HU220857B1 - Method of production of transgenic plants wholly transformed into to generation, from meristems - Google Patents
Method of production of transgenic plants wholly transformed into to generation, from meristems Download PDFInfo
- Publication number
- HU220857B1 HU220857B1 HU9600504A HU9600504A HU220857B1 HU 220857 B1 HU220857 B1 HU 220857B1 HU 9600504 A HU9600504 A HU 9600504A HU 9600504 A HU9600504 A HU 9600504A HU 220857 B1 HU220857 B1 HU 220857B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- transformed
- buds
- meristematic
- plant part
- shoots
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás transzgenikus növények előállítására a merisztémából, ahol a növény a To generációban teljes egészében transzformált. A találmány kiterjed az eljárással kapott transzformált növényrészekre.
A géntechnológiát ma már széles körben alkalmazzák növényfajták nemesítésére. Ezzel a technikával olyan új jellemzők vihetők be, amelyek a szokásos technikával csak nehezen vagy egyáltalán nem alakíthatók ki. Az ilyen módszerek fejlődése ellenére vannak olyan fajok, amelyek nem transzformálhatok könnyen, vagy amelyek elválasztott növényrészekből, így sziklevélből vagy levélből nem regenerálhatok. Az ilyen fajoknál (például napraforgó, gyapot, borsó, bab, szójabab és hasonló fajok) kimutatták, hogy ezek a nehézségek részben kiküszöbölhetők, ha a transzformáláshoz növényrészként merisztematikus növényrészt, például csúcsmerisztémát alkalmaznak.
A merisztéma felhasználásával a termőképes növény hegképződés nélkül regenerálható. A merisztémából történő regenerálás nagyszámú különböző fajon, és azonos fajon belül nagyszámú genotípuson megvalósítható. Ilyen technikával több ellenálló faj transzformálása és regenerálása megoldható [például Bidney és munkatársai: Plánt Molecular Bioi. 18, 301-313 (1992); Bidney és munkatársai: Proc. 13e Int. Sunflower Conf. II, Pisa, 1992. szeptember; Schrammeijer és munkatársai : Plánt CellRep., 9, 55-60 (1990); Christou és munkatársai: The Plánt Journal, 2(3), 283-290 (1992); Gambley és munkatársai: Plánt Cell Rep. 12, 343-346 (1993); Russel és munkatársai: Plánt Cell Rep. 12, 165-169(1993)].
A módszer azonban több hátránnyal rendelkezik. A transzformálás frekvenciája rendkívül alacsony, és a regenerált növények szinte teljesen kimér növények, ami azt jelenti, hogy egyes szövetek transzformáltak, mások nem. Ez annak eredménye, hogy a merisztéma a celluláris anyagot a különböző növényszervek (szár, gyökér, levél) szöveteinek eredeténél termeli. A transzformálás során ezért a használt technikától függetlenül a növényrészen belül a sejtek korlátozott száma transzformálódik, és ezek a sejtek véletlenszerűen oszlanak el. Az ilyen manipuláció következtében a merisztéma sohasem transzformálódik teljes egészében. A transzformáit merisztémából regenerált növények ezért kimérek. Teljes egészében transzgenikus növények csak az utódokban nyerhetők, azzal a feltétellel, hogy a csíravonalsejtek transzformálódtak. Ilyen típusú eljárást ismertet például Bidney és munkatársai: Plánt Molecular Bioi, 18, 301-313 (1992); Schrammeijer és munkatársai: Plánt Cell Rep. 9, 55-60 (1990).
A kimér növények előállításával kapcsolatos hátrányok ismertek, de eddig nem találtak rájuk megoldást. Próbálkoztak olyan jelölés alkalmazásával, amely a To kimér növények között lehetővé teszi azon növények felismerését, amelyeknél a csíravonal transzformálódott, és ezért képesek az új jellemző átvitelére az utódokba [Christou és munkatársai: The Plánt Journal, 2(3) 283-290 (1992)]. Ez a megoldás a következő generációban elősegíti a teljes egészében transzformált növények előállítását, de a To generációban termelt növények még mindig kimérek.
A WO 92/15675 számú irat és az azonos tárgyról szóló McCabe és Martinelli. Biotechnology 11, 596-598 (1993) cikk szerint csíratranszformánst állítanak elő a növény nem transzformált részének szelektív metszésével. A megtartott rügyeket azonban - a találmány szerinti megoldástól eltérően - nem a hónaljrügyek és újonnan kialakuló levélrügyek közül szelektálják.
Nem ismert tehát olyan módszer, amely szisztematikus és előre meghatározott módon lehetővé teszi a To generációban teljes egészében transzformált transzgenikus növények merisztematikus növényrészekből történő előállítását.
A találmány ezt a feladatot oldja meg. A találmány szerinti megoldás alapját az a fejlesztés képezi, amely lehetővé teszi a merisztéma feldúsítását a transzformált sejtekben, és így teljes egészében transzformált merisztéma előállítását, vagyis olyan merisztéma előállítását, amelynek valamennyi sejtje transzformált. A találmány értelmében ezután a növény regenerálását kizárólag a teljes egészében transzformált növényrészről végezzük, ami a kapott növénynél garantálja a transzgenikus jellemzőt. Azt találtuk továbbá, hogy a merisztémából származó növényrész levelein újonnan kialakuló levélmerisztéma és rügy növeszthető. Az újonnan kialakuló levélmerisztémát tartalmazó újonnan kialakuló levélrügyek képzése az irodalomból nem ismert. A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi az újonnan kialakuló levélmerisztéma teljes egészében transzformált állapotban történő előállítását. így ez kiváló celluláris anyagot képez a teljes egészében transzformált To generációjú növények regenerálásához.
Általánosságban, a találmány lehetővé teszi teljes egészében transzformált merisztéma előállítását, és az ilyen növényrészekből kiindulva a teljes egészében transzgenikus To generációjú növények regenerálását.
A találmány tárgya tehát eljárás a To generációban teljes egészében transzformált transzgenikus növények előállítására oly módon, hogy
a) egy merisztematikus növényrészt genetikusán transzformálunk,
b) a transzformált merisztematikus növényrészt szelektív közegen tenyésztjük,
c) a hónaljrügyek és/vagy az újonnan kialakuló levélrügyek között detektáljuk a transzformált rügyeket,
d) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket eltávolítjuk a tenyésztett transzformált merisztematikus növényrésztől,
e) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket szelektív közegen tenyésztjük, és
f) a tenyésztett transzformált hónaljrügyekből és/vagy transzformált, újonnan kialakuló levélrügyekből a To generációban teljes egészében transzformált transzgenikus növényeket regenerálunk.
A leírás keretein belül a „merisztematikus növényrész” kifejezés olyan növényrészt jelent, amely lényegében vagy kizárólag merisztematikus szövetből vagy a
HU 220 857 Bl fejlődése során merisztematikussá váló szövetből áll. A találmány értelmében a merisztematikus növényrész lehet például
- csúcsmerisztéma (más néven primer merisztéma), előnyösen csúcsszármerisztéma, vagyis a szár eredete,
- újonnan kialakuló levélrügy,
- újonnan kialakuló levélrügy képzésére alkalmas fiatal levél része.
Az „újonnan kialakuló levélrügy” kifejezés a levél felső epidermiszén található rügyet jelenti. Ez a rügy újonnan kialakuló levélmerisztémát tartalmaz. Fejlődését „mesterségesen” váltjuk ki a pontosan betartott tenyésztési körülményekkel.
A különböző növényrészek típusait később ismertetjük.
A „szekunder merisztéma” kifejezés a primer merisztémából képződött merisztémát jelenti. A kifejezés közelebbről a levelek hónaljában elhelyezkedő és az oldalsó ágak kialakítására alkalmas hónaljmerisztémára vonatkozik.
A „hónaljrügy” kifejezés a levél hónaljában elhelyezkedő és szekunder merisztémát tartalmazó rügyekre vonatkozik.
Az „újonnan kialakuló levélmerisztéma” kifejezés az újonnan kialakuló levélrügyben található merisztémára vonatkozik. Az ilyen merisztéma kialakulását „mesterségesen” váltjuk ki a később ismertetett tenyésztési körülmények betartásával.
Celluláris szinten a szekunder merisztéma és az újonnan kialakuló levélmerisztéma szerkezeti felépítése és hatása azonos a primer merisztéma szerkezeti felépítésével és hatásával, de méreteiben annál kisebb. Emellett az újonnan kialakuló levélmerisztéma kisebb, mint a szekunder merisztéma.
A találmány szerinti megoldás alapját a következő morfogenetikus elvek képezik. A csúcsmerisztéma a Primordia levél hónaljánál olyan sejteket tartalmaz, amelyek sejtszaporodással és előre meghatározott módon szekunder merisztémát képeznek. Ezek az „előre programozott” sejtek genetikus transzformálással transzformálhatok. Az ilyen sejtek szaporodásával kialakuló szekunder merisztéma kizárólag transzformált sejtekből áll. Ugyanez érvényes azokra a sejtekre, amelyek megfelelő tenyésztési körülmények között újonnan kialakuló levélmerisztémát képeznek. Az ilyen transzformált szekunder merisztémából és transzformált újonnan kialakuló levélmerisztémából regenerált növények teljes egészében transzgenikusak lesznek.
Olyan szelektív tenyésztőrendszert dolgoztunk ki, amely a transzformált sejtek közül a szekunder merisztéma és az újonnan kialakuló levélmerisztéma eredetét képező sejtek fejlődését favorizálja.
A szelektív tenyésztés előnyösen a következő lépésekből áll:
i) a transzformált merisztematikus növényrészt szelektív közegen tenyésztjük, ii) az i) lépésben kapott transzformált hónaljrügyeket és adott esetben a transzformált, újonnan kialakuló levélrügyeket eltávolítjuk, iii) az ii) lépésben kapott transzformált rügyeket szelektív közegen tenyésztjük, iv) az ii) és iii) lépést legalább egyszer megismételjük.
