HU219810B - Glükózamin-diszacharidok, eljárás előállításukra és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint alkalmazásuk - Google Patents
Glükózamin-diszacharidok, eljárás előállításukra és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint alkalmazásuk Download PDFInfo
- Publication number
- HU219810B HU219810B HU9601312A HU9601312A HU219810B HU 219810 B HU219810 B HU 219810B HU 9601312 A HU9601312 A HU 9601312A HU 9601312 A HU9601312 A HU 9601312A HU 219810 B HU219810 B HU 219810B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- group
- hydroxy
- acyl
- fatty acid
- disaccharides
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
- C07H13/06—Fatty acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
A találmány tárgya (I) általános képletű glükóz-amin-diszacharidok,valamint sóik, eljárás előállításukra és e vegyületeket tartalmazógyógyszerkészítmények, valamint alkalmazásuk. Az (I) képletben R1jelentése hidroxilcsoport, dihidroxi-foszfonoil-oxi-csoport vagy annaktöltéssel bíró formái, egy acil-oxi-csoport; egy alkil-oxi-csoport,vagy egy X csoport; R2 és R2’ mindegyikének jelentése acilcsoport vagyY csoport, azzal a megkötéssel, hogy R2 vagy R2’ csoportok legalábbegyikének jelentése Y csoport; R3 és R3’ mindegyikének jelentésehidrogénatom, alkilcsoport vagy acilcsoport; R4 jelentésehidrogénatom, alkilcsoport vagy acilcsoport; R4’ jelentésehidrogénatom, acilcsoport, alkilcsoport, dimetoxi-foszfonoil-csoportvagy foszfonocsoport vagy annak töltéssel bíró formái; és R6’jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, dihidroxi-foszfonoil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-oxi-csoport, azoknak egy töltéssel bíróformái vagy Z csoport, ahol X jelentése karboxi-alkil-oxi-csoport,–O–CH–[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH] képletű csoport, ahol m=0–5 és n=0–5;foszfono-alkil-csoport, dimetoxi-foszfonoil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-alkil-csoport; vagy az Xcsoport töltéssel bíró formái; ahol Y jelentése acil-oxi-acil-csoport,acil-amino-acil-csoport, alkil-oxi-acil-csoport, alkil-amino-acil-csoport, alkil-tio-acil-csoport, és ahol Z jelentése alkil-oxi-csoport, acil-oxi-csoport, 3-dezoxi-D-manno-2-oktuloszonsav(rövidítve: KDO), (KDO)n, ahol n=1–10, poliszacharidoldallánc,magkomponens vagy amino-alkil-karboxil-csoport. A találmány szerintidiszacharidok immunmoduláló és tumorellenes hatással rendelkeznek,gyógyszerkészítményekben, továbbá vakcinában is alkalmazhatók. ŕ
Description
A találmány szerinti diszacharidok immunmoduláló és tumorellenes hatással rendelkeznek, gyógyszerkészítményekben, továbbá vakcinában is alkalmazhatók.
A találmány tárgya glükóz-amin-diszacharidok, közelebbről 2-N- és/vagy 2’-N-acilezett glükóz-amin-disza- 15 charidok, ahol az acilcsoportok legalább egyike elágazó szénláncú, továbbá e diszacharidokat tartalmazó vegyületek. A találmány tárgya továbbá eljárás e diszacharidok előállítására lipopoliszacharidok lipid A egységét tartalmazó kiindulási anyagokból olyan módon, 20 hogy a kiindulási anyagot bizonyos lúgos kezelésnek vetjük alá. A találmány tárgyát képezi továbbá hatóanyagként e diszacharidokat tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint e diszacharidok terápiás és profilaktikus alkalmazása. 25
A lipopoliszacharidok mikroorganizmusok, így például a Gram-negatív baktériumok endotoxinjait képezik, és egy poliszacharid-, valamint egy lipidkomponensből állnak. A lipidkomponens, amelyet lipid A komponensnek is neveznek, határozza meg a lipopolisza- 30 charid endotoxikus tulajdonságait [Rietschel E. Th. és munkatársai, Immunobiology, 186, 169-190, (1993)].
Az A-4 912 094 amerikai egyesült államokbeli találmányi bejelentésben olyan módosított lipopoliszacharidokat ismertetnek, amelyek kisebb endotoxicitás 35 mellett megtartják antigén és immunstimuláns sajátságaikat. E módosított lipopoliszacharidok kémiailag 3O-dezacilezett származékok, amelyek savas hidrolízissel 3-O-dezacilezett diszacharidokká alakíthatók. E vegyületek közül a monofoszforil 3-O-dezacilezett disza- 40 charid kevésbé toxikus, mint a difoszforil-3-O-dezacilezett diszacharid.
A találmány tárgya diszacharidok, amelyek 3-Odezacilezett és 3’-O-dezacilezett származékok vagy a 3O-helyzetben és/vagy a 3’-O-helyzetben egy rövid Ián- 45 cú O-kapcsolt alkil- vagy acilcsoportot tartalmaznak, és legalább egy N-kapcsolt, elágazó acilcsoportot tartalmaznak a 2-helyzetben, a 2’-helyzetben, vagy mind a 2és 2'-helyzetekben. E vegyületek endotoxicitása még csekélyebb, ugyanakkor megtartják biológiai aktivitású- 50 kát (így immunmoduláló hatásukat) és rákellenes hatással rendelkeznek.
Meglepő módon úgy találtuk, hogy e bizonyos glükóz-amin-diszacharidok csekély endotoxicitás mellett megtartják biológiai aktivitásukat; ismeretes ugyanis, 55 hogy szintetikus 3-O- és 3’-O-dezacilezett glükóz-amindiszacharidok, amelyek a 2- és 2'-helyzetekben egy lekapcsolt acilcsoportot tartalmaznak [307. vegyület, Takada H. és munkatársai, CRC Critical Reviews in Microbiology, 16, 477-523, (1989)]; továbbá az LA-19-PP 60 jelű vegyület [Rietschel és munkatársai (1993)] kifejtenek ugyan némi immunobiológiai hatást in vitro vizsgálatokban, de hatásuk sokkal gyengébb, mint a referens bakteriális lipid A komponenseké. Nem rendelkeznek továbbá a tipikus endotoxicitási hatással sem.
A találmány tárgya (I) általános képletű β(1-»6) glükóz-amin-diszacharidok, ahol R[ jelentése hidroxilcsoport, dihidrofoszfonil-oxi-csoport vagy annak töltéssel bíró formái, egy (1-5 szénatomos acil)-oxi-csoport; egy (1-5 szénatomos alkil)-oxi-csoport, vagy egy X csoport;
R2 és R2’ mindegyikének jelentése egy acilcsoport vagy egy Y csoport, azzal a megkötéssel, hogy R2 vagy R2’ csoportok legalább egyikének jelentése Y csoport;
Rj és R3’ mindegyikének jelentése hidrogénatom, egy 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy egy 1-3 szénatomos acilcsoport;
R4 jelentése hidrogénatom, egy 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy egy 1-3 szénatomos acilcsoport;
R4’ jelentése hidrogénatom, egy 1-5 szénatomos acilcsoport, egy 1-5 szénatomos alkilcsoport, dimetoxifoszfonoil-csoport vagy egy foszfonocsoport vagy annak töltéssel bíró formái; és
R6’ jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, dihidroxifoszfonoil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-oxi-csoport, azoknak egy töltéssel bíró formái vagy egy Z csoport, ahol X jelentése egy karboxi-(2-5 szénatomos alkil)-oxi-csoport, egy -O-CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH] képletű csoport, ahol m=0-5 és n=0-5;
foszfono-(l-5 szénatomos alkil)-csoport, dimetoxi-foszfonoil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-(l-5 szénatomos alkil)-csoport; vagy az X csoport töltéssel bíró formái; ahol Y jelentése egy acil-oxi-acil-csoport, egy acil-amino-acil-csoport, egy (1-24 szénatomos alkil)-oxi-acil-csoport, egy (1-24 szénatomos alkil)-amino-acil-csoport, egy (1-24 szénatomos alkil)-tio-acil-csoport, és
HU 219 810 Β ahol Z jelentése egy (1-24 szénatomos alkil)-oxi-csoport, egy (1-24 szénatomos acil)-oxi-csoport, 3-dezoxi-D-manno-2-oktuloszonsav (rövidítve: KDO), (KDO)n, ahol n=l-10, egy poliszacharidoldallánc, így egy természetes lipopoliszacharidból származó oldallánc;
egy magkomponens, így egy természetes lipopoliszacharidból származó komponens; és egy amino-(l-8 szénatomos alkil)-karboxil-csoport, valamint mindezek sói.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok az úgynevezett limulus amoebocyte lysate (LAL) vizsgálati módszer szerint lényegesen alacsonyabb endotoxicitással rendelkeznek, mint például az E. coli, lipid A és módosított lipid A, amelyet az A-4 912 094 amerikai egyesült államokbeli találmányi bejelentésben írnak le, lipopoliszacharidok (LPS). A találmány szerinti glükózamin-diszacharidok továbbá nitrogén-oxid reaktív intermedierek és citokinek, így interleukin 1-alfa (IL—1alfa), IL-6, az úgynevezett tumomekrózis-faktor (TNF) és prosztaglandin (PGE) indukcióját is okozzák.
Mindezentúl a találmány szerinti diszacharidok tumorellenes hatással is rendelkeznek, igy például peritoneális karcinómatózisban fejtenek ki ilyen hatást.
E diszacharidok akut toxicitása ugyanakkor rendkívül csekély. Egy svájci egereken (Swiss mice) végzett vizsgálat során, amikor is 100 mg/testtömegkilogramm intravénás dózisban alkalmaztuk a diszacharidot, pusztulás nem volt megfigyelhető.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás e glükóz-amin-diszacharidok előállítására biológiai eredetű, vagyis mikroorganizmusokból, így például Gram-negatív baktériumokból származó poliszacharidok lipid A egységét tartalmazó bármilyen kiindulási anyagból. A találmány értelmében olyan módon járunk el, hogy a kiindulási anyagot lúgos kezelésnek alávetve a cukor O-kapcsolt acil- és/vagy O-kapcsolt oxi-acil-csoportokat eltávolítjuk. Adott esetben a lúgosán kezelt kiindulási anyagot további kezeléseknek is alávethetjük, a poliszacharid- és magkomponens (savas kezeléssel) eltávolítására, valamint az 1-, 2-, 3-, 4-, 2’-, 3’-, 4’- és 6’helyzetekben lévő szubsztituensek változtatására vagy kicserélésére.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok olyan módon is előállithatók, hogy a megfelelő glükózamin-diszacharidból indulunk ki és szintetikusan viszszük be a kívánt szubsztituenseket a 2- és/vagy 2’-helyzetekbe.
A találmány szerinti diszacharidok annak köszönhetően, hogy a fentiekben ismertetett biológiai hatás és rendkívül alacsony endotoxicitás kombinációját valósítják meg, gyógyszerkészítmények hatóanyagaként jönnek számításba. E gyógyszerkészítmények és önmagukban a diszacharidok immunmoduláló szerként, tumorellenes hatású szerként és vakcinában annak komponenseként alkalmazhatók.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok, amelyek β(1—>6) D-glükóz-amin-dimerek, jellemző módon az egyes glükóz-amin-egységekben a 3- és 3’helyzetekben egy hidroxilcsoportot vagy egy rövid Okapcsolt alkil- vagy acilcsoportot tartalmaznak, amelyek lényegesen nem befolyásolják az endotoxicitást és/vagy biológiai hatást, valamint legalább egy lekapcsolt elágazó acilcsoportot tartalmaznak a 2- vagy 2’-helyzetben vagy mind a 2- és 2’-helyzetekben. A még megmaradó 2’- vagy 2-helyzet N-acilezett. Feltételezhetően a 2- és 2’-helyzetekben jelen lévő két hidrofób lánc, amelyek közül legalább az egyik egy elágazó acilcsoport, eredményezi a rendkívül alacsony endotoxicitás és egyidejű biológiai aktivitás kombinációját egy diszacharidmolekulában.
Elágazó acilcsoportként, amelyet Y csoporttal jelölünk, acil-oxi-acil-csoport, acil-amino-acil-csoport, acil-tio-acil-csoport, (1-24 szénatomos alkil)-oxi-acilcsoport, (1-24 szénatomos alkil)-amino-acil-csoport és (1-24 szénatomos alkil)-tio-acil-csoport jöhet számításba.
Az acil-oxi-acil-csoportban a két acilcsoport oxigénatomon keresztül kapcsolódik, az acil-amino-acil-csoportban NH-csoporton keresztül, míg az acil-tio-acilcsoportban a kapcsolódás kénatomon keresztül történik. A többi Y csoport esetében, így az (1-24 szénatomos alkil)-oxi-acil-csoport, az (1-24 szénatomos alkil)-amino-acil-csoport és az (1-24 szénatomos alkil)tio-acil-csoport a megfelelő hidroxi-zsírsavból kiindulva alakítható ki.
Az Y csoport előnyösen egy, a 3-helyzetben elágazó N-kapcsolt acilcsoportot jelent, így például 3-acil-oxiacil-csoportot, egy 3-acil-amino-acil-csoportot és egy 3-acil-tio-acil-csoportot. Ugyanez érvényes a fent említett 1 -24 szénatomos alkilekvivalensek esetében is.
Az Y csoport előnyösen egy vagy két acilcsoportot, előnyösen zsírsavcsoportokat, hidroxi-zsírsav-csoportokat és oxi-zsírsav-csoportokat tartalmaz. Abban az esetben, amikor az acil-oxi-acil-csoport előnyösen egy 3acil-oxi-acil-csoport, úgy acilcsoportként 3-hidroxizsírsav-csoportok vagy az észterkapcsolt csoport esetében 3-oxo-zsírsav-csoport jön számításba. Acil-oxiacil-csoportok például lehetnek 3-hidroxi-(4-24 szénatomos zsírsav)-acil-csoportok, amelyek a 3-hidroxihelyzetben egy 1-24 szénatomos karbonsavval észtert képezhetnek. Az acil-oxi-acil-csoport előnyösen egy 3hidroxi-(8-18 szénatomos zsírsav)-acil-csoport lehet, amely a 3-hidroxi-helyzetben egy 10-18 szénatomos zsírsavval észtercsoportot képez. Ilyen típusú acil-oxiacil-csoportok találhatók a Gram-negatív baktériumok, például az Escherichia coli, Haemophilus influenzáé, Campylobacter jejuni, Rhodocyclus gelatinosus, Chromobacterium violaceum, Neisseria meningitidis, Salmonella minnesota lipid A komponensében.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok egyik előnyös körét képezik azok a vegyületek, ahol az acil-oxi-acil-csoport egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos zsírsav)-acil-csoport, amely a 3-hidroxi-helyzetben egy 12 szénatomos zsírsavval észterezett, és ez az acil-oxi-acil-csoport a 2’-helyzethez kapcsolódik.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok egy másik előnyös körében az acil-oxi-acil-csoport egy
HU 219 810 Β
N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos zsírsav)-acil-csoport, amely a 3-hidroxi-helyzetben egy 14 szénatomos zsírsavval észterezett, és ahhoz az acil-oxi-acil-csoport előnyösen a 2’-helyzethez kapcsolódik.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok előnyös körét képezik azok a vegyületek is, amelyekben az acil-oxi-acil-csoport egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos zsírsav)-acil-csoport, amelyben a 3-hidroxi-csoport észterezve van a 12 szénatomos zsírsavval, ahol az acil-oxi-acil-csoport a 2-helyzethez kapcsolódik. A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok előnyös körét képezik azok a vegyületek is, ahol az acil-oxi-acil-csoport egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos zsírsav)acil-csoport, amelyben a 3-hidroxi-helyzet észterezett a 12 szénatomos zsírsavval, ahol az acil-oxi-acil-csoport mind a 2-, mind a 2'-helyzetekben jelen van.
