái .tűk monociták, polinukleáris sejtek vagy méhlepény teljes RNS-éből a kőve tkező o1igonuk1eot1dók segítségéve1:

TxP5: CGCGGATGCA GGATGGCAGA AGGCAAGCAC AGA (a 20-as azonosí tós zámon megadót1 sze-kvencia)

TxP3 : GGGTCIAGAC TCGAGTTATC AATTGCCAGG AAAGAGGTA (a

2.1 -es azonosító-számon megadott szekvencia.) .

Ezeket az amplifikáciő© láncindítókat a Tx~cDNS előzőleg meghatározott konszenzusszekvenciája alapján (vagy komplementer· szál alapján) választottunk ki és szintetizáltuk meg BamHI és Ncol klőnozőhelyeket .hozzáadva a TxP-5oligonukieotódhoz, és Xbal valamint Xhol klőnozőhelyeket hozzáadva a TxP3 ol i gon.uk.1 eo ti óhoz.

A fentiek szerint előállított kb. 1150 hp. hosszúságú amplifikéit terméket BamRI és Xbal enzimekkel (Boe.hr ingerMannheim) emésztettük, Amersham ligáié reagenskészlettel klónoztuk előzőleg szintén BamKI és Xbal enzimekkel megemésztett pcDNAI/Amp vektorba (Invitrogen). A klónozott termék mindkét szálat teljes egészében megszekvenáltuk a fenti TxA_f TxB, TxC, TxB, Txl, Tx2, Tx3, Tx4, TxS és a Tx6oligonukieotidők segítségével.

Minden felhasznált kiindulási RNS esetében a kapott nukleotidszekvencia azonos volt a fenti Tx-cDNS konszenzusszekvenciáját kódoló szekvenciával (az 1-es azonosítöszámon me-cadott szekvencia). így tehát a különböző egyénekből.

* ♦ származó egyes felhasznált szövetek között nerc: találtunk különbséget.

A Tx-cDNS kódoló· régiója a Tx-fehérjét kódolja, amelynek származtatott aminosav-szekvenciáját <a 2-es azonosífőszámon megadott szekvencia) a 3. ábrán látható, A Txfehérje szekvenciája 377 aminosavból áll, számított molekulatömege 43,26 kö.

A Tx~fehérje szekvenciája legfeljebb 52 %-os homoiögiát mutat a p45 ICE-prekurzorral, ha az amlnosavak azonosságát tekintjük és folytonossági hiányokat is megengedünk az egymás mellé rendezés során.

Bgy, a Tx-cDNS-t kódoló régiót a pcDNAI/Aop vektorba (Tx cDNA./pcDNAI 13/07/94) klónozva tartalmazó S. coli XL-1sejfcekfeől álló mintát a CNCM-nél helyeztünk letétbe 1994 július 29-én az 1-1462 azonosítőszámon.

c.) A Tx-mRNS expressziéia különböző emberi szövetekrendezett szakaszának

A Tx-fehérjét kódoló mRNS expressziéiát nyolc különböző szövettípusban Northern blottal tanulmányoztuk, a Txnek az ICS 6. exonjavai egymás mellé megfelelő próba alkalmazásával (Tx exon 6). megfelel az 1-es azonosítőszámon megadott szekvencia 595.. nukleotidtől a 81.1. nukleotídig terjedő szakaszának.

A “Tx exon S^!! próbát úgy készítettük el, hogy ezt a szekvenciát a. Tx-cDNS-t tartalmazó plazmádból kiindulva ampllf'ikáltuk a fenti T2.A (6~os azoncsíbőszámon megadott szekvencia) és a TxC (12-es azonosífőszámon megadott szekvencia) láncindítők alkalmazásával.

Szt a. próbát as ön *random priming* (véletlenszerű láncindítás) módszerrel az Oligolabeliíng* reagenskészlet (Pharmacia Biotech) segítségével 32p.._v„j jelöltök, majd felhasználtuk a Tx-mRNS detektálására hibr.idizáltatás révén egy membránon, ami a különböző· emberi szövetek polyA-i--Résének 2-2 pg-ját tartalmazta. A hibrídizálást egy «Multiple Tissue Northern Biot 11” membránon {Clonteeh) végeztük el, a forgalmazó által közölt hibridizációs körülmények szerint .

Amint azt a 4. ábrán láthatjuk, a legtöbb vizsgált szövetben kimutathatunk mRNS jelet, bár változó intenzitással . A perifériás vérből származó leukociták <H) eredményezték a legerősebb jelet. A lép (A) , a vékonybél (F) , a csecsemőmirigy (Bj és a petefészek (S) közepesen erős jelet mutattak. A prosztata (C; és a. vastagbél (G) nagyon gyenge jelet eredményeztek, és végül a here mRNS-ében CD) nem tudtunk semmilyen jelet mérni.

A Tx-fehérjét kódoló mRNS tehát sok szövetben expresszálódik, különösen nagymértékben a vér sejtjeiben.

2. példa: A Tx···fehérje funkciójának vizsgálata

A. A gre-ÜL-lj) hasítása

A Tx-fehérjének azt a képességét, hogy tetszőlegesen elhasíthatja az emberi IL-1'β prekurzorát, egy eukarióta transzfekciós rendszerben teszteltük a következő expressziős vektorok egyikével vagy másikával: pcDNAT/Amp és pcB.L S'Ral pha 296.

««« «* «♦ * ♦ ♦ « » « X * $ 4 ♦ 4 9 > » « « «τ ♦ »

A Tx cDNS-ét kódoló régiót (1-es azonositószámon megadott szekvencia) először a pcDNAI/Amp (Invitrogen) eukarióta expressziós vektor BamHl és Xhel helyeire klónoztuk. A BamHI-gyel és Xbal-gyel történt emésztés után egy kb. 1150 bp hosszúságú ínszertet izoláltunk.» majd tisztítottunk. A restrikciós helyeket az inszert végein T4-DNSpolímerázzal (Boehringer-Mannheim) töltöttük fel. A kapott oDNS-t szufoklónoztuk, egy li-gálő reagenskészletet (Amersham) .alkalmazva a pcDL~-SRalpha296 vektorba (Takebe és mtsai., Moleeular and Cellular Biology, 8, 486, (1988)), amelyet Xba.I~gyel nyitottunk fel, majd a végeit T4-DNS-polímerázzal töltöttük .fel. '‘Plasmiö maxi reagenskészlettel (QIAGE.N) végzett tisztítás után. a Tx plazmid-DNS-preparátumok kaptunk két vektorban.

= ? sióh»_e™su eukarióta sej tek a Cos-1

A transz.fektéi	.is;a heszn·:
sejtvonai sejtjei	, amelyek
expresssálnak pID-li	β-t és amel.
hordozó piazmiddal	történt tr;
pIL-Χ.β szintézisét	ebben a sej
hogy a sejteket; D!®!>	1-ben oldott
% FCS, glutamin, P/ ében tenyésztjük.	S, piruvát

3xX0⁶ Cos-1 sejtet inkubálunk 37 ^GC-on párás környezetben 5 % CO2 jelenlétében Petrí-csészékben, majd transz fektetünk 15 pg plazmid-DNS-selamit előzőleg 200 μΐ DSAE-DEXTRÁN-nal kevertünk össze, és 4 ml PBS-sel. hígítottunk a csészékhez való hozzáadás előtt. A sejteket 37 ^eC-on 30 percig inkubáljuk, majd chloroquíne 8 ml 88 ,μΜ-os szé•jj .-J *’U «« « A- * * * * Jí « j * * * * « sej te rwwsentss DMEM-mel készült oldatát adjuk hozzá, és a két újabb 2,5 érán át inkubáijuk. A felülüszó oldatot ezután eltávolítjuk, és a sejteket két percig DMSO 10 %-os szérummantes DMEM-es oldatával kezeljük. Szérumkéntes tápközeggel való mosás után a fenti teljes sejttenyésztő tápoldatból lö ml-t adunk a sejtekhez. A transzfektéit sejtekről a felüluszőt 16 órától 4.8 óráig terjedő inkubáiás után különböző időpontokban távolítjuk el, &:z felülöszóban jelenlevő érett IL-Ιβ mennyiségét az IL-ΐβ specifikus kimutatását lehetővé tevő ELISA IL-ΐβteszttel .{R & D Systems) mérjük meg.

A transzéektáiást a Tx-cDNS a fenti két vektor egyikébe vagy másikába ínszertált kódoló régiójával végeztük el, összehasonlítva az I'CEpéS és az ICEpSO eDNS~e kódoló régiójával végzett transzfektálásokkal, valamint egy kontroll transzfektáiássai, amit az ínszertet nem tartalmazó megfelelő vektorral hajtottunk végre.

Amint az 5. ábrán látható, az ICSp4S (2. oszlop) és az ICEp30 (?. oszlop) cDNS-ével végzett transzé skció: a sejteket kétessé teszi érett IL-Ιβ szekretálására. Ezzel ellentétben amikor ugyanilyen körülmények között Tx-cDNS-s kódoló régiójával transzfektálunk (3... és 6. oszlop) , nem tapasztalunk IL-Ιβ-szekréciót, mint ahogy a kontroll transzfektálás-ok esetében sem (1.,-4,. 5. oszlop). Hasonló eredményeket kaptunk mindkét expressziös vektorral a transzéektálás utáni inkubáiás időtartamától függetlenül (16 óra: SA. ábra; 24 óra 5B. ábra; 29 óra és további időpontok egészen 44 óráig).

*♦* ** φ* ♦ * * * # φ * * * * * * * χ ? * 9 9 χ « »« » * «χ „

A Tx-fehérje ne® képes plL-lp-t ΐό-ΐβ-vá konvertálni.