Más szavakkal, a találmány értelmében a transzformáit növényrészt szelektív közegen tenyésztjük előre meghatározott ideig. A hajtás és néhány levél megjelenése után a tenyésztést megszakítjuk, és a hónaljrügyeket és a megfelelő újonnan kialakuló levélrügyeket, amelyek legalább részben transzformáltak, eltávolítjuk. A transzformált állapotot szelektív marker segítségével mutatjuk ki. A rügyeket ezután átültetjük, és szelektív közegen tenyésztjük hónaljrügyek és adott esetben újonnan kialakuló levélrügyek megjelenéséig. A tenyésztést ismét megszakítjuk, a transzformált rügyeket eltávolítjuk és újból tenyésztjük. A korlátozott idejű tenyésztésből és a rügyek eltávolításából álló ciklust néhányszor ismételve teljesen transzformált rügyeket kapunk. A valóságban minden egyes ciklusnál a sejtszaporodás során növekszik a rügyben található transzformált sejtek száma és a transzformált sejteknek a nem transzformált sejtekhez viszonyított aránya. A ciklusokat ezért teljes egészében transzformált rügyek kialakulásáig ismételjük. A teljes egészében transzformált rügyeket úgy ismerjük fel, hogy ezek olyan hajtást eredményeznek, amely a transzformált állapot kimutatására alkalmazott szelektív marker által kifejtett gátlásnak ellenálló és jellemző zöld színnel rendelkezik. A transzgenikus növényeket a hónaljrügyekből vagy újonnan kialakuló levélrügyekből regeneráljuk.
A „szelektív szer” kifejezés olyan anyagot jelent, amely elősegíti a transzformált sejtek kifejlesztését. A szelektív szer általában kanamicin. Ebben az esetben a transzformálás során bevitt heterológ szekvencia kanamicinrezisztenciát kódoló gént, például NPT II gént tartalmaz. A kanamicin blokkolja a kloroplasztriboszómákat. Ennek következtében a kanamicinrezisztens növény zöld, mivel képes funkcionális kloroplasztok kialakítására, míg a nem rezisztens növény sárga vagy fehér színű, ami a funkcionális kloroplasztok hiányát jelenti. Ez a jellegzetesség lehetővé teszi a transzformánsok vizuális kiválogatását. A zöld színű, újonnan kialakuló levélrügyeket és hónaljrügyeket válogatjuk ki, a fő rügyet, a fő növénykét és a fehér vagy sárga növények összes részét eltávolítjuk.
A fő rügy eltávolítása elősegíti a hónaljrügyek kialakulását, elsősorban a csúcsdominanciával rendelkező növényeknél, így a javított napraforgónál.
A szelektív tenyésztési ciklusok száma előnyösen legalább kettő, beleértve a transzformált merisztematikus növényrész első tenyésztését. A ciklusok számát úgy választjuk meg, hogy elegendő legyen teljes egészében transzformált rügyek előállításához. Általában három ciklus elegendő, de egyes fajoknál vagy egyes transzformálási technikáknál szükség lehet például négy, öt vagy hat ciklus elvégzésére.
A szelektív közegen végzett tenyésztés egyes fokozatainak időtartama általában legalább 15 nap, de a fajtól függően egy hét és három hét között változhat. Az egyes tenyésztési fokozatok időtartamát úgy választjuk
HU 220 857 Bl meg, hogy lehetővé tegye legalább egy levéllel rendelkező hajtás kifejlődését. Ha a szelektálást ciklust háromszor ismételjük, a szelektív tenyésztés összidőtartama mintegy hat hét, amelynek során a szelektív szer a periódus teljes időtartamában jelen van. Ahol ez lehetséges, megfelelő riportergént, például GUS-gént építünk be a transzformálás során a transzformált állapot kimutatásának elősegítésére.
A találmány szerinti megoldás meglepő módon hatékony, mivel a találmány szerinti szelektív tenyésztés teljes időtartama lényegesen hosszabb, mint a szokásos (például hat hét a szokásos kettő hét helyett). Több szerző megemlíti, hogy a kanamicin káros hatást fejt ki a növények regenerálására [például Schrammeijer és munkatársai: Plánt Cell Rep. 9, 55-60 (1990)]. Az ismert transzformálást és regenerálási eljárásoknál ezért minimalizálták a szelektálás időtartamát (Bidney és munkatársai: Proc. 13e Int. Sunflower Conf. II. kötet, Pisa, 1992. szeptember). A gyakorlatban kimutattuk, hogy a kanamicin jelenlétében végzett hosszabb szelektív tenyésztés az irodalommal ellentétben nem gátolja a növény regenerálását.
A merisztematikus növényrész transzformálása bármely megfelelő technikával megvalósítható. A transzformálás során a merisztematikus növényrészt Agrobacteriummal érintkeztetjük, amely tartalmazza a növényi sejtbe beépítendő heterológ szekvenciát. Az érintkeztetést a DNS átvitelét elősegítő körülmények között végezzük.
A transzformálási technikákra példaként említhető az a módszer, amelynek során a merisztematikus növényrészt mikroszemcsékkel bombázzuk, és ezzel egyidejűleg vagy a bombázás után Agrobacteriummal érintkeztetjük. Ezzel a módszerrel nagyszámú mikrosérülést alakítunk ki a növényrészen, amely szükséges a DNS Agrobacteriummal történő átviteléhez. A bombázás és ezzel egyidejű transzformálás esetén a mikroszemcséket Agrobacteriummal vonjuk be (EP 0 486 234 számú irat). Az Agrobacteriummal történő érintkeztetést előnyösen a bombázás után végezzük, például az EP 0 486 233 számú iratban ismertetett módon. A mikroszemcsék általában aranyból vagy volfrámból állnak.
Egy másik transzformációs technika szerint a merisztematikus növényrészt Agrobacterium szuszpenziójával érintkeztetjük. Ebben az esetben a növényrészt előnyösen megsértjük, például szikével megvágjuk a transzformáció elősegítése érdekében.
A transzformációs fázis egyik periódusában a növényrészt Agrobacteriummal együtt tenyésztjük. Ennek időtartama 2-4 nap, előnyösen 3 nap. Az együtt tenyésztéshez alkalmazott közeg bármely ilyen célra általánosan alkalmazott közeg lehet. Előnyösen alkalmazható a BAP-vel kiegészített M2 közeg, amelyet részletesen a példákban ismertetünk.
Agrobacteriumként előnyösen alkalmazható az Agrobacterium tumefaciens. Ennek különböző törzsei használhatók, például a GV2260 vagy LBA 4404 törzs. Vektorként használható a pGA492-GI biner plazmid vagy alternatív módon a p35GUS intron. A „törzs/vektor” pár befolyásolja a transzformáció hatékonyságát.
Előnyösen alkalmazható az LBA 4404 törzs és a pGA492-GI vektor.
A növényi sejtekbe beépítendő nukleinsavszekvenciaként bármely olyan szekvencia használható, amely mezőgazdasági szempontból értékes növényi tulajdonság kialakítására alkalmas. Példaként említhetők a rovarokkal, herbicidekkel vagy gombás betegségekkel (például Sclerotinia sclerotorium vagy Botrytis cinerea) szembeni rezisztenciát biztosító szekvenciák, fehéijék magban történő tárolását elősegítő vagy a tárolt fehérje minőségét javító egy vagy több gén, a gyümölcs érését befolyásoló szekvenciák, vírusokkal szembeni rezisztenciát biztosító szekvenciák, egy vagy több ribozim, egy vagy több antiszenz szekvencia, zsírsavak vagy aminosavak metabolizmusában részt vevő egy vagy több gén vagy hím sterilitást biztosító egy vagy több gén.
Emellett, a heterológ szekvencia a transzformánsok kiválogatását elősegítő szert kódoló szekvenciát is tartalmaz. Ilyen szerekre példaként említhető az antibiotikumokkal, így kanamicinnel, G418-cal vagy neomicinnel szembeni rezisztenciát biztosító szerek. A vektor tartalmazza a heterológ szekvencia stabil kifejeződéséhez szükséges szabályozószekvenciákat. Promoterként alkalmazható például a 35S promoter, a kettős 35S promoter a Ω transzlációs rásegítő anyaggal vagy a napraforgóból származó ubiquitin promoter. Különösen előnyös a NOS terminátor.
A fent ismertetett transzformálás és szelektív tenyésztés egy olyan műveleti sorozat részét képezi, amely a növényi részből kiindulva lehetővé teszi transzgenikus növények regenerálását. A találmány szerinti megoldás teljességében az alábbiak szerint összegezhető:
1. merisztematikus növényrész előállítása,
2. a növényrész fent ismertetett módon történő transzformálása,
3. a szelektálás fent ismertetett módon történő megvalósítása,
4. a transzgenikus növények regenerálása szelektálás során kapott szerkezetekből.
A találmány értelmében a merisztematikus növényrész előállításához a csúcsmerisztémát vagy a csúcsszemimerisztémát 5-30 napon keresztül, előnyösen 5-8 napon keresztül előtenyésztjük.
Az előtenyésztéshez alkalmazott közeg citokinnal, előnyösen 6-benzil-amino-purinnal (továbbiakban BAP) kiegészített növényi sejttenyésztő közeg. Előnyösen alkalmazható a 0,05-2,0 mg/1, előnyösen 0,1 mg/1 BAP-vel, és adott esetben további hormonnal kiegészített MS közeg (Murashige-Skoog-közeg).
Az előtenyésztés és annak időtartama lényegében befolyásolja a növényrész kifejlődését. Ha az előtenyésztés időtartama több mint 9-10 nap, akkor a leveleken újonnan kialakuló levélrügyek jelennek meg. A csúcsmerisztémából regenerált hajtások ebben az esetben olyan leveleket tartalmaznak, amelyek a felső epidermiszen újonnan kialakuló levélrügyeket hordoznak.
A találmány szerinti megoldás fenti változatánál lehetőség van arra, hogy a transzformálás előtt kivágjuk az újonnan kialakuló levélrügyeket, vagy egyszerűen eltávolítjuk a levél egy részét, és ezeket használjuk a
HU 220 857 Bl transzformáláshoz. Ebben az esetben a transzformáláshoz alkalmazott merisztematikus növényrész a legalább 9 napon keresztül előtenyésztett, és újonnan kialakuló levélrügyek kifejlesztésére alkalmas levél része vagy az eltávolított újonnan kialakuló levélrügy.
Ha az előtenyésztés időtartama 5-12 nap, a csúcsmerisztéma általában közvetlenül felhasználható a transzformáláshoz szükséges merisztematikus növényrészként. Ebben az esetben az újonnan kialakuló levélrügyeket az előtenyésztés során indukáljuk, de ezek csak a későbbi kifejlesztés, például az együttes tenyésztés vagy a szelektív közegen történő tenyésztés során jelennek meg.
A találmány értelmében ugyanaz a tenyészközeg alkalmazható az előtenyésztéshez, az együttes tenyésztéshez és a kiválogatáshoz. Ez a közeg előnyösen 0,05-2,0 mg/1, elsősorban 0,1 mg/1 BAP-vel kiegészített MS közeg. A tenyészközeg növényi hormonként általában csak BAP-t tartalmaz. Különösen előnyös, ha a tenyészközeg gibberelinsavtól vagy indol-ecetsavtól mentes, elsősorban az előtenyésztéshez alkalmazott közeg esetében. A tenyészközeg az előtenyésztés és az együttes tenyésztés során kiegészíthető egy fenolos vegyülettel, például acetosziringonnal, amely képes az Agrobacterium vir gének aktiválására. A fenolos vegyület koncentrációja előnyösen mintegy 200 pmol/l. A szelektív tenyésztéshez alkalmazott tápközeg legalább egy szelektív szert, előnyösen kanamicint tartalmaz, amelynek koncentrációja 50-200 mg/1, előnyösen 50 mg/1, és adott esetben egy bakteriosztatikus anyagot tartalmaz.