Abban az esetben, ha az Y csoport egy királis centrumot tartalmaz, úgy a találmány az összes R- és Senantiomerekre, valamint bármilyen racém keverékre kiterjed.
A másik N-kapcsolt szubsztituens egy acilcsoport vagy egy másik acil-oxi-acil-csoport lehet. A találmány szerinti diszacharidok egy másik csoportját képezik azok a vegyületek, ahol az acilcsoport egy 3-hidroxi(4-24 szénatomos zsírsav)-rész, előnyösen egy 3-hidroxi-(10-18 szénatomos zsírsav)-csoport. Előnyösek azok a találmány szerinti diszacharidok, amelyekben az acilcsoport egy 3-hidroxi-(14 szénatomos zsírsav)csoportot jelent, amely a 2- vagy a 2'-helyzethez kapcsolódik.
Ezentúl N-kapcsolt szubsztituensként számításba jöhet egy fentiekben definiált acil-oxi-acil-csoport is, így egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(4-24 szénatomos zsírsav)acil-csoport, amely a 3-hidroxi-helyzetben a 1 -20 szénatomos karbonsavval észterezett, előnyösen egy Nkapcsolt 3-hidroxi-(8-18 szénatomos zsírsav)-acil-csoport, amely a 3-hidroxi-helyzetben a 10-18 szénatomos zsírsavval van észterezve. Különösen előnyösek azok a diszacharidok, amelyek képletében R2 jelentése egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos zsírsav)-acilcsoport, amely a 3-hidroxi-helyzetben egy 12 szénatomos zsírsavval vagy 16 szénatomos zsírsavval van észterezve, és ahol R2· jelentése egy N-kapcsolt R-hidroxi(14 szénatomos zsírsav)-acil-csoport, amely a 3-hidroxi-helyzetben a 12 szénatomos zsírsavval vagy 14 szénatomos zsírsavval észterezett.
Megjegyezzük, hogy az Y csoportban az acilcsoportok és/vagy acil- és alkilcsoportok egymással is összekapcsolódhatnak.
A fentiekben „zsírsavcsoport” kifejezés alatt az alábbi csoportokat értjük: 2-30 szénatomos atomból álló lényegében hidrofób lánc, amely lehet egyenes vagy elágazó, telített, egyszeresen vagy többszörösen telítetlen, egy vagy több heteroatomot, például nitrogénatomot, oxigénatomot vagy kénatomot a láncban tartalmazó csoport, amely adott esetben egy vagy több szubsztituenssel, például hidroxilcsoporttal, oxocsoporttal, acil-oxi-csoporttal, alkoxicsoporttal, aminocsoporttal, nitrocsoporttal, ciáncsoporttal, halogénatommal, szulfhidrilcsoporttal helyettesítve lehet, feltéve, hogy a biológiai hatás számottevően kedvezőtlenül nem változik. Helyettesített zsírsavcsoportra példaként említjük (amelyek amidkapcsolt szubsztituenst tartalmaznak), az irodalomban ismertetett csoportokat [Onozuka, K. és munkatársai, Int. J. Immunopharmac, 15, 657-664, (1993)].
Az Rj csoport jelentése lehet egy (1-5 szénatomos acil)-oxi-csoport vagy egy (1-5 szénatomos alkil)-oxicsoport, míg az R/ csoport jelentése lehet egy (1-5 szénatomos acil)-csoport vagy egy (1-5 szénatomos alkil)-csoport, feltéve, hogy a glükóz-amin-diszacharidok tulajdonságait hátrányosan nem befolyásolják. Az Rj csoport jelenthet továbbá egy hidroxilcsoportot, míg R4 jelenthet hidrogénatomot. Előnyösen az Rj és R4’ csoportok mindegyike jelenthet egy foszforatomot tartalmazó csoportot. Egy ilyen csoport különösen az 1vagy 4’-helyzetben befolyásolhatja a biológiai hatást, például a citokinek különböző mértékű stimulálását [Takada, H. és Kotani, S., Bacterial Endotoxid Lipopolisaccharides, Morrison, D. C. és Ryan, J., CRC Press, 1, 107-134, (1992)]. A találmány szerinti diszacharidok előnyösen egy dihidroxi-foszfonoil-oxi-csoportot tartalmaznak az 1-helyzetben, míg a 4-helyzetben egy foszfonocsoportot, ahol az 1-helyzetben a csoport konfigurációja a.
Az Rj csoport jelenthet egy X csoportot is. Az X csoport általában negatív töltéssel rendelkezik fiziológiás pH mellett. Az X csoport jelenthet egy karboxi(1-5 szénatomos alkil)-oxi-csoportot, továbbá egy O-CH-[(CH2)mCOOH][CH2)nCOOH] képletű dikarbonsavcsoportot, ahol m=0-10 és n=0-10, úgymint m és n=0, m és n=l; és m=l és n=3. Az 1-helyzetben dikarbonsavcsoportot tartalmazó származékot, ahol m és n egyaránt egyet jelent, leírták Onozuka és munkatársai (1993). Az X csoport dikarbonsavcsoporton kívül jelenthet egy foszfono-(l-5 szénatomos alkil)-csoportot is, például egy foszfono-metil-csoportot vagy egy foszfono-etil-csoportot.
Az X csoport jelentése lehet szulfátcsoport vagy egy hidroxi-szulfonil-(l -5 szénatomos alkil)-csoport is, például hidroxi-szulfonil-metil-csoport. Az R és R3’ jelenthetnek egy rövid alkil- vagy acilcsoportot, amelyek a találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok endotoxicitását és/vagy biológiai hatását kedvezőtlenül nem befolyásolják. Példaként nevezzük meg az (1-3 szénatomos alkil)-csoportokat és az (1-3 szénatomos acil)-csoportokat. Előnyösen az R3 és R3’ csoportok mindegyike hidrogénatomot jelent, vagyis ez esetekben a 3- és a 3’helyzetek nem tartalmaznak acilcsoportot.
Az R4 csoport a 4-helyzetben jelenthet egy (1-3 szénatomos alkil)-csoportot vagy egy (1-3 szénatomos acil)-csoportot, amelyeket a fentiekben definiáltunk. A 4-O-acilezett diszacharidok az irodalomban leírt módszerrel állíthatók elő (Kusumoto S. és munkatársai, ÁCS Sympoium Series, 231, 237-254, (1983)]. Előnyösen azonban a 4-helyzetben egy hidroxilcsoport van jelen, azaz az R4 csoport hidrogénatomot jelent.
Az Rg’ csoport jelentése lehet hidrogénatom, hidroxilcsoport, egy dihidroxi-foszfonoil-oxi-csoport, dihidroxi-szulfonil-oxi-csoport, valamint ezek töltéssel bíró formái.
HU 219 810 Β
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok vízoldhatóságának javítása érdekében, a 6’-szubsztituens a Z csoport révén jelentős hidrofílitással rendelkezhet. így a Z csoport jelentése lehet 3-dezoxi-D-manno-2-oktuloszonsav (KDO) vagy több KDO-molekula úgy, ahogyan az a lipid A komponenshez közvetlenül kapcsolódó természetes poliszacharidok belső magjában van.
A Z csoport jelenthet egy teljes vagy részleges poliszacharidláncot, például egy természetes lipopoliszacharidból származó oldalláncot vagy egy természetes lipopoliszacharidból származó magkomponenst.
A Z csoport jelentése lehet továbbá egy amino(1-8 szénatomos alkil)-karboxil-csoport is.
A találmány szerinti diszacharidok vízoldhatóságát egyrészt egy töltéssel bíró csoport jelenléte, a 6’helyzetben lévő szubsztituens hidrofil sajátságai határozzák meg. Másrészt a vízoldhatóság javítható annak a révén is, ha a glükóz-amin-diszacharid valamilyen só formájában, például egy vagy több alkálifém-kationnal és/vagy ammóniumionnal dihidroxi-foszfonoil-oxi-csoportok, karboxilátcsoportok, foszfonocsoportok, hidroxi-szulfonil-oxi-csoportok és hidroxi-szulfonil-alkilcsoportok révén képzett sóként van jelen.
A fentiekben az alkil- és acilcsoport, lánc vagy rész egyenes, elágazó, telített, egyszeresen vagy többszörösen telítetlen, egy vagy több heteroatomot, például nitrogénatomot, oxigénatomot, kénatomot beékelve tartalmazó, adott esetben egy vagy több szubsztituenssel, például hidroxilcsoporttal, oxocsoporttal, acil-oxi-csoporttal, alkoxicsoporttal, aminocsoporttal, nitrocsoporttal, cianocsoporttal, halogénatommal, szulfhidrilcsoporttal helyettesített lehet, amennyiben a biológiai aktivitás lényegesen hátrányosan nem változik.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidokat mikroorganizmusokban, például Gram-negatív baktériumokban jelen lévő lipopoliszacharidok lipid A részt tartalmazó kiindulási anyagból állíthatók elő. E lipopoliszacharidok például a mikroorganizmusok felszíni szerkezetében vannak jelen és az abból származó lipopoliszacharidokban. A kiindulásianyag-forrásként előnyösen alkalmazott Gram-negatív baktériumok az Escherichia coli és a Haemophilus influenzáé. Mindazonáltal a kereskedelemben beszerezhető LPS vagy lipid A is alkalmasak kiindulási anyagként.
A 3-helyzetben és a 3’-helyzetben a szelektív dezacilezést lúgos kezeléssel végezzük. E reakciókörülményeket aszerint választjuk meg, hogy mindkét glükózamin 3-hidroxi-helyzetében végbemenjen a dezacetilezés. A lúgos kezelést végezhetjük hidroxidok, karbonátok és foszfátok alkalmazásával, például használhatunk nátrium-hidroxidot vagy kálium-karbonátot. Szerves bázisként például alkil-aminokat, így például dietilamint és trietil-amint használhatunk. A lúgos kezelést általában vizes vagy szerves közegben végezzük. A reakció pH-ja általában 10 és 14 között, így például 11 és 13 között lehet, a gyakorlatban a pH például 12,2. A reakciót általában szobahőmérséklet és 70 °C közötti hőmérsékleten, például 37 °C-on végezzük. A reakcióidő függ a kiindulási anyag típusától. Mikroorganizmusból származó kiindulási anyag esetén általában 1 óra és nap között változhat, például 8 óra és 5 nap közötti lehet, szokásosan 8 és 40 óra közötti. Amennyiben lipopoliszacharidokból vagy lipid A-ból indulunk ki, úgy a reakcióidő 0,2 és 10 óra közötti, például 1 és 5 óra közötti lehet. Rendszerint a reakcióidő másfél és 3 óra között van.
Abban az esetben, ha a kiindulási anyag a 6’helyzetben egy eltávolítandó magkomponenst tartalmaz, úgy a kiindulási anyagot savas kezelésnek vetjük alá a magkomponens eltávolítására. A savas kezelést végezhetjük a fent említett lúgos kezelés előtt vagy után. A savas kezelést 1 és 5 közötti pH-értéken, előnyösen 2,5 és
4,5 közötti, általában 3-nál nagyobb és 4,5-nél alacsonyabb pH-értéken, így 3,5 pH-értéken hajtjuk végre. Az 1-nél alacsonyabb pH-értékeknél a glükóz-amin-diszacharid defoszforileződése is végbemegy, amikor is a monofoszforilezett származék képződik. A reakcióban savként alkalmazhatók ásványi és szerves savak, például hidrogén-klorid és jégecet. A savas kezelés esetében a reakcióidő mintegy 30 perc és 5 óra közötti, például 1-2 óra lehet. A savas kezelést mintegy 70 és 100 °C közötti, így 80 és 100 °C közötti hőmérsékleten, a gyakorlatban 95 °C-on végezzük. A reakció végén a hőmérsékletet szobahőmérsékletre csökkentjük.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok a megfelelő de-, mono- vagy difoszforilezett glükóz-amin dimerekből is előállíthatok, olyan módon, hogy egy aciloxi-acil-csoportot, acil-amino-acil-csoportot és/vagy egy acil-tio-acil-csoportot kapcsolunk mind a 2-, mind a 2’helyzetekhez.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok részleges dezacilezésével és a termékek elkülönítésével azok a találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok nyerhetők, amelyek a 2-helyzetben vagy a 2'-helyzetben elágazó acilcsoportot tartalmaznak.
A találmány szerinti glükóz-amin-diszacharidok gyógyszerkészítményekben vagy gyógyszerként alkalmazhatók és alkalmasak mint immunmoduláló szerek nitrogén-oxid reaktív intermedierek és citokinek termelésének gátlására, stimulálására vagy velük szembeni tolerancia kifejlesztésére az adagolás gyakoriságának és dózisának a függvényében, mint tumorellenes szerek, mint például T-sejt-reaktivátorok, mint vakcinakomponensek, mint endotoxinkötő hely kompetitív szerei és mint interleukinek modulátorai. Minthogy a találmány szerinti diszacharidok rendkívül csekély endotoxicitást fejtenek ki, teljesen vagy csaknem teljesen mentesek mellékhatásoktól.
A találmány szerinti diszacharidokat adagolhatjuk szisztémásán vagy lokálisan (helyileg), intravénás injekció, szubkután injekció, intraperitoneális injekció, intramuszkuláris injekció vagy ehhez hasonló formában. Az alkalmazott dózis függ a kezelt állattól vagy személytől, kortól, testtömegtől, a kezelendő tünetektől vagy betegségtípustól, a kívánt terápiás hatástól, az adagolási módtól, a kezelési időtől és ezekhez hasonló tényezőktől. Kielégítő hatás érhető el 0,001 és 500 mg/testtömegkilogramm közötti dózis egy vagy több napi dózisként való adagolásával vagy lassú felszabadulást biztosító forma alkalmazásával.
HU 219 810 Β
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények adott esetben gyögyászatilag elfogadható vivő- vagy hígítóanyagokat is tartalmazhatnak, például vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók és emulziók nem orális adagolásra szánt készítmények esetében. A vizes oldatok vagy szuszpenziók tartalmazhatnak desztillált vizet vagy fiziológiás sóoldatot. A nemvizes oldatok propilénglikolt, polietilénglikolt, növényi olajokat, például olívaolajat, alkoholokat tartalmazhatnak. A gyógyszerkészítmények adott esetben további segédanyagokat, így például tartósítószereket, nedvesítőszereket, emulgeáló- és diszpergálószereket, valamint ezekhez hasonló anyagokat tartalmazhatnak.
A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül.
1. példa
1-1147 Escherichia coli törzset (amelyet 1-1147 jelzéssel a CNCM gyűjteményben 1991. október 3-án deponáltak) az 1. táblázatban ismertetett táptalajon tenyésztettünk.