B. ,......A.....Tx-fehérje proteázakfc 1 vitása? az ICE 30 kD-c-s prekurzorának hasítása

A Tx- fehérje azon képességét, hogy az 1CE 30 kD-os prekurzorát (ICEpSO)- optimálisan hasítja, eukaríóta sejtekben, egy kotranszfekciós rendszerben teszteltük a Cos-i sejtekbe egyidejűleg juttatva be egy vektort, ami a Tx-cDNS (1-es azonoséfőszámon megadott szekvencia) kódoló régióját tartalmazza, valamint egy, a módosított ICB-fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó vektort. Mindkét DNS-t a fenti pcDLSKaIpha295 expressziős vektorba inszertáltűk.

Az ÍCE-fehérjét kétszeresen módosítottuk; Egyfelől abból a célból, hogy lehetővé tegyük az I'CE-fehérje specifikus detektálását a Tx-fehérje jelenlétében, egy kis T7peptidet fuzionáltunk az XCBprö N-termináÜs végére. Az így megjelölt fehérje vagy a belőle az érés során keletkező termékek Western-blot -módszerrel, a T?-peptid elleni monokionáíis antitesttel kimutathatőkká válnak [Tsai és 'mtsai., Proc. Nati. Acad. Sci., 89, 8864, (1982)]. Másfelől ahhoz, hogy kifejezhessük az enzimet egy olyan formában, amelyik nem képes indukálni saját érését, az ICEpSö egy mutánsát használtuk, amelyben az aktív hely 2S5. Cys aminosavát Séf-re cseréltük (Wilson, K. P. és mtsai., Natúré, 370, 270-275, (1994)]. Ez as enzim Sgy inaktív, és- képtelen saját érését indukálni, vagy a plL-lö-t hasítani. A mutánst helyspe-eíf ikus mutagenezissel készítettük -el a megfelelő ol igonukleotidokat es a ^Transformer^” helyspecifikus mutagenezi-s reagenskészletet (Clonfcech) alkalmazva. A ka~ 24 *5 ** ♦» «

-· * ί < * «

Φ Φ φ ΦΦΦ, pott szekvenciát teljes egészében leellenőriztük. Az így jelzett és mutált iCEp30-at T7-XCEp3öC2S5S-nek jelöljük,

A Cos-1 sejteket vagy a T7-lCEp30C2S5S-t tartalmazó poDL-SR.alpha.2 3S vektorral, vagy a Tx-et tartalmazó pcDLSRalpha29S vektorral transzfektáltuk, vagy pedig a két vektorral kotranszfektáltuk a fent leírt végrehajtási körülményeket betartva. Miután 22 órán át tenyésztettük a sejteket, összegyűjtöttük őket, mostuk, majd 10 mM NaCi-ot, 10 mM Hepest, 1 mM SDTA-t, 50 mM NaF-t, 0,2 % Triton Χ-100-at, 1 pg/ml leupeptint, 20 u/μΐ aprotinint és 1 mM PMSF-et tartalmazó, pH 7,4 pufferre! tártuk fel a sejteket. A feltárt sejteket 400 g-vel 4 ^cC-on centrifugáltuk, majd a felülüszőt elektroforézi sne'k vetettük alá 16 %-os SDSpoliakrilamid gélben. Ά gélből a fehérjéket nitrocellulőz membránra vittük át, majd 2 órán keresztül T7-elleni egér monoklonálís antitesttel (Novagsn) inkubáltuk a környezet hőmérsékletén. A membránt mostuk, majd 1 órát inkubáltuk a környezet hőmérsékletén egy egér-ímmunoglobulin elleni kecske antitesttel, amelyhez alkálikus foszfatázt kapcsoltak. A membránhoz fixált antitesteket az alkálikus foszfatáz szubsztrátjavai (Promega) tettük láthatóvá.

A transz-fekciöt illetve a kotránéziekeiét ugyanezen a módon végeztük el a T7-lCSp30C235S-t tartalmazó pcDI,-~ SRslpha.2 96 vektorral» és a Tx helyett IGEp45-őt vagy ICBp30-at tartalmazó pcDL-S.Ralpha2 36 vektorral együttesen transzfektálva.Amint az a 6. ábrán látható, amikor a mutáns IÜEp30feherjét {T?-1CBO30C28SS) önmagában expresszáltatjuk a

I * V transzfektáit Cos-I sejtekben, az enzim T7~p3ö formája detektálható CB· csík, látszólagos molekula tömeg 35 kD) . A megfelelő 20 kD-os csík hiánya, azt mutatja, hogy az mutáns enzim saját magát hasítani képtelen. Amikor a sejteket kotranszfektáituk. az ICEpóO-enzimet (C sáv) , vagy a p45enzimet (D sáv) tartalmazó vektorral, egy 26 kD látszólagos moiekulatőmegü csíkot figyeltünk meg, ami megfelel a ?7~p20 hasítási terméknek, ami aktív enzim jelenlétére utal. Amikor a sejteket kötranszfektéitűk a Tx-et (S sáv) tartalmazó vektorral, szintén megfigyeltűk a 26 kD-os látszólagos molekulát ömegű erősebb csík megjelenését, amelyet azonban két 'kisebb csík kísér 31 .kb-ná.1 és 28 kD-nál. A különböző csíkok megfelelnek a sejtekben expresszálódott Tx-fehérje által elhasított ICSpóö különböző hasítási termékeinek.

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Tx-fehérje egyfelől expresszálődik a Cos-l sejtekben,· másfelől proteázaktivitása van. Ezenfelül a Tx-fehérje képes hasítani az ICE 30 kD-os prekurzorát és így képes hozzájárulni az ICS proenzim formájának éréséhez és az enzim aktív formájának keletkezéséhez in vivő.

C. · ápoptózis indukálása Tx-fehérjével

A Tx-fehérje apoptózist indukáló képességét Cossejtek transzfektálásával és a tenyésztett sejtek vizsgálatával teszt él tűk.

Ismert, hogy ICE bejuttatása transzfékeióval különböző típusú sejtekbe appptőzis révén a sejtek halálát váltja ki [Miura és mtsai., mint fent].

**** ** ♦ * « * χ ♦ * • « * * χ » χ

Κ * Μ t

A Cos-1 sejtek transzfekcióját a Tx-cDNS {1-es azonosító-számon megadott szekvencia) kódoló régióját tartalmazó pcDL-SPalphaS9S vektorral, valamint a transzfekeiöt az lGEp45-őt tartalmazó pcDb-SRalpha.226 vektorral a korábban leírtak szerint végeztük el. A. sejtek morfológiáját 22 órás inknbálás után vizsgáltuk meg.

λϊηαΗο «ζ «

?. ábrán látható, gömbölyű sejtek megjelenését figyelhetjük meg, amelyek leválnak a hordozóról, és amelyek morfológiai megjelenése jellegzetesen hasonlít az IGE cDNS-sel. transzfektált apoptőzison keresztülmenő Cossejtekre C7D). Ugyanez a morfológiai változás figyelhető meg a Tx~c.DNS-sel transzfektált Cos - sej t kultúrákban (7C) .

Ugyanilyen morfológiai eredményeket kaptunk, amikor a fenti pcDNAl/Amp vektort alkalmaztuk IGE és Tx expresszáltatására transzfektált C.os-1 sejtekben.

Ezeket az eredményeket megerősítette a traszfektált és a transzé ekeié után 4 0 órán keresztül inkubált Gos-1 sejtekből, nyert DNS megfigyelése is. A sejtekből származó DNS-t microTurboGen reagenskészlet (Invitrogen) segítségével izoláltuk, agarózgélhen megfuttatva és BET-tel festve.

Amint a S. ábrán látható, az ICEp4S-tel (B sáv) és a Tx-szel (C sáv) transzfektált sejtek. DNS-ének van jellegzetes létraszerű” megjelenése, ami jellemző az apoptőzison kérésztúlmenő sejtekre.

Azok a sejtek, amelyeket DNS nélkül (7.A és 8A) , vagv cDNS-t nem {Ima.zó vektorral iranszfektál tűrik, sem morfológiájukat, sem DNS-űket szemlélve nem mutatják aoootőzis jeleit.

??

** ♦ * φ ♦ φ * * » φ < φ * φ «β ·» « * φ φ J* φ* «V Φ

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Tx-fehérje szerepet játszik az apoptő-zis indukáláséban,

3.példa A Ty-szek veneía azonosírása

A.,, A Tx-szel homológ gének klónozása

Emberi genomi DNS~t, amit perifériás vér mononukieáris sejtjeiből izoláltunk, HindiII-enzimmel (BoehríngerMannheim) majd a fragmenseket l%--os lxTAE-ve.l készült

agarezgőiben p	répa	rat	iv	d- -S-J	ct rotoré zzssm	si választottuk, el,
a már idézett.	Mán	iát	is	és Γ	ntsai. által	közölt körülmények.
között. A gélt	24	f ra	kei	.óra	vágtuk azon	a területen, amely

1,9 kb-nál nagyobb molekulasűlyü SNS-t tartalmazó felvivő helyeknek felelt meg, majd minden egyes frakcióról eluált DNS-t PCE alkalmazásával ampl ifikéi tűk. a fent leírt T2A (6os azonosífőszámon megadott szekvencia) és TxC (12-es azonosítószémon megadott szekvencia) oligonukl-eotidoka-t alkalmazva. Az amplifikálás körülményei a kővetkezők voltak: 94 ^eC, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 ®C, 1 perc, 30 ciklus, Bio-Tag* polimeráz (BioProbe).

A fenti 24 frakció közül a PCx alkalmazásával végzett amplifikáciö során a legjobb eredményt mutató tízet használtuk fel a továbbiakban. Az amplifikáit anyagot agar-özgélben tisztítottuk, TA kló-nozö reagenskészlettel (Invitrogen.) pCRll-vektorba kiónoztuk, majd Sanger módszerével megszekvenál tűk szekvenáz enzimei (2.0 verziószámú DNS-szekvenálö reagenskészlet} ihacrophor elektroforézis készüléket .(.Pharmacia System) alkalmazva. A meghatározott

7’ szekvenciákat a GCG szoftver segítségével analizáltuk az I. példában leírtak szerint,.