A csúcsmerisztémát hántolt és sterilizált érett magok csíráztatásával állítjuk elő. A csíráztatáshoz a magokat általában csíráztatóközegen, előnyösen szilárd csíráztatóközegen, például adott esetben felére redukált makro- és mikroelem-tartalmú MS közegen tenyésztjük. A csíráztatás időtartama 2-4 nap, előnyösen 4 nap 25 °C hőmérsékleten és előnyösen mintegy 16 óra megvilágítási periódussal.
Az előtenyésztés, transzformálás és szelektálás után regenerálást végzünk a teljes egészében transzformált hajtásból vagy rügyekből kiindulva. A tenyészközeg és a tenyésztési körülmények általában azonosak az adott fajnál szokásos tenyészközeggel és tenyésztési körülményekkel. Napraforgónál a regenerálást a példákban bemutatott körülmények között végezzük.
A transzgenikus növények előállítására alkalmas fent ismertetett eljárás mellett a találmány tárgya továbbá maga az eljárás során kapott újonnan kialakuló levélrügy és teljes egészében transzformált szekunder merisztéma. A találmány kiterjed továbbá a merisztematikus növényrészből kapott, teljes egészében transzformáit To generációjú transzgenikus növényre.
A találmány szerinti megoldás egy sor előnnyel rendelkezik. Először is, sokkal hatékonyabb, mint a technika állásából ismert módszerek, mivel a regenerálást csak akkor végezzük, ha a növényrész teljes egészében transzformált. Az ismert technikák során azonban az összes transzformált merisztémát regenerálják, majd a kapott kimér növények közül kiválogatják azokat, amelyek csíravonala transzformálódott. A találmány szerinti eljárás ezért lehetővé teszi az idő és az eszközök lényegesen gazdaságosabb kihasználását.
A találmány szerint előállított transzgenikus növények kitermelése ezért lényegesen nagyobb, mint az ismert technikákkal elérhető kitermelés. így például, napraforgó esetében a regenerált növények 92%-a legalább egy transzgenikus utódot eredményez (lásd a 8. táblázatot). Ezzel szemben a Bidney és munkatársai: Plánt Molecular Bioi. 18, 301-313 (1992) szerint ugyanez az érték 0,2-2%.
A találmány szerinti megoldás számos olyan növényfajnál, elsősorban kétszikűeknél alkalmazható, amelyek nehezen transzformálhatok és regenerálhatok. Példaként említhető a gyapot, szójabab, olajtartalmú növényfajok, így napraforgó, pillangósok, így borsó vagy bab, valamint a tökfélék családjába tartozó növények, például a tök. Az említett fajokon belül számos különböző genotípus alkalmazható. Különösen előnyös a napraforgó.
A találmány szerinti megoldás jobb megértését segítik az ábrák.
Az 1. ábrán szemimerisztémából származó levelek transzformálását mutatjuk be, amelynek hatására a glükuronidáz kifejeződése analizálható az újonnan kialakuló levélrügyekből regenerált hónaljhajtásokban. Az ábrán alkalmazott jelölések értelmezése a következő:
- mag
- MO csíráztatóközeg, 2 nap
- a csúcsok kimetszése: a sziklevél, a radikula és az első levél eltávolítása
- a csúcs felezése
- a szemimerisztéma előtenyésztése 200 mmol/1 acetosziringont tartalmazó M2 közegen, 30 nap
- újonnan kialakuló levélrügy
- a szemimerisztémából kialakuló hónaljhajtás
- a felső oldalon újonnan kialakuló levélrügyeket hordozó levelek eltávolítása
- újonnan kialakuló levélrügy nélküli levelek eltávolítása
- a levelek bombázása és Agrobacterium tumefaciens-szel történő együttes tenyésztése 200 pmol/l acetosziringont tartalmazó M2 tápközegen, 3 nap
- tenyésztés 400 mg/1 augmentint tartalmazó
M2 tápközegen, 15 nap
- hónaljhajtások
- újonnan kialakuló levélrügyek hónalj hajtásokká történő kifejlesztése
- glükuronidáz kifejeződésének vizsgálata a leveleken megjelenő újonnan kialakuló levélrügyekből kifejlesztett hónaljhajtásokban
- levél növényrész
- GUS+ transzformált sejtek foltjai
- GUS+ transzformált sejtek régiója
- GUS+ transzformált sejtek vonala
- GUS + transzformált hónaljrügyek.
A 2. ábrán a szemimerisztéma transzformálását és glükuronidáz kifejeződésének vizsgálatát mutatjuk be. Az ábrán alkalmazott számok értelmezése:
- mag
- csíráztatás MO közegen, 2 nap
HU 220 857 Bl
- a csúcsok kimetszése: a sziklevél, a radikula és első levél eltávolítása
- a csúcs felezése
- a szemimerisztéma előtenyésztése 200 pmol/l acetosziringont tartalmazó M2 közegen, 5 nap
- a szemimerisztéma bombázása és együttes tenyésztése Agrobacterium tumefaciens-szel 200 pmol/l acetosziringont tartalmazó M2 tápközegen, 3 nap
- a bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztéma tenyésztése 400 mg/1 augmentint tartalmazó M2 tápközegen, 15 nap
- újonnan kialakuló levélrügy
- a szemimerisztémából kifejlesztett hónaljhajtások
- hónaljhajtás
- sejtszaporulat a növényrész alapjánál
- glükuronidáz kifejeződésének vizsgálata a szemimerisztémából kifejlesztett hónaljhajtásokban
- GUS+ transzformált sejtek foltja
- GUS+ transzformált sejtek régiója
- GUS+ transzformált újonnan kialakuló levélrügy
- GUS+ transzformált sejtek vonala
- GUS+ transzformált hónaljrügyek.
A 3. ábra az újonnan kialakuló levélrügyekből vagy a szemimerisztémából származó transzformált és regenerált hónaljhajtások szelektálását mutatja be. Az ábrán alkalmazott számok jelentése:
- a 2. példa szerint bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztéma
- az 1. példa szerint bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztémából származó levél Az első szelekciós tenyésztést kanamicinen végezzük:
- kanamicinre rezisztens zöld, újonnan kialakuló levélrügy
- a növényrészek 400 mg/1 augmentint és 50 mg/1 kanamicint tartalmazó M2 közegen történő tenyésztése, 15 nap
- kanamicinre érzékeny nem transzformált fehér részek
- kanamicinre rezisztens zöld hónaljrügy
- kanamicinre rezisztens transzformált zöld rész
- a zöld hónaljrügyek eltávolítása
- a zöld újonnan kialakuló levélrügyek eltávolítása
A második szelektálást kanamicinen végezzük:
- a zöld hónaljrügyek, a zöld újonnan kialakuló levélrügyek és a zöld hónaljhajtások tenyésztése 400 mg/1 augmentint és 50 mg/1 kanamicint tartalmazó M2 tápközegen, 15 nap
- kanamicinre rezisztens zöld újonnan kialakuló levélrügy
- kanamicinre érzékeny nem transzformált fehér rész
- kanamicinre rezisztens zöld hónaljrügy
- kanamicinre rezisztens zöld rész
- kanamicinre rezisztens zöld hónaljhajtás
- zöld hónaljrügyek eltávolítása
- zöld újonnan kialakuló levélrügyek eltávolítása
- zöld hónaljhajtások eltávolítása.
A 4. ábra a transzformált növények regenerálását mutatja. Az ábrán alkalmazott számok jelentése:
Harmadik szelektálás kanamicinen:
- zöld hónaljrügyek, zöld újonnan kialakuló levélrügyek és zöld hónaljhajtások tenyésztése 400 mg/1 augmentint és 50 mg/1 kanamicint tartalmazó M2 tápközegen, 15 nap
- zöld hónaljhajtások eltávolítása
- nem transzformált fehér részeket és transzformált zöld részeket tartalmazó kimér hónaljhajtás
- M3 közeggel kiegészített SORBAROD rendszeren történő tenyésztés, 30 nap, tenyészkamra
- gyökéreresztés
- az M3 tápközeg mosása, M4 tápközeg hozzáadása
- gyökeres növény
- SORBAROD rendszeren történő tenyésztés, nap, tenyészkamra
- gyökér nélküli növény
- kifejlesztés
- SORBAROD rendszeren történő tenyésztés, nap, növényház
- kifejlesztés és akklimatizálás
- gyökeres növények átültetése cserepekbe töltött tőzegbe, gyökér nélküli növények gyökértörzsre történő ráoltása, tenyésztés növényházban virágzás és önbeporzás
- növesztés.
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. példa
Szemimerisztémából származó levelek transzformálása és az újonnan kialakuló levélrügyekböl regenerált hajtásokban a glükuronidáz kifejeződésének vizsgálata (1. ábra)
1.1 Szemimerisztéma előállítása
Napraforgó (Helianthus annuus) vonalak (Ha300, RHa 274, RHa 297, RHa 356, RHa 359, RHa 362), Helianthus petiolaris-szal végzett fajkeresztezésből származó LG60 és LG61 populáció és a LIMAGRAIN GENETICS (Les Alleuds) különböző vonalainak magjait használjuk a kísérletekhez. A magok hántolásával eltávolítjuk a belső maghéjt, majd a magokat Javelle vízben 12° klórkoncentrációnál és 1 ml/1 Tween 80 jelenlétében 20 percen keresztül sterilizáljuk. A hántolt magokat ezután steril desztillált vízzel ötször leöblítjük. A magokat 1 órán keresztül steril desztillált vízben áztatjuk, majd a magot bevonó filmet eltávolítjuk. A csupasz magokat ismét Javelle vízben 6° klórkoncentrációnál sterilizáljuk 2 percen keresztül, majd steril desztillált vízzel háromszor leöblítjük, és tálcás áramlókamrában szűrőpapíron szárítjuk. A száraz magokat M0 közegen csíráztatjuk. A közeg az MS közegben [Murashige és Skoog: Physiologia Plantarum, 15, 473-497. (1962)] szokásos makroelemek, mikroelemek, Fe-EDTA és vitaminok mellett 10 g/1 szacharózt és 7 g/1 agart (pH=5,8) tartalmaz. A csíráztatást tenyésztőkamrában végezzük 26 °C hőmérsékleten és órás megvilágítás (50 μ Einstein/m2 fényintenzitás) mellett 2 napon keresztül. A kicsirázott magokat eltávo6
HU 220 857 Bl
Htjuk, a sziklevelet és a radikulumot, valamint a csúcs apikális részét eltávolítjuk. Az így kapott néhány mm átmérőjű hengert a sziklevél illeszkedési tengelye mentén két félre vágjuk. Az így kapott és csúcs-szemimerisztémát tartalmazó növényi részt nevezzük szemimerisztémának.