1. táblázat
E. coli Ι-1147-tenyésztés táptalaj-összetétele (vizes oldatban)
Komponens | Tömeg/1 |
Inozin | 0,200 g |
C itromsav-monohidrát | 0,300 g |
Glutaminsav | 1,300 g |
Ammónium-klorid | 1,050 g |
Magnézium-szulfát 7H2O | l,110g |
Kálium-dihidrogén-foszfát (KH2PO4) | 1,360 g |
Arginin | 0,300 g |
Uracil | 0,100 g |
Kalcium-klorid | 0,017 g |
Nátrium-klorid | 2,000 g |
Többkomponensű fémionoldat (1000 χ töménységű törzsoldat) | Imi |
L-leucin | 10,0 g |
L-lizin-HCl | 10,0 g |
L-szerin | 10,0 g |
L-metionin | 10,0 g |
L-valin | 10,0 g |
L-alanin | 10,0 g |
L-aszparagin | 10,0 g |
Glükóz (500 g/1 törzsoldat) | 5 ml |
A többkomponensű fémiontörzsoldat összetétele:
2,5 g FeCl2.4 H2O, 0,25 g CoC12.6 H2O, 0,25 g NaMoO4.7 H2O, 0,25 g MnSO4.4 H2O, 0,25 g ZnSO4.7 H2O, 0,25 g NiSO4.7 H2O, 0,05 g H3BO4, 0,05 g CuSO4, ehhez 1,0 1 vizet adunk, összekeverjük és hozzáadunk 1,1 ml H2SO4-et (85%).
A táptalaj pH-ját 5 n nátrium-hidroxid-, 5% ammónia- vagy 25% sósavoldattal állítottuk be. Az Escherichia coli 1-1147 törzset 37 °C-on és pH=6,9 értéken levegőztetés és keverés mellett tenyésztettük.
A tenyésztés után a fermentort hőkezeléssel (105 °C hőmérsékleten 2 percen át) inaktiváltuk.
A fermentor inaktivált tartalmát ultraszűrésnek vetettük alá (küszöbérték: 1000 kD), majd a visszamaradó baktériumokat vizes 0,6%-os nátrium-klorid-oldattal mostuk. A megmosott baktériumszuszpenziót ultraszűréssel betöményítettük. így 764 g száraz biomasszát nyertünk.
A biomasszát 7,0 g/1 koncentrációra hígítottuk, majd 345 ml 10,77 n nátrium-hidroxid-oldattal kezeltük és 40 órán át 37 °C-on inkubáltuk (pH=12,2).
A lúgos extraktumot ezután ultraszűrésnek vetettük alá (küszöbérték: 1000 kD), majd a szűrletet ismét ultraszűréssel szűrtük (10 kD). A második ultraszűrés után visszamaradó részt savval kezeltük.
Az így visszamaradó részt ezután 7,0 liter vízzel hígítottuk, majd 370 ml jégecettel megsavanyítottuk (a végső pH=3,52). Az elegyet 120 perc alatt 95 °C-ra hevítettük keverés közben, majd a savas szuszpenziót 25 °C-ra hűtöttük, és a kivált anyagot centrifugálással (4000xg, 50 percen át) elkülönítettük. A nyert szemcsés-iszapos maradékot 3,7 liter vízben felszuszpendáltuk és 4,3 liter 2-propanollal extraháltuk, majd 25 °C-on 60 percen át tartottuk. Végül 252 ml trietil-amint adtunk hozzá (pH=9,0) és a keverést 24 órán át folytattuk.
A felülúszót centrifugálással (4000 χ g, 50 percen át 25 °C-on) elkülönítettük és az iszapot 90%-os 2-propanollal kétszer ismételten extraháltuk. A felülúszókat egyesítettük és fordított fázisú kromatográfiának (Waters No. 10001, preparatív Clg, 125 · 108 cm) vetettük alá.
Egy másik megoldás szerint olyan módon járhatunk el, hogy a savval kezelt extraktumot ultraszűrésnek vetjük alá és a visszamaradó részt (> 1000 kD) betöményítjük, majd ötszörös térfogatú vízzel szemben dializáljuk. A dializált visszamaradó részt kilencszeres térfogatú 2propanollal hígítjuk, és a pH-t trietil-aminnal pH=9-re állítjuk. Az extrakciót keverés közben 2 óra alatt hajtjuk végre.
A felülúszót a fentiekben ismertetett módon elkülönítjük, és a kivált anyagot 2-propanollal ismét extraháljuk. A felülúszókat egyesítjük, majd vákuumban (40 °C, 12 Torr) betöményítjük, végül a kapott maradékot fordított fázisú kromatográfiának vetjük alá (Cl8 Prep Sep Pák, Waters No. 10001).
A két felülúszó mindegyikét kétszeres térfogatú vízzel hígítjuk, majd 5 mmol/1 tetrabutil-ammónium-foszfát (rövidítve: TBAP-) oldattal összekeverjük, és ezt követően fordított fázisú oszlopon kromatografáljuk [50 g C18 Prep Sep Pák, (Waters No. 10001, preparatív C18, 125-10~8 cm)], a töltetet előzetesen 250 ml CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP elegyekkel kezeljük. Az oszlopot 60% CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP és 40% 2-propanol:H2O 9:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP elegyekkel mossuk. A találmány szerinti diszacharidok a
HU 219 810 Β
30% CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP és 70% 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP összetételű eleggyel eluálódnak.
A fordított fázisú kromatográfiával nyert diszacharidfrakciót víz 1:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP eleggyel hígítottuk és preparatív nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiának (nemzetközi rövidítése: HPLC) vetettük alá (Millipore-Waters Bondapak C18 300·ΙΟ-8 cm, 15 mol/1, oszlopméret: 300 mmx47 mm). A találmány szerinti diszacharidfrakciót a 67% 2-propanol :H2O 9:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP és 33% CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP összetételű eluálószerrel nyertük. E frakció 55 mg találmány szerinti diszacharid A vegyületet tartalmazott.
A diszacharid sómentesítése
A diszacharid A frakció egy aliquot részéből a sót az alábbi módon távolítottuk el. Egy Sep Pák Vác C18 Plus oszlopot (szilikagél C18 0,6 ml, Waters No. 20515) egymást követően 5 ml CHC13-CH3OH 2:1 (térfogat szerinti) 5 ml CH3CN és 5 ml CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint) elegyekkel kondicionáltunk. A kromatografálandó mintát a HPLC-frakcióból háromszoros térfogatú vízzel állítottuk elő úgy, hogy annak teljes térfogata a hígítás után 6 ml-nek adódott. A TBAP eluálószert ezután 10 ml CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+10 ml mmol/1 HC1 eleggyel, majd 10 ml CH3CN-nel végzett kezeléssel távolítottuk el. A tiszta diszacharid A komponenst 5 ml CHC13-CH3OH 2:1 (térfogat szerint) eleggyel különítettük el.
A frakciót vákuumban (12 Torr) 35 °C-on végzett bepárlással szárítottuk. A sómentes diszacharid A komponenst H2O:TEA 1000:1 (térfogat szerint) oldottuk fel a biológiai és biokémiai vizsgálatokhoz, illetve CHC13: CH3OH 2:1 (térfogat szerint) elegyben a FAB-MS vizsgálathoz.
A nátriumsó forma előállítása
Egy 10 g fordított fázisú töltetet (C,8 Prep Sep Pák, Waters No. 10001, preparatív C18,125 · 10~8 cm) tartalmazó oszlopot egymás után 50 ml CH3CN és 50 ml CH3CN: H2O 1:1 (térfogat szerint) eluálószerekkel előkondicionáltunk.
A kromatografálandó mintát (HPLC-frakció) egyszeres vízzel végzett hígítás után vittük fel az oszlopra. Az adszorpció után az oszlopot 100 ml CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP eluálószerrel mostuk. A diszacharidot 50 ml 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 PBAP eluálószerrel mostuk le.
A kapott frakciót az alábbiak szerint tisztítottuk. Egy 20 ml gyorsan mozgó Q-Sepharose-töltetet (Pharmacia 17-0510-01) tartalmazó oszlopot egymás után 30 ml 1 mol/1 nátrium-hidroxid-oldattal, melyet vizes semlegesre mosás követ, és 30 ml 1 mol/1 sósavoldattal, melyet vizes semlegesre mosás követ, kondicionáltunk. A mintát közvetlenül az oszlopra vittük fel. Az adszorpció után a nem adszorbeált anyagot 200 ml H2O és 100 ml 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint) elegygyel távolítottuk el. A diszacharidot 100 ml 0,9% nátrium-klorid :izopropanol 1:1 (térfogat szerint) eleggyel eluáltuk.
A végső tisztítást az alábbiak szerint végeztük.
Egy 10 g fordított fázisú C!8 Prep Sep Pák töltetet tartalmazó oszlopot egymás után 50 ml CH3CN, 50 ml CHC13-CH3OH 2:1 (térfogat szerint), 50 ml CH3CN és 50 ml 50% CH3CN: H2O 1:1 (térfogat szerint) elegyekkel prekondicionáltunk. A mintát egyszeres térfogatú vízzel végzett hígítás után vittük fel az oszlopra. Az adszorpció után az oszlopot egymás után 200 ml H2O, 200 ml 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint) és 50 ml CH3CN eluálószerekkel mostuk. A diszacharidot 50 ml CHC13-CH3OH 2:1 (térfogat szerint) eleggyel eluáltuk. A frakciót vákuumban (12 Torr) 35 °C hőmérsékleten végzett bepárlással szárítottuk.
A nátriumsó vízben (100 mg/ml koncentrációig) tisztán oldható.
2. példa
Haemophilus influenzáé törzset [a Nemzeti Törzsgyűjteményből (ATCC 9795) szereztük be] a 2. táblázatban megadott táptalajon tenyésztettünk.
2. táblázat
Haemophilus influenzáé tenyészethez használt főtáptalaj összetétele
Komponens | Tömeg/1 |
Nátrium-klorid | 2g |
Nátrium-monohidrogén-foszfát | 2g |
Nátrium-acetát | 0,5 g |
Aneurin | 0,0003 g |
Nikotinsav | 0,0003 g |
70% nátrium-laktát-oldat | 2 ml |
60% ammónium-laktát-oldat | 2 ml |
Húsextraktum | 7,5 g |
Pepton | 15 g |
Szójapepton | lg |
Tripton | 3g |
Élesztőextraktum | 7,5 g |
Glükóz | 3g |
A táptalajhoz 10 mg/1 koncentrációban hemint és 4 mg/1 koncentrációban NADH-t adtunk. A pH-t 5 n nátrium-hidroxiddal vagy 25% sósavval állítottuk pH=7,0±0,3 értékre. A stacionárius fázis kialakulásának kezdetekor a tenyésztést megszakítottuk és a fermentor tartalmát hőkezeléssel (100 °C-on 100 másodpercen át) inaktiváltuk. Az inaktivált tenyészetet centrifugáltuk és az elkülönített biomasszát 0,6% vizes nátriumklorid-oldattal hígítottuk (közelítően 60 g/1 koncentrációig). Ezután lúgos kezelést végeztünk 10 n nátriumhidroxiddal úgy, hogy 0,2 n nátrium-hidroxid-végkoncentrációhoz jutottunk. A kezelést 5 napon át 37 °C hőmérsékleten folyamatos keverés közben végeztük.
Közvetlenül a lúgosán kezelt lizátumot vetettük alá savas kezelésnek, a pH-t 3,5-re állítva jégecettel. Az elegyet 120 percen át 95 °C-ra hevítettük, majd ezután
HU 219 810 Β szobahőmérsékletre hűtöttük. A kivált anyagot centrifugáltuk (10 OOOxg, 30 percen át 4 °C-on) s a felülúszót elöntöttük.
A csapadékos részt CH3CN: H2O 1:1 (térfogat szerint) elegyben felszuszpendáltuk és trietil-aminnal a pH-t 9-re állítottuk. Centrifugálás (15 OOOxg, 10 percen át) után a felülúszót 5 mmol/1 TBAP-re állítottuk be. Ezt követően a felülúszót Sep Pák Vak C18-töltetű oszlopon [50 ml CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint) eleggyel kondicionált 10 g C18 szilikagél, 35 ml, Waters No. 43345] kromatografáltuk. A találmány szerinti diszacharid B komponenst tartalmazó frakciót 50 ml 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP eleggyel eluáltuk. Ezután centrifugáltuk (15 OOOxg, 5 percen át) és a felülúszót egy szemipreparatív HPLC-C18-töltetű oszlopra (Macherey-Nagel No. 715806, 250 mmxlO mm, Nucleosil 300-708) vittük föl. A találmány szerinti diszacharid B komponenst tartalmazó frakció 28% CH3CN: H2O 1:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP és 72% 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP összetételű frakcióból nyertük. A diszacharid B komponens sómentesítését az 1. példában ismertetett módszerhez hasonló módon végeztük.
3. példa
Escherichia coli 0111 :B4 lipopoliszacharidot (Sigma, L3024 számú termék) 0,2 mól nátrium-hidroxiddal 37 °C-on másfél órán át lúgos kezelésnek vetettünk alá. Az oldatot ezután 1 mol/1 foszforsavval semlegesítettük.
A lúgosán kezelt LPS-oldat 400 pl-ét ultraszűréssel (Millipore Ultrafree-MC, UFC3 LGC 00, küszöbérték 10 kD) betöményítettük.
A visszamaradó részt (>10 kD) 400 μΐ vízzel hígítottuk és jégecettel végzett savas kezeléssel 0,2 mol/1 ecetsavkoncentrációt állítottunk be. A megsavanyított oldatot 120 percen át 95 °C-ra hevítettük. Ezután 25 °C-ra hűtöttük és a kivált anyagot centrifugálással (15 OOOxg, 10 percen át) ülepítettük, majd a felülúszót elöntöttük. A levált anyagot 20 μΐ H2O:TEA 1000:1 (térfogat szerint) elegyben feloldottuk és az oldatot analitikai HPLC-C18-oszlopra (Supelco 58985, Supelcosil LC-18, 3 pm, 150 mm χ 4,6 mm) vittük fel. A találmány szerinti diszacharidfrakciót 42% CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP és 58% 2-propanol :H2O 9:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP összetételű elegyet tartalmazó frakcióban nyertük.
4. példa
Escherichia coli F-583 lipid A komponens (Sigma, L5399 számú tennék) 2 mg/ml koncentrációjú H2O:TEA 1000:1 (térfogat szerint) elegyben készített oldatát 0,2 mol/1 nátrium-hidroxiddal 37 °C-on
2,5 órán át lúgos kezelésnek vetettük alá. Az oldatot ezután 1 mol/1 foszforsavval semlegesítettük.
A semlegesített oldatot analitikai HPLC-oszlopra (Supelco 58985, Supelcosil LC-18, 3 pm, 150 mmx x4,6 mm) vittük fel. A találmány szerinti diszacharidot 42% CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1
TBAP és 58% 2-propanol:H2O 9:1 (térfogat szerint)+ +5 mmol/1 TBAP eleggyel eluáltuk.
