HU220584B1 - A keratinocita növekedési faktorok tisztítására szolgáló módszer - Google Patents

A keratinocita növekedési faktorok tisztítására szolgáló módszer Download PDF

Info

Publication number
HU220584B1
HU220584B1 HU9701514A HU9701514A HU220584B1 HU 220584 B1 HU220584 B1 HU 220584B1 HU 9701514 A HU9701514 A HU 9701514A HU 9701514 A HU9701514 A HU 9701514A HU 220584 B1 HU220584 B1 HU 220584B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
kgf
seq
type
unknown
glu
Prior art date
Application number
HU9701514A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT76879A (en
Inventor
Eric W. Hsu
William C. Kenney
Tim Tressel
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/487,830 external-priority patent/US6008328A/en
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of HUT76879A publication Critical patent/HUT76879A/hu
Publication of HU220584B1 publication Critical patent/HU220584B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A jelen találmány a keratinocita növekedési faktorok tisztításávalkapcsolatos. ŕ

Description

A találmány területe
A jelen találmány területe a proteintisztítás területével kapcsolatos. Specifikusan, a jelen találmány a keratinocita növekedési faktor tisztításának területével kapcsolatos.
A találmány háttere
A polipeptid növekedési faktorok az intercelluláris kommunikáció fontos közvetítői (Rubin et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806). Ezeket a molekulákat általában az egyik sejt szabadítja fel (választja ki) és más sejttípusok proliferációjának befolyásolása céljából hatnak.
A növekedési faktorok egyik családja a fibroblaszt növekedési faktor (FGF). Jelenleg nyolc ismert FGFcsaládba tartozó növekedési faktor ismeretes, melyek primer szerkezetükben rokonságot mutatnak: a bázikus fibroblaszt növekedési faktor, a bFGF (Abraham et al., 1986 ENBO J., 5:2523-2528); a savas fibroblaszt növekedési faktor, az aFGF (Jaye et al., 1986, Science 233:541 -545); az int-2 géntermék, az int-2 (Dickson & Peters, 1987, Natúré, 326:833); ahst/kFGF (Delli-Bovi et al., 1987, Cell 50:729-737 és Yoshida et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7305-7309); az FGF5 (Zhan et al., 1988, Mól. Cell. Bioi. 8:3487-3495); az FGF-6 (Mancs et al., 1989, Oncogene, 4:335-340); a keratinocita növekedési faktor (Finch et al., 1989, Science 24:752-755; Rubin et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806; Ron et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry, 268 (4): 2984-2988; and Yan et al., 1991, In Vitro Cell. Dev. Bioi. 27A:437-438) és a hisactophilin (Habazettl et al., 1992, Natúré, 359:855-858).
A proteinek FGF-családján belül a keratinocita növekedési faktor egy egyedülálló előidézője a mezenchima (embrionális kötőszövet) szövetekből származó nem fibroblasztszerű epiteliális (különösen keratinocita) sejtproliferációnak. A „natív KGF” kifejezés a természetes humán (hKGF) vagy rekombináns (rKGF) polipeptidre utal (jelszekvenciával vagy anélkül), amint azt a 2. számú szekvenciában vagy ennek alléi variánsa esetében bemutatott aminosavszekvenciában leírtuk. (Hacsak másként nem jelöltük az itt leírt molekula esetén alkalmazott aminosavszámozás megfelel a natív molekula (azaz mínusz a jelszekvencia) érett formája esetében bemutatott számozásnak, amint az a 2. számú szekvencia 32-194 aminosavai esetében leírásra került.)
A natív KGF természetes forrásokból izolálható. Például a hKGF egy embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonallal kondicionált tápközegből izolálható (Rubin et al., 1989, supra). Három kromatográfiás lépés, nevezetesen a heparin-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) affinitáskromatográfia, a HPLC gélszűrés és a reverz fázisú HPLC alkalmazható egy tisztított hKGF-készítmény kinyerése céljából. Megközelítően 6 mg hKGF nyerhető 10 liter kondicionált tápközegből. Ezekkel a kromatográfiás lépésekkel a teljes hKGF csupán 0,8%-a nyerhető ki egy mitogénaktivitási vizsgálatra alapozva. Egy további példa egy másik kromatográfiás lépés alkalmazását mutatja be heparin-Sepharose affinitást és Mono-S ioncserés kromatográfiákat (Pharmacia. Piscataway,
NJ) használva a baktériumokban termelt rKGF izolálásához (Ron et al., 1993, Journal of Biological Chemistry, 268:2984-2988).
A keratinocita növekedési faktor tulajdonságai azt sugallják, hogy lehetőség van ezen faktoroknak az epiteliális sejtnövekedés specifikus stimulálásának elősegítésére szolgáló gyógyszerként való alkalmazására. Ezért kívánatos lehet egy olyan módszer vagy módszerek kifejlesztése, melynek segítségével viszonylag nagy mennyiségű homogén keratinocita növekedési faktor nyerhető megfelelő mennyiségű anyag biztosításához az átfogó in vitro és in vivő biológiai értékelés és a potenciális terápiás alkalmazás megvalósításához.
A jelen találmány tárgya egy a keratinocita növekedési faktor tisztítására szolgáló új módszer biztosítása. A találmány összefoglalása
A jelen találmány egy keratinocita növekedési faktor tisztításának egy első módszerére irányul, mely a következő lépésekből áll:
a) KGF-et tartalmazó oldat előállítása;
b) az a) rész oldatából a KGF-et egy kationcserés gyantához kötjük;
c) egy eluálóoldattal a KGF-et a kationcserés gyantáról eluáljuk;
d) a c) lépésből származó eluálóoldatot egy molekuláris méretexklúziós mátrixon engedjük át; és
e) a molekulaexklúziós mátrixból a KGF-et kinyerjük.
A jelen találmány a továbbiakban egy keratinocita növekedési faktor (KGF) tisztítására szolgáló második módszerre irányul, mely módszer a következő lépésekből áll:
a) KGF-et tartalmazó oldatot előállítjuk;
b) az a) rész oldatából a KGF-et egy kationcserés gyantához kötjük;
c) egy eluálóoldattal a KGF-et a kationcserés gyantáról eluáljuk;
d) a c) lépésből származó eluálóoldaton hidrofób interakciójú kromatográfiát végzünk; és
e) a d) lépés hidrofób interakciójú kromatográfiájából a KGF-et kinyerjük.
Általában az első vagy a második módszer kationcserés kromatográfiás lépése bármilyen tetszés szerinti pufferrel elvégezhető (például foszfátpufferes sóoldattal, nátrium-acetáttal vagy tris-HCl-dal) olyan pH-értéken, ami körülbelül 6,8-7,5 értékek között van. Az ezen lépésben használható megfelelő oszlopok közé tartoznak a karboxi-metil-cellulóz, a karboxi-metil-agaróz és a szulfát-agaróz és a cellulózoszlopok (például az SSepharose Fást Flow gyanta, a Mono-S gyanta és a CM-cellulóz-gyanta, ezek a kereskedelemben a Pharmaciától (Piscataway, NJ) szerezhetők be). Az átfolyási sebesség az oszlop méretétől függően változik.
Az első lépés gélfiltrációs lépése bármilyen tetszés szerinti pufferrel elvégezhető (például foszfátpufferes sóoldat) olyan pH-értéken, ami előnyösen körülbelül 7,0-7,5 értékek között van. Az ezen lépésben használható megfelelő oszlopok közé tartoznak az agarózalapú, az akrilamid-alapú, a szilikaalapú vagy a polimeralapú méretexklúziós oszlopok (például a Sephadex
HU 220 584 BI
G-75 gyanta és a Superdex-75 gyanta), melyek a kereskedelemben a Pharmaciától szerezhetők be.
A második módszer egy különösen előnyben részesített megvalósulásában a szabad szulfhidrilcsoportok a hidrofóbos interakciós lépés előtt oxidálhatok az alábbiakban leírtak szerint. Bármilyen oxidációs lépés alkalmazható. Például a protein megfelelő ideig kitehető atmoszferikus oxigén hatásának. Másik lehetőségként különböző oxidációs eljárások alkalmazhatók. Egy ilyen, a keratinocita növekedési faktor számára különösen megfelelő eljárás az, amikor egy vagy több ciszteinmaradékot - a natív KGF-molekulához hasonlítva deléciónak vagy helyettesítésnek vetünk alá. Ebben az eljárásban az oxidálóanyag (például a cisztamin-dihidroklorid vagy egy másik megfelelő oxidálóanyag, például cisztein, oxidált glutation vagy divalens réz) adható végső koncentrációban, a pH előnyösen 7-9,5 értékek közé állításával, még előnyösebben 9,0 ±0,3, ha cisztamin-dihidrokloridot használunk és a hőmérsékletet előnyösen körülbelül 10-30 °C hőmérséklet között tartjuk megfelelő ideig. A második eljárás az összehasonlítható ciszteinmaradék-mintával rendelkező natív KGF és más keratinocita növekedési faktorok oxidálására használható. Ebben az eljárásban az oxidáció úgy végezhető el, ha egy ionerősség-módosító anyag [például (NH4)2SO4] megfelelő mennyiségét adjuk hozzá, a pHértéket 7,5-9,5 értékek közé állítjuk és a hőmérsékletet megfelelő szinten tartjuk 23 ±5 °C hőmérsékleten tartjuk megfelelő ideig.
A második módszer hidrofób interakciós lépése elvégezhető bármilyen tetszés szerinti puffer (például nátrium-foszfát) használatával olyan pH-értéken, mely előnyösen 6,0-8,0 értékek között van, még előnyösebben 7,0 értéken és (NH4)2SO4] 2-0 M közötti csökkenő lineáris gradiensével eluáljuk. Az ezen lépésben alkalmazható megfelelő oszlopok közé tartoznak az alkil- vagy fenilhelyettesítésű gyanták (például a Butyl-650M Toyopearl gyanta egy oszlopa, mely a kereskedelemben a Tosohaas, Inc.-től Montgomeryville, PA szerezhető be, és a fenil Sepharose gyanta és fenil Superose gyanta oszlopaival, melyek a Pharmaciától szerezhetők be).
A jelen találmány eljárása felhasználható a KGF tisztítására. így el kell fogadni, hogy a „keratinocita növekedési faktor” és a „KGF” kifejezések, ahogy azt a jelen találmányban alkalmazzuk, és hacsak másként nem jelöltük felcserélhetően a natív KLGF-et és a KGFanalóg proteineket (vagy „muteineket”) jelentik, illetve foglalják magukba, melyek olyan peptidszekvenciával jellemezhetők, melyek alapjában véve ugyanazok, mint a natív KÓF peptidszekvenciája, és megtartják a natív KGF biológiai aktivitásának egy részét vagy egészét, különösen a nem fibroblaszt epitheliális sejtproliferációt (például a BALB/MK keratinocitasejteket legalább 500-szor erősebben stimulálják, mint a NIH/3T3 fibroblasztsejteket és legalább 50-szer erősebben stimulálják a BALB/MK keratinocitasejteket, mint a BS/589 epitheliális sejteket vagy a CC1208 epitheliális sejteket, amint azt a H-timidin-beépüléssel meghatároztuk). A kifejezés, hogy „olyan peptidszekvenciával jellemezhetők, melyek alapjában véve azonosak a natív KGF peptidszekvenciájával” olyan peptidszekvenciát jelent, melyet egy, az 1. számú szekvencia 201-684 nukleotidjaihoz hibridizálódni képes DNS-szekvencia kódol, előnyösen szigorú hibridizációs körülmények között.