1.2 A szemimerisztéma tenyésztése
A szemimerisztémát 10 g/1 szacharózzal, 0,1 mg/1 BAP-vel, 8 g/1 agarral (pH=5,8-6) és 200 pmol/l acetosziringonnal kiegészített M2 közegen (az MS közegben szokásos makroelemek, mikroelemek Fe-EDTA és vitaminok) tenyésztjük 30 napon keresztül egy tenyésztőszobában 26 °C hőmérsékleten és 16 órás megvilágítás (50 μ Einstein/m2 fényintenzitás) mellett. A tenyésztési periódus során a szemimerisztéma a szekunder merisztémából hajtást növeszt a levélkezdemény tengelyében. 10 napos tenyésztés után kidudorodások jelennek meg a levelek felső felületén. Ezeket a kidudorodásokat, amelyek az újonnan kialakuló levélmerisztémák, újonnan kialakuló levélrügyekbe transzformáljuk (1. ábra). Ezek a rügyek a levelek felső felületén található epidermális és szubepidermális sejtekből kialakult vegetatív merisztémából fejlődtek ki.
napos tenyésztés után a levelek szekunder merisztémát vagy újonnan kialakuló levélrügyeket tartalmaznak, és az újonnan kialakuló levélrügyek nélküli leveleket eltávolítjuk (1. ábra).
1.3 Λ szemimerisztémából származó levelek bombázása és együttes tenyésztése
A leveleket héliumos szemcseágyú [partiele inflow gun, PIG; Finer és munkatársai: Plánt Cell Reports, 11, 323-328. (1992)] segítségével 0,2-2 pm átmérőjű volfrámszemcsékkel bombázzuk mikrosérülések kialakítása érdekében.
mg volfrámszemcsét 500 pl 95% etanolban 20 percen keresztül sterilizálunk, majd steril vízzel négyszer centrifugáljuk (10 000 fordulat/perc, 1 perc). A steril szemcséket 300 pl TE pufferben (10 mmol/1 TriszHC1, 1 mmol/1 EDTA) felvesszük. 2 pl csupasz szemcsét alkalmazunk minden egyes bombázáshoz. A leveleket a felső felülettel felfelé 5 cm átmérőjű Petri-csészébe helyezzük, amely 15 g/1 agart tartalmazó vízzel van töltve. A növényi részeket tartalmazó Petri-csészéket az ágyú kamrájába helyezzük, amit 9,8 χ 10s Pa értékű vákuumra állítunk. A növényrészek bombázását 8 bar nyomással 16 cm távolságból végezzük.
A bombázott növényi részeket ezután 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe helyezzük, amelyek 200 pmol/l acetosziringont tartalmazó M2 közeggel vannak töltve. Od=2-600 nm optikai sűrűségnél egy éjszakán keresztül végzett tenyésztéssel kapott legyengített Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 [Hoekema és munkatársai: Natúré, 303, 179-180. (1983)] szuszpenzióját cseppentjük (1-10 pl) a növényi részre. Az LBA 4404 törzs pGA492-GI biner vektort [AN: Plánt Physiol., 81, 86-91 (1986)] tartalmaz, amely a pNOS promoter [Herrera-Estrella és munkatársai: EMBO J„ 2, 987-995. (1983)] és a t-NOS terminátor [Depicker és munkatársai: Mól. Appl. Génét. 1, 561-573. (1982)] szabályozása alá eső, kanamicinrezisztenciát kiváltó NPTII gént hordoz, ahol az Scal-helyen a CaMV p35S promoter és a t-NOS terminátor [Vancanneyt és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 220, 245-250. (1990)] szabályozása alatt egy GUS intron gén van beépítve. A bombázott és Agrobacterium tumefaciens-szel inokulált növényi részeket 3 napon keresztül 26 °C hőmérsékleten és 16 órás megvilágítás (50 μ Einstein/m2) mellett együtt tenyésztjük. A csupasz szemcsékkel végzett bombázás és az Agrobacterium tumefaciens-szel végzett együttes tenyésztés kombinációjával mikrosérüléseket okozunk a levelek és a szekunder merisztéma sejtjein. Ezek a mikrosérülések lehetővé teszik a baktérium behatolását, és így a transzformáció hatékonyságának növelését [Bidney és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 18, 301-313.(1992)].
1.4J levelek tenyésztése és hajtások regenerálása az újonnan kialakuló levélrügyekből
Az együttes tenyésztés után a növényrészeket 400 mg/1 augmentinnel kiegészített M2 közeggel töltött Petri-csészékbe helyezzük, és 15 napon keresztül tenyésztőkamrában tartjuk 16 óra megvilágítás (15 μ Einstein/m2) és 23 °C, illetve 8 óra sötétség és 21 °C mellett.
nap tenyésztés után a megjelenő vagy a bombázott és együtt tenyésztett leveleken már megtalálható, újonnan kialakuló levélrügyek 1-5 levelet és rövid szárat tartalmazó hajtásokká fejlődnek. Ezeket a hajtásokat elválasztjuk, és a glükuronidázaktivitás méréséhez pufferbe helyezzük (1. ábra).
1.5^4 glükuronidázaktivitás analizálása az újonnan kialakuló levélrügyekből képződött hajtásokban
Az újonnan kialakuló levélrügyekből képződött hajtásokat 1 mg/ml X-gluc-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-P-Dglükuronsav-ciklohexil-ammóniumsó) tartalmazó GUSpufferbe [Jefferson: Plánt Mól. Bioi. Rep. 5, 387-405. (1987)] merítjük, vákuumban átitatjuk, és 24 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk.
A 24 órás inkubálás után a GUS-gént kifejező transzformált sejtek glükuronidázaktivitást (GUS+-aktivitás) mutatnak, és képesek az Χ-Glu hidrolizálására és egy kék színű vegyület felszabadítására.
A 24 órás inkubálás után a GUS+-aktivitást mutató transzformált sejtek különböző plakkokat képeznek (1. ábra).
- Néhány mm átmérőjű foltok, amelyek az újonnan kialakuló levélmerisztémából regenerált hajtások leveleinek felületén helyezkednek el. Ezek a foltok a bombázás és az együttes tenyésztés során transzformált, újonnan kialakuló levélmerisztéma-sejtekből származnak.
- Transzformált sejtek régiója, amely lehet egy, legalább 5 mm átmérőjű kék folt, kék színű fél levél vagy kék sejtvonal. Ezek a nagyobb területek az újonnan kialakuló levélrügyek merisztémájának belsejében elhelyezkedő transzformált sejtekből származnak, amelyek teljes egészében transzformált celluláris tulajdonságokat mutatnak (fél levéllemez és sejtvonal).
HU 220 857 Bi
- Egyes esetekben a hajtások leveleinek hónaljában glükuronidázt kifejező kék szekunder merisztéma vagy rügy figyelhető meg. Az ilyen szekunder merisztéma teljes egészében transzformált. Ez a merisztéma vagy a bombázott és együtt tenyésztett, újonnan kialakuló levélmerisztéma belső sejtjeiből származik, ahol a merisztéma a növesztés és differenciálás során hónaljrügyet fejlesztett a levél hónaljában, vagy újonnan kialakuló levélmerisztémát, majd szekunder rügyet tartalmazó levél felületének transzformált sejtjeiből származik.
Az 1. táblázatban megadott adatok százalékban mutatják az olyan bombázott és együtt tenyésztett levelek számát, amelyek GUS+-sejtekből álló foltot, GUS+-sejtek nagyobb régióját vagy GUS szekunder merisztémát tartalmazó hajtást eredményeznek. A bombázott levélnövényrészek nagyrészénél az újonnan kialakuló levélrügyekből olyan hajtások regenerálhatok, amelyek GUS+-foltokat (80%) vagy nagy kiterjedésű GUS+-régiót (55%) tartalmaznak. Ezek a hajtások transzformált és nem transzformáit sejtek elegyéből álló kimér növénykék.
Aktív bombázott és együtt tenyésztett növényrészek mennyisége (%)
| GUS+-folt | GUS +-régió | Hónaljrügy |
| 80 | 55 | 2 |
Ezek a hajtások csak akkor eredményeznek genetikailag átvitt tulajdonságot, ha transzformált sejtek találhatók a magkezdemény vagy a pollenszemcsék kiinduló pontjánál található csírasejteket tartalmazó merisztéma régiójában. Másrészről, a bombázott és együtt tenyésztett növényrészek 2%-a transzformált hónaljrügyet tartalmaz az újonnan kialakuló levélrügyekből származó hajtások leveleinek hónaljában. Ezek a hónaljrügyek egyetlen sejtből származnak, ezért ezek teljesen transzformáltak, és a Mendel-féle kiválasztódás szerint a transzformált növény utódját eredményezik (legalább 3/4 rész transzformáit növény és 1/4 rész nem transzformált növény).
2. példa
Szemimerisztéma transzformálása és a szemimerisztémából regenerált hajtások glükuronidázaktivitásának vizsgálata (2. ábra)
2.1 Szemimerisztéma előállítása
A szemimerisztéma előállítását az 1. példa 1.1 részében leírt módon végezzük.
2.2 A szemimerisztéma elótenyésztése
A szemimerisztémát 1, 5, 8 és 12 napon keresztül 200 pmol/l acetosziringont tartalmazó M2 közegben előtenyésztjük, amit 26 °C hőmérsékleten 16 órás megvilágítás (15 μ Einstein/m2) mellett végzünk.
Az előtenyésztés után a szemimerisztéma kis hajtásokat képez, amelyek a szekunder merisztémából és a csúcsmerisztémából fejlődnek ki. A hajtások fejlődése az előtenyésztés időtartamától függ. Minél hosszabb az előtenyésztés időtartama, annál fejlettebbek a hajtások. 12 napos előtenyésztésnél a hajtások leveleket hordoznak, és újonnan kialakuló levélrügyek jelennek meg a levelek felső felületén (2. ábra).
2.3Az előtenyésztett szemimerisztéma bombázása és együttes tenyésztése
Az előtenyésztés után a szemimerisztémát az 1. példa 1.3 részében leírt módon bombázzuk és együtt tenyésztjük.