A kapott nukleotidszekvenciák .között azonosítottunk ecyy Ty megnevezésű szekvenciát, amelynek, nufcleotidjai .94,9%-ban azonosak voltak a Tx. cDNS-ének {1-es azonosítószámon megadott szekvencia.) megfelelő szekvenciával, arai lehetővé tette., hogy megkíséreljük a Ty-nak megfelelő oDNS klónozását B., A Ty-cDNS klónozása és azonosítása

a) A Ty-cBNS konszenzus-szekvenciájának meghatározása

A Ty cDNS-e 3 ⁵ - és 5’-végeinek nuklectídszekvenciáját emberi méhlepényből illetve 1éptől származó e.DNS-foől ön ”rögzített (anchored”) PCR-mődszerrel kaptuk meg.

A Ty cBNS-e 3’-végét a «3’RCE System” reagenskészlet (Gihoo-SRL) alkalmazásával és a következő oligonukleotidok s égi t s égéve1 amp1i f i ká11uk:

Ty3,2u CATGTCTCAT GGCATCCTA (24-es azonosítószámon megadott szekvencia) és a

Ty3,1; CTGGGGAACT CCGCATAAAA (25-ős azonosítószámon megadott szekvencia),

Ezt a két Iáncíndítőt a fentiek szerint megkapott Tyszekvencia 6. exonjának részleges szekvenciája alapján határoztuk meg. A kapott amplifikéit fragmenseket agarözgéiben tisztítottuk, pCRXI-vektorba klónoztuk, és szekvenáituk, a fent leírtak szerint. A kapott szekvenciák összeállítása lehetővé tette a Ty-eDMS-e kódoló régiója 3’~ részének, valamint a nera kódold 3’-régiónak a meghatározását .

A Ty cDMS-e 5’-végét a ** Humán Spleen 5 ’ -Race-Ready* cDNS-reagenskészlet (Cl-ontech) alkalmazásával és a következő oligonukleotidok segítségével ampiifikáitűk:

^,2X1 , >-”%.« ΓΓί^Ύζ-,χΓ’ι-'ίΓηΓτΓ’ΓΠ fWtspnv'ft’j’/'W rrs·—’TSjT’ ~ ^5 £T ο x/3Ai: ubLivIAbAv iv<aibV3i\jti viiiUAxbli b«.\Ai ZO-O& diO“ nősít©számo-n megadott szekvencia) és a

TySA4; CTTCTCCTCG TGGATCTTGC (a 27-es azonosító-számon megadott szekvencia),

Szt a két láncindítót a .fentiek szerint megkapott Ty-cDNS 3.‘-régiója szekvenciája alapján határoztuk meg ügy, hogy a TySAl lóncindítő esetében Xbaí és Xhol restrikciós helyeket is beépítettünk.. Az amplifikáit f ragmenseket azután TA klónozó reagenskészlet (Invitrogen) alkalmazásával kiónoztuk és szekvenáituk a fent leírtak szerint.

A nukieotidszekveneiák helyességéről a fent megadott TySAl (a 2f-os azonosítőszómon megadott szekvencia) és a Ty3-1 (25-ös azonosí tószámon megadott szekvencia.) öligonukleotidok, valamint a következő ol.igonukleotidokkal segítségéve 1 bizonyosodtunk megτ

Ty2 ; AGATGTTCTT CAT3GT (a 28-as azonosítőszómon megadott szekvencia)

Ty4: CTTCT-CA&TA TGGACCA (a 22-es azonosítőszómon megadott s zekvenci a}

TyS: CCTGGCTCTC ATCATAT (a 30-as azonosítószámon megadott

TyS: ATTTGCTGCC AGACCAGA (a. 31-es azonosít ős zárion megadott szekvencia)

Iy7; GCCTGCAGAG GTGAAAAAC (a 32-es azonos!főszámon megadott szekvencia)

X 4

Ty8: GCTCCATCTT CATTACGGA (a 33-as azonosítőszámon megadott szekvencia)

Työ; GATTTCTGTA CATTACGGA (a 34-es azonos £ tőszámon megértőt t szekvencia)

TyA: TTTATGCGCA GTTCCG (a 35-ős azonos.itőszámon megadott

S'ZSk\^;'6Tí.C 1 3 !

TyS; GTCATAGTGA GCCCCATT (a 36-os azonos!tőszámon megadott s zekvenc ia)

TyC: CTTCACGAGG ACAAAGT (a 37-es azonos!főszámon megadott szekvencia)

TyD; TCGCAAAGAG TCTACCA <a 33-as azonosífőszámon megadott szekvencia).

Ezeket az oiigonukleotirtokat a Ty kódoló szekvenciájából választottunk ki (kódoló szál vagy komplementer szál) .

Az összes kapott szekvenciát összeállítva kapjuk meg a Ty-cDNS konszenzus-nukleotidszekvencíáját (a 22-es azonosí kószámon megadott szekvencia).

.fo) A Ty-cDNS kódoló régiójának klónozása

A Ty-cDNS (22-es azonosítőszámon megadott szekvencia) kódoló régióját PCR segítségével ampiifikáltuk emberi lép vagy méhlepény eredetű cDNS-foŐl kiindulva a megfelelő ⁸5'R&CE-Ready* reagenskészletet (Clontech), a fenti TySAl (26os azonos!tőszámon megadott szekvencia) oiigonukleotirtot és a kővetkező oligonukleotidot alkalmazva<

TyP5; GGCGGA.TCCA. AGATGTTGGA ATACCTGGÖC AAA <39-es azonosétószámon megártott szekvencia).

Ezek az ampiifikáciős láncindítókat a Ty-cDNS (22-es a zonos í t ős z ámon megadót t s zekvenc i a) el őző 1 eg mégha t ár02ot t konszenzus-szekvenciája alapján választottunk ki ás szintetizáltuk meg RamHI klőnczóhelyet hozzáadva. a Ty?5 oligonu'kl eotidhoz.

Az ampii.fikált és agarőzgélben tisztított, kb. llöö bp. hosszúságú amplifikált terméket BamHI. és Xbaí enzimekkel emésztettük, majd az 1. példában, leírtak szerint klónoztuk pcDNAI/Amp vektorba, és ahogy fent is jeleztük, megszekvenáltuk. A klónozott, termék mindkét szálát teljes egészében megszekvenáltuk a fenti 28-as azonos!főszámon megadott szekvenciájű és 38-as azonosítő.számon. megadott szekvenciájű oligonukleotidők segítségével,

A Ty-cDNS (22-es azonosífőszámon megadott szekvencia) konszenzusszekvenciáiának kódoló szekvenciájával azonos szekvenciát kaptunk. A. Ty~cDNS kódoló szekvenciájának homölőgiáfc mutat az 1. példában kapott Tx~cDdS kódoló szekvenciájával, ami nukleotidjaik 84%-ának azonosságát jelenti ..

A Ty-cDNS kódoló régiója a Ty-fehérjét kódolja, amelynek származtatott aminosav-szekvenciáját a 23.-as azonosító-számon adtuk meg. A. Tx-fehérje szekvenciája 364 arainosavből áll, számított molekulatömege 41,8 kD.

A Tx-fehérje szekvenciája 75%-os homológ!át mutat az 1. példában kapott Tx-fehérjével, ha az aminosavak azonosságát tekintjük.

Bgy, a Ty-oDKS-f kódoló régiót a pcDNAI/Amp vektorba (Ty cDWA/ocDRAl 13/07/94) klónozva tartalmazó S. coli XL-isejtekből álló mintát a CNCM-nél helyeztünk letétbe 1395 iölins 5-én az 1-1068 azonos!tőszámon.

·>

* *

4. példa A Ty-fshérj.e biológiaí _ hatásai

A., Apoptézis indukálásá

A Ty-fehérje apopfózist indukáló képességét sz 2. példában említett végrehajtási eljárás alapján, a Ty~cDNS kódoló régióját tartalmazó peDL~SRaIpha296 vektorral - amelyet igy pcDL-TY-na'k neveztünk - trans2fektált Cos-sejtek alkalmazásával teszteltük. A pcDh-TY előállítását a 2. példában a Tx-cDNS szubklónozása kapcsán leírt körülmények között végeztük el.

A sejtek morfológiáját 23 órás és 9 3 órás inkubálás után vizsgáltuk meg, az izolált DNS vizsgálatát pedig 43 órás inkubálás után.

Az eredmények, amelyeket a Tx kódoló régiójával vagy az ICSp4S~ót tartalmazó vektorral transzfektáit sejtekkel összehasonlítva kaptunk, megegyeznek azokkal, amelyeket Txfehérjére kaptunk, és a 2. példában valamint a ?. és· a 3.

ábrán mutatunk be.

Ezek. az eredmények azt mutatják, hogy a Ty-f ehérje a Tx-fehérjéhez hasonlóan részt vesz az apoptőzis indukálásá bán.

3., A Ty-fehérje proteáz akti vitása

Azt, hogy a Ty-fehérje képes-e önmagát hasítani intermolekulárisan, eukarióta sejtekben egy kot.ranszfekoiős rendszerben teszteltük, hasonló körülmények között, mint amelyeket a 2. példában az ICS prekurzorának Tx általi hasításánál leírtunk. A kotranszfekcíő úgy történt, hogy Cos1-sejtekbe egyszerre juttattunk be egy, a Ty-cDNS-t (22-es «r azonosítószámon megadott szekvencia) tartalmazó- vektort és egy vektort, amely a módosított Ty-fehérjét kódoló DNS-t tartalmazta, ahol az említett vektorok, rendre a 2. példában leírt pcDIi.-SRaipha296 expressziős vektor és pcDNAI/'Ampve kt or vo 11 ak.

A Ty-fehérjét kétszeresen módosítottuk, egyfelől a 245-ös Cys kodon j át -szerin-kodonná változtattuk átfedő overlapping PCR-módszerrel, másfelől egy T7-epitóp toldalékot. (MASMTGGQQNG) kapcsoltunk a Ty-fragmens N-terminális végéhez. A Ty-fragmens a 23-as azonos!tőszómon megadott szekvencia SS. és 3S4. aminosava közötti -szakasz volt.