5. példa
2-Amino-2-dezoxi-6-O-(2-amino-2-dezoxi-4-O-foszfono-P-D-glükopiranozil)-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát [Holst és munkatársai, Eur. J. Biochem. 214, (1993) 695-701] metanolban nátrium-metoxiddal (pontosan 4,0 ekvimolárist alkalmaztunk) kezeltünk, majd (R)-3-(dodekanoil-oxi-tetradekánsavanhidridet (2,2 mólekvivalens) adtunk hozzá [e reagenst (R)-3dodekanoil-oxi-tetradekánsavból 0,5 mólekvivalens DCC-vel vízmentes diklór-metánban állítjuk elő; lásd Charon és munkatársai, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1984) 2291-2295]. Ezután 12 órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd a metanol térfogatára vonatkoztatottan kétszeres térfogatú vizet adtunk hozzá, és az elegyet dietil-éterrel extraháltuk a 3-dodekanoil-oxitetradekánsav eltávolítása céljából. A vizes fázist betöményítettük és a találmány szerinti nyersdiszacharid C komponenst fordított fázisú HPLC-tisztításnak vetettük alá. A terméket H2O:TEA 1000:1 (térfogat szerint) elegyben feloldottuk és 5 mmol/1 koncentráció eléréséig tetrabutil-ammónium-foszfátot (rövidítve: TBAP) adtunk hozzá. A kapott oldatot ezután preparatív HPLC-oszlopra (Millipore-Waters Bondapak C18 300·10~8 cm, 15 mol/1, 300 mmx47 mm) vittük föl. A diszacharid C komponenst gradienselúcióval nyertük. Eluálószerként CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP (A oldószerelegy) és 2-propanol:H2O 9:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP (B oldószerelegy) elegyeket alkalmaztunk úgy, hogy 50% A/50% B összetételről az összetételt 0% A: 100% B értékig 1%/perc gradiens és 80 ml/perc áramlási sebesség mellett változtattuk. A sómentesítést a következőképpen végeztük. A diszacharid C komponenst tartalmazó HPLC-frakciót vízzel hígítottuk, majd egy C18-Sep Pák Vác Plus oszlopra (Waters) vittük fel. A C18-fordított fázisú szilikagél-töltetű oszlopot ez esetben egymás után CHC13:CH3OH 2:1 (térfogat szerint), CH3CN, CH3CN: H2O 1:1 (térfogat szerint) elegyekkel prekondicionáltuk. A TBAP-ágenst CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint), 10 mmol/1 HCl- és CH3CN-oldatokkal egymás után végzett mosással távolítottuk el. A tiszta diszacharid C komponenst CHC13: CH3OH 2:1 (térfogat szerint) eluálószerrel nyertük.
6. példa
Az 5. példában nyert (tisztítás előtti állapotú) diszacharid C komponenst tartalmazó vizes fázist vizes nátrium-hidroxiddal (pontosan 1,0 ekvimoláris mennyiséget alkalmazva; kezdeti 12,5 pH-értéket eredményező koncentrációban) kezeltük. Az elegyet 24 óra múlva szobahőmérsékleten pH=6,5-7 értékre állítottuk és preparatív HPLC-oszlopra (Millipore-Waters Bondapak C18 300 10~8 cm, 15 mol/1, 300 mmx47 mm) vittük fel. A diszacharid A és D komponenseket CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP (A oldószer) és 2-propanol-H2O 9:1 (térfogat szerint)+25 mmol/1 TBAP (B oldószer) elegyekkel végzett gradienselúció8
HU 219 810 Β val nyertük, olyan módon, hogy 75% A:25% B összetételt 0% A: 100% B összetételig változtattuk és 1%/perc gradienst, valamint 80 ml/perc áramlási sebességet alkalmaztunk. A diszacharid A és D komponenseket tartalmazó HPLC-ffakciókat az 5. példában a diszacharid C esetében leírt módon sómentesítettük.
Összehasonlító példa
Escherichia coli F-583-ból nyert lipid A (Sigma, L5399 számú termék) H2O: trietil-amin 1000:1 (térfogat szerint) eleggyel készített 10 mg/ml koncentrációjú oldatát 0,2 mol/1 NaOH-oldattal 37 °C-on 20 percen át lúgos kezelésnek vetettük alá. Ez alatt az idő alatt csupán 3-O-dezacilezett lipid A képződik [lásd Mayer és munkatársai, Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions, 145-156, (1990), Elsevier Science Publishers].
Az oldatot ortofoszforsavval semlegesítettük. A biológiai vizsgálatokhoz az oldatot 0,1% TEA/0,9% NaCl koncentrációjúra állítottuk be és azokat további tisztítás nélkül alkalmaztuk.
A FAB-MS-vizsgálathoz a lúgosán kezelt lipid A mintát fordított fázisú HPLC-vel (Supelco 58985, Supelcosil LC18, 3 pm, 15 mmx4, 6 mm) tisztítottuk. A 18% CH3CN:H2O 1:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP és 82% 2-propanol: H2O 9:1 (térfogat szerint)+5 mmol/1 TBAP összetételű eleggyel nyert főcsúcsnak megfelelő anyag sómentesítését az 1. példa szerinti módon végeztük. A FAB-MS-analízis szerint a molekulaion 1570,1 tömegegységnek adódott (számított érték: 1569,1 tömegegység).
A találmány szerinti diszacharidok fizikokémiai jellemzése
Az 1. és 2. példa szerinti diszacharid A és B komponensek jellemzését végeztük el.
A glükóz-amint savas hidrolízis (4 mol/1 HC1, 16 óra, 100 °C, argonatmoszféra) után fenil-izotiocianáttal végzett származékképzéssel és a származéknak azt követő HPLC-vel történő kvantitatív analízisével határoztuk meg [lásd Anumula, K. R. és munkatársai, Analytical Biochemistry, 179, 113-122, (1991)].
A teljes zsírsav-meghatározást savas hidrolízis (4 mol/1 HC1,4 óra, 100 °C) után végrehajtott metilezéssel (a metilezést metanol jelenlétében bór-trifluorid alkalmazásával végeztük), és azt követő gázkromatográfiás (OV-1 típusú oszlop, Hewlett Packard) kvantitatív analízissel végeztük [lásd Miller, L., Gas-Liquid Chromatography of Cellular Fatty Acids as a Bacterial Identification Aid, Gas Chromatography Application Note, 228-237, (1984)].
Az észtercsoportot tartalmazó zsírsavak meghatározását nátrium-metiláttal végzett kezelést követően gázkromatográfiás módszerrel végeztük [lásd Rietschel, E. T. és munkatársai, European Journal of Biochemistry, 28, 166-173,(1972)].
A foszfátmeghatározást Ames módszere szerint végeztük [lásd Ames, Β. N., Methods in Enzymology, 8, 115-118,(1966)].
A 3-dezoxi-D-manno-2-oktuloszonsav- (rövidítve: KDO-) meghatározást Karkhanis, Y. D. és munkatársai módszere szerint végeztük [lásd Analytical Biochemistry, 58, 595-601, (1978)].
A diszacharid A komponens 2,1 pmol/ml foszfátot, 1,9 pmol/ml glükóz-amint, 1,0 pmol/ml C12.o zsírsavat és 2,2 pmol/ml 3 OH-C14:o zsírsavat tartalmazó oldatát vizsgáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy csak a Ci2:0 zsírsav mutatható ki az észterkötésben kapcsolódó zsírsavak lehasítása után, arra utalva, hogy a 3 OH-C14:0 zsírsavmaradékok amidkötésben kapcsolódnak. KDO nem volt kimutatható (< 1 mol/10 mól diszacharid A).
Fentieknek megfelelően a diszacharid mólonként 2 mól foszfátot, 2 mól glükóz-amint, 2 mól 3 OH-C14;0 zsírsavat és 1 mól C12;0 zsírsavat tartalmaz.
Gyorsatom-bombázású tömegspektroszkópia- (nemzetközi rövidítése: FAB-MS-) analízist is végeztünk. A vizsgálatban a mintát kloroform: CH3OH 1:1 (térfogat szerint) oldatban preparáltuk (negatív mód), koncentrációja 1 mg/ml. A VG ZAB-2SE típusú tömegspektrométert 8 kV gyorsítófeszültséggel (rövidítése: Vac(.) működtettük és a spektrumot 30 kV értéken 1 pA emissziós árammal állítottuk elő. A spektrométer kalibrálását cézium-jodiddal végeztük. A kapott spektrumot az 1. ábrán mutatjuk be. A találmány szerinti diszacharid A komponens által szolgáltatott molekulaion 1133,55 tömegértéknél figyelhető meg (számított tömeg : 1133,3). A spektrumban lévő egyéb csúcsok a terméknek az analízis során bekövetkező ffagmentációjára utalnak. Az 1053,5 tömegnél megfigyelhető csúcs egy foszfátcsoport elvesztésére, míg a 951,3-nál megfigyelhető csúcs egy C12 zsírsav elvesztésére utal.
A találmány szerinti diszacharid B komponens FAB-MS-spektruma a 2. ábrán látható. A molekulacsúcs 1161,8 tömegegységnél figyelhető meg (számított érték: 1161,3). Az 1183,8 értéknél megfigyelhető csúcs nátrium addíciójára utal. A 951,6 értéknél megfigyelhető csúcs C14 zsírsav vesztésére, a 973,6 értéknél megjelenő csúcs a 951,6 értéknél megfelelő csúcs nátriumionnal való kombinációjának felel meg.
A diszacharid A vegyület (nátriumsójának D2O-val készített oldata) ’H-NMR-spektrumát (Bruker 360 MHz) a 3. ábrán, 13C-NMR-spektrumát (Bruker 90 MHz) a 4. és 5. ábrákon (nyújtott skála) mutatjuk be.
Az alábbi P-D-glükóz-amin-(l-6)-a-D-glükózamin-diszacharid-származékok szerkezetét is megadjuk.
* diszacharid A (2-dezoxi-6-O-[2-dezoxi-2-[(R)-3dodekanoil-oxi-tetradekanoil-amino]-4-O-foszfono-fiD-glükopiranozil]-2-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amino]-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát);
* diszacharid B (2-dezoxi-6-O-[2-dezoxi-2-[(R)-3tetradekanoil-oxi-tetradekanoil-amino]-4-O-foszfono-PD-glükopiranozil]-2-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amino]-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát);
* diszacharid C (2-dezoxi-6-O-[2-dezoxi-2-[(R)-3dodekanoil-oxi-tetradekanoil-amino]-4-O-foszfono-PD-glükopiranozil]-2-[(R)-3-dodekanoil-oxi-tetradekanoil-amino]-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát);
* diszacharid D (2-dezoxi-6-O-[2-dezoxi-2-[(R)-3hidroxi-tetradekanoil-amino]-4-O-foszfono-P-D-glükopiranozil]-2-[(R)-3-dodekanoil-oxi-tetradekanoilamino]-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát).
HU 219 810 Β
A találmány szerinti diszacharidok endotoxicitásának és biológiai hatásának vizsgálata
A találmány szerinti diszacharid A vegyület (1. példa szerinti vegyület) és diszacharid B vegyület (2. példa szerinti vegyület) endotoxicitását és biológiai aktivitá- 5 sát határoztuk meg. Összehasonlító anyagként Escherichia coli 0111 :B4 törzsből származó lipopoliszacharidot (Sigma, L3024 számú termék), lipid A-t (Sigma, L5399 számú termék, amelyet a 4. példában kiindulási anyagként alkalmaztunk) és Escherichia coli F583 lipid A-ból származó 3-O-dezacilezett lipid A-t (amelyet az összehasonlító példában állítottunk elő) alkalmaztunk, azonban HPLC-vel végzett tisztítást nem végeztünk.
1. Endotoxicitás
Az endotoxicitást úgynevezett Limulus amöbocitali- 15 zátum- (rövidítve: LAL-) teszt alapján határoztuk meg.
E módszer azon a megfigyelésen alapszik, hogy az endotoxinok a Limulus polifemus hemolimpfjének koagulációját indukálják.
A gélképződési vizsgálatban a vizsgálandó vegyület különféle sorozathígításait LAL 1:1 (térfogat szerint) [forrás: Haemachem Inc., LAL érzékenység: 0,06 endotoxinegység/ml) eleggyel kevertük össze, majd a keveréket egy órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezután a gélképződést az optikai sűrűség 405 nm-en történő mérésével követtük. Azt az utolsó hígítási értéket, amely esetében gél képződött, meghatároztuk a reakciómikrolemez invertálásával. A mintákban az endotoxinaktivitást egy lipopoliszacharid standard hígításaival történő összehasonlítás alapján határoztuk meg (1 endotoxinegység=0,l ng LPS).
Az endoxocitást kromogén vizsgálatban is megmér10 tűk, amikor is az LPS által az LAL-ben lévő proteáznak az aktiválását mértük egy kromogén vegyület (Ac-IleGlu-Ala-Arg-pNA; Bio Whittaker képlet, 50-650U) alkalmazásával. A színképződést (amely p-nitro-anilin, rövidítve: pNA, felszabadulásának a következménye) 405 nm-n mértük.
A mintákat 37 °C-on 10 percen át preinkubáltuk, majd kromogént tartalmazó LAL-t adtunk hozzá. Ezután megmértük azt az időt, amely 405 nm-en 0,2 optikai sűrűség eléréséhez volt szükséges. Az endotoxin20 aktivitást LPS-standardokkal nyert referenciagörbéhez való viszonyítás alapján számítottuk ki. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg, ahol az értékek ng LPS/ng termék értékre vonatkoznak.
3. táblázat
Endotoxikus hatás LAL-ban (ng/ng)
A vizsgálati módszer | E. coli LPS* | Lipid A | 3-O-dezacilczctt lipid A | Diszacharid A | Diszacharid B | Monofoszforildiszacharid A |
Gélképződés | 0,9±0,4 | 0,6±0,3 | l,0±0,l | 0,003 ±0,002 | 0,004+0,002 | 0,0031 ±0,0013 |
(n=6) | (n=3) | (n=2) | (n=12) | (n=7) | (n=10) | |
Kromogén | 0,70 | 0,7 ±0,3 | l,70±0,95 | 0,0014+0,0013 | 0,0008+0,0006 | 0,0016+0,0009 |
(n=l) | (n=3) | (n=3) | (n=9) | (n=7) | (n=10) |
* LPS endotoxikus hatása LAL-ban= 1 ng/ng, a kísérleti adatok a 0,3-3 ng/ng tartományba esnek.
A 3. táblázatban megadott adatok alapján a találmány szerinti diszacharid A és B vegyületek rendelkeznek a legalacsonyabb endotoxicitással, különösen az A-4 912 094 számú amerikai egyesült államokbeli találmányi bejelentés szerinti 3-O-dezacilezett lipid A vegyülettel való összehasonlításban.
2. C57BL/6 egerek makrofágsejtjeiben indukált in vitro biológiai hatás
Hathetes hímnemű C57BL/6 törzshöz tartozó egerekből csontvelőt különítettünk el a csípő-, a combcsont- és a sípcsontrészekből. A velőt ezután Dulbecco módosított táptalajban szuszpendáltuk és homogenizáltuk, majd centrifugáltuk, és a szemcsés-iszapos anyagot Dulbecco módosított táptalajban ismét felszuszpendáltuk. A sejteket 4xl05 sejt/ml koncentrációban tenyésztettük; táptalajként a fenti táptalajt 30% L-929 fibroblasztfelülúszóval [amely az úgynevezett kolóniastimuláló faktor-1 (nemzetközi rövidítése CSF-1) szokásos forrása] és 20% lószérummal egészítettük ki.