2.4x4 bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztéma tenyésztése
Az előtenyésztett, bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztémát 9 cm átmérőjű Petri-csészékben tenyésztjük, amelyek 400 mg/1 augmentinnel kiegészített M2 tápközeggel vannak töltve. A Petri-csészéket tenyésztőkamrába helyezzük, és a tenyésztést 16 órás megvilágítás (15 μ Einstein/m2) mellett 23 °C hőmérsékleten és 8 órás sötétben 21 °C hőmérsékleten végezzük.
nap tenyésztés után több hajtás a hónaljrügyekből, a csúcsmerisztémából és a levelek felső felületén megjelenő, újonnan kialakuló levélrügyekből kifejlődő 1-5 levelet és szárat tartalmaznak.
2.5x4 glükuronidázaktivitás mérése a szemimerisztémából származó hajtásokban (2. ábra)
A szemimerisztémából származó hajtásokat szétválogatjuk, és mérjük a glükuronidáz kifejeződésének aktivitását. A vizsgálatot az 1. példa 1.5 részében leírt módon végezzük. A glükuronidázaktivitással rendelkező sejtek foltokat képeznek (2. ábra):
- Glükuronidázt kifejező transzformált sejtek (GUS+) kék foltjai.
- Glükuronidázt kifejező sejtek (GUS + ) nagy kiterjedésű régiója vagy vonala.
- A levelek hónaljában glükuronidázt kifejező (GUS+) szekunder merisztéma található, amely teljesen kék.
- Előtenyésztett (1-12 nap) szemimerisztéma transzformálása esetén GUS+ transzformált újonnan kialakuló levélrügyek jelennek meg a levelek felső felületén (2. ábra). Ezek az újonnan kialakuló levélrügyek a szemimerisztéma bombázása és együttes tenyésztése során a fiatal leveleken elhelyezkedő transzformált sejtekből származnak. Ezek a sejtek újonnan kialakuló levélrügyeket képeznek. Ezek az újonnan kialakuló levélrügyek egyetlen sejtből származnak, és így lehetővé válik teljes egészében transzformált rügyek kialakítása, amelyek teljes egészében transzformált növényt eredményeznek.
| Az előtenyésztés időtartama (nap) | Aktív szemimerisztéma mennyisége (%) | ||
| GUS+- scjt-foltok | GUS+- sejt-régió | GUS+- hónaljriigy | |
| 1 nap | 38 | 26 | 0 |
| 5 nap | 50 | 40 | 4 |
| 8 nap | 67 | 47 | 0 |
| 12 nap | 38 | 38 | 0 |
HU 220 857 BI
A szemimerisztéma bombázásával végzett transzformálás frekvenciája nagy, a bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztéma 38 -70%-a GUS +-foltot és 26-47%-a GUS+-régiót mutat (2. táblázat).
A nagy kiterjedésű GUS+-régióval rendelkező bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztéma %-os mennyisége nagyobb, ha a szemimerisztéma előtenyésztését 5 napon keresztül (40%) és 8 napon keresztül (47%) végezzük (2. táblázat).
Csak az 5 napon keresztül előtenyésztett szemimerisztéma eredményez teljesen kék újonnan kialakuló levelet vagy hónaljrügyeket tartalmazó hajtásokat.
Ezek a teljes egészében transzformált újonnan kialakuló levelek vagy hónaljrügyek teljes egészében transzformált növényeket eredményeznek, amelyek utódai legalább 3/4 rész transzformált növényt és 1/4 rész nem transzformált növényt eredményeznek. Az előtenyésztés 5 napos időtartama ezért a találmány szerinti standard eljárás optimális időtartamának minősül.
3. példa
Szemimerisztéma vagy szemimerisztémából származó levél transzformálása (3. és 4. ábra)
3.1 Szemimerisztémából származó levelek transzformálása
A szemimerisztéma előállítását és előtenyésztését, valamint a szemimerisztémából származó levelek bombázását és együttes tenyésztését az 1. példa 1.1, 1.2 és
1.3 részében leírt módon végezzük.
3.2 A szemimerisztéma transzformálása
A szemimerisztéma előállítását, előtenyésztését, bombázását és együttes tenyésztését a 2. példa 2.1,
2.2 és 2.3 részében leírt módon végezzük.
3.3 A kanamicinrezisztens hajtások kiválasztása
3.3.1 Kanamicin jelenlétében végzett első szelektáló tenyésztés (3. ábra)
Az együttes tenyésztés után a növényrészeket (szemimerisztéma vagy levél) 9 cm átmérőjű Petricsészékbe helyezzük, amelyek 400 mg/1 augmentinnel és 50, 100, 200 és 400 mg/1 kanamicinnel kiegészített M2 közeggel vannak töltve.
A növényrészeket tartalmazó csészéket tenyésztőkamrába helyezzük, és 16 órás megvilágítás (15 μ Einstein/m2) mellett 23 °C hőmérsékleten, és 8 órás sötét periódussal 21 °C hőmérsékleten, 15 napon keresztül tenyésztjük. A tenyésztés során a növényrészekből 1-5 levelet és rövid szárat tartalmazó hajtások fejlődnek (3. ábra).
A kanacimint tartalmazó szelektív közegen végzett 15 napos tenyésztés után a regenerált hajtások megjelenése eltér a bennük található kanamicinrezisztens transzformált sejtek mennyiségétől függően:
- Hajtások, amelyek kanamicinre érzékeny, nem transzformált sejtekből álló fehér vagy sárga területeket és kanamicinre rezisztens transzformált sejtekből álló zöld területeket tartalmazó leveleket hordoznak.
- Hajtások, amelyek a fejlődőképes levelek hónaljában zöld hónaljrügyeket tartalmaznak. Ezek a zöld hónaljrügyek transzformáltak, és kanamicin jelenlétében hónaljhajtásokat fejlesztenek.
- Hajtások, amelyek a leveleken kanamicinre érzékeny, nem transzformált sárga vagy fehér újonnan kialakuló levélrügyeket tartalmaznak.
- Kanamicinre érzékeny teljes egészében fehér vagy sárga nem transzformált hajtások.
- Hajtások, amelyek kanamicinre rezisztens, fejlődőképes zöld, újonnan kialakuló levélmerisztémából vagy rügyekből származó leveleket hordoznak.
3.3.2 Kanamicin jelenlétében végzett második szelektáló tenyésztés (3. ábra)
A zöld hónaljhajtásokat, zöld hónaljrügyeket és zöld, újonnan kialakuló levélrügyeket vagy merisztémát 400 mg/1 augmentint és 50, 100, 200 és 400 mg/1 kanamicint tartalmazó M2 közegre telepítjük, és a
3.3.1 részben leírt körülmények között 15 napon keresztül tenyésztjük.
A fenti tenyészperiódus után az újonnan kialakuló levélrügyek és hónaljrügyek ismét hajtásokat fejlesztenek (3. ábra):
- Egyes, nem transzformált hajtások teljesen fehérek, ami kanamicinérzékenységre utal.
- Egyes hajtásokat olyan leveleket tartalmaznak, amelyek kanamicinre rezisztens, transzformált sejtekből álló zöld részeket és kanamicinre érzékeny, nem transzformált sejtekből álló fehér részeket tartalmaznak.
A nem teljes egészében transzformált hajtások jelenléte arra utal, hogy az első tenyésztés után a zöld újonnan kialakuló levélrügyek és hónaljrügyek nem voltak teljes egészében transzformáltak, és transzformált és nem transzformált sejtek elegyéből álló kimér hajtásokat eredményeznek.
- Egyes kimér hajtások kanamicinre rezisztens zöld hónaljrügyeket és szekunder merisztémát tartalmaznak.
- Egyes kimér hajtások olyan leveleket hordoznak, amelyek zöld foltokat és fehér foltokat tartalmaznak, amelyekre kanamicinre rezisztens zöld újonnan kialakuló levélmerisztémát vagy rügyet tartalmaznak.
- Egyes hajtások zöld szekunder merisztémát vagy hónaljrügyet hordozó zöld leveleket tartalmaznak. Ezek a hajtások kanamicinre rezisztens transzformált sejtekből állnak.
Ezek a teljesen zöld hajtások újonnan kialakuló levélmerisztémából vagy rügyből származnak. Ezek a hajtások nagyszámú, kanamicinre rezisztens transzformáit sejtet tartalmaznak.
A második tenyésztés után kapott hajtásokban nagyszámú, teljesen zöld hajtás figyelhető meg, míg az első tenyésztés után teljesen zöld hajtás nem jelentkezik, ami arra utal, hogy a második tenyésztés során kanamicin jelenlétében tenyésztett, újonnan kialakuló levélvagy hónaljrügyek némelyike teljes egészében transzformáit.
HU 220 857 Bl
3.3.3 Harmadik szelektáló tenyésztés kanamicin jelenlétében (4. ábra)
A teljesen zöld hajtásokat, zöld hónalj rügyeket és zöld újonnan kialakuló levélmerisztémát vagy rügyet elválasztjuk, és M2 közegen a 3.3.1 részben leírt módon tenyésztjük (3. és 4. ábra).
nap tenyésztés után a növényrészekből hajtások fejlődnek. A hajtások egy része teljesen zöld és kanamicint tartalmazó M2 közegen gyorsan fejlődik. Ezek a hajtások teljes egészében transzformáltak. A hajtások kis része zöld foltokat és fehér sejtekből álló foltokat tartalmaz. Ezeket a kimér hajtásokat kiválogatjuk (4. ábra).
A zöld hajtásokat SORBAROD tenyészrendszerre átültetjük. A SORBAROD tenyészrendszer zárt és steril mini növényházakból áll, amelyek 10 g/1 szacharózzal kiegészített M3 közeggel (az MS közegből származó mikroelemek, makroelemek, Fe-EDTA és vitaminok) nedvesített cellulózhengereket tartalmaznak. A mini növényházakat három nyílással látjuk el, amelyeket gázkicserélődést biztosító és a külső és belső légkör relatív nedvességtartalmát kiegyenlítő membránnal fedünk le.
A harmadik tenyésztésből származó zöld hajtásokat a cellulózhengerekbe ültetjük, és a SORBAROD rendszer mini növényházaiba helyezzük (4. ábra). A mini növényházakat tenyésztőkamrába állítjuk (16 óra megvilágítás 23 °C és 15 μ Einstein/m2, illetve 8 óra sötétség, 21 °C). 30 nap inkubálás után a transzformált növények gyökeret eresztenek és fejlődnek. Az M3 közeget pipettálással eltávolítjuk, és a hengereket steril desztillált vízzel háromszor átöblítjük, majd szacharózmentes M4 közeggel (MS közegből származó mikroelemek, makroelemek, Fe-EDTA és vitaminok) töltjük fel. A tenyésztőkamrában végzett 10 napos tenyésztés után a növények nagyméretű leveleket fejlesztenek, és elérik a 2-3 cm-es méretet. A SORBAROD mini növényházakat növényházba helyezzük (26 °C hőmérséklet 16/8 óra megvilágítási periódus) és 10 napon keresztül tenyésztjük. A gyökeret eresztett növények ez idő alatt kifejlődnek, és aklimatizálódnak a növényház körülményeihez. Ezután a gyökeres és leveles napraforgónövényeket tartalmazó hengereket COIC és LESAINT típusú oldatokkal [Hortic Fr., 8, 11 (1971)] megpermetezett tőzeggel töltött cserepekbe ültetjük.