Az alábbi láncindítópárokat alkalmaztuk a Ty-cDNStemplát amplifikáiása során: a) Egyfelől a

T7Ty:

CGCGGATCCA CCATGGCTTC TATGACAGGA. GGTCAACAAA TGGGACAAAA

GATCACCAC4T GTAAAACC (40-es azonosítössámori megadott szekvencia) láncindítőt, amelyet a Ty kódoló szekvenciájából választottunk ki , es amelyet, egy SamHI restrikciós hasítőhely és az ezt, követő T7-toldalékot kódoló szekvencia hozzáadásával szintetizáltunk, meg, é-s a

TyC.245SR:

ATGTTTTTCA CCTCTGGAGG CCTGGACAAT GATGAC (41-es azonosítószámon megadott szekvencia) láncindítőt, amelyet a Ty (komplementer szál) kódoló szekvenciájából választottunk ki, de a 17-es helyen egy C~»G mutációt építettünk be.

ί κ χ 99 * * * * « 9

Φ * ♦ ί χ φ « < » * * « • »4 Ό«ί 9

b) Másfelől a

TyC245S :.

GTCATGA7TG 7CGAGGCCTC CAGAGGTGAA AAACAT (42-es azonosítőszáaon megadott szekvencia) láncindítöt alkalmaztuk, amelyet a Ty kódoló szekvenciájából választottunk ki, de a 2ö~as helyen egy G-»C mutációt építettünk be, valamint a fenti

TySAl (25~os azonosí.tőszámon, megadott szekvencia) láucindítot. Az amplifikáció körülményei a kővetkezők voltak: 94*0, 1 perc; 60°C, 1 perc; 72°C, 2. perc; 30 ciklus;

Vént. - tol .ímeráz (Bioiabs) . Az amplif ikácíőval kapott két terméket egyesítettük, és PCR-re1 ampliflkaitűk a T7Ty és a TySAI láncindítók alkalmazásával az. előzővel megegyező körű 1mények kő ző11.

Az amplifikácíőval kapott terméket BamB'I és Xbal restrikciós enzimekkel emésztettük, majd az előzőleg ugyanazon. restrikciós enzimekkel megemésztett. pcDNAI/Alapvektorba klónoztuk. A kapott plazmidot pT7TYÁ67C245S-nek neveztük el. A kapott szekvenciát teljes egészében igazoltuk DNS -szekvenálással.

A poDL-TY-plazmidot, ami nem volt más, mint a pcDLSRalpha2S5 expressziős vektor és a belé szubklónozott TycDNS-szekvencia (22-es azonosítőszámon, megadott szekvencia) együttesen, a fent leírtak szerint preparáltuk,

A Cos-1-sej beket vagy a pT?7YÁ€7C245S-vektorral t.ranszfektáltuk, vagy pedig ezzel a plazmáddal és a pcDLTY-plazmiddal együttesen kotranszfektáltuk, majd 23 vagy 43 órán keresztül tenyésztettük őket. A sejteket feltártuk és ' s * ΐ * ♦ » * se ν » # *· ♦ $

'.·* i poliakrílandd-gélelektroforézisssl valamint egérből száimzó T7 elleni moncklonális antitest felhasználásával Western -biot tai analizáltuk, a 2. példában leírt végrehajtási körülmények szerint, azzal a különbséggel, hogy a egérímmunoglohuliú elleni kecske antitesthez ebben az esetben alkalikus foszfatáz helyett torma peroxidázt kapcsoltak. A membránhoz kötött antitesteket azután az kCh Western” detektáló rendszerrel {Amersham) tettük láthatóvá autoradiog.ráf ia alkalma zásával.

A transafekciót illetve a kot. ránéz féke lót ugyanígy hajtottuk végre a pcDL-SRalpha29€' vektorral önmagában, illetve vele és a peDNAI/Amp vektorral együttesen,, és a sejteket 23 -órán keresztül tenyésztettük.

Amint az a 9. ábrán látható, amikor a mutáns Ty fehérjét önmagában expresszáltat tűk a transzf ektált Cos-1 sejtekben, a T7Ty-f ormát (kb. 30 kD 'látszólagos molekula tömeg5 lehetett kimutatni (S sáv). Az alacsonyabb molekulatömegnél jelentkező csíkok hiánya arra utal, hogy a mutáns Ty-fehérje képtelen önmagát hasítani. Amikor a sejteket kötranszfektéitűk a Ty-t tartalmazó vektorral (F és G sáv) , 32 erős csík megjelenése 20 kD látszólagos molekulatömegnél megfelel a Ty-fehérje által elhasított mutáns Ty-fehérje hasított fragmensének.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Ty-fehérje egyfelől expresszálődik a txanszfektált Cos-sejtekben, másfelől proteázaktivltása van., és főként önmagát képes hasítani íntermoiekulárlsan, $·»· * > # 9 χ χ , > ♦ * * * * ♦ ' * · -* « 4»íll, s* w /

SZEKVENCIA LISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1291 bázispár TÍPÍÍSA: nukieinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS; cDNS

EREDET:

ÉLŐLÉNY: ember

SAJÁTSÁG: :

NÉ-V/'MSGJELÖLSS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 42 ....1172

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCTCTTTCCA ACCCTCTAAA AAAGOACAGA COCTCTTCCC 7 ATG GGA GAA CCC Hét Alá Glu Gly

AAC CAC

ACA

AAA

AAC

GC«

CCC

AAG

U ÍV

4. Λ

GAA

ccc

Í-Mf*/* V*V

COL

AAA

GAT

Asn His

Arg

Lys

Lys

Ars

Lau

Lys

Val

Lsu

Gl«

Ser

Leu

Gly

Lys

Asp

5

10

15

20

CCC ccc

ACT

GOT

V λ A

TTC

Z* * X* W-Λ A

AAC

C á c

GTC

CAA

CAA

AAT

GTA

CTG

AAC

?hs Ls«

Thr

Gly

Val

Lee

Asp

Asn

ixSli

Val

üiU

G'X&

Asn

Val

Lee

Asn

··>£' A. Α»

30

35

Λ* ν* >»·«, /* A 'mX ví ΛΛ«

CAA

CAG

CAA

* *, X Ζ5ΛΛ

AA^

AAA

CAC

TAG

CAT

ΛΑ 4X Xtf 4.

AAA

Λ-Ui

GAA

GAC

Trs Lys

Clw

Glu

Giu

Lys

Lys

Lys

Cyr

Tyr

Asp

Alá

Lys

Thr

Obi

Asp

40

45

50

101

149

19?

* r

♦ *

h <·,

* * «

z

s ZS í·^

» «

* i J·

* *

«

«>

·* « 9

x\£fc

AAA

GTT

Gi C

-x Λ* W

GCA

/* * szΛν

Λ’νζ'Ν'}»

Λ X ζ$

CAA

GAG

AAG

CAA

CSC

ATG

ce&

245

Lys

V&l

Arg

Val

Ken

Alá

Asp

Ser

Hét

Gin

Gin

Lys

Gin

Arg

Mefc

&X&

55

80

SS

GCA

CAA

ATG

V'* -Os

ctt

CAA

AGG

fJMAgtfJN

•4» i ί

AAC

ATA

GAC

CAA

ATA

**><**?« t-L·

Sx'Vx'Sx·

293

Gly

Gin

két

Lan

Gin

Thr

Phe

Phs

Asn

IXe

Asp

Gin

He

Ser

Pro

?5 gO

AAT Aan 55

AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG CCT

GGA Gly SS

CCA Pro

CCT Pro

GAG GXu

TCA GGA

341

Lys

Lys Alá Kis

Pro Asn Két. 90

Gla Alá

Ger

Giy 100

CAA

TCT

AGA GAT GCG

CTG AAG CTT

TGT

GCT

CAT

GAA

GAA

TTC

CTG

AGA

385

Gin

Ser

Thr Asp AXe

Len Lys Lee

Cys

Pro

Kis

Gin

Gla

Phe

Len

Arg

105

110

225

CTA

TGT

AAA CAA AGA

GCT CAA GAG

ATG

TAT

CGA

ATA

AAG

GAG

AGA

AAC

437

Len

Cys

Lys GXn Arg

A,.e Gin Gin

ZXe

Tyr

Pro

He

Lys

Gin

Arg

Asn

120

125

no

AAC CGC

AGA CGC CTG

GCT CTG ATG

ATA

TGC

AAT

AGA

GAG

TTT

GAC

GAT

4SS

Aan Arg

Thr Arg Len ,

Alá Lee Xie

He

Cys

Asn

Thr

Gla

Phe

Asp

Kis

135

140

145

CTG

CCG

&GC' AAT OQA

GCT CAC TTT

’ CAC

ATC

ACA

GCG

ATG

AAG

GAG

533

Len

Pro

Pro

Ar§ Asn Gly

Alá Asp Phe

Asp

He

Thr

Gly

P.eh

Lys

Gin

ISO

IS 5

150

CTA

Xw> -Z 4.

GAG

f*/*·** Λ^ΛΛ VÍV*

TAT AGT GTA

GAT

GTA

CAA

GAG

AAT

CTG

ACA

581

Lee

Len

Gin

Oly Len Asp

Tyr Ser Val

Asp

Val

GXn

Gr n

Asn

Le«

Thr

155

170

175

ISO

\z<^U

AGG

GAT

ATG GAG TCA

,«% X* » y*, Λ WGV V*V PiVfSZ

GCA

TTT

GnT

ACC

AGA

CCA

GAG

53 S

Alá

Arg

Aap

Mer Gin Ser

Alá Le a Arg

Alá.