Hét nap múlva az érett makrofágokat elkülönítettük és Dulbecco módosított táptalajban újraszuszpendáltuk, a táptalaj 7xl06 sejt/ml koncentráció eléréséig 5%-os magzati marhaszérumot tartalmazott. E sejtszuszpenziót 1:1 arányban (térfogat szerint) összekevertük az ugyanabban a táptalajban hígított minták oldatával és az így kapott elegyet használtuk a biológiai vizsgálatokhoz a lyukanként 70 000 sejtet tartalmazó mikrolemezeken (az inkubációt 37 °C-on 22 órán át, 100% nedvesség- és 8% szén-dioxid-tartalom mellett végeztük).
Nitrogén-monoxid-(NO-)képződés
A makrofágokban a bakteriális fertőzés hatására, különösen az LPS hatására nitrogén-monoxid (NO) képződik. A nitrogén-monoxid citosztatikus és citotoxikus sajátságokkal bír. Rendkívül reaktív és oxidációval igen gyorsan átalakul nitritté és nitráttá.
A nitritképződést az úgynevezett Griess-teszttel határoztuk meg [1:1 (térfogat szerint) arányban N-(l-naftil)-etilén-diamin-hidroklorid, (1 g/1 vízben) és p-amino-benzolszulfonamid (10 g/1 5% H3PO4-ban) hozzáadásával végezzük a meghatározást]. Az aktivált makrofágok felülúszójában a nitritkoncentrációt NaNO2-standardhoz viszonyítva határoztuk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban ismertetjük.
HU 219 810 Β
4. táblázat
LPS-sel és származékokkal stimulált NO-képződés makrofágok felülúszójában
Anyag | Maximális aktivitás* | Minimális aktivitás* | Aktivitás 50%* | NO-akti vitás 50%-nál nmol N02/ml** | Analízisek száma |
LPS E. coli | 100 | 0,0004 | 0,01 | 7 | n=6 |
Lipid A | 50 | 0,005 | 0,07 | 5 | n=7 |
3-O-dezacilezett lipid A | 50 | 0,005 | 0,16 | 5 | n=3 |
Diszacharid A | 50 | 0,016 | 0,016 | 5 | n=6 |
Diszacharid B | 16 | 0,0005 | 0,05 | 5 | n=l |
Monofoszforil-diszacharid A | 50 | 5 | 8 | 4 | n=l |
* Anyagkoncentráció pg/ml-bcn kifejezve; megfelel az indukált NO-aktivitásnak. ** A hígításigörbe-sorozatból extrapolált N02/ml koncentráció.
A kísérlet alapján megállapítható, hogy az LPS indukálja a legnagyobb mértékű NO-képződést. A lipid 20 A, 3-O-dezacilezett lipid A, diszacharid A és diszacharid B azonos nagyságrendben indukálnak NO-képződést.
Következésképpen a diszacharid A és B vegyületek makrofágokban a NO képződését olyan erős mértékben indukálják, mint a lipid A és 3-O-dezacilezett lipid A.
Interleukin-1 a-(IL -1 a.-)képződés
Az interleukin-ΐα számos sejtben, így a makrofágokban is képződik LPS hatására. Az IL-Ια néhány ismert hatása a következő: T-sejtek aktiválása, IL-2receptorexpresszió és citokin-gén expresszió T-sejtekbeni indukciója, B-sejt-proliferáció és Ig-szekréció együttes stimulációja, valamint NK-mediált citotoxicitás IL-2- és IFN-indukált aktiválásának kedvező befolyásolása, továbbá akut fázisú fehérjeszintézis indukció25 ja és láz indukálása.
Az IL-Ια koncentrációját a makrofágok felülúszójában ELISA-teszt alapján mértük (GENZYME-készlet, Intertest-la). Az eredményeket az 5. táblázatban adjuk meg.
5. táblázat
LPS-sel és származékokkal stimulált IL-la-képződés makrofágok felülúszójában
Anyag | Legmagasabb vizsgált koncentráció | Koncentráció 500 mg/ml IL-Ια (pg/ml) | Detektált minimális aktivitás | ||
koncentráció (pg/ml) | IL-la (pg/ml) | koncentráció (pg/ml) | IL-la (pg/ml) | ||
Vak=TEA 0,1% | 500 | <15* | <15* | <15* | |
LPS E. coli | 1600 | 295+129 | 170** | 1,56 | 18+4 |
Lipid A | 500 | 53+35 | 53+35 | 50 | 17+8 |
3-O-dezacilezett lipid A | 500 | 56+19 | 56+19 | 160 | 21+6 |
Diszacharid A | 500 | 75+45 | 75+45 | 16 | 19+11 |
* Kimutathatósági határ 15 pg/ml nagyságrendjében van.
** A hígításigörbe-sorozatból extrapolált IL-la-koncentráció.
E kísérletben az IL-1 a maximális képződését nem lehetett meghatározni, mivel a képződés még a legnagyobb alkalmazott koncentrációban is növekedést mutatott.
Az 500 pg/ml koncentrációban kapott IL-laképződés indukciója nem különbözik szignifikánsan a lipid A, 3-O-dezacilezett lipid A és a diszacharid A esetében kapottól. Ugyanakkor az LPS ennél erősebben indukált IL-la-termelést.
A vizsgálat szerint a diszacharid A által előidézett IL-la-termelés mértéke legalább olyan, mint a lipid A és a 3-O-dezacilezett lipid A esetében tapasztalt IL-la-termelés.
Interleukin - 6-(lL - 6)-képződés
Az IL-6 aktivált monociták vagy makrofágok, Tés B-limfociták révén képződik. Az IL-6 többek között bizonyos sejttípusok proliferációját, bizonyos melanóma-sejtvonalak növekedésének gátlását, B-limfociták differenciálódását és IgG-szekréció stimulációját, citotoxikus T-sejtek differenciálódását indukálja és gyenge antivirális hatást fejt ki.
Az IL-6-koncentrációt makrofágok felülúszójában ELISA-vizsgálattal határoztuk meg (ENDOGENkészlet, EM-IL-6).
Az eredményeket a 6. táblázatban adjuk meg.
HU 219 810 Β
6. táblázat
LPS-sel és származékokkal stimulált IL-6-képződés makrofágok felülúszójában
Anyag | Maximális aktivitás | Minimális aktivitás | 50% aktivitás | |||
koncentráció (pg/ml) | IL-6 (pg/ml) | koncentráció (pg/ml) | IL-6 (pg/ml) | koncentráció (pg/ml) | IL-6 (pg/ml) | |
Vak=TEA 0,1% | 500 | 1150+80 | 0 | 710+240 | - | - |
LPS E. coli | 25 | 13 860+2750 | 0,006 | 2400+960 | 0,3 | 6950 |
Lipid A | 160-0,016* | 3 000-2200* | 0,016 | 2460+50 | ND** | ND** |
3-O-dezacilezett lipid A | 160-0,016* | 2 850-2200* | 0,016 | 2410+160 | ND** | ND** |
Diszacharid A | 50 | 5 700+2650 | 0,016 | 850+350 | 1 | 2850 |
* Az indukált aktivitás viszonylag állandó a vizsgált tartományban és nincs maximuma. ** ND=ncm határoztuk meg.
A vizsgált anyag legalacsonyabb koncentrációjában (0,016) indukált aktivitás kisebb mint az 50%-os aktivitás.
Az eredmények alapján megállapítható, hogy az IL-6-elválasztás fokozódása a diszacharid A esetében jelentősen kisebb, mint az LPS esetében. Mindazonáltal a diszacharid A vegyület makrofágokban jelentősebb mértékben fokozza az IL-6-termelést, mint a 25 lipid A és 3-O-dezacilezett lipid A.
Tumomekrózis-faktor-alfa-(TNF-a-)képződés
A TNF-α LPS-stimuláció hatására főként makrofágokban és monocitákban képződik. A TNF-α főbb hatásai a következők: antivirális hatás, bizonyos sejttí- 30 pusokban citolitikus és citosztatikus hatás, bizonyos sejtvonalak növekedésére kifejtett hatás, antigénexp20 resszió, például I. és II. osztályba tartozó fő hisztokompatibilitási komplexek, metil-kolantrén által indukált szarkóma nekrózisa, polimorfnukleáris leukociták (rövidítve : PMN) aktiválása, csontfaló sejtek aktiválása és csontfelszívódás. A TNF-d toxikus sokkban és szepszisben szintén fontos mediátoranyag.
A TNF-α koncentrációját makrofágok felülúszójában ELISA-teszttel (GENZYME-készlet, mTNF-a) határoztuk meg.
Az eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze.
7. táblázat
LPS-sel és származékokkal stimulált TNF-a-képződés makrofágok felülúszójában
Anyag | Legmagasabb vizsgált koncentráció | Koncentráció 500 pg/ml TNF-α (pg/ml) | Detektált minimális aktivitás | ||
koncentráció (pg/ml) | TNF-α (pg/ml) | koncentráció (pg/ml) | TNF-α (pg/ml) | ||
Vak=TEA 0,1% | 500 | 138+9 | 138+9 | 0 | <100* |
LPS E. coli | 100-6,25 | 2,57-284 | 130** | 0,006 | 175+55 |
Lipid A | 500 | 223+64 | 223+64 | 0,016 | 118+9 |
3-O-dezacilezett Lipid A | 500 | 311+72 | 311+72 | 0,016 | 155+6 |
Diszacharid A | 500 | 530+139 | 530+139 | 0,16 | 159+43 |
* Kimutathatósági határ 100 pg/ml nagyságrendjében van.
** TNF-a-konccntráció viszonylag állandó 100 és 6,25 pg/ml LPS-tartományban, és a 200 pg/ml-nél nagyobb értékek esetében csökken. *** A hígításigörbe-sorozatból extrapolált TNF-a-koncentráció.
A TNF-α maximális képződését nem lehetett meghatározni, mivel a képződés még a legmagasabb vizsgált koncentráció esetén is folyamatosan fokozódott.
A többi vizsgálattal szemben az LPS által indukált TNF-a-képződés alacsonyabb volt, mint a diszacharid A esetében. A diszacharid A azonos vagy jelentősebb mértékű TNF-a-indukciót okozott, mint a lipid A vagy a 3-O-dezacilezett lipid A.
Prosztaglandin E2-(PGE2-)képződés
A PGE1 és PGE2 az LPS, TNF-α vagy IL-1 által stimulált makrofágok révén szintetizált arachidonsav fő metabolitjai. E prosztaglandinszármazékok a T- és Blimfocitákra immunmoduláló hatást fejtenek ki. Úgy tűnik, hogy a T-limfociták alosztályaira is hatást fejtenek ki, így a Th2-sejteket stimulálják, míg a Thl-sejteket gátolják, valamint az immunglobulinok izotípusaira gyakorolnak hatást.
A PGE2 koncentrációját makrofágok felülúszójában RIA-teszttel (PAESEL+LŐRÉI, 36-104-6001 prosztaglandin E2 3H-RIA) mértük. Az eredményeket a 8. táblázatban foglaltuk össze.
HU 219 810 Β
8. táblázat
LPS-sel és származékokkal stimulált PGE2-képződés makrofágok felülúszójában
Anyag | Aktivitást indukáló legmagasabb koncentráció | Aktivitást indukáló legalacsonyabb koncentráció | ||
koncentráció (pg/ml) | PGE2 (pg/ml) | koncentráció (pg/ml) | PGE2 (pg/ml) | |
Vak=TEA 0,1% | 500 | <80* | <80* | |
LPS E. coli | 1600 | 1120+135 | 6,25 | 153+29 |
Lipid A | 500 | <80* | <80* | |
3-O-dezacilezett lipid A | 500 | 290+25 | 500 | 240+25 |
Diszacharid A | 500 | 540+65 | 16 | 80+41 |
*Kimutathatósági határ 80 pg/ml nagyságrendjében van.
A kísérletben a PGE2 maximális képződését nem lehetett meghatározni, mivel még a legmagasabb alkalmazott koncentrációban is a képződés növekedést mutatott. A diszacharid A által előidézett PGE2-képződésfokozódás jelentősen kisebb, mint az LPS esetében tapasztalt. A diszacharid A vegyület azonban a lipid A és a 3-O-dezacilezett lipid A vegyületeknél hatásosabbnak bizonyult. A lipid A a PGE2-képződést nem fokozta, míg a 3-O-dezacilezett lipid A csak a legmagasabb koncentrációban indukált PGE2-termelést.
Következtetések
A találmány szerinti diszacharidok in vitro vizsgálatokban hatásosnak bizonyultak és nitrogén-monoxid (NO), IL-Ια, IL-6, TNF-a és PGE2 képződését indukálták. A találmány szerinti diszacharidok aktivitása azonos vagy jelentősebb, mint a lipid A és a 3-O-dezacilezett lipid A aktivitása, endotoxicitásuk, amelyet az LAL-vizsgálattal határoztunk meg, azonban lényegesen csekélyebb. A lipid A és a 3-O-dezacilezett lipid A alacsonyabb aktivitása a tisztaságbeli különbségekre vezethető vissza. A diszacharid A és B vegyületeket HPLCvel tisztítottuk, míg a lipid A egy kereskedelemben beszerezhető biológiai készítmény (Sigma, L-5399 számú termék), illetve a 3-O-dezacilezett lipid A-t kereskedelemben beszerezhető lipid A készítményből az A-4 912 054 számú amerikai egyesült államokbeli találmányi bejelentés szerint állítottuk elő. Az egyedüli nagyobb aktivitást mutató anyag az LPS, amely általában nagyobb választ váltott ki és alacsonyabb koncentrációban szignifikáns válaszjelet indukált.
3. fn vivő biológiai hatás
A diszacharid A in vivő biológiai aktivitását BDIX törzsű patkányokban indukált peritoneális karcinomatózissal szemben kifejtett tumorellenes hatás alapján vizsgáltuk. A kísérletben Martin módszerével [Martin, F. és munkatársai, International Journal of Cancer, 32, 623-627, (1983)] nyert Pro b sejteket intraperitoneálisan injektáltunk patkányokba (1 patkánynak 106 sejtet adagoltunk). 10 nap múlva számos tömör csomó jelentkezett a bélfodorban (mesenterium) a tejpontokban és progresszíven behatolt a peritoneális üregbe [lásd Lagadec, P. és munkatársai, Inasion and Metastasis, 7, 83-95, (1987)]. 4-5 héttel később vérzéses ascitis fejlődött ki, és 8-12 héten belül valamennyi patkány elpusztult.
A tumor Pro b sejtek beadását követő 14 nap múlva kezdtük el az immunterápiát. A kezelés során diszacharid A vegyületet 0,1, 0,3 és 0,8 mg/kg testtömegdózisokban intraperitoneális injekció formájában adagoltuk. A vegyület oldását 0,9% nátrium-klorid és 0,1% trietil-amin vizes oldatban végeztük. A patkányokat minden 3,5 nap eltelte után kezeltük összesen 5 injekcióval. A kontrollcsoport vizes oldatot kapott injekcióban. Mindkét csoportban 10 állat szerepelt a vizsgálatban.
A tumoros sejtek adagolása után 6 héttel autopsiát végeztünk. A peritoneális karcinomatózis mértékét vakon határoztuk meg, és az állatokat a növekvő karcinomatózis szerint osztályoztuk. A csomó mérete szerint végeztük az osztályozást az alábbiak alapján:
0. osztály : tumor nem látható
1. osztály: néhány 0,2 cm-nél kisebb csomó
2. osztály: nem számolhatóan sok 0,5 cm-nél kisebb csomó
3. osztály: 1 cm-es méretig terjedő tumorok
4. osztály: a tumoros üreget teljesen átnövik a tumorok; méretük néhány cm-ig teijed
Az eredményeket a 9. táblázatban foglaltuk össze.