A gyökér nélküli növényeket gyökértörzs szárára oltjuk (nem transzformált napraforgó, 4-6 leveles állapot). A transzformált növények számának alakját ferdén levágjuk, és a gyökértörzs szárában kialakított mélyedésbe helyezzük. Az oltványt raffiával rögzítjük a gyökértörzsön és műanyag szalaggal vesszük körül. Az oltvány megeredése és a levelek és szárak fejlődése után a műanyag szalagot eltávolítjuk. A gyökértörzset és az oltványt ezután növényházba helyezzük és COIC és LESAINT típusú tápoldattal [Hortic Fr., 8, 11 (1971)] permetezzük.
A napraforgónövényeket növesztjük, virágoztatjuk és önbeporzást végzünk. A transzformált növények magjait begyújtjuk, és vizsgáljuk a kanamicinrezisztens gén és a GUS-gén kifejeződését (lásd a 8. példát).
4. példa
Baktériumtörzs és biner plazmid hatása a szemimerisztémából származó levelek genetikus transzformálásának hatékonyságára
A szemimerisztémából származó leveleket bombázzuk és különböző törzsekkel együtt tenyésztjük:
- LBA 4404 törzs, amely pGA492-GI biner plazmidot tartalmaz (lásd az 1. példa 1.3 részét),
- GV 2260 törzs, amely p35S GUS intron biner plazmidot tartalmaz [Vancanneyt és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 220, 245-250. (1990)],
- C58’3 törzs [Mullineau és munkatársai: Plánt Sci. 63, 237-245. (1989)], amely pGA492-GI plazmidot tartalmaz (lásd az 1. példa 1.3 részét).
A leveleket 6 héten keresztül (a 3. példában leírt módon) 100 mg/1 vagy 200 mg/1 kanamicint tartalmazó szelektív közegen tenyésztjük, és a kanamicinrezisztens zöld hajtásokban vizsgáljuk a glükuronidáz kifejeződésének aktivitását. Ha a sejt glükuronidázaktivitást mutat, akkor ezt GUS+-aktivitásnak nevezzük. A glükuronidázaktivitást az 1. példa 1.5 részében leírt módon vizsgáljuk. A mérési eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze.
| Törzs cs biner plazmid | Aktív növényrészek mennyisége (%) | ||
| GUS + - foltok | GUS+- regió | GUS+hónaljrügy és teljes hajtás | |
| GV 2260 (pGUS intron) | 21,5 | 4,5 | 0 |
| C58’3 (pGA492-GI) | 0 | 0 | 0 |
| LBA 4404 (pGA492-GI) | 38,5 | 18,5 | 1 |
Csak a GV 2260 törzzsel (pGUS intron) és LBA 4404 törzzsel (pGA492-GI) végzett együttes tenyésztésből származó regenerált hajtások fejezik ki a glükuronidázt (GUS+-aktivitás). A C58’3 törzzsel GUS+-aktivitás nem mutatható ki. A legalább egy nagy kiteijedésű GUS+-aktivitású folttal rendelkező hajtást eredményező bombázott és együtt tenyésztett növényrészek százalékos mennyisége négyszer nagyobb, ha a növényrészt LBA 4404 törzzsel (pGA492-GI) tenyésztjük együtt, a GV 2260 törzzsel (pGUS intron) végzett együtt tenyésztéshez viszonyítva. Csak az LBA 4404 törzs teszi lehetővé, hogy az összes sejtben G US+-aktivitást mutató szekunder merisztémát vagy hajtást állítsunk elő.
5. példa
A baktériumtörzs és a biner plazmid hatása a szemimerisztéma genetikus transzformálásának hatékonyságára
A szemimerisztémát bombázzuk, és LBA 4404 törzzsel (pGA492-GI), C58’3 törzzsel (pGA492-GI) és GV 2260 törzzsel (p35S GUS intron) együtt tenyésztjük (a törzseket a 4. példa ismerteti). A tenyésztést a 3. példában leírt módon 6 héten keresz10
HU 220 857 Β1 tül végezzük, amelynek során nagyszámú, 100 mg/1 kanamicin jelenlétében fejlődőképes hajtást eredményező szemimerisztémát kapunk. Az eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg, ahol a transzformálás százalékos hatékonysága a legalább egy kanamicinrezisztens hajtást eredményező bombázott és együtt tenyésztett szemimerisztéma százalékos mennyiségét jelenti.
| Törzs és biner plazmid | Transzformálás hatékonysága (%) |
| C58’3 (pGA492-GI) | 0 |
| LBA 4404 (pGA492-GI) | 4,5 |
| GV 2260 (p35S GUS intron) | 1 |
Az LBA 4404 törzzsel (pGA492-GI) együtt tenyésztett szemimerisztéma 4,5% olyan szemimerisztémát tartalmaz, amely 6 héten keresztül 100 mg/1 kanamicint tartalmazó M2 közegen tenyésztve kanamicinrezisztens transzformált hajtást eredményez. Ez a mennyiség négyszer nagyobb, mint a GV 2260 törzzsel (p35S GUS intron) kapott százalékos mennyiség. A C58’3 törzs esetében kanamicinrezisztens hajtás nem nyerhető.
A standard eljáráshoz (3. ábra) tehát az LBA 4404 törzset (pGA492-GI) választjuk, mivel ez lehetővé teszi nagyszámú, teljes egészében transzformált hajtás rutinszerű előállítását.
6. példa
A kanamicinkoncentráció hatása a szemimerisztéma genetikus transzformálására A bombázott és LBA 4404 törzzsel (pGA492-GI) együtt tenyésztett szemimerisztémát 6 héten keresztül különböző koncentrációjú kanamicinnel (50, 100, 200 és 400 mg/1) kiegészített M2 közegen tenyésztjük a
3. példában leírt módon. A 6 hetes tenyésztés után a kanamicinre rezisztens zöld hajtásokban vizsgáljuk a glükuronidázkifejeződést (1. példa 1.5 része). Az eredményeket az 5. táblázatban adjuk meg.
| Kanamicin- koncentráció | Aktív szemimerisztémák mennyisége (%) | ||
| GUS+- foltokkal rendelkező hónaljhajtások | GUS+- régióval rendelkező hajtások | teljes GUS+hónaljhajtások | |
| 50 mg/1 | 30 | 22,5 | 3,3 |
| 100 mg/1 | 30,5 | 18,5 | 3,3 |
| 200 mg/1 | 29 | 15,5 | 0 |
| 400 mg/1 | 24 | 12 | 0,5 |
Az 5. táblázat a kanamicin hatását mutatja a glükuronidázkifejeződést mutató szemimerisztémák %-os mennyiségére. A bombázott és együtt tenyésztett merisztéma 25 30%-a legalább egy olyan hajtást eredményez, amely glükuronidázt fejez ki folt formájában, és ez független a kanamicin használt koncentrációjától.
A kanamicin nagy koncentrációja (200 mg/1 vagy 400 mg/1) enyhén csökkenti a GUS+-foltokkal rendelkező hajtásokat eredményező szemimerisztéma mennyiségét, de jelentős mértékben csökkenti a nagy GUS+régióval rendelkező hajtásokat eredményező szemimerisztéma mennyiségét. Csak 50 mg/l és 100 mg/1 koncentrációnál van arra lehetőség, hogy szelektálás után 3,3% teljes egészében transzformált hajtást kapjunk. A standard eljáráshoz (3. és 4. ábra) ezért 50 mg/1 kanamicinkoncentrációt választunk, amelynél glükuronidázt kifejező rezisztens hajtások rutinszerűen és nagy számban állíthatók elő.
7. példa
Különböző napraforgó genotípusok transzformálásának hatékonysága
ΊΑΑ szemimerisztéma vegetatív szaporításának és újonnan kialakuló levélmerisztéma képzésének hatékonysága
Az előzetes kísérletekben 50 napraforgóvonalat választottunk ki a szemimerisztémából kialakuló hónaljhajtások és a hajtás levelein újonnan kialakuló levélmerisztéma képzésének hatékonysága alapján. A vizsgált vonalak a szemimerisztémából 20-90% hatékonysággal regenerálnak hónaljhajtásokat. A vizsgált vonalak 7-44% olyan szemimerisztémát eredményeznek, amely a levél felső felületén újonnan kialakuló levélmerisztémát hordozó hónaljhajtásokat képeznek. A vizsgált vonalak több, mint 60%-a legalább 20% olyan szemimerisztémát eredményez, amely a leveleken újonnan kialakuló levélmerisztémát hordozó hónaljhajtásokat regenerál.
7.2A szemimerisztéma transzformálásának hatékonysága
Az 50 vonal közül 10 olyan vonalat választunk ki, amely a legnagyobb hatékonyságot mutatja a hajtás vegetatív szaporítása és a merisztéma kialakítása vonatkozásában, a szemimerisztéma genetikus transzformálása hatékonyságának növelése érdekében.
Az összesen 16 vonalból mintegy 200 szemimerisztémát bombázunk, és LBA 4404 törzzsel (pGA492-GI) együtt tenyésztünk, majd 400 mg/1 augmentint és 50 mg/1 kanamicint tartalmazó M2 közegen tenyésztjük 6 héten keresztül (3. példa).
A 6 hét elteltével kiválogatjuk az 50 mg/1 kanamicinre rezisztens hajtásokat, amelynek során az összes vizsgált vonal legalább egy olyan szemimerisztémát eredményez, amely kanamicinrezisztens hónaljhajtást fejleszt, ami arra utal, hogy a leírt eljárás alkalmas arra, hogy a vizsgált napraforgóvonalakból 100%-ban teljes egészében transzformált napraforgónövényeket kapjunk (6. táblázat).
A transzformálás hatékonysága a vonalaktól függően 0,5-6% között változik. A legnagyobb transzformációs hatékonyságot mutató vonalak (LG15, LG60 és LG61) a legnagyobb hatékonyságot mutatják a szemimerisztéma vegetatív szaporítása vonatkozásában is, ami pozitív összefüggésre utal a találmány szerinti transzformálás hatékonysága és a szemimerisztémából történő generálódó képesség között.