Két aminosavszekvencia között egy megfelelő aminosavpozíció meghatározása megvalósítható a két szekvencia egymás mellé állításával a maradékok illeszkedésének maximalizálása céljából, az amino- és/vagy karboxilvégek eltolásával, rések beillesztésével ha szükséges és/vagy inszertként a jelöltben jelen levő maradékok deléciójával. Az adatbázis-keresés, a szekvenciaanalízis és a manipulációk megvalósíthatók a jól ismert és rutin módon alkalmazott szekvenciahomológia/azonosítási szkennelési algoritmusprogramok felhasználásával (például Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448; Altschul et al., 1990, J. Mól. Bioi. 215:403-410; Lipman and Pearson 1985, Science, 222:1435 vagy Devereux et al., 1984, Nuc. Acids Rés., 12:387-395).
A szigorú körülmények a hibridizációs szövegösszefüggésben a só, hőmérséklet, szerves oldószerek és más paraméterek szigorú körülményeit jelentik, tipikusan szabályozott hibridizációs reakciókban. A példaként szolgáló szigorú hibridizációs körülmények a 4 χ SSCben, 62-67 °C hőmérsékleten végzett hibridizáció, melyet körülbelül 1 óráig tartó 0,1 χ SSC-ben 62-67 °C hőmérsékleten végzett mosás követ. Másik lehetőségként a példaként szolgáló szigorú hibridizációs körülmény 45-55%-os formamidban, 4 χ SSC-ben 40-45 °C hőmérsékleten végzett hibridizációt jelent [lásd T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 387-389].
így a proteinek magukban foglalják az aminosavak alléi variánsait vagy deléció(i)t, helyettesítés(ei)t, vagy inszertáció(i)t, ideértve a natív KGF fragmentjeit, kiméra- vagy hibridmolekuláit. A KGF egyik példája magában foglalja a 2. számú szekvencia helyettesített vagy deléciónak alávetett Cys1 és Cys15 maradékainak megfelelő maradékokkal rendelkező proteineket, a kapott molekula jobb stabilitással jellemezhető, mint a szülői molekula (az 1995. július 7.-én iktatott 08/487,825 számú USSN szabadalom mutatja be). A KGF másik példájába tartoznak a töltéscserés polipeptidek, melyekben a natív KGF 41-154 aminosavmaradékaiból egyet vagy többet (előnyösen az Arg41, Gin43, Lys55, Lys95, Lys128 Asn137, Gin138, Lys139, Arg144, Lys147, Gin152, Lys153 vagy a Thr154 maradékok) deléciónak vetünk alá, vagy egy semleges maradékkal, vagy egy negatív töltéssel rendelkező maradékkal helyettesítünk, melyeket úgy szelektáltunk, hogy egy csökkent pozitív töltéssel rendelkező proteinre legyenek hatással (az 1994. október 13.-án iktatott 08/323,337 számú USSN szabadalomban került leírásra). Egy megint más KGF-re szolgáló példák közé tartoznak az olyan proteinek, melyeket úgy hoztunk létre, hogy legalább egy erősebb hurokképző potenciállal rendelkező aminosavat helyettesítünk a KGF legalább egy, a hurokképző régión belüli Asn115-His116-Tyr117-Asn118Thr119 aminosavával (az 1994. október 13.-án iktatott 08/323,473 számú USSN szabadalomban került leírásra). Egy megint más példa olyan proteineket foglal ma3
HU 220 584 Bl gában, melyek egy vagy több aminosavhelyettesítéssel, delécióval, vagy addícióval rendelkeznek a natív KGF 123-133 régióján belül (a 2. számú szekvencia 154-164 aminosavai); ezek a proteinek agonista- vagy antagonistaaktivitással rendelkezhetnek.
A specifikusan leírt proteinek közé tartoznak a 2. számú szekvenciában leírt, következő KGF-molekulák [az érett proteinben az adott pozícióban talált maradék után neveztük el, (mínusz a jelszekvencia)], melyeket a zárójelben megadott aminosavpozíciók követnek, majd vagy a helyettesített maradék vagy a következik, mely a deléciót hivatott jelölni: C(1,15)S, deltaN15deltaN24, deltaN3/C(15)S, deltaN3/C(15)-, deltaN8/C(15)S, deltaN8/C(15)-, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, deltaN23/R(144)Q, C(l,15,40)S, S(l,15,102)S, C(l,15,102,106)S, deltaN23/N(137)E, deltaN23/K(139)E,deltaN23/K(139)Q, deltaN23/R(144)A, deltaN23/R(144)E, deltaN23/R(144)L, deltaN23/K(147)E, deltaN23/K(147)Q, deltaN23/K(153)E, deltaN23/K(l 53)Q, deltaN23/Q(l 52)E/K(153)E, R(144)Q és aH(116)G.
Ahogy azt a tudomány e területén képzett szakemberek is elfogadják, számos gazdavektorrendszer használható a KGF-protein-kódoló szekvencia expresszálására. Ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül az eukarióta sejtrendszerek, mint a vírussal (például a vaccinia vírussal, az adenovírussal) fertőzött emlőssejtrendszerek, a vírussal (például a baculovírussal) fertőzött rovarsejtrendszerek, a mikroorganizmusok, mint például az élesztőgombát tartalmazó élesztőgombavektorok; vagy a prokarióta sejtrendszerek, mint például a bakteriofág-DNS-sel, plazmid-DNS-sel, vagy kozmid-DNS-sel fertőzött baktériumok. Az ezen vektorok expressziós elemei változó hosszúságúak és specifitásúak. A felhasznált gazdavektorrendszertől függően tetszőleges számú megfelelő transzkripciós és transzlációs elem alkalmazható.
Ha a KGF-expresszió egy proteintermékét egyszer izolálták, tisztították és KGF-aktivitásra vizsgálták (a tudomány e területén képzett szakemberek által ismert eljárásokkal) ez a tennék számos gyógyszerészeti készítményben formulázható. Tipikusan, az ilyen készítmények magukban foglalnak egy megfelelő, általában kémiailag definiált hordozót vagy excipienst a terápiás anyag számára, és az alkalmazás tervezett formájától függően, valamint más alkotórészeket is. A készítmény magában foglalhat vizes hordozókat, vagy tartalmazhatnak szilárd fázisú formulákat, melyekben a KGF a nemvizes hordozóba épül be, mint például kollagéneket, hialuronsavat és különböző polimereket. A készítmény megfelelően formulázható a különböző módon történő alkalmazásokhoz, ideértve az injektálást, az orális, topikális, intranazális és a pulmonáris alkalmazást.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra a natív KGF-nukleotid- (1. számú szekvencia) és aminosav- (2. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja (a natív KGF érett formáját kódoló nukleotidokat az 1. számú szekvencia 201-684 bázisai és a
KGF érett formáját a 2. számú szekvencia 32-194 aminosavmaradékai mutatják).
A 2A., 2B. és a 2C. ábrák sorrendben a pCFM1156, pCFM1656 és a pCFM3102 plazmidok plazmidtérképeit mutatják.
A 3. ábra az RSH-KGF szerkezet nukleotid- (3. számú szekvencia) és aminosav- (4. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A 4. ábra a plazmid-KGF-ben levő szerkezet nukleotid- (5. számú szekvencia) és aminosav- (6. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
Az 5. ábra a kémiailag szintetizált OLIGO-kat (OLIGO#6-OLIGO#11; sorrendben a 12-17. számú szekvenciák) mutatja, melyeket a KpnI hely és egy KpnI helyhez (a 6. számú szekvencia 46-85 aminosavpozíciói) való EcoRI hely közötti DNS-szekvencia helyettesítésére használunk a szerkezetet tartalmazó plazmid-KGF-ben a szerkezet KGF-plazmidban (dsd) való létrehozása céljából.
A 6. ábra a KGF (kódon optimalizált) megszerkesztéséhez használt kémiailag szintetizált OLIGO-kat (OLIGO#12-OLIGO#24, sorrendben a 18-30 számú szekvenciák) mutatja.
A 7. ábra a C(1,15)S, egy KGF- analóg - melyben a szerint egy ciszteinnel helyettesítettük a natív KGF 1. és 15. aminosavpozícióiban - nukleotid- (31. számú szekvencia) és aminosav- (32. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A 8. ábra C(1,15)S/R(144)E, egy KGF-analóg melyben a szerint egy ciszteinnel helyettesítettük a natív KGF 1. és 15. aminosavpozícióiban és a glutaminsavat argininnel helyettesítettük a natív KGF 144. aminosavpozíciójában-nukleotid- (33. számú szekvencia) és aminosav- (34. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A 9. ábra C(1,15)S/R(144)Q, egy KGF-analóg melyben a szerint egy ciszteinnel helyettesítettük a natív KGF 1. és 15. aminosavpozícióiban és a glutamint argininnel helyettesítettük a natív KGF 144. aminosavpozíciójában - nukleotid- (35. számú szekvencia) és aminosav- (36. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A 10. ábra a deltaN15 - egy olyan KGF-analóg, melyben a natív KGF N-terminusának első 15 aminosava hiányzik-nukleotid- (37. számú szekvencia) és aminosav- (38. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A 11. ábra a deltaN23 - egy olyan KGF-analóg, melyben a natív KGF N-terminusának első 23 aminosava hiányzik-nukleotid- (39. számú szekvencia) és aminosav- (40. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A 12. ábra a deltaN23/R (144)Q - egy olyan KGFanalóg, melyben a natív KGF N-terminusának első 23 aminosava hiányzik és a glutamint argininre cseréltük a natív KGF 144. aminosavpozíciójában - nukleotid(41. számú szekvencia) és aminosav- (42. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.
A specifikus megvalósulások leírása
A következő példákban alkalmazott, leírt eljárásokhoz való standard módszereket vagy a megfelelő alternatív eljárásokat széleskörűen ismert molekuláris biológiai kézikönyvekben találhatjuk meg mint például a
HU 220 584 Bl
Molecular Cloning, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) és a Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990).
1. példa
A KGF-et és KGF-analógokat kódoló DNS előállítása A teljes hosszúságú humán KGF-gén (a natív KGF szekvenciájával rendelkező polipeptidet kódol) klóno- 10 zását egy állati sejtből származó RNS polimeráz láncreakciójával (PCR) és a kémiailag szintetizált (E. coli optimalizált kódon) oligonukleotidok (OLIGO-k) PCR-ével hajtjuk végre. Mindkét eljárást leírjuk az alábbiakban.
Az ismert polipeptid termelő sejtekből izolált RNS-t használva PCR-amplifikációt hajtunk végre. Először, az AG1523A humán fibroblasztsejtvonalból származó sejteket (a Humán Genetic Mutant Cell Culture Repository Institute Fór Medical Researchtől szereztük be, Camden New Jersey) guanidium-tiocianáttal feltárjuk, 20 majd extraháljuk [Chomyzinski et al., (1987, Anal. Biochem., 172:156) módszerének megfelelően]. A teljes RNS-hez való standard reverz transzkriptázos eljárást alkalmazva létrehozzuk a KGF-cDNS-t. A KGF-gén PCR-es (PCR#1) amplifikációját templátként a KGF- 25 cDNS-t és primerekként a KGF-gén 5’ és 3’ végei után azonnal következő DNS-szekvenciákat kódoló az OLIGO#l-et és az OLIGO#2-ót használva hajtjuk végre [model 9600 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 ciklusban; az egyes ciklusok a következőket jelentik: 1 perc 94 °C hőmérsékleten a denaturálás megvalósításához, 2 perc 60 °C hőmérsékleten az anneáláshoz, és 3 perc 72 °C hőmérsékleten a lánchosszabbításhoz], Ezután a PCR#1 tennék egy kis mennyiségét használjuk templátként egy második 35 KGF-PCR- (PCR#2) amplifikáció elvégzéséhez, mely azonos a fent leírt cikluskörülményekkel, azzal az eltéréssel, hogy az anneálási hőmérséklet 50 °C. A KGFgén expressziós klónozásához a beépített PCR-primereket használjuk a KGF-gén mindkét végén levő hagyó- 40 mányos restrikciós helyek létrehozása céljából. Az OLIGO#3-at és OLIGO#4-et használjuk a PCR#2-ből származó KGF DNS-termék módosítására, hogy a gén 5’ és 3’ végein sorrendben a Miül és BamHI restrikciós helyeket tartalmazzák, [PCR#3; 30 ciklus, az egyes cik- 45 lusok a következőket jelentik: 1 perc 94 °C hőmérsékleten a denaturációhoz, 2 perc 60 °C hőmérsékleten az anneáláshoz, 3 perc 72 °C hőmérsékleten a lánchosszabbításhoz]. Ezt a DNS-t ezután Mlul-gyel és BamHI5 gyei hasítjuk, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapatjuk. Ezután reszuszpendáljuk és a pCFM1156 plazmádba ligáljuk (T4 ligázt használva) (2. ábra). Ez a plazmid egy „RSH” jelszekvenciát foglal magában az RSHKGF-szerkezet létrehozása céljából (3. ábra). A ligációs termékeket az FM5 E. coli törzsbe (ATCC: 53911) transzformáljuk (Hanahan, 1983, J. Mól. Bioi. 166:557 módszerének megfelelően), majd LB+kanamycinre szélesztjük 28 °C hőmérsékleten. Számos transzformánst szelektálunk és szaporítunk 20 pg/ml kanamycint tartal15 mazó kis folyadéktenyészetekben. Az egyes tenyészetek sejtjeiből az RSH-KGF-plazmidot izoláljuk és a DNS-t szekvenáljuk. A KGF-génben levő belső Ndel hely miatt nincs lehetőség a natív génszekvencia közvetlenül a kívánt expressziós vektorba való klónozására a zárójeles Ndel és BamHI restrikciós helyekkel. Ezt egy háromlépéses ligálással valósítjuk meg. A plazmidRSH-KGF-et az egyedüli BsmI és SstI restrikciós helyeivel hasítjuk és egy körülbelül 3 kbázispár hosszúságú fragmentet (mely tartalmazza a KGF-gén 3’ végét) izolálunk az 1% agarózgélen való elektroforézist követően. A PCR-t (PCR#4) a PCR#3 esetében leírtaknak megfelelően hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az OLIGO#3 helyett az OLIGO#5-öt használjuk. Ezután a PCR-DNS-terméket az Ndel és BsmI enzimekkel hasít30 juk és egy 311 bázispár hosszúságú DNS-fragmentet izolálunk a 4%-os agarózgélen való elektroforézist követően. Az ezen ligálásban használt harmadik fragment a pCFMl 156 plazmid egy 1,8 kbázispár hosszúságú DNS-fragmentje, melyet az Ndel és SstI enzimekkel hasítunk és az 1%-os agarózgélen való elektroforézis után izolálunk. A ligálást (T4 ligáz), transzformációt, a kanamycinszelekciót és a DNS-szekvenálást követően (amint azt korábban leírtuk) egy olyan kiónt izolálunk, mely tartalmazza a 4. ábrán látható szerkezetet és a KGF-nek jelölt plazmidot. Egy belső riboszomális kötőhely következtében - mely csonka termékeket eredményez - a KpnI és EcoRI helyek közötti KGF-DNSszekvenciát kémiailag szintetizált OLIGO-kkal helyettesítjük (OLIGO#6-OLIGO#11) a belső starthely (5. ábra) használatának minimalizálása céljából.
1. számú OLIGO (7. számú szekvencia):
5’-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3’
2. számú OLIGO (8. számú szekvencia):
5’-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3’
3. számú OLIGO (9. számú szekvencia):
5’-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3’
4. számú OLIGO (10. számú szekvencia):
5’-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3’
5. számú OLIGO (11. számú szekvencia):
5’-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3’
6. számú OLIGO (12. számú szekvencia):
5’-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3’
7. számú OLIGO (13. számú szekvencia):
5’-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3’
HU 220 584 Bl
8. számú OLIGO (14. számú szekvencia):
5’-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3’
9. számú OLIGO (15. számú szekvencia):
5’-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC - 3’
10. számú OLIGO (16. számú szekvencia):
’ -ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC- 3 ’
11. számú OLIGO (17. számú szekvencia):
5’-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3’
Az OLIGO-kat T4 polinukleotid kinázzal foszforiláljuk majd hővel denaturáljuk. Az egyszálú (ss) OLIGO-kat ezután hagyjuk, hogy egy kétszálú DNS-fragmentté alakuljanak oly módon, hogy a hőmérsékletet lassan hagyjuk szoba-hőmérsékletűre hűlni. A T4 ligázt használjuk ezután a belső OLIGO ragadós végek és a teljes kétszálú OLIGO-k KpnI-gyel és EcoRI-gyel hasított K.GF plazmidhoz való kovalens kötéséhez. Az új plazmidot KGF-(dsd)-nek jelöljük.
Egy teljesen E. co/i-kodon-optimalizált KGF-gént szerkesztünk meg a kémiailag szintetizált 12-24 OLIGO-k PCR-amplifikációjával.
12. számú OLIGO (18. számú szekvencia):
5’-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3’
13. számú OLIGO (19. számú szekvencia):
5’-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3’
14. számú OLIGO (20. számú szekvencia):
’ -AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGAC TCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT - 3 ’
15. számú OLIGO (21. számú szekvencia):
’ -CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTC GTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA- 3 ’
16. számú OLIGO (22. számú szekvencia):
5’-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTA CAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA- 3 ’
17. számú OLIGO (23. számú szekvencia):
5’-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAAC TGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3’
18. számú OLIGO (24. számú szekvencia):
5’-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGA CCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT- 3 ’
19. számú OLIGO (25. számú szekvencia):
’ -ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCT CACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA- 3 ’
20. számú OLIGO (26. számú szekvencia):
5’-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3’
21. számú OLIGO (27. számú szekvencia):
5’-CTTTACCACGTTTGTCGATA- 3’
22. számú OLIGO (28. számú szekvencia):
5’-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3’
23. számú OLIGO (29. számú szekvencia):
5’-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3’
24. számú OLIGO (30. számú szekvencia):
5’-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3’
A 12-24. számú OLIGO-kat úgy terveztük, hogy a natív KGF-et kódoló teljes DNS-szekvenciát reprezentálják az OLIGO-k vagy a „Watson” vagy a „Crick” szálon és a PCR-rel való amplifikáció után a kívánt kétszálú DNS-szekvenciát (6. ábra) hozza létre (5# PCR, Model 9600, Termocycler (Perkin-Elmer Cetus); 21 ciklus, az egyes ciklusok 31 mp-ig tartanak 94 °C hőmérsékleten a denaturálás céljából, 31 mp-ig 50 °C hőmérsékleten az anneálás céljából és 31 mp-ig 73 °C hőmérsékleten az elongáció (lánchosszabbítás) céljából, a 21 ciklus után a PCR-t egy 7 percig tartó végső hosszabbítólépéssel fejezzük be). A PCR-amplifikáció után a DNS-fragmentet Xbal-gyel és BamHI-gyel hasítjuk és az 521 bázispár hosszúságú fragmentet az ugyanezen enzimekkel hasított pCFM1156 expressziós plazmidba ligáljuk. A PCR#5 az OLIGO#12 és OLIGO#13 külső primereket (100 pmol/100 μΐ rxn) és egy KGF templát 1 μ1/100μ1 rxn-jét használja fel, mely templátot az OLIGO#14-OLIGO#19 T4 ligázzal való ligálásával származtatjuk (az OLIGO#15-OLIGO#18 OLIGO-kat T4 polinukleotid kinázzal foszforiláltuk) szálsegítő oligóként (Jayaraman et al., 1992, Biotechniques, 12:392)
HU 220 584 Β1 az OLIGO#20-OLIGO#24 oligókat használva a ligáláshoz. A végső szerkezet KGF (kodonoptimalizált) jelölést kap.
A jelen találmányban leírt összes KGF-analóg részben a KGF (dsd)-ben vagy a KGF (kodonoptimalizált)ben talált DNS-szekvenciából áll, vagy ezek kombinációjából. A szekvenciákat tovább módosítjuk a DNSszekvenciák - melyek az adott KGF-analóg aminosavakat kódolják - hagyományos restrikciós helyeire való inszertációval, melyeket egy vagy több, a DNS-fragment-szintézishez leírt, fent megadott technikákkal valósítunk meg. Bármelyik analóg teljes mértékben létrehozható a fent leirt technikák bármelyikével. Azonban az általános OLIGO tervezés részeként optimalizált E. co/j'-kodonokat használunk ha erre lehetőség van, bár az E. co/z-optimalizált kodonok jelenléte a vizsgált gének bármelyikének egy részében vagy in toto nem növeli szignifikánsan a tenyésztett bakteriális sejtekből nyerhető proteinhozamot. A megfelelő példaként a 7-12. ábrákban bemutatott adott KGF-analóg nukleotid- és aminosavszekvencia-szerkezetek a következők: C(1,15)S (7. ábra); C(1,15)S/R(144)E (8. ábra); C(1,15)S/R(144)Q (9. ábra); deltaN15 (10. ábra); deltaN23 (11. ábra) és deltaN23/R(144)Q (12. ábra). Az összes itt leírt KGF-analóg szerkezet esetében megerősítettük a DNS-szekvenciát.
2. példa
Az E. coliból való tisztítás
Három különböző expressziós plazmidot használunk a KGF-analóg gének klónozásában. Ezek a pCFMl 156 plazmid (ATCC 69702), a pCFM1656 plazmid (ATCC 69576) és a pCFM3102 plazmid (sorrendben 2A., 2B. és 2C. ábrák). A p3102 plazmid a pCFM1656 plazmidból származtatható egy sor hely irányította bázisváltozás végrehajtásával PCR-átfedő oligomutagenezissel. A plazmidreplikációs promotertől (Pcopb) közvetlenül 5’ irányban levő BglI hellyel kezdődően (pCFM1656 plazmid #180 bp) és a plazmidreplikációs gének felé haladva a bázispárváltozások a következők:
pCFM1656bp# bp a pCFM1656 plazmidban bp-ra változtatás a pCFM3102-ben
#204 T/A C/G
#428 AZT G/C
#509 G/C A/T
#617 — két G/C bp inszertálunk
#677 G/C T/A
#978 T/A C/G
#992 G/C A/T
#1002 A/T C/G
#1005 C/G T/A
#1026 A/T T/A
#1045 C/G T/A
#1176 G/C T/A
#1464 G/C T/A
#2026 G/C bp deléció
#2186 C/G T/A
#2479 A/T T/A
#2498-2501 AGTG TCAC GTCA CAGT
#2641-2647 TCCGAGC AGGCTCG bp deléció
#3441 G/C A/T
#3452 G/C AZT
#3649 A/T T/A
#4556 — bp-okat inszertálunk
(43. számú szekvencia)
5'-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3’ (44. SZÁMÚ szekvencia) '-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-3 ’
Amint az fent látható, a pCFM1156, a pCFM1656 és a pCFM3102 plazmidok nagyon hasonlóak egymáshoz és sok azonos restrikciós helyet tartalmaznak. A plazmidokat kényelem szempontjából választjuk, és a vektor-DNS-komponensek könnyen megváltoztathatók az új szerkezetek céljából. Az összes klónozáshoz használt gazda az E. coli FM5 törzs (ATCC 53911) és a transzformációt Hanahan (1983, supra) módszerének megfelelően hajtjuk végre, vagy Gene Pulser transzfekciós készüléket (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA) használva elektroelúcióval a gyártók leírásának megfelelően.
Kezdetben a három pCFM-vektor egyikén levő kívánt szerkezetet hordozó kívánt rekombináns E. coliklón egy kis frissen tenyésztett inokulumát indítjuk úgy, hogy a megfelelő törzs fagyasztott glicerol törzsoldatának 0,1 ml mennyiségét visszük egy 500 ml Luria táplevest tartalmazó 2 literes lombikba. A tenyészetet 30 °C hőmérsékleten 16 órán keresztül rázatjuk. Ezután a tenyészetet 8 liter steril töltő tápközeget tartalmazó (Tsai et al., 1987, J. Industrial Microbiol., 2:181-187) 15 literes fermentorba visszük át.
A rátöltéses (feed batch) fermentáció az 1. töltő tápközeg (Tsai et al., 1987, supra) adagolásával kezdődik. Ha az OD600 eléri a 35 értéket, a kívánt KGF-analóg expressziója indukálódik a tenyésztési hőmérséklet gyors 37 °C hőmérsékletre való emelésével a plazmid amplifikációjának lehetővé tételével. 37 °C hőmérsékleten való két óra után a tenyésztési hőmérsékletet gyorsan 42 °C hőmérsékletre emeljük a Cl-represszor denaturálása céljából és az 1. tápközeg adagolását abbahagyjuk és megkezdjük a 2. tápközeg adagolását, melynek adagolási sebessége 300 ml/óra sebességgel indul. A 2. tápközeg 175 g/1 triptikáz-peptont, 87,5 g/1 élesztőkivonatot és 260 g/1 glükózt tartalmaz. 42 °C hőmérsékleten való 1 óra után a tenyésztési hőmérsékletet 36 °C hőmérsékletre csökkentjük, majd ezen a hőmérsékleten tartjuk 6 órán keresztül.
Ezután a fermentációt leállítjuk és a sejteket 1 literes centrifugacsövekbe helyezett műanyag zsákokba való centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket 400 rpm fordulatszámon 60 percig tartó centrifugálással pelletizáljuk, majd a felülúszót eltávolítjuk és a sejtmasszát -90 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk.
Az E. coliban levő különböző KGF-analógok expressziója után a natív KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, deltaN15, deltaN23, és del7
HU 220 584 Bl taN23/R(144)Q proteint a következő eljárásokat használva tisztítjuk. A nagy sejtsűrűségű fermentációból származó sejtmasszát 4 °C hőmérsékleten 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO4 elegyében szuszpendáljuk pH=7,5 értéken 10-20% (súly/térfogat) oldatként egy megfelelő nagy fordulatszámú keverőt használva. Ezután a szuszpendált sejteket lizáljuk az oldat homogenizátoron (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) való háromszori áteresztésével. A kifolyó homogenizált anyagot 4-8 °C hőmérsékletűre hűtjük egy megfelelő hőcserélő készüléket használva. Ezután a hulladékot eltávolítjuk a lizátum egy JS 4,2 rotorral felszerelt J-6B centrifugában (Beckman Instruments, Inc. Brea, CA) való centrifugálásával, 4200 rpm fordulatszámon 30-60 percig 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót ezután óvatosan leöntjük és egy előzőleg elkészített 450 ml (5 cmx23 cm) S-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) gyantaoszlopra helyezzük, melyet 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO4 elegyével (pH=7,5) ekvilibráltuk 4 °C hőmérsékleten. Ezután az oszlopot öt oszloptérfogat (2250 ml) 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO4 elegyével (pH=7,5) mossuk 4 °C hőmérsékleten. A kívánt proteint az oszlop 5 liter 0,5 M NaCl, 20 mM NaPO4 elegyével (pH=7,5) való mosásával eluáljuk. Ezután 50 ml-es frakciókat gyűjtünk és a kifolyó anyag A2g0-értékét folyamatosan nyomon követjük. Az A280 méréssel az eluált anyagot tartalmazó azonosított frakciókat SDS-PAGE-vizsgálattal analizáljuk 14%-os gélen, a kívánt polipeptid jelenlétének megerősítése céljából.
A kérdéses proteineket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, majd azonos térfogatú desztillált vizet adunk hozzá. Ezután a hígított mintát egy korábban előkészített 450 ml-es (5 cmx23 cm) S-Sepharose Fást Flow 0,4 M NaCl, 20 M NaPO4 (pH=6,8) elegyével ekvílibrált oszlopra helyezzük 4 °C hőmérsékleten. Az oszlopot 2250 ml 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO4 elegyével (pH=6,8) mossuk és a protein egy 20 oszloptérfogatnyi 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO4 (pH = 6,8) - 0,6 M NaCl, 20 mM NaPO4 (pH=6,8) lineáris gradiensével eluáljuk. Ismét 50 ml-es frakciókat gyűjtünk, az effluens (kifolyó) anyag A280 folyamatos nyomonkövetése mellett. A proteint tartalmazó frakciókat (14%-os SDS-PAGE-val határoztuk meg) ezután összegyűjtjük, majd egy YM-10 (10000 molekulasúly résméretű) membránon egy 350cc keverősejtben (Amicon, Inc. Mayberry, MA) 30-40 ml térfogatra koncentráljuk.
Ezután a koncentrátumot egy korábban előállított 1300 ml (4,4 cmx85 cm) Superdex-75 gyanta- (Pharmacia) oszlopra helyezzük, melyet lx PBS-sel (Dulbecco-féle foszfátpufferelt sóoldat, „D-PBS”, kalciumés magnéziummentes) vagy 0,15 M NaCl és 20 mM NaPO4 elegyével (pH=7,0) ekvilibráltunk. Miután a mintát az oszlopon megfuttatjuk a proteint a gélszűréses mátrixról egy oszloppuffert használva eluáljuk. Ezután 10 ml-es frakciókat nyerünk és az analógot tartalmazó frakciókat (14%-os SDS-PAGE-val határozzuk meg) összegyűjtjük. Tipikusan a proteinkoncentráció 5-10 mg/ml körüli a kapott összegyűjtött anyagban. Az összes fent leírt eljárást 4-8 °C hőmérsékleten hajtjuk végre, hacsak másként nem jelöltük.
Egy alternatív tisztítási eljárást használunk a natív KGF, a C(1,15)S és a deltaN23 tisztítására. Az eljárás a következő lépéseket foglalja magában, és hacsak másként nem specifikáljuk az összes eljárást, az oldatokat és anyagokat 23+5 °C hőmérsékleten végezzük el, illetve tároljuk.
A bakteriális fermentáció termelési fázisának elvégzése után a sejttenyészetet lehűtjük 4-8 °C hőmérsékletre, majd a sejteket centrifügálással vagy egy hasonló eljárással összegyűjtjük. A proteinsejtmassza-egység súlyonkénti várt hozama alapján, valamint a várt tisztított protein alapján egy megfelelő mennyiségű sejtmasszát (súly szerint) enyhe pufferoldatban (20 mM NaPO4, 0,2 M NaCl (pH=7,5) szuszpendálunk szuszpendálandó sejttömegsúlyának körülbelül ötszörös mennyiségében. A sejteket egy homogén oldattá diszpergáljuk nagy fordulatszámú keverőben. A sejtmaszsza-diszperzió hőmérsékletét 4-8 °C hőmérsékleten tartjuk a homogenizálás ideje alatt.
Ezután a sejteket nyomással lizáljuk, például a sejtmassza-diszperzió megfelelő méretű sejthomogenizátoron való kétszeri átnyomásával. A homogenizátumot hidegen tároljuk 5+/-3 °C hőmérsékleten. A sejtlizátum tisztításához egy korábban elkészített megfelelő szűrőfelszínnel rendelkező szűrővel felszerelt mélységi szűrőkészüléket (Cuno, Inc., Meriden, CT) használunk, melyet 20 mM NaPO4, 0,2 M NaCl (pH=7,5) ekvilibráltunk. Az ekvilibrálást és a tisztítást 5+/-3 °C hőmérsékleten végezzük el. Tisztítás után egy megfelelő szűrő megfelelő mennyiségét használjuk a szűrő előburkolására és alaposan összekeverjük a sejtlizátummal, mely után a lizátumot tisztítjuk az oldat szűrőapparátuson való átengedésével. A szűrőt 20 mM NaPO4,0,2 M NaCl (pH=7,5) elegyével mossuk. A szűrletet és bármilyen ezt követő mosott anyagot egy megfelelő kapacitású hűtött tartóban gyűjtjük össze, melyet egész idő alatt 10 °C hőmérséklet alatt tartunk.
Tisztítás után a lizátumot egy korábban előkészített 2 g/sejtmassza/1 ml gyantát tartalmazó SP-Sepharose Fást Flow oszlopon engedjük át. Az SP-Sepharose Fást Flow oszlopot 20 mM NaPO4,0,2 M NaCl (pH=7,5) hideg elegyével ekvilibráltuk. Az oszlop hőmérsékletét 10 °C hőmérséklet alatt tartjuk. A tisztított lizátumot (5+/-3 °C) egy ioncserés oszlopra helyezzük az eluátumot 280 nm (A280) abszorbanciaértéken folyamatosan nyomon követjük. A minta felhelyezése után az oszlopot 20 mM NaPO4, 0,2 M NaCl (pH=7,5) hideg elegyével mossuk, majd 20 mM NaPO4,0,3 M NaCl (pH=7,5) elegyével mossuk 23+/-5 °C hőmérsékleten.
A kívánt protein eluálásához 20 mM NaPO4, 0,2-1 M NaCl (pH=7,5) lineáris gradiensét használjuk. A terméket számos frakcióban gyűjtjük össze az eluátum A280-értéke alapján. Eluálás után a frakciókat összegyűjtjük és a térfogatot feljegyezzük.
A szabad szulfhidrilcsoportok oxidálása céljából egy oxidációs lépést hajtunk végre. A megváltozott ciszteinmintával rendelkező proteinek esetében a natív KGF-hez viszonyítva egy oxidálóanyagot (például cisztamin-dihidrokloridot vagy egy másik megfelelő oxidálóanyagot, például cisztint, oxidált glutationt vagy
HU 220 584 Bl divalens rezet) adunk 1-20 mM végső koncentrációban és a pH-értéket 7-9,5 értékek közé állítjuk, 9,0+/-0,3 értékre ha cisztamin-dihidrokloridot használunk. Az oxidációt 10-30 °C hőmérsékleten hajtjuk végre megfelelő időtartam alatt. A natív KGF esetében az oxidációt (NH4)2SO4 megfelelő mennyiségének hozzáadásával érjük el, például 1-2 M (NH4)2SO4 hozzáadásával, valamint a pH-érték 7,5-9,5 értékre való állításával és a hőmérséklet 23+/-5 °C hőmérsékleten megfelelő ideig való tartásával.
Az oxidálás után az oldat pH-értékét 6,5-9,5 értékek közé állítjuk. Ha szükséges szilárd (NH4)2SO4-ot adunk az oldathoz 2 M végső koncentrációban. A részecskék eltávolítása céljából az oldatot egy megfelelő tisztítószűrőn engedjük át.
A szűrt, oxidált terméket ezután hidrofób interakciós kromatográfiának (HIC) vetjük alá. A HIC mátrix Butyl-650M Toyopearl gyanta (Tosohaas, Inc. Montgomeryville, PA). A proteint tartalmazó oldatot egy oszlopra helyezzük, melyet korábban 2M (NH4)2SO4; 20 20 mM NaPO4, 0,2 M NaCl (pH=7,0) elegyével ekvilibráltunk. A minta felhelyezése után az oszlopot 2 M (NH4)2SO4,20 mM NaPO4,0,15 M NaCl (pH=7,0) elegyével mossuk. A kívánt proteint 20 mM NaPO4,
0,15 M NaCl elegyében (pH = 7,0) létrehozott 25 (NH4)2SO4 2-0 M közötti csökkenő lineáris gradiensével eluáljuk. Amikor a kívánt protein elkezd eluálódni - amint azt az eluátum A2g0-értékének növekedése jelzi - a frakciókat összegyűjtjük. Az egyes frakciók azonos mennyiségeit SDS-PAGE-val analizáljuk. A ki- 30 vánt proteint tartalmazó frakciókat összeöntjük, jól összekeveijük és az összegyűjtött anyag térfogatát meghatározzuk, valamint a benne található proteinkoncentrációt is meghatározzuk.
Az összegyűjtött HIC proteintartalmú eluátumot ez- 35 után koncentráljuk és az elúciós puffért megváltoztatjuk. Tipikusan a proteineket 5,0-10,0 mg/ml értékekre koncentráljuk. Ezután ultraszűrést hajtunk végre egy
Pellicon kazettarendszerrel (Millipore, Inc., Bedford,
MA) felszerelt, megfelelő lyukméretű membránt tartalmazó ultraszűrő-készülékkel.
A koncentráció után a mintát egy megfelelő pufferrel 5 szemben diaszűijük. A koncentrációs lépésből visszatartott anyagot 20 mM NaPO4, 0,15 M NaCl (pH=7,0) elegyével szemben diaszűijük, míg a visszatartott anyag konduktivitása a 20 mM NaPO4,0,15 M NaCl (pH=7,0) elegyének konduktivitásának 5%-a alá esik.
Ezenkívül, a csapadék és az esetlegesen jelen levő bakteriális endotoxin eltávolítása céljából a koncentrált, diaszűrt, proteint tartalmazó mintát egy 0,1 pm méretű Posidyne szűrön (Pali, Inc., Cortland, NY) engedjük át. Az oldat proteintartalmának meghatározása után és a 15 végső tömeges termék kívánt koncentrációjának alapján az oldatot 20 mM NaPO4, 0,15 M NaCl (pH=7,0) elegyével a kívánt végső koncentrációra állítjuk. Ezután egy végső aszeptikus szűrést hajtunk végre egy 0,22 pm-es szűrő segítségével, amint a végső ömlesztett terméket egy pirogénmentes tartóba helyezzük tárolás céljából (körülbelül 5 °C hőmérsékleten) a további formulázásig.
3. példa
Emlőssejt-tenyészetből való tisztítás
Ez a példa emlős-expressziósrendszerben létrehozott két biológiailag aktív rekombináns KGF (rKGF)forma expresszióját, izolálását és jellemezését írja le.
A humán KGF-gént a normális humán dermális fibroblasztsejtekből (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) készített cDNS-PCR-amplifíkációval izoláljuk. A cDNS reverz transzkriptázzal való létrehozása után PCR-t használunk a KGF-gén amplifikálásához. Az OLIGO#25-öt és az OLIGO#26-ot használjuk a gén cDNS-ből való amplifíkálására és az OLIGO#27-et és az OLIGO#28-at használjuk a HindlII és a BglII restrikciós helyek a fragment végeihez való helyezéséhez egy második PCR-amplifikáció segítségével, amint azt az 1. ábrán bemutatjuk.
OLIGO#25 (45. számú szekvencia):
’ -CAATCTACAATTCACAGA- 3 ’
OLIGO#26 (46. számú szekvencia):
5’-TTAAGTTATTGCCATAGG- 3’
OLIGO#27 (47. számú szekvencia):
5’-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3’
OLIGO#28 (48. számú szekvencia):
5’-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3’
A klónozás után és a DNS-szekvencia megerősíté- fikációt a következő két prímért használva hajtjuk se után a KGF-gén-DNS-t felhasználjuk. Az ampli- 50 végre:
OLIGO#29 (49. számú szekvencia):
5’-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG- 3’
OLIGO#30 (50. számú szekvencia):
5’-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3’
Az OLIGO#29, sense primer magában foglal egy Xbal helyet és egy konszenzus Kozak-transzlációs-szekvenciát (5’-CCACC-3’) az ATG startkodontól upstream irányban. Az antisense primer, az OLIGO#30, egy Sáli klónozóhelyet és egy további stopkodont foglal magában. A PCR-amplifikáció 18 ciklusa után (30 mp denaturáció 94 °C hőmérsékleten, 40 mp anneáiás 55 °C hő60 mérsékleten és 40 mp lánchosszabbítás 72 °C hőmérsék9
HU 220 584 Bl létén) a terméket Xbal-gyel és Sall-gyel emésztjük és a pSDRalfa2 plazmid hasonlóan emésztett DNS-ével ligáljuk (Bourdrel és munkatársai (1993, Protein Exp. & Purif. 4:130-140) és Lu és munkatársai (1992, Arch. Biochem. Biophys. 298:150-158) módszereinek megfelelően). Ez a KGF/pDSRalfa2 plazmidot eredményezi, mely a humán KGF-gént az SV40 korai promoter és az alfa-FDH poliadenilációs szekvenciák közé helyezi. A kiónokat izoláljuk és a DNS-szekvencia-analízis megerősíti a kívánt vektor megszerkesztését.
Ezután 2 pg KGF/pDSRalfa2 DNS-t linearizálunk Pvul-gyel. Kínaihörcsög-petesejteket (CHO) - melyeket előző nap oltottunk 0,8 χ 106 sejt/60 mm-es tenyészedény mennyiségben - transzfektálunk a kezelt DNSsel egy standard kalcium-foszfátos kicsapatási módszert használva (Bourdrel et al., supra). Két héttel később az egyes telepeket izoláljuk és egy 24 üregű lemezre visszük át. A kondicionált tápközeget szérummentesnek tekintjük, ha a sejtek elérik a konfluenciát, és azonos mennyiségeiket Westem-lenyomat-technikával analizáljuk egy E. coli által expresszált humán KGF-fel szemben reaktív poliklonális nyúlantiszérumot használva.
A Westem-lenyomat-technikákat 12,5%-os (w/v) SDS-poliakrilamid géleken futó mintákkal hajtjuk végre, majd 1 órán keresztül elektrolenyomatolást végzünk 400 mA értéken nitrocellulóz membránokra félszáraz átvivőkészüléket (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) használva. 20 mM Tris, 150 mM glicin, 20% metanol szolgál transzferpufferként. A nitrocellulóz lemezeket PBS-ben levő 10% normál kecskeszérumban való inkubálással blokkoljuk. Primer antitestként az E. coli eredetű KGF-fel szembeni nyúlantiszérumot használjuk. Az alkalmazáshoz ezt PBS-ben levő 1% normál kecskeszérumban 1/10 000 arányban hígítjuk és a blokkolt nitrocellulóz lemezekkel 12 órán keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd a feleslegben levő antitestet 30 percig tartó PBS-sel való mosással távolítjuk el. Ezután a nitrocellulóz membránokat 100 ml Vectastain biotinilált kecske-antinyúl IgG-t (másodlagos antitest, Vector Labs, Burlingame, CA) tartalmazó PBS-ben levő 1%-os normál kecskeszérumban inkubáljuk 30 percen keresztül szobahőmérsékleten. PBS-ben való háromszor 10 percig tartó mosás után egy 30 percig tartó szobahőmérsékleten végzett inkubálás következik streptavidint és biotinilált peroxidázt tartalmazó 1% normál kecskeszérum 100 ml oldatában, melyet a gyártók (Vector Labs) előírásának megfelelően készítettünk el. PBS-ben végzett három mosást követően a KGF keresztreaktív anyagot úgy tesszük láthatóvá, hogy 100 ml-ben levő 60 μΐ 30%-os (w/v) H2O2 és 20 ml metanolban levő 50 mg 4-kloronaftol elegyében inkubáljuk. A reakciót vízben való mosással állítjuk le 10 perc eltelte után.
A lenyomatok analízise felfedte, hogy a KGF specifikus antiteste három különböző proteinsávval kapcsolódott, kettő szorosan közel áll egy körülbelül 25-29 kDa molekulasúlyhoz és egy, egy körülbelül 17 kDa molekulasúlyhoz, amint azt a 163 aminosavhosszúságú érett protein megközelítően 18,8 kDa várt molekulasúlyúhoz hasonlítjuk. Ezenkívül, különböző erősen expresszáló kiónt - melyek több mint 20, mg rKGF-et szekretálnak literenként, amint azt a Westem-analízis Igazolta - szelektálunk és szaporítunk el forgólombikokban (Lu et al., supra módszerének megfelelően) a szérummentes kondicionált tápközeg nagy mennyiségeinek létrehozása céljából a KGF kationcserés kromatográfiával és gélszűréssel való tisztításához, amint azt az alábbiakban leírjuk.
liter szérummentes kondicionált tápközegből KGFet tisztítunk úgy, hogy a tápközeget közvetlenül egy kationcserés oszlopra (5x24 cm) helyezzük, melyre egy 20 mM nátrium-foszfáttal (pH=7,5) preekvilibrált 450 ml-es szulfoetil SP-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopot helyeztünk. 20 mM NaPO4,0,2 M NaCl (pH=7,5) elegyének öt oszloptérfogatnyi mennyiségével történő mosás után az rKGF-et 20 mM NaPO4-ban levő 0,2-1,0 M NaCl (pH=7,5) 20 oszloptérfogatnyi lineáris gradiensével eluáljuk. 50 ml-es frakciókat gyűjtünk folyamatos A280 nm hullámhosszon való nyomon követés mellett. A KGF-proteint az egyes frakciók SDS-PAGEval való analizálásával detektáljuk. Az SDS-PAGE-t egy elektroforézises rendszeren (Novex, San Diego, CA) végezzük el előregyártott 14%-os Tris-glicin előregyártott géleket használva (Laemmli 1970, Natúré 227:680-685 módszerének megfelelően). A mintákat nem redukáló SDS-minta pufferrel keveijük össze - melegítés nélkül - a felhelyezés előtt. A proteineket vagy Coomassie kék vagy ezüst festéssel detektáljuk. Két későn eluáló csúcs tartalmazni látszik a Westem-lenyomattechnikával detektált 25-29 kDa és a 17 kDa sávoknak megfelelő proteinsávokat. Az ezen csúcsokat tartalmazó frakciókat külön koncentráljuk 1,0 ml-nél kisebb térfogatúra és géltisztításnak vetjük alá.