The

Alá

Thr

Arg

Pro

Gin

1S5

190

IS 5

CAC

AAG

TCC

TGT GAC AGG

AGA TTC TTG

x> VaA

CTG

X «'A z-iitz

TCT

χ·»·χ «X*

,/*./♦·,«*

x wyx ΛΛΛ*·

577

Hls

Lys

Ser

Ser Asp Ser

Thr Pse Lee

Val

Len

Kér

Ser

Kis

Giy

X Xa

200

205

210

ν*

*♦>**>>♦ v.*v Len

GAG Glu

XXν'» ». vvA Gly 21S

ATC lie

*<*/*-/* i'VV Cys

GGA Gly

ACT *** *« ·*

UTG Val 220

*** 'Τ' Gri4. Kis

GAT Asp

GAG \? iU

.AAA Lys

AAA CCA

GAT Asp

Λ6Λ\,Λ VÍAVÍ Vei

/ χ» *2

Lys 225

Pro

i V

TAT

GAC

ACC

ATC

*. .X W

CAG

ΑΤΑ

TTC

AAC

AAG

CGC

AAC

TGC

CTC

χ* «χ *t 4 4 □

Leu

Leu

Tyr

Asp

Thr

lie

Phe

Cin

11»

Phe

Asn

Asn

Arg

Asn

Cys

Leu

230

23s

240

AGT

CTG

AAG

GAC

AAA

ccc

**/·*

GTC

ATC

ATT

CTC

CAG

GCG

TCC

ACA

GGT

821

Sár

Leu

Lys

Asp

Lys

Pro

Lys

Val

lie

21»

Vei

Cin

Alá

Cys

Arg

Gly

24S

2SG

255

250

CCA	AAC CCT	CCC	GAA CTC	TGG GTC	AGA	CAG TCT	CCA	GCA	TCC TTG	GAA	839
Alá	Asn Arg	Gly	Giu Leu	Trp val	Arg	Asp Sísjr	Pro	A1.&	Ser Leu	Glu
			2S5			270			273
G χ G-	z*/*·»** 1 t 1	TCA	CAG TCA	«'f*/·*-·** /»* > ex Λ;v v. u.r\tí	AAC	Λ· -Λ •bi.v óng	GAA	CAT	XX· >*»>*> XX .χβοΐ» wUX Wi *	TAC	327
vei	Alá Ser	Ser	Gin Ser	Ser Giu	Asn	Leu Glu	Giu	Asp	A.X& v&x	Tyr
		280			233				230
AAC	ACC CAC	GTC	GAG AAC	GAC TTC	ATT	**>»> \-> U λ A Ά \λ	Λ*χ* X*		TCA ACG	CCA	3 SS
Lys	Thr Kis	Val	Glu Lys	Asp Phe	11»	Alá Phe	Cys	Ser	Ser Thr	Pro
	293			300				30-5
CAC	AAC v> a 0	TCC	TGG AGA	X” x .,·» X X* x> Vrt'w	ACA	A a G CC C	.;. V x	ATC	TTC ATC	ACA	2013
His	Asn Val	Ser	Trp Arg	Asp Ser	***	Kér Gly	Ser	Tle	Phe lie	Thr
	310			315			320

CAA CTC ATC	ACA	XXVVV^X XX X <«X vrtW	·*· X x *<* * w> ΛΛΛ X Λ 4,	***^T	χχτχΧΧ* X W	TCC	TCC	CAC	CTA	CAG	1052
Gin. Leu lie	Thr	Cys Phe Gin	Lys Tyr	Ser	Trp	CyS	Cys	HiS	Leu	CfXu
325		330								340
GAA GTA TTT	CCC	AAG CTA CAC	CAA TCA		X*· X *. U-ΛΛ	ACT	CCA	AGG	GCC	ΑΛΑ	2103
Giu Val Ph®	Arg	Lys Val Cin	Gin Ser	Phe	Glu	Thr	Pro	Arg	Alá	Lys
		34 5		350					355
m'ví Λ á Lz	CCC	ACC ATA CAA			ATG	ACA	AGA	TAT	TTC	TAC	12S7
Alá Gin Kér	Pro	Thr He Giu	Ars Leu	Ser	Kér	Thr	& p-x*	λ yj.	Phe	•*.y*·

350 355 370

GCC AAT TGAAAATCGA AGCCACAAGC ACCCCAGCC

TCCTTAA'TCA

1212

Leu Phe Pro elv Asm * /***»

X* ««Ό ,Λ> x A Λ *» Λ Λ\ί ς· Λ\νΛν *.«.

A?*/*

ACATTTTCTA TTTCAATAAA

1272 ;75 ‘ 2S Sl/*;** í* ?*«*

UVrtV>,

Άί> χ GAAGACA ΛΛΑΑΛΛΛΑΛ

USX ♦ φ φ

Λ.ΤΪ *1 / « »

Α 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 377 amínosav

TÍPUSA: amínosav

KÖNEIGURÁC IÓ: 1 ineári s

MOLEKULÁT íEUS: fehérje

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Aia Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro tea Lys Val Leu Glu Sex

Lau Gly Lys Asp Phs Lea Thr Gly Vei Lea Asp Asn Lea Val Gla Gin

Asn Vei Lea .Ásó Trp Lys Gly Gla Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Alá. 35 40 <S

Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Alá Asp Sár Met Gin Glu Lys 50 55 60

Gin Arg Met Alá Gly Gin Ken Lea Len SS 70

Gin Thr PHe Phe Asn lle Asp

Gin Xle Ser Pro Asn Lys Lys Alá Kis Pro Asn Két Glu Alá Gly pro §5

Pro Gla Ser Cly Glu Ser Thr Asp Alá Lea Lys Lea Cys Pro His Glu

110

Gla Phe Leu Arg Lea Cys Lys Gla Arg Alá Glu Gla He Tyr Pro 11© 115 120 125

Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Lea Al. 130 125 ,su lle lle Cys Asn Th:

Glu Phe Asp Kis Lea Pro Pro Arg Asn Gly Alá Asp Phe Asp 11® Thr 14S 150 1SS 150

Gly Két Lys Gla Lea Lea Gla Gly Lea Aso Tar Ser is:

Asp Val Gla 175

Λ Ο •S ώ

Glu Asn Leu

Thr ISO

Alá

Arg

Asp

Heh

Gitt IS 5

Ser Alá

Len Arg

Alá 190

Phe Ale

Thr

Arg

Pro

GXu

Kis

Lys

Ser

Ser

Asp

Ser

Thr

Phe

Len

Val

Len

hét

135

200

205

Ser

Kis

Gly

11®

Lett

Glu

Gly

He

Cys

Gly

Thr

Val

31®

Asp

Gitt

Lys

210

215

220

Lys Pro Asp Val Leu 22$ lett Tyr Asp Thr 230

11« Phe Gin

235

IXe Phe Asn Asn 240

Arg Asn Cys Len Ser Lau Lys Asp 245 /s Pro Lys Val He Iie Val Gin 250 255

Alá Cys Arg Gly Alá Asn Arg Oly 2 £0

Alá Ser Leó Gitt Val Alá Ser Ser 225 280

Asp Alá Val Tyr Lys Thr Kis Val 230 _35s

Ser Ser Thr Pro Kis Asn vei Ser 205 no

Gitt Len Trp Val Arg Asp Ser Pro 2S5 - 270

Gin Ser Ser Gitt Asn Leu Gitt Gitt 2SS

Cin Lys Asp Phe He Alá Phe Cys 300

Trp Arg Asp Ser Thr Mer Gly Ser SIS 320

He Phe He Thr Gin Lea He Thr Cys Phe Gin Lys Tyr Ser Trp Gye 325 330 335

Cys Mis Le« Gitt Gla Val Phe Arg Lys Val Gin Gin Ser Phe Gin Thr 340 345 350

Pro Arg Alá Lys Alá Cin Kér Pro Thr He Glu Arg Leu Ser Heh Thr 355 350 355

Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn 375

370 “ϊ

Íff » « « « a « « *Φ»«

A 3. AZONOSÍ TÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAT::

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 20 bázíspár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

KON.E1GURÁCTŐ : lineáris mLSKöLATTPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: ο 1 i gonu k le ot i<T

PUBLIKÁLÁSI INFORMÁCIÓK:

SZERZŐK: Thonrberry, Nancy A.

Bull, Herbert, G.

Calaycay, Jimmy R,

Chapman, Kevin. T.

Howard, Andrew D.

Kostura, Matthsw J.

Miller, Douglas K.

Molineaux, Sussn M.

Weidner, Jeffrey R.

Aunins, John

CÍM: „A növel heterodimerxc cysteiné protease is required fór interieukin-lbeta pro.cessz.ing in wnocytes

FOLYÓIRAT: Natúré

ELTET: 356

OLDALSZÁM: 768-774 DÁTUM: 1992. április 30.

A 3. AZ.SZ. S2E.KV.-BŐL ÉRINTETT NUKLEOTIDOK: 1-20.

A 3, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:

ACATGACTAC AGAGCTGGAG

A 4. AZONOSÍTÓ' SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 20 bá2lepár

TÍPUSA: nuklentid

HÁNY SZÁLÚ: egy

KONFIGURÁCIÓ: lineáris

MOLEKULÁI!FOS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oiigonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MKGJELÖLÉS: misc_feature ELHELYEZKEDÉS : komplementer (1. .-20>

PUBLIKÁLÁSI INFORMÁCIÓK:

SZERZŐK: Thonrberry, Nancy A.

Bu1I_f Herbert, G.

Calaycay, Jiwny R..

Chapman, Kevín T.

Koward, Andrew D.

Kostura, Matthew J.

Miller, Doaglas K.

Molineaö'X, Susan M.

Weidner, Jeffrey R.

Aunins, John

CÍM: „A növel heterodimeric oysteine protease is required fór In tér leu kin-Ibet a process-zíng in monocytes

- Γ- 7. S-'·' X

FOLYÓIRAT: Natúré

KÖTET: 356

OLDALSZÁM: 763-774 DÁTUM: 1992. április 30.

A 4, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

CACCACGGCA GGCCTGGATG

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 235 bázíspár

TÍPUSA; nukieotid

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomí DNS

EPEDET:

ÉLŐLÉNY: ember

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

•GAAATGACTA CAGAGCTGGA GGCATTTGCT CACCGCCCAG AGCAC&AGAC CTCTGACAGC 80

ACCTTCCCGG TGTTCTTGTC TCATGGTGTT CGGG.AAGGCA TTTGTSGGAA GAAATACTCT 120

GAACAAGTCC CTGATATATT ACAATTCAAT GAAATÁTTTA AAATGTTGAA TAGCAAGA&C 18Ö

TGCC'CA&GTT TGAA8GAC&A ACCCAAGGTG ATCATCTTCG AGGCCTGCTG TGGTG 235

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 23 Lásispár TÍPUSA: nukleotid HÁNY SZÁLÚ: egy KONFIGURÁCIÓ:

lineáris

Φ V bz'

MD LE KU LA TÍPUS: e g yé b n u. ki e i n s a v

LEÍRÁSA: ,,olIgonukieotid*

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELŐLÉS: mise feature ELHELYEZKEDÉS: 1. . .23

EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyzés: S.az.sz.szekv. A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTACAGAGCT GGAGGCATTT GCT

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nuklectid

HÁNY SZÁLÚ: egy

KONFIGURÁCIÓ: lineáris

MOLEKULÁT!RCS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oligonukieotid*

SZÁRMAZÁS :

NÉ ./MEGJELÖLÉS: mi s-c_featu re ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1. . .24)

PUBLIKÁLÁSI INFORMÁCIÓK:

SZERZŐK: Thonrberry, Nancy A.

Bull, Berbert, G.

Calaycay, J'immy R.

Chapman, Kevín T.

Howard, Andrew D.

Kostára, Mátthew J.

Miller, Douglas K.

* * * * « >t ♦ * ? K * Φ A * * « « #««« *♦ «« ·$

Molineaux, Susan M.

Weidner, Jeffrey R.

Aunins, John .A növel heterodimeric cysteine protea.se is requíred fór interleukin-lfoeta prooessring in monocytes'

FOLYÓIRAT: Natúré

KÖTET: 356

OLDALSZÁM: 768-774 DÁTUM: 1992. április 30.

A ?. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTAATGTOCT GGGAAGAGGT AGAA

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: effy mon?!

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „ ol igonukleotid'

SZÁRMAZÁS :

NÉ/MEGJELÖLÉS: rcísc_£eatu.re

ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...21}

EGYES INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementet ssekvsncie:

I ..az. sz . szekvenciában : 753-773 .

A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGGCAGTTG CGGIIGTTGA A 21

Χφ; Λ» 9χ * ® * * * 9 * > « * * * * *

X # 9 χ 9«y«

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁND SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

KOSSZA.: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TO POLöGIÁJA: 1ineáxis

MOLEKULÁT!PUS: egyéb nukieinsav

LEÍRÁSA: „oligonukleoticT

SZÁRMAZÁS:

NÉ /MEG JELÖLÉS : misc__f eature ELHELYEZKEDÉS: komplementér (1,..21)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie 1 .az .sz. szekvenciában; :829-8-4 9.

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTCTGACOCA CAGTTCCCCA C 2

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PÜS: egyéb nukieinsav LEÍRÁSA: ,..eligonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJ'ELÖLÉS: misc~f.eature ELHELYEZKEDÉS: 1-17

S;

’“í ,· » i ·*}

EGYÉB INFORMÁCIÓK; segjegyzés:1.az.S2.szekvenciában: 659-711.

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

AACTGTGCAT GATGAGA

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 foázíspár

TÍPUSA; nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

ΤΟ RO XÓ GIA JA: i ineárí s

MOLEKULÁTÍFUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oligonukleotid'

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise_festure ELHELYEZKEDÉS; 1 ... 9

EGYÉB INFORMÁCIÓK; megjegyzés;1.az,sz.szekvenciában; 905-913.

SZÁRMAZÁS;

NE/MEGJELÖLÉS: mise featare

ELHELYEZKEDÉS: 11... 19

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés tl.az.sz.szekvenciában; 315-923.

A 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGATGCTGTG TAGAAGACC **·$ ♦* * % * ♦·$·

Α 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 17 bázispár ?í PU5 A: nukleotid HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris MOLEKULÁT!PUS; egyéb nuklelnsav LEÍRÁSA: „oligonukleotíd'

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS; adscjeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK; megjegyzés: komplementer szekvencie;

1.32. S2 . szekvenciában : 7 95-8.11.

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

^•...('.ϊνύΛ.-ίΑ ’i όΑΙοΑΌ r 7

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTIPUS: egyéb nuklelnsav

LEÍRÁSA: ,, oligonukleotíd

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise teatűre ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...17)

* 9

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie 1, az . sz. szekvenc iában: 995-101.1.

A 13. AZONOS ÍTÓS-ZÁMŐ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGATGAAGAT AGAGCCC 1

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZALU: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁI!POS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA; „oligonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MSGJBLölÉS: mis'c_feature ELHELYEZKEDÉS: 1 ... 17

EGYÉB INFORMÁCIÓK:: megjegyzés: 1.az.sz . szekvenciában:

204-220.

A 14. AZONOS.Í.7ŐSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGGGTCATGG CAGAGTC .17

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav * » Λ ♦ >♦»»

LEIRASA: „ο1igonukieotId

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: misc_íeature ELHELYEZKEDÉS : 1...17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencia:

1.az.sz.szekvenciában: 249-2€5.

A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTTTGAAGAA GCAITTG 17

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HO S S 2A: 17 bás i spá r

TIBÚSA: nukieínsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PHS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oligonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise^íeature ELHELYEZKEDÉS : I... 17

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés:1,az.sz.szekvenciába 33Ö-346.

A IS. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

COTGAGTCAG GAGAATC 17

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár ·* * « * ♦ ♦ χ * * V 4 4 * ♦ * * 4 4 *44» *

TÍPUSA: nukieotíd HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLSKULATÍPUS: egyéb nukieinsav LEÍRÁSA: „ oligonukieoticF SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: m£sc_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1....17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencia:

l.az.sz.szekvenciában: 375-391 A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGTCTCAGGA ATTGTTC 2 Γ

A 1,8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

nOSsrA: ί í oazispar

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA : lineáris

MO LE KJ LA T ί P U S : a g y eb nu fc 1 e i n s a v

LEÍRÁSA: ,_f ol.igonuk.le.Qtid

SZÁRMAZÁS:

NÉ /MEGJELÖLÉS: misc^íeature ELHELYEZKEDÉS: 1-17,

EGYES INFORMÁCIÓK: megjegyzés: 1. az. sz .szekvenciában:

5Ö3-519.

A IS, AZONOSÉ 70 SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Hwv x uAt l χ x «ftvrt i xri χ í ♦ ♦ * ♦

# X-»· * * ♦ * X * X Λ

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI::

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1? bázispár

TÍPUSA: nukleínsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TO PO LÓ GIÁ JA: lineáris

MOLSKULATJPJS: egyéb nukleínsav

LEÍRÁSA; „oligonukieotíd*

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS : miscyf eafcure ELHELYEZKEDÉS; komplementer (1...17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer saekvencie 1. az. sz , szekvenciában: 587-60-3.

Ál .-Γ'···* X ,··>.?p,··-' Γ' Ά 'T¹ Τ' w-í··* '•jCü vlb*hL· i ·- %-A ί.Λ i

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: .33 bézíspár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleínsav

LEÍRÁSA: „öligonukIeot i d

SZÁRMAZÁS:

NÉ /MEGJELÖLÉS : mi-so__featűre ELHELYEZKEDÉS : 13.,,33

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés:1.az.sz.szekver 'r?-- aba:

42-62 .A 20, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGATCCA CCATGGCAGA AGGÜ.AACCAC AGA

A 21, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár TÍPUSA: nukleotid HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁTÍPÚS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: ,,oiigonukleotid

SZÁRMAZÁS :

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementet (19..,39)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvenc;

1.. az. sz . szekvenciában: 11.55-1175.

A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCTCTAGAC TCGAGTTATC AATTGCCAGG AAAGAGGTA

A 22, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1.310 baoispár ιιγΛλ: RUKi-eo'«.ia

HÁNY SZALU: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULA TIP US: cDNS

SZÁRMA.

	ÉÉ/MEGJELÖLÉS:	CDS
	ELHELYEZKEDÉS:	104..1195
A 2	!2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ	SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAACAACCTG GCTGGACAAA CATCTATCCA GACCCTACTA CCTAATACGC ATCAAAAGTC 60

GACCAGTCTA AAAAAAGACA ACCACAAAAA AAAAACACTT AAG ATC TTG GAA TAG 1X5

Hét Leu Glu Tyr

CTG CCC AAA GAT	GTT CTT	CAT GGT GTT TTT AAT	TAT TTG	GCA	. AAA	. CAC	XS3
Leu Gly Lys Asp	Vei Lea	His Gly Val The Asn	Tyr Leu	Alá	Lys	Kis
5	10	IS				20
GAT GTT CTG AGA	TTG AAG	GAA CAG CAA AAG AAA	AAA TAT	TAT	CAT	GCC	? 1 ? 4* a
Asp Val Leu Thr	Leu Lys	Via Glu Glu Lys Lys	Lys Tyr	Tyr	Asp	Alá
	25	30			35
AAA ATT GAA GAC	AAG CCC	CTG ATC TTG GTA GAC	TCT TTG	CGA	AAG	AAT	259
Lys Tle Glu Asp	Lys Alá	Leu lie Lea Val Asp	Ser Leu	Arg	Lys	Asn
4 3		45		50
/‘ί**.**' j**!*/·* Λ,**’» ««.*< v5 χ. ií vV« \^·Λ.Χ	CAA ATG	TTT ACC CAA ACA GTT	CTC AAT	ATG	GAC	CAA	30?
Arg Val Alá Hxs	Gin Hét	The Thr Gin Thr Lea	Lea Asn	Heh	Asp	Gla
55		80	65
AAG ATC ACC AGT	GTA AAA	/»*·<>* .«*» * * > - \a í. á ΟΛΛ A 4 \x-	GAG GCT	GCA	CCA		355
Lys lie Thr Ser	Val Lys	Pro Lea Lea Gin lle	Gla Alá	Gly	Pro	Pro
70		7 5	80
GAG TCA GCA GAA	TCT ACA	AAT ATA CTG AAA CTT	ί»,·'»»*» .4.VÍ VV'*	CCT	CAA	GAA	403
Glu Ser Alá Glu		Asn lle Lea Lys Lea	Cys ?ró	Arg	Glu	Glu
SS	so	95				ICO
TTC CTG AGA CTG	TCT AAA	AAA AAT CAT GAT CAG	ATC TAT	CCA	ATA	AAA	451
Fhe Leu Arg Lea	Cys Lys	Lys Asn His Asp Gla	Lle Tyr	Pro	lle	Ly«
	105	110			115
AAG AGA CAG GAC	CCC AGA	.<*>/* ?** ΛΆ»,Λ> *»<* V··^ V' V«*Ájf Afv»*- *> iV Λα Κ·	ATA TGC	AAT	AGA	AAG	495
Lvs Arg Glu Asp	Arg Arg	Arg Leu Alá Leu lle	lle Cys	Asn	Thr	Lys
120		125		.130
TTT GAT CAC CTG	CCT GCA	AGG AAT GGG GCT GAC	TAT GAC	ATC	GTG	CGG	S4?
The Asp His Lea	Ars? Alá	Arg Asn Gly Alá His	Tyr Asp	lle	Val	Gly
135		140	145

χ Λλ V

AAA Lys 150

AGG Arg

CTG Lee

W Λ Λτ Lex

CAA Gin

GCG Oly 155

CTG Lv&t*

GCG Gly

CAC Tvr

ACT Thr

GTG Val ISO

Val

CAC Asp

GAA Cl«

AAG Ly®

595

ΑΑΤ

Ver Ί 5β^

ACA

/» z*z*

ÁCG

GAT

λ ·***«* Λ-i Lí

GAG

ICA

GTG

GTG

ACG

GCA

t. A Jtf

\AV*4e.

CCC

843

Asn

Lee

Tár

Alá

Arg

Asp

her

Giu

Ser

Vei

Lee

Arg

Alá

Phe

Alá

Al®

165

170

1?5

ISO

AGA

CCA

GAG

GAG

AAG

*ΛΧ*Λ Je

TeT

GAG

AGC

AGG

TTC

TTG

GTA

CTG

ATG

TCT

591

Arg

Pro

Gin

His

Lvs

Ser

Ser

Asp

Ser

Thr

Ph®

Lee

val

Lee

Hét

Ser

185

190

195

CAT

GGC

ATC

CTA

GAG

GGA ATG

«*/* x>* á UK

GGA

ACT

GGG

CAT

AAA

AAG

AAA

AAA

739

Gly

He

Lee

Gle

Gly He

Cys

Giy

Thr

Alá

His

Lys

Lys

Lys

Lys

200

20S

210

Vv^váP

GAT

CTG

CTG

Uii

TAT GAG

AGG

ATC

TTC

CAG

ATA

A >. v-

AAC

AAC

CCC

78?

Pro

Asp

Val

Lee

Lee

Tyr Asp

Thr

lle

Phe

Gin

lle

Phe

Asn

Asn

Arg

215

220

225

AAC

TCC

CTC

AGT

CTA

AAC CAG

AAA

....

AAG

ATC

ATT

GTC

CAG

CCG

635

Asn

Cys

Leu

Ser

Lee

Lys Asp

Lys

Pro

Lys

Val

He

lle

Val

Gin

Alá

230

235

240

TGC

AGxA

>*» KA \Z i

GAA

AAA

CAT GGG

GAA

CTG

wx*z*

GTC

AGA

GAG

TCT

CCA

GCA

863

Cys

Arg

Gly

Gle

Lys

HiS Giy

Gle

Lee

Val

Arg

Asp

Ser

Pro

Alá

245

250

255

250

TCC TTG GCA CTC

ATC lle. 2S5

i· V» £. Ser

TCA. Ser

CAG TCA Gin Ser

TCT GAG AAC CTG GAG CCA GAT

932

Ser

Lee

Alá

Lee

Ser Giu Asn Lee 270

Cl e

Alá 275

Asp

x?*y«**« X. W ír

TCG

AAG

ATC

CAC

<^Ae

GAG AAG

GAG TTC ATT GCT

TTC

TCT

TCT

979

ser

Val

Cys

Lys 280

He

His

Cia

Giu Lys 265

Asp Phe He Alá

Phe 290

Cys

Ser

iKhi

ACA

CCA

CAT

AAC

CTG

TCC

TGC AGA

CAG CCC ACA AGG

CtW

TCC

ATC

IA’?'» *wí 4r í

Ser

Thr

Pro 255

Kis

Asn

Val

Ser

Trp Arg 300

Asp Arg Thr Arg 305

Gly

Ser

He

TTC

ATT

AGG

GAA

U-X V·

ATC

AGA

íuU χ. a V

CAG AAA TAT TCT

TGC

A wv

TCC

1075

Ph®

He 310

Thr

OXu

Lee

11®

Thr 315

Cys Aha

Gin Lys Tyr Ser 320

Cys

Cys

Cys

* *

GAC

CTA

ATG

CAA

ATA

yify 1 i*

VW

AAG

GTA CAG

AAA

zr-.***

i il

GAA

W A *

CCA

Kis

Leu

Mer

Glu

He

Phe

Arg

Lys

Vei Gin

Lys

Ser

The

Glu

Vei

Fro

325

33Ö

335

340

CAG

CCT

AAA

GGC

uAG

ATG

Z*/'*'*·

Alu

ATA GAA

CGA

ACC

TTG

ACA

AGA

Gin

Alá

Lys

Alá

Gin

Met

Pro

Thr

He Glu

Arg

AX&

Thr

Leu

Thr

Arg

345

350

355

GAT

TTG

TAG

CTC

*^>νιΛΫ a. 1 *r

CCT

GGC

AAT

TGAAAATGAA ACCACAGGCA GCCCAGCCCT

Asp

The

Tyr

Lau

The

Pro

Gly

Asn

360

CCTCTGTCAA CATCAAASAC CACATTTACC AGTATAGCTT CCATAGTCAA TATTTGGTAT

TTCAATAAAA GTAAAGACTC TAT CT

1123

1171

1225

1255

1310

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HO S S Z A: 3 6 4 3minős a v

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PUS: fehérje

A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mer Leu Glu Tvr Leu Gly Lys Asp Val Leu Kis Gly vei The Asn Tyr

1Ö

IS

Leu Alá Lys His Asp Val Leu Thr Leu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys 20 25 30

Tyr Tyr As? Alá Lys He Glu Asp Lys Alá Leu He Leu Val Asp Ser 2S 40 45

Lau Arg Lys Asn Arg Val Alá Kis Gin «ar ?he Thr Gin Thr Leu Leu 50 2 5 50

Thr Ser Val Lys Pro Leu Leu Gin He Glu

80

Asn Mát Asp Gin Lys He 55 7C *» ,* ί ϊ ‘ * ί «

Ars	í Gly Pro Pro	ulu	ser	Alá Glu ser	Thr	Asn	. Xle	Lea	Lys	Lsu	Cys
		SS			50					SS
Pro	Arc Glu Glu	Phe	Lea	Arg Lea Cys	Lys	Lys	Asn	His	Asp	Clu	11®
	1ΛΛ Λ'-ίΛ*			10 S					no
Tyr	Pro lle Lys	Lys	Arg	Glu Asp Arg	Arg	Arg	Lea	Alá	Leu	lle	11®
	115			120				125
Cys	Asn Thr Lys	Phe	Asp	Kis Lea Pro	Alá	Arg	Asn	Cly	A Is	His	Tyr
	130			135			140
&3SS	2le Val Gly	Kér	Lys	Arg Leu Leu	Cin	oly	Leu	Gly	Tyr	Thr	Val
145			ISO			1S5					150
Val	Asp Cin Lys	Asn	Lea	Thr Alá Arg	Asp	Két	d »	Ser	Val	Leu	Arg
		155			» ΤΛ iíV					175
AU	Phe Alá Alá	Arg	Pro Glu Kis Lys	Ser	Ser	Asp	Ser	Thr	Phe	Leu
	ISO			155					ISO
Val	Leu Mer Ser :	ΪΧλ.·^. '	-	lle Leu Glu -	Gly	lle	Cys	Cly	T hr .	Alá	Kis
	155			200				205

Lys Lys Lys Lys Pro Asp Val Lea Lea Tyr Asp Thr lle Phe Cin lle 210 215 220

Phe Asn Asn Arg Asn Cys 235 230 u Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val 21®

235 2<0 lle Val Cin Alá Cys Arg Gly CL 245

Lys Kis Gly Glu Lsu Trp Val Arg 350 255

As» Ser Pro Alá Ser Leu Alá Lea lle Ser Ser Cin Ser Ser Gin Asn 250 2SS 270

Leu Glu Alá Asp Ser Val Cys Lys Xla Kis Glu Glu Lys Asp Phe lle 275 ISO 285

Alá Phe Cys Ser Ser Thr Pro Kis Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr 250 295 300

Arg Cly Ser lle Phe lle Thr Glu Leu lle Thr Cys Phe Cin Lys Tyr 305 210 315 32S »4·** vv «t* 4

Ser

Cys

Cys

Cys

His 325

Leó

Hét Glu

1 ie

Phe 330

Arg

Lys

v&x

Gin

Lya 335

Ser

Pás

CX.ú

Val

Pro

Gin

Ale

Cys Alá

Gin

Heh

?Γ·Ο

Thr

Xi e

Giu

Arg

A1&

340

34 S

350

Thr

Leu

Thr

Arg

Asp

Phe

Tyr Leu

Phe

Pro

Gly

Asn

355 3δΟ

Α 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA .JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1in®ár i s

MOLEKULÁT!PUS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oiígonukleofcid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELOLÉS: miSc_featare ELHELYEZKEDÉS: 1...19

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: 22.az.sz.szekvenciában:

685-703.

A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGTCTCA? GGCATCCTA 19

A. 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 2G bázispár

TÍPUSA: nukleotid *« « **· ** * * * <. * ... _Λ

HÁNY SZALU: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PCS: egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oligonukleotid*

SZÁRMAZÁS:

NÉ./MS'G JELÖLÉS: misc_féature ELHELYEZKEDÉS: 1. ..20

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: 22.az.sz.szekvenciában: 712-731,

A 25- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGCGGAACT GGGCATAAAA 20

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 bázispár

TÍPUSA: nukleotíd

Η.ΑΝΎ SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT! PUS : egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: ,, olígonukleotid*'

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS : msc_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (15....35}

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie 22 . az .sz- szekvenciában: 1229-1248 .

A 26. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCTCTAGAC TCGAGGTGCT CTTTGATGTT GACAG «χ * «Φ«

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

.HOSSZA: 20 básispár

TÍ PUSA.j nukleotid

HÁNY SZÁLÉ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

WLEKÚLATÍ PLIS : egyéb nukleinsav

LE í P.ÁS A: „a 1 x go nu k. 1 e o t id

SZÁRMAZÁS :

NÉ/MEG JELÖLÉS : jsisc__feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...20)

EGYÉB IN'FORMÁCIŐK: megjegyzés: komplementer szekvencia:

2.2'.az . sz . szekvenciában: 939 -958 .

A 27. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTCTCCTCG TGCATCTTGC 20

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCiA JELLEMZŐI:

HOSSZA:16 bázispár

TÍPUSA: nukieotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Lineáris

MOLEKULÁT!?US : egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: ciigormfcleotid*

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: róscjeature ELHELYEZKEDÉS: 1... 16

EGYES INFORMÁCIÓK: megjegyzés: 22.az.sz.szekvenciában

124-139.

A 28. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

lb i it-i i u-A ioö 1

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

xÁ SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

EOSSZA: 1? básispáx

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: egyéb nukíeinsav

LEÍRÁSA: ,, oligonukleoticf*

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: misc__£eature ELHELYEZKEDÉS: 1...17

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés:22.az.sz.szekvenciában

290-306.

A 29. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTCTCAATA TGGACCA 17

A 3Ö. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 17 bárispár

ΤIPUSA; nuk1eot id

HÁNY S.ZÁLÜ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PUS: eevéb nukíeinsav * * ·»

LEÍRÁSA: „eligonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise_teature ELHELYEZKEDÉS: 1... 17

EGYES INFORMÁCIÓK; megjegyzés.; 22 . az. S2 .szekvenciában: 472-488,

A 3Ö. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCTGGCTCTC ATCATAT 17

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 bázispár

TÍPUSA: nukleotid HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris MOLEKULATÍPUS; egyéb nuklelnsav LEÍRÁSA: „ o1igonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEG JELÖLÉS: mise __ f ea tűre ELHELYEZKEDÉS: 1 ... 1S

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés:22.az.sz.szekvenciában :

634-652.

A 31. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATTTGCTGCC AGACCAGA 18

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 bázispár »* »

**♦ '*·♦·

TÍPUSA: nukleotid HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MÖLEKULATÍFÜS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: „oligonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise feature ELHELYEZKEDÉS: 1...19

EGYÉB INFORMÁCIÓKÉ megjegyzés: 22.az.sz.szekvenciában:

833-851.

A. 32... AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCTGCAGAG GTGAAAAAC 1

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 bázi.spár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

Molekulatípus: egyéb nukleinsav

LEI RÁ SA: oligonukleotid'

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise feature ELHELYEZKEDÉS: 1...19

EGYÉB INFORMÁCIÓK: meg jegyzés : 2.2 - az . sz. szekvenciában : 1020-1038.

A 33. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTCCATCTT CATTACGGA

V «9 9 * Ka a < » 9 99 «9: 0 0 9 * * * ♦' * ♦ ♦ **?

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PUS: egyéb nukieinsav

LEÍRÁSA: „oligonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS : mis-c feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (X...17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencia:

22.az.sz.szekvenciában: I094-1110.

A 34. AZONOSÍTÓSZÁMÓ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATTTCTGTA CCTTCCG 13

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 básispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

Tö PO LÓ GI Á JA: lineáris

MOLEKULÁTIPUS: egyéb nukieinsav

LEÍRÁSA: ,, oligonukleotld

SuARMAZÁS:

Nfii / MEGJfS LÓ .US S ϊ γπ ó. -s c í & s Γ. ώ r θ

ELHELYEZKEDÉS: kompieméntér (1,.,16)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie:

2 . az,sz,szek venciában: 715-7 30.

A 35. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTTATGCGCA GTTCCG 16

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 bázispár

TÍPUSA: nnkleotid

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁT! PUS: egyéb nakleinsav

LEÍRÁSA: „ο1igonukieotId

SZÁRMAZÁS :

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1,,.18)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie:

22,az.sz.szekvenciában: 521-538.

A 36. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCATAGTGA GCCCCATT 18

•a -ν'-y -< }	AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZERVEN	CIA ADATAI
A SZÉK	VT/X?-·'' 7 R ΤΪΓΪ T FW7Ő 7 »
w( > '•s / . · i ivz V* *<.« vj ; i	: _ í oázis©ár
	: nukleotid
HÁNY S	ZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKYLATÍPUS: egyéb nukleinsav * < X ·» < X

Φ 5 ♦ X Φ ♦ * * ♦ X ί ♦ ♦♦>

« ** »4 ♦

LEÍRÁSA: „oligonukleotid

SZÁRMAZÁS :

NÉ/MEGJELÖLÉS: miscjeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie:

22, a.z.sz .szekvenciában: 385--4ÖI.

A 37. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

CTTCACGAGG ACAAAGT 1?

A 38, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PUS : egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „oligonukleotid

SZÁRMAZÁS .:

NÉ/MEGJELÖLES: misc _ feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...17)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés: komplementer szekvencie:

2.2 .az - sz. szekvenciában : 237-253.

A 38. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCGCAAAGAG TCTACCA 17

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

hi á S.Í SOájíT

HOSSZA:

**** ** *-» « * * * X « « ♦ * ♦ · Φ * » * * * Μ #*£ * *♦. 4

TÍPUSA: nukleotíd

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA:' lineáris

MOLSKULATÍPOS: egyéb nukleínsav

LEÍRÁSA: ,,olígonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELGLÉS: mise f-eature ELHELYEZKEDÉS: 10 ... 33

EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés:22.az.sz.szekvenciában: 101-124.

A 39. AZONOSíTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGATCCA AGATOTTGGA ATÁCCTGGGC AAA

EGYSE

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 68 bázispár

TÍPUSA: nukleotíd

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA:: 1 ineáris

MOLEKULÁI!PCS; egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: „olígonukleotid

SZÁRMAZÁS:

NÉ/MEGJELÖLÉS: mise_£eature ELHELYEZKEDÉS. 46...88

INFORMÁCIÓK: megjegyzés: 22.az.sz.szekvenciában:

305-327.

A 40. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

OGCGGATCCA CCATGGCTTC TAIGÁCAGGA GGTCAACAAA TGGGACAAAA 50

GATCACCAGT GTAAAACC 68

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

WLEKÜLATÍ PüS : egyéb nukleinsav

LEÍRÁSA: ,, gligonukieofeidO

SZÁRMAZÁS:

NE/MEGJELÖLÉS: mise festőre ELHELYEZKEDÉS: komplementer <1...16)

EGYÉB INFORMÁCIÓK: .megjegyzés: komplementen szekvencia:

.az . S2.szekvenciában: 638--836.

A 41. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGTTTTTCA CCTCTGGAGG CCTGGACAAT GATGAC 36

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 házispár

TÍPUSA: nukleoti'd

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav

LE ÍRÁSA: „öligo n ufcIeo t id ί

Ν'

Π * · » φ fcfc

SZAP'MAZAS :

NÉ/MEGJELÖLÉS: misc_feature t?r ?.ΐϊ?τ vpíwnóo . i iü bUvvb'AM i <2 λ \ W J Kk? * .1· % A' A -4·

EG YÉB IN PORMÁCTő K: meg j egyzés.: 22 . az . s.s. s se k ve ne í ába n: s38--853.

A 42. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCATCATTG TCCAÖGCCTC CAGAGGTGAÁ AKÁCÁT 3í ***.

~ 70-

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált DNS-·szekvencia, amely proteáz aktivitású és apoptózis indukálására képes emberi poiipeptidet kódol, és amely kódoló szekvencia megegyezik az 22. azonosítószámú szekvenciával.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált .DNS-szekvencia, amely a 22. azonosítószámú szekvencia 104. nukleot iájával kezdődik és 1195, nukleotiájával végződik.
3. 3. Proteáz aktivitású és apoptózis indukálására képes emberi eredetű izolált poíipeptid, melynek amnosavszekveneiája. megegyezik a 23. azonosítószámú szekvenciával, és megnevezése : Ty-fehérje,
4. 4. Emberi eredetű rekombináns poíipeptid, amely a 23, azonosítószámú amínosav-szekvenciát kódoló DNS-fc tartalmazó gazdasejtben végrehajtott expresszlóval lett előállítva.
5. 5. SÍjárás Ty-fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy 23. azonosítószámú szekvenciával megegyező amínosav- szekvenciát kódoló DNS-sel transzformált gazdasejtben Ty-fehérjét expresszálunk.