HU 220 857 Β1
| Napraforgó- vonal | Hónaljhaj lássál rendelkező szemimerisztéma mennyisége (%) | Újonnan kialakuló levélmerisz- tcmával rendelkező hajtást eredményező szemime- risztéma mennyisége (%) | Transzfor- málás hatékonysága |
| HA 300 | 78,5 | 17,5 | 2,5 |
| LG 1 | 65 | 42,5 | 0,5 |
| LG 15 | 85 | 44,5 | 3,4 |
| RHa 356 | 71 | 43,5 | 2 |
| RHa 362 | 46 | 37,5 | 0,5 |
| RHa 274 | 70,5 | 13,5 | 2,6 |
| RHa 297 | 66 | 39,5 | 1,4 |
| RHa 359 | 66 | 39,5 | 2,3 |
| LG 60 | 90 | ND | 3,6 |
| LG 61 | 90 | ND | 6 |
8. példa
A szemimerisztémából regenerált transzformált növény és utódai vizsgálata
A SORBAROD rendszerre átvitt és növényházhoz akklimatizált kanamicinrezisztens hajtásokat (3. példa) növényházban tenyésztjük. Ezeken a növényeken több elágazás fejlődik ki, amelyek mindegyike fészekvirágzatot hordoz.
A glükuronidázaktivitást minden növényen és minden elágazáson vizsgáljuk. Az elágazásoknál a glükuronidázaktivitás a leveleken, a nyelvesvirágon (a fészekvirágzat perifériáján elhelyezkedő és sziromlevéllel rendelkező virág) és a kis virágokon (a fészekvirágzat belsejében elhelyezkedő és sziromlevél nélküli virág) mérjük. A GUS-aktivitás mérésével meghatározhatjuk a teljes egészében transzformált növények százalékos mennyiségét, amelyek a beépített géneket (NPT II gén és GUS-gén) a Mendel-féle kiválasztás alapján kifejező utódokat eredményeznek. Az ilyen növények összes szövetükben és szervükben, elsősorban a magkezdeményt és a pollent tartalmazó virágzó szervekben transzformált sejtekből állnak, ahol a virágzó szervek megtermékenyítés után a magban termékeny embriót eredményeznek. Egy növény akkor tekinthető teljes egészében transzformáltnak, ha GUS-aktivitást mutat az összes elágazásban, és minden egyes elágazásnál a levelekben, kis virágokban és nyelvesvirágokban.
A 7. táblázat szerint a találmány szerinti eljárással a növényházban termesztett transzformált növények 92%-a teljes egészében transzformált, az ilyen növényeknél az összes elágazás glükuronidázhatékonyságot mutató levelekkel, nyelvesvirágokkal és kis virágokkal rendelkezik.
| Teljes egészében GUS+ To növény | GUS+-levéllel és GUS—virággal rendelkező T„növény | GUS+-elágazással és GUS— elágazással rendelkező To növény |
| 92% | 6,5% | 1,5% |
A transzformált növények 8%-a azonban kimér növények jellemzőit mutatja:
- A növények 1,5%-a tartalmaz olyan elágazást, amelynek levele és fészekvirágzata GUS+-aktivitást mutat, de a többi elágazás levele és fészekvirágzata glükuronidázaktivitást nem jelez.
Ezek a kimér növények olyan hajtásokból származnak, amelyeknél egyes hónaljrügyek transzformáltak, mások nem transzformáltak.
- A növények 6,5%-a olyan elágazásokat tartalmaz, amelyek levele glükuronidázaktivitást mutat, de a kis virágok és a nyelvesvirágok nem fejezik ki a glükuronidázt. Az ilyen kimér növények olyan hajtásokból származnak, amelyek a vegetatív növényrészek (levél, szár és levélnyél) eredeténél elhelyezkedő vegetatív merisztematikus gyűrűben transzformált sejtekből állnak, és a virág és a szaporodószervek eredeténél elhelyezkedő középső részeknél nem transzformált sejtekből állnak.
A kimér növények százalékos mennyisége alacsony (8%). A találmány értelmében a glükuronidázaktivitást nem mutató nyelvesvirággal vagy kis virággal rendelkező növények kimér növények, és ezeket elimináljuk.
A teljes egészében transzformált növényeknél több szakaszban önbeporzást végzünk, amelynek során a pollent szétterítjük a fészekvirágzaton. A megtermékenyítés után 1-2 hónappal betakarítjuk a magokat. A magokat 5 órán keresztül 0,1%, vizes etreloldatban áztatjuk, majd hántoljuk és sterilizáljuk (lásd 1. példa). A steril magokat 100 mg/1 kanamicint tartalmazó MO közegen csíráztatjuk Phytatray tenyésztőedényekben (SIGMA, Pl552 katalógusszám). 15 napos csíráztatás után a kanamicinrezisztens transzformált növénykék zöldek és zöld leveleket fejlesztenek. A kanamicinérzékeny, nem transzformált növénykék fehérek és nem fejlesztenek gyökeret vagy zöld levelet.
A glükuronidázaktivitást a kanamicinrezisztens növénykék zöld levelében vizsgáljuk. A kanamicinrezisztens növénykék mennyiségét és a GUS-gént kifejező növények mennyiségét a 8. táblázatban adjuk meg.
| TI vonal | Elültetett magok száma | Kanamicin- rezisztens magok mennyisége (%) | GUS+- magok mennyisége (%) |
| 80-2 | 37 | 78 | 76 |
| 84-1-2 | 40 | 72 | ND |
| 79-1 | 51 | 74 | 20 |
| 107-1 | 8 | 38 | 38 |
| 139-6 | 14 | 35 | 35 |
HU 220 857 Bl
8. táblázat (folytatás)
| TI vonal | Elültetett magok száma | Kanamicin- rezisztens magok mennyisége (%) | GUS+- magok mennyisége (%) |
| 80-1 | 34 | 71 | 71 |
| NT | 40 | 0 | 0 |
A GUS és NPT II gének kifejeződése a teljes egészében transzformált növények utódainál Mendel típusú szegregációt mutat, mivel a növények legalább 3/4 része kifejezi az NPT II gént vagy a GUS-gént, és a növények 1/4 része nem transzformált. Ezek az eredmények igazolják, hogy a kapott növények teljes egészében transzformáltak és nem kimérek.
A transzgenikus növények molekuláris analizálásával azonosítjuk a beépülést helyek számát, a TDNS másolatok számát, és meghatározzuk az inszert szegélyének hasítási térképét.
Claims (27)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás a To generációban teljes egészében transzformáit transzgenikus növények előállítására, azzal jellemezve, hogya) egy merisztematikus növényrészt genetikusán transzformálunk,b) a transzformált merisztematikus növényrészt szelektív közegen tenyésztjük,c) a hónaljrügyek és/vagy az újonnan kialakuló levélrügyek között detektáljuk a transzformált rügyeket,d) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket eltávolítjuk a tenyésztett transzformált merisztematikus növényrésztől,e) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformált, újonnan kialakuló levélrügyeket szelektív közegen tenyésztjük, ésf) a tenyésztett transzformált hónaljrügyekből és/vagy transzformált, újonnan kialakuló levélrügyekből a To generációban teljes egészében transzformált transzgenikus növényeket regenerálunk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c), d) és e) lépéseket legalább egyszer megismételjük.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikai transzformálás előtt a merisztematikus növényrészt 5-30 napon keresztül citokinint tartalmazó tenyészközegben előtenyésztjük.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy merisztematikus növényrészként primer merisztémát, újonnan kialakuló levélrügyet és/vagy a primer vagy szekunder merisztémából regenerált, eltávolított fiatal levelet alkalmazunk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy újonnan kialakuló levélmerisztéma kifejlesztésére alkalmas sejteket tartalmazó merisztematikus növényrészt alkalmazunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti transzformáláshoz a következő lépéseket végezzük:a) a merisztematikus növényrész legalább egy részét mikroszemcsékkel bombázzuk, ésb) a bombázott növényrészt Agrobacteriummal érintkeztetjük, ahol az Agrobacterium a merisztematikus sejtekbe beépítendő, legalább egy nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti transzformáláshoz a merisztematikus növényrészt legalább részben a merisztematikus sejtekbe beépítendő DNS-sel bevont mikroszemcsékkel bombázzuk.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti transzformáláshoz a merisztematikus növényrészt Agrobacterium-szuszpenzióval érintkeztetjük.
- 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merisztematikus sejtekbe beépítendő nukleinsavszekvenciaként rovarokkal szembeni rezisztenciát biztosító gént, herbicidekkel szembeni rezisztenciát biztosító gént, gombabetegségekkel szembeni rezisztenciát biztosító gént, magban előforduló fehérjék tárolását biztosító egy vagy több gént, a tárolt fehérjék minőségét javító egy vagy több gént, zsírsavak metabolizmusában részt vevő egy vagy több gént, aminosavak metabolizmusában részt vevő egy vagy több gént, vagy a hím sterilitásban részt vevő gént tartalmazó nukleinsavszekvenciát alkalmazunk.
- 10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merisztematikus sejtekbe beépítendő nukleinsavszekvenciaként a transzformánsok kiválogatását elősegítő szert kódoló szekvenciát tartalmazó nukleinsavszekvenciát alkalmazunk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett szer antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosít.
- 12. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merisztematikus sejtekbe beépítendő nukleinsavszekvenciaként a gyümölcs érését módosító szekvenciákat vagy vírusokkal szembeni rezisztenciát biztosító szekvenciákat tartalmazó nukleinsavszekvenciát alkalmazunk.
- 13. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Agrobacteriumként biner vektort tartalmazó Agrobacterium tumefacienst alkalmazunk.
- 14. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tenyésztő- és szelektív közegként mintegy 0,05-2,0 mg/1 BAP-vel és a szelektáláshoz legalább egy szelektív szerrel kiegészített MS közeget alkalmazunk.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szelektív közeg további komponensként bakteriosztatikus szert tartalmaz.
- 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az MS közeg 0,1 mg/1 BAP-vel van kiegészítve.
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szelektív szer kanamicin.HU 220 857 Β1
- 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Agrobacterium vir gének aktiválására alkalmas fenolos vegyülettel kiegészített tenyésztő- és szelektív közeget alkalmazunk.
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fenolos vegyület acetosziringon.
- 20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotból, olajtartalmú növényfajból, pillangós fajból vagy a tökfélék családjába tartozó fajból származó merisztematikus növényrészt alkalmazunk.
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az olajtartalmú növényfaj Helianthus annus.
- 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pillangós faj Pisum sativum vagy Phaseolus vulgáris.
- 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tökfélék családjába tartozó faj Cucurbita pepo.