9. táblázat
A diszacharid A in vivő tumorellenes hatása peritoneális karcinomatózisban
Diszacharid A (dózis) | Az egyes karcinomatózisfokozathoz tartozó állatszám: | Anyag hatása (1) | Aszcitis térfogata (ml/állat) | Anyag hatása (2) | |
0 12 3 4 | Határértékek | Átlag | |||
0 mg/kg | 0 112 6 | 0-64 | 40+24 | ||
0,1 mg/kg | 0 2 0 4 4 | NS | 0-18 | 7+7 | p<0,01 |
HU 219 810 Β
9. táblázat (folytatás)
Diszacharid A (dózis) | Az egyes karcinomatózisfokozathoz tartozó állatszám: | Anyag hatása (1) | Aszcitis térfogata (ml/állat) | Anyag hatása (2) | |
0 12 3 4 | Határértékek | Átlag | |||
0,3 mg/kg | 2 3 2 2 1 | p<0,01 | 0-20 | 2±6 | p<0,01 |
0,8 mg/kg | 16 111 | p<0,01 | 0-2 | 0±l | p<0,01 |
A tumorellenes hatás statisztikai értékelését Kruskal-Wallis-teszt (1) vagy varianciaanalízis (2) alapján végeztük.
A kísérletből egyértelműen megállapítható, hogy a diszacharid A dózisfüggő tumorellenes hatással rendelkezik.
4. Akut toxicitás
Diszacharid A vegyületet hím és nőstény NMRI törzsű, 6-7 hetes egereknek a farok- (kaudális) vénán ke- 20 resztül adagoltunk. A kísérletben 100 mg/testtömeg kg dózisértékig semmiféle pusztulást nem tapasztaltunk.
7. példa
Kiindulási anyagként Pseudomonas aeruginosából nyert lipopoliszacharidot (Sigma, L7018 számú termék) alkalmaztunk. A lipid A szerkezete már ismeretes [lásd Kulshin és munkatársai, Eur. J. Biochem. 198, 697-704, (1991)]. Az E. co/Zból származó lipid A-val szemben, a domináns fajták a diglükóz-amin-difoszfát- 30 váz mindkét aminocsoportján acil-oxi-acil-csoportokat tartalmaznak. Továbbá a 3’-helyzetben egy 3’-hidroxidekánsav van jelen, míg ugyanez a zsírsav-acil-csoport csak a 3-helyzetben van jelen a minor komponensben.
Ennek a zsírsav-acil-csoportnak a 3’-helyzetből tör- 35 ténő eltávolítása egy diszacharid C analógot eredményezne. További hidrolízissel a 2- vagy 2’-helyzetben lévő acil-oxi-acil-csoport észterezett zsírsav-acil-csoportjának eltávolítását eredményezné. E szerkezetek a diszacharid C és D szerkezetekkel analógok.
Ps. aeruginosából származó lipopoliszacharidot (Sigma L7018 számú termék) 0,1 mol/1 acetátban pH=4,0 értéken 5 mg/ml koncentrációban feloldottunk, és az oldatot 120 percen át 100 °C-on hevítettük. Lehűtés után 0,5-szeres térfogatú 2-propanolt adtunk 45 hozzá és ezt követően tetrabutil-ammónium-foszfátot (TBAP) 25 mmol/1 végkoncentráció eléréséig adagoltunk az oldathoz. Ezután trietil-aminnal pH=9,0-re (közelítő érték) állítjuk, pH-papírt alkalmazunk. Az elegyet egy C18 Sep-Pak (Waters) oszlopra vittük és recik- 50 lizáltuk (tízszer). A Sep-Pak-oszlopot 10 ml 5 mmol/1 TBAP acetonitril: H2O 1:1 (térfogat szerint) eleggyel készített oldatával, majd 10 ml acetonitrillel mostuk.
Az adszorbeált anyagokat 4 ml kloroform:metanol 2:1 (térfogat szerint) eleggyel eluáltuk.
A két főcsúcsot, amelyet a 6. ábrán PSA1 és PSA2 szimbólumokkal jelölünk, HPLC-vel tisztítottuk és a zsírsavakat analizáltuk. A zsírsavösszetétel megfelelt a Kulshin és munkatársai által leírtnak (lásd az alábbi táblázatot). A PSA1-komponens kevésbé hidrofób a
PSA2-hez képest, ennek megfelelően kisebb retenciós idővel (Rt) eluálódik az oszlopról. Ez megfelel annak a molekulának, amely két 2 OH-C12:0 savmaradékkal 15 rendelkezik. A PSA2-ben mind a 2 OH-C12:0, mind a C12:0 csoportokkal jelen vannak.
Csúcs | Azonosított zsírsav |
PsAl | 3 0H-C10:0 2OH-C12:0 3OH-C12:0 |
PsA2 | 3 0H-C10:0 02:0 2OH-C12:0 3OH-C12:0 |
Az oldószert rotavapor-készülékkel eltávolítottuk, és a maradékot 0,2% trietil-amin vizes oldatában feloldottuk.
Ps. aureginosa lipid A oldatához nátrium-hidroxidot adagoltunk 0,2 mol/1 koncentráció beállításához, majd az oldatot szobahőmérsékleten 60 percen át inkubáltuk. Ezután 8,5% ortofoszforsavval semlegesítettük, majd fordított fázisú HPLC-rendszeren tisztítottuk (HP1050 Supelco LC18, 3 pm fordított fázisú oszlop, előtétoszloppal ellátva), az ekvilibrálást 75% A oldószer [5 mmol/1 TBAP acetonitril: víz 1:1 (térfogat szerint)] és 25% B oldószer [5 mmol/1 TBAP 2-propanol: víz 9:1 (térfogat szerint)] elegyével végeztük, majd az elúciót 2% B oldószer/perc összetétellel kezdtük és az oldószergradienst 100% B oldószer eléréséig növeltük. A csúcsokat 210 nm-nél mért abszorpcióval detektáltuk. A főcsúcsokat gyűjtöttük (lásd 7. ábra), majd kétszeres térfogatú vízzel hígítottuk és C18 Sep-Pak-rendszerre vittük fel, amelyet A oldószerrel ekvilibráltunk. A rendszert 10 ml 0,45% 2-propanol: H2O 1:3 (térfogat szerint) oldószereleggyel készített nátrium-klorid-oldattal, 10 ml vízzel és 10 ml acetonitrillel mostuk. Az adszorbeált anyagokat 4 ml kloroform:metanol 2:1 (térfogat szerint) oldószereleggyel eluáltuk, majd az oldószereket nitrogénatmoszférában eltávolítottuk. A frakciókat 100 pl vízben ismét feloldottuk.
A frakciók zsírsavtartalmát 4 mol/1 sósavval 100 °C-on 4 órán át végzett hidrolízis után gázkroma55 tográfiásan határoztuk meg. A felszabadított zsírsavakat Miller módszerével [Miller, L. Gas Chromatography bejelentési szám (application note) 228-37 (Hewlett Packard)] metil-észterekké alakítottuk és az analízist Hewlett Packard 5890 típusú készülékkel szili60 kagéloszlopon (Supelco 2-4026) végeztük referens
HU 219 810 Β standard zsírsav-metil-észterek (Supelco) alkalmazásával.
A lipid A extraktum hidrolízise után a fordított fázisú HPLC-vizsgálatban számos csúcs volt megfigyelhető. A főcsúcsokat a HPLC-rendszerből elkülönítettük (e csúcsok PsAOHl, 2, 4 és 6 jelzéssel szerepelnek). Mindegyik frakcióban azonosítottuk a zsírsavakat, amelyeket az alábbi táblázatban adunk meg.
Csúcs | Azonosított zsírsav |
PsAOHl | 3OH-C12:0 2OH-C12:0 |
PsAOH2 | 3OH-C12:0 2OH-C12:0 |
PsAOH4 | 3OH-C12:0 02:0 |
PsAOHó | 3OH-C12:0 2OH-C12:0 02:0 |
A fenti diszacharidok kémiai nevét az alábbiakban, képletüket a leírás mellékletében adjuk meg.
* PsAOHl: 2-Dezoxi-6-O-{2-dezoxi-2-[(R)-3-/(S)2-hidroxi-dodekanoil-oxi/-dodekanoil-amino]-4O-foszfono-P-D-glükopiranozil}-2-[(R)-3-hidroxi-dodekanoil-amino]-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát;
* PsAOH2: 2-Dezoxi-6-O-{2-dezoxi-2-[(R)-3-hidroxi-dodekanoil-amino]-4-O-foszfono-[l-D-glükopiranozil}-2-{(R)-3-[(S)-2-hidroxi-dodekanoiloxi]-dodekanoil-amino}-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát;
* PsAOH4: 2-Dezoxi-6-O-{2-dezoxi-2-[(R)-3dodekanoil-oxi-dodekanoil-amino]-4-0-foszfono-p-D-glükopiranozil}-2-[(R)-3-hidroxi-dodekanoil-amino]-a-D-glükopiranozil-dihidrogénfoszfát;
* PsAOHó: 2-Dezoxi-6-0-{2-dezoxi-2-[(R)-3-dodekanoil-oxi-dodekanoil-aminoj-4-O-foszfonoβ-D-glükopiranozil} -2- {(R)-3- [(S)-2-hidroxidodekanoil-oxi]-dodekanoil-amino}-a-D-glükopiranozil-dihidrogén-foszfát.
A frakciókat elektron-spray tömegspektrometriásan (ES-MS) negatív üzemmódban szintén analizáltuk. E vizsgálatban egy VG Biotech BIO-Q készüléket használtunk, amelyhez egy kvadrupolanalizátort kapcsoltunk. Az analízist az alábbiak szerint végeztük. 2 és 4 μΐ közötti térfogatú mintákat 10 μΐ-re hígítottunk acetonitril: víz: 25% ammóniaoldat 50:50:1 (térfogat szerint) összetételű oldószereleggyel. Ezután közvetlenül a tömegspektrométerbe 10 μΐ térfogatot injektáltunk. Eluensként 7 μΐ/perc áramlási sebességgel acetonitril:víz:25% ammóniaoldat 50:50:1 (térfogat szerint) oldószerelegyet alkalmaztunk. A főionok fragmentációjának analíziséhez az első kvadrupolból származó parens ionokat a második kvadrupolban ütközéses (úgynevezett kollézióval aktivált) fragmentációnak vetettük alá, kolléziós gázként argont alkalmazva. A második generációs úgynevezett „lány-”ionokat a harmadik kvadrupolban detektáltuk.
Minden egyes csúcs esetében számítottuk a tömeget és az alábbiakban megadjuk a tömegspektrometriás méréssel kapott értékeket is.
Csúcs | Számított tömeg | Méréssel kapott tömeg |
PsAOHl | 1093,5 | 1093,4 |
PsAOH2 | 1093,5 | 1093,1 |
PsAOH4 | 1077,5 | 1077,0 |
PsAOHó | 1275,8 | 1275,7 |
Mindegyik esetben igen jó egyezést tapasztaltunk a számított és mért értékek között. A PsAOHl és PsAOH2 esetében a tömegek azonosak. Ez arra utal, hogy a molekula két izoform alakjáról van szó; ismeretes, hogy a lipid A bizonyos analitikai körülmények között tömegspektrometriában fragmentálódik [Kulshin, 1991; és Cotter és munkatársai, Biomed. Encl. Mass Spectrom. 14, 591-598, (1987)]. Ionok képződnek, amelyek 102 tömegegység a molekula nem redukáló feléhez való addíciójának felelnek meg. így két tandem tömegspektrométer esetében a főion az első MS-ben fragmentálódhat és a második MS-ben detektálhatok az úgynevezett lányionok. Ezáltal kizárható annak a lehetősége, hogy a megfigyelt szekunder ionok szennyeződésektől származnak; valójában azok az eredeti ionból fragmentációval kell hogy képződjenek. A lányionok várt tömege minden egyes frakció esetében és az MS-MS-vizsgálatban megfigyelt tömegértékek az alábbi táblázatban szerepelnek.
Csúcs | Fragmens számított tömege | Fragmens méréssel kapott tömege |
PsAOHl | 558,5 vagy 756,8 | 756,1 |
PsAOH2 | 558,5 vagy 756,8 | 557,7 |
PsAOH4 | 558,5 vagy 740,8 | 739,9 |
PsAOHó | 558,5 vagy 740,8 | 740,1 |
E megfigyelések alapján egyértelműen megállapítható a diszacharid E, F, G és H szerkezetek.
Belső összehasonlítás céljából a diszacharid A komponenst szintén analizáltuk ES-MS-módszerrel. A számított tömeg 768,9-nek, míg a mért érték 768-nak adódott.
A frakciók biológiai hatását rágcsáló peritoneális (hashártya-) makrofágokban a nitritképződés stimulálása alapján határoztuk meg, miként azt a fentiekben ismertettük.
A törzsoldatban mindegyik analóg szerkezetű diszacharid mennyiségét a HPLC-vizsgálatban mért abszorpció alapján a diszacharid A-ra vonatkoztatva határoztuk meg. A frakciók biológiai hatása a diszacharid A hatásával azonos nagyságrendbe esik (lásd 8. ábra). A diszacharid H, amely két acil-oxi-acil-csoporttal rendelkezik, ugyanakkor más zsírsav-acil-maradékot nem tartalmaz, bizonyult a legaktívabbnak. Az acil-oxi-acilcsoport 2- vagy 2’-helyzethez való kapcsolódása csupán kismértékben befolyásolja a hatást.
HU 219 810 Β
Annak kizárására, hogy a minták esetleges más anyagokkal, például LPS-sel való szennyeződésének a következménye a biológiai hatás, a diszacharid E, F, G és H anyagokat fordított fázisú HPLC-rendszeren ismét tisztításnak vetettük alá, és közvetlenül a csúcs előtti és utáni HPLC-alapvonalrészeket is elkülönítettük és azokat ugyanolyan módon kezeltük, miként az anyagot tartalmazó csúcsoknak megfelelő frakciókat. Ezután a csúcsfrakciók és az alapvonal-frakciók hatását vizsgáltuk. A diszacharid E, F, G és H anyagokat tartalmazó csúcsok hasonló aktivitást mutattak, mint azt az első meghatározásban tapasztaltuk. Az úgynevezett vakminták, amelyek közvetlenül a lipid A analóg csúcs előtti és utáni HPLC-régióknak felelnek meg, inaktívnak bizonyultak. így tehát a nitrit képződésének fokozódása specifikusan a lipid A analógokra jellemző.
A diszacharid E, F és G komponensek endotoxicitását a kromogén LAL-vizsgálatban (lásd fent) határoztuk meg. Ez esetben azonban 1 mg/ml marhaszérum-albumin helyett 0,1 mg/ml-t alkalmaztunk. Az eredményeket (n=4 vagy 6) két kísérletsorozatban kaptuk, azokat az alábbi táblázatban ismertetjük.