A géltisztításhoz Superdex-75 gyantaoszlopokat (HR 10/30, Pharmacia) használunk, melyeket PBS-sel (pH=7,2) ekvilibráltunk, és a következő ismert molekulasúlyú standardekkel (BioRad, San Francisco, CA) kalibráltunk: tiroglobulin (670 kDa), gammaglobulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), mioglobin (17 kDa) és B12-vitamin (1,4 kDa). Ezek a tisztítási lépések az rKGF megközelítően 2000-szeres tisztaságát eredményezi, specifikusan magában foglalja a 17 kDa és a 30 kDa molekulasúlyú anyagot, amint azt az ezüst festéssel megbecsültük.
A nagyobb molekulasúlyú anyag esetében az rKGF egy főbb szimmetrikus csúcsként eluál, melyet KGF-anak neveztünk el. Ezen anyag egy kisebb mennyiségének SDS-PAGE analízisével 3 pg/sáv versus 6 pg/sáv, 1-2 kDa molekulasúly különbségű két sávot különítettünk el. Az alacsonyabb molekulasúlyú anyag esetében, melyet KGF-b-nek neveztünk el, a gélszűrés a várt mobilitású proteinkészítményt eredményezte. A KGF-a és a KGF-b esetében a tisztítás utáni teljes hozam körülbelül 30-40%-os.
A KGF-a és a KGF-b aminosavszekvenciáit szintén analízisnek vetjük alá. Ezeket az analíziseket egy automata szekvenálón (Model 477A vagy 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) végezzük el, melyet egy Model 120 A on-line PTH aminosavanalizátorral és egy Model 900A adatgyűjtő rendszerrel szereltünk fel
HU 220 584 Bl (Lu et al., 1991 J. Bioi. Chem., 266:8102-8107 módszerének megfelelően). A KGF-a Edman-szekvenciaanalízise egy fő N-terminális szekvenciát (Xj-N-D-MT-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S- (51. számú szekvencia) fedett fel. Egy a harmadik N-terminális aminosavnál, az aszparaginsavnál kezdődő kisebb szekvencia szintén jelen van a teljes szekvenálható protein 1,6%ában. Az Xj-et, X2-őt, X3-at nem határoztuk meg a feniltiohidantoinil (PTH) aminosavjelek hiányának köszönhetően a szekvenciaanalízis során.
Érdekes, hogy a KGF-b N-terminális szekvenciaanalízise egy S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (52. számú szekvencia) N-terminális aminosavszekvenciát fedett fel, azt jelezve, hogy ez a KGF egy N-terminálisan csonkított formája, mely proteolitikusan hasított az Arg23-Ser24 peptidkötéseknél.
A KGF-a és KGF-b további jellemzéséhez a proteint glükozidázoknak (neuraminidáz, O-glükanáz és/vagy N-glükanáz) vetettük alá ismert technikákat használva (Sasaki et al. 1987, J. Bioi. Chem., 262:12059-12076; Takeuchi et al., 1988, J. Bioi. Chem., 263:3657-3663; Zsebo et al., 1990, Cell, 63:195-201). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a KGF-a N és O-kapcsolódású szénhidrátokat tartalmaz bár a KGF-a alacsonyabb molekulasúlyú formája feltehetően csupán az N-kötésú cukrot tartalmazza. A glükozidázos kezelés nem okozott molekulasúly-csökkenést a KGF-b esetében, ami azt jelzi, hogy a molekula nem glikozilált.
4. példa
Biológiai aktivitás
Az egyes KGF-analógokat hígítjuk és biológiai aktivitásra vizsgáljuk a Balb/MK sejtek [3H]-timidin-felvételének mérésével (Rubin et al., 1989 supra módszerének megfelelően). A mintákat először egy biovizsgálati tápközegben hígítjuk fel, mely 50% a vásárló által készített Eagle-féle MEM-et, 50% a vásárló által készített
F12-öt, 5 pg/ml transzferrint, 5 ng/ml nátrium-szelenitet, 0,0005% HSA-t és 0,005% Tween 20-at tartalmaz. Ezután a KGF-mintákat a Falcon primeria 96 üregű lemezekre helyezzük, melyeket Balb/MK sejtekkel oltottunk be. A DNS-szintézis alatti [3H]-timidin-beépülést mérjük és az input natív KGF-koncentrációra konvertáljuk egy natív KGF standard görbéhez való hasonlítással. Az egyes tesztelt analógok mitogén aktivitást mutatnak.
A KGF-receptorral való kölcsönhatást a Balb/MK egér-epidermáliskeratinocitákból előállított izolált KGFreceptormembrán-készítményeket használva vizsgáljuk (Massague 19932, J. Bioi. Chem., 258:13614-13620 módszerének megfelelően). Specifikusan, A KGF különböző formáit 0,2% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó 50 mM Tris-HCl-ben (pH=7,5) hígítjuk (így a koncentráció 50 μΐ mennyiségenként 0,8-100 ng határok között mozog). Ezeket egyesével inkubáljuk a membránkészítménnyel (75 ng/ml) és a 125I-jelölésú E. coli eredetű KGF-fel (1,5 ng). A receptorkötési és a -kompetíciós kísérleteket 4 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 16 órán keresztül, ezután a mintákat kivesszük és centrifugáljuk, majd kétszer a fenti hígítópufferrel mossuk a nem kötött és nem specifikusan kötött jelölt KGF eltávolítása céljából. Ezután a minták fennmaradó radioaktivitását méqük. A KGF-minták és ajelölt KGF közötti receptorkötődés kompetíciós görbéit úgy hozzuk létre, hogy a százalékos kompeticiómentességet az egyes KGF-minták koncentrációjával szemben ábrázoljuk. A radioreceptoros vizsgálati kompetíciómentességi kísérletek azt jelzik, hogy az E. coli eredetű KGF, a KGF-a és a KGF-b hasonló receptorkötési aktivitással rendelkeznek.
Míg a jelen találmányt általánosan és az előnyben részesített megvalósulásokkal írtuk le, el kell fogadni, hogy más változatok és módosulások is előfordulhatnak a tudomány e területén képzett szakemberek számára a fenti leírás fényében.
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:
(i) FELTALÁLÓ: Amgen Inc.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: A keratinocita növekedési faktorok tisztítására szolgáló módszer (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 52 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍMZETT: Amgen inc.
(B) UTCA: 1840 DeHavilland Drive (C) VÁROS: Thousand Oaks (D) ÁLLAM: Califomia (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 91320-1789 (v) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:
(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reéease #1.0 #1.25 verzió (vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:
(A) A TALÁLMÁNY SZÁMA: US 08/487,830 (B) IKTATÁSI DÁTUM:
(C) KLASSZIFIKÁCIÓ: eddig nem ismert
HU 220 584 Bl (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 862 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAATCTACAA 60 TTCATTTTCA 120 TTCACAGATA GGAAGAGGTC AATGACCTAG GAGTAACAAT CAACTCAAGA
TTATGTTATT CATGAACACC CGGAGCACTA CACTATAATG CACAAATGGA
TACTGACATG 180 GATCCTGCCA ACTTTGCTCT ACAGATCATG CTTTCACATT ATCTGTCTAG
TGGGTACTAT 240 ATCTTTAGCT TGCAATGACA TGACTCCAGA GCAAATGGCT ACAAATGTGA
ACTGTTCCAG 300 CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA CATGGAAGGA GGGGATATAA
GAGTGAGAAG 360 ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG GATCGATAAA AGAGGCAAAG
TAAAAGGGAC 420 CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT GGAAATCAGG ACAGTGGCAG
TTGGAATTGT 480 GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA TCTTGCAATG AACAAGGAAG
GAAAACTCTA 540 TGCAAAGAAA GAATGCAATG AAGATTGTAA CTTCAAAGAA CTAATTCTGG
AAAACCATTA 600 CAACACATAT GCATCAGCTA AATGGACACA CAACGGAGGG GAAATGTTTG
TTGCCTTAAA 660 TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA AACGAAGAAA GAACAAAAAA
CAGCCCACTT 720 TCTTCCTATG GCAATAACTT AATTGCATAT GGTATATAAA GAACCCAGTT
CCAGCAGGGA 780 GATTTCTTTA AGTGGACTGT TTTCTTTCTT CTCAAAATTT TCTTTCCTTT
TATTTTTTAG 840 GTGCATTTAT TAATCAAGAA GTTTGTTTTA AGGCTGGAAA AG AACTACTGAA AAACTGATCA AGCTGGACTT
862 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 194 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t His 1 Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 5 10 15
Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val Gly Thr Ile Ser Leu Alá Cys 20 25 30
Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser 35 40 45
Pro Glu 50 Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 55 60
Arg Val 65 Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 70 75
Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 85 90 95
11 e Me t Glu Ile Arg Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile Lys Gly 100 105 110
HU 220 584 Bl
Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Me t Asn Lys Glu Gly Ly s Leu Tyr
115 120 125
Al a Ly s Ly s Glu Cy s Asn Glu Asp Cy s Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu
130 135 140
Glu Asn Hi s Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Al a Lys Trp Thr Hi s Asn Gly
145 150 155
Gly Glu Me t Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly
165 170 175
Lys Lys Thr Ly s Ly s Glu Gin Lys Thr Al a Hi s Phe Leu Pro Me t Al a
180 185 190
Ile Thr
(2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 595 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATCGATTTGA 60 TGCTGTGGCT TTCTAGAAGG AGGAATAACA TATGAAAAAG CGCGCACGTG CTATCGCCAT
CTGGCAGGTT TCGCAACTAG TGCACACGCG TGCAATGACA TGACTCCAGA
120 GCAAATGGCT ACAAATGTGA ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA
180 CATGGAAGGA GGGGATATAA GAGTGAGAAG ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG
240 GATCGATAAA AGAGGCAAAG TAAAAGGGAC CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT
300 GGAAATCAGG ACAGTGGCAG TTGGAATTGT GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA
360 TCTTGCAATG AACAAGGAAG GAAAACTCTA TGCAAAGAAA GAATGCAATG AAGATTGTAA
420 CTTCAAAGAA CTAATTCTGG AAAACCATTA CAACACATAT GCATCAGCTA AATGGACACA
480 CAACGGAGGG GAAATGTTTG TTGCCTTAAA TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA
540 AACGAAGAAA GAACAAAAAA CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATAG
595 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 186 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(x i)A4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ SA:
Me t Ly s Ly s Arg Al a Arg Al a Ile Al a Ile Al a Val Ala Leu Al a Gly
1 5 10 15
Phe Al a Thr Ser Al a Hi s Al a Cy s Asn As p Me t Thr Pro Glu Gin Me t
20 25 30
Al a Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg Hi s Thr Arg Ser Tyr
35 40 45
As p Tyr Me t Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg
50 55 60
Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile As p Lys Arg Gly Lys Val Ly s Gly Thr
65 70 75
Gin Glu Me t Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Me t Glu Ile Arg Thr Val Val
85 90 95
HU 220 584 Β1
Val Gly I le Val Alá 100 I le Lys Gly Val Glu 105 Ser Glu Phe Tyr Leu 110 Al a
Me t Asn Ly s Glu Gly Lys Leu Tyr Alá Lys Ly s Glu Cys Asn Glu Asp
115 120 125
Cys Asn Phe Lys Glu Leu I le Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn Thr Tyr Al a
130 135 140
Ser Al a Lys Trp Thr Hi s Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Alá Leu A
145 150 155
Gin Lys Gly I1e Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Ly s Glu Gin Lys
165 170 175
Thr Al a Hi s Phe Leu Pro Me t Al a Ile Thr
180
185 (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 499bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TATGTGCAAT
GCGACACACA
120
CTGTCGAACA
180
GATGAAGAAT
240
CAAAGGGGTG
300
GAAAGAATGC
360
ATATGCATCA
420
GGGGATTCCT
480
TATGGCAATA
499
GACATGACTC
AGAAGTTATG
CAGTGGTACC
AATTACAATA
GAAAGTGAAT
AATGAAGATT
GCTAAATGGA
GTAAGAGGAA
ACTTAATAGG
CAGAGCAAAT
ATTACATGGA
TGAGGATCGA
TCATGGAAAT
TCTATCTTGC
GTAACTTCAA
CACACAACGG
AAAAAACGAA
GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA
AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT
TAAAAGAGGC AAAGTAAAAGGGACCCAAGAA
CAGGACAGTG GCAGTTGGAA TTGTGGCAAT
AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA
AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC
AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAATCAAAA
GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 164 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t Cys Asn Asp Me t Thr Pro Glu Gin Me t Al a Thr Asn Val Asn Cys
1 5 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg Hi s Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
35 40 45
Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Ly s Gly Thr Gin Glu Me t Lys Asn Asn
50 55 60
Tyr Asn Ile Me t Glu Ile Arg Thr Val Al a Val Gly Ile Val Al a Ile
65 70 75
Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Al a Me t Asn Lys Glu Gly Lys
85 90 95
HU 220 584 Bl
Leu Tyr Al a Lys 100 Lys
Ile Leu Glu 115 Asn Hi s
Asn Gly 130 Gly Glu Me t
Arg 145 Gly Lys Ly s Thr
Me t Al a Ile Thr
Glu Cys Asn Glu 105 Asp
Tyr Asn Thr Tyr Al a
120
Phe Val Al a Leu Asn
135
Lys Lys Glu Gin Lys
150
Cy s Asn Phe Ly s Glu 110 Le
Ser Al a Lys Trp 125 Thr Hi
Gin Lys Gly 140 Ile Pro Va
Thr Al a Hi s Phe Leu Pr
155 (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(1) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 26bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) All. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA
HU 220 584 Bl (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 37 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 44bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 37bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC (2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 36bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA
HU 220 584 Bl (2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AGTTTTGATC TAGAAGGAGG (2) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TCAAAACTGG ATCCTATTAA (2) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 91 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG
GTGCAACGAC ATGACTCCGG T
AACAGATGGC (2) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 90 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA
GTGTTCGTCG
TCTGTTCTGC (2) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 90bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA
GGAAATCCGT (2) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZÚSÁG: 90bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen
HU 220 584 Bl (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA
CGCAAAAAAA (2) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 90bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT
CAACGGTGGT (2) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 88 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA
GAACAGAAAA
CCGCTCACTT
CCTGCCGATG (2) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TACGGGTGTG ACGTTCCGGG (2) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CTTTACCACG TTTGTCGATA (2) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATTCAACACC TTTGATTGCA (2) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A)HOSSZÚSÁG: 20bázispár
HU 220 584 Bl (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CCAGGATCAG TTCTTTGAAG (2) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GAACCGGGAT ACCTTTCTGG (2) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 495 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60
CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120
TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180
ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240
AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 300
AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC 360
TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420
GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480
ATGGCAATCA CTTAA
495 (2) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 164 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t Ser Asn Asp Me t Thr Pro Glu Gin Me t Al a Thr Asn Val Asn Se Γ
1 5 10 15
Se r Ser Pro Glu Ar g Hi s Thr Arg Ser Tyr As p Tyr Me t Glu Gly G1 y
20 25 30
As P Ile Arg Val Ar g Arg Leu Phe Cy s Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Ar g
35 40 45
11 e As p Ly s Arg G1 y Lys Val Ly s Gly Thr Gin Glu Me t Ly s As n As n
50 55 60
HU 220 584 Β1
Tyr Asn Ile Me t Glu I le Arg Thr Val Al a Val Gly Ile Va 1 Al a Ile
65 70 75 80
Ly s Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Al a Me t Asn Lys Glu Gly Lys
85 90 95
Leu Tyr Al a Lys Ly s Glu Cys Asn Glu As p Cy s Asn Phe Lys Glu Leu
100 105 110
Ile Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn Thr Tyr Alá Ser Al a Lys Trp Thr Hi s
115 120 125
Asn Gly Gly Glu Me t Phe Val Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val
130 135 140
Arg Gly Lys Lys Thr Lys Ly s Glu Gin Lys Thr Al a Hi s Phe Leu Pro
145 150 155 160
Me t Al a Ile Thr
(2) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 495 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGTGCAATG 60 CGCCACACCC 120 ATATGACTCC TGAACAAATG GCTACCAATG TCAACTGTTC CTCTCCGGAG
GGAGTTACGA TTACATGGAA GGTGGGGATA TTCGCGTACG TCGTCTGTTC
TGCCGTACCC 180 AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG
ATGAAAAACA 240 ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC
AAAGGTGTTG 300 AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG
AAAGAATGCA 360 ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA
TATGCATCTG 420 CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA
GGTATCCCTG 480 ATGGCAATCA TTCAAGGTAA CTTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG
495 (2) A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 164 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Cy s Asn Asp Me t 5 Thr Pro G1 u G1 n Me t 10 Al a Thr Asn Va 1 Asn 15 Cys
Ser Ser Pro Glu Arg Hi s Thr Arg Ser Tyr As p Tyr Me t Glu Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
35 40 45
Ile As p Lys Arg Gly Lys Val Ly s Gly Thr Gin Glu Me t Ly s Asn Asn
50 55 60
Tyr Asn Ile Me t Glu Ile Arg Thr Val Al a Val Gly Ile Va 1 Al a Ile
65 70 75 80
Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Al a Me t Asn Lys Glu Gly Ly s
85 90 95
HU 220 584 BI
Leu Tyr Alá Lys 100 Ly s Glu Cys Asn Glu 105 Asp Cy s Asn Phe Ly s 110 Glu Leu
Ile Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn Thr Tyr Al a Ser Al a Lys Trp Thr Hi s
115 120 125
Asn Gly Gly Glu Me t Phe Val Al a Leu Asn Gin Ly s Gly Ile Pro Val
130 135 140
Arg Gly Ly s Ly s Thr Ly s Ly s Glu Gin Lys Thr Al a Hi s Phe Leu Pro
145 150 155 160
Me t Al a Ile Thr
(2) A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 495 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGTCTAATG 60 CGTCACACGC 120 ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA
GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC
TGCCGTACCC 180 AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG
ATGAAAAACA 240 ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC
AAAGGTGTTG 300 AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG
AAAGAATGCA 360 ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA
TATGCATCTG 420 CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA
GGTATCCCTG 480 ATGGCAATCA TTCAAGGTAA CTTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG
495 (2) A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 164 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Ser Asn Asp Me t 5 Thr Pro Glu Gin Me t 10 Al a Thr Asn Va 1 Asn 15 Ser
Ser Ser Pro Glu Arg Hi s Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Me t Glu Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
35 40 45
Ile Asp Ly s Arg G1 y Ly s Val Ly s Gly Thr Gin G1 u Me t Lys Asn Asn
50 55 60
Tyr Asn Ile Me t Glu Ile Arg Thr Val Alá Val Gly Ile Val Al a Ile
65 70 75 80
Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Al a Me t Asn Lys Glu Gly Lys
85 90 95
Leu Tyr Al a Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cy s Asn Phe Ly s Glu Leu
100 105 110
Ile Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn Thr Tyr Al a Ser Al a Lys Trp Thr Hi s
115 120 125
HU 220 584 Bl
Asn Gly 130 Gly Glu Me t Phe Val 135 Alá Leu Asn Gin Lys 140 Gly Ile Pro Val
Gin Gly Lys Ly s Thr Lys Ly s Glu Gin Ly s Thr Al a Hi s Phe Leu Pro
145 150 155 160
Me t Al a Ile Thr
(2) A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 450bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGTCTTCTC
GTACGTCGTC
120
AAGGGCACCC
180
GGTATCGTTG
240
AAACTGTACG
300
AACCACTACA
360
GCTCTGAACC
420
GCTCACTTCC
CTGAACGTCA
TGTTCTGCCG
AAGAGATGAA
CAATCAAAGG
CAAAAAAAGA
ACACCTACGC
AGAAAGGTAT
TGCCGATGGC
TACGCGTTCC
TACCCAGTGG
AAACAACTAC
TGTTGAATCT
ATGCAACGAA
ATCTGCTAAA
CCCGGTTCGT
AATCACTTAA
TACGACTACA
TACCTGCGTA
AATATTATGG
GAATTCTACC
GACTGCAACT
TGGACCCACA
GGTAAAAAAA
TGGAAGGTGG TGACATCCGC
TCGACAAACG CGGCAAAGTC
AAATCCGTAC TGTTGCTGTT
TGGCAATGAA CAAAGAAGGT
TCAAAGAACT GATCCTGGAA
ACGGTGGTGA AATGTTCGTT
CCAAAAAAGA ACAGAAAACC
450 (2) A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 149 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Ser Ser Pro Glu Arg His 5 Thr Arg Ser 10 Tyr Asp Tyr Me t Glu 15 Gly
Gly Asp Ile Arg Va 1 Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu
20 25 30
Arg Ile As p Lys Arg Gly Ly s Val Ly s G1 y Thr Gin Glu Me t Lys Asn
35 40 45
Asn Tyr Asn Ile Me t Glu Ile Arg Thr Val Al a Val Gly Ile Va 1 Al a
50 55 60
Ile Ly s Gly Val G1 u Ser Glu Phe Tyr Leu Alá Me t Asn Ly s Glu Gly
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Al a Ly s Ly s Glu Cy s Asn Glu As p Cy s Asn Phe Ly s Glu
85 90 95
Leu Ile Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn Thr Tyr Al a Ser Al a Ly s Trp Thr
100 105 110
Hi s Asn Gly Gly G1 u Me t Phe Val Al a Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro
115 120 125
Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Ly s Glu Gin Ly s Thr Alá Hi s Phe Leu
130 135 140
Pro Me t Alá Ile Thr
145
HU 220 584 Bl (2) A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(1) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 426 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120
AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180
GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240
AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360
GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420
ACTTAA (2) A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
426
Me t 1 Ser Tyr Asp Tyr 5 Me t Glu Gly Gly Asp 10 I le Arg Val Arg Arg 15 Leu
Phe Cy s Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg I le Asp Lys Arg Gly Lys Val
20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Me t Ly s Asn Asn Tyr Asn I le Me t Glu I le Arg
35 40 45
Thr Val Al a Va 1 Gly I le Val Al a I le Ly s Gly Val Glu Ser Glu Phe
50 55 60
Tyr Leu Al a Me t Asn Ly s Glu Gly Lys Leu Tyr Al a Ly s Lys Glu Cys
65 70 75 80
Asn Glu Asp Cy s Asn Phe Lys Glu Leu I le Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn
85 90 95
Thr Tyr Al a Ser Al a Lys Trp Thr Hi s Asn Gly Gly Glu Me t Phe Val
100 105 110
Al a Leu Asn Gin Ly s Gly I le Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Ly s Lys
115 120 125
Glu Gin Lys Thr Al a Hi s Phe Leu Pro Me t Al a I le Thr
130 135 140
(2) A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 426 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
HU 220 584 Bl
ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120
AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180
GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA GAAAGAATGC 240
AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT 300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360
GTTCAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420
ACTTAA 426 (2) A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Ser Tyr Asp Tyr 5 Me t Glu Gly Gly Asp 10 Ile Arg Val Arg Arg 15 Leu
Phe Cy s Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile As p Lys Arg Gly Lys Val
20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Me t Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Me t Glu Ile Arg
35 40 45
Thr Va 1 Al a Val Gly Ile Val Al a Ile Ly s G1 y Val Glu Ser Glu Phe
50 55 60
Tyr Leu Ala Me t Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Al a Lys Ly s Glu Cy s
65 70 75 80
Asn G1 u Asp Cys Asn Phe Ly s Glu Leu Ile Leu Glu Asn Hi s Tyr Asn
85 90 95
Thr Tyr Al a Ser Al a Ly s Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Me t Phe Val
100 105 110
Al a Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys
115 120 125
Glu Gin Lys Thr Al a Hi s Phe Leu Pro Me t Al a Ile Thr
130 135 140
(2) A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS
HU 220 584 Bl (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: (B) LOKÁCIÓ: komplement (1.. .24) (xi) A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC (2) A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAATCTACAA TTCACAGA (2) A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A46. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTAAGTTATT GCCATAGG (2) A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA (2) A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG (2) A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG (2) A 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
HU 220 584 Bl (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG 3 3 (2) A 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 16 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Xaa Xaa Ser 15 10 15 (2) A 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 12 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy keratinocita növekedési faktor tisztítására szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy a módszer a következő lépésekből áll:
    a) KGF-et tartalmazó oldat előállítása;
    b) az a) rész oldatából a KGF-et egy kationcserés gyantához kötjük;
    c) egy eluálóoldattal a KGF-et a kationcserés gyantáról eluáljuk;
    d) a c) lépésből származó eluálóoldatot egy molekuláris méretexklúziós mátrixon engedjük át; és
    e) a molekulaexklúziós mátrixból a KGF-et kinyerjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et egy prokarióta sejtben termeljük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et E. coliban termeljük.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et egy emlőssejtben termeljük.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et kínaiaranyhörcsög-petefészeksejtekben termeljük.
    30
  6. 6. Egy keratinocita növekedési faktor (KGF) tisztítására szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy, a módszer a következő lépésekből áll:
    a) KGF-et tartalmazó oldatot előállítjuk;
    b) az a) rész oldatából a KGF-et egy kationcserés
    35 gyantához kötjük;
    c) egy eluálóoldattal a KGF-et a kationcserés gyantáról eluáljuk;
    d) a c) lépésből származó eluálóoldaton hidrofób interakciójú kromatográfiát végzünk; és
    40 e) a d) lépés hidrofób interakciójú kromatográfiájából a KGF-et kinyerjük.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-ben levő szabad szulfhidrilcsoportokat oxidáljuk.
    45
  8. 8. A 6. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et prokarióta sejtekben termeljük.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et E. coliban termeljük.
  10. 10. A 6. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezbe ve, hogy a KGF-et egy emlőssejtben termeljük.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a KGF-et kínaiaranyhörcsög-petefészeksejtekben termeljük.
HU9701514A 1994-10-13 1995-10-12 A keratinocita növekedési faktorok tisztítására szolgáló módszer HU220584B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32333994A 1994-10-13 1994-10-13
US08/487,830 US6008328A (en) 1994-10-13 1995-06-07 Method for purifying keratinocyte growth factors
PCT/US1995/013099 WO1996011952A1 (en) 1994-10-13 1995-10-12 Method for purifying keratinocyte growth factors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT76879A HUT76879A (en) 1997-12-29
HU220584B1 true HU220584B1 (hu) 2002-03-28

Family

ID=26983902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701514A HU220584B1 (hu) 1994-10-13 1995-10-12 A keratinocita növekedési faktorok tisztítására szolgáló módszer

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP1334981B1 (hu)
JP (1) JP3877226B2 (hu)
CN (1) CN1161380C (hu)
AT (1) ATE239038T1 (hu)
CA (1) CA2201762C (hu)
CZ (1) CZ98297A3 (hu)
DE (2) DE69530599T2 (hu)
DK (1) DK0785949T3 (hu)
ES (1) ES2197926T3 (hu)
HU (1) HU220584B1 (hu)
IL (3) IL115605A (hu)
LU (1) LU91235I2 (hu)
NL (1) NL300229I2 (hu)
NO (1) NO971567L (hu)
PT (1) PT785949E (hu)
SI (1) SI0785949T1 (hu)
SK (1) SK43097A3 (hu)
WO (1) WO1996011952A1 (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6077692A (en) 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
EP1041996A4 (en) 1997-12-22 2003-05-14 Human Genome Sciences Inc KERATINOCYTE GROWTH FACTOR-2 FORMULATIONS
WO2002062842A1 (en) * 2001-02-06 2002-08-15 Merck Patent Gmbh Modified keratinocyte growth factor (kgf) with reduced immunogenicity
MXPA04001526A (es) * 2001-08-21 2004-05-31 Chiron Corp Composiciones de polipetidos kgf.
CN102242124B (zh) * 2010-05-10 2013-05-22 齐鲁制药有限公司 改造的角化细胞生长因子基因及其在酵母中的表达
CN102675449B (zh) * 2011-03-17 2016-06-08 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人角质细胞生长因子-ⅰ二硫键变构体及其用途
CN109402130A (zh) * 2018-11-23 2019-03-01 成都中医药大学附属医院 一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途
CN110183529B (zh) * 2019-05-23 2023-06-02 重庆派金生物科技有限公司 一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE197800T1 (de) * 1989-01-31 2000-12-15 Jeffrey S Rubin Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor
CA2098484A1 (en) * 1990-12-18 1992-06-19 Tsutomu Arakawa Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity
ES2227527T3 (es) * 1993-06-29 2005-04-01 Chiron Corp Un factor de crecimiento de queratinocitos (kgf) truncado que tiene actividad biologica aumentada.
CA2172137C (en) * 1993-09-24 1999-12-14 Andrew Peter Seddon Surface loop structural analogues of fibroblast growth factors
HUT77746A (hu) * 1994-10-13 1998-07-28 Amgen Inc. Fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkező savas fibroblaszt növekedési faktor analógok
WO1996011951A2 (en) * 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Keratinocyte growth factor analogs
SK284534B6 (sk) * 1994-10-13 2005-06-02 Amgen Inc. Polypeptidový analóg natívneho keratinocytového rastového faktora, spôsob jeho výroby a použitie, farmaceutický prostriedok a kit, nukleová kyselina, vektor a hostiteľská bunka

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10507452A (ja) 1998-07-21
EP0785949A1 (en) 1997-07-30
EP1334981A2 (en) 2003-08-13
CN1169734A (zh) 1998-01-07
AU3830695A (en) 1996-05-06
WO1996011952A1 (en) 1996-04-25
CZ98297A3 (cs) 1998-08-12
EP1334981B1 (en) 2011-01-26
DE69530599D1 (de) 2003-06-05
ATE239038T1 (de) 2003-05-15
IL115605A (en) 2003-06-24
DE69530599T2 (de) 2003-11-13
CA2201762C (en) 2001-12-18
HUT76879A (en) 1997-12-29
NL300229I2 (nl) 2006-09-01
SI0785949T1 (en) 2003-08-31
ES2197926T3 (es) 2004-01-16
LU91235I2 (fr) 2006-11-22
IL147575A (en) 2004-05-12
CA2201762A1 (en) 1996-04-25
EP0785949B1 (en) 2003-05-02
CN1161380C (zh) 2004-08-11
AU709362B2 (en) 1999-08-26
IL115605A0 (en) 1996-01-19
DK0785949T3 (da) 2003-08-18
DE122006000019I1 (de) 2006-06-29
MX9702481A (es) 1997-07-31
NO971567D0 (no) 1997-04-04
IL147575A0 (en) 2002-08-14
NO971567L (no) 1997-06-12
SK43097A3 (en) 1998-10-07
JP3877226B2 (ja) 2007-02-07
EP1334981A3 (en) 2004-05-06
NL300229I1 (nl) 2006-06-01
PT785949E (pt) 2003-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100205078B1 (ko) 염기성 섬유 아세포 성장인자 및 이의 생산방법
AU638402B2 (en) Analogs of fibroblast growth factor
CA2202075C (en) Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using
JP2007020575A (ja) ケラチノサイト増殖因子アナログ
HU220584B1 (hu) A keratinocita növekedési faktorok tisztítására szolgáló módszer
EP0275204A2 (en) Production of fibroblast growth factor
FI98915C (fi) Happaman fibroblastikasvutekijän nukleotidisekvenssi, plasmidi, isäntäsolu ja puhdistus
US6008328A (en) Method for purifying keratinocyte growth factors
HUT77746A (hu) Fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkező savas fibroblaszt növekedési faktor analógok
AU709362C (en) Method for purifying keratinocyte growth factors
JP2733207B2 (ja) 繊維芽細胞成長因子キメラ蛋白質を含有する医薬組成物
MXPA97002481A (en) Method for the purification of growth factors of queratinoci
AU2813399A (en) Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: BIOVITRUM AB (PUBL), SE

Free format text: FORMER OWNER(S): AMGEN INC., US

FH91 Appointment of a representative

Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): IFJ. SZENTPETERI ADAM, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU

Representative=s name: S.B.G. & K. SZABADALMI ES UEGYVEDI IRODAK, HU