- 24. Eljárás transzgenikus növények előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket végezzük:a) egy merisztematikus növényrészt genetikusán transzformálunk,b) a transzformált merisztematikus növényrészt szelektív közegen tenyésztjük,c) a hónaljrügyek és/vagy az újonnan kialakuló levélrügyek között detektáljuk a transzformált rügyeket,d) a transzformált hónalj rügyeket és/vagy a transzformált, újonnan kialakuló levélrügyeket eltávolítjuk a tenyésztett transzformált merisztematikus növényrésztől,e) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket szelektív közegen tenyésztjük, ésf) a tenyésztett transzformált hónaljrügyekből és/vagy transzformált, újonnan kialakuló levélrügyekből transzgenikus növényeket regenerálunk, ahol a növények legalább 92%-a a To generációban teljes egészében transzformált.
- 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c), d) és e) lépéseket legalább egyszer megismételjük.
- 26. Eljárás a To generációban teljes egészében transzformált transzgenikus napraforgó előállítására, azzal jellemezve, hogya) a napraforgó egy merisztematikus növényrészét genetikusán transzformáljuk,b) a transzformált merisztematikus növényrészt szelektív közegen tenyésztjük,c) a hónaljrügyek és/vagy az újonnan kialakuló levélrügyek között detektáljuk a transzformált rügyeket,d) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket eltávolítjuk a tenyésztett transzformált merisztematikus növényrésztől,e) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket szelektív közegen tenyésztjük, ésf) a tenyésztett transzformált hónaljrügyekből és/vagy transzformált, újonnan kialakuló levélrügyekből a To generációban teljes egészében transzformált transzgenikus napraforgót regenerálunk.
- 27. Eljárás transzgenikus napraforgó előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket végezzük:a) a napraforgó egy merisztematikus növényrészét genetikusán transzformáljuk,b) a transzformált merisztematikus növényrészt szelektív közegen tenyésztjük,c) a hónaljrügyek és/vagy az újonnan kialakuló levélrügyek között detektáljuk a transzformált rügyeket,d) a transzformált hónalj rügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket eltávolítjuk a tenyésztett transzformált merisztematikus növényrésztől,e) a transzformált hónaljrügyeket és/vagy a transzformáit, újonnan kialakuló levélrügyeket szelektív közegen tenyésztjük,f) a c)-e) lépéseket legalább háromszor megismételjük, ésg) a tenyésztett transzformált hónaljrügyekből és/vagy transzformált, újonnan kialakuló levélrügyekből transzgenikus napraforgót regenerálunk, ahol a napraforgó legalább 92%-a a To generációban teljes egészében transzformált.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9310368A FR2709496B1 (fr) | 1993-08-30 | 1993-08-30 | Procédé de production de plantes transgéniques, entièrement transformées en génération T0, à partir de méristèmes. |
| PCT/FR1994/001017 WO1995006741A1 (fr) | 1993-08-30 | 1994-08-19 | Procede de production de plantes transgeniques, entierement transformees en generation to, a partir de meristemes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9600504D0 HU9600504D0 (en) | 1996-04-29 |
| HUT74664A HUT74664A (en) | 1997-01-28 |
| HU220857B1 true HU220857B1 (en) | 2002-06-29 |
Family
ID=9450453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9600504A HU220857B1 (en) | 1993-08-30 | 1994-08-19 | Method of production of transgenic plants wholly transformed into to generation, from meristems |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6649812B1 (hu) |
| EP (1) | EP0716706B9 (hu) |
| JP (1) | JPH09509302A (hu) |
| AT (1) | ATE342991T1 (hu) |
| AU (1) | AU695398B2 (hu) |
| DE (1) | DE69434870T2 (hu) |
| ES (1) | ES2274513T3 (hu) |
| FR (1) | FR2709496B1 (hu) |
| HU (1) | HU220857B1 (hu) |
| SK (1) | SK25896A3 (hu) |
| WO (1) | WO1995006741A1 (hu) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693506A (en) * | 1993-11-16 | 1997-12-02 | The Regents Of The University Of California | Process for protein production in plants |
| US5750870A (en) * | 1994-06-17 | 1998-05-12 | Agritope, Inc. | Plant genetic transformation methods and transgenic plants |
| GB9600698D0 (en) * | 1996-01-13 | 1996-03-13 | British American Tobacco Co | Genetic transformation of trees |
| ZA974176B (en) * | 1996-05-16 | 1998-09-01 | Univ North Texas | A rapid in-vitro regeneration scheme of cotton (gossypium hirsutum l.) plants compatible with agrobacterium-mediated transformation |
| ATE278026T1 (de) * | 1997-02-20 | 2004-10-15 | Bayer Bioscience Nv | Verbesserte methode zur transformation von pflanzen |
| US7129393B1 (en) | 1999-02-22 | 2006-10-31 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University | Transgenic plants and method for transforming carnations |
| AU2687000A (en) * | 1999-02-22 | 2000-09-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Transgenic plants and method for transforming carnations |
| IT1317038B1 (it) * | 2000-06-05 | 2003-05-26 | Vitroplant Vivai Di Zuccherell | Metodo per la rigenerazione di piante e suoi usi per lamoltiplicazione e/o la trasformazione di piante. |
| KR20110066979A (ko) | 2002-12-06 | 2011-06-17 | 델몬트 후레쉬 프로듀스 컴퍼니 | 변형된 카로테노이드 수준을 갖는 형질전환 파인애플 식물 및 그 생산 방법 |
| US7663021B2 (en) | 2002-12-06 | 2010-02-16 | Del Monte Fresh Produce Company | Transgenic pineapple plants with modified carotenoid levels and methods of their production |
| JP4744512B2 (ja) * | 2004-06-07 | 2011-08-10 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー | ダイズの改良された形質転換法 |
| EP2220243A4 (en) * | 2007-11-21 | 2010-12-15 | Mendel Biotechnology Inc | TRANSFORMATION OF CRAMBE ABYSSINICA |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5015580A (en) * | 1987-07-29 | 1991-05-14 | Agracetus | Particle-mediated transformation of soybean plants and lines |
| GB2211204B (en) * | 1987-10-20 | 1992-05-20 | Oji Paper Co | Process for production of plant transformant |
| JP2996995B2 (ja) * | 1988-06-01 | 2000-01-11 | ザ テキサス エイ アンド エム ユニヴァーシティ システム | 茎頂による植物の形質転換方法 |
| FI902635A0 (fi) * | 1989-05-29 | 1990-05-25 | Eidgenoess Tech Hochschule | Foerfarande foer framstaellning av transgena vaexter. |
| US5322783A (en) * | 1989-10-17 | 1994-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean transformation by microparticle bombardment |
| NZ239977A (en) | 1990-11-14 | 1993-08-26 | Pioneer Hi Bred Int | Transforming plants by the use of agrobacterium |
| US5932782A (en) | 1990-11-14 | 1999-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles |
| ES2129042T3 (es) * | 1991-03-06 | 1999-06-01 | Monsanto Co | Transformacion de algodon mediada por particulas. |
-
1993
- 1993-08-30 FR FR9310368A patent/FR2709496B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-08-19 ES ES94925521T patent/ES2274513T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-19 AT AT94925521T patent/ATE342991T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-19 DE DE69434870T patent/DE69434870T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-19 WO PCT/FR1994/001017 patent/WO1995006741A1/fr active IP Right Grant
- 1994-08-19 AU AU75396/94A patent/AU695398B2/en not_active Expired
- 1994-08-19 EP EP94925521A patent/EP0716706B9/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-19 SK SK258-96A patent/SK25896A3/sk unknown
- 1994-08-19 JP JP7507979A patent/JPH09509302A/ja not_active Ceased
- 1994-08-19 HU HU9600504A patent/HU220857B1/hu unknown
-
1999
- 1999-03-25 US US09/276,163 patent/US6649812B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK25896A3 (en) | 1996-09-04 |
| ATE342991T1 (de) | 2006-11-15 |
| EP0716706B9 (fr) | 2007-05-09 |
| JPH09509302A (ja) | 1997-09-22 |
| AU7539694A (en) | 1995-03-22 |
| DE69434870T2 (de) | 2007-05-31 |
| HU9600504D0 (en) | 1996-04-29 |
| DE69434870D1 (de) | 2006-11-30 |
| ES2274513T3 (es) | 2007-05-16 |
| EP0716706B1 (fr) | 2006-10-18 |
| FR2709496B1 (fr) | 1995-11-03 |
| US6649812B1 (en) | 2003-11-18 |
| HUT74664A (en) | 1997-01-28 |
| EP0716706A1 (fr) | 1996-06-19 |
| AU695398B2 (en) | 1998-08-13 |
| FR2709496A1 (fr) | 1995-03-10 |
| WO1995006741A1 (fr) | 1995-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110637087B (zh) | 一个表观遗传操作植物表型可塑性性状的方法 | |
| CA2087703C (en) | Binary cryptocytotoxic method of hybrid seed production | |
| US5272072A (en) | Method for preparing transformed plant | |
| ES2256856T3 (es) | Proceso de seccion de celulas transgenicas. | |
| AU2005270845B2 (en) | Traceability of transgenic plant seeds in upstream and downstream processing | |
| WO2008112267A2 (en) | Transformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| HU220857B1 (en) | Method of production of transgenic plants wholly transformed into to generation, from meristems | |
| Yancheva et al. | Efficient Agrobacterium-mediated transformation and recovery of transgenic fig (Ficus carica L.) plants | |
| AU706650B2 (en) | Genetic modification of plants | |
| CN115605600A (zh) | 未成熟花序分生组织编辑 | |
| US7122722B2 (en) | Methods for producing transgenic cotton plants using chilled apical shoot tips | |
| US20030046733A1 (en) | Transformation of soybeans | |
| Gentile et al. | Morphological and physiological effects of rolABC genes into citrus genome | |
| ES2250173T3 (es) | Nuevo metodo para la generacion y seleccion de plantas de linaza o lino transgenicas. | |
| RU2261275C2 (ru) | Способ получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам | |
| JP3234534B2 (ja) | 形質転換されたホモノ科植物 | |
| US8148603B2 (en) | Transgenic ficus, method for producing same and use thereof | |
| CN113957078B (zh) | 耐除草剂抗虫转基因大豆京豆323培育及特异性检测方法 | |
| Haines et al. | Abnormalities in growth, development and physiological responses to biotic and abiotic stress in potato (Solanum tuberosum) transformed with Arabidopsis ETR1 | |
| MXPA01007194A (es) | Hibridos de nicotiana interespecificos y su progenie. | |
| Colby et al. | Transformation in grapevine (Vitis spp.) | |
| JPH0799856A (ja) | 形質転換されたキュウリ種植物 | |
| PUGLIESI et al. | II. 7 Transgenic Sunflower (Helianthus annuus) | |
| Otani et al. | Transgenic Ornamental Ipomoea |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: BIOGEMMA, FR |