Minta | Endotoxikus hatás LAL-ban (mg/mg) |
E. coli LPS | 0,58+0,14 |
E. coli lipid A | 0,32+0,06 |
Diszacharid E | 0,000 005 +0,000 002 |
Diszacharid F | 0,000 025 +0,000 026 |
Diszacharid G | 0,000 06+0,000 03 |
Diszacharid A | 0,000 003 +0,000 002 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (33)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. (I) általános képletű β(1—>6) glükóz-amin-diszacharid-származékok, aholRí jelentése hidroxilcsoport, dihidroxi-foszfonoil-oxicsoport vagy annak töltéssel bíró formái, egy (1-5 szénatomos acil)-oxi-csoport; egy (1-5 szénatomos alkil)-oxi-csoport, vagy egy X csoport;R2 és R2’ mindegyikének jelentése egy acilcsoport vagy egy Y csoport, azzal a megkötéssel, hogy R2 vagy R2’ csoportok legalább egyikének jelentése Y csoport;R3 és R3’ mindegyikének jelentése hidrogénatom, egy 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy egy 1-3 szénatomos acilcsoport;R4 jelentése hidrogénatom, egy 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy egy 1-3 szénatomos acilcsoport;R4’jelentése hidrogénatom, egy 1-5 szénatomos acilcsoport, egy 1-5 szénatomos alkilcsoport, dimetoxi-foszfonoil-csoport vagy egy foszfonocsoport vagy annak töltéssel bíró formái; ésR6’ jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, dihidroxifoszfonoil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-oxi-csoport, azoknak egy töltéssel bíró formái vagy egy Z csoport, ahol X jelentése egy karboxi-(l-5 szénatomos alkil)-oxi-csoport, egy -O-CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH] képletű csoport, ahol m=0-5 és n=0-5;foszfono-(l-5 szénatomos alkil)-csoport, dimetoxi-foszfonoil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-oxi-csoport, hidroxi-szulfonil-(l-5 szénatomos alkil)-csoport; vagy az X csoport töltéssel bíró formái;ahol Y jelentése egy acil-oxi-acil-csoport, egy acil-amino-acil-csoport;egy (1-24 szénatomos alkil)-oxi-acil-csoport, egy (1-24 szénatomos alkil)-amino-acil-csoport, egy (1-24 szénatomos alkil)-tio-acil-csoport, és ahol Z jelentése egy (1-24 szénatomos alkil)-oxi-csoport, egy (1-24 szénatomos acil)-oxi-csoport, 3-dezoxi-D-manno-2-oktuloszonsav (rövidítve: KDO), (KDO)n, ahol n= 1-10, egy poliszacharidoldallánc, így egy természetes lipopoliszacharidból származó oldallánc; egy magkomponens, így egy természetes lipopoliszacharidból származó magkomponens, és egy amino-(l-8 szénatomos alkil)-karboxil-csoport, valamint mindezek sói.
- 2. Az 1. igénypont szerinti diszacharidok, ahol Y egy 3-acil-oxi-acil-csoportot, egy 3-acil-amino-acil-csoportot vagy egy 3-acil-tio-acil-csoportot jelent.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti diszacharidok, ahol Y egy acil-oxi-acil-csoportot jelent.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol az acilcsoport jelentése egy zsírsavmaradék, egy 3-hidroxi-zsírsav-maradék vagy egy 3-oxozsírsav-maradék.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol az Y csoportot képező acil-oxi-acil-csoportban, acil-amino-acil-csoportban és az acil-tio-acilcsoportban az acilcsoport jelentése egy zsírsavmaradék, egy 3-hidroxi-zsírsav-maradék vagy egy 3-oxozsírsav-maradék.
- 6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol az Y csoport helyén lévő acil-oxi-acilcsoport egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(4-24 szénatomos acil)-csoport, előnyösen egy (8-18 szénatomos zsírsav)acil-csoport, amely a 3-hidroxi-csoporton egy 1-20 szénatomos acilcsoporttal, előnyösen egy 10-18 szénatomos zsírsavból származó acilcsoporttal észtert képez.
- 7. A 6. igénypont szerinti diszacharidok, ahol az acil-oxi-acil-csoport jelentése egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos acil)-csoport, amely a 3-hidroxicsoporton egy 12 szénatomos zsírsavval észtert képez.
- 8. A 6. igénypont szerinti diszacharidok, ahol az acil-oxi-acil-csoport jelentése egy N-kapcsolt 3-hidroxi16HU 219 810 Β (14 szénatomos-acil)-csoport, amely a 3-hidroxicsoporton egy 14 szénatomos zsírsavval észtert képez.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol R2’ jelentése Y csoport.
- 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol R2 jelentése Y csoport.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol a 3-hidroxi-zsírsav-maradék egy 3hidroxi-(4-24 szénatomos)-, előnyösen 3-hidroxi(10-18 szénatomos zsírsav)-maradék.
- 12. A 11. igénypont szerinti diszacharidok, ahol 3hidroxi-zsírsav-maradék egy 3-hídroxi-(14 szénatomos zsírsav)-maradék.
- 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti diszacharidok, ahol R2 jelentése a 3-hidroxi-zsírsav-maradék.
- 14. A 11. vagy 12. igénypont szerinti diszacharidok, ahol R2’ jelentése a 3-hidroxi-zsírsav-maradék.
- 15. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol R2 és R2’ mindegyikének jelentése egy Y csoport.
- 16. A 15. igénypont szerinti diszacharidok, ahol R2 és R2’ mindegyike egy acil-oxi-acil-csoportot jelent, amely egy N-kapcsolt 3-hidroxi-(4-24 szénatomos acil)-, előnyösen egy (8-18 szénatomos acil)-csoportot tartalmaz, amelynek 3-helyzetű hidroxilcsoportja egy (1-20 szénatomos acil)-csoporttal, előnyösen egy (10-18 szénatomos acil)-csoporttal észtert képez.
- 17. A 16. igénypont szerinti diszacharidok, ahol R2 jelentése N-kapcsolt 3-hidroxi-(14 szénatomos acil)-csoport, amely a 3-hidroxi-csoporton egy 16 szénatomos zsírsavval észtert képez; és ahol R2’ jelentése N-kapcsolt 3hidroxi-(14 szénatomos acil)-csoport, amely a 3-hidroxicsoporton egy 12 szénatomos zsírsavval képez észtert.
- 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol Rj jelentése egy dihidroxi-foszfonoil-oxi-csoport.
- 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol R, jelentése hidrogénatom.
- 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol Rj α-konfigurációban van jelen.
- 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol R3 jelentése hidrogénatom.
- 22. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok, ahol R3’ jelentése hidrogénatom.
- 23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti disza charidok, ahol R6’ jelentése hidroxilcsoport.
- 24. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti disza charidok, ahol R4’ jelentése egy foszfonocsoport.
- 25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti disza charidok, ahol a diszacharid egy vagy több kationt tartalmazó só formában van jelen.
- 26. A 25. igénypont szerinti diszacharidok, kationokként alkálifém-kationokat tartalmaz.
- 27. Eljárás az 1 -26. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidok előállítására, azzal jellemezve, hogyi) lipopoliszacharidot tartalmazó mikroorganizmusok lipid A részét magában foglaló kiindulási anyagot nyerünk; és ii) a kiindulási anyagot lúggal kezeljük a lipid A rész 3- és 3'-helyzeteinek O-dezacilezéséhez.
- 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként lipopoliszacharidot tartalmazó mikroorganizmusokat, Gram-negatív baktériumokat, e mikroorganizmusok és Gram-negatív baktériumok részét tartalmazó felszíni szerkezetet vagy e mikroorganizmusok és Gram-negatív baktériumok egy lipopoliszacharidját alkalmazzuk.
- 29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként Gram-negatív baktériumok lipid A anyagát alkalmazzuk.
- 30. A 27-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lúgos kezelést a magrész és a poliszacharidoldallánc eltávolítására szolgáló savas kezelés előtt vagy az után végezzük.
- 31. Gyógyszerkészítmények, amelyek tartalmaznak- hatóanyagként egy 1 -26. igénypontok bármelyike szerinti diszacharidot; és- egy gyógyászatilag elfogadható vivő- vagy hígítóanyagot.
- 32. Egy, az 1-26. igénypontok bármelyike szerinti diszacharid immunmodulátor és/vagy tumorellenes ágensként történő alkalmazásra.
- 33. Egy, az 1-26. igénypontok bármelyike szerinti diszacharid alkalmazása vakcinakomponensként.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP93203223 | 1993-11-17 | ||
PCT/EP1994/003852 WO1995014026A1 (en) | 1993-11-17 | 1994-11-17 | Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9601312D0 HU9601312D0 (en) | 1996-07-29 |
HUT74738A HUT74738A (en) | 1997-02-28 |
HU219810B true HU219810B (hu) | 2001-08-28 |
Family
ID=8214175
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9601312A HU219810B (hu) | 1993-11-17 | 1994-11-17 | Glükózamin-diszacharidok, eljárás előállításukra és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint alkalmazásuk |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6005099A (hu) |
EP (1) | EP0729473B1 (hu) |
JP (1) | JP3967769B2 (hu) |
KR (1) | KR100355470B1 (hu) |
CN (1) | CN1055093C (hu) |
AT (1) | ATE195740T1 (hu) |
AU (1) | AU700485B2 (hu) |
BR (1) | BR9408071A (hu) |
CA (1) | CA2175375C (hu) |
CZ (1) | CZ290331B6 (hu) |
DE (1) | DE69425671T2 (hu) |
DK (1) | DK0729473T3 (hu) |
ES (1) | ES2149340T3 (hu) |
GR (1) | GR3034872T3 (hu) |
HU (1) | HU219810B (hu) |
PL (1) | PL181241B1 (hu) |
PT (1) | PT729473E (hu) |
RO (1) | RO115731B1 (hu) |
RU (1) | RU2154068C2 (hu) |
SI (1) | SI0729473T1 (hu) |
SK (1) | SK281944B6 (hu) |
WO (1) | WO1995014026A1 (hu) |
Families Citing this family (131)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1168702C (zh) * | 1998-06-30 | 2004-09-29 | Om药业 | 酰基-二肽类化合物,其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物 |
TW527358B (en) | 1999-02-10 | 2003-04-11 | Sankyo Co | Ether type lipid A1 position carboxylic acid analogue |
US7776343B1 (en) | 1999-02-17 | 2010-08-17 | Csl Limited | Immunogenic complexes and methods relating thereto |
JP2003514824A (ja) * | 1999-11-15 | 2003-04-22 | ビオミラ,インコーポレーテッド | 合成脂質−a類似体およびその使用 |
AU1581400A (en) | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Om Pharma | Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer |
KR100898844B1 (ko) * | 1999-12-22 | 2009-05-21 | 옴 파르마 | 작용기화된 보조 아암을 가진 아실 슈도디펩티드 |
ES2377077T3 (es) | 2000-10-18 | 2012-03-22 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vacunas que comprenden al antígeno MAGE unido a un fragmento de proteína D |
KR100465229B1 (ko) * | 2001-04-09 | 2005-01-13 | 주식회사 안지오랩 | 2-아미노-2-데옥시-d-글루코피라노오즈 또는 그의약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 혈관신생억제용 약학적 조성물 |
EP1528937B1 (en) * | 2001-06-05 | 2016-08-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Nanoemulsion vaccines |
NZ539509A (en) | 2002-10-23 | 2008-05-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Priming vaccine comprising a polynucleotide encoding at least one first malarial antigen and a boosting vaccine comprising at least one polypeptide comprising at least one second malarial antigen having at least one epitope in common with the first malarial antigen of the priming vaccine |
GB0321615D0 (en) | 2003-09-15 | 2003-10-15 | Glaxo Group Ltd | Improvements in vaccination |
CA2565500A1 (en) | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant |
WO2006095270A1 (en) * | 2005-03-10 | 2006-09-14 | Om Pharma | Combination anticancer therapy or om-174 and pharmaceutical compositions therefor |
RU2396960C2 (ru) * | 2004-07-23 | 2010-08-20 | Ом Фарма | Комбинированная противоопухолевая терапия и фармацевтические композиции для нее |
GB0417494D0 (en) | 2004-08-05 | 2004-09-08 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
US20060210590A1 (en) | 2005-02-03 | 2006-09-21 | Alk-Abello A/S | Minor allergen control to increase safety of immunotherapy |
GB0503337D0 (en) | 2005-02-17 | 2005-03-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Compositions |
PL1861120T3 (pl) | 2005-03-23 | 2016-11-30 | Zastosowanie wirusa grypy i adiuwantu emulsji olej-w-wodzie do indukcji komórek t cd4+ i/lub ulepszonej odpowiedzi komórek b pamięci | |
MY150719A (en) | 2005-12-22 | 2014-02-28 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine |
GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
KR101541383B1 (ko) | 2006-03-30 | 2015-08-03 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 면역원성 조성물 |
KR100780868B1 (ko) * | 2006-07-10 | 2007-11-30 | 부경대학교 산학협력단 | 항암효과를 나타내는 4급 아미노 글루코사민 화합물 |
EP2422810B1 (en) | 2006-07-17 | 2014-10-22 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Influenza vaccine |
CA2657279A1 (en) | 2006-07-18 | 2008-01-24 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccines for malaria |
GB2453475B (en) | 2006-07-25 | 2011-01-19 | Secr Defence | Live vaccine strain |
US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
JP5443164B2 (ja) | 2006-09-26 | 2014-03-19 | インフェクティアス ディジーズ リサーチ インスティチュート | 合成アジュバントを含むワクチン組成物 |
EP2086582B1 (en) | 2006-10-12 | 2012-11-14 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant |
WO2008059307A2 (en) * | 2006-11-16 | 2008-05-22 | Om Pharma | Functionalized beta 1,6 glucosamine disaccharides and process for their preparation |
MX2009009342A (es) | 2007-03-02 | 2009-09-11 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Metodo novedoso y composiciones. |
PT2114421T (pt) | 2007-03-05 | 2018-04-17 | Om Pharma | Extrato bacteriano para distúrbios respiratórios e processo para a sua preparação |
AR066405A1 (es) | 2007-04-20 | 2009-08-19 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna |
US9610340B2 (en) | 2007-06-26 | 2017-04-04 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccine comprising Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates |
AU2008352942B2 (en) | 2007-12-19 | 2013-09-12 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Soluble forms of Hendra and Nipah virus F glycoprotein and uses thereof |
RS55162B1 (sr) | 2007-12-24 | 2017-01-31 | Id Biomedical Corp Quebec | Rekombinantni rsv antigeni |
RS54306B1 (en) | 2008-04-16 | 2016-02-29 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | THE VACCINE |
WO2010033274A2 (en) * | 2008-05-23 | 2010-03-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Nanoemulsion adjuvants |
CA2826508C (en) | 2008-05-23 | 2016-07-19 | The Regents Of The University Of Michigan | Nanoemulsion vaccines |
WO2009155489A2 (en) | 2008-06-19 | 2009-12-23 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating influenza |
WO2010036938A2 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Nanobio Corporation | Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same |
CN102325790A (zh) | 2008-12-03 | 2012-01-18 | 西马生物医学计划公司 | 应用酚可溶性调控蛋白研制疫苗 |
WO2010079081A1 (en) | 2009-01-07 | 2010-07-15 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Methods for recovering a virus or a viral antigen produced by cell culture |
GB0901411D0 (en) | 2009-01-29 | 2009-03-11 | Secr Defence | Treatment |
GB0901423D0 (en) | 2009-01-29 | 2009-03-11 | Secr Defence | Treatment |
WO2010089339A1 (en) | 2009-02-06 | 2010-08-12 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Purification of virus or viral antigens by density gradient ultracentrifugation |
NZ700477A (en) | 2009-02-17 | 2016-04-29 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant |
GB0906234D0 (en) | 2009-04-14 | 2009-05-20 | Secr Defence | Vaccine |
US20110097418A1 (en) * | 2009-05-29 | 2011-04-28 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating influenza |
DK2437753T3 (en) | 2009-06-05 | 2016-12-19 | Infectious Disease Res Inst | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants and vaccine compositions containing them |
JP6110140B2 (ja) * | 2009-06-16 | 2017-04-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァシティ オブ ミシガン | ナノエマルションワクチン |
CA2766205A1 (en) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine comprising at least two paramyxovirus f protein antigens |
PE20121541A1 (es) | 2009-06-24 | 2012-12-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de virus de sincicio respiratorio recombinantes |
US9907746B2 (en) | 2009-07-06 | 2018-03-06 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
EP2451950B9 (en) | 2009-07-06 | 2016-11-23 | Variation Biotechnologies Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
EP4218799A1 (en) | 2009-07-15 | 2023-08-02 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Rsv f protein compositions and methods for making same |
GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
US9341623B2 (en) | 2009-09-25 | 2016-05-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunodiffusion assay for influenza virus |
GB0919117D0 (en) | 2009-10-30 | 2009-12-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Process |
WO2011101332A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma |
US20110229512A1 (en) * | 2010-03-19 | 2011-09-22 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for diagnosing and treating urinary tract infections |
WO2011138229A1 (en) | 2010-05-03 | 2011-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel method |
GB201009273D0 (en) | 2010-06-03 | 2010-07-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel vaccine |
US8658603B2 (en) | 2010-06-16 | 2014-02-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for inducing an immune response |
CA2840079C (en) | 2010-07-06 | 2018-07-03 | Variation Biotechnologies Inc. | Compositions and methods for treating influenza |
US9168292B2 (en) | 2010-09-27 | 2015-10-27 | Crucell Holland B.V. | Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria |
WO2012049317A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel antigen |
BR112013017939B1 (pt) | 2011-01-13 | 2022-11-16 | Variation Biotechnologies Inc | Composição imunogênica liofilizada termoestável, uso e método para preparação da mesma |
EP2663288B1 (en) | 2011-01-13 | 2022-12-21 | Variation Biotechnologies Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
EP2505640A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-03 | Neo Virnatech, S.L. | Vaccine compositions for birnavirus-borne diseases |
EP3632463A1 (en) | 2011-04-08 | 2020-04-08 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
AR086405A1 (es) | 2011-05-17 | 2013-12-11 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna de streptococcus pneumoniae |
ES2729278T3 (es) | 2011-09-16 | 2019-10-31 | Ucb Biopharma Sprl | Anticuerpos neutralizantes de las exotoxinas principales tcda y tcdb de Clostridium difficile |
US20130122038A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department | Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines |
WO2013104995A2 (en) | 2012-01-12 | 2013-07-18 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating viral infections |
AU2013213345A1 (en) | 2012-01-27 | 2014-08-28 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for therapeutic agents |
US20150110824A1 (en) | 2012-03-18 | 2015-04-23 | Glaxosmithkline Biologicals, Sa | Method of vaccination against human papillomavirus |
US9518078B2 (en) * | 2012-04-12 | 2016-12-13 | Avanti Polar Lipids, Inc. | Disaccharide synthetic lipid compounds and uses thereof |
US9241988B2 (en) * | 2012-04-12 | 2016-01-26 | Avanti Polar Lipids, Inc. | Disaccharide synthetic lipid compounds and uses thereof |
NZ701881A (en) | 2012-05-16 | 2016-10-28 | Immune Design Corp | Vaccines for hsv-2 |
US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
SG11201500573RA (en) | 2012-08-06 | 2015-02-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method for eliciting in infants an immune response against rsv and b. pertussis |
US10058603B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine |
US8957047B2 (en) | 2013-04-18 | 2015-02-17 | Immune Design Corp. | GLA monotherapy for use in cancer treatment |
US11052142B2 (en) * | 2013-06-04 | 2021-07-06 | Petr G. Aparin | Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants) |
US9463198B2 (en) * | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
EA031879B1 (ru) * | 2013-06-04 | 2019-03-29 | Пётр Геннадиевич Апарин | Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты) |
EP3030260A1 (en) | 2013-08-05 | 2016-06-15 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Combination immunogenic compositions |
JP6851827B2 (ja) | 2013-08-30 | 2021-03-31 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 細胞培養中でのウイルスの大規模製造 |
CN104436157A (zh) | 2013-09-23 | 2015-03-25 | 恩金生物有限公司 | 流感疫苗和治疗 |
CA2928700C (en) | 2013-11-01 | 2019-01-15 | University Of Oslo | Albumin variants and uses thereof |
WO2015071763A2 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Oslo Universitetssykehus Hf | Ctl peptide epitopes and antigen-specific t cells, methods for their discovery, and uses thereof |
WO2015092710A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Contralateral co-administration of vaccines |
US10821175B2 (en) | 2014-02-25 | 2020-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems |
WO2015165480A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same |
US11571472B2 (en) | 2014-06-13 | 2023-02-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic combinations |
EP3204039B1 (en) | 2014-10-10 | 2022-06-08 | The Regents Of The University Of Michigan | Nanoemulsion compositions for preventing, suppressing or eliminating allergic and inflammatory disease |
WO2016140702A1 (en) | 2015-03-03 | 2016-09-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Serivces | Display platform from bacterial spore coat proteins |
EP4226937A3 (en) | 2015-03-05 | 2023-09-27 | Northwestern University | Non-neuroinvasive viruses and uses thereof |
WO2016207730A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | The University Of Oslo | Targeting of vaccine antigen to an intracellular compartment |
US20180186897A1 (en) | 2015-06-26 | 2018-07-05 | Institute For Research In Biomedicine | Novel vaccines in prevention and treatment of malaria |
CN116239693A (zh) | 2016-03-14 | 2023-06-09 | 奥斯陆大学 | 具有改变的FcRn结合的工程化免疫球蛋白 |
WO2017158421A1 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | University Of Oslo | Anti-viral engineered immunoglobulins |
US11173207B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-11-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Adjuvant compositions |
EP3471761A2 (en) | 2016-06-21 | 2019-04-24 | University Of Oslo | Hla binding vaccine moieties and uses thereof |
CA3034124A1 (en) | 2016-08-23 | 2018-03-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74) |
GB201614799D0 (en) | 2016-09-01 | 2016-10-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions |
US11466292B2 (en) | 2016-09-29 | 2022-10-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions and methods of treatment |
WO2018096396A1 (en) | 2016-11-22 | 2018-05-31 | University Of Oslo | Albumin variants and uses thereof |
GB201620968D0 (en) | 2016-12-09 | 2017-01-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adenovirus polynucleotides and polypeptides |
US11084850B2 (en) | 2016-12-16 | 2021-08-10 | The Pirbright Institute | Recombinant prefusion RSV F proteins and uses thereof |
WO2018162450A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-13 | Fundación Para La Investigación Médica Aplicada | New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells |
EA201992434A1 (ru) | 2017-04-19 | 2020-03-30 | Инститьют Фор Рисерч Ин Байомедисин | Новые противомалярийные вакцины и антитела, связывающиеся со спорозоитами плазмодия |
WO2018229708A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Method of treatment |
EP3678698A1 (en) | 2017-09-07 | 2020-07-15 | University Of Oslo | Vaccine molecules |
EP3678699A1 (en) | 2017-09-07 | 2020-07-15 | University Of Oslo | Vaccine molecules |
WO2019051149A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Infectious Disease Research Institute | LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SAPONIN AND METHODS OF USE |
GB201721069D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis B Immunisation regimen and compositions |
GB201721068D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis B immunisation regimen and compositions |
KR20200123436A (ko) | 2018-02-12 | 2020-10-29 | 이니뮨 코퍼레이션 | 톨-유사 수용체 리간드 |
CA3102224A1 (en) | 2018-06-12 | 2019-12-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Chimpanzee adenovirus chad157 polynucleotides, polypeptides.vectors, compositions, cells and uses thereof |
EP3581201A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-18 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof |
US20210283238A1 (en) | 2018-08-07 | 2021-09-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel processes and vaccines |
WO2020128012A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Methods of inducing an immune response |
CN113573730A (zh) | 2019-03-05 | 2021-10-29 | 葛兰素史密斯克莱生物公司 | 乙型肝炎免疫方案和组合物 |
EP4004018A1 (en) | 2019-07-24 | 2022-06-01 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Modified human cytomegalovirus proteins |
US20240115688A1 (en) | 2020-12-02 | 2024-04-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel Antigens |
WO2022161598A1 (en) | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Eth Zurich | Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof |
WO2022162012A2 (en) | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Eth Zurich | Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof |
WO2023114727A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-06-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Bacteriophage lambda-vaccine system |
WO2023144665A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified human cytomegalovirus proteins |
WO2024133160A1 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis b compositions |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8501582A (nl) * | 1985-02-12 | 1986-09-01 | Philips Nv | Videosignaalverwerkingsschakeling voor de verwerking van een geinterlinieerd videosignaal. |
GR860379B (en) * | 1985-02-22 | 1986-06-11 | Akzo Nv | Novel disaccharide and trisaccharide derivatives of the lipid a type |
US4912094B1 (en) * | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
US5158939A (en) * | 1989-07-21 | 1992-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of stimulating the immune systems of animals and compositions useful therefor |
JPH06206893A (ja) * | 1992-09-07 | 1994-07-26 | Suntory Ltd | 新規なジサッカライド誘導体 |
-
1994
- 1994-11-17 HU HU9601312A patent/HU219810B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 WO PCT/EP1994/003852 patent/WO1995014026A1/en active IP Right Grant
- 1994-11-17 BR BR9408071A patent/BR9408071A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-11-17 JP JP51423395A patent/JP3967769B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-17 US US08/648,022 patent/US6005099A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 AT AT95903265T patent/ATE195740T1/de active
- 1994-11-17 ES ES95903265T patent/ES2149340T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 CN CN94194201A patent/CN1055093C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-17 CA CA002175375A patent/CA2175375C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-17 SK SK613-96A patent/SK281944B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 KR KR1019960702587A patent/KR100355470B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 EP EP95903265A patent/EP0729473B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 SI SI9430340T patent/SI0729473T1/xx unknown
- 1994-11-17 PL PL94314494A patent/PL181241B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 RO RO96-00978A patent/RO115731B1/ro unknown
- 1994-11-17 AU AU12194/95A patent/AU700485B2/en not_active Ceased
- 1994-11-17 DE DE69425671T patent/DE69425671T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 RU RU96113100/04A patent/RU2154068C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 PT PT95903265T patent/PT729473E/pt unknown
- 1994-11-17 CZ CZ19961418A patent/CZ290331B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 DK DK95903265T patent/DK0729473T3/da active
-
2000
- 2000-11-16 GR GR20000402561T patent/GR3034872T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0729473B1 (en) | 2000-08-23 |
EP0729473A1 (en) | 1996-09-04 |
CZ141896A3 (en) | 1996-10-16 |
CN1137799A (zh) | 1996-12-11 |
RO115731B1 (ro) | 2000-05-30 |
HUT74738A (en) | 1997-02-28 |
SK281944B6 (sk) | 2001-09-11 |
PL181241B1 (pl) | 2001-06-29 |
US6005099A (en) | 1999-12-21 |
JPH09505071A (ja) | 1997-05-20 |
GR3034872T3 (en) | 2001-02-28 |
SK61396A3 (en) | 1996-11-06 |
BR9408071A (pt) | 1996-12-24 |
CA2175375C (en) | 2010-01-05 |
RU2154068C2 (ru) | 2000-08-10 |
ES2149340T3 (es) | 2000-11-01 |
WO1995014026A1 (en) | 1995-05-26 |
CN1055093C (zh) | 2000-08-02 |
CA2175375A1 (en) | 1995-05-26 |
AU700485B2 (en) | 1999-01-07 |
ATE195740T1 (de) | 2000-09-15 |
PL314494A1 (en) | 1996-09-16 |
CZ290331B6 (cs) | 2002-07-17 |
DK0729473T3 (da) | 2000-10-30 |
DE69425671D1 (de) | 2000-09-28 |
SI0729473T1 (en) | 2001-02-28 |
AU1219495A (en) | 1995-06-06 |
HU9601312D0 (en) | 1996-07-29 |
KR100355470B1 (ko) | 2003-02-17 |
PT729473E (pt) | 2001-02-28 |
DE69425671T2 (de) | 2001-04-19 |
JP3967769B2 (ja) | 2007-08-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU219810B (hu) | Glükózamin-diszacharidok, eljárás előállításukra és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint alkalmazásuk | |
US9309276B2 (en) | Synthetic lipid A derivative | |
DE69032206T2 (de) | Lipid-a-derivate sowie deren verwendungen | |
Holst et al. | Preparation and structural analysis of oligosaccharide monophosphates obtained from the lipopolysaccharide of recombinant strains of Salmonella minnesota and Escherichia coli expressing the genus‐specific epitope of Chlamydia lipopolysaccharide | |
US5648343A (en) | Method for treating LPS-mediated disorders | |
RU2481352C2 (ru) | Функционализированные бета 1,6 глюкозамин-дисахариды и способ их получения | |
JP2013502456A (ja) | リポタイコ酸由来の糖脂質及びこれを含む組成物 | |
Vinogradov et al. | The structure of the carbohydrate backbone of the lipopolysaccharide from Acinetobacter strain ATCC 17905 | |
GB2179945A (en) | New saccharides, their preparation and pharmacetical compositions containing them | |
HU201559B (en) | Process for producing saccharide derivatives | |
Iida et al. | Chemical structure of lipid A isolated from Comamonas testosteroni lipopolysaccharide | |
EP0668289A1 (en) | Novel disaccharide derivative | |
INAGAKI et al. | Constituents of Crinoidea. 1. Isolaton and Structure of Inositolphosphocermide from the Feather Star Comanthus japonica | |
FI81807B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av 2,3-diamino-2,3-didesoxyhexosderivativer. | |
US5654289A (en) | Disaccharide derivative | |
FR2931480A1 (fr) | Analogues synthetiques de phosphatidyl-myo-inositol mannosides pourvus d'une active inhibitrice de la reponse inflammatoire | |
Likhosherstov et al. | Synthesis of mono-and di-α-l-fucosylated 2-acetamido-2-deoxy-N-glycyl-β-d-glucopyranosylamines, spacered fragments of glycans of N-glycoproteins | |
Vorobeva et al. | An unusual lipid A from a marine bacterium Chryseobacterium scophtalmum CIP 104199 T | |
JPH06206893A (ja) | 新規なジサッカライド誘導体 | |
JP2519074B2 (ja) | α,α−トレハロ−ストリミコ−ル酸エステルおよび医薬組成物 | |
JPS624297A (ja) | 新規糖類、その製法および医薬組成物 | |
JP4500008B2 (ja) | 新規な二糖類、それを含有する組成物及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: OM PHARMA, CH |
|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |