HU219767B - Készítmények és eljárások genetikai anyag sejtbe történő beviteléhez - Google Patents

Készítmények és eljárások genetikai anyag sejtbe történő beviteléhez Download PDF

Info

Publication number
HU219767B
HU219767B HU9502229A HU9502229A HU219767B HU 219767 B HU219767 B HU 219767B HU 9502229 A HU9502229 A HU 9502229A HU 9502229 A HU9502229 A HU 9502229A HU 219767 B HU219767 B HU 219767B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
hiv
nucleic acid
plasmid
dna
Prior art date
Application number
HU9502229A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT73099A (en
HU9502229D0 (en
Inventor
Leslie R. Coney
Michael J. Merva
Bin Wang
David B. Weiner
William V. Williams
Vincent R. Zurawski
Original Assignee
Leslie R. Coney
Michael J. Merva
Bin Wang
David B. Weiner
William V. Williams
Vincent R. Zurawski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/125,012 external-priority patent/US5593972A/en
Application filed by Leslie R. Coney, Michael J. Merva, Bin Wang, David B. Weiner, William V. Williams, Vincent R. Zurawski filed Critical Leslie R. Coney
Priority claimed from US08/979,385 external-priority patent/US5981505A/en
Publication of HU9502229D0 publication Critical patent/HU9502229D0/hu
Publication of HUT73099A publication Critical patent/HUT73099A/hu
Priority claimed from US09/359,975 external-priority patent/US7001759B1/en
Publication of HU219767B publication Critical patent/HU219767B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárások genetikai anyag sejtekbe történőbeviteléhez, valamint készítmények és készletek az említett eljárásokmegvalósításához. Az eljárások során a sejteket polinukleotidműködéstfokozó szerrel hozzák érintkezésbe, majd a sejtekbe retrovírus-részecskéktől mentes nukleinsavmolekulát adnak be. A beadottnukleinsavmolekula olyan nukleotidszekvenciát foglal magában, amelyegy patogén antigén vagy hiperproliferatív betegséggel vagyautoimmunbetegséggel kapcsolatos antigén epitópjával azonos vagy ahhozlényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó proteint; apáciensből hiányzó, működésképtelen vagy részlegesen működő gén miatthiányzó proteint; vagy a páciensben gyógyhatást kifejtő proteintkódol. Eljárásokat írtak le HIV elleni profilaktikus vagy terápiásimmunizálásra, továbbá gyógyszerészeti készítményeket és készleteketírtak le a találmány szerinti eljárások megvalósításához. ŕ

Description

A találmány tárgya készítmények és eljárások genetikai anyag élő szervezet sejtjeibe történő beviteléhez. A találmány szerinti készítmények és eljárások protektív és/vagy gyógyászati hatású anyagok (beleértve az immunizáláshoz alkalmazható protein targeteket és gyógyhatású proteineket kódoló genetikai anyagot) beviteléhez alkalmazhatók.
Normális, működőképes gén élő állatba történő közvetlen bevitelét a hibás genetikai információ kicserélésének eszközeként tanulmányozták. Néhány vizsgálatban DNS-t vírusrészecskék vagy egyéb fertőző vektorok felhasználása nélkül vittek be közvetlenül élő állat sejtjeibe. Nabel, E. G. és munkatársai (Science, 249, 1285-1288, 1990) egérartéria-falba közvetlenül átvitt β-galaktozidáz-gén in vivő helyspecifikus génexpresszióját írták le. Wolfe, J. A. és munkatársai (Science, 247, 1465-1468, 1990) egérizomba in vivő közvetlenül átvitt különböző riportergének expresszióját írták le. Acsadi, G. és munkatársai (Natúré, 352, 815-818, 1991) DNS-konstrukciók intramuszkuláris injektálása után humán dystrophingén egérben történő expresszálását írták le. Wolfe, J. A. és munkatársai (BioTechniques, 11 (4), 474-485,1991) (amelyet itt hivatkozásul említünk) a rágcsáló izomba történő közvetlen génátvitelt befolyásoló körülményeket elemezték. Felgner, P. L. és G. Rhodes (Natúré, 349, 351-352, 1991) tisztított gének gyógyszerhatóanyagokként retrovírusok alkalmazása nélkül végzett közvetlen in vivő bevitelét írták le.
Alternatív, patogénellenes vakcinálási eljárásként elvetették a közvetlen génátvitel alkalmazását. A HÍV elleni lehetséges vakcinálási módként az egyszeri injektálással végzett közvetlen génátvitel alkalmazását javasolták. Beszámoltak arról, hogy HIV-gpl20-at kódoló plazmid DNS-sejtbe történő bevitele hatására a HIV-gpl20 ellen immunreakciót tapasztaltak. A PCT/US 90/01515 számú, 1990. október 4-én közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben eljárásokat írtak le egy páciens patogén fertőzés elleni immunizálására, melynek során a páciens sejtjeibe egy lépésben közvetlenül csupasz polinukleotidokat injektáltak. Transzfektálószerként a lipofektinen kívül minden más szer alkalmazását kizárták a leírt eljárásokból. A beoltott sejtek stimulálását nem írták le, s nem is javasolták. Olyan HÍV elleni vakcinálást bocsátottak közre, amely a gpl20 vírusproteint kódoló polinukleotidok beviteléből áll. A vakcina működőképessége nem bizonyított.
Thomason, D. B. és munkatársai (Cell Physiol., 27, C578-581, 1990; és WO 91/12329 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) leírták, hogy a retrovírus közvetett génbeviteli eljárás részeként a szatellita sejtproliferáció indukálása érdekében izomsejtekbe bupivacaint adtak.
A találmány tárgya eljárások genetikai anyag páciens sejtjeibe történő bevitelére. Az eljárások során az említett páciens sejtjeit először polinukleotidműködést fokozó szerrel hozzuk érintkezésbe, amely előnyösen olyan szer, ami elősegíti a sejtek DNS-felvételét vagy gyulladási reakciót fokoz; majd a sejtekbe olyan nukleotidszekvenciából álló nukleinsavmolekulát viszünk be, amely kívánt peptidet vagy proteint kódol, vagy amely a működő nukleinsavmolekulák számára templátként szolgál. A nukleinsavmolekulát retrovírus-részecskék nélkül visszük be a sejtekbe. A kívánt protein egyrészt lehet a kezelt személy szervezetében funkcionáló protein, másrészt immunreakció számára targetként szolgálhat.
A találmány további tárgya eljárás egy személy patogén elleni immunizálására. Az eljárás során az említett személy sejtjeit először polinukleotidműködést fokozó szerrel hozzuk érintkezésbe, amely előnyösen olyan szer, ami elősegíti a sejtek DNS-felvételét vagy fokozza az immunreakciót; majd a sejtekbe olyan nukleotidszekvenciából álló nukleinsavmolekulát viszünk be, amely egy patogén antigénen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó peptidet kódol, s amely a szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik. A nukleinsavmolekula a kezelt személy sejtjeiben expresszálható.
A találmány további tárgya eljárás ember immunizálására HÍV ellen. Az eljárás során a páciensnek olyan nukleotidszekvenciából álló nukleinsavmolekulát adunk be, amely egy HIV-proteinen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó peptidet kódol, s amely a szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik.
A találmány további tárgya eljárás ember immunizálására HÍV ellen. Az eljárás során a páciens különböző sejtjeibe két különböző nukleinsavmolekulát viszünk be. Mindkét nukleinsavmolekula olyan nukleotidszekvenciából áll, amely egy HIV-proteinen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó peptidet kódol, s amely a szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik. A két különböző nukleinsavmolekula különböző nukleotidszekvenciákat tartalmaz, melyek legalább egy, a másik szekvencia által kódolt peptidtől eltérő peptidet kódolnak, s humán sejtekben mindkettő expresszálható.
A találmány további tárgya eljárások egy személy immunizálására hiperproliferatív vagy autoimmunbetegség ellen. Az eljárás során a páciensnek olyan nukleotidszekvenciából álló nukleinsavmolekulát adunk be, amely hiperproliferatív betegséggel, illetve autoimmunbetegséggel kapcsolatos proteinen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó peptidet kódol, s amely a szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik. Az alkalmazott nukleinsavmolekula a páciens sejtjeiben expresszálható.
A találmány további tárgya eljárások egy betegségben szenvedő személy kezelésére. Az eljárások során az említett személy sejtjeit először polinukleotidműködést fokozó szerrel hozzuk érintkezésbe, amely előnyösen olyan szer, ami elősegíti a sejtek DNS-felvételét vagy gyulladási reakciót fokoz; majd a személy sejtjeibe olyan nukleotidszekvenciából álló nukleinsavmolekulát viszünk be, amely egy hibás gén helyett működik, vagy amely a páciensben gyógyhatást kiváltó molekulát kódol, s amely a szabályozószekvenciákhoz műkö2
HU 219 767 Β dőképesen kapcsolódik. Az alkalmazott nukleinsavmolekula a páciens sejtjeiben expresszálható.
A találmány további tárgya gyógyszerészeti készítmények, amelyek nukleinsavmolekulát és polinukleotidműködést fokozó szert tartalmaznak. A találmány egy másik tárgya gyógyszerészeti készletek (kit), melyek egy tartályban nukleinsavmolekulát, egy másik tartályban pedig polinukleotidműködést fokozó szert tartalmaznak.
A találmány további tárgya profilaktikus és gyógyhatású HIV-vakcinák, melyek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóból vagy diluensből és olyan nukleinsavmolekulából állnak, amely legalább egy HlV-proteinen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó egy vagy több peptidet kódol, s amely a szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik. Az alkalmazott nukleinsavmolekula a páciens sejtjeiben expresszálható.
A találmány további tárgya profilaktikus és gyógyhatású HIV-vakcinák, melyek két oltóanyagból állnak. Az első oltóanyag gyógyszerészetileg elfogadható hordozót vagy diluenst és egy első nukleinsavmolekulát tartalmaz. Az első nukleinsavmolekula legalább egy HIV-proteinen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó egy vagy több peptidet kódoló nukleotidszekvenciából áll, amely szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik; a nukleinsavmolekula humán sejtekben expresszálható. A második oltóanyag gyógyszerészetileg elfogadható hordozót vagy diluenst és egy második nukleinsavmolekulát tartalmaz. A második nukleinsavmolekula legalább egy HIV-proteinen található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó egy vagy több peptidet kódoló nukleotidszekvenciából áll, amely a szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódik; a nukleinsavmolekula humán sejtekben expresszálható. Az első és második nukleinsavmolekula különbözik egymástól, s eltérő peptideket kódol.
Az ábrák rövid leírása
Az 1A. ábrán a pM160 plazmid összeállítását mutatjuk be. A plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a HIV-HXB2 gpl60 glikoproteint kódoló, PCR-tecímikával előállított fragmenst a pMAMweoBlue plazmidba (Clonetech) inszertáltuk.
Az IB. ábrán a pM160 plazmiddal (3G7 sejtek) és a vektorral önmagában (TE671 sejtek) transzfektált sejtek teljes sejtes lizátumaival végzett Westem-blot analízis autoradiogramját mutatjuk be. A képen látható, hogy a 3G7 sejtekben van gpl20- és gp41-termelés, a TE671 sejtekben azonban nincs.
A 2. ábrán 125I-pgl60-hoz kötődő szérumantitestek immunprecipitátumainak autoradiogramja látható.
A 3A-3E. ábrákon grafikonon mutatjuk be a különböző szérumok mikrotiterlemezeken immobilizált különböző proteinekhez való kötődésével végzett ELISAvizsgálatok eredményeit.
A 4A. és 4B. ábrán antiszérum sorozathígítással preinkubált TCID5OHIV-1/IIIB sejtmentes vírussal fertőzött MT-2 sejtek fényképei láthatók.
A 4C. ábrán a kontrollszérum (x=pMAMneoBlue vektorral immunizált egerek) és a vizsgálati szérum (o=pM 160-nal immunizált egerek) alkalmazásával kapott eredmények alapján a hígítási faktorok függvényében grafikusan mutatjuk be a semlegesítési értékeket (Vn/V0).
A 4D-4G. ábrákon az immunizált és kontrollállatokból származó szérum alkalmazásával szincitiális gátlás vizsgálatára végzett kísérletekben használt H9/IIIB sejtek fényképei láthatók.
Az 5. ábrán oszlopgrafikonon mutatjuk be a HIV-gpl60-nal jelölt és jelöletlen tumorsejtekkel immunpróbázott immunizált és immunizálatlan egerek túlélési idejét. Az egereket rekombináns gpl60 proteinnel, csak vektor-DNS-sel vagy a gpl60-at kódoló DNS-t tartalmazó vektorral immunizáltuk. Az egerekbe SP2/0 vagy SP2/0-gpl60 (gpl60-at kódoló DNSsel transzfektált és gpl60-at expresszáló SP2/0 sejtek) tumorsejteket vittünk be.
A 6. ábrán a pGAGPOL.rev. plazmid térképe látható.
A 7. ábrán a pENV plazmid térképét mutatjuk be.
A 8. ábrán a genetikai konstrukciók előállításához alkalmazott A, B, C és D gerincvázat mutatjuk be.
A 9. ábrán az 1., 2., 3. és 4. inszertet mutatjuk be, melyeket a genetikái konstrukciók előállítása érdekében a gerincvázakba inszertáltunk.
A találmány tárgya eljárás nukleinsavmolekulák állat sejtjeibe történő bevitelére, mely eljárás a nukleinsavmolekulák nagyarányú felvételét és magas szintű működését biztosítja. A találmány szerinti eljárás során a páciens sejtjeibe (olyan kiegészítőszerrel együtt, amely fokozza a gyulladásos reakciót és/vagy fokozza a nukleinsavmolekula expresszióját a szövetben és/vagy elősegíti a sejt nukleinsavfelvételét) vírusrészektől, elsősorban retrovírusrészektől mentes nukleinsavmolekulákat viszünk be. A találmány előnyben részesített megvalósítási módjai olyan eljárásokat biztosítanak, melyekkel a nukleinsavmolekulák fertőző anyagok alkalmazása nélkül juttathatók a sejtekbe.
A találmány szerint sejtekbe juttatott nukleinsavmolekulák (1) profilaktikus vagy gyógyászati hatású immunizálóanyagokként funkcionáló proteinek genetikai templátjaiként;
(2) a hibás, hiányzó vagy nem működő gének helyettesítő példányaiként;
(3) gyógyhatású proteinek templátjaiként;
(4) antiszensz molekulák genetikai templátjaiként; vagy (5) ribozimok genetikai templátjaiként szolgálhatnak.
A proteineket kódoló nukleinsavmolekulák esetében a nukleinsavmolekulák előnyösen tartalmazzák az állat sejtjeiben lejátszódó transzkripcióhoz és transzlációhoz szükséges szabályozó- (regulátor-)szekvenciákat. Az antiszensz molekulák és ribozimok templátjaiként szolgáló nukleinsavmolekulák esetében a nukleinsavmolekulák előnyösen az általuk kódolt antiszensz, illetve ribozim molekulák elegendő példányának termelődéséhez szükséges szabályozóelemekhez kapcsolódnak. A nukleinsavmolekulák retrovírusrészektől mente3
HU 219 767 Β sek, s e molekulákat előnyösen plazmid alakban álló DNS-ként alkalmazzuk.
A kiegészítőszert más néven „polinukleotidműködést fokozó szerként” vagy „PFE”-ként („polynucleotide function enhancer”) is említjük. A PFE olyan vegyület vagy készítmény, amely fokozza a gyulladásos reakciót és/vagy fokozza a nukleinsavmolekula expresszióját a szövetben és/vagy elősegíti a sejt nukleinsavfelvételét, és előnyösen e tulajdonságok közül egynél többel rendelkezik. Azon polinukleotidműködést fokozó szereket, melyek elősegítik a sejt DNS- vagy RNS-felvételét és serkentik a sejtosztódást, sejtstimuláló szerekként is említjük. A találmány szerinti előnyben részesített kiegészítőszerek benzoesav-észterek és anilidek közül származnak. Az előnyben részesített megvalósítási módokban PFE-ként bupivacaint alkalmazunk.
A találmány néhány vonatkozásának megfelelően olyan készítményeket és eljárásokat bocsátunk rendelkezésre, melyekkel a páciens profilaktikusan és/vagy gyógykezelésszerűen patogén vagy abnormális, betegséggel kapcsolatos sejt ellen immunizálható. A genetikai anyag olyan pepiidet vagy proteint kódol, amely a patogénen vagy a megcélozni kívánt sejtekben található immunogén proteinnel legalább egy közös epitóppal rendelkezik. A genetikai anyagot a páciens sejtjei expresszálják, s immunogén targetként szolgál, amely ellen immunreakció váltható ki. A kiváltott immunreakció széles körű; a Immorális immunreakción kívül a celluláris immunreakció mindkét változata megjelenik. A találmány szerinti eljárások a profilaktikus és gyógyhatású immunitás biztosítására egyaránt alkalmasak. Ennek megfelelően, az immunizálási eljárás magában foglalja mind a páciens patogének hatásától, illetve specifikus sejtek megjelenésétől vagy proliferációjától való megóvását, mind a patogén okozta fertőzésben, hiperproliferatív betegségben vagy autoimmunbetegségben szenvedő páciens kezelését.
A találmány szerinti készítmények és eljárások alkalmasak targetprotein elleni, azaz a patogénekkel vagy a páciens saját „abnormális” sejtjeivel specifikus kapcsolatban álló protein elleni széles körű immunreakciók kiváltására; kezelt személyek patogén anyagok vagy szervezetek elleni immunizálására (miáltal egy patogén protein elleni immunreakció a patogén ellen védő immunitást biztosít); a hiperproliferatív sejtekkel specifikusan kapcsolatos targetproteinek elleni immunreakció kiváltása révén hiperproliferatív betegségek vagy rendellenességek (mint a rák) leküzdésére; valamint autoimmunbetegséggel specifikusan kapcsolatos targetproteinek elleni immunreakció kiváltása révén autoimmunbetegségek vagy rendellenességek leküzdésére.
A találmány bizonyos vonatkozásaiban génterápiára vonatkozik, azaz olyan készítményekre és eljárásokra, melyek nukleinsavmolekulák kezelt személy sejtjeibe történő bevitelére alkalmasak. Ezek a nukleinsavak olyan gének exogén példányai, melyek megfelelnek a páciens hibás, hiányzó, működésképtelen vagy csak részlegesen működő génjeinek, vagy gyógyhatású proteineket kódolnak, azaz olyan proteineket, melyek jelenléte a páciens szervezetében valamilyen hiányosságot szüntet meg, és/vagy gyógyászati hatást biztosít a páciens szervezetében, miáltal a protein beadása nélkül a protein bevitelének alternatív módját biztosítják.
A találmány leírásában használt „kívánt protein” kifejezésen a találmány szerinti génkonstrukciók által kódolt peptideket és proteineket értünk, melyek immunreakció számára targetproteinként működnek, vagy a génterápiás kezelésekben gyógyhatású vagy kompenzálóproteinként szolgálnak.
A találmány értelmében egy kívánt proteint kódoló DNS-t vagy RNS-t egy kezelt személy sejtjeibe viszünk be, ahol az expresszálódik, miáltal a kívánt protein termelődik. A kívánt proteint kódoló DNS-t vagy RNS-t a páciensek sejtjeiben történő expresszióhoz szükséges szabályozóelemekhez kapcsoljuk. A DNSexpresszióhoz szükséges szabályozóelemek közé tartozik a promoter és a poliadenilációs jel; ezeken kívül egyéb elemek, mint például a Kozák-régió, szintén beépíthető a genetikai konstrukcióba.
A találmány leírásában alkalmazott „genetikai konstrukció” kifejezés olyan DNS- vagy RNS-molekulára vonatkozik, amely a kívánt proteint kódoló nukleotidszekvenciát, valamint a vakcinával kezelt személy sejtjeiben az expresszió irányítására képes promoterből és poliadenilációs jelből álló szabályozóelemekhez működőképesen kapcsolt iniciációs és terminációs jeleket tartalmaz.
A találmány leírásában alkalmazott „expresszálható alak” kifejezés olyan génkonstrukcióra vonatkozik, amely a szükséges szabályozóelemeket a targetproteint kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazza, miáltal az a páciens sejtjeiben lehetővé teszi a kódolószekvencia expresszióját.
A találmány leírásában alkalmazott „genetikai vakcina” kifejezés olyan gyógyszerészeti készítményre vonatkozik, amely a targetproteint kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló genetikai konstrukciót tartalmaz, beleértve a gyógyhatású immunreakció kiváltására alkalmazható gyógyszerészeti készítményeket.
A találmány leírásában alkalmazott „genetikai gyógyszer” kifejezés olyan gyógyszerészeti készítményre vonatkozik, amely gyógyhatású vagy kompenzálóproteint kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló genetikai konstrukciót tartalmaz.
A találmány leírásában alkalmazott „target- (cél-)protein” kifejezés olyan proteinre vonatkozik, amely ellen immunreakció váltható ki. A targetprotein olyan immunogén protein, amely a patogénből vagy egy nemkívánatos sejttípusból (mint a ráksejtek vagy az autoimmunbetegséggel kapcsolatos sejtek) származó proteinnel (amely ellen az immunizálás szükséges) legalább egy közös epitóppal rendelkezik. A targetprotein ellen irányuló immunreakció a pácienst megvédi a specifikus fertőzéstől vagy betegségtől, mellyel a targetprotein kapcsolatos, illetve kezelésként is alkalmazható.
A találmány leírásában alkalmazott „közös epitóppal rendelkezik” kifejezés olyan proteinekre vonatkozik, melyek egy másik protein epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló legalább egy epitópot tartalmaznak.
HU 219 767 Β
A találmány leírásában alkalmazott „lényegében hasonló epitóp” kifejezésen olyan epitópot értünk, amelynek szerkezete nem azonos egy adott protein epitópjának szerkezetével, azonban a proteinnel keresztreaktív celluláris vagy humorális immunreakciót vált ki.
A találmány leírásában alkalmazott „gyógyhatású protein” kifejezés olyan proteinekre vonatkozik, melyek jelenléte előnyös gyógyhatást biztosít a páciens számára.
A találmány leírásában alkalmazott „kompenzálóprotein” kifejezésen olyan proteineket értünk, amelyek jelenléte kompenzál egy teljesen működőképes, endogén termelődő protein hiányzó, hibás, működésképtelen vagy részlegesen működő endogén génnek köszönhető hiányát.
A genetikai konstrukciók egy kívánt proteint kódoló nukleotidszekvenciát a génexpresszióhoz szükséges szabályozóelemekhez működőképesen kapcsolva tartalmaznak, ezáltal a DNS- vagy RNS-molekula élő sejtbe történő bevitele kívánt proteint kódoló DNS vagy RNS expresszióját, s ezáltal a kívánt protein termelődését eredményezi.
Amennyiben a kívánt proteint kódoló, szabályozóelemekhez működőképesen kapcsolt nukleotidszekvenciát tartalmazó genetikai konstrukciót egy sejt felveszi, az a sejtben működő extrakromoszomális molekulaként maradhat fenn, vagy beépülhet a sejt kromoszomális DNS-ébe. A DNS tehát bejuttatható a sejtekbe, ahol plazmid alakban elkülönült genetikai anyag formájában marad fenn, illetve más módon lineáris DNS is bevihető a sejtekbe, amely be tud épülni a sejt kromoszómájába. A DNS sejtbe történő bevitelekor alkalmazhatók DNS-integrációt elősegítő reagensek. Az integráció elősegítésében hasznos DNS-szekvenciák szintén beépíthetők a DNS-molekulába. Más módon, RNS is adható sejtbe. A genetikai konstrukciót lineáris minikromoszómaként is előállíthatjuk, amely centromert, telomereket és replikációs kezdőhelyet is tartalmaz.
A kívánt proteint kódoló molekula lehet DNS vagy RNS, amely a kívánt proteint kódoló nukleotidszekvenciából áll. Ezek a molekulák lehetnek cDNS-ek, genom DNS-ek, szintetizált DNS-ek vagy ezek hibridjei, illetve RNS-molekulák, például mRNS. Ennek megfelelően az általunk használt „DNS-konstrukció”, „genetikai konstrukció” és „nukleotidszekvencia” kifejezések DNS- és RNS-molekulákra egyaránt vonatkoznak.
Egy DNS-molekula génexpressziójához szükséges szabályozóelemek a promoter, iniciációs kodon, stop kodon és poliadenilációs jel. A génexpresszióhoz ezeken kívül gyakran enhancerek is szükségesek. Lényeges, hogy az említett elemek a kívánt proteint kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolódjanak, s hogy a szabályozóelemek működőképesek legyenek a kezelt személyben, akinek beadjuk azokat.
Az iniciációs kodonok és a stop kodon általában a kívánt proteint kódoló nukleotidszekvencia részét képezik, azonban lényeges, hogy ezen elemek működőképesek legyenek abban a páciensben, akinek a génkonstrukciót beadjuk. Az iniciációs és terminációs kodonoknak a kódolószekvenciával egy leolvasási keretben kell lennie.
Az alkalmazott promotereknek és poliadenilációs jeleknek a páciens sejtjeiben működőképesnek kell lenniük.
A találmány gyakorlati megvalósításában, különösen emberek számára készült genetikai vakcina előállításában alkalmazható promoterek példái közé tartoznak (nem korlátozó jelleggel) a Simian vírus 40-ből (SV40) származó promoterek, az egér-emlőtumorvírus (MMTV) promoter, humán immundeficienciavírus (HÍV) promoter [mint a HÍV hosszú terminális ismétlődés (LTR) promoter], Moloney vírus promoter, ALV promoter, citomegalovírus (CMV) promoter (mint a CMV közvetlen korai promoter), Epstein-Barr vírus (EBV) promoter, Rous-szarkómavírus (RSV) promoter, valamint a humán gének, úgymint a humán aktin, humán miozin, humán hemoglobin, humán izom kreatin és humán metalotionein promoterek.
A találmány gyakorlati megvalósításában, különösen emberek számára készült genetikai vakcina előállításában alkalmazható poliadenilációs jelek közé tartoznak (nem korlátozó jelleggel) az S V40 poliadenilációs jelek és az LTR poliadenilációs jelek. Elsősorban az SV40 poliadenilációs jelet alkalmazzuk, amely a pCEP4 plazmidban (Invitrogen, San Diego, CA) található.
A DNS-molekulában a DNS-expresszióhoz szükséges szabályozóelemeken kívül egyéb elemek is lehetnek; ilyenek például az enhancerek, melyek (nem kizárólag) a humán aktin, humán miozin, humán hemoglobin, humán izom kreatin gének enhancerek, valamint vírus enhancerek (mint a CMV, RSV és EBV enhancer) közül választhatók ki.
A genetikai konstrukciókba emlőseredetű replikációs kezdőhelyet foglalhatunk, annak érdekében, hogy a konstrukciók extrakromoszomálisan maradjanak fenn, s hogy több példányban termelődjenek a sejtben. Az Invitrogentől (San Diego, CA) beszerezhető pCEP4 és pREP4 plazmid Epstein-Barr vírusból származó replikációs kezdőhelyet és EBNA-1 antigént kódoló nukleáris kódolórégiót tartalmaz, amely integráció nélkül nagy példányszámú episzomális replikációt eredményez.
Néhány előnyben részesített megvalósítási módban az alkalmazott vektort a 46. példában leírtak közül választjuk ki. A találmány génterápiát érintő vonatkozásaiban a replikációs kezdőhelyet (beleértve az aktiváláshoz szükséges antigént) tartalmazó konstrukciók az előnyben részesítettek.
Néhány immunizálási alkalmazást érintő előnyben részesített megvalósítási módokban a genetikai konstrukció a targetproteint kódoló nukleotidszekvenciákon kívül olyan proteineket kódoló géneket tartalmaz, melyek fokozzák az említett targetprotein elleni immunreakciót. Az ilyen gének példái a citokineket és limfokineket [mint az alfa-interferon, gamma-interferon, vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, epidermális növekedési faktor (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 és IL—12] kódoló gének. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha a GM-CSF génjét az immunizálókészítmé5
HU 219 767 Β nyékben alkalmazott genetikai konstrukciókba foglaljuk.
Ha bármely okból szükséges a genetikai konstrukciót felvevő sejtek eliminálása, további elem alkalmazható, amely a sejtpusztítás targetjeként szolgál. Például a genetikai konstrukcióba expresszálható formában herpesz-timidin-kináz (tk) gént építhetünk be, s a páciensnek gangciklovirt adva az minden tk-t termelő sejtet szelektíven elpusztít, miáltal a genetikai konstrukcióval módszert biztosíthatunk a sejtek szelektív elpusztítására.
A proteintermelés maximalizálása érdekében olyan szabályozószekvenciákat választhatunk ki, amelyek azokban a sejtekben, melyekbe a konstrukciót bevisszük, a génexpresszió szempontjából különösen alkalmasak. A szakember előállíthat olyan DNS-konstrukciókat, melyek a sejtekben funkcionálisak.
A genetikai konstrukciók a kezelni kívánt sejtekkel megegyező típusú sejtekből készült szövettenyészet alkalmazásával in vitro expressziós szintre tesztelhetők. Például, ha a genetikai vakcinát humán izomsejtekbe kívánjuk beadni, az expressziós szint in vitro modelljeként tenyészetben növesztett izomsejteket, mint például kemény rhabdomyosarcoma izomtumorsejteket alkalmazhatunk.
A találmányban alkalmazott genetikai konstrukciókat nem retrovírusrészekbe építjük. A genetikai konstrukciókat a sejtek retrovírusrészek által közvetett inszerció nélkül veszik fel, azaz olyan inszerció nélkül, ami akkor fordul elő, ha retrovírus-RNS-t magában foglaló retrovírusrészek fertőzik a sejteket. Ahogy itt használjuk, a „retrovírusrészektől mentes” kifejezés olyan genetikai konstrukciókra vonatkozik, melyeket nem retrovírusrészekbe foglaltunk. A leírásban használt „fertőző anyagoktól elkülönített” kifejezés olyan genetikai anyagra vonatkozik, amely nem inaktivált, aktív, élő vagy elpusztított vírusból, baktériumból vagy eukarióta organizmusból származó, a sejt megfertőzésére képes vektor része.
Néhány megvalósítási módban a genetikai konstrukciók nem tesznek ki egy komplett, replikálható virális genomot, vagyis a sejtbe történő bevitel esetén a genetikai konstrukció a fertőző vírusrészek közvetlen termelődéséhez elégtelen genetikai információt nyújt. Az itt használt „inkomplett virális genom” kifejezés olyan genetikai konstrukcióra vonatkozik, amely nem teljes genomot foglal magában, miáltal az ilyen genetikai konstrukció sejtbe történő bevitele a fertőző vírus termelődéséhez nem biztosít elegendő genetikai információt.
Néhány megvalósítási módban genetikai konstrukcióként olyan legyengített vírusvakcina vihető be a sejtbe, amely a vírusrészek termelődéséhez elegendő genetikai anyagot tartalmaz. Genetikai konstrukcióként a legyengített vakcina bevitele biztonságos, tiszta aktív immunizálótermék nagy mennyiségben történő előállításának egyszerű módját teszi lehetővé.
A genetikai konstrukció mikrolövedékek (microprojectiles) alkalmazásával vagy anélkül adható be. A találmány szerinti genetikai konstrukciók előnyösen szilárd részecskéktől mentesen vihetők be a páciens sejtjeibe. Ahogy itt használjuk, a „szilárd részektől mentes” kifejezés olyan folyadékra vonatkozik, amely nem tartalmaz semmilyen szilárd mikrolövedéket, melyet a genetikai anyag sejtbe jutását elősegítő nyílás létrehozása érdekében a sejtmembrán perforálásához, átfúrásához vagy más módon történő átlyukasztásához alkalmaznak.
A találmány szerinti készítmények és eljárások emberek patogének, mint a vírusok, prokarióta és patogén eukarióta organizmusok (úgymint egysejtű patogén organizmusok és többsejtű paraziták) elleni immunizálásához alkalmazhatók. A találmány szerinti készítmények és eljárások különösen alkalmasak olyan patogének elleni immunizálásra, amelyek betokozódás nélkül fertőzik a sejteket; ilyenek a vírusok és a prokarióták, mint a Gonorrhoea-, Listeria- és Shigella-fajok. A találmány szerinti készítmények és eljárások ezeken kívül szintén alkalmasak emberek olyan protozoa patogének elleni immunizálására, melyek életciklusuk egy szakaszában intracelluláris patogének. Az itt használt „intracelluláris patogén” kifejezés olyan vírusra vagy patogén organizmusra vonatkozik, amely szaporodási vagy életciklusa legalább egy részében gazdasejten belül élősködik, s ott patogén proteineket termel vagy azok termelődését okozza. Az 1. táblázatban néhány víruscsaládot és -nemzetséget sorolunk fel, melyek ellen a találmány szerinti vakcinák készíthetők. A vakcinák készítéséhez olyan DNS-konstrukciók alkalmasak, melyek egy patogén antigénen (mint például a táblázatokban felsorolt antigének) található epitóppal azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó peptideket kódoló DNS-szekvenciákból állnak. A találmány szerinti készítmények és eljárások továbbá alkalmasak emberek egyéb patogének elleni immunizálására; e patogének közé tartoznak a prokarióta és eukarióta egysejtű patogének, valamint a többsejtű paraziták, mint például a 2. táblázatban felsoroltak.
1. táblázat
Picomaviridae család
Nemzetségek: Rhinovírusok: (humán gyógyászat) a megfázásos esetek körülbelül 50%-áért felelősek.
Ethrovírusok: (humán gyógyászat), közéjük tartoznak a poliovírusok, coxsackievírusok echovírusok és humán enterovírusok, mint a hepatitis A vírus. Apthovírusok: (állatgyógyászat) a száj- és körömfájást okozó vírusok.
Target antigének: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG. Calciviridae család
Nemzetségek: Norwalk víruscsoport: (humán gyógyászat) ezek a vírusok a járványos gyomor-bél hurut lényeges okozói.
Togaviridae család
Nemzetségek: Alfa-vírusok: (humán és állatgyógyászat) például a Senilis vírusok, RossRiver vírus és az Eastem & Western lóencephalitis.
Reovírus: (humán gyógyászat) Rubellá vírus.
HU 219 767 Β
1. táblázat (folytatás)
Flariviridae család (Humán gyógyászat): például a dengue-láz, sárgaláz, encephalitis japonica, St. Louis encephalítis és a kullancs okozta encephalitisvírusok.
Hepatitis C vírus: (humán gyógyászat) ezeket a vírusokat még nem sorolták be egy családba sem, de úgy vélik, hogy a togavírusok vagy a flavivírusok közé tartoznak. Legtöbb hasonlóság a togavíruscsaláddal figyelhető meg.
Coronaviridae család (humán és állatgyógyászat): fertőző hörghurut (baromfi), átörökölhető sertésgyomor-bél vírus, sertésben haemagglutininációt okozó vírus, fertőző macska-peritonitisvírus, macska-bélrendszeri coronavírus, kutya-coronavírus;
A humán légzési coronavírusok a közönséges megfázás körülbelül 40 esetét okozzák, EX. 224E, OC43 (a coronavírusok non-A, B, vagy C hepatitist okozhatnak.
Target antigének: El, más néven M vagy mátrixprotein,
E2, más néven S- vagy Spike-protein,
E3, más néven HE vagy hemagglutin-elteróz-glikoprotein (nem mindegyik coronavírusban van meg),
N - nukleokapszid.
Rhabdoviridae család
Nemzetségek: Vesiliovírusok
Lyssavírusok (humán és állatgyógyászat): veszettség
Target antigén : G-protein, N-protein
Filoviridae család (humán gyógyászat)
Vérzésesláz-vírusok, mint a Marburg és az Ebola vírus.
Paramyxoviridae család
Nemzetségek: Paramyxovírusok: (humán és állatgyógyászat) mumpszvírus, New Castle-betegség-vírus (fontos patogén csirkékben).
Morbilli vírusok: (humán és állatgyógyászat) kanyaró, szopornyica. Pneuminvírusok: (humán és állatgyógyászat) légzési szincitiális vírus.
Orthomyxoviridae család (humán gyógyászat) Influenzavírus
Bungaviridae család
Nemzetségek: Bungavirusok: (humán gyógyászat) Califomia-encephalitis, LA Crosse.
Phlebovirusok: (humán gyógyászat) Rift-Valley-láz Hantavírusok: Puremala (hemahaginláz-vírus), továbbá számos meg nem jelölt bungavírus.
Arenaviridae család (humán gyógyászat)
LCM, Lassa-lázvírus.
Reoviridae család
Nemzetségek: Reovírus: lehetséges humán patogén,
Rotavírus: gyomor- és bélhurut gyermekekben
Orbivírusok: (humán és állatgyógyászat) Colorado-kullancsláz, Lebombo (emberek) lóagybántalom, kéknyelv-betegség.
Retroviridae család
Alcsalád: Oncorivírusok: (humán és állatgyógyászat) macskaleukémia-vírus, HTLVI és HTLVII,
Lentivírusok: (humán és állatgyógyászat) HÍV, macskaimmundeficiencia-vírus, lófertőzések, anémiavírus.
Spumavírusok.
Papovaviridae család
Alcsalád: Polyomavírusok: (humán gyógyászat) BKU és JCU vírusok, Papillomavírusok: (humán gyógyászat) rákkal és szemölcsök rosszindulatú fejlődésével kapcsolatos számos vírustípus.
Adenovírusok (humán gyógyászat)
EX AD7, ARD., Ο. B. (légzési betegség okozója) körülbelül 275 adenovírus bélgyulladást okoz.
Parvoviridae család (állatgyógyászat)
Macskaparvovírus (macskában bélgyulladást okoz) macska-panleukopeniavírus,
Kutyaparvovírus,
Sertésparvo vírus.
Herpesviridae család
Alcsalád: Alfa-herpesviridue
Nemzetségek: Simplexvírus (humán gyógyászat)
HSVI, HSVII,
Varicellavírus: (humán és állatgyógyászat) pseudorabies - varicella zoster
Alcsalád: Béta-herpesviridue
Nemzetségek: Cytomegalovírus (humán gyógyászat)
HCMV; Muromegalovírus Alcsalád: Gamma-herpesviridue
Nemzetségek: Lymphociyptovírus (humán gyógyászat)
EBV - (Burkitts lympho) Rhadinovírus
Poxviridae család
Alcsalád: Chordopoxviridue (humán és állatgyógyászat)
Nemzetségek: Variola (himlő)
Vaccinia (tehénhimlő) Parapoxivírus (állatgyógyászat) Auipoxvírus (állatgyógyászat) Capripoxvírus
HU 219 767 Β
1. táblázat (folytatás)
Leporipoxvírus
Suipoxvírus
Alcsalád: Entemopoxviridue
Hepadnaviridae család
Hepatitis B vírus
Be nem sorolt vírusok: Hepatitis delta-vírus
2. táblázat
Baktérium patogének
Patogén Gram-pozitív coccusok: Pneumococcus, Staphylococcus, Streptococcus;
Patogén Gram-negatív coccusok: Meningococcus, Gonococcus;
Patogén enterális Gram-negatív bacillusok: Enterobacteriaceae; Pseudomonas, Acinetobaktériumok és Eikenella; melioidosis; salmonella; shigellosis; hemophilus; lágy fekély; brucellosis; tularémia; yersinia (pasteurella), Streptobacillus moniliformis és Spirillum; Listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathidae; diftéria; kolera; anthrax; donovanosis (granuloma inguinale); és bartonellosis.
Patogén anaerob baktériumok; tetanusz; botulizus; egyéb clostridiumok, tuberkulózis; lepra; és egyéb mycobaktériumok.
Patogén sirochaeták okozta betegségek; szifilisz, treponematosis: Trepanéma pertenue-fertőzés, Trepona carateum-fertőzés, és endémiás szifilisz; és leptospirosis.
Magasabb rendű patogén baktériumok és patogén gombák okozta fertőzések: actinomycosis; nocardiosis; cryptococcosis, blastomycosis, histoplasmosis és coccidioidomycosis; candidiasis, aspergillosis és mucormycosis; sporotrichosis; paracoccidiodomycosis, petriellidiosis, torulopsosis, mycetoma és chromomycosis; és dermatophytosis.
Rickettsiák által okozott fertőzések, rickettsiosis. Mycoplasma- és chlamydiafertőzések: mycoplasma pneumoniae; lymphogranuloma venerum; psittacosis; és perinatális chlamydia fertőzések.
Patogén eukarióták
Patogén protozoák és férgek, és az általuk okozott fertőzések :
amebiasis; malária; leishmaniasis; trypanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; babesiasis; giardiasis; trichinosis; filariasis; schistosomiasis; orsóférgek; Trematodák; és laposféreg-fertőzések.
Patogén okozta fertőzés elleni védelemben alkalmazható genetikai vakcina előállítása érdekében a genetikai konstrukcióba olyan genetikai anyagot kell foglalni, amely olyan immunogén proteineket kódol, melyek ellen védőhatású immunreakció indukálható. A patogén akár intracellulárisan (mely esetben a találmány különösen alkalmas), akár extracellulárisan fertőz, nem valószínű, hogy valamennyi patogén antigén védőhatású immunreakciót vált ki. Mivel a DNS és RNS viszonylag kicsi, s viszonylag könnyen előállítható, a találmány további előnye, hogy több patogén antigénnel teszi lehetővé a vakcinálást. A genetikai vakcinában alkalmazott genetikai konstrukció sok patogén antigént kódoló genetikai anyagot foglalhat magában, például egy konstrukcióba több vírusgén foglalható, ami több targetet biztosít. Ráadásul az összetett oltóanyagok, melyek egy páciens különböző sejtjeibe vihetők be, úgy állíthatók elő, hogy a vakcinában a gének bizonyos esetekben teljes, még előnyösebben nem teljes, azaz majdnem teljes sorozatát tartalmazzák. Például vírusgének teljes sorozatát két konstrukció alkalmazásával adhatjuk be, melyek közül mindkettő a genom más-más felét tartalmazza, s a két konstrukciót különböző helyeken adjuk be. Ilyenformán valamennyi antigén ellen immunreakció váltható ki annak kockázata nélkül, hogy fertőző vírust állítunk elő. Ez egynél több antigén target bevitelét teszi lehetővé, s nincs szükség a protektív antigének azonosítására.
A DNS és RNS könnyű kezelhetősége és olcsósága protektív antigének kiválasztásának (screenelésének) hatékonyabb módját is lehetővé teszi. A gének rendszeres osztályozása és tesztelése sokkal könnyebb, mint a proteineké. Kiválasztjuk a patogén anyagokat és organizmusokat, melyek ellen a vakcinát előállítani kívánjuk, s immunogén proteint azonosítunk. Az 1. és 2. táblázatban néhány olyan patogén anyagot és organizmust soroltunk fel, melyek ellen genetikai vakcinák készíthetők azzal a céllal, hogy a pácienseket megvédjük az általuk okozott fertőzéstől. Néhány előnyben részesített megvalósítási módban egy páciens patogén elleni immunizálása HÍV, HTLV vagy HBV ellen irányul.
A találmány egy másik vonatkozása értelmében eljárást írunk le hiperproliferatív betegségekkel kapcsolatos túlburjánzó sejtek elleni széles körű protektív immunreakció kialakítására, valamint hiperproliferatív betegségben szenvedő páciensek kezelésére. Amint itt használjuk, a „hiperproliferatív betegségek” kifejezésen olyan betegségeket és rendellenességeket értünk, melyek a sejtek túlburjánzásával jellemezhetők. A hiperproliferatív betegségek példái közé tartozik a rák összes fajtája és a pikkelysömör.
Felfedeztük, hogy amennyiben egy páciens sejtjeibe immunogén, „túlburjánzó sejttel kapcsolatos proteint” kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló genetikai konstrukciót juttatunk, a páciens vakcinával kezelt sejtjeiben az említett proteinek termelődnek. Az említett „túlburjánzó sejttel kapcsolatos protein” kifejezésen olyan proteineket értünk, melyek hiperproliferatív betegséggel állnak kapcsolatban. Hiperproliferatív betegségek elleni immunizálás érdekében a páciensnek olyan genetikai konstrukciót adunk be, amely a hiperproliferatív betegséggel kapcsolatos proteint kódoló nukleotidszekvenciát foglal magában.
Hogy a hiperproliferatív betegséggel kapcsolatos protein hatásos immunogén cél (target) legyen, olyan proteinnek kell lennie, amelyet kizárólag a túlburjánzó sejtek termelnek, vagy amelyet azok a normális sejteknél magasabb szinten termelnek. A target antigének közé az ilyen proteinek, proteindarabok és peptidek tartoznak, melyek legalább egy, az említett proteinen talál8
HU 219 767 Β ható epitóppal rendelkeznek. Bizonyos esetekben a túlburjánzással kapcsolatos protein egy proteint kódoló gén mutációjának eredménye. A mutáció következtében megváltozott gén olyan proteint kódol, amely megközelítően azonos a normális proteinnel, azzal a különbséggel, hogy csekély mértékben különböző aminosavszekvenciával rendelkezik, ami a normális proteinen nem található epitópot eredményez. Az ilyen targetproteinek közé tartoznak az onkogének (mint a myb, myc, fyn, a bcr/abl transzlokációs gén, ras, src, P53, neu, trk és EGRF) által kódolt proteinek. Az onkogének termékein kívül target antigénként rák elleni és protektív kezelésekhez alkalmazható targetproteinek közé tartoznak a B-sejt limfómák által termelt antitestek variábilis régiói és a T-sejt limfómák által termelt T-sejt-receptorok variábilis régiói, melyek bizonyos megvalósítási módokban szintén alkalmazhatók autoimmunbetegség target antigénjeiként. Targetproteinként egyéb, daganattal kapcsolatos proteinek is alkalmazhatók, mint például azok a proteinek, amelyek a tumorsejtekben nagyobb mennyiségben találhatók meg; ilyen a 17-1A monoklonális antitest által felismert protein és a folátkötő proteinek.
Bár a találmány szerinti készítmények és eljárások a páciensek egy- vagy többfajta rák elleni immunizálására alkalmazhatók, a találmány eredményei különösen olyan páciens megelőzésszerű immunizálásában hasznosak, aki hajlamos egy adott rákos megbetegedésre, vagy akinek korábban volt rákja, s emiatt hajlamos a visszaesésre. A genetika, a technika, valamint a járványtan fejlődése lehetővé teszi a rák adott személyben történő kialakulása valószínűségének meghatározását és kockázatának értékelését. Genetikai screeneléssel és/vagy az adott páciens családjában megjelent betegségek ismeretében megjósolható, hogy milyen valószínűséggel alakulhat ki a páciensben a rák valamely típusa.
Azok a személyek, akikben már kifejlődtek rákos folyamatok, s akiket már kezeltek a rák felszámolása vagy enyhítése érdekében, különösen hajlamosak a visszaesésre és a rák kiújulására. A kezelés részeként az ilyen személyek a kiújulás leküzdése érdekében a megállapított rákfajta ellen immunizálhatok, így amint ismertté válik, hogy egy páciensnek volt egy bizonyos fajta rákos megbetegedése, s a kiújulás veszélye fenyeget, annak érdekében immunizálható, hogy immunrendszerét felkészítsük a rák esetleges későbbi megjelenésének leküzdésére.
A találmány egyik tárgya eljárás hiperproliferatív betegségben szenvedő személyek kezelésére. Az ilyen eljárásokban a genetikai konstrukció bevitele jelenti az immunterápiát, ami a targetproteineket termelő hiperproliferatív (túlbuqánzó) sejtek leküzdése érdekében irányítja és segíti a kezelt személy immunrendszerét.
A találmány egy másik tárgya eljárás autoimmunbetegségekben és rendellenességekben szenvedő személyek kezelésére, melynek során az autoimmunitással kapcsolatos targetek ellen (beleértve a sejtreceptorokat és azon sejteket, melyek önmaguk ellen irányuló antitesteket termelnek) széles körű immunreakciót váltunk ki.
A T-sejt által közvetített autoimmunbetegségek közé tartozik a rheumatoid arthritis (RA), sclerosis multiplex (MS), Sjögren-szindróma, sarcoidosis, inzulinfüggő diabetes mellitus (IDDM), autoimmun pajzsmirigygyulladás, reaktív arthritis, ízületi merevséget okozó csigolyagyulladás (spondylitis ankylopoetica), scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, psoriasis, érgyulladás (vasculitis), Wegener-féle granulomatosis, Crohn-kór és fekélyesedő vastagbélgyulladás. Valamennyi fenti betegségre olyan T-sejt-receptorok jellemzők, melyek endogén antigénekhez kötődnek, s autoimmunbetegségekkel gyulladásos folyamatokat indítanak be. A T-sejtek variábilis régiói ellen végzett vakcinálással e T-sejtek eliminálása érdekében immunreakció (beleértve a CTL-eket) váltható ki.
A rheumatoid arthritis esetében a T-sejt-receptorok (TCR) több specifikus variábilis régióját karakterizálták, melyek szerepet játszanak a betegség kialakulásában. Ezen TCR-ek közé tartozik a νβ-3, νβ-14, νβ-17 és Va-17. Ilyenformán e proteinek közül legalább egyet kódoló DNS-konstrukcióval végzett vakcinálás a rheumatoid arthritisben szerepet játszó T-sejtekre irányuló immunreakciót fog kiváltani (lásd Nowell, M. D. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10 921-10 925, 1991; Paliard, X. és munkatársai, Science, 253, 325-329, 1991; Williams, W. V. és munkatársai, J. Clin. Invest., 90, 326-333; melyek mindegyikét hivatkozásul említjük).
A sclerosis multiplex esetében a T-sejt-receptorok (TCR) szintén több specifikus variábilis régióját karakterizálták, melyek szerepet játszanak a betegség kialakulásában; ezek közé tartozik a νβ-7 és Va-10. Ennek megfelelően e proteinek közül legalább egyet kódoló DNS-konstrukcióval végzett vakcinálás a sclerosis multiplexben szerepet játszó T-sejtekre irányuló immunreakciót fog kiváltani (lásd Wucherpfennig, K. W. és munkatársai, Science, 248, 1016-1019, 1990; Oksenberg, J. R. és munkatársai, Natúré, 345, 344-346, 1990; melyek mindegyikét hivatkozásul említjük).
A scleroderma esetében több, a betegség kialakulásában szerepet játszó variábilis TCR-régiót karakterizáltak; ezek közé tartozik a νβ-6, νβ-8, νβ-14, valamint a Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 és Va-12. Ennek megfelelően, e proteinek közül legalább egyet kódoló DNS-konstrukcióval végzett vakcinálás a sclerodermaban szerepet játszó T-sejtekre irányuló immunreakciót fog kiváltani.
T-sejt által közvetített autoimmunbetegségben (különösen olyanban, amely esetében a TCR variábilis régióját még nem karakterizálták) szenvedő páciensek kezelése érdekében szinoviális biopsziát hajthatunk végre, miáltal a jelen levő T-sejtekből mintát vehetünk, és standard módszerekkel azonosíthatjuk T-sejt-receptoraik variábilis régióit. Ezek ismeretében elkészíthetjük a genetikai vakcinákat.
A B-sejt által közvetített autoimmunbetegségek közé tartozik a lupus (bőrtuberkulózis; SLE), Gravesbetegség, myasthenia gravis, autoimmun hemolitikus anémia, autoimmun trombocytopenia, asztma, cryoglobulinemia, primer epesclerosis és vészes vérszegény9
HU 219 767 Β ség. E betegségek mindegyikére olyan antitestek jellemzők, melyek endogén antigénekhez kötődnek, s autoimmunbetegséggel kapcsolatos gyulladási folyamatokat indítanak be. Az antitestek variábilis régiói ellen végzett vakcinálással immunreakciót válthatunk ki (beleértve a CTL-eket), hogy eltávolítsuk az antitestet termelő B-sejteket.
B-sejt által közvetített autoimmunbetegségben szenvedő páciensek kezelése érdekében azonosítani kell az autoimmunaktivitásban szerepet játszó antitestek variábilis régióját. Ennek érdekében biopsziát végezhetünk és mintát vehetünk a gyulladás helyén jelen levő antitestekből, miáltal standard módszerek alkalmazásával azonosíthatjuk az antitestek variábilis régióit. Ezek ismeretében elkészíthetjük a genetikai vakcinákat.
A bőrtuberkulózis esetében az egyik antigénről azt tartják, hogy DNS. Ilyenformán a bőrtuberkulózis ellen immunizálni kívánt páciensek vérsavóját anti-DNS-antitestekre screenelhetjük, s olyan vakcinát állíthatunk elő, amely a vérsavóban található anti-DNS-antitestek variábilis régióját kódoló DNS-konstrukciókat tartalmaz.
Az antitestek variábilis régióinak és T-sejt-receptorainak (TCR) közös szerkezeti jellemzői jól ismertek. Egy adott TCR-t vagy antitestet kódoló DNS-szekvencia jól ismert eljárások, mint például a Rabat és munkatársai által leírt eljárás („Sequence of Proteins of Immunological Interest”, U. S. Department of Health and Humán Services, Bethesda, MD, 1987; melyet hivatkozásul említünk) alapján általában könnyen megtalálható. Ezenkívül Chaudhary, V. K. és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1066,1990; melyet hivatkozásul említünk) antitestekből származó funkcionális variábilis régiók klónozásának általános módját írják le.
A találmány génterápiára vonatkozó néhány megvalósítási módjaiban a génkonstrukciók tartalmaznak kompenzálógéneket vagy gyógyhatású proteineket kódoló géneket. A kompenzálógének közé tartozik a dystrophint vagy működőképes fragmensét kódoló gén, a cisztás fibrózisban szenvedő páciensekben a hibás gént kompenzáló gén, az inzulint kódoló gén, az ADAhiányban szenvedő páciensekben a hibás gént kompenzáló gén és a VIII. faktort kódoló gén. A gyógyhatású proteineket kódoló gének közé tartoznak az erythropoietint, interferont, LDL-receptort, GM-CSF-et, IL-2-t, IL-4-et és TNF-et kódoló gének. Ezeken kívül beadhatók olyan genetikai konstrukciók, melyek a toxikus anyagokat specifikusan kötő, egyláncú antitestkomponenseket kódolnak.
Néhány előnyben részesített megvalósítási módban a dystrophingént egy „minigén” részeként prezentáljuk, s muszkuláris disztrófiában szenvedő páciens kezeléséhez alkalmazzuk. Néhány előnyben részesített megvalósítási módban olyan minigént készítünk, amely egy részleges dystrophinproteint kódol. A dystrophin-rendellenességek felelősek az enyhébb Becker-féle muszkuláris disztrófiáért (BMD) és a súlyos Duchenne-féle muszkuláris disztrófiáért (DMD). A BMD esetében termelődik dystrophin, de mind méretét, mind mennyiségét tekintve abnormális. Az ilyen beteg mérsékelten gyenge. A DMD esetében nem termelődik protein, s a beteg 13 éves korára tolószékhez kötött, s rendszerint 20 éves korára meghal. Néhány páciens, különösen a BMD-ben szenvedők esetében a találmány szerint bejuttatott minigén expressziójával termelt részleges dystrophinprotein fokozott izomműködést eredményezhet.
Bizonyos előnyben részesített megvalósítási módokban IL-2-t, IL-4-et, interferont vagy TNF-et kódoló géneket viszünk be a tumorsejtekbe, melyek a páciensben maradtak, vagy melyeket eltávolítottunk, s azután visszaültettünk a páciens szervezetébe. Bizonyos megvalósítási módokban gamma-interferont kódoló gént adunk be sclerosis multiplexben szenvedő betegnek.
Egy páciens sejtjeibe antiszensz molekulákat és ribozimokat juttathatunk be oly módon, hogy a sejtekbe genetikai anyagot viszünk be, amely az említett aktív anyagok sokszorosításához templátként szolgál. Ezek a szerek inaktiválják vagy más módon akadályozzák az olyan proteineket kódoló gének expresszióját, melyek jelenléte nemkívánatos. Az antiszensz molekulákat kódoló szekvenciákat tartalmazó konstrukciók a sejteken belüli proteinek termelésének gátlására vagy megakadályozására használhatók, miáltal megszüntethető vagy csökkenthető az olyan proteinek, mint például az onkogéntermékek termelődése. Hasonlóan a ribozimok meghiúsíthatják a génexpressziót azáltal, hogy a messenger RNS-t szelektíven lebontják, mielőtt az proteinné transzlálódhatna. Néhány megvalósítási módban a sejteket egyéb gyógyszerek és eljárások alkalmazásával végzett gyógykezelés részeként a találmány szerint olyan konstrukciók alkalmazásával kezeljük, melyek antiszensz molekulákat vagy ribozimokat kódolnak. Az antiszensz molekulákat és ribozimokat kódoló génkonstrukciókhoz hasonló vektorokat alkalmazunk, mint abban az esetben, ha proteintermelésre van szükség, azzal a különbséggel, hogy a kódolószekvencia nem tartalmaz az RNS proteinné történő transzlációjának beindításához szükséges start kodont. Bizonyos megvalósítási módokban előnyösek a 46. példában leírt vektorok, különösen azok, amelyek tartalmazzák a replikációs kezdőhelyet és a megfelelő magi antigén expresszálható formáját.
A ribozimok katalitikus RNS-ek, melyek önhasadásra vagy más RNS-molekula hasítására képesek. A tudományban a ribozimok számos különböző típusa ismert, mint például a „hammerhead”, a „hairpin”, az I. csoportba tartozó Tetrahymena-intron, az „axhead” és az RNáz P (S. Edington, Biotechnology, 10, 256-262, 1992). A hammerhead ribozimok olyan katalitikus hellyel rendelkeznek, melyek core-ja kevesebb, mint 40 nukleotidból áll. A növényi viroidokban található számos ribozim- és a szatellit-RNS-ek közös másodlagos szerkezettel és bizonyos konzervált nukleotidokkal rendelkeznek. Bár ezek a ribozimok természetes állapotban saját szubsztrátjukként szolgálnak, az enzimdoménnel a konzervált hasítási helyet szegélyező szekvenciákkal való bázispárosodás folytán egy másik RNSszubsztrát is megcélozható. A ribozimok méretre készíthetősége lehetővé teszi szekvenciaspecifikus RNS-hasításban való alkalmazásukat (G. Paolella és munkatár10
HU 219 767 Β sai, EMBO, 1913-1919, 1992). A szakemberek különböző típusú ribozimokból származó különféle katalitikus szekvenciákat alkalmazhatnak, mint például a , Jiammerhead” katalitikus szekvenciát, és azokat a találmány szerint alakíthatják ki. Ribozimek számos target, köztük patogén nukleotidszekvenciák és onkogén szekvenciák ellen alakíthatók ki. A találmány szerinti bizonyos előnyben részesített megvalósítási módok elegendő kiegészítést tartalmaznak az abl-bcr fúziós transzkriptum (hasítási reakció hatékonyságnak fenntartása melletti) specifikus megcélzásához.
A találmány szerinti néhány előnyben részesített megvalósítási mód értelmében sejteket olyan vegyületekkel kezelünk, melyek elősegítik a genetikai konstrukciók sejtek által történő felvételét. A találmány szerinti néhány előnyben részesített megvalósítási mód értelmében sejteket olyan vegyületekkel kezelünk, melyek serkentik a sejtosztódást és elősegítik a genetikai konstrukciók felvételét. A genetikai konstrukciók sejtek által történő felvételét elősegítő vegyületek (beleértve a sejtosztódást serkentő vegyületeket) beadása a genetikai konstrukció által kódolt targetprotein ellen hatásosabb immunreakciót eredményez.
A találmány néhány előnyben részesített megvalósítási módja értelmében a genetikai konstrukciót tű nélküli injektálókészülékkel adjuk be a kezelt személynek. A találmány néhány előnyben részesített megvalósítási módja értelmében a genetikai konstrukciót tű nélküli injektálókészülékkel intradermálisan, szubkután és intramuszkulárisan egyidejűleg adjuk be a páciensnek. A tű nélküli injektálókészülékek jól ismertek és könnyen beszerezhetők. A találmány útmutatásai alapján a szakemberek genetikai anyag kezelt személy sejtjeibe juttatásához alkalmazhatják az ilyen készülékeket, melyek igen alkalmasak genetikai anyag bármilyen szövetbe, különösen bőr- és izomsejtekbe történő bevitelére. Bizonyos megvalósítási módokban a tű nélküli injektálókészülékek DNS-molekulákat tartalmazó folyadék bőrön keresztül történő belövéséhez alkalmazhatók. A folyadékot olyan sebességgel lőjük be, ami elég ahhoz, hogy a folyadék a bőr felületén becsapódva áthatoljon azon, s beszivárogjon a bőr- és izomszövetbe. így a genetikai anyagot egyidejűleg intradermálisan, szubkután és intramuszkulárisan adjuk be. Bizonyos megvalósítási módokban a tű nélküli injektálókészülékek genetikai anyag más szervek szöveteibe történő beviteléhez alkalmazható, miáltal a szerv sejtjeibe nukleinsavmolekulát juttathatunk.
A találmány értelmében a genetikai vakcinát beadhatjuk közvetlenül az immunizálni kívánt páciensnek, vagy ex vivő beadhatjuk a páciens eltávolított sejtjeibe, melyeket a beadás után visszaültetünk. Mindkét módon olyan sejtekbe juttatjuk be a genetikai anyagot, melyek a páciens testében jelen vannak. A beadás történhet (nem kizárólagosan) intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intradermálisan, szubkután, intravénásán, intraarteriálisan, szemen és szájon keresztül, valamint transzdermálisan és inhalálással vagy végbélkúp alkalmazásával. Az előnyben részesített beadási mód az intramuszkuláris, intraperitoneális, intradermális és szubkután injekció. A targetproteineket kódoló génkonstrukciók bevitele olyan személyekben, akiket úgy immunizáltunk, hogy a bevitt anyag nyálkahártya-immunitással kapcsolatos szövetekben legyen jelen, nyálkahártya-immunitást biztosít. Ilyenformán néhány példában a génkonstrukciót a beteg szájüregében végzett beadással visszük be.
A genetikai konstrukciók többek között hagyományos fecskendőkkel, tű nélküli injektálókészülékekkel vagy „mikrolövedékes génágyúkkal” adhatók be. Más módon, a genetikai vakcina különböző módszerekkel a páciens testéből eltávolított sejtekbe juttatható. Ilyen módszer például az ex vivő transzfekció, az elektroporáció, a mikroinjektálás és a „mikrolövedékes bombázás”. A sejteket, miután felvették a genetikai konstrukciót, visszaültetjük a páciensbe. Foglalkozunk azzal, hogy egyébként nem immunogén sejtek, melyekbe genetikai konstrukciókat foglaltunk, beültethetők legyenek a páciensbe akkor is, ha a vakcinával kezelt sejteket eredetileg egy másik személyből vettük.
A találmány szerinti genetikai vakcinák körülbelül 1 nanogramm és körülbelül 1000 mikrogramm közötti mennyiségű DNS-t tartalmaznak. Bizonyos előnyben részesített megvalósítási módokban a vakcinák körülbelül 10 nanogramm és körülbelül 800 mikrogramm közötti mennyiségben tartalmaznak DNS-t. Néhány előnyben részesített megvalósítási módban a vakcinák körülbelül 0,1 mikrogramm és 500 mikrogramm közötti mennyiségben tartalmaznak DNS-t. Más előnyben részesített megvalósítási módokban a vakcinák körülbelül 1-350 mikrogramm DNS-t, más esetekben körülbelül 25-250 mikrogramm DNS-t, ismét más előnyben részesített megvalósítási módokban pedig körülbelül 100 mikrogramm DNS-t tartalmaznak.
A találmány szerinti genetikai vakcinákat az alkalmazni kívánt beadási módnak megfelelően alakítjuk ki. A szakemberek számára nem okoz nehézséget a genetikai konstrukciókat tartalmazó genetikai vakcinák előállítása. Olyan esetekben, ahol az intramuszkuláris injekció a választott beadási mód, előnyösen izotóniás készítményt alkalmazunk. A készítmény izotóniássá tételéhez szükséges adalékanyagok közé tartozik általában a nátrium-klorid, dextróz, mannitol, szorbitol és laktóz. Néhány esetben izotóniás oldatokat, mint a foszfátpufferelt sóoldat, részesítjük előnyben. Stabilizátorként zselatint vagy albumint alkalmazunk. Néhány megvalósítási módban érszűkítő szert is adunk a készítményhez. A találmány szerinti gyógyszerészeti készítményeket sterilen és pirogénektől mentesen állítjuk elő.
A találmány szerinti genetikai konstrukciókat polinukleotidműködést fokozó szerrel együtt alakítjuk ki vagy azzal együtt adjuk be. A találmány szerinti előnyben részesített kiegészítőszereket a benzoesav-észterek, anilidek, amidinek, uretánok és ezek hidrokloridsói (mint például a helyi érzéstelenítők sói) közül választjuk ki.
A polinukleotidműködést elősegítő szer az alábbi képletek valamelyikével rendelkező vegyület lehet:
Ar-R‘-O-R2-R3,
Ar-N-R’-R2-R3,
R4-N-R5-R6
R4-O-R1-N-R7;
HU 219 767 Β a képletekben Ar jelentése fenil-, ρ-amino-fenil-, mamino-fenil, o-amino-fenil, szubsztituált fenilcsoport, szubsztituált ρ-amino-benzol-, szubsztituált zn-aminobenzol-, szubsztituált o-amino-benzol-, melyekben az amino-benzol aminocsoportja lehet aminocsoport, 1-5 szénatomos alkil-amino-csoport vagy 1-5 szénatomos dialkil-amino-csoport, és a szubsztituált vegyületek szubsztituense halogénatom, 1-5 szénatomos alkilés 1-5 szénatomos alkoxicsoport;
R1 jelentése C=O;
R2 jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport (beleértve az elágazó láncúakat is);
R3 jelentése hidrogénatom, aminocsoport, 1-5 szénatomos alkil-amino-csoport vagy 1-5 szénatomos dialkil-amino-csoport;
R2 és R3 együttesen ciklusos alkilcsoportot, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alkilcsoportot, ciklusos alifás aminocsoportot, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alifás aminocsoportot, heterociklusos csoportot vagy 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált heterociklusos csoportot (beleértve az 1-10 szénatomos alkilcsoporttal N-szubsztituált heterociklusos csoportokat) alkothat;
R4 jelentése Ar, R2 vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport, ciklusos alkilcsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alkilcsoport, ciklusos alifás aminocsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alifás aminocsoport, heterociklusos csoport vagy 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált heterociklusos csoport (beleértve az 1-10 szénatomos alkilcsoporttal N-szubsztituált heterociklusos csoportokat); és
R7 jelentése Ar, R2 vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport, ciklusos alkilcsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alkilcsoport, ciklusos alifás aminocsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alifás aminocsoport, heterociklusos csoport vagy 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált heterociklusos csoport (beleértve az 1-10 szénatomos alkilcsoporttal N-szubsztituált heterociklusos csoportokat).
Az észterek példái közé tartoznak a benzoesavészterek, mint a piperocain, meprilcain és izobucain; a para-amino-benzoesav-észterek, mint a procain, tetracain, butetamin, propoxicain és kloroprocain; a metaamino-benzoesav-észterek, mint a metabutamin és primacain; és a para-etoxi-benzoesav-észterek, mint a paretoxicain. Az anilidek példái közé tartozik a lidocain, etidocain, mepivacain, bupivacain, pirrocain és prilocain. Az ilyen vegyületek egyéb példái közé tartozik a dibucain, benzocain, diklonin, pramoxin, proparacain, butacain, benoxinát, karbocain, metil-bupivacain, butazin-pikrát, fenacain, diotán, luccain, intracain, nupercain, metabutoxicain, piridocain, bifenamin és a növényi eredetű biciklusos vegyületek, mint a kokain, cinnamoil-kokain, truxillin és koka-etilén, továbbá valamennyi ilyen vegyület hidrokloridkomplexe.
Az előnyben részesített megvalósítási módokban polinukleotidműködést fokozó szerként bupivacaint alkalmazunk. A bupivacain és a mepivacain között az a különbség, hogy a bupivacain a mepivacain N-metilcsoportja helyett N-butilcsoporttal rendelkezik. A vegyületek ezen a nitrogénatomon 1-10 szénatomos csoporttal lehetnek szubsztituáltak, továbbá tartalmazhatnak halogén szubsztituenseket, mint a prokain vagy a kloroprokain esetében. Előnyben részesítjük az anilideket.
A bupivacaint a genetikai konstrukció beadása előtt, azzal egy időben vagy azt követően adjuk be. A bupivacain és a genetikai konstrukció egyazon készítményben is beadható. A bupivacain sok tulajdonsága és aktivitása miatt sejtstimuláló szerként különösen alkalmas. A bupivacain elősegíti a genetikai anyag sejt által történő felvételét, s mint ilyen, transzfektálószer. A genetikai konstrukció bupivacainnal végzett együttes beadása elősegíti a genetikai konstrukciók sejtbe jutását. Úgy tartják, hogy a bupivacain szétrepeszti vagy más módon teszi nagyobb áteresztőképességűvé a sejtmembránt. A bupivacain serkenti a sejtosztódást és a replikációt is, így replikációt elősegítő szerként is működik. A bupivacain beadása irritálja és károsítja a szövetet, ezáltal gyulladáskeltő szerként is működik, ami az immunreakcióban részt vevő sejtek beadási hely felé történő vándorlását és kemotaxisát váltja ki. A beadás helyén normális esetben jelen levő sejteken kívül a beadott genetikai anyaggal és a bupivacainnal azok a sejtek is érintkezésbe kerülnek, amelyek a gyulladást okozó szerre reagálva vándorolnak a beadási hely felé. A bupivacain transzfektálószerként alkalmas arra is, hogy elősegítse az immunrendszer említett sejtjeinek genetikaianyag-felvételét.
A bupivacain kémiailag és gyógyszerészetileg rokonságban áll az amino-acil helyi érzéstelenítőkkel. Homológ a mepivacainnal, s a lidokain rokonvegyülete. A bupivacain az izomszövetet feszültségérzékennyé teszi a nátrium hatására, s a sejteken belül ionkoncentrációt hoz létre. A bupivacain gyógyszerészeti hatásainak teljes leírását lásd: Ritchie, J. M. és N. M. Greene, „The Pharmacological Basis of Therapeutics”, szerkesztő: Gilman, A. G. és munkatársai, 8. kiadás, 15. fejezet, 3111. oldal (melyet hivatkozásul említünk). A találmány szerinti eljárásban a bupivacain és a hozzá funkcionálisan hasonló vegyületek az előnyben részesítettek.
A bupivacain-HCl kémiai elnevezése 2-piperidinkarboxamid, l-butil-N-(2,6-dimetil-fenil)-monohidroklorid-monohidrát, s gyógyszerészeti felhasználáshoz számos forrásból beszerezhető, mint például az Astra Pharmaceutical Products Inc. -tői (Westboro, MA), a Sanofi Winthrop Pharmaceuticals-tól (New York, NY) és az Eastman Kodaktól (Rochester, NY). A bupivacaint metil-parabénnel együtt vagy a nélkül, illetve epinefrinnel vagy a nélkül készítik. Bármely ilyen készítmény alkalmazható. Gyógyszerészeti felhasználáshoz 0,25%, 0,5% és 0,75% koncentrációban kapható, melyek bármelyike alkalmazható a találmányban. Kívánság szerint egyéb koncentrációk, elsősorban a 0,05% és 1,0% közöttiek állíthatók elő, melyek megfelelő hatásokat váltanak ki. A találmány értelmében a bupivacaint körülbelül 250 pg és körülbelül 10 mg kö12
HU 219 767 Β zötti mennyiségben adjuk be. Néhány megvalósítási módban a bupivacaint körülbelül 250 pg és körülbelül 7,5 mg közötti mennyiségben, más megvalósítási módokban körülbelül 0,05 mg és körülbelül 5,0 mg közötti mennyiségben, ismét más megvalósítási módokban körülbelül 0,05 mg és körülbelül 3,0 mg közötti mennyiségben, további megvalósítási módokban körülbelül 5 pg és körülbelül 50 pg közötti mennyiségben adjuk be. Néhány megvalósítási módban például körülbelül 50 pl és körülbelül 2 ml közötti, előnyösen 50 pl és 1500 pl közötti, még előnyösebben körülbelül 1 ml 0,5% bupivacain-HCl-ot és 0,1% metil-parabént (izotóniás gyógyszerészeti hordozóban) adunk be a vakcina beadási helyén (a vakcina beadása előtt, azzal egy időben vagy azt követően).
Hasonlóan néhány megvalósítási módban körülbelül 50 pl és körülbelül 2 ml közötti, előnyösen 50 pl és 1500 pl közötti, még előnyösebben körülbelül 1 ml 0,5% bupivacain-HCl-ot és 0,1% metil-parabént adunk be (izotóniás gyógyszerészeti hordozóban) a vakcina beadási helyén (a vakcina beadása előtt, azzal egy időben vagy azt követően). A bupivacainon kívül bármely más, hasonló hatású vegyület (különösen a helyi érzéstelenítőkkel rokon vegyületek) beadható olyan koncentrációban, amely a genetikai anyag sejtek által történő felvételét kívánt mértékben elősegíti.
A találmány néhány megvalósítási módjában a genetikai vakcina intramuszkuláris injekcióval történő beadása előtt a páciensnek bupivacaininjekciót adunk be. Ez azt jelenti, hogy például a pácienst vakcinálás előtt körülbelül 7-10 nappal bupivacainnal oltjuk be. Néhány megvalósítási módban a pácienst a vakcinálás előtt körülbelül 1-5 nappal oltjuk be a bupivacainnal. Más megvalósítási módokban a pácienst a vakcinálás előtt 24 órával oltjuk be bupivacainnal. Más módon, a bupivacain a vakcinálással egy időben (néhány perccel előtte vagy utána) is beadható. Ennek megfelelően a bupivacain és a genetikai konstrukció kombinálható, s elegyként egyidejűleg is injektálható. Néhány megvalósítási módban a bupivacaint a genetikai konstrukció beadása után adjuk be; ez bizonyos megvalósítási módokban történhet a vakcinálás után 7-10 nappal, más esetekben a vakcinálás után 1-5 nappal, ismét más esetekben a vakcinálás után 24 órával.
A bupivacainnal együtt beadható és hasonló hatású egyéb szerek közé tartoznak (melyek transzfektálószerként és/vagy replikációt elősegítő és vagy gyulladáskeltő szerként funkcionálhatnak) a lektinek, növekedési faktorok, citokinek és limfokinek, mint az alfainterferon, gamma-interferon, vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, epidermális növekedési faktor (EGF), IL— 1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 és IL-12, valamint a kollagenáz, fibroblaszt növekedési faktor, ösztrogén, dexametazon, szaponinek, felületaktív szerek, mint az immunstimuláló komplexek (ISCOM-ok), a Freund-féle inkomplett adjuváns, LPS-analógok, köztük a monofoszforillipid A (MPL), muramilpeptidek, kinonanalógok és vezikulák, mint a szkvalén és szkvalán, hialuronsav és hialuronidáz. Ezek a genetikai konstrukcióval együtt szintén alkalmazhatók. Néhány megvalósítási módban e szereket a bupivacainnal és a genetikai konstrukcióval együtt adjuk be. A bupivacaint például akár hialuronsavval, akár hialuronidázzal kombinálva a genetikai konstrukcióval együtt adhatjuk be.
A genetikai konstrukció kollagénnel emulzió formájában kombinálható, s parenterálisan adható be. A kollagén emulzió a DNS hosszan tartó kibocsátását teszi lehetővé. A kollagént 50 pl-től 2 ml-ig terjedő mennyiségben alkalmazzuk. Egy ilyen készítményt alkalmazó előnyben részesített megvalósítási módban 1 ml kollagénnel körülbelül 100 pg DNS-t elegyítünk. Egyéb lassú kibocsátású készítmények leírását lásd a Remington’s Pharmaceutical Sciences-ben (A. Osol), amely e területen alapműnek tekinthető, s amelyet hivatkozásul említünk. Az ilyen készítmények közé vizes szuszpenziók, olajos oldatok és szuszpenziók, emulziók és implantátumok, valamint rezervoárok és transzdermális eszközök tartoznak. Bizonyos megvalósítási módokban a genetikai konstrukciókhoz időzített kibocsátású készítmények előnyösek. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha a genetikai konstrukció időzített kibocsátása 6-144 órán keresztül, előnyösen 12-96 órán keresztül, még előnyösebben 18-72 órán keresztül történik.
A találmány néhány megvalósítási módjában a genetikai konstrukciót tű nélküli injektálókészülékkel lőjük be. A tű nélküli injektálókészülékek különösen alkalmasak az anyag egyidejű intramuszkuláris, intradermális és szubkután beadására.
A találmány néhány megvalósítási módjában a genetikai konstrukciót polinukleotidműködést fokozó szerrel (PFE) együtt „míkrolövedékes részecskebombázás” eljárással adjuk be (lásd Sanford és munkatársai, 4 945 050 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, 1990. július 31.; melyet itt hivatkozásul említünk).
A találmány néhány megvalósítási módjában a genetikai konstrukciót liposzómakomplexum részeként polinukleotidműködést fokozó szerrel együtt adjuk be.
A találmány néhány megvalósítási módjában a pácienst teljes, széles körű immunreakció kiváltása érdekében egyszeri vakcinálással kezeljük. A találmány néhány megvalósítási módjában a pácienst teljes, széles körű immunreakció kiváltása érdekében többszöri (sorozatos) vakcinálással kezeljük. A találmány néhány megvalósítási módja értelmében egy adott időtartamon belül legalább kettő, előnyösen négy vagy öt injekciót adunk a páciensnek. Az injekciók beadása közötti időtartam 24 órától két hétig vagy még tovább terjedhet; az injekciókat előnyösen egyhetenként adjuk be. Más módon, különböző helyekre egy időben legalább kettő, maximum négy külön injekciót adhatunk.
A találmány néhány megvalósítási módjában a teljes vakcinálás egy oltóanyaggal végzett injektálásból áll, mely oltóanyag egy vagy több megcélzott epitópot kódoló szekvenciákból álló genetikai konstrukciót tartalmaz.
A találmány néhány megvalósítási módjában a teljes vakcinálás két vagy több különböző oltóanyag különböző helyekre történő beadásából áll. Például a talál13
HU 219 767 Β mány szerinti HIV-vakcina két oltóanyagból áll, melyek mindegyike különböző vírusproteineket kódoló genetikai anyagot tartalmaz. Ez a vakcinálási mód lehetővé teszi, hogy komplett vírusgénkészletet vigyünk be a páciens sejtjeibe, anélkül, hogy fertőző vírusrészecske kialakulásának veszélye fenyegetne. Ilyenformán a vakcinával kezelt páciensben a vírus egésze vagy nagy része ellen váltható ki immunreakció. Valamennyi oltóanyag injektálását különböző helyen végezzük, előnyösen egymástól olyan távolságban, hogy biztosan ne legyenek olyan sejtek, melyek mindkét genetikai konstrukciót felveszik. További óvintézkedésként bizonyos géneket deletálhatunk vagy megváltoztathatunk annak érdekében, hogy még hatásosabban megakadályozzuk a fertőző vírus összerendeződésének lehetőségét. A leírásban használt „gyógyszerészeti készlet (kit)” kifejezésen a találmányban alkalmazott összetett oltóanyagot értjük. Az ilyen készletek elkülönített tartályokból állnak, melyek különböző oltóanyagokat és/vagy sejtstimuláló szereket tartalmaznak. Ezek a készletek az immunizálási eljárásban alkalmazott oltóanyagok sorozatát tartalmazzák.
A találmány szerinti eljárások a humán és állatgyógyászat területén egyaránt alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány emlősök, madarak és halak genetikai immunizálására vonatkozik. A találmány szerinti eljárások különösen alkalmasak emlősfajok, köztük az ember, valamint szarvasmarha, juh, sertés, ló, kutya és macska esetében.
Az alábbi példákban a találmány vonatkozásait mutatjuk be részletesen. A példákat nem a találmány tárgykörének korlátozásaként újuk le. Az alábbi leírás segítségével összefoglalhatók a találmány különböző vonatkozásai. Ezt a leírást azonban nem a találmány tárgykörének korlátozásaként, hanem különböző vonatkozásainak megvilágítása érdekében mutatjuk be. A szakember számára nem okoz nehézséget a találmány további vonatkozásainak és megvalósítási módjainak megértése.
1. példa
A találmányban közvetlen genetikai immunizálásra alkalmas HIV-vakcinát bocsátunk közre. Olyan genetikai konstrukciókat állítunk elő, melyek egy páciens sejtjeibe juttatva HlV-proteineket termelve expresszálódnak. Néhány megvalósítási mód értelmében a páciens sejtjeiben valamennyi virális szerkezeti protein termelődése védőhatású (protektív) immunreakciót vált ki, ami védelmet nyújt a HIV-fertőzés ellen. A találmány szerinti HIV-vakcina fertőzés nélküli személyek HIVfertőzés elleni immunizálására vagy már megfertőzött személyek immunkezelésére alkalmazható. A találmány szerinti HIV-vakcina immunreakciót vált ki, beleértve a CTL-ekét, melyek felismerik és megtámadják a HIV-fertőzött sejteket, és felismerik a lehető legtöbb HIV-proteint, miáltal a meg nem fertőzött személyek védetté válnak a HIV-fertőzéstől.
Bizonyos megvalósítási módokban a találmány egy páciens két oltóanyag beadásával végzett HÍV elleni immunizálására vonatkozik. Ez a két oltóanyag a HIV-vírus legalább kettő, előnyösen kettőnél több, számos vagy valamennyi génjét tartalmazza. Az oltóanyagokat azonban nem együtt adjuk be, így a beoltott sejt nem teljes génkomplementet kap. A vakcinálással kezelt páciens a vírus legalább kettő, előnyösen számos vagy valamennyi génjét megkapja, így az immunreakciók a HIV-protein target teljes komplementje ellen irányulhatnak.
Ez a módszer növeli annak valószínűségét, hogy a leghatásosabb targetproteint kódoló genetikai anyag benne van a vakcinában, s csökkenti annak lehetőségét, hogy egy vírusrészecske megmeneküljön az immunreakció okozta detektálódástól, annak ellenére, hogy egy vagy több vírusprotein szerkezete megváltozik, ha a vírus mutáción esik át. Ennek megfelelően kívánatos a pácienst a vírusproteineket kódoló gének összetett, s lehetőleg majdnem teljes vagy teljes komplementjével vakcináim.
Ha egyetlen sejtnek teljes vírusgénkomplementet adunk, előfordulhat, hogy egy komplett vírus alakul ki a sejten belül. Emiatt a találmány szerinti genetikai konstrukciót nem teljes génkomplementtel készítjük, hanem különböző sejtekbe két vagy több oltóanyagot adunk, melyek egyike sem tartalmaz teljes génkészletet, de összességükben teljes vírusgénkomplementet alkotnak. Az oltóanyagok beadását lehetőleg egymástól olyan távolságban végezzük, hogy véletlenül se legyen olyan, vakcinával kezelt sejt, amely teljes génkészletet vett fel. Például a HIV-genom egy részét egy első konstrukcióba, a fennmaradó részt pedig egy második konstrukcióba inszertáljuk. Az első konstrukciót genetikai vakcinaként a páciens egyik karjának izomszövetébe, míg a másik konstrukciót genetikai konstrukcióként a páciens másik karjának izomszövetébe adjuk be. A páciens így teljes vírusgénkészletet kapott, s lényegében a teljes vírus ellen vakcináltuk, de annak kockázata nélkül, hogy fertőző vírusrészecskék rendeződhetnének össze.
További óvintézkedésként, annak ellenére, hogy a genetikai anyagot a páciens testének egymástól távoli pontjain két vagy több oltóanyagban adjuk be, egy vagy több esszenciális gént deletálhatunk vagy szándékosan megváltoztathatunk, hogy még jobban megakadályozzuk egy fertőző vírusrészecske kialakulását. Az ilyen megvalósítási módokban a páciensnek nem teljes funkcionáló vírusgénkészletet adunk be.
Egy további óvintézkedésként az elkülönített oltóanyagokat alkotó különböző genetikai konstrukciókba a vírusgenom nem átfedő részeit építjük, így megakadályozzuk a két genetikai konstrukció közötti rekombinációt.
A találmány néhány megvalósítási módjában teljes strukturális génkomplementet alkalmazunk. A HÍV strukturális génjei a gag, pol és env gének. Ezt a három gént két különböző DNS- vagy RNS-konstrukción helyezzük el. Ennek megfelelően az egyik előnyben részesített megvalósítási módban a gag és pol gén az egyik DNS- vagy RNS-konstrukción, az env gén pedig a másikon helyezkedik el. Egy másik előnyben részesített megvalósítási módban a gag gén helyezkedik el az egyik DNS- vagy RNSkonstrukción, a pol és env gén pedig a másikon. Egy harmadik előnyben részesített megvalósítási módban a gag
HU 219 767 Β és env gén az egyik DNS- vagy RNS-konstrukción, a pol gén pedig a másikon helyezkedik el. Néhány előnyben részesített megvalósítási módban a rév gént tartalmazó konstrukciók a rév start kodonjától upstream irányban splice akceptorral rendelkeznek. Néhány előnyben részesített megvalósítási módban a gag génnel rendelkező konstrukciók a gag transzlációs start kodonjától upstream irányban splice donorral rendelkeznek. A fenti kombinációk bármelyikében adott esetben HÍV regulátorgének szintén jelen lehetnek. A HÍV regulátorgének a vpr, vif, vpu, nef, tat és rév.
Egy előnyben részesített megvalósítási módban a DNS-konstrukció egy promoterből, egy enhancerből és egy poliadenilációs jelből áll. A promoter a HÍV LTR, humán aktin, humán miozin, CMV, RSV, Moloney, MMTV, humán hemoglobin, humán izom kreatin és EBV közül választható ki. Az enhancer a humán aktin, humán miozin, CMV, RSV, humán hemoglobin, humán izom kreatin és EBV közül választható ki. A poliadenilációs jelet az LTR poliadenilációs jel és az SV40 poliadenilációs jel közül választjuk ki; elsősorban, többek között, az SV40 kis poliadenilációs jelet alkalmazzuk.
Néhány megvalósítási módban a két oltóvakcinát intramuszkulárisan a páciens térbelileg elkülönült szövetébe adjuk be, előnyösen különböző testrészekbe, például a jobb és a bal karba. A találmány szerinti valamennyi oltóanyag körülbelül 0,1 pg és körülbelül 1000 pg közötti mennyiségben, előnyösen körülbelül 1 pg és körülbelül 500 pg közötti mennyiségben, még előnyösebben körülbelül 25 pg és körülbelül 250 pg közötti mennyiségben tartalmaz DNS-t. Az oltóanyagok legelőnyösebben körülbelül 100 pg DNS-t tartalmaznak.
Az oltóanyagot néhány megvalósítási módban stril izotóniás oldatban, előnyösen foszfátpufferelt sóoldatban készítjük el.
Néhány megvalósítási módban a vakcinázni kívánt szövetbe a vakcina beadása előtt sejtproliferációt elősegítő szert, előnyösen bupivacaint injektálunk. A bupivacain injekciókat a vakcinálás előtt legfeljebb 24 órával adjuk be; de beadhatjuk közvetlenül a vakcinálás előtt is. A vakcina tervezett beadási helyére körülbelül 50 pl és körülbelül 2 ml közötti mennyiségben, előnyösen 50 pl és körülbelül 1500 pl közötti mennyiségben, még előnyösebben körülbelül 1 ml mennyiségben izotóniás NaCl-oldatban 0,5% bupivacain-HCl-ot és 0,1% metil-parabént adunk be.
Más megvalósítási módokban a sejtproliferációt elősegítő szert, előnyösen bupivacaint, a genetikai konstrukcióval együtt a készítménybe foglaljuk. A vakcina beadási helyére körülbelül 50 pl és körülbelül 2 ml közötti mennyiségben, előnyösen 50 pl és körülbelül 1500 pl közötti mennyiségben, még előnyösebben körülbelül 1 ml mennyiségben izotóniás NaCl-oldatban 0,5% bupivacain-HCl-ot és 0,1% metil-parabént adunk be.
Néhány megvalósítási módban a vakcina két oltóanyagból áll: az egyik két HÍV strukturális gént tartalmazó DNS- vagy RNS-konstrukciót, a másik, a fennmaradt harmadik HÍV strukturális gént tartalmazó DNSvagy RNS-konstrukciót foglal magában, miáltal a kombinált oltóanyagok a HÍV strukturális gének teljes komplementjét tartalmazzák. Az egyes DNS-konstrukciókban a strukturális gének működőképesen kapcsolódnak egy promoterhez, egy enhancerhez és egy poliadenilációs jelhez. A vírusgének expresszióját ugyanazon vagy különböző szabályozóelemek irányíthatják. A páciens vakcinálásakor a két oltóanyagot intramuszkulárisan különböző helyekre, előnyösen a két karba adjuk be. A találmány néhány megvalósítási módjában az oltóanyag beadási helyére először bupivacaint adunk be. Más megvalósítási módokban a bupivacaint a genetikai konstrukcióval együtt a készítménybe foglaljuk.
Néhány megvalósítási módban a vakcinálási eljárást legalább egyszer, előnyösen kétszer vagy háromszor megismételjük. Az egyes vakcinálásokat úgy végezzük, hogy a köztük eltelt idő 24 órától két hónapig terjedhet.
Néhány megvalósítási módban a vakcinát tű nélküli injektálókészülék alkalmazásával adjuk be. Néhány megvalósítási módban a vakcinát tű nélküli injektálókészülék alkalmazásával hypodermálisan adjuk be, ami egyszerre intramuszkuláris, intradermális és szubkután, valamint intersticiális beadást eredményez.
Az előnyben részesített genetikai konstrukciók közé az alábbiak tartoznak.
Plazmidok és klónozási stratégiák
Két plazmidot állítottunk elő, melyek közül az egyik HÍV gag és pol gént, a másik HÍV env gént tartalmaz.
A pNL43 HÍV-1 genomklónt a NIH AIDS Research and Reference Reagent Programon keresztül (ARRRP) (Division of AIDS, NIAID, NIH) Dr. Malcolm Martintól kaptuk, s ez a klón a HÍV -1 gének genetikai konstrukciókban való alkalmazásának kiindulási anyagaként szolgál. Más lehetőség szerint polimeráz-láncreakció alkalmazásával a konstrukció kialakításához fertőzött sejtekből származó bármilyen HÍV molekuláris klón módosítható; ilyenek a HXB2 klón, az MN klón, valamint az SF vagy a BAL-1 klón. A pNL43 klón olyan konstrukció, amely a pUC18 plazmidba klónozva HIV-1 provirális DNS-t és az integráció helyéből származó 3 kb gazdaszekvenciát tartalmaz.
A pNL-puro-env-plazmid előállítása
Ezt a plazmidot a gag pol gének expressziójához hoztuk létre. A pNL43 nem HÍV eredetű 5’ humán szegélyező DNS-szekvenciáján belül az Stul helyet Stul enzimmel végzett részleges emésztéssel megszüntettük, majd a szabad végeket E. coli poiimeráz-l-gyel emésztettük. A lineáris plazmidot fel töltöttük, majd önmagával ligáltuk, miáltal a HIV-genomon belül egyetlen Stul hely maradt. Ezt a plazmidot (pNLDstu) ezután Stul és BsaBI, tompa végeket kialakító enzimekkel emésztettük, melyek a gpl20 kódolószekvenciájából egy nagy szakaszt távolítottak el. Az SV40 promotert és a puromycinrezisztenciát kódoló régiót (puromycin-acetil transzferáz; PÁC) EcoRI és Clal alkalmazásával pBABE-puro plazmidból izoláltuk [Morgenstem és Land, Nucl. Acids. Rés., 75(12), 3587-3596,1990; melyet itt hivatkozásul említünk] [a plazmidot Dr. Hartmut Land (Imperial Cancer Research Fund) bocsátotta rendelkezésünkre]. Az izolált fragmenst tompa végűvé
HU 219 767 Β alakítottuk, majd az StuI/BsaBI enzimekkel emésztett pNLDstu plazmidba klónoztuk. A kiónt az SV40-puro fragmenssel a helyes orientációban szelektáltuk, hogy a HÍV 3’ LTR poli-A funkciókat biztosítson a PÁC üzenet számára. A kapott plazmidot pNLpuro-nak neveztük el.
A vpr szabályozógén HÍV gag pol vektorból való deléciójának klónozási stratégiája
Az egyetlen PflMI helytől közvetlenül upstream irányban kezdődő, és közvetlenül a vif terminációs kodon után végződő régiót PCR-technikával olyan primerek alkalmazásával amplifikáltuk, melyek a vpr 22. aminosaván nem konzervatív aminosavcserélődést (glu-val), a vpr leolvasási keretében közvetlenül a 22. aminosav után egy stop kodont, és közvetlenül az új stop kodon után egy EcoRI hely bevitelét eredményezték. Ezzel a PCR-fragmenssel a pNLpuro vagy pNL43 PflMI-EcoRI fragmensét helyettesítettük. Ez a szubsztitúció a vpr nyitott leolvasási keretéből 222 nukleotid delécióját eredményezte, megszüntetve ezáltal a reverzió lehetőségét, ami a pontmutáció velejárója. A kapott pNLpuro vpr plazmid a vpr első természetes aminosavat plusz egy valint tartalmaz, továbbá natív formában tartalmazza valamennyi fennmaradó HÍV-1 gént és splice illeszkedést. A deléciós módszer a nef, vif és vpu génekhez is alkalmazható, s lehetővé teszi a strukturális gének expresszióját, miközben meggátolja az élő rekombináns vírus kialakulását.
Plazmidkonstrukció az „envelope” expresszióhoz
A HÍV-1 HXB2 envelope génjét kódoló DNS-szegmenst az AIDS Research and Reference Reagent Programtól kapott lambda-klónozott DNS alkalmazásával PCR amplifikációs technikával klónoztuk. Az 5’ és 3’ primerek szekvenciája az 5’-AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3’ (1. szekvencia), amely Xhol helyet foglal magában, illetve az 5’-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3 ’ (3. szekvencia), amely Xbal helyet foglal magában. E primerek a gpl60, tat és rév kódolórégiókat veszik körül. A génspecifikus amplifikációt 7a</-polimeráz alkalmazásával a gyártó (Perkin-Elmer Cetus Corp.) útmutatásai alapján végeztük. A PCR reakciótermékeket 37 °Con 30 percig 0,5 pg/ml koncentrációjú proteináz K-vel kezeltük, majd fenol/kloroform extrakciót és etanolos kicsapást végeztünk. A kapott DNS-t 37 °C-on két óráig Xhol és Xbal enzimmel emésztettük, s agarózgélelektroforézist végeztünk. Az izolált és tisztított Xhol-Xbal PCR-fragmenst Bluescript plazmidba (Stratagene Inc., La Jolla, CA) klónoztuk, majd a pMAMneoBlue eukarióta expressziós vektorba (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) szubklónoztuk. A kapott konstrukciót pM160-nak neveztük (1A. ábra). A plazmid-DNS-t CsCl gradiens ultracentrifugálással tisztítottuk. A pM160-konstrukció promoterként az MMTV LTR-rel az RSV enhancer elem szabályozása alatt a HIV-1/HXB2 (Fischer, A. G. és munkatársai, Natúré, 316, 262-265, 1985) gpl60 membránkötött glikoproteint kódolja.
Alternatív „ envelope ” expressziós plazmidkonstrukció (HIV-1 env-rev-plazmid)
A rév két exonját kódoló régiót és a vpu-X és a HIV-1 HXB2 envelope nyitott leolvasási keretét PCRtechnikával amplifikáltuk, s a pCNDA/neo expressziós vektorba (Invitrogen) klónoztuk. Ez a plazmid az envelopetermelést a CMV promoter irányítása alatt végzi.
Előállítás és tisztítás
A plazmidot E. coliban (DH5-alfa) az alábbiak szerint termeljük. A fagyasztott törzsből származó kívánt plazmidtenyészetet LB+ampicillin agarlemezre kenjük, majd a lemezt 37 °C-on egy éjszakán keresztül (14-15 óra) inkubáljuk. A lemezről leveszünk egy telepet, s azt peptonkészítményt és 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápközegbe oltjuk. A tenyészetet 37 °C-on rázatás mellett (körülbelül 175 fordulat/perc) 8-10 óráig növesztjük, míg az OD^-érték legalább 1,0 nem lesz. Egy liter, peptonnal és 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített LB tápközeget 1,0 OD-értékű tenyészettel oltunk be. Ezeket az 1-2 literes tenyészeteket 37 °C-on rázatás közben (175 fordulat/perc) egy éjszakán át növesztjük.
Az E. coliban (DH5-alfa törzs) termelődött plazmidokat begyűjtjük, s az alábbiak szerint tisztítjuk. A sejtek lízisének és tisztításának általános eljárásait illetően lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, 1989). A sejteket bekoncentráljuk és glükóz-Tris-EDTA-pufferrel (pH=8,0) mossuk. A bekoncentrált sejteket lizozimmel végzett kezeléssel lizáljuk, s rövid ideig 0,2 N KOH-oldattal kezeljük, majd a pH-t kálium-acetát/ecetsav pufferrel 5,5-re állítjuk be. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, s a felülúszóhoz a plazmid kicsapása érdekében 2-propanolt adunk. A plazmidot Tris-EDTA-pufferben újra feloldjuk, s fenol/kloroform extrakcióval és 2-propanollal végzett újabb kicsapással tovább tisztítjuk.
Az endotoxin adott esetben számos eljárással eltávolítható, ezek közé tartoznak az alábbiak: specifikus adszorpció immobilizált anyagokkal, mint például polymyxinnel [Tani és munkatársai, Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnoi., 20 (2-4), 457-62, 1992; Issekutz, J. Immunoi. Methods, 67(3), 275-281, 1983]; antiendotoxin monoklonális antitestekkel, mint a 8A1 és HA-1A™ [Centocor, Maivem, PA; Bogard és munkatársai, J. Immunoi., 750 (10), 4438-4449, 1993; Rietschel és munkatársai, Infect. Immunity, 3863. oldal, 1993]; pozitív töltésű vastag filterekkel [Hou és munkatársai, J. Parenter. Sci. Technoi., 44 (4), 204-209, 1990. július-augusztus] poli(y-metil-L-glutamát)-tal [Hirayama és munkatársai, Chem. Pharm. Bull., (Tokio), 40 (8), 2106-2109, 1992]; hisztidinnel [Matsumae és munkatársai, Biotechnoi. Appl. Biochem., 72 (2), 129-140, 1990]; hidrofób kölcsönhatási oszlopokkal és membránokkal [Aida és munkatársai, J. Immunoi. Methods, 132 (2), 191-195,1990; Umeda és munkatársai, Biomater Artif Cells Artif Organs, 18 (4), 491-497, 1990; Hou és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 1073 (1), 149-154, 1991; Sawada és munkatársai, J. Hyg. (London), 97 (1) 103-114,1986]; endotoxin eltávolítására alkalmas specifikus hidrofób gyantákkal, köztük a hidrofób polisztirol/divinil-benzol
HU 219 767 Β vagy divinil-benzol-gyanták, mint a Brownlee Polypore Resin (Applied Biosystems, Palo Alto, CA); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, MI); HP20, CHP20P (Hamilton, Reno, NV); Jordi Reversed-Phase DVB, Jordi Gél DVB, Polymer Labs PLgelTM (AI1tech, Deerfield, IL); Vydac PLx™ (Separations Group, Hesperia, CA); alkalmazhatók, továbbá egyéb endotoxin-eltávolító anyagok és eljárások, mint például a Detoxi-Gel™ Endotoxin Removing Gél (Pierce Chemical, Rockford, IL); Application Note 206 (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ). Általános áttekintést illetően lásd: Sharma, Biotech. App. Biochem., 8, 5-22, 1986). Az előnyben részesített endotoxin elleni monoklonális antitestek az endotoxin konzervált doménjeihez kötődnek, előnyösen lipid A-hoz, amely az endotoxin-molekula szerkezetileg legjobban konzervált része. Az ilyen antilipid A monoklonális antitestek közé tartozik a nagy affinitású 8A1 egér-IgG monoklonális antitest és a HA-1A™ humán antilipid A IgM(k) monoklonális antitest. A HA-1A™ a humán Β E. coli J5 vakcinából származik. A HA-1A™ számos bakteriális endotoxinnal (lipopoliszacharidokkal) széles körben keresztreaktív.
2. példa
A genetikai vakcinálással és a proteines vakcinálással kiváltott immunreakciók összehasonlítása érdekében idegen targetproteineket, specifikusan expresszáló tumorsejtek alkalmazásával állatmodelleket hoztunk létre. Három idegen antigéneket expresszáló immunkompetens egérmodellt fejlesztettünk ki, melyhez Balb/c egértörzsből származó három klonális tumorsejtvonalat alkalmaztunk. A sejtvonalak a következők: (1) limfoidsejtvonal, amely más szövetekre nem terjed át jelentős mértékben, de nagy, kitapintható daganatokat hoz létre, melyek az állatot 8-12 héten belül elpusztítják; (2) egérmelanoma-sejtvonal, mely képes bizonyos mértékű átterjedésre, többnyire a tüdőre, s egymillió sejttel végzett beoltás után az egerekben nagy, kitapintható daganatokat okoz, melyek az állatokat 10-12 héten belül elpusztítják; (3) egértüdőadenocarcinoma-sejtvonal, amely több szövetre átterjed, s az állatot 12 vagy több héten belül elpusztítja. Olyan szubklónokat választottunk ki, amelyek idegen antigénekkel rendelkeznek, de felismerhetetlen formában. Amikor a transzfektált tumorokat az egérgazdatörzsbe ültetjük át, a hasonló egértumor-sejtvonalakkal ellentétben az egerek nem alakítanak ki védőhatású immunreakciót az idegen antigénre, és szervezetük befogadja a tumorokat. Ezek a tumorok azután az eredeti, transzfektálatlan tumorral azonos fenotípussal és azonos idő alatt elpusztítják az állatokat. E modelleket alkalmazva mérhetjük a genetikai vakcinálással az antigén ellen kiváltott immunreakciót.
Azt tapasztaltuk, hogy az egér sejtjeiben targetprotein termelését eredményező genetikai konstrukciót tartalmazó genetikai vakcinával kezelt egerek immunreakciót (beleértve az erős citotoxikus reakciót) mutattak, s ezek a reakciók teljesen eltávolították a targetproteinnel rendelkező tumorokat, az ilyen proteinnel nem rendelkező tumorokra azonban nem hatottak. A magával a targetproteinnel beoltott egerekben a kiváltott immunreakció sokkal kevésbé volt hatásos. A daganatok mérete csökkent, de a citotoxikus reakció hiánya miatt a daganatok nem szűntek meg. A genetikai vakcinával és alegységvakcinával kezelt állatok, valamint a vakcinával nem kezelt állatok immunreakcióinak összehasonlítására végzett kísérletekben kontrollként transzfektálatlan tumorokat alkalmaztunk. Ezek a kísérletek világosan bizonyítják, hogy a genetikai vakcina szélesebb körű és hatásosabb immunreakciót váltott ki, amely a CTL-sejteknek köszönhetően teljesen eltávolítja a daganatokat. Ezzel szemben az intakt targetprotein alkalmazásával végzett immunizálás korlátozottabb, s kevésbé széles körű immunreakciót hozott létre.
3. példa
A találmány egy másik megvalósítási módjában HÍV elleni genetikai vakcinát alakítottunk ki. A genetikai vakcinát targetproteinként a gpl60 vírusprotein (amely érési folyamatok során a gpl 20 és gp41 proteinekké alakul) ellen termeljük. A genetikai vakcina olyan DNS-konstrukciót foglal magában, amely szabályozóelemekhez működőképesen kapcsolódó, gpl60-at kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A genetikai vakcinában lévő DNS-konstrukció a páciensnek történt beadás után beépül a páciens sejtjeibe, és gpl60-at termel. A protein által kiváltott immunreakció széles körű, s humorális immunreakcióból, illetve mindkét fajta celluláris immunreakcióból áll. A széles körű biológiai reakció sokkal nagyobb védelmet biztosít, mint amit akkor érhetünk el, ha önmagában a proteint adjuk be.
Az egereket az 1. példában leírt pM160 plazmiddal intramuszkulárisan oltottuk, majd vizsgáltuk az antiHIV immunreakciókat. Az így immunizált állatokból származó antiszérum HÍV envelope glikoprotein elleni immunreakciókat hoz létre, melyeket ELISA-módszerrel és immunprecipitációs vizsgálattal mértünk. Az antiszérum semlegesíti a HIV-l-fertőzést, és gátolja a HIV-1 által indukált syncytiumképződést.
A megfigyelt semlegesítés és syncytiumellenes aktivitás a HIV-1 envelopeprotein funkcionálisan lényeges régiói (mint például, többek között a gpl20 V3 hurokja, a CD4 kötési hely és a gp41 N-terminális „immundomináns” régiója) ellen kiváltott antitestek reaktivitásának lehet az eredménye.
Az itt leírt genetikai immunizálásban a BALB/c egerek quadriceps izmába az izomsejtek regenerációjának serkentése és a genetikai konstrukció felvételének elősegítése érdekében 27-es tűvel izotóniás NaCl-oldatban 100 pl 0,5%-os bupivacain-HCl-ot és 0,1 %-os metilparabént injektáltunk. 24 órával később az előző oltással megegyező helyeken 100 pg pM160 plazmidot vagy kontrollplazmidként 100 pg pMAMneoBlue plazmidot (1 A. ábra) injektáltunk. Az egereknek azonos módon, de bupivacain-HCl-os előkezelés nélkül, azonos mennyiségű DNS-konstrukcióval, kéthetes időközönként három emlékeztető oltást adtunk.
A rekombináns gpl60 elleni immunizálás esetében BALB/c egereket először komplett Freund-féle adjuvánsban adott 1 pg glikozilált, rekombináns (HÍV—1/IIIB)
HU 219 767 Β gpl 60-nal (MicroGeneSys Inc.) immunizáltuk, majd inkomplett Freund-féle adjuvánsban adott 1 pg gpl60nal háromszor (kéthetes időközönként) emlékeztető oltást végeztünk. A HIV-1 gpl60 elleni antitesttermelést az egérszérum-gpl60-at immunprecipitáló képességének tesztelésével határoztuk meg. Az immunprecipitációt 1 χ 106 cpm 125I-izotóppal jelölt rgpl60, egérszérum és protein-G agarózgyöngyök (GIBCO, Inc.) alkalmazásával Osther, K. és munkatársai korábbi leírása szerint végeztük (Hybridoma, 10, 673-683, 1991; melyet hivatkozásul említünk). A specifikus precipitátumokat 10%-os SDS-PAGE alkalmazásával analizáltuk. A 2. ábra 1. oszlopán a 125I-gpl60-nal reagáltatott 1 pl preimmun egérszérummal kapott eredmény, a 2. oszlopon a pM160 plazmiddal immunizált egerekből származó 1 pl egérszérummal kapott eredmény, a 3. oszlopon pedig a kontrollként 1 pl 1:100 hígítású ID6 antigpl20 monoklonális antitest (Ugen, K. E. és munkatársai: Generation of Monoclonal Antibodies Against the Amino Region of gpl20 Which Elicits Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, 1992, Cold Spring Harbor) alkalmazásával kapott eredmény látható. Az ábrán a nyíl a specifikusan immunprecipitált 125I-gpl60 envelope glikoproteint jelzi.
A 125I-izotóppal jelölt gpl60-at a pM160 plazmiddal immunizált egerekből származó antiszérum (2. ábra, 2. oszlop), valamint az ID6 anti-gpl20 monoklonális antitest (pozitív kontroll) (2. ábra, 3. oszlop) specifikusan immunprecipitálta, az preimmun szérum (2. ábra, 1. oszlop) azonban csak minimális aktivitást mutatott.
A tíz, pM160-konstrukcióval immunizált egér közül az ELISA-vizsgálatban nyolc pozitív reakciót mutatott a gpl60 ellen, s a legmagasabb anti-gpl60 titerrel rendelkező állat immunreakcióit részletesen analizáltuk. A kontrollvektorral immunizált négy egér közül az ELISA-vizsgálatban valamennyi hasonló negatív reaktivitást mutatott a gpl60-ra, s ezen szérumok egyikét használtuk kontrollként a következő kísérletekhez.
Kimutatták, hogy a HIV-et semlegesítő antitestek specifikusan a gpl20 és gp41 több epitópját célozzák meg; ezek közé tartozik a gpl20 V3 hurokja (Goudsmit, J. és munkatársai, AIDS, 2, 157-164, 1988; Putney, S. D. és munkatársai, Development of an HÍV Subunit Vaccine, Montreal, 1989), a gpl20 C-terminálisához közeli CD4 kötőhely (Lasky, L. A. és munkatársai, Cell, 50, 975-985, 1987), valamint a gp41 N-terminális fúziós régiótól közvetlenül downstream irányban elhelyezkedő immundomináns hurokja (Schrier, R. D. és munkatársai, J. Virol., 62, 2531-2536,1988).
Hogy meghatározzuk, vajon ezekben az egerekben termelődött anti-gpl60 antitestek reaktívak-e az envelope glikoproteinek fenti fontos régióival, a BRU/V3 huroknak, az MN/V3 huroknak, a HXB2/gp41 Nterminálisnak és a HXB2/CD4 kötési helynek megfelelő peptideket mikrotiterlemezeken abszorbeáltuk, s ELISA-vizsgálattal meghatároztuk az egérantiszérumok specifikus reaktivitását. Mikrotiterlemezeken 0,1 M bikarbonátpufferben (pH=9,5) 1 pg/ml gpl60at, illetve mindegyik peptidből 10 pg/ml-t 4 °C-on egy éjszakán át inkubáltunk, majd a lemezeket PBS-ben 2% szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkoltuk, s 37 °C-on egy órán át HRPO-val (Fischer) konjugált kecske-antiegér-IgG-vel reagáltattuk, és sötétben 10-30 percig TMB-szubsztráttal (Sigma) kezeltük. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Az antiszérumokat a következők szerint jelöljük: (-H—): preimmun szérum; (- χ -): pMAMneoBlue-vektorral immunizált egerekből származó szérum; (—O—): pM160-konstrukcióval immunizált egerekből származó szérum; (—Δ—): rgpl60-nal immunizált egerekből származó szérum. A 3A. ábrán az rgplóO proteinnel bevont lemez alkalmazásával kapott eredményeket mutatjuk be. A 3B. ábrán a BRU/V3 hurok peptidekkel (CNTRKRIRIQRGPGAFTIGK; 11. szekvencia) bevont lemezek alkalmazásával kapott eredmények láthatók. A 3C. ábrán az MN/V3 hurok peptidekkel (YNKRKRIHIQRGPGRAFYTTKNIIC; 12. szekvencia; a vastagon szedett QR aminosavak a HÍV- l/IIIB-ből származnak) bevont lemezek alkalmazásával kapott eredmények láthatók. A 3D. ábrán a HXB2/CD4 kötőhely peptidekkel (CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGIRC; 13. szekvencia) bevont lemezek alkalmazásával kapott eredményeket mutatjuk be. A 3E. ábrán a BRU/gp41 immundomináns régió peptidekkel (RILAVERYIKDQQLLGIWGCSGKLIC; 14. szekvencia) bevont lemezek alkalmazásával kapott eredmények láthatók.
A 3. ábrán látható, hogy a pM160-konstrukcióval immunizált egérből származó antiszérum lényegesen nagyobb reaktivitást mutatott a BRU és MN/V3 hurok peptidekre, a CD kötőhely pepiidre és az immundomináns gp41 peptidre, mint a rekombináns gpl60 proteinnel (rgp 160) immunizált szérum. Az rgp 160-nal immunizált egérből származó antiszérum rgp 160 elleni titere sokkal nagyobb volt, mint a pMl 60-nal immunizált antiszérumé, a gpl60 három tesztelt specifikus semlegesítő epitópja ellen azonban kisebb aktivitást mutatott.
Annak meghatározása érdekében, hogy a DNSimmunizálással kialakított antiszérum rendelkezik-e vírusellenes aktivitással, az antiszérum HÍV-1-fertőzést semlegesítő képességét vizsgáltuk. Sejtmentes HIV-1/IIIb vírust MT-2 célsejtek (Montefiori, D. C., J. Clin. MicrobioL, 26, 231-235, 1988) fertőzéséhez való felhasználása előtt 100 TCID50-értékkel az antiszérum sorozathígításaival inkubáltuk.
100 TCID50HIV-1/IIIb sejtmentes vírust 37 °C-on egy órán át az antiszérum sorozathígításaival preinkubáltuk. Az inkubálás után az előkezelt vírusokat 37 °Con egy órára 4 χ 104 MT-2 célsejtre szélesztettük, majd a fertőzés után az MT-2 sejteket háromszor mostuk, s 37 °C-on 5% CO2-ot tartalmazó levegőben inkubáltuk. A fúziót három nappal később a syncytiumok üregenkénti számának fáziskontraszt-mikroszkóppal háromszori ismétléssel végzett számolásával értékeltük.
Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. A 4A. ábrán a vektorra] immunizált egérből származó szérummal kapott eredmények láthatók, összehasonlítva a 4B. ábrán bemutatott, pM 160-nal immunizált egérből származó szérummal kapott eredménnyel. A 4C. ábrán
HU 219 767 Β a hígítás! faktorok függvényében mutatjuk be a semlegesítési értékeket (V„/Vo) (Nara, P., Techniques In HÍV Research, szerkesztő: Aldovini, A. és Walkter, B. D., 77-86. oldal, 1989, M. Stockton Press). Kontrollszérumként (- + -) pMAMneoBlue vektorral immunizált szérumot alkalmaztunk, a tesztszérum pedig (-O-) a pM160-konstrukcióval immunizált egerekből származó szérum volt.
A syncytiumgátlást Osther, K. és munkatársai leírása (Hybridoma, 10, 673-683, 1991) szerint végeztük. A H9/IIIb sejtvonalat 96 üregű lemezeken 50 μΐ végtérfogatban antiszérum-sorozathígításokkal (1:100, 1:200 és 1:400) 37 °C-on 5% CO2 jelenlétében 30 percig preinkubáltuk. A fúziót három nappal később a kialakult syncytiumok fáziskontraszt-mikroszkóppal végzett számlálással kvantitatívan értékeltük. A 4D. ábrán a preimmun szérummal kezelt HÍV- 1/IIIB sejtvonallal együtt tenyésztett célsejtek láthatók. A 4E. ábrán a vektorral immunizált kontrollszérummal kezelt HÍV- 1/IIIB sejtvonallal együtt tenyésztett célsejtek láthatók. A 4F. ábrán az rgpl60-konstrukcióval immunizált szérummal kezelt HIV-1/IIIB sejtvonallal együtt tenyésztett célsejteket mutatjuk be. A 4G. ábrán a pM160 plazmiddal immunizált szérummal kezelt HIV-1/IIIB sejtvonallal együtt tenyésztett célsejteket mutatjuk be. A 4D. és 4G. ábra azt mutatja, hogy e vizsgálatok során a syncytiumok kialakulásának gátlása 1:200 hígításnál nyilvánvaló volt. Az MT-2 sejteket előzetesen vektorral immunizált antiszérummal preinkubált sejtmentes HÍV— 1/IIIB vírussal fertőztük, és syncytiumok jöttek létre (4A. ábra). Összehasonlításul, a pM160-konstrukcióval immunizált egérszérummal végzett preinkubálás megakadályozta a syncytiumok kialakulását (4B. ábra). A semlegesítés kinetikáját az antiszérum sorozathígítási értékei függvényében meghatározott Vn/Vo értékekkel határoztuk meg (Nara, P., Techniques In HÍV Research, szerkesztő: Aldovini, A. és Walkter, B. D., 77-86. oldal, 1989, M Stockton Press) (4C. ábra). A pM160konstrukcióval immunizált egérből származó szérum egészen 1:320 hígításig hatásos semlegesítőaktivitással rendelkezett, míg a kontrollantiszérum nem mutatott hasonló aktivitást.
Annak meghatározása érdekében, hogy a pM160konstrukcióval immunizált egérből származó antiszérum gátolja-e a közvetlen sejt-sejt fúzión keresztül megvalósuló envelopeközvetett vírusterjedést, syncytiumgátlási vizsgálatokat végeztünk. A pM160-konstrukcióval immunizált egérből származó antiszérum 1:200 hígításban gátolja az HIV-1 által indukált syncytiumképződést (4G. ábra). Ezzel szemben a preimmun szérum (4D. ábra), a gpl60-nal immunizált egerekből származó antiszérum (4F. ábra) és a kontrollvektorral immunizált állatokból származó antiszérum (4E. ábra) ugyanezen hígításban nem gátolja a syncytiumok kialakulását.
E szérumokkal a semlegesítési (4A-4C. ábra) és a syncytiumgátlási vizsgálatokban (4D-4G. ábra) végzett megfigyelések összhangban állnak a tapasztalt ELISA-reaktivitásokkal (3. ábra). A pM160-konstrukcióval immunizált egérből származó antiszérum, amely magas szintű kötődést mutatott a semlegesítési epitópokhoz, hasonlóképpen magas szintű vírusellenes aktivitást mutatott; ezzel ellentétben az említett epitópokhoz alacsony szintű kötődést mutató szérumok, mint az rgp 160-nal immunizált egerekből származó, alacsony vírusellenes aktivitással rendelkeznek.
Annak tesztelése érdekében, hogy a pM160 konstrukcióval immunizált egerekből származó antiszérum gátolja-e a gpl20 CD4-et hordozó T-sejtekhez való kötődését, fluorocitometriával ellenőrzött közvetlen gátlási vizsgálatot végeztünk (Chen, Y. H. és munkatársai, AIDS, 6, 533-539, 1992). Azt tapasztaltuk, hogy a pM160 konstrukcióval immunizált egérből származó antiszérum képes volt gátolni a gpl20 CD4-et hordozó T-sejtekhez való kötődését; 1:15 hígítású immunszérum a FITC-gpl20 CD4+SupTl sejtekhez való kötődését ismétléssel végzett kísérletekben 22+2% arányban gátolta, amit áramlásos citometriával határoztunk meg. Ez azt jelzi, hogy ez a HIV-célsejtekbe való bejutási helyeként szolgáló régió ezen antiszérummal szintén funkcionálisan gátolható. Ez az adat összhangban áll az antiszérum CD4 kötőhely peptidekre vonatkozó ELISA-reaktivitásával (3C. ábra).
Az immunglobulinok izotipizálási vizsgálatát a kereskedelemben kapható egér monoklonális antitestizotipizáló készlet (Sigma) alkalmazásával végeztük., A pM160 konstrukcióval végzett immunizálással létrehozott anti-gpl60-specifíkus antitestek közül 19% IgGl, 51% IgG2, 16% IgG3, 10% IgM és 5% IgA. Az IgG izotípusok túlsúlya azt jelzi, hogy másodlagos , immunreakció játszódik le, továbbá felveti annak lehetőségét, hogy genetikai immunizálással helper T-sejtek. kialakulása váltható ki.
pM160 és pMAMneoBlue DNS-eket mikrotiterlemezekre vittünk fel; és a specifikus kötődést az egyes immunizált állatokból származó szérum alkalmazásával végzett ELISA-vizsgálattal határoztuk meg; plazmid-DNS-hez történő jelentős kötődést nem figyeltünk meg. Ilyenformán úgy tűnik, hogy ha genetikai anyagot izomszövetbe injektálunk, nem valószínű, hogy plazmid-DNS elleni reakció alakuljon ki.
A DNS-konstrukció egérizomba injekciós tűvel történő beadása ellentétes eredményeket adhat, mivel ez a módszer nem biztosítja az izomsejtek DNS-felvételének irányítását. A DNS-konstrukció val önmagában végzett injektálás eredményét (n=körülbelül 4) összehasonlítottuk az előzetesen bupivacainnal kezelt állatoknak (n=körülbelül 4) beadott injekciók eredményével. A két csoportban tapasztalt immunreakciók különböztek egymástól, minthogy az állatok 25%-a, illetve 75%-a mutatott reaktivitást az ELISA-vizsgálat során. Fokozott hatékonyság közvetlen DNS-beviteli rendszer, mint például a „részecskebombázás” (Klein, T. M. és munkatársai, Bio/Technology, 10, 286-291) alkalmazásával érhető el.
A semlegesítés, a syncytiumgátlás, a CD4-gpl20 kötődés gátlása és a gpl60 több fontos régiójához való specifikus kötődés bizonyítékai alátámasztják, hogy HIV-gpl60 membránkötött glikoproteint kódoló DNSkonstrukció élő állat izomsejtjeibe közvetlenül történő
HU 219 767 Β bevitelével specifikus humorális reakciókat válthatunk ki, s biológiailag releváns vírusellenes antitesteket hozhatunk létre.
A fentebb leírt állatmodellt használtuk annak tesztelése érdekében, hogy a vakcina képes-e védőhatású immunreakció kiváltására. Tumorsejteket gpl60-at kódoló DNS-sel transzfektáltunk, meggyőződtünk arról, hogy ténylegesen expresszálják-e a proteint, majd az állatba ültettük. Kontrollként transzfektálatlan tumorsejteket alkalmaztunk.
Genetikailag immunizált állatokat pM160 plazmáddal vakcináltunk. A kontrollt a nem vakcinázott, azaz csak vektor-DNS-sel oltott állatok képezték, s az állatoknak gpl 60 proteint adtunk be.
Az eredmények azt mutatják, hogy a genetikai vakcinával kezelt egerek immunreakciója elegendő volt a transzfektált tumorok teljes felszámolásához, miközben a nem transzfektált tumorokra semmilyen hatást nem gyakorolt. A gpl60 proteinnel végzett vakcinálás a transzfektált tumorok méretét némileg csökkentette a transzfektálatlan tumorok méretéhez képest, a mortalitásra azonban nem volt hatással. A nem vakcinázott egerek mind a transzfektált, mind a transzfektálatlan tumorok esetében hasonló mortalitást mutattak.
4. példa
Az alábbiakban a találmány szerinti eljárásban alkalmazható konstrukciókat soroljuk fel. A pBabe.puro vektort, amelyet az alábbiakban felsorolt több konstrukció előállításához használtuk kiindulási anyagként, eredetileg J. P. Morgenstem és H. Land állította elő és írta le [Nucl. Acids. Rés., 18 (12), 3587-3596, 1990; melyet hivatkozásul említünk]. A pBabe.puro plazmid különösen alkalmas exogén gének emlőssejtekben történő expressziójához. Az expresszálni kívánt DNS-szekvenciákat a Moloney egérleukémia-vírus (Mo MuLV) hosszú terminális ismétlődésének (LTR) promotere szabályozása alá inszertáljuk a klónozási helyekre. A plazmid puromycinrezisztenciára szelektálható markert tartalmaz.
5. példa
A pBa.Va3 egy 7,8 kb-os plazmid, amely a Babe.puro EcoRI helyére klónozva az L-, V- és Jszegmenseket tartalmazó T-sejt-receptor Va3 régiót kódoló 2,7 kb-os EcoRI genomfragmenst tartalmazza. A T-sejt-receptor eredetű targetprotein hasznos a T-sejt közvetett autoimmunbetegség és a klóntipikus T-sejt limfóma és leukémia elleni immunizálásban, illetve ezen betegségek kezelésében.
6. példa
A pBa.gagpoI-vpr plazmid egy 9,88 kb hosszúságú plazmid, amely a HIV/MN gag/pol és vif génjét a pBabe.puro vektorba klónozva tartalmazza. A vpr gén deléció folytán hiányzik. A plazmid, amely ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV géneket tartalmazza, hasznos a HIV-fertőzés és az AIDS elleni immunizálásban, illetve e betegségek kezelésében. A HÍV DNSszekvenciáját Reiz, M. S. tette közzé (AIDS Rés. Humán Retro., 8, 1549,1992; melyet hivatkozásul említünk). A szekvencia a Genbankban Ml7449 számon férhető hozzá (amit hivatkozásul említünk).
7. példa
A pM160 plazmid egy 11,0 kb-os plazmid, amely a HIV-1/3B envelopeproteint kódoló 2,3 kb-os PCRfragmenst és a rev/tat géneket a pMAMneoBlue vektorba klónozva tartalmazza. A nef régió deléció folytán hiányzik. A plazmid, amely ezeket a targetproteineket kódoló HÍV virális géneket tartalmazza, hasznos a HIV-fertőzések és az AIDS elleni immunizálásban, illetve e betegségek kezelésében. A HIV-1/3B DNSszekvenciáját A. Fischer tette közzé (Natúré, 316, 262, 1985; melyet hivatkozásul említünk). A szekvencia a Genbankban K03455 számon férhető hozzá (amit hivatkozásul említünk).
8. példa
A pBa.VL plazmid egy 5,4 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor Xbal és EcoRI helyeire klónozva egy anti-DNS-antitest VL régióját kódoló PCR-fragmenst tartalmaz. Az antitest eredetű targetprotein a Bsejt-közvetett autoimmunbetegség és a klóntipikus Bsejt limfóma és leukémia elleni immunizálásban, illetve ezen betegségek kezelésében hasznos.
Az antitestekből származó funkcionális, variábilis régiók klónozásának általános módját lásd: Chaudhary, V. K. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 87, 1066,1990; melyet hivatkozásul említünk.
9. példa
A pOspA.B plazmid egy 6,84 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor BamHI és Sáli helyeire klónozva a Borrelia burgdorferi (a Lyme-kórért felelős spirochaeta) OspA és OspB antigénjeit kódoló régiókat tartalmaz. Az OspA- és OspB-fragmensek előállításához alkalmazott primerek az 5’-GAAGGATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3’ (3. szekvencia) és az 5’-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTTAAG-3’ (4. szekvencia) [lásd Williams, W. V. és munkatársai, DNA and Cell. Bioi., 77(3), 207,1992, melyet hivatkozásul említünk]. A targetproteineket kódoló patogén géneket tartalmazó plazmid alkalmas a Lyme-kór elleni immunizálásra.
10. példa
A pBa. Rb-G plazmid egy 7,10 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor BamHI helyére klónozva rabies G-proteint kódoló, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. A rabies G-proteint kódoló patogén gént tartalmazó plazmid alkalmas a veszettség elleni immunizálásra. A DNS-szekvencia a Genebank No. M32751 számon férhető hozzá, melyet hivatkozásul említünk. Lásd még: Anilionis, A. és munkatársai, Natúré, 294, 275, 1981; melyet hivatkozásul említünk.
11. példa
A pBa.HPV-Ll plazmid egy 6,80 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor BamHI és EcoRI helyeire klónozva a humán papillomavírus (HPV) (beleértve a
HU 219 767 Β
16., 18., 31. és 33. HPV törzseket) L1 kapszid proteinjét kódoló, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. Ez a plazmid HPV-fertőzés és az általa okozott rák elleni immunizáláshoz alkalmas. A DNS-szekvencia leírása a Genebankban M15781 számon található meg, melyet hivatkozásul említünk. Lásd még: Howley, P., Fields Virology, szerkesztő: Channock, R. M. és munkatársai, 2. kötet 58. fejezet, 1625. oldal, 1990; és Shah, K. és P. Howley, Fields Virology, szerkesztő: Channock, R. M. és munkatársai, 2. kötet 59. fejezet; mindkettőt hivatkozásul említjük.
12. példa
A pBa.HPV-L2 plazmid egy 6,80 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor BamHI és EcoRI helyeire klónozva a humán papillomavírus (HPV) (beleértve a 16., 18., 31. és 33. HPV törzseket) L1 kapszid proteinjét kódoló, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. Ez a plazmid HPV-fertőzés és az általa okozott rák elleni immunizáláshoz alkalmas. A DNS-szekvencia leírása a Genebankban Ml 5781 számon található meg, melyet hivatkozásul említünk. Lásd még: Howley, P., Fields Virology, szerkesztő: Channock, R. M. és munkatársai, 2. kötet 58. fejezet, 1625. oldal, 1990; és Shah, K. és P. Howley, Fields Virology, szerkesztő: Channock, R. M. és munkatársai, 2. kötet 59. fejezet; mindkettőt hivatkozásul említjük.
13. példa
A pBa.MNp7 plazmid egy 5,24 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor BamHI helyére klónozva a HÍV MN gag (core protein) szekvenciát magában foglaló p7 kódolórégiót kódoló PCR-fragmenst tartalmaz. Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid alkalmas a HIV-fertózések és az AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre. (Reiz, M. S., AIDS Rés. Humán Retro., 8, 1549,1992; melyet hivatkozásul említünk.) A szekvencia a Genbankban Ml7449 számon férhető hozzá (melyet hivatkozásul említünk).
14. példa
A pGA733-2 plazmid egy 6,3 kb-os plazmid, amely az SW948 carcinoma-sejtvonalból pCDM8 vektor (Seed, B. és Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365, 1987; melyet hivatkozásul említünk) BstXI helyére klónozva GA733-2 felületi tumorantigént tartalmaz. A tumorral kapcsolatos targetprotein a hiperproliferatív betegségek, mint például a rák elleni immunizálásra és kezelésre alkalmas targetproteinek egyik példája. A GA733-2 antigén a vastagbélrák ellen hasznos target antigén. Ezt az antigént Szala S. és munkatársai írták le (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3542-3546,1990; melyet hivatkozásul említünk).
75. példa
A pT4-pMV7 egy 11,15 kb-os plazmid, amely a pMV7 EcoRI helyére klónozva humán CD4-receptort kódoló cDNS-t tartalmaz. A CD4 targetprotein alkalmas a T-sejt-lymphoma elleni immunizálásra, illetve kezelésre. A pT4-pMV7 plazmid az AIDS Repositoiytól 158-as katalógusszámon szerezhető be.
16. példa
A pDJGA733 egy 5,1 kb-os plazmid, amely a pBabe. puro BamHI helyére klónozva a GA733 felületi tumorantigént tartalmazza. A tumorral kapcsolatos targetprotein a hiperproliferatív betegségek, mint például a rák elleni immunizálásra és kezelésre alkalmas targetproteinek egyik példája.
17. példa
A pBa.RAS egy 6,8 kb-os plazmid, amely az először pZIPneoRAS-ból szubklónozott, majd a pBabe.puro BamHI helyére klónozott ras kódolórégiót tartalmazza. A ras targetprotein citoplazmikus jelzőmolekulák egyik példája. A ras klónozási eljárását Weinberg írta le (Mól. Cell. Bioi., 4, 1577, 1984; melyet hivatkozásul említünk). A ras-t kódoló plazmid hiperproliferatív betegségek, mint a rák (különösen a ras proteinnel kapcsolatos rákok, mint a húgyhólyagot, izmokat, tüdőt, agyvelőt és csontokat érintő rákos megbetegedések) elleni immunizálásra, illetve e betegségek kezelésére alkalmas.
18. példa a pBa.MNp55 egy 6,38 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro vektor BamHI helyére klónozva a HÍV MN gag prekurzor (core protein) szekvenciát magában foglaló p55 kódolórégiót kódoló PDC-fragmenst tartalmazza. Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid alkalmas a HlV-fertőzések és az AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre. (Reiz, M. S., AIDS Rés. Humán Retro., 1549,1992; melyet hivatkozásul említünk.) A szekvencia a Genbankban Ml7449 számon férhető hozzá (melyet hivatkozásul említünk).
19. példa
A pBa.MNp24 egy 5,78 kb-os plazmid, amely a teljes HÍV MN gag kódolórégiót magában foglaló p24 kódolórégiót kódoló, ρΜΝ-SFl-ből származó, PCR-technikával előállított fragmenst a Babe.puro vektor BamHI és EcoRI helyeire klónozva tartalmazza. Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid alkalmas a HIV-fertőzések és az AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre. (Reiz, M. S., AIDS Rés. Humán Retro., 8, 1549,1992; melyet hivatkozásul említünk.) A szekvencia a Genbankban Ml7449 számon férhető hozzá (melyet hivatkozásul említünk).
20. példa
A pBa.MNpl7 egy 5,5 kb-os plazmid, amely a HÍV MN gag prekurzor (core protein) szekvenciát magában foglaló pl7 kódolórégiót kódoló PCR-technikával előállított fragmenst a pBabe.puro BamHI és EcoRI helyeire klónozva tartalmazza. Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid alkalmas a HIV-fertőzések és az AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre. (Reiz, M. S., AIDS Rés. Humán Retro., 8, 1549, 1992; melyet hivatkozásul említünk.) A szek21
HU 219 767 Β vencia a Genbankban Ml 7449 számon férhető hozzá (melyet hivatkozásul említünk).
21. példa
A pBa.SIVenv egy 7,8 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro BamHI és EcoRI helyére klónozva egy pBR322 plazmidban SIV 239-et tartalmazó konstrukcióból amplifikált 2,71 kb-os, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. Az alkalmazott primerek az 5’-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3’ (5. szekvencia) és az 5’-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3’ (6. szekvencia). A plazmid az AIDS Research and Reference Reagent Programból 210-es katalógusszámon férhető hozzá.
22. példa
A pcTSP/ATK.env egy 8,92 kb-os plazmid, amely a pcDNAl/neo vektorba szubklónozva a HTLV-l/TSP és /ATK izolátumokból származó teljes HTLV envelope kódolórégiót kódoló, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. Az alkalmazott primerek az 5’-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3’ (7. szekvencia) és az 5’GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3’ (8. szekvencia). A pcTSP/ATK.env plazmid leírását lásd: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3599,1988 (melyet hivatkozásul említünk). A HTLV env targetprotein alkalmas a HTLV okozta fertőzések és a T-sejt-lymphoma elleni immunizálásra, illetve e betegségek kezelésére.
23. példa
A pBa.MNgpl60 egy 7,9 kb-os plazmid, amely a pBabe.puro BamHI és EcoRI helyére klónozva a pSP72-ben MNenv gént tartalmazó konstrukcióból amplifikált 2,8 kb-os, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. Az alkalmazott primerek az 5’GCCTTAGGCGGATCCTATGGC AGG AAG-3 ’ (9. szekvencia) és az 5’-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3’ (10. szekvencia) (Reiz, M. S., AIDS Rés. Humán Retro., 8, 1549,1992; melyet hivatkozásul említünk). A szekvencia a Genbank No. M17449 számon férhető hozzá (amit hivatkozásul említünk). Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid alkalmas a HIV-fertőzések és az AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre.
24. példa
A pC.MNp55 egy 11,8 kb-os plazmid, amely a pCEP4 vektorba klónozva egy 1,4 kb-os, MN izolátum gag régiójából amplifikált, PCR-technikával előállított fragmenst tartalmaz. Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid alkalmas a HIV-fertőzések és az AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre. (Reiz, M. S., AIDS Rés. Humán Retro., 8, 1549,1992; melyet hivatkozásul említünk.) A szekvencia a Genbankban Ml 7449 számon férhető hozzá (melyet hivatkozásul említünk).
25. példa
A pC.Neu egy 14,2 kb-os plazmid, amely a humán neu onkogén kódolórégiót tartalmazó 3,8 kb-os DNSfragmenst tartalmaz, melyet az LTR-2/erbB-2 konstrukcióból vágtunk ki, és a pCEP4 vektorba szubklónoztunk. A pC.Neu plazmidot DiFiore írta le (Science, 237, 178, 1987; melyet hivatkozásul említünk). A neu onkogén targetprotein a növekedési faktorok egyik példája, amely targetproteinként alkalmas hiperproliferatív betegségek, mint a rák, különösen a vastagbélrák, emlőrák, tüdőrák és agyvelőrák elleni immunizálásra, illetve ezen betegségek kezelésére.
26. példa
A pC.RAS egy 11,7 kb-os plazmid, amely ras onkogént kódoló régiót tartalmazó 1,4 kb-os DNS-fragmenst foglal magában, melyet először pZIPneoRAS vektorból szubklónoztunk, majd a pCEP4 BamHI helyére szubklónoztunk. A pC.RAS plazmidot Weinberg írta le (Mól. Cell. Bioi., 4, 1577, 1984; melyet hivatkozásul említünk). A ras targetprotein a citoplazmikus jelzőmolekulák egyik példája. A ras-t kódoló plazmid hiperproliferatív betegségek, mint a rák (különösen a ras proteinnel kapcsolatos rákok, mint a húgyhólyagot, izmokat, tüdőt, agyvelőt és csontokat érintő rákos megbetegedések) elleni immunizálásra, illetve e betegségek kezelésére alkalmas.
27. példa
A pNLpuro egy 15 kb-os plazmid, amely HÍV gag/pol és SV40-puro inszerciót tartalmaz. Ezeket a HÍV targetproteineket kódoló HÍV vírusgéneket tartalmazó plazmid HIV-fertőzések és AIDS elleni immunizálásra, illetve kezelésre alkalmas.
28. példa
Genetikai vakcina humán GD4 elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze. Ezeket a kísérleteket a vakcinák Tlymphoma antigén elleni védőképességének tesztelése érdekében végeztük. A T-sejt-lymphomában a CD4 egy tumorspecifikus antigén, így ez a modell a genetikai vakcina T-lymphoma elleni védőképességét demonstrálja. Ezekben a kísérletekben továbbá az immunglobulin molekulacsalád egyik tagjának hatékonyságát is teszteltük. A CD4 az ember és az egér között nagymértékben konzervált.
A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket CD4-et kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték. Annak ellenére, hogy az állatok immunkompetensek voltak, a vakcinával nem kezelt állatokban a beültetett, CD4-gyel megjelölt tumorok ellen nem alakult ki immunreakció.
A genetikailag immunizált állatokat a 15. példában leírt pT4-pMV7 plazmiddal vakcináltuk. Kontrollként vakcinálás nélküli, illetve CD4 proteinnel beoltott állatokat alkalmaztunk.
A genetikai immunizálás során BALB/c egerek quadricepsizmaiba 27-es tűvel 100 μΐ 0,5%-os bupivacain-HCl-ot és 0,1% metil-parabént (izotóniás NaCl22
HU 219 767 Β oldatban) injektáltunk, hogy serkentsük az izomsejtek regenerálódását, és hogy elősegítsük a genetikai konstrukció felvételét. 24 órával később az előző injekció helyére 100 pg pT4-pMV7 plazmidot, illetve kontrollplazmidként 100 pg pMV7 plazmidot injektáltunk. Az egereknek azonos mennyiségű DNS-konstrukcióval hasonló módon, de bupivacain-HCl-os előkezelés nélkül, kéthetes időközönként háromszor emlékeztető oltást adtunk.
Az állatokba egymillió, CD4-gyel jelölt sejtet ültettünk. A vakcinával nem kezelt állatokban nagy daganatok alakultak ki, s elhullásuk körülbelül 7-10 hét elteltével következett be. A vakcinával kezelt állatokban hasonló, halálos kimenetelű daganatok nem fejlődtek ki.
Az eredmények azt bizonyítják, hogy a genetikai vakcinával kezelt egerek immunreakciója elégséges volt ahhoz, hogy teljesen eliminálja a transzfektált tumorokat, míg a transzfektálatlan tumorokra nem volt hatással. A CD4 proteinnel végzett vakcinálás a transzfektált tumorok esetében a daganatok méretét némileg csökkentette a transzfektálatlan tumorokhoz képest, a mortalitást azonban nem befolyásolta. A vakcinával nem kezelt állatok a transzfektált és transzfektálatlan tumorok esetében egyaránt hasonló mortalitást mutattak.
29. példa
Genetikai vakcina humán GA733 elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze. Ezeket a kísérleteket a vakcinák GA733-mal kapcsolatos rák (mint a vastagbélrák) elleni védőképességének tesztelése érdekében végeztük. A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket GA733-at kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték.
A genetikailag immunizált állatokat a 14. példában leírt pGA733-2 plazmiddal vakcináltuk. Kontrollként vakcinálás nélküli, illetve GA733 proteinnel beoltott állatokat alkalmaztunk.
Az eredmények azt bizonyítják, hogy a genetikai vakcinával kezelt egerek immunreakciója elégséges volt ahhoz, hogy teljesen eliminálja a transzfektált tumorokat, míg a transzfektálatlan tumorokra nem volt hatással. A GA733 proteinnel végzett vakcinálás a transzfektált tumorok esetében a daganatok méretét némileg csökkentette a transzfektálatlan tumorokhoz képest, a mortalitást azonban nem befolyásolta. A vakcinával nem kezelt állatok a transzfektált és transzfektálatlan tumorok esetében egyaránt hasonló mortalitást mutattak.
30. példa
Genetikai vakcina humán pl85nen elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze. Ezeket a kísérleteket a vakcinák pl85«e«-val kapcsolatos rák (mint az emlőrák, tüdőrák vagy agyvelőrák) elleni védőképességének tesztelése érdekében végeztük. A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket neu proteint kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték.
A genetikailag immunizált állatokat a fentebb leírt módon a 14,3 kb-os pLTR-2/eróB-2 plazmiddal vakcináltuk, amely a humán neu onkogént kódoló régiót az LTR-2 vektor Xhol helyére klónozva tartalmazza. Az 5’LTR és 3’LTR a Moloney-MuLV LTR-ből származik. Kontrollként vakcinálás nélküli, illetve pl85neu proteinnel beoltott állatokat alkalmaztunk.
Az eredmények azt bizonyítják, hogy a genetikai vakcinával kezelt egerek immunreakciója elégséges volt ahhoz, hogy teljesen eliminálja a transzfektált tumorokat, míg a transzfektálatlan tumorokra nem volt hatással. A pl 85 proteinnel végzett vakcinálás a transzfektált tumorok esetében a daganatok méretét némileg csökkentette a transzfektálatlan tumorokhoz képest, a mortalitást azonban nem befolyásolta. A vakcinával nem kezelt állatok a transzfektált és transzfektálatlan tumorok esetében egyaránt hasonló mortalitást mutattak.
31. példa
Genetikai vakcina humán Ras elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze.
Ezeket a kísérleteket a vakcinák Ras proteinnel kapcsolatos rák (mint a húgyhólyagot, izmokat, tüdőt, agy velőt és csontokat érintő rákos megbetegedések) elleni védőképességének tesztelése érdekében végeztük. A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket Ras proteint kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték.
A genetikailag immunizált állatokat a fenti eljárás szerint a 17. példában leírt pBa.RAS plazmiddal vakcináltuk. A ras targetprotein citoplazmikus jelzőmolekulák egyik példája. A ras klónozási eljárását Weinberg írta le (Mól. Cell. Bioi., 4, 1577,1984; melyet hivatkozásul említünk). Kontrollként vakcinálás nélküli, illetve Ras proteinnel beoltott állatokat alkalmaztunk.
32. példa
Genetikai vakcina humán rabies G-protein antigén elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze. A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket rabies G-proteint kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték.
A genetikailag immunizált állatokat a fenti eljárást követve a 10. példában leírt pBa.Rb-G plazmiddal vakcináltuk. A rabies G targetprotein a patogén antigének egyik példája. A DNS-szekvencia leírása a Genebank
HU 219 767 Β
M32751 számon található meg. Kontrollként vakcinálás nélküli, illetve a G-proteinnel beoltott állatokat alkalmaztunk.
33. példa
Genetikai vakcina Lyme-kór antigén elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze. A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket OspA-t és OspB-t kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték.
A genetikailag immunizált állatokat a fenti eljárást követve a 9. példában leírt pOspA.B plazmiddal vakcináltuk. Kontrollként vakcinálás nélküli, illetve OspA és OspB proteinnel beoltott állatokat alkalmaztunk.
34. példa
Genetikai vakcina humán T-sejt-receptor variábilis régiója elleni hatékonyságának egerekben végzett teszteléséhez DNS-konstrukciót állítottunk össze. Ezeket a kísérleteket a vakcinák T-sejt-receptor eredetű proteinnel kapcsolatos rák, mint a T-sejt-lymphoma és a T-sejt által közvetített autoimmunbetegség elleni védőképességének tesztelése érdekében végeztük. A kísérletekhez a fentebb leírt állatmodellt alkalmaztuk. A tumorsejteket Ras-t kódoló DNS-sel transzfektáltuk, megbizonyosodtunk arról, hogy valóban expresszálják a proteint, majd beültettük az állatba. A kontrollt transzfektálatlan tumorsejtvonalak képezték.
A genetikailag immunizált állatokat a fenti vakcinálási eljárást követve az 5. példában leírt pBa.Va3 plazmiddal vakcináltuk.
35. példa
A pM160 plazmid számos, a HÍV env részéből származó egy vagy több gén expresszálásában hasznos plazmid kiindulási anyagaként alkalmazható. A pM160 konstrukciót fentebb leírtuk. A plazmid gpl60, tat és rév kódolórégiót tartalmaz. A nef gén hiányzik.
A gpl60/rev/íű/ génexpressziót szabályozó promoter az MMTV LTR. A promoter delécióval eltávolítható, s aktin promoterrel, miozin promoterrel, HÍV LTR promoterrel vagy CMV promoterrel helyettesíthető.
Az ampicillinrezisztenciát biztosító gén deletálható, eltávolítható vagy más módon inaktiválható. A neomycinrezisztenciát biztosító gént bakteriális promoter szabályozása alá helyezhetjük.
A Rous-sarcomavírus (RSV) enhancer delécióval eltávolítható a plazmidból. Az RSV enhancert az izom kreatin enhancerrel helyettesíthetjük.
A gpl60, rév és tat gének átfedők, s különböző leolvasási keretben egyazon nukleotidszekvenciával rendelkeznek. A rév gén deletálható oly módon, hogy kezdőkodonját egy másik kodonra cseréljük. A tat gén hasonló módon távolítható el. Valamennyi plazmidban (kivéve azokat, amelyekben a gpl60/rev/tat HÍV LTR promoter szabályozása alatt áll) a rév, a tat, illetve mind a rév, mind a tat gén egyaránt eltávolítható.
A HÍV LTR promotert alkalmazó plazmidokban a tat génnek jelen kell lennie.
Az alábbi táblázatban a módosított pM160 plazmidokat soroljuk fel. Valamennyi plazmid rendelkezik inaktivált ampicillingénnel, s valamennyiben deletált az RSV enhancer. A táblázatban az enhancer felirat alatt olvasható „nincs” az enhancer hiányát, a „CME” a kreatin izom enhancer (CME) jelenlétét jelzi. A rév és tat feliratok alatt álló „van” és „nincs” értelemszerűen a HÍV rév, illetve HÍV tat gének jelenlétére vagy hiányára utalnak.
3. táblázat
Konst- rukció Promoter Enhancer rév tat
RA-1 Aktin nincs van van
RA-2 Aktin nincs van nincs
RA-3 Aktin nincs nincs van
RA-4 Aktin CME van van
RA5 Aktin CME van nincs
RA-6 Aktin CME nincs van
RA-7 CMV nincs van van
RA-8 CMV nincs van nincs
RA-9 CMV nincs van van
RA-10 CMV CME van van
RA-11 CMV CME van nincs
RA12 CMV CME nincs van
RA-13 MMTV nincs van van
RA-14 MMTV nincs van nincs
RA15 MMTV nincs nincs van
RA-16 MMTV CME van van
RA-17 MMTV CME van nincs
RA-18 MMTV CME nincs van
RA19 Miozin nincs van van
RA20 Miozin nincs van nincs
RA-21 Miozin nincs nincs van
RA-22 Miozin CME van van
RA-23 Miozin CME van nincs
RA-24 Miozin CME nincs van
RA-25 HÍV-1 LTR nincs van van
RA-26 HIV-1 LTR nincs nincs van
RA-27 HÍV-1 LTR CME van van
RA-28 HIV-1 LTR CME nincs van
Az RA-29 - RA-56 konstrukciók azonosak az RA-1 - RA-32 konstrukciókkal, azzal a különbséggel, hogy a neomycingént szabályozó promoter minden esetben bakteriális promoter.
36. példa
A pNLpuro plazmid kiindulási anyagként különböző, HÍV gag/pol géneket expresszáló plazmidok előállí24
HU 219 767 Β tásának kiindulási anyagaként alkalmazható. Amint fentebb leírtuk, a pNLpuro plazmidot gag pol gének expressziójához alakítottuk ki. A fentebb leírt pNLpuroAvpr plazmidot azért hoztuk létre, hogy ezáltal a HÍV gag pol vektorból eltávolítsuk a vpr regulátorgént, annak érdekében, hogy a vakcinálással bevinni kívánt génkészletből eltávolítsuk a szükséges regulátorproteint. A szakemberek a pNLpuro43 plazmidon standard molekuláris biológiai technikák és széles körben beszerezhető kiindulási anyagok alkalmazásával a vpr eltávolításán kívül egyéb változtatásokat is végezhetnek.
A HIV-szekvenciák humán 5’ és 3’ szegélyezőszekvenciái számos eljárással eltávolíthatók. Az egyik módszer szerint például PCR alkalmazásával csak HÍV, SV40-puro és pUC18 szekvenciákat amplifikálunk és állítunk össze.
A HÍV psi régiója, amely a vírus pakolódásában fontos, delécióval eltávolítható azokból a plazmidokból, amelyek alapját a pNL43puro képezi. A psi régió deletálásához a pNLpuro plazmidot SacI és Spel enzimmel hasítjuk. Ez az enzimes emésztés a psi-vél együtt eltávolítja a psi-tol upstream irányban elhelyezkedő 5’LTR-t, valamint gag/pol régió psi-től downstream irányban elhelyezkedő részét is. A deletált, nem psiszekvenciák visszahelyezése és e szekvenciák regenerálása érdekében PCR-amplifikációt végzünk. Olyan primereket terveztünk, amelyek a HIV-szekvencia 5’- és 3’-részeit regenerálják, a psi-t azonban nem. A primerek a plazmid 5’LTR részén megváltoztatják a SacI helyet. A primerek a SacI helytől upstram irányban elhelyezkedő helytől kiindulva downstream irányban haladnak a psi régió 5’-végének 3’-végén levő helyig, s a 3’végen egy Aatl helyet hoznak létre. A közvetlenül a psi régió 5’-végétől induló primerek szintén létrehoznak egy Aatl helyet, és az Spel hely 3’-végétől kiindulva regenerálják azt. A PCR-technikával előállított fragmenseket SacI, Aatl és Spel enzimekkel emésztjük, és a SacI és Spel enzimekkel emésztett pNLpuro-psi fragmenssel Egáljuk. A HÍV 5’LTR promoter deletálható és Moloney vírus promoterrel, MMTV LTR promoterrel, aktin promoterrel, miozin promoterrel vagy CMV promoterrel helyettesíthető.
A HÍV 3’LTR poliadenilációs jel szintén eltávolítható, és SV40 poliadenilációs hellyel helyettesíthető.
Az ampicillinrezisztenciát biztosító gént delécióval eltávolíthatjuk, vagy más módon inaktiválhatjuk.
Az alábbi táblázatban a pNLpuro plazmidon alapuló konstrukciókat mutatjuk be, melyekben a HÍV psi és vpr régióit, és a HIV-szekvenciák humán 5’ és 3’ szegélyezőszekvenciáit delécióval eltávolítottuk.
4. táblázat
Konstrukció Promoter poli(A) Ampr
LA-1 Moloney HÍV 3’LTR van
LA-2 Moloney SV40 van
LA-3 Moloney HÍV 3’LTR nincs
LA-4 Moloney SV40 nincs
Konstrukció Promoter poli(A) Ampr
LA-5 CMV HÍV 3’LTR van
LA-6 CMV SV40 van
LA-7 CMV HÍV 3’LTR nincs
LA-8 CMV SV40 nincs
LA-9 MMTV HÍV 3’LTR van
LA-10 MMTV SV40 van
LA-11 MMTV HÍV 3’LTR nincs
LA-12 MMTV SV40 nincs
LA-13 HÍV 5’LTR HÍV 3’LTR van
LA-14 HÍV 5’LTR SV40 van
LA-15 HÍV 5’LTR HÍV 3’LTR nincs
LA-16 HÍV 5’LTR SV40 nincs
Az LA-17 - LA-32 konstrukciók azonosak az LA-1 - LA-16 konstrukciókkal, azzal a különbséggel, hogy valamennyi esetben megmarad legalább az egyik humán szegélyezőszekvencia.
37. példa
Az env gén expresszálásához alkalmas másik konstrukcióban a HÍV rév régióját a kereskedelemben beszerezhető pCEP4 plazmidba (Invitrogen) inszertáljuk. A pCEP4 plazmid különösen alkalmas, mivel Epstein-Barr vírusreplikációs kezdőhelyet és magi EBNA-1 antigént kódoló régiót tartalmaz, ami integráció nélkül nagy példányszámú episzomális replikációt eredményez. A pCEP4 a timidin-kináz promoter és poliadenilációs hely szabályozóirányítása alatt hygromicinmarkert is tartalmaz. A HÍV env kódolórégiót a CMV promoter és az SV40 poliadenilációs jel szabályozóirányítása alá helyezzük. A HÍV env kódolórégiót 2,3 kb-os PCR-fragmensként a HIV/3B-ből (Genebank K03455 számú szekvencia) nyertük. A kapott, pCEP4 alapján készült pRA-100 plazmid extrakromoszomálisan a gpl60 proteint termeli.
38. példa
Az env gén expresszálásához alkalmas másik konstrukcióban a HÍV rév régióját a kereskedelemben beszerezhető pREP4 plazmidba (Invitrogen) inszertáljuk. A pREP4 plazmid különösen alkalmas, mivel Epstein-Barr vírusreplikációs kezdőhelyet és magi EBNA-1 antigént kódoló régiót tartalmaz, ami integráció nélkül nagy példányszámú episzomális replikációt eredményez. A pREP4 a timidin-kináz promoter és poliadenilációs hely szabályozóirányítása alatt hygromicinmarkert is tartalmaz. A HIV-env kódolórégiót az RSV promoter és az SV40 poliadenilációs jel szabályozóirányítása alá helyezzük. A HIV-env kódolórégiót 2,3 kb-os PCR-fragmensként a HIV/3B-ből (Genebank K03455 számú szekvencia) nyertük. A kapott, pREP4 alapján készült pRA-101 plazmid extrakromoszomálisan a gp!60 proteint termeli.
HU 219 767 Β
39. példa
A gag/pol gének expresszálásához alkalmas másik konstrukcióban a HÍV gag/pol régióját a kereskedelemben beszerezhető pCEP4 plazmidba (Invitrogen) inszertáljuk. A pCEP4 plazmid különösen alkalmas, mivel Epstein-Barr vírusreplikációs kezdőhelyet és magi EBNA-1 antigént kódoló régiót tartalmaz, ami integráció nélkül nagy példányszámú episzomális replikációt eredményez. A pCEP4 a timidin-kináz promoter és poliadenilációs hely szabályozóirányítása alatt hygromicinmarkert is tartalmaz. A HÍV gag/pol kódolórégiót a CMV promoter és az SV40 poliadenilációs jel szabáíyozóirányítása alá helyezzük. A HÍV gag/pol kódolórégiót a HÍV MN-ből (Genebank MI7449 számú szekvencia) nyertük, s magában foglalja a vif gént; a vpr gén azonban hiányzik. A kapott, pCEP4 alapján készült pLA-100 plazmid extrakromoszomálisan a GAG55, reverz transzkriptáz, proteáz és integráz proteineket termeli.
40. példa
A gag/pol gének expresszálásához alkalmas másik konstrukcióban a HÍV gag/pol régióját a kereskedelemben beszerezhető pREP4 plazmidba (Invitrogen) inszertáljuk. A pREP4 plazmid különösen alkalmas, mivel Epstein-Barr vírusreplikációs kezdőhelyet és magi EBNA-1 antigént kódoló régiót tartalmaz, ami integráció nélkül nagy példányszámú episzomális replikációt eredményez. A pREP4 a timidin-kináz promoter és poliadenilációs hely szabályozóirányítása alatt hygromicinmarkert is tartalmaz. A HÍV gag/pol kódolórégiót a CMV promoter és az SV40 poliadenilációs jel szabályozóirányítása alá helyezzük. A HÍV gag/pol kódolórégiót a HIV-MN-ből (Genebank MI7449 számú szekvencia) nyertük, s magában foglalja a vif gént; a vpr gén azonban hiányzik. A kapott, pREP4 alapján készült pLA-101 plazmid extrakromoszomálisan a GAG55, reverz transzkriptáz, proteáz és integráz proteineket ermeli.
41. példa
A következő pGAGPOL.rev elnevezésű konstrukció alkalmas a HÍV gag/pol gének expresszálásához.
A plazmid kanamycin-rezisztenciagént és pBR322 DNS-replikációs kezdőhelyet tartalmaz. A transzkripciós regulátorszekvenciák a cytomegalovírus promoter, a Rous-sarcomavírus enhancer és az SV40 poliadenilációs jel. A pGAGPOL.rev konstrukcióban az alábbi HÍV-1-szekvenciák találhatók: a gag nyitott leolvasási keretének pl7, p24 és pl5 régióját kódoló szekvencia; egy proteázt kódoló szekvencia; egy kis deléciót tartalmazó reverz transzkriptázt kódoló szekvencia; a pol nyitott leolvasási keret integrázának inaktív N-terminálisát kódoló szekvencia; és a rév kódolószekvencia. Valamennyi HIV-szekvencia a HXB2 HIV-1 törzsből származik.
A pGAGPOL.rev konstrukcióban több biztonsági megoldást alkalmaztunk, ezek közé tartozik a CMV promoter és a nem retrovirális poli(A) hely alkalmazása. A szekvencia deléciója továbbá korlátozza a virális
RNS pakolódási képességét. Ezeken kívül a reverz transzkriptáz több mutációja enzimatikusan inaktív terméket eredményez, továbbá az integráz nagy deléciója is inaktív terméket eredményez. A bakteriális transzformánsok stabilizálásához kanamycin-rezisztenciamarkert alkalmazunk.
A pGAGPOL.rev plazmidot az alábbiak szerint állítjuk elő:
1. lépés: A HIV-1 (HXB2) genom egy részének szubklónját alkalmazzuk, amit a Bluescript vektorba (Stratagene) klónozunk. A HÍV-1 szubklónja a teljes 5’LTR-t, és a fennmaradó HIV-l-genomot az 5795. nukleotidig (Genebank-számozás szerint) tartalmazza. A HIV-1-szekvenciákat a HXB2D plazmidból (AIDS Repository) nyerjük.
2. lépés: A gag HXB2D plazmid (AIDS Repository) nyitott leolvasási keretétől kezdődő részét PCRtechnikával amplifikáljuk. A PCR-fragmenst NotI és Spel enzimekkel hasítjuk, és a fentebb leírt, NotI és Spel helyek által határolt HIV-1 szubklónnal Egáljuk.
3. lépés: a HXB2D plazmidból (AIDS Repository) származó gag/pol kapcsolódást és a pol-t kódoló szekvenciák egy részét PCR-technikával, a 15. szekvenciaés 16. szekvenciaprimerek alkalmazásával amplifíkáljuk. A PCR-terméket Clal enzimmel hasítjuk, s összeligáljuk, majd a ligálódott fragmenseket Bell és Sáli enzimmel hasítjuk, s a 2. lépésben kapott, Bell és Sáli enzimmel emésztett plazmiddal Egáljuk.
4. lépés: A 3. lépésben előállított plazmidot BspMI és EcoRI enzimmel hasítjuk, s a 17. szekvencia- és 18. szekvencialinkerek annuálásával kialakított adapterekkel Egáljuk.
5. lépés: A 4. lépésben kapott plazmidot NotI és Sáli endonukleázzal hasítjuk, s a pENV plazmid esetében a 42. példa 4/a vagy 4/b lépésében kapott plazmiddal Egáljuk, melyet szintén NotI és Sáli endonukleázzal hasítunk.
6. lépés: Az 5. lépésben kapott plazmidot Sáli és Miül endonukleázzal emésztjük, s a rév 19. és 20. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával végzett PCR-reakciójával kapott PCR-termékkel Egáljuk.
7. lépés: A 6. lépésben előállított plazmidot NotI endonukleázzal hasítjuk, és a HXB2D plazmid (AIDS Repository) rév „responsive” elemének 21. és 22. szekvenciával rendelkező primerekkel végzett PCR-reakciójával kapott termékkel Egáljuk.
A 6. és 7. lépés tetszőlegesen végezhető.
42. példa
Az alábbi, pENV elnevezésű konstrukció HÍV env gének expresszálására alkalmas.
A plazmid kanamycin-rezisztenciagént és pBR322 DNS-replikációs kezdőhelyet tartalmaz. A transzkripciós regulátorszekvenciák a cytomegalovírus promoter, Rous-sarcomavírus enhancer és SV40 poliadenilációs jel. A pENV-konstrukcióban az alábbi HÍV- 1-szekvenciák találhatók: vpu proteint kódoló szekvencia; rév proteint kódoló szekvencia; gpl60 proteint kódoló szekvencia; a nef 50%-át kódoló szekvencia; vif proteint kódoló szekvencia; és egy 13 aminosavas C-terminális
HU 219 767 Β deléciót tartalmazó vpr proteint kódoló szekvencia. A vpu, rév, gpl60 és nef szekvenciák az MN HIV-1 törzsből, a vif és vpr szekvenciák pedig a HXB2 HIV-1 törzsből származnak.
A pENV-konstrukcióban több biztonsági megoldást alkalmaztunk; ezek közé tartozik a CMV promoter és a nem retrovirális poli(A) hely alkalmazása. Ezenkívül a tat gént delécióval eltávolítottuk, és a nef 50%-os deléciója inaktív nef-terméket eredményez. A vif és vpr gént a normális szekvencián kívül helyeztük el, s a vpr részleges deléciója még jobban biztosítja az inaktív ypr-termék képződését.
A pENV plazmidot az alábbiak szerint állítjuk elő:
1. lépés: A pUC18 plazmidot HindlII és EcoRI endonukleázokkal emésztjük. A kapott, ColEl replikációs kezdőhelyet és a laci gént tartalmazó fragmenst a pMAMneoBlue plazmidból származó EcoRI/HindlII ffagmenssel Egáljuk, amely a sarcomavírus enhancerünket tartalmazza. A kapott plazmidot vagy a Clontech (Palo Alto, CA) pMAMneoBlue plazmidját ezután HindlII és BglI endonukleázzal emészthetjük, s a kapott ffagmenst a „geneblock” plazmid (Pharmacia) PCR-amplifikálásával kapott, kan gént tartalmazó ffagmenssel standard technikák alkalmazásával Egáljuk.
2. lépés: Ha kiindulási plazmidként pMAMneoBlue plazmidot alkalmazunk, azt Miül és EcoRI enzimekkel emésztjük, a végeket a polimeráz I Klenow ffagmensével feltöltjük, s újból Egáljuk.
3. lépés: A kapott plazmidot, akár a pMAMweoBlue plazmidból, akár a pUCl8-ból indultunk ki, HindlII enzimmel emésztjük, és az SV40 poliA hellyel és a pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) 23. és 24. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával végzett PCR-reakciójával kapott korai splicingrégióval Egáljuk.
4/a lépés: Emésztés BamHI enzimmel és Egálás a pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) 25. és 26. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával végzett PCR-reakcióval kapott CMV promoterrel.
4/b lépés: Emésztés BamHI enzimmel és ligálás a 27. és 28. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával végzett PCR reakcióval kapott MoMLV LTR szekvenciával.
5. lépés: Emésztés a NotI és Miül enzimekkel, és ligálás a pMN-STl plazmid 29. és 30. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával végzett PCR-reakciójával kapott GP160 kódolórégióval.
6. lépés: Emésztés Mlul-gyel, és ligálás a teljes vif proteint és 13 aminosavas C-terminális deléciót tartalmazó vpr proteint kódoló szekvenciákkal [mely utóbbit a HXB2D plazmid (AIDS Repository) 31. és 32. szekvenciával rendelkező primerekkel végzett PCR-reakciójával kaptuk],
43. példa
Ebben a példában egy olyan immunizálási rendszert írunk le, amely izotóniás, gyógyszerészetileg elfogadható oldatban körülbelül 100 pg pGAGPOL.rev plazmidot tartalmazó gyógyszerészeti készítményből; és szintén izotóniás, gyógyszerészetileg elfogadható oldatban 100 pg pENV plazmidot tartalmazó gyógyszerészeti készítményből áll. Ezeken kívül az immunizálási rendszer előnyösen tartalmaz még körülbelül 1 ml, izotóniás gyógyszerészeti hordozóban 0,5% bupivacainHCl-ot és 0,1% metil-parabént tartalmazó oldatot.
Az előnyben részesített immunizálási rendszerben egy első beadási sorozatot végzünk, melynek során először a bupivacaint és a két másik gyógyszerészeti készítmény egyikét adjuk be a páciensnek intramuszkulárisan, lehetőleg a kar- vagy farizomba. A másik gyógyszerészeti készítményt a bupivacainnal együtt a páciens testének más részén, az első gyógyszerészeti készítmény beadási helyétől lehetőleg távol, intramuszkulárisan adjuk be, előnyösen másik oldali karjába vagy farizmába. A beadás későbbi sorozatait később, előnyösen 48 órától két hétig vagy még tovább terjedő időközzel végezzük.
Az immunizálási rendszer a páciens HIV-fertőzéstől való megóvása érdekében végzett vakcináláshoz vagy HIV-fertőzött beteg immunterápiás kezeléséhez alkalmazható.
44. példa
A találmány néhány megvalósítási módjában egy páciens HÍV elleni immunizálási eljárására vonatkozik, melynek során a páciensnek egy oltóanyagot adunk be. Ez az oltóanyag olyan genetikai konstrukciót foglal magában, amely a HÍV vírusgénjei közül legalább egyet, előnyösen kettőt, még előnyösebben kettőnél többet vagy a gének többségét, vagy a strukturális gének mindegyikét tartalmazza. Az oltóanyag azonban nem tartalmazza valamennyi HÍV gén teljes komplementjét. Ha egy sejtbe a vírusgének teljes komplementjét visszük be, lehetséges, hogy a sejten belül egy teljes, fertőzőképes vírus alakul ki. Emiatt a találmány szerinti genetikai konstrukcióba nem foglalunk teljes génkomplementet. Hogy még jobban megakadályozzuk a fertőző vírusrészecskék kialakulását, óvintézkedésként egy vagy több esszenciális gént delécióval eltávolíthatunk, vagy szándékosan megváltoztathatjuk azokat.
A találmány néhány megvalósítási módjában a HÍV strukturális génjei közül legalább egynek, kettőnek vagy valamennyinek részletét beépítjük a genetikai konstrukcióba. A HÍV strukturális génjei a gag, apol és az env. E három gén legalább egyikének részeit foglaljuk a genetikai konstrukcióba. Ennek megfelelően, néhány megvalósítási módban a gag és a pol legalább egy-egy részletét foglaljuk a konstrukcióba. Más megvalósítási módokban legalább az env egy részletét; más megvalósítási módokban legalább a gag egy részletét; néhány megvalósítási módban a pol és az env legalább egy-egy részletét; további megvalósítási módokban legalább a gag és az env egy-egy részletét; ismét más megvalósítási módokban legalább a pol egy részletét foglaljuk a genetikai konstrukcióba. Adott esetben a teljes gén is beépíthető a konstrukcióba. Az említett konstrukciók bármelyikében adott esetben HÍV regulátorgének is jelen lehetnek. A HÍV regulátorgének a vpr, vif, vpu, nef, tat és rév.
HU 219 767 Β
45. példa
Ahogy itt használjuk, az „expressziós egység” kifejezésen olyan nukleinsavszekvenciát értünk, amely egy poliadenilációs jelhez működőképesen kapcsolódó kódolószekvenciához működőképesen kapcsolva egy promotert tartalmaz. A kódolószekvencia egy vagy több proteint vagy proteinfragmenst kódolhat. Az előnyben részesített megvalósítási módokban az expressziós egység a plazmidon belül helyezkedik el.
Ahogy itt használjuk, a „HÍV expressziós egység” kifejezésen olyan nukleinsavszekvenciát értünk, amely egy poliadenilációs jelhez működőképesen kapcsolódó kódolószekvenciához működőképesen kapcsolva egy promotert tartalmaz, s amelyben a kódolószekvencia olyan pepiidet kódol, amely egy HIV-proteinen található epitóppal megegyező vagy ahhoz lényegében hasonló epitópot tartalmaz. A „lényegében hasonló epitóp” kifejezésen olyan epitópot értünk, amelynek szerkezete nem azonos a HIV-protein szerkezetével, azonban olyan celluláris vagy humorális immunreakciót vált ki, amely keresztreaktív a HIV-proteinnel. Az előnyben részesített megvalósítási módokban a HÍV expressziós egység olyan kódolószekvenciát tartalmaz, amely egy vagy több HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódol. Az előnyben részesített megvalósítási módokban az expressziós egység a plazmidon belül helyezkedik el.
A találmány néhány megvalósítási módjában olyan genetikai konstrukciót állítunk elő, amely egy vagy több HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló DNSszekvenciákat tartalmazó egyetlen HÍV expressziós egységből áll. Az „egyetlen HÍV expressziós egységből álló konstrukció” kifejezésen olyan genetikai konstrukciót értünk, amely egyetlen HÍV expressziós egységet tartalmaz. Az előnyben részesített megvalósítási módokban az egyetlen HÍV expressziós egységből álló konstrukció egy plazmid.
A találmány néhány megvalósítási módjában olyan genetikai konstrukciót állítunk elő, amely egy vagy több HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó, egynél több HÍV expressziós egységből áll. A „több HÍV expressziós egységből álló konstrukció” kifejezésen olyan plazmidot értünk, amely egynél több HÍV expressziós egységet tartalmaz. Az előnyben részesített megvalósítási módokban a több HÍV expressziós egységből álló konstrukció egy plazmid.
A találmány néhány megvalósítási módjában olyan genetikai konstrukciót állítunk elő, amely két HÍV expressziós egységgel rendelkezik, melyek közül mindkettő egy vagy több HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaz. A ,Jcét HÍV expressziós egységből álló konstrukció” kifejezésen olyan plazmidot értünk, amely két HÍV expressziós egységet tartalmaz; vagyis olyan, több HÍV expressziós egységből álló konstrukció, amely két HÍV expressziós egységet tartalmaz. A két HÍV expressziós egységből álló genetikai konstrukciók esetében előnyös, ha a két HÍV expressziós egység ellenkező irányban működik. Az előnyben részesített megvalósítási módokban a két HÍV expressziós egységből álló konstrukció egy plazmid.
A találmány néhány megvalósítási módjában olyan HÍV genetikai vakcinát állítunk elő, amely egyetlen genetikai konstrukciót tartalmaz. Az említett egyetlen genetikai konstrukció lehet egy HÍV expressziós egységből álló, két HÍV expressziós egységből álló vagy több HÍV expressziós egységből álló (vagyis kettőnél több HÍV expressziós egységet tartalmazó) genetikai konstrukció.
A találmány néhány megvalósítási módjában olyan HÍV genetikai vakcinát állítunk elő, amely egyetlen oltóanyagban egynél több genetikai konstrukciót tartalmaz.
A találmány néhány megvalósítási módjában olyan HÍV genetikai vakcinát állítunk elő, amely egynél több oltóanyagban egynél több genetikai konstrukciót tartalmaz. Az általunk használt „összetett oltóanyag” kifejezésen olyan genetikai vakcinát értünk, amely egynél több genetikai konstrukciót tartalmaz, melyek mindegyikét külön-külön adjuk be. A találmány néhány megvalósítási módjában olyan HÍV genetikai vakcinát állítunk elő, amely két genetikai konstrukciót tartalmaz. E genetikai konstrukciók közül mindkettő lehet egy HÍV expressziós egységből álló, két HÍV expressziós egységből álló vagy több HÍV expressziós egységből álló genetikai konstrukció, mely utóbbi kettőnél több HÍV expressziós egységet tartalmaz. Néhány megvalósítási módban mindkét genetikai konstrukció egy HÍV expressziós egységet tartalmaz, más megvalósítási módokban mindkét genetikai konstrukció két HÍV expressziós egységet tartalmaz, ismét más megvalósítási módokban mindkét genetikai konstrukció több HÍV expressziós egységet tartalmaz. Bizonyos megvalósítási módokban az egyik genetikai konstrukció egy HÍV expressziós egységet, míg a másik két HÍV expressziós egységet tartalmaz. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a genetikai vakcinában alkalmazott genetikai konstrukciók számától és az egyes genetikai konstrukciókban lévő HÍV expressziós egységek számától függően számos variáció lehetséges.
A találmány szerinti genetikai konstrukciók előnyösen nem tartalmaznak bizonyos HIV-szekvenciákat, különösen olyanokat nem, amelyek szerepet játszanak a HIV-genom gazdasejt kromoszomális anyagába történő beépülésében. A találmány szerinti genetikai konstrukciók előnyösen nem tartalmaznak HIV-ből származó LTR-eket. Hasonlóan előnyös, ha a találmány szerinti genetikai konstrukciók nem tartalmaznak HIV-ből származó psi helyet. Előnyös továbbá az is, ha a reverz transzkriptázgén és az integrázgén deletált. A deléciók csak a kodonok némelyikének delécióját vagy néhány kodon helyettesítését jelentik, melyek eredményeképpen a gén lényegében deletáltnak tekinthető. Például az iniciációs kodont deletálhatjuk, megváltoztathatjuk vagy eltolhatjuk a leolvasási keretből, hogy olyan nukleotidszekvenciát kapjunk, amely nem teljes vagy nem működő proteint kódol.
Előnyös továbbá, ha a találmány szerinti genetikai konstrukciók nem tartalmaznak HIV-ből származó, transzkripcióra képes tat gént. A tat gén, amely átfedő a rév génnel, oly módon deletálható, hogy a rév gént kó28
HU 219 767 Β doló kodonokat olyan kodonokkal cseréljük ki, amelyek a rév protein számára ugyanazokat az aminosavakat kódolják, a tat leolvasási keretében azonban nem a tat kellő aminosavait kódolják. Más módon csak a tat iniciációs kodonját és/vagy azokat a kodonokat kell kicserélni, vagyis lényegében deletálni, amelyek megváltoztatása nem teljes vagy nem működő tat proteint kódoló nukleotidszekvenciát eredményez.
Előnyös, ha a genetikai konstrukció olyan kódolószekvenciákat tartalmaz, amelyek a HÍV gag, pol, env vagy rév proteinjeiről származó epitópokkal azonos vagy azokhoz lényegében hasonló, legalább egy epitóppal rendelkező peptideket kódolnak. Még előnyösebb, ha a genetikai konstrukció olyan kódolószekvenciákat tartalmaz, amelyek legalább egy HÍV gag, pol, env vagy rév proteint vagy proteinffagmenst kódolnak. Előnyös, ha a genetikai konstrukció olyan kódolószekvenciákat tartalmaz, amelyek a HÍV gag, pol, env vagy rév proteinjeiről származó epitópokkal azonos vagy azokhoz lényegében hasonló, egynél több epitóppal rendelkező peptideket kódolnak. Még előnyösebb, ha a genetikai konstrukció olyan kódolószekvenciákat tartalmaz, amelyek egynél több HÍV gag, pol, env vagy rév proteint vagy proteinffagmenst kódolnak.
Néhány megvalósítási módban a genetikai konstrukció olyan kódolószekvenciákat tartalmaz, amelyek a HÍV vif, vpr, vpu, vagy nef proteinjeiről származó epitóppal azonos, vagy ahhoz lényegében hasonló legalább egy epitóppal rendelkező peptideket kódolnak. Néhány megvalósítási módban a genetikai konstrukció olyan kódolószekvenciákat tartalmaz, amelyek legalább egy HÍV vif, vpr, vpu, vagy nef proteint vagy proteinffagmenst kódolnak.
Az egy HÍV expressziós egységből álló genetikai konstrukció egyetlen expressziós egységben egyetlen promoter és poliadenilációs jel szabályozása alatt egy vagy több olyan peptid számára tartalmazhat kódolórégiókat, amely(ek) egy HIV-proteinnel vagy proteinffagmenssel legalább egy közös epitóppal rendelkeznek. Előnyös, ha a genetikai konstrukció egynél több HIV-proteint vagy proteinffagmenst kódol. Promoterként bármilyen, emberi sejtben működőképes promotert alkalmazhatunk, előnyösen SV40 promotert vagy CMV promotert, lehetőleg közvetlen korai CMV promotert. Poliadenilációs jelként bármilyen, emberi sejtben működőképes poliadenilációs jelet alkalmazhatunk, előnyösen SV40 poliadenilációs jelet, lehetőleg az SV40 kis poliadenilációs jelet. Ha egy expressziós egységben egynél több kódolórégiót helyezünk el, azok lehetnek egymással közvetlenül szomszédosak, vagy állhatnak közöttük nem kódoló régiók. A pontos expresszálás érdekében a kódolórégiónak iniciációs és terminációs kodonnal kell rendelkeznie.
A két HÍV expressziós egységből álló genetikai konstrukció a két expressziós egység mindegyikében egy vagy több olyan peptid számára tartalmazhat kódolórégiót, amely(ek) egy HIV-proteinnel vagy proteinffagmenssel legalább egy közös epitóppal rendelkeznek. Mindkét expressziós egység egyetlen promoter és poliadenilációs jel szabályozása alatt áll. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha a genetikai konstrukció egynél több HIV-proteint vagy proteinffagmenst kódol. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha a gag és pol proteineket kódoló nukleotidszekvenciák az egyik expressziós egységen, az env és rév proteineket kódoló nukleotidszekvenciák pedig a másikon helyezkednek el. Promoterként bármilyen, emberi sejtben működőképes promotert alkalmazhatunk, előnyösen SV40 promotert vagy CMV promotert, lehetőleg közvetlen korai CMV promotert. Poliadenilációs jelként bármilyen, emberi sejtben működőképes poliadenilációs jelet alkalmazhatunk, előnyösen SV40 poliadenilációs jelet, lehetőleg az SV40 kis poliadenilációs jelet. Ha egy expressziós egységben egynél több kódolórégiót helyezünk el, azok lehetnek egymással közvetlenül szomszédosak, vagy állhatnak közöttük nem kódoló régiók. A pontos expresszálás érdekében a kódolórégiónak iniciációs és terminációs kodonnal kell rendelkeznie.
A találmány néhány megvalósítási módja értelmében az env II. osztályú MHC keresztreaktív epitópját eltávolítjuk, és a HÍV II analóg régiójával helyettesítjük.
Ha egy genetikai konstrukció gag és/vagy pol gént tartalmaz, általában lényeges, hogy rév gént is tartalmazzon. A gag és pol gén fokozott expressziója érdekében a rév génen kívül a gag és pol génekkel együtt egy rév „response” elemet is beépíthetünk.
A genetikai konstrukciók előállításakor előnyös, ha az 1. plazmidban alkalmazott env gén MN vagy MNszerű izolátumokból (beleértve az MN-re emlékeztető klinikai izolátumokat), lehetőleg syncytiumképződést nem indukáló klinikai izolátumokból származik, előnyösen a makrofágtrofíkus, korai stádiumú klinikai izolátumokból.
Egy expressziós egységgel több protein alternatív splicing mechanizmussal termelhető. A splicing jeleket az alternatív splicingot lehetővé tevő módon biztosítjuk, miáltal különböző proteineket kódoló különböző üzenetek olvashatók le.
46. példa
A 8. ábrán az A, B, C és D gerincváz látható. A 9. ábrán az 1., 2., 3. és 4. inszertet mutatjuk be. Az 1. inszert a gag és a pol expresszióját teszi lehetővé; a rév „response”-elemet úgy klónoztuk, hogy megőrizzük a HÍV splicing akceptort. A 2. inszert hasonlít az 1. inszerthez, minthogy szintén a gag és a pol expresszióját teszi lehetővé, a rév responseelemet azonban a HÍV splicing akceptor megőrzése nélkül klónoztuk. A 3. inszert a gag és a pol expresszióját teszi lehetővé; az integrázgénben egy deléciót tartalmaz, és nem tartalmaz cis működésű rév responseelemet. A 4. inszert a rév, vpu és env expresszióját teszi lehetővé. Az env II. osztályú MHC keresztreaktív epitópja a keresztreaktivitás megszüntetése érdekében megváltoztatható, a syncytiumképződés lehetőségének kizárása érdekében pedig megváltoztathatjuk a V3 loopot (hurok).
Néhány megvalósítási módban az A gerincvázat az
1. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pAlori+ plazmid az 1. inszertet és az SV40 rep29
HU 219 767 Β likációs kezdőhelyet tartalmazó A gerincvázból áll. A pAlori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 1. inszertet tartalmazó A gerincvázból áll. Mind a pAlori+, mind a pAlori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pAlori+int+, illetve a pAlori-int+ plazmidokat kapjuk. A pAlori+, pAlori-, pAlori+int+ és pAlori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pAlori+RT-, pAlori-RT-, pAlori+int+RT-, illetve pAlori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban az A gerincvázat a 2. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pA2ori+ plazmid a 2. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó A gerincvázból áll. A pA2ori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 2. inszertet tartalmazó A gerincvázból áll. Mind a pA2ori+, mind a pA2ori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pA2ori+int+, illetve a pA2ori-int+ plazmidokat kapjuk. A pA2ori+, pA2ori~, pA2ori+int+ és pA2ori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT-, illetve pA2ori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a B gerincvázat az 1. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pBlori+ plazmid a 1. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó B gerincvázból áll. A pBlori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 1. inszertet tartalmazó B gerincvázból áll. Mind a pBlori+, mind a pBlori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pBlori+int-i-, illetve a pBlori-int+ plazmidokat kapjuk. A pBlori+, pBlori-, pBlori+int+ és pBloriint+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pBlori+RT-, pBlori-RT-, pBlori+int+RT-, illetve pBlori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a B gerincvázat a 2. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pB2ori+ plazmid a 2. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó B gerincvázból áll. A pB2ori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül a 2. inszertet tartalmazó B gerincvázból áll. Mind a pB2ori+, mind a pB2ori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pB2ori+int+, illetve a pB2ori-int+ plazmidokat kapjuk. A pB2ori+, pB2ori-> pB2ori+int+ és pB2ori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT-, illetve pB2ori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a rév nélküli A gerincvázat a 3. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pA/r-3ori+ plazmid a 3. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó A gerincvázból áll. A pA/r-3 őri-plazmid a 3. inszertet az SV40 replikációs kezdőhely nélkül tartalmazó, rév nélküli A gerincvázból áll. Mind a pA/r-3ori+, mind a pA/r-3ori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pA/r3ori+int+, illetve a pA/r-3ori-int-l- plazmidokat kapjuk. A pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int-l- és pA/r3ori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT-, illetve pA/r-3ori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a C gerincvázat az 1. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pClori-i- plazmid az 1. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó C gerincvázból áll. A pClori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 1. inszertet tartalmazó C gerincvázból áll. Mind a pClori+, mind a pClori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pClori+int+, illetve a pClori-int+ plazmidokat kapjuk. A pClori+, pClori-, pClori+int+ és pClori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pClori+RT-, pClori-RT-, pClori+int+RT-, illetve pClori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a C gerincvázat az 2. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pC2ori+ plazmid a 2. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó A gerincvázból áll. A pC2ori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 2. inszertet tartalmazó C gerincvázból áll. Mind a pC2ori+, mind a pC2ori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pC2ori+int+, illetve a pC2ori-int+ plazmidokat kapjuk. A pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ és pC2ori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pC2ori+RT-, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT-, illetve pC2ori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a C gerincvázat az 3. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pC3ori+ plazmid a 3. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó C gerincvázból áll. A pC3ori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 3. inszertet tartalmazó C gerincvázból áll. Mind a pC3ori+, mind a pC3ori- tartalmazhat integrázt is, miáltal a pC3ori+int+, illetve a pC3ori-int+ plazmidokat kapjuk. A pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ és pC3ori-int+ plazmidok a reverz transzkriptáz (RT) gén funkcionális deléciójával tovább módosíthatók, miáltal a pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT-, illetve pC3ori-int+RT-plazmidokat kapjuk.
Néhány megvalósítási módban a D gerincvázat az 4. inszerttel együtt alkalmazzuk. Az ilyen konstrukciók adott esetben az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazzák. A pD4ori+ plazmid a 4. inszertet és az SV40 replikációs kezdőhelyet tartalmazó D gerincvázból áll. A pD4ori- plazmid az SV40 replikációs kezdőhely nélkül az 4. inszertet tartalmazó D gerincvázból áll.
47. példa
Néhány megvalósítási módban egy oltóanyagban egy expressziós egységet tartalmazó genetikai vakcinát
HU 219 767 Β készítünk, amely a HIV-proteinek epitópjaival azonos vagy azokhoz lényegében hasonló, legalább egy epitóppal rendelkező peptidet kódoló szekvenciát tartalmazó genetikai konstrukciót foglal magában. A kódolószekvencia a CMV közvetlen korai promoter és az SV40 kis poliadenilációs jel szabályozása alatt áll.
Néhány megvalósítási módban egy oltóanyagban egy expressziós egységet tartalmazó genetikai vakcinát készítünk, amely legalább egy HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmazó genetikai konstrukcióból áll. A kódolószekvencia a CMV közvetlen korai promoter és az SV40 kis poliadenilációs jel szabályozása alatt áll. A HIV-protein a gag, pol, env és rév proteinek valamelyike. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha olyan genetikai vakcinát állítunk elő, amely a gag, pol, env és rév HIV-proteinek vagy ezek fragmensei közül legalább két HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmazó genetikai konstrukciót foglal magában. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha olyan genetikai vakcinát állítunk elő, amely a gag, pol, env és rév HIV-proteinek vagy ezek fragmensei közül legalább három HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmazó genetikai konstrukciót foglal magában. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha olyan genetikai vakcinát állítunk elő, amely gag, pol, env és rév proteineket vagy proteinfragmenseket kódoló szekvenciát tartalmazó genetikai konstrukciót foglal magában.
Néhány megvalósítási módban egy oltóanyagban két expressziós egységet tartalmazó genetikai vakcinát készítünk, amely két expressziós egységből álló genetikai konstrukciót tartalmaz, melyek mindegyike HIVproteinek epitópjaival azonos vagy azokhoz lényegében hasonló, legalább egy epitóppal rendelkező peptidet kódoló szekvenciát foglal magában. A kódolószekvencia a CMV közvetlen korai promoter és az SV40 kis poliadenilációs jel szabályozása alatt áll. A két expressziós egység egymáshoz képest ellenkező irányban kódolt.
Néhány megvalósítási módban egy oltóanyagban két expressziós egységet tartalmazó genetikai vakcinát készítünk, amely két expressziós egységből álló genetikai konstrukciót tartalmaz, melyek mindegyike legalább egy HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát foglal magában. Mindkét expressziós egység olyan kódolószekvenciát tartalmaz, amely a CMV közvetlen korai promoter és az SV40 kis poliadenilációs jel szabályozása alatt áll. A HIV-protein a gag, pol, env és rév proteinek valamelyike. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha olyan genetikai vakcinát állítunk elő, amely két expressziós egységet magában foglaló genetikai konstrukcióból áll, mely expressziós egységek közül legalább az egyik a gag, pol, env és rév HIV-proteinek vagy ezek fragmensei közül legalább két HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmaz, a másik pedig a gag, pol, env és rév HIV-proteinek vagy ezek fragmensei közül legalább egy HIV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmaz. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha olyan genetikai vakcinát állítunk elő, amely két expressziós egységet magában foglaló genetikai konstrukcióból áll, mely expressziós egységek közül legalább az egyik a gag, pol, env és rév HIV-proteinek vagy ezek fragmensei közül legalább három HlV-proteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmaz, a másik pedig a gag, pol, env és rév HlV-proteinek vagy ezek fragmensei közül legalább egy HIVproteint vagy proteinfragmenst kódoló szekvenciát tartalmaz. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha olyan genetikai vakcinát állítunk elő, amely két expressziós egységből álló, gag, pol, env és rév proteineket vagy proteinfragmenseket kódoló szekvenciát tartalmazó genetikai konstrukciót foglal magában.
48. példa
A pCMN160A 16 plazmidot HIV-ellenes gyógyszerészeti készletben (kit) vagy gyógyszerészeti készítményben történő alkalmazáshoz állítottuk elő. A plazmidot az alábbiak szerint készítettük.
1. lépés: A 35. és 34. szekvenciával rendelkező primereket a HIV/MN genom-DNS PCR-fragmenséhez alkalmaztuk.
2. lépés: A 33. és 36. szekvenciával rendelkező primereket a HIV/MN genom-DNS PCR-fragmenséhez használtuk.
3. lépés: A 35. és 36. szekvenciával rendelkező primereket az 1. és 2. lépés reakcióanyagának 2 μΐ-ével elegyítettük.
4. lépés: A 3. lépésben kapott reakcióterméket Notl-gyel és Mlul-gyel hasítottuk, s a 46. példában leírt, Notl-gyel és Mlul-gyel hasított A gerincvázba inszertáltuk.
A kialakított pCMN160A16 plazmid az A gerincvázba inszertálva az MN törzs ENV proteinjét kódoló régiót, valamint a rév régiót, illetve a HLA-DB régió változásokkal rendelkező nef régiót tartalmazza.
49. példa
A pGAGPOL.rev2 plazmidot az alábbiak szerint készítettük. Elsőként a gerincvázat alakítottuk ki, majd a HÍV gag és pol génnel inszertet hoztunk létre, s azt a gerincvázba inszertáltuk.
A gerincvázat a következők szerint készítettük:
1. lépés: A pMAMneo plazmidot (Clonetech) Bgll endonukleázzal emésztjük, a polimeráz I Klenowfragmensével feltöltjük, HindlII-mal hasítjuk, s gélen 1763 kb-os fragmenst tisztítunk.
2. lépés: A pJ4Dkan+ plazmidból származó KanR gént a 37. és 38. szekvenciával rendelkező oligonukleotidokkal amplifikáljuk (a Pharmacia Inc.-tól kapott kanamycin-rezisztenciagént az Imperial Cancer Research Fund UK adományaként kapott ρΙ4Ω vektorba klónoztuk; a ρΙ4Ω vektort eredetileg Morgenstem, J. P. és H. Land állították elő és írták le [Nucl. Acids Rés., 18(4), 1068; melyet hivatkozásul említünk], A PCR-terméket tompa végűvé alakítjuk, HindlII endonukleázzal hasítjuk, s a PCR-fragmenst gélen tisztítjuk.
3. lépés: A pMAMneo-ból kialakított és az 1. lépésben leírt vektort a 2. lépésben leírt, KanR gént kódoló
HU 219 767 Β
PCR-termékkel ligáljuk. Izoláljuk a KanR gént és a bakteriális replikációs kezdőhelyet tartalmazó plazmidot.
4. lépés: A kapott plazmidot Mlul-gyel emésztjük, és a DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével feltöltjük, majd SacII linkerrel (New England Biolabs) ligáljuk.
5. lépés: A 4. lépésben kapott plazmidot Asel és Sspl enzimekkel emésztjük.
6. lépés: A 3. lépésben leírt plazmidból származó KanR gén egy részét a 39. és 40. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával PCR-reakcióval kezeljük.
7. lépés: Az 5. lépésben kapott legnagyobb fragmenst a 6. lépésben kapott PCR-termékkel ligáljuk.
8. lépés: A 7. lépésben kapott ligálás termékét (plazmidot) HindlII-mal hasítjuk, majd a DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével tompa végűvé alakítjuk.
9. lépés: A pCEP4 plazmidot (Invitrogen) a CMV promotert, polilinkert és SV40 poliA helyet tartalmazó DNS-fragmens felszabadítása érdekében Sall-gyel hasítjuk. A kapott fragmenst tisztítjuk, és a DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével tompa végűvé alakítjuk.
10. lépés: A 8. lépésben kapott plazmidot és a 9. lépésben kapott fragmenst ligáljuk, és izoláljuk a bakteriális replikációs kezdőhelyet, KanR gén, RSV enhancert, CMV promotert, polilinkert és SV40 poliA helyet tartalmazó plazmidot.
11. lépés: A 10. lépésben kapott plazmidot BamHIgyel és Nhel-gyel hasítjuk.
12. lépés: Annuáljuk a 41. és 42. szekvenciával rendelkező oligonukleotidokat.
13. lépés: A 10. lépésben kapott plazmidot a 12. lépésben kapott, annuált oligonukleotidokkal ligáljuk, majd izoláljuk az azokban lévő adaptert tartalmazó plazmidot.
14. lépés: A 13. lépésben kapott plazmidot Sallgyel és Mlul-gyel emésztjük.
15. lépés: A rév nyitott leolvasási keretet templátként BBG35 (RD System Inc. Minneapolis, MN; amely a pUC19 vektorban a HX3B HÍV törzsből származó rév kódolórégióját tartalmazza), valamint a 43, és 44. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával PCR-amplifikáljuk. A PCR-terméket Sall-gyel és Mlul-gyel emésztjük.
16. lépés: A 14. lépésben kapott plazmidot a 15. lépésben kapott PCR-termékkel ligáljuk, és izoláljuk a rév kódolórégiót tartalmazó plazmidot.
A gag/pol inszertet az alábbiak szerint állítjuk elő:
1. lépés: A HIV-1 (HXB2) genom egy részének szubklónját Bluescript-vektorba (Stratagene) klónoztuk. A HIV-1 szubklónja az 5’LTR-t és az 5795. nukleotidig Genebank-számozás szerint) a HIV-l-genom maradékát a Bluescript-vektor Xbal és Sáli helyei közé klónozva tartalmazza. A HIV-1-szekvenciákat a HXB2D plazmidból (AIDS Respiratory) nyertük.
2. lépés: Az 1. lépésben leírt plazmid (a Bluescriptvektorba klónozott HIV-1 HXB2 genom egy részének szubklónja) nyitott leolvasási keretéből származó gag kódolórégió egy részét a 45. és 46. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával PCR-reakcióba visszük.
3. lépés: Az 1. lépésben leírt plazmidot (a Bluescript-vektorba klónozott HÍV-1 HXB2 genom egy részének szubklónját) EcoRI-gyel emésztjük. A pBluescript gerincvázat, az 5’HIV-l LTR-t, a gag kódolórégiót és a pol kódolórégió egy részét tartalmazó plazmidot tisztítjuk, és újból ligáljuk.
4. lépés: A 3. lépésben kapott plazmidot Notl-gyel és Spel-gyel hasítjuk, és a 2. lépésben kapott, Notl-gyel és Spel-gyel emésztett PCR-fragmenssel ligáljuk. Izoláljuk az 5’HIV-l LTR-t tartalmazó eredeti Notl/Spel fragmens helyett a PCR-fragmenst tartalmazó plazmidot.
5. lépés: A 4. lépésben kapott plazmidot EcoRIgyel és Sall-gyel emésztjük.
6. lépés: Annuáljuk a 47. és 48. szekvenciával rendelkező oligonukleotidokat.
7. lépés: Az 5. lépésben kapott plazmidot a 6. lépésben kapott adapterrel ligáljuk. Izoláljuk az EcoRI/Sall helyek közé klónozott adaptert tartalmazó plazmidot.
8. lépés: A 7. lépésben kapott plazmidot Ndel-gyel és EcoRI-gyel emésztjük.
9. lépés: A HXB2 HÍV-1 törzsből származó Rév Response-elemet (RRE) tartalmazó plazmidból a 49. és
50. szekvenciával rendelkező primerek alkalmazásával PCR-rel amplifikáljuk az REE-t. A PCR-terméket Ndel-gyel és EcoRI-gyel emésztjük.
10. lépés: A 8. lépésben kapott plazmidot a 9. lépésben kapott PCR-termékkel ligáljuk. Izoláljuk az RREszekvenciával rendelkező inszertet tartalmazó plazmidot.
11. lépés: A 10. lépésben kapott plazmidot Notlgyel és Sall-gyel emésztjük, és izoláljuk a gag kódolórégiót, a módosított pol kódolórégiót és az REE-szekvenciát tartalmazó fragmenst.
12. lépés: A gerincváz fentebb leírt előállítási eljárásának 16. lépésében kapott plazmidot Notl-gyel és Sall-gyel emésztjük.
13. lépés: A 12. lépésben kapott plazmidot a 11. lépésben kapott inszerttel ligáljuk, és izoláljuk a gag kódolórégiót, a módosított pol kódolórégiót és az REEszekvenciát tartalmazó inszertet magában foglaló plazmidokat.
14. lépés: A 13. lépésben kapott plazmidot Xbalgyel és Nhel-gyel emésztjük, tompa végeket alakítunk ki, és újból ligáljuk. Izoláljuk azt a plazmidot, melyből hiányzik a 13. lépésben kapott plazmid Xbal és Nhel helyei között található KpnI hely.
15. lépés: A 14. lépésben kapott KpnI-gyel emésztjük, és izoláljuk a legnagyobb fragmenst.
16. lépés: Annuáljuk az 51. és 52 szekvenciával rendelkező oligonukleotidokat.
17. lépés: A 15. lépésben kapott tisztított plazmidfragmenst a 16. lépésben kapott adapterfragmenssel ligáljuk. Izoláljuk a 15. lépésben kapott plazmid KpnI helyére inszertált adaptert tartalmazó plazmidot.
50. példa
Genetikai immunizálás regulátorproteinek génjeivel
A HÍV leküzdésében felmerülő nehézségek egy része a vírus rendkívüli változékonyságából és azon ké32
HU 219 767 Β pességéből ered, hogy mutációval gyorsan új formákat hoz létre. Az emberi populációban található HlV-izolátumok között nemcsak jelentős proteinszekvencia-eltérések tapasztalhatók, hanem a vírus nagyon gyors mutálódása miatt minden egyes HIV-fertőzött egyén valójában számos rokon HIV-mikrovariánst tartalmaz. Az ilyen HIV-izolátumok a replikációs hatékonyságban, tropizmusban, semlegesítésre való érzékenységben és a gyógyszer-rezisztenciában eltéréseket mutatnak. A gyógyszerrezisztens mutánsok megjelenése miatt a gyógyszeres kezelés nem alkalmazható. Az AZT esetében a gyógyszer-rezisztencia rendszerint a kezelés első évében kialakul. Az ilyen mutánsok állandó képződése szerepet játszhat a HÍV azon képességében, hogy hosszú idő után (mely alatt úgy tűnik, hogy ellenőrzésünk alatt tartjuk) végül elárasztja a gazda védekezőrendszerét.
Ezt a mutációs driftet (génsodródás) a gpl20 envelope glikoprotein különböző régióiban leírták, köztük a V3 hurok elsődleges semlegesitődoménjében, valamint a HIV-core proteinekben. A HÍV regulátorproteinek sokkal jobban konzerváltak, mint a strukturális proteinek, s azonos idő alatt kisebb mutációs driftet mutatnak. A regulátorproteinek emiatt az antivirális támadás vonzó célpontját képezik.
A HÍV a regulátor- és strukturális proteinek expressziójának jelentős átmeneti szabályozását mutatja. A virusreplikáció korai fázisában a Tat, Rév és Nef regulátorproteint kódoló mRNS-ek vannak túlsúlyban, míg a késői fázisban a strukturális proteineket (mint a Gag, Pol és Env prekurzorok és sok járulékos protein) kódoló mRNS-ek expresszálódnak nagyobb mennyiségben. A korai fázisból a késői fázisba történő eltolódás akkor következik be, amikor a Rév protein elér egy bizonyos szintet. A Tat, Rév és Nef vírusreplikációs ciklus korai stádiumában tapasztalható túlsúlya ezeket a proteineket az antivirális támadás számára szintén alkalmas célpontokká teszi. Ez különösen igaz a tat és rév esetében, melyek kulcsfontosságú szerepet játszanak a HÍV génexpresszió transzkripciós és poszttranszlációs szabályozásában, s a strukturális vírusproteinek transzkripciója és a fertőző vírusrészecskék termelődése előtt, a vírusreplikációs ciklus korai szakaszában, túlsúlyban vannak.
A HIV-replikáció során kulcsfontosságú szerepet betöltő tat és rév proteinekkel ellentétben, az egyéb regulátorproteineket (mint a nef, vpr, vif és vpu) gyakran járulékos” proteineknek nevezzük. Funkciójuk kevésbé ismert, és a virusreplikáció egy adott funkció elvesztése miatt bekövetkező mérséklődésének foka igen változó, és a megfertőzött gazdától is függhet. Mindazonáltal ezen funkciók nagyon eltérő HIV-izolátumok, valamint más főemlős-immundeficienciavírusok között tapasztalható erős konzerváltsága arra utal, hogy a természetes fertőzési folyamatokban ezen járulékos” funkciók jelentős szerepet játszanak (általánosságban lásd: Terwilliger, E. F., AIDS Research Reviews, 2, 3-27, 1992, szerkesztők: W. C. Koff, F. Wong-Staal és R. C. Kennedy, New York: Marcel Dekker, Inc.). A vpr, nef és vif valamelyikében deléciót tartalmazó főemlősrekombinánsvírusok in vivő nem patogének, ami tovább bizonyítja ezen járulékos gének vírusok életciklusában betöltött fontos szerepét.
Bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a HÍV ellen néhány kiválasztott regulátor- és/vagy enzimatikus protein prezentálásával magasabb szintű és nagyobb védőhatású immunreakciók válthatók ki, mint a HÍV gének teljes komplementjének alkalmazásával. Ennek megfelelően olyan immunizálási stratégiára van szükség, amely egy vagy több nem strukturális HIV-proteint (mint a tat, rév, vpr, nef, vpu vagy vif) kódoló szekvencia alkalmazásával végzett genetikai immunizálást foglal magában. Csak a vpr kapcsolatos a vírusrészecskékkel; a többi regulátorprotein (a tat, rév, nef, vpu és vif) nem áll kapcsolatban a virionokkal.
A HÍV ellen regulátorgének alkalmazásával végzett genetikai immunizálás néhány megvalósítási módjában a tat, rév, nef, vif és vpu gének közül egyet vagy többet a 46. példában leírt „A” gerincvázba inszertálunk. Előnyösen tat és/vagy rév gént alkalmazunk. Néhány megvalósítási módban tat vagy rév gént inszertálunk az A gerincvázba. Néhány megvalósítási módban (az előnyösség sorrendjében) targetként nef, vpr, vif és vpu alkalmazható. Előnyösen egynél több regulátorgént alkalmazunk: tat és rév; tat, rév és nef; tat, rév, nef és vpr; tat, rév, nef, vpr és vif; tat, rév, nef, vpr, vif és vpu; valamint ezek kombinációit, és adott esetben olyan további regulátorgéneket, mint a tev.
A Tat protein az LTR által irányított génexpresszió transzaktivátora; a HIV-replikációhoz feltétlenül szükséges. A Tat a vírusreplikációs ciklus korai szakaszában termelődik, s szükséges a Gag, Pol, Env és Vpr expressziójához. A Tat uralkodó formája két exon mRNS-ből származó 86 aminosavas protein. Az 58 Nterminális aminosav elégséges a transzaktiváláshoz, igaz, csak csökkent aktivitással. A Tat egy criz-működésű szekvencián (tar) működik, miáltal az LTR által irányított génexpresszió óriási mértékű növekedését eredményezi. A Tat részben a fokozott RNS-szintézis útján, részben a szintetizált protein-RNS transzkriptumonkénti mennyiségének növelésével fejti ki hatását. Egészen az utóbbi időkig a Tat-ról úgy gondolták, hogy csak a HIV-lLTR-en működik, azonban beszámoltak a JC vírus kései promoteréből kiinduló Tat-aktivált expresszióról is. A Tat a sejtproliferációt exogén faktorként is serkentheti, és HIV-fertőzött személyekben hozzájárulhat a Kaposi-sarcoma növekedéséhez. A Tat HIV-fertőzött és nem fertőzött páciensekben kifejtett káros hatásai miatt a genetikai immunizáláshoz alkalmazott, előnyben részesített toí-konstrukciókat úgy módosítjuk, hogy csak működésképtelen Tat proteint expresszáljanak. A Tat vagy Rév inaktiválására képes mutációk transzdomináns mutációkként működhetnek, melyek a HIV-fertőzött személyekben potenciálisan inaktiválják mindenféle Tat termelődését.
A Rév a HÍV második, virális replikációhoz nélkülözhetetlen regulátorproteinje. A Rév 116 aminosavból álló, 19 kD-os protein, amelyet különböző, többszörös splicinggal összeillesztett mRNS-ekben található két
HU 219 767 Β kódolóexon expresszál. Két különálló domént azonosítottak; az egyik az RRE-(Rev-response elem) tartalmú transzkriptumokhoz való kötődésben szerepet játszó alaprégió, a másik pedig egy „aktiváló” dómén, amely a kötődés eredményeként az említett transzkriptumok magi exportját indukálja. A természetes vírusfertőzés során a Rév szükséges a Gag, Pol és Env strukturális HIV-proteinek, valamint a Vpr expressziójához.
A Vpr a legtöbb HIV-1 törzsben egy 96 aminosavból álló, 15 kD molekulatömegű protein, bár a Vpr nyitott leolvasási kerete a sejttenyészetekben sok passzázson átesett vírustörzsekben jelentősen csonkított lehet. A vpr nyitott leolvasási keret a HIV-2 törzsben és a legtöbb SIV-izolátumbam is jelen van. A Vpr az első retrovírusregulátor-protein, melyről kimutatták, hogy kapcsolatban áll a HIV-vírusrészecskékkel (varionokkal). A HIV-varionokban való jelenléte azt sugallja, hogy a vírusreplikációs ciklus valamely korai pontján játszhat szerepet. A Vpr gyorsítja a HlV-replikációt, különösen a fertőzés korai szakaszában. A Vpr a HÍV TLR-hez kapcsolt riportergének expressziós szintjét körülbelül háromszorosára növeli. Sőt a Vpr és a Tat úgy tűnik, az LTR-kötött géneket illetően szinergikusan működik. A Vpr HlV-fertőzött páciensek vérsavójából izolálható, s úgy tűnik, fokozza a vírus újabb sejteket megfertőző képességét. A Vpr-ről azt is kimutatták, hogy gátolja a sejtproliferációt és indukálja a sejtdifferenciálódást (Levy, D. N. és munkatársai, Cell, 72, 1-20, 1993). Azt tapasztalták, hogy a primer monocita/makrofágok in vitro csak differenciálódásuk során fertőzhetők meg (Schuitemaker, H. és munkatársai, J. Clin. Invest., 89, 1154-1160, 1992). A Vpr hatására még azok a sejtek is károsodnak, melyek nem támogatják a HIV-replikációt. Például a Vpr lehet felelős az AIDS-es betegekben gyakran megfigyelt izomsorvadásért. A Vpr potenciális károsítóhatásai miatt a genetikai immunizálást lehetőleg módosított vpr-konstrukció alkalmazásával kell végezni, ami működésképtelen Vpr protein termelődését eredményezi.
A Nef (régebben 3’ orj) egy 25-27 kD molekulatömegű protein, melyről felvetették, hogy szerepet játszhat a CD4+ T-limfociták alulszabályozásában. A Nef ráadásul a sejtjelzésben is szerepet játszhat. Úgy tűnik, a Nef lényeges szerepet tölt be a HIV-fertőzés in vivő kialakulásában. A Nef-specifikus CTL-sejtekről úgy tartják, hogy fontosak a HIV-fertőzés in vivő szabályozásában.
A Vif („vírusragályossági faktor”) egy 23 kD molekulatömegű citoplazmikus protein. Bár a Vif-defektív mutáns vírusok a sejtről sejtre terjedésben nem játszanak közre, sok CD4+ sejtvonal megfertőzését illetően jelentősen megnövekedett képességet mutatnak. Vif hiányában a vírus sarjadása és fertőzőképessége csökken. Főemlősökkel végzett vizsgálatokban a Vif deléciós mutánsok in vivő fertőzések kialakítására nagyon csökkent mértékben voltak képesek. E vizsgálatok alátámasztják a Vif gazdában lejátszódó vírusreplikációban betöltött klinikai szerepét.
A Vpu 81 aminosavból álló, 15-20 kD molekulatömegű protein. Bár a Vpu(+) és Vpu(-) vírusok azonos mennyiségű vírusproteint termelnek, az utóbbiak a vírusproteinek fokozott intracelluláris feldúsulását, s ezzel együtt csökkent extracelluláris vírusmennyiséget eredményeznek. Ez azt sugallja, hogy a Vpu szerepet játszhat a vírusrészecskék összerendeződésében és/vagy felszabadulásában.
Az egyszerű retrovírusokból (mint az egér- és madárvírusok) hiányoznak a HIV-1, HIV-2 és SIV regulátorproteinekkel analóg proteinek. Ezekben az állatokban a retrovírus-fertőzés önkorlátozó, ami a vírusok eltávozásával és csökkent patogenitással jár. Hasonlóan a HTLV-1, amely csak Tax (amely a Tat-hoz hasonló működésű, és vpr-szerű aktivitást is mutat) és Rex proteint (amely a Rev-hez hasonló működésű) tartalmaz, sok páciensből eltávozik. A regulátorgénekkel végzett genetikai immunizálás nemcsak a HÍV ellen hatásos, hanem a HBV (X géntermék), HCV és HTLV-1 (Tax és Rex géntermék) ellen is. E vírusokban a regulátorgénekről úgy véljük, kulcsfontosságú szerepet játszanak a vírus életciklusában és a fertőzés kialakításában.
57. példa
A pREG HIV-1 regulátorplazmid előállítása
A pREG plazmidot lépésenkénti módszerrel alakítottuk ki, melynek során a konstrukció kialakításának folytatása előtt valamennyi intermediert proteinexpresszióra tesztelhetjük. A tét és rév gén expresszióját biztosító expressziós vektort két lépésben állítjuk elő. Először egy szintetikus templátból amplifikációs terméket amplifikálunk, amely egy 5’NheI helyet, a HIV-1 fő splicing donorhelyet, a tat kódolórégió nagy részét, a rév protein N-terminális végét kódoló régiót és egy Avall helyet tartalmaz. A szintetikus templátot a GenBank Adatbázistól kapott HIV-1 HXB2 törzs publikált szekvenciáinak felhasználásával készítjük, s a tat protein 22, és 30 ciszteingyökét mutációval megváltoztatjuk. E mutációkról kimutatták, hogy a tat proteint működésképtelenné teszik [Kuppuswamy és munkatársai, Nucleic Acids Research, 77(9), 3551-3561, 1989].
A PCR-terméket Nhel és Avall helyet, valamint kanamycin-rezisztenciagént és pBR322 replikációs kezdőhelyet tartalmazó vektorba ligáljuk. Ez a plazmid tartalmaz még egy cytomegalovírus promotert, egy Roussarcomavírus enhancert, rév kódolórégiót és SV40 poliadenilációs jelet is. A plazmidban található rev-szekvencia a HIV-1 IIIB provirális kiónjából származik. Ebben a lépésben olyan expressziós vektort kapunk, amely teljes, de mutált tat kódolórégiót és egy teljes rév kódolórégiót tartalmaz.
A következő lépésben olyan PCR-terméket állítunk elő, amely 5’-végén egy Avall helyet, a rév 81. aminosavát érintő mutációt, a rév kódolórégiójának körülbelül 30%-át, a ne/kódolórégiójának körülbelül 30%-át, s 3’-végen pedig egy Miül helyet tartalmaz. A 81. aminosavat érintő aminosavváltozásról kimutatták, hogy megszünteti a rév működését, s ezáltal a kapott plazmid működésképtelen rév protein termelődését eredményezi [Bogard, H. és Greene, W. C., J. Virol., 67(5),
HU 219 767 Β
2496-2502, 1993]. Feltételezzük, hogy a nef kódolórégió nagy deléciója működésképtelen nef protein termelődését eredményezi. Az 5’ Avall helyet és a rév protein 81. aminosavat érintő mutációt az 5’ PCR primerrel visszük be, amely komplementer a rév kódolórégiójával, amely Avall helyet és a 81. aminosavat kódoló nukleotidot tartalmaz. A Nef 63. aminosavnál lévő terminációs stop kodonját és a 3 kódoló klónozási helyet (Miül) a 3’ PCR primerrel visszük be. A PCR -amplifikációhoz templátként a HIV-1 MN törzséből származó rév és nef kódolórégiókat tartalmazó plazmidot vagy szintetikus templátot alkalmazunk. A kapott PCR-terméket Avall és Miül endonukleázzal emésztjük, s az előző bekezdésben leírt tat-rev plazmid Avall-vel és Mlul-gyel végzett emésztése után kapott kisebb Avall-Mlul ffagmens helyettesítésére használjuk.
Ehhez a plazmidhoz egy vagy két helyre adott esetben vpr adható. Az egyik módszer szerint a vpr-t 5’ PCR primer (amely a vpr transzlációs start kodont átívelő szekvenciáktól upstream irányban elhelyezkedő Mlul-et tartalmaz) és 3’ PCR primer (amely a vpr stop kodonnal, és a stop kodont szegélyező, Miül klónozóhelyet szintén tartalmazó szekvenciákkal komplementer) alkalmazásával amplifikáljuk. A start kodontól upstream irányban elhelyezkedő szekvenciák splicing akceptort tartalmaznak. A PCR-terméket Mlul-gyel emésztjük, és a fentebb leírt tat, rév, nef plazmidba inszertáljuk (melyet előzőleg Mlul-gyel emésztettünk).
Más lehetőség szerint a vpr-amplifikációt hasonló módon úgy hajtjuk végre, hogy olyan restrikciós helyeket tartalmazó primereket alkalmazunk, amelyek egy másik vektorba történő klónozáshoz felelnek meg, miáltal az expresszió egy második eukarióta promoter szabályozása alá kerül. Az e plazmidból származó kazetta [amely a második promotert, a vpr kódolórégiót és a poli(A) szekvenciát tartalmazza] a kazettát szegélyező restrikciós helyeknek megfelelő enzimekkel (melyek a kazettán belül nem hasítanak) végzett emésztéssel felszabadítható. A kapott DNS-fragmens a tat, rév, vpr plazmid olyan helyére klónozható, amely a tat, rév, vpr expresszióhoz szükséges régión kívül esik. Ezzel a módszerrel két expressziós egységgel rendelkező plazmid állítható elő.
52. példa
HCV és HTLV-1 plazmid előállítása
HTLV-1 vagy HCV által kódolt, a vírus életciklusához és/vagy ezen vírusok regulátorproteinjeihez szükséges enzimatikus funkciókkal rendelkező proteineket expresszáló plazmid előállításához az előzőhöz hasonló megközelítés alkalmazható. A HTLV-1 esetében a fentebb leírt klónozási módszer és plazmidgerincváz alkalmazásával TAX regulátorproteint kódoló plazmidot állítunk elő. Az enzimatikus proteineket kódoló HCV gének közé tartozik az RNS-dependens RNS-polimeráz, amely egy helikáz/proteáz működésű protein. A plazmid előállításához szükséges szekvenciákat leírták, s a GenBankból beszerezhetők. A HTLV-1 és a HCV virális szerkezetét Cann, A. J. és
Chen, I. S. Y. (Virology, 2. kiadás, szerkesztő: Β. N. Fiddr, Raven Press, Ltd., New York, 1990), illetve Bradley, D. W. [Transfúsion Medicine Reviews, 7(2), 93-102,1992] írták le.
53. példa
Genetikai immunizálás enzimatikus génekkel
Az enzimatikus funkciójú proteineket kódoló génekkel, mint például a HÍV pol génnel végzett genetikai immunizálás szintén fontos vírusellenes stratégia lehet, hiszen az életképes vírusok termeléséhez enzimek (mint a Pol) szükségesek. Polimeráz vagy annak bármilyen részfúnkciója nélkül a HÍV nem patogén, s nem fertőzőképes. Az egyéb vírusok enzimatikus génjei, mint a HBV polimeráz, a genetikai immunizálás számára szintén vonzó célpontul szolgálnak. [Lásd például Radziwill és munkatársai, „Mutational Analysis of the Hepatitis B Vírus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity”, J. Virol., 64(2), 613-620, 1990.]
Az egyik ok, ami miatt a vírusenzimek immunológiai targetként való alkalmazása előnyös, az, hogy az ilyen enzimek aminosavszekvenciát érintő mutációs képessége korlátozott, s megtartják enzimatikus funkcióikat. Például a HIV-1 esetében a Pol korlátozott számú „escape” mutációt mutat, melyek a nukleotidanalógokra (mint az AZT) vonatkozó rezisztenciával kapcsolatosak. Azonban a proteinen belül, még a gyógyszerrezisztens mutánsokban is hatalmas mennyiségű immunológiai target konzerválódik.
54. példa
HBV polimeráz plazmid előállítása
Az irodalomban leírt kísérletek azt mutatják, hogy a HBV polimeráz expressziót szövettenyészetben olyan sejtekben valósították meg, melyekben az mRNS-molekulában mind a core, mind a polimeráz nyitott leolvasási keretek jelen voltak. Ez azt is bizonyítja, hogy ebben az esetben a core TG mutációja nem befolyásolta a polimeráz expresszióját.
A HBV-genomot az ADW HBV törzs „head-totail” dimeijét tartalmazó plazmidból amplifikáljuk. Mivel csak a polimeráz, s nem a core expressziójára van szükség, az 5’ PCR prímért úgy alakítottuk ki, hogy a precore és core transzlációs kezdőkodonok mutációt szenvedjenek. Hogy kiküszöböljük a replikációkompetens HBV genom-RNS képződésének lehetőségét, a primer egy mutáns DR1-szekvenciát is visz a plazmidba. Ezt a PCR-terméket kanamycin-rezisztenciagént és pBR322 replikációs kezdőhelyet tartalmazó plazmidba klónoztuk. A plazmid ezenkívül tartalmaz még cytomegalovírus promotert, Rous-sarcomavírus enhancert és SV40 poliadenilációs jelet is. A HBS és X géntermékek expressziójának megakadályozása érdekében a felületi antigén és az X kódolórégió termékének kezdőkodonjait mutáltuk.
A HBV polimeráz expresszió megvalósításának másik megközelítése szerint a teljes polimerázt kódoló régiót kódoló PCR-terméket amplifikáltunk, s azt kanamycin-rezisztenciagént és pBR322 replikációs kezdőhe35
HU 219 767 Β lyet tartalmazó plazmidba klónoztuk. A plazmid ezenkívül tartalmaz még cytomegalovírus promotert, Roussarcomavírus enhancert és SV40 poliadenilációs jelet is. Az amplifikációhoz alkalmazott 5’ PCR primer tartalmaz egy klónozási helyet, s átíveli a polimeráz gén transzlációs kezdőkodonját. A 3’ PCR primer az inszert expressziós vektorba történő klónozásához egy restrikciós helyet tartalmaz, és komplementer a HBV polimeráz gén hagyományos stop kodonjával, valamint a stop kodont szegélyező szekvenciákkal. Miután ezt a PCR-terméket kanamycin-rezisztenciagént, pBR322 replikációs kezdőhelyet, cytomegalovírus promotert, Rous-sarcomavírus enhancert és SV40 poliadenilációs jelet tartalmazó plazmidba ligáltuk, a Hepatitis B felületi antigén gén és az X gén transzlációs kezdőkodonjait mutáltuk, hogy megakadályozzuk e géntermékek expresszálódását. Egy másik, hasonló módszer szerint HBVpoli(A) jelet és e jelet szegélyező szekvenciákat tartalmazó 3’ PCR prímért alkalmazunk. Ezt a 3’ prímért olyan esetben alkalmazzuk, ha a HBV poli(A) jelet tartalmazó és/vagy azt szegélyező szekvenciák lényegesek az expresszióhoz. Mutációs analízissel kimutatták, hogy a HBV polimeráz működése bizonyos nukleotidok megváltoztatásával megszüntethető [Radziwell, G. és munkatársai, J. Virol., 64(2), 613-620, 1990]. A fentebb leírt módon előállított plazmid alkalmazása előtt az expresszált polimeráz a leírt mutációk valamelyikének (vagy analóg mutáció) bevitelével mutálható.
55. példa
A granulocita-makrofág kolónia stimuláló faktor (GM-CSF) számos sejtvonalra (mint a neutrofil leukociták, monociták/makrofágok és eozinofil sejtek) serkentőhatást gyakorol. A GM-CSF, hatásai miatt, előnyös gyógyszermodell. Az FDA jóváhagyta a GM-CSF autológ csontvelő-transzplantációban való alkalmazását, és a különböző neutropeniák kezelésében megnyilvánuló hatékonyságának tesztelése érdekében klinikai kísérleteket folytatnak. Jelenleg a GM-CSF-et többdózisú beadást igénylő proteinként alkalmazzák. Ebben az esetben a proteineket elő kell állítani, illetve tisztítani kell őket.
A GM-CSF protein alkalmazásának másik megközelítési módja GM-CSF-et kódoló gént tartalmazó génkonstrukció bupivacainnal együttes, közvetlen beadását foglalja magában. A genetikai konstrukciót jelzőszekvenciát magában foglaló GM-CSF gén PCR reakciójával állítjuk elő. A genetikai konstrukció előnyösen kanamycin-rezisztenciagént (amino-glikozid 3’-foszfotranszferáz gén), bakteriális replikációs kezdőhelyet, valamint olyan szekvenciákat tartalmaz, melyek azokban a sejtekben, amelyekbe a plazmidot (mint például a 46. példában nukleotid-gerincvázként leírt vektorokat) kívánjuk bevinni, lehetővé teszik a GM-CSF kódolórégiójának expresszálódását. A plazmid előnyösen tartalmaz egy emlősreplikációs kezdőhelyet, amit a bupivacain beadásával kapcsolatos celluláris replikáció indukál. Ha az EBV-replikációs kezdőhelyet alkalmazzuk, a megfelelő regulátorszekvenciákkal együtt az
EBNA-1 magi antigént kódoló szekvenciát is beépítjük a plazmidba. Az inszert PCR-amplifikálásához alkalmazott primerek az expressziós vektorba történő klónozás elősegítése érdekében restrikciós felismerési helyeket tartalmaznak, s komplementerek a GM-CSF kódolószekvenciáinak 5’- és 3’-végeivel. A PCR-reakciót cDNS-klón alkalmazásával Lee és munkatársai leírása szerint végezzük (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4360-4364).
56. példa
A krónikus csontvelő-leukémia (CML) a vérképző stemsejtek klonális mieloproliferatív betegsége, amely a Philadelphia-kromoszómával kapcsolatos. A Philadelphia-kromoszóma a 9. és 22. kromoszóma közötti transzlokációból eredő kromoszóma-rendellenesség. A 22. kromoszóma törési pontjai a „breakpoint cluster region” (BCR) elnevezésű 6 kb-os régióban csoportosulnak, míg a 9. kromoszómán a törési pontok a c-abl exon 2-től upstream irányban elhelyezkedő 90 kb-os régión szóródnak szét. A különböző 9:22 transzlokációk két típusra, a K28 és az L6 transzlokációkra oszthatók. A bcr-abl transzlokáción lejátszódó transzkripció fúziós mRNS-ek kialakulását eredményezi. Az mRNS-ek bcr-abl, kapcsolódásait célzó antiszenszről bebizonyosodott, hogy csökkenti a CML páciensekből származó vérképző sejtek kolóniaképző képességét.
A CML-ben szenvedő páciens sejtjeibe bupivacainnal együtt antiszenszt kódoló genetikai konstrukciót adunk be ex vivő, majd a kezelt sejteket visszajuttatjuk a páciensbe.
57. példa
A 46. példában nukleotid-gerincvázként leírt vektorok alkalmazásával HBV elleni immunizálásra és kezelésre alkalmas gyógyszerészeti készletben (kit) és vakcinakészítményben alkalmazható génkonstrukciókat készítünk. A plazmidok strukturális HBV géneket, elsősorban HBV felületi antigént és/vagy HBV core antigént és/vagy HBV precore antigént kódoló géneket tartalmaznak.
58. példa
A 46. példában nukleotid-gerincvázként leírt vektorok alkalmazásával HCV elleni immunizálásra és kezelésre alkalmas gyógyszerészeti készletben (kit) és vakcinakészítményben alkalmazható génkonstrukciókat készítünk. A plazmidok strukturális HCV géneket, elsősorban HCV core proteint és/vagy HCV envelope proteint kódoló géneket tartalmaznak.
59. példa
Egyetlen targetproteinként HÍV rev-et kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó pREV génkonstrukciót készítettünk. A rév kódolószekvenciáját a HX3B HÍV törzs rév kódolórégióját a pUC19 vektorban tartalmazó BBG35 plazmidból (RD Systems Inc., Minneapolis, MN) a 46. példában leírt „A” nukleotid-gerincvázba klónoztuk.
HU 219 767 Β
SZEKVENCIALISTA
Szekvenciák száma: 52
TUDNIVALÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZEKVENCIA AGGCGTCTCG AGACAGAGGA GAGCAAGAAA TG 32
TUDNIVALÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 30bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZEKVENCIA TTTCCCTCTA GATAAGCCAT CCAATCACAC 30
TUDNIVALÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 29bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. SZEKVENCIA GAAGGATCCA TGAAAAAATA TTTATTGGG 29
TUDNIVALÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 30bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZEKVENCIA ACTGTCGACT TATTTTAAAG CGTTTTTAAG 30
TUDNIVALÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZEKVENCIA GCCAGTTTTG GATCCTTAAA AAAGGCTTGG 30
TUDNIVALÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZEKVENCIA TTGTGAGGGA CAGAATTCCA ATCAGGG 27
TUDNIVALÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
HU 219 767 Β (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZEKVENCIA CAGTGATATC CCGGGAGACT CCTC 24
TUDNIVALÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZEKVENCIA GAATAGAAGA ACTCCTCTAG AATTC 25
TUDNIVALÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 27bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. SZEKVENCIA GCCTTAGGCG GATCCTATGG CAGGAAG 27
TUDNIVALÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZEKVENCIA TAAGATGGGT GGCCATGGTG AATT 24
TUDNIVALÓK A 11. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. SZEKVENCIA Cys Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile Gin Arg Gly Pro Gly Arg 1 5 10 15
Alá Phe Val Thr Ile Gly Lys
TUDNIVALÓK A 12. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 25 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. SZEKVENCIA Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gin Arg Gly Pro Gly Arg 1 5 10 15
Alá Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Cys
25
TUDNIVALÓK A 13. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 27 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: peptid
HU 219 767 Β (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 13. SZEKVENCIA Cys Arg Ile Lys Gin Phe Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys 15 10 15
Alá Met Thr Alá Pro Pro Ile Ser Gly Ile Arg Cys
25
TUDNIVALÓK A 14. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 25 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 14. SZEKVENCIA Arg Ile Leu Alá Val Glu Arg Tyr Ile Lys Asp Gin Gin Leu Leu 1 5 10
Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys
20 25
TUDNIVALÓK A 15. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 15. SZEKVENCIA TTGTTTAACT TTTGATCGAT CCATTCC 27
TUDNIVALÓK A 16. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 16. SZEKVENCIA GATTTGTATC GATGATCTGA C 21
TUDNIVALÓK A 17. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 17. SZEKVENCIA TGTAGTAGCA AAAGAAATAG TTAAG 25
TUDNIVALÓK A 18. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 18. SZEKVENCIA AATTCTTAAC TATTTCTTTT GCTAC 25
TUDNIVALÓK A 19. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 40bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS
HU 219 767 Β (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 19. SZEKVENCIA ATTTGTCGAC TGGTTTCAGC CTGCCATGGC AGGAAGAAGC 40
TUDNIVALÓK A 20. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 29bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 20. SZEKVENCIA ACGACGCGTA TTCTTTAGCT CCTGACTCC 29
TUDNIVALÓK A 21. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 21. SZEKVENCIA GCTGACGGTA GCGGCCGCAC AATT 24
TUDNIVALÓK A 22. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 22. SZEKVENCIA GTATTAAGCG GCCGCAATTG TT 22
TUDNIVALÓK A 23. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 78 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 23. SZEKVENCIA AAAAAGCTTC GCGGATCCGC GTTGCGGCCG CAACCGGTCA CCGGCGACGC 50 GTCGGTCGAC CGGTCATGGC TGGGCCCC 78
TUDNIVALÓK A 24. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 24. SZEKVENCIA CCCAAGCTTA GACATGATAA GATACATTG 29
TUDNIVALÓK A 25. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 25. SZEKVENCIA CTAGCAGCTG GATCCCAGCT TC 22
TUDNIVALÓK A 26. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24bázispár
HU 219 767 Β (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 26. SZEKVENCIA GGATTTCTGG GGATCCAAGC TAGT 24
TUDNIVALÓK A 27. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 27. SZEKVENCIA TATAGGATCC GCGCAATGAA AGACCCCACC T 31
TUDNIVALÓK A 28. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 28. SZEKVENCIA ATATGGATCC GCAATGAAAG ACCCCCGCTG A 31
TUDNIVALÓK A 29. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 30bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 29. SZEKVENCIA TAAAGCGGCC GCTCCTATGG CAGGAAGACG 30
TUDNIVALÓK A 30. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 34 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 30. SZEKVENCIA ATTACGCGTC TTATGCTTCT AGCCAGGCAC AATG 34
TUDNIVALÓK A 31. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 40bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 31. SZEKVENCIA ATTACGCGTT TATTACAGAA TGGAAAACAG ATGGCAGGTG 40
TUDNIVALÓK A 32. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 32. SZEKVENCIA ATTACGCGTT ATTGCAGAAT TCTTATTATG GC 32
HU 219 767 Β
TUDNIVALÓK A 33. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 33. SZEKVENCIA GAGGCTTGGA GAGGATTATA GAAGTACTGC AAGAGCTG 38
TUDNIVALÓK A 34. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 34. SZEKVENCIA GAATCCTCTC CAAGCCTCAG CTACTGCTAT AGCTGTGGC 39
TUDNIVALÓK A 35. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (11) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 35. SZEKVENCIA AAAAATAAAG CGGCCGCTCC TATGGCAGGA AGAGAAGCG 39
TUDNIVALÓK A 36. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 39bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 36. SZEKVENCIA AAAAAATTAC GCGTCTTATG CTTCTAGCCA GGCACAATG 39
TUDNIVALÓK A 37. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 37. SZEKVENCIA CCC AAGCTTG GGAATGCTCT GCCAGTGTTA C 31
TUDNIVALÓK A 38. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 36 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 38. SZEKVENCIA GGGGGCCGGA AGGGCACAAT AAAACTGTCT GCTTAC 36
TUDNIVALÓK A 39. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris
HU 219 767 Β (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 39. SZEKVENCIA
CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG CTG 33
TUDNIVALÓK A 40. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 111 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 40. SZEKVENCIA AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA 50
GTGAGAAATC ACCATCAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGT 100
TTATGCATTT C 111
TUDNIVALÓK A 41. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 55 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 41. SZEKVENCIA CTAGCGCGGG GATCCGCGTT GCGGCCGCAA AAAGTCGACG GGCGACGCGT 50 AAAAA 55
TUDNIVALÓK A 42. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 55 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 42. SZEKVENCIA GATCTTTTTA CGCGTCGCCC GTCGACTTTT TGCGGCCGCA ACGCGGATCC 50 CCGCG 5 5
TUDNIVALÓK A 43. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 43. SZEKVENCIA ATGTCGACTG GTTTCAGCCT GCCATGGCAG GAAGAAGC 48
TUDNIVALÓK A 44. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 35 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 44. SZEKVENCIA CCCCACGACG CGTCTATTCT TTAGCTCCTG ACTCC 35
TUDNIVALÓK A 45. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 35 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS
HU 219 767 Β (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 45. SZEKVENCIA TTTGCGGCCG CGTAAGTGGA GAGAGATGGT GCGAG TUDNIVALÓK A 46. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 46. SZEKVENCIA CTGGTGGGGC TGTTGGCTCT G TUDNIVALÓK A 47. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 80 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 47. SZEKVENCIA AATTTAATAA GTAAGTAAGT GTCATATGTT TGTTTGAATT CTGCAACAAC TGCTGTTTAT CCATTTTCAG AATTGGGTG
TUDNIVALÓK A 48. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 80bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 48. SZEKVENCIA TCGACACCCA ATTCTGAAAA TGGATAAACA GCACTTGTTG CAGAATTCAA ACAAACATAT GACACTTACT TACTTATTA
TUDNIVALÓK A 49. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 49. SZEKVENCIA GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAA TTGGAGAAGT G TUDNIVALÓK AZ 50. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 70 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 50. SZEKVENCIA AAGCTTGTGG AATTCTTAAT TTCTCTGTCC GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAT TGGAGAAGTG
TUDNIVALÓK AZ 51. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 51. SZEKVENCIA CAGTATCTGG CATGGGTAG
HU 219 767 Β
TUDNIVALÓK AZ 52. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 51. SZEKVENCIA CCATGCCAGA TACTGGTAC 29

Claims (41)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Gyógyszerészeti immunizálókészlet, azzal jellemezve, hogy
    a) tartalmaz egy első oltóanyagot, amely (i) gyógyszerészetileg elfogadható hordozót vagy diluenst, és (ii) legalább egy HIV-proteint kódoló, szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolt, humán sejtekben expresszálható nukleotidszekvenciát magában foglaló első nukleinsavmolekulát tartalmaz;
    b) és tartalmaz egy második oltóanyagot, amely (i) gyógyszerészetileg elfogadható hordozót vagy diluenst, és (ii) legalább egy HIV-proteint kódoló, szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolt, humán sejtekben expresszálható nukleotidszekvenciát magában foglaló második nukleinsavmolekulát tartalmaz;
    valamint egy Ar-R‘-O-R2-R3, Ar-N-R'-R2-R3,
    R4-N-R5-R6 vagy
    R4_O-R1-N-R7 általános képletű polinukleotidműködést fokozó szert, a képletekben Ar jelentése fenil-, ρ-amino-fenil-, mamino-fenil-, ο-amino-fenil-, szubsztituált fenil-, szubsztituált p-amino-benzol, szubsztituált zM-aminobenzol-, szubsztituált o-amino-benzol, melyekben az amino-benzol aminocsoportja lehet aminocsoport, 1-5 szénatomos alkil-amino-csoport vagy 1-5 szénatomos dialkil-amino-csoport, és a szubsztituált vegyületek szubsztituense halogénatom, 1-5 szénatomos alkilés 1-5 szénatomos alkoxicsoport;
    R1 jelentése C=O;
    R2 jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport (beleértve az elágazó láncúakat is);
    R3 jelentése hidrogénatom, aminocsoport, 1-5 szénatomos alkil-amino-csoport vagy 1-5 szénatomos dialkil-amino-csoport;
    R2 és R3 együttesen ciklusos alkilcsoportot, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alkilcsoportot, ciklusos alifás aminocsoportot, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alifás aminocsoportot, heterociklusos csoportot vagy 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált heterociklusos csoportot (beleértve az 1-10 szénatomos alkilcsoporttal Nszubsztituált heterociklusos csoportokat) alkothat;
    R4 jelentése Ar, R2 vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport, ciklusos alkilcsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alkilcsoport, ciklusos alifás aminocsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alifás aminocsoport, heterociklusos csoport vagy 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált heterociklusos csoport (beleértve az 1-10 szénatomos alkilcsoporttal N-szubsztituált heterociklusos csoportokat); és
    R7 jelentése Ar, R2 vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport, ciklusos alkilcsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alkilcsoport, ciklusos alifás aminocsoport, 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált ciklusos alifás aminocsoport, heterociklusos csoport vagy 1-10 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált heterociklusos csoport, beleértve az 1-10 szénatomos alkilcsoporttal N-szubsztituált heterociklusos csoportokat.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül tartalmaz még
    c) egy bupivacaint magában foglaló harmadik oltóanyagot.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy az említett első nukleinsavmolekula és az említett második nukleinsavmolekula együttesen gag, pol és env HIV-proteineket kódol.
  4. 4. Gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy
    a) egy psi delécióval együtt gag és pol HÍV strukturális proteineket kódoló, Rous-sarcomavírus enhancerhez, cytomegalovírus közvetlen korai promoterhez és SV40 kis poliadenilációs jelhez, és adott esetben SV40 replikációs kezdőhelyhez működőképesen kapcsolt DNS-szekvenciát magában foglaló DNS-molekulát; és
    b) egy, az 1. igénypontban meghatározott polinukleotidműködést fokozó szert tartalmaz.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett polinukleotidműködést fokozó szerként bupivacaint tartalmaz.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy HÍV rév „response”-elemet és egy HÍV integráz deléciót is tartalmaz.
  7. 7. A 4. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzaljellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy HÍV „splice” akceptort is tartalmaz.
  8. 8. A 4. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-molekulát tar45
    HU 219 767 Β talmaz, amely HÍV rév proteint kódoló, SV40 promoterhez és SV40 kis poliadenilációs helyhez, és adott esetben SV40 replikációs kezdőhelyhez működőképesen kapcsolt DNS-szekvenciát is tartalmaz.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan, rév proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely HÍV vpu és HÍV env proteineket is kódol.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan, gag és pol proteineket kódoló DNS-szekvenciát foglal magában, amely HÍV rév „response”-elemet és HÍV integráz deléciót is tartalmaz.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan, gag és pol proteineket kódoló DNS-szekvenciát foglal magában, amely HÍV „splice” akceptort is tartalmaz.
  12. 12. Gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy
    a) egy rév, vpu és env HIV-proteineket kódoló, Rous-sarcomavírus enhancerhez, cytomegalovírus közvetlen korai promoterhez és SV40 kis poliadenilációs jelhez, és adott esetben SV40 replikációs kezdőhelyhez működőképesen kapcsolt DNS-szekvenciát magában foglaló DNS-molekulát; és
    b) egy, az 1. igénypontban meghatározott polinukleotidműködést fokozó szert tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett polinukleotidműködést fokozó szerként bupivacaint tartalmaz.
  14. 14. Gyógyszerészeti immunizálókészlet, azzal jellemezve, hogy
    a) tartalmaz egy első oltóanyagot, amely (i) egy psi delécióval együtt gag és pol HÍV strukturális proteineket kódoló, Rous-sarcomavírus enhancerhez, cytomegalovírus közvetlen korai promoterhez és SV40 kis poliadenilációs jelhez, és adott esetben SV40 replikációs kezdőhelyhez működőképesen kapcsolt DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-molekulából álló első gyógyszerészeti készítményt; és (ii) egy, az 1. igénypontban meghatározott polinukleotidműködést fokozó szert foglal magában; és
    b) tartalmaz egy második oltóanyagot, amely (i) rév, vpu és env HIV-proteineket kódoló, Roussarcomavírus enhancerhez, cytomegalovírus közvetlen korai promoterhez és SV40 kis poliadenilációs jelhez, és adott esetben SV40 replikációs kezdőhelyhez működőképesen kapcsolt DNS-szekvenciát tartalmazó DNSmolekulából álló második gyógyszerészeti készítményt; és (ii) egy, az 1. igénypontban meghatározott polinukleotidműködést fokozó szert foglal magában.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti gyógyszerészeti immunizálókészlet, azzal jellemezve, hogy az említett polinukleotidműködést fokozó szerként bupivacaint tartalmaz.
  16. 16. Gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy
    i) egy patogén antigén epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló legalább egy epitópot tartalmazó proteint; hiperproliferatív betegséggel kapcsolatos protein epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó proteint; autoimmunbetegségre jellemző sejtekkel kapcsolatos protein epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó proteint; a páciensben hiányzó, nem működő vagy részlegesen működő proteint kompenzáló proteint; vagy a páciensben gyógyhatást kifejtő proteint kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló nukleinsavmolekulát; és ii) egy, az 1. igénypontban meghatározott polinukleotidműködést fokozó szert tartalmaz;
    és az említett gyógyszerészeti készítmény retrovírus-részecskéktől mentes.
  17. 17. Az 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett polinukleotidműködést fokozó szerként bupivacaint tartalmaz.
  18. 18. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett nukleinsavmolekulaként DNS-molekulát tartalmaz.
  19. 19. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett proteinként egy patogén antigént vagy annak ffagmensét tartalmazza.
  20. 20. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett patogénként a következő vírusok valamelyikét tartalmazza: humán immunhiányvírus, HÍV; humán T-sejt-leukémiavírus, HTLV; influenzavírus; hepatitis A vírus, HAV; hepatitis B vírus, HBV; hepatitis C vírus, HCV; humán papillomavírus, HPV; Herpes simplex 1 vírus, HSV1; Herpes simplex 2 vírus, HSV2; citomegalovírus, CMV; Epstein-Barr vírus, EBV; rhinovírus; vagy coronavírus.
  21. 21. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett patogénként HIV-t és említett nukleinsavmolekulaként olyan molekulát tartalmaz, amely egy HIV-proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  22. 22. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett patogénként HIV-t és említett nukleinsavmolekulaként egy, több HÍV strukturális proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz.
  23. 23. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett patogénként HIV-t és említett nukleinsavmolekulaként egy, több HÍV regulátorproteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz.
  24. 24. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett proteinként egy hiperproliferatív betegséggel kapcsolatos proteint tartalmaz.
  25. 25. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett proteinként egy autoimmunbetegséggel kapcsolatos proteint tartalmaz.
  26. 26. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett nukleinsavmolekulaként egy, a következő proteinek valamelyikét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz: myb, myc, fyn, ras, sarc, neu és trk onkogének
    HU 219 767 Β proteintermékei; bcl/abl transzlokációs gén proteintermékei: P53; EGRF; B-sejt-limfómák által termelt antitestek variábilis régiói; és T-sejt-limfómák T-sejt-receptorainak variábilis régiói.
  27. 27. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett proteinként a Bsejtek által közvetített autoimmunbetegségekben részt vevő antitestek variábilis régióinak vagy a T-sejtek által közvetített autoimmunbetegségekben részt vevő Tsejt-receptorok variábilis régióinak valamelyikét tartalmazza.
  28. 28. A 16. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy említett nukleinsavmolekulaként egy, a következő proteinek valamelyikét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz: enzimek, strukturális proteinek, citokinek, limfokinek és növekedési faktorok.
  29. 29. Gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy
    i) egy patogén antigén epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó proteint; hiperproliferatív betegséggel kapcsolatos protein epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó proteint; autoimmunbetegségre jellemző sejtekkel kapcsolatos protein epitópjával azonos vagy ahhoz lényegében hasonló, legalább egy epitópot tartalmazó proteint: a páciens hiányzó, nem működő vagy részlegesen működő proteinjét kompenzáló proteint; vagy a páciensben gyógyhatást kifejtő proteint kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló nukleinsavmolekulát tartalmazó tartályból; és ii) egy, az 1. igénypontban meghatározott polinukleotidműködést fokozó szert tartalmazó tartályból áll;
    és az említett gyógyszerészeti készlet retrovírus-részecskéktől mentes.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy az említett polinukleotidműködést fokozó szerként bupivacaint tartalmaz.
  31. 31. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett nukleinsavmolekulaként egy DNS-molekulát tartalmaz.
  32. 32. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett proteinként egy patogén antigént vagy annak egy fragmensét tartalmazza.
  33. 33. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett patogénként a következő vírusok valamelyikét tartalmazza: humán immunhiánybetegség-vírus, HÍV; humán T-sejt-leukémiavírus, HTLV; influenzavírus; hepatitis A vírus, HAV; hepatitis B vírus, HBV; hepatitis C vírus, HCV; humán papillomavírus, HPV; Herpes simplex 1 vírus, HSV1; Herpes simplex 2 vírus, HSV2; cytomegalovírus, CMV; Epstein-Barr vírus, EBV; rhinovírus és coronavírus.
  34. 34. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett patogénként HIV-t és említett nukleinsavmolekulaként egy HIV-proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz.
  35. 35. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett patogénként HIV-t és említett nukleinsavmolekulaként egy több HÍV strukturális proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz.
  36. 36. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett patogénként HIV-t és említett nukleinsavmolekulaként egy több HÍV regulátorproteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz.
  37. 37. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett proteinként egy, a hiperproliferatív betegséggel kapcsolatos proteint tartalmaz.
  38. 38. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett proteinként egy autoimmunbetegséggel kapcsolatos proteint tartalmaz.
  39. 39. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett nukleinsavmolekulaként olyan molekulát tartalmaz, amely a következő proteinek valamelyikét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza : myb, myc, fyn, ras, sarc, neu és trk onkogének proteintermékei; bcl/abl transzlokációs gén proteintermékei: P53; EGRF; B-sejt-limfómák által termelt antitestek variábilis régiói; és T-sejt-limfómák T-sejt-receptorainak variábilis régiói.
  40. 40. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy proteinként B-sejtek által közvetített autoimmunbetegségekben részt vevő antitestek variábilis régióit vagy T-sejtek által közvetített autoimmunbetegségekben részt vevő T-sejt-receptorok variábilis régióit tartalmazza.
  41. 41. A 29. igénypont szerinti gyógyszerészeti készlet, azzal jellemezve, hogy említett nukleinsavmolekulaként a következő proteinek valamelyikét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó molekulát tartalmaz: enzimek, strukturális proteinek, citokinek, limfokinek és növekedési faktorok.
HU9502229A 1993-01-26 1994-01-26 Készítmények és eljárások genetikai anyag sejtbe történő beviteléhez HU219767B (hu)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US834293A 1993-01-26 1993-01-26
US2933693A 1993-03-11 1993-03-11
US9323593A 1993-07-15 1993-07-15
US12496293A 1993-09-21 1993-09-21
US08/125,012 US5593972A (en) 1993-01-26 1993-09-21 Genetic immunization
PCT/US1994/000899 WO1994016737A1 (en) 1993-01-26 1994-01-26 Compositions and methods for delivery of genetic material
US08/979,385 US5981505A (en) 1993-01-26 1994-01-26 Compositions and methods for delivery of genetic material
US49568495A 1995-08-28 1995-08-28
US09/359,975 US7001759B1 (en) 1993-01-26 1999-07-23 Compositions and methods for delivery of genetic material

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9502229D0 HU9502229D0 (en) 1995-09-28
HUT73099A HUT73099A (en) 1996-06-28
HU219767B true HU219767B (hu) 2001-07-30

Family

ID=38247352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502229A HU219767B (hu) 1993-01-26 1994-01-26 Készítmények és eljárások genetikai anyag sejtbe történő beviteléhez

Country Status (14)

Country Link
US (1) US8304234B2 (hu)
EP (1) EP0681483B1 (hu)
JP (1) JP3701966B2 (hu)
AT (1) ATE302854T1 (hu)
AU (1) AU675702B2 (hu)
CA (1) CA2153593C (hu)
DE (1) DE69434469T2 (hu)
DK (1) DK0681483T3 (hu)
ES (1) ES2249760T3 (hu)
HU (1) HU219767B (hu)
IL (1) IL108449A (hu)
NZ (1) NZ262582A (hu)
PT (1) PT681483E (hu)
WO (1) WO1994016737A1 (hu)

Families Citing this family (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2169635C (en) * 1993-08-26 2002-11-12 Dennis A. Carson Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
US6348449B1 (en) 1993-09-21 2002-02-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of inducing mucosal immunity
US6235888B1 (en) 1994-10-05 2001-05-22 The General Hospital Corporation Hepatitis C virus vaccine
RU2189254C2 (ru) * 1995-06-06 2002-09-20 Америкэн Хоум Продактс Корпорэйшн Вакцины против вирусов гепатита
USRE38490E1 (en) 1995-11-16 2004-04-06 Baylor College Of Medicine Method for identifying metastatic sequences
EP0923284A4 (en) * 1996-01-19 2003-03-26 Allegheny University Of The He CELLULAR IMMUNOGENES THAT ARE USEFUL AS A VACCINE AGAINST CANCER
USRE38392E1 (en) 1996-01-30 2004-01-20 Baylor College Of Medicine Method for identifying metastatic sequences
US6168918B1 (en) 1996-01-31 2001-01-02 American Home Products Corp. Method of detecting foreign DNA integrated in eukaryotic chromosomes
TR199801615T2 (xx) * 1996-02-22 1998-11-23 Merck & Co., Inc. Sentetik HIV genleri
US6534312B1 (en) 1996-02-22 2003-03-18 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
US5851804A (en) * 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
EP1579814A3 (en) 1996-05-17 2006-06-14 Roche Diagnostics Operations, Inc. Methods and apparatus for sampling and analyzing body fluid
US7235056B2 (en) 1996-05-17 2007-06-26 Amira Medical Body fluid sampling device and methods of use
US7666150B2 (en) 1996-05-17 2010-02-23 Roche Diagnostics Operations, Inc. Blood and interstitial fluid sampling device
US20020010406A1 (en) 1996-05-17 2002-01-24 Douglas Joel S. Methods and apparatus for expressing body fluid from an incision
US7828749B2 (en) 1996-05-17 2010-11-09 Roche Diagnostics Operations, Inc. Blood and interstitial fluid sampling device
US5846946A (en) * 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
AU728422B2 (en) * 1996-06-21 2001-01-11 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
CA2268752A1 (en) 1996-10-23 1998-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Plasmids encoding immunogenic proteins and intracellular as follows
EP0958373A4 (en) * 1996-10-23 2001-11-28 American Home Prod Vaccines.
EP0941356A2 (en) * 1996-11-01 1999-09-15 Genespan Corporation Stabilized transient gene expression
US6146847A (en) * 1996-11-01 2000-11-14 Genespan Corporation Stabilized transient gene expression
AU5597998A (en) * 1996-12-04 1998-06-29 Heska Corporation Recombinant plague vaccine
GB9626539D0 (en) * 1996-12-20 1997-02-05 Univ Liverpool A method of enhancing the rate of transfection of cells
AU743616B2 (en) * 1997-02-07 2002-01-31 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
US6696291B2 (en) 1997-02-07 2004-02-24 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
US6217900B1 (en) * 1997-04-30 2001-04-17 American Home Products Corporation Vesicular complexes and methods of making and using the same
JP2002509545A (ja) * 1997-07-08 2002-03-26 カイロン コーポレイション Ｄｎａワクチンを伴うサブミクロン水中油型エマルジョンの使用
EP0893507A1 (en) * 1997-07-25 1999-01-27 Institut Gustave Roussy Use of MHC class II ligands (CD4 and LAG-3) as adjuvant for vaccination and of LAG-3 in cancer treatment
US6818627B1 (en) 1997-08-14 2004-11-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Functional fragments of HIV-1 Vpr protein and methods of using the same
ES2389519T3 (es) 1997-09-18 2012-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Casetes de inmunización de ADN de vif atenuados para vacunas genéticas
GB9720585D0 (en) * 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6482804B1 (en) 1997-10-28 2002-11-19 Wyeth Compositions and methods for delivery of genetic material
EP1029048A2 (en) 1997-11-05 2000-08-23 Baylor College Of Medicine Sequences for targeting metastatic cells
AU746258B2 (en) * 1998-01-30 2002-04-18 General Hospital Corporation, The Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus
EP1062340A2 (en) 1998-03-13 2000-12-27 The Baylor College of Medicine Compositions and methods for the treatment and prevention of metastatic disorders
EP1105490A1 (en) 1998-08-20 2001-06-13 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia
US6686339B1 (en) 1998-08-20 2004-02-03 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia
US6693087B1 (en) 1998-08-20 2004-02-17 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia
FR2785293B1 (fr) 1998-10-30 2002-07-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Acides nucleiques et polypeptides specifiques des souches pathogenes du genre neisseria
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
BR0009884A (pt) 1999-04-21 2002-01-08 American Home Prod Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos
WO2000066162A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mutant human cd80 and compositions for and methods of making and using the same
US8017590B1 (en) 1999-10-22 2011-09-13 Sanofi Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
EP1257298B1 (en) * 1999-12-22 2008-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cosmid dna constructs and methods of making and using the same
WO2001059071A2 (en) 2000-02-09 2001-08-16 Genvec, Inc. Methods of preparing and using a viral vector library
JP5156163B2 (ja) 2000-04-18 2013-03-06 ビルコ・ビーブイビーエイ 薬剤耐性の測定方法
EP1792995A3 (en) 2000-05-08 2007-06-13 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia secretory locus orf and uses thereof
DE60124899T2 (de) 2000-05-10 2007-08-16 Sanofi Pasteur Ltd., Toronto Durch mage minigene kodierte immunogene polypeptide und ihre verwendungen
RU2286172C2 (ru) 2000-08-17 2006-10-27 Трипеп Аб Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
EP1311289B1 (en) 2000-08-17 2007-10-17 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
DE60127421T8 (de) 2000-08-25 2008-08-28 Chancellor, Masters And Scholars Of The University Of Oxford Innen-kern oligosaccharide epitopes aus lipopolysacchariden von haemophilus influenza als vakzinen in der prophylaktischen behandlung von haemophilus influenzae infektionen
EP1355573A4 (en) 2001-01-22 2005-08-24 Roche Diagnostics Gmbh LANZET DEVICE WITH CAPILLARY EFFECT
AU2002329176A1 (en) 2001-05-25 2002-12-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted particles and methods of using the same
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US6958211B2 (en) 2001-08-08 2005-10-25 Tibotech Bvba Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy
EP1285971B1 (en) * 2001-08-08 2007-10-10 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Methods for the phenotypic and genotypic assessment of the drug sensitivity of HIV integrase variants
DE10142232B4 (de) 2001-08-29 2021-04-29 Roche Diabetes Care Gmbh Verfahren zur Herstellung eines analytischen Hilfsmittels mit Lanzette und Testelement
US7462491B2 (en) 2002-01-31 2008-12-09 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for diagnosis and monitoring of prostate cancer progression by detection of serum caveolin
JP2005532789A (ja) 2002-03-15 2005-11-04 ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン 減少した酵素活性を有する型別不能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のＰ４タンパク質の変異体
EP1356820A1 (en) 2002-04-26 2003-10-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) DNA vaccine combined with an inducer of tumor cell apoptosis
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
AU2003243663A1 (en) 2002-06-20 2004-01-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines for suppressing ige-mediated allergic disease and methods for using the same
PT2241325E (pt) 2002-10-29 2012-04-12 Coley Pharm Gmbh Utilização de oligonucleótidos cpg no tratamento de infecção com vírus da hepatite c
BR0316722A (pt) 2002-11-19 2005-10-18 Univ Pennsylvania Constructos genéticos e composições compreendendo rre e cte e usos destes
NZ570709A (en) 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
ATE535249T1 (de) 2003-06-13 2011-12-15 Univ Pennsylvania Vakzine, immuntherapeutika und verfahren zu ihrer verwendung
AU2004299457B2 (en) 2003-12-12 2011-03-24 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services A human cytotoxic T-lymphocyte epitope and its agonist epitope from the non-variable number of tandem repeat sequence of MUC-1
TW200613554A (en) 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
EP2213298A3 (en) * 2004-10-21 2011-07-20 Wyeth LLC Immunogenic compositions of staphylococcus epidermidis polypeptide and polynucleotide antigens
WO2007050095A2 (en) 2004-11-19 2007-05-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved vaccines and methods for using the same
ATE533782T1 (de) 2006-01-13 2011-12-15 Univ Pennsylvania Impfstoffe und immuntherapeutika mit codon- optimiertem il-15 und verwendungsverfahren dafür
WO2007082105A2 (en) 2006-01-16 2007-07-19 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chlamydia vaccine
US8921050B2 (en) 2006-03-17 2014-12-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of diagnosing renal cell carcinoma
DK3037429T3 (en) 2006-07-28 2019-01-21 Univ Pennsylvania IMPROVED HIV VACCINES
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
WO2009073330A2 (en) 2007-11-12 2009-06-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel vaccines against multiple subtypes of influenza virus
US8927508B2 (en) 2007-11-14 2015-01-06 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Antibody production elicited by a DNA vaccine delivered by electroporation
JP5963442B2 (ja) 2008-05-28 2016-08-03 ブイジーエックス ファーマシューティカルズ， エルエルシー 免疫応答を誘発する天然痘ｄｎａワクチンおよびその中の抗原
US8829174B2 (en) 2008-10-29 2014-09-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania HCV vaccines and methods for using the same
US8921536B2 (en) 2008-10-29 2014-12-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania HCV vaccines and methods for using the same
US8961994B2 (en) 2008-11-17 2015-02-24 Vgx Pharmaceuticals, Llc DNA constructs eliciting immune response against flavivirus and effective adjuvants
US9050287B2 (en) 2009-01-23 2015-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same
CA2653478A1 (en) 2009-01-23 2010-07-23 Gregg Martin Automated wash system for industrial vehicles
CN102439150A (zh) 2009-03-27 2012-05-02 法国国家健康医学研究院 用于癌症治疗的卡那霉素反义核酸
CN106987595B (zh) 2009-11-02 2021-07-06 宾夕法尼亚大学托管会 ***病毒病毒(fmdv)共有蛋白质、其编码序列及由其制备的疫苗
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
CN102781952B (zh) 2010-02-08 2015-09-02 宾夕法尼亚大学托管会 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法
CN110195069A (zh) 2010-09-27 2019-09-03 宾夕法尼亚大学托管会 共有抗原构建体和由其制备的疫苗以及使用所述疫苗治疗疟疾的方法
KR101939150B1 (ko) 2010-11-12 2019-01-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 공통 전립선 항원, 이것을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이것을 포함하는 백신 및 용도
WO2012106377A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding novel herpes antigens, vaccine comprising the same, and methods of use thereof
EA037377B1 (ru) 2011-02-11 2021-03-22 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Вакцина для индукции иммунного ответа на hbv
US9238679B2 (en) 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
AU2012267512B2 (en) 2011-06-10 2014-11-20 Bluebird Bio, Inc. Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy
KR102071228B1 (ko) 2011-07-11 2020-01-30 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 교차-보호성 아레나바이러스 백신 및 이의 사용 방법
EP2791362B1 (en) 2011-12-12 2019-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proteins comprising mrsa pbp2a and fragments thereof, nucleic acids encoding the same, and compositions and their use to prevent and treat mrsa infections
KR102674807B1 (ko) 2011-12-12 2024-06-13 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 il-12 유전적 컨스트럭트 및 백신을 포함하는 조성물, 면역치료제 및 이를 이용하는 방법
AU2013245950B2 (en) 2012-04-10 2016-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human respiratory syncytial virus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
KR20220012403A (ko) 2012-04-12 2022-02-03 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 필로바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 구조체 및 백신, 및 이를 사용하는 방법
EP2841572B1 (en) 2012-04-27 2019-06-19 Duke University Genetic correction of mutated genes
US9738879B2 (en) 2012-04-27 2017-08-22 Duke University Genetic correction of mutated genes
WO2015089492A2 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Dna antibody constructs and method of using same
MX364732B (es) 2012-12-13 2019-05-06 Univ Pennsylvania Vacuna contra el tumor de wilms 1.
KR20220140025A (ko) 2013-03-12 2022-10-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 인간 파밀로마 바이러스용 개선된 백신 및 이것을 사용하는 방법
CN114225019A (zh) 2013-03-15 2022-03-25 宾夕法尼亚大学理事会 癌疫苗及使用其的治疗方法
MX2015011487A (es) 2013-03-15 2016-02-03 Univ Pennsylvania Proteinas de consenso para el virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (fmdv), secuencias de codificacion para estas y vacunas elaboradas a partir de estas.
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
KR102551324B1 (ko) 2013-06-05 2023-07-05 듀크 유니버시티 Rna-가이드 유전자 편집 및 유전자 조절
ES2925950T3 (es) 2013-06-25 2022-10-20 Int Aids Vaccine Initiative Inc Composiciones para la tuberculosis y procedimientos de uso de las mismas
CN106715458A (zh) 2014-07-18 2017-05-24 华盛顿大学 癌症疫苗组合物及其使用方法
WO2016081924A1 (en) 2014-11-20 2016-05-26 Duke University Compositions, systems and methods for cell therapy
WO2016089862A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Dna antibody constructs and method of using same
US10676726B2 (en) 2015-02-09 2020-06-09 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
US10624964B2 (en) 2015-05-01 2020-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for stimulating immune response using potent immunostimulatory RNA motifs
WO2017015637A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
IL288662B2 (en) 2015-08-25 2023-09-01 Univ Duke Preparations and methods for improving specificity in genomic engineering using RNA-guided endonucleases
EP3362571A4 (en) 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS
WO2017082946A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 University Of Utah Research Foundation Combinatorial gene construct and non-viral delivery for anti-obesity
CN108779466B (zh) 2015-11-30 2024-03-29 杜克大学 用于通过基因编辑修正人肌营养不良蛋白基因的治疗靶标和使用方法
CA3013718C (en) 2016-02-05 2023-09-26 Jian Yan Cancer vaccines and methods of treatment using the same
WO2017193029A2 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Duke University Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy
CA3027995A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Aeras Tuberculosis compositions and methods of treating or preventing tuberculosis
CN109843321A (zh) 2016-06-22 2019-06-04 国际艾滋病疫苗行动组织公司 作为结核病疫苗的重组巨细胞病毒载体
WO2018017754A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
EP3532616A1 (en) 2016-10-28 2019-09-04 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
EP3697806A4 (en) 2017-10-17 2021-10-27 International AIDS Vaccine Initiative, Inc. TUBERCULOSIS ANTIGEN CASSETTES
MX2020006217A (es) 2017-12-13 2020-12-03 Inovio Pharmaceuticals Inc Vacunas de cáncer dirigidas a muc16 y sus usos.
CN117264963A (zh) 2017-12-13 2023-12-22 艾诺奥医药品有限公司 靶向prame的癌症疫苗和其用途
BR112020010499A2 (pt) 2017-12-13 2020-11-24 Inovio Pharmaceuticals, Inc. vacinas de câncer de alvo de mesotelina e usos das mesmas
IT201900007060A1 (it) 2019-05-21 2020-11-21 St Superiore Di Sanita Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi
IT201900012540A1 (it) 2019-07-22 2021-01-22 Humanitas Mirasole Spa Inibitori di CHI3L1 e loro usi
JP2023504536A (ja) 2019-12-06 2023-02-03 スクライブ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 粒子送達システム
WO2022261149A2 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Scribe Therapeutics Inc. Particle delivery systems
WO2023227669A2 (en) 2022-05-26 2023-11-30 UCB Biopharma SRL Novel nucleic acid-editing proteins

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3688765A (en) 1969-10-03 1972-09-05 Jack S Gasaway Hypodermic injection device
GB1594097A (en) 1976-12-16 1981-07-30 Int Inst Of Differentiation Production of specific immune nucleic acids cell dialysates and antibodies
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US4680027A (en) 1985-12-12 1987-07-14 Injet Medical Products, Inc. Needleless hypodermic injection device
US4806463A (en) 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5024656A (en) 1988-08-30 1991-06-18 Injet Medical Products, Inc. Gas-pressure-regulated needleless injection system
US5185254A (en) 1988-12-29 1993-02-09 The Wistar Institute Gene family of tumor-associated antigens
JP3140757B2 (ja) 1989-02-06 2001-03-05 デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用
ES2200016T3 (es) * 1989-03-21 2004-03-01 Vical Incorporated Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.
US6214804B1 (en) * 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
EP0502105A4 (en) 1989-11-20 1993-02-24 Oncogen Limited Partnership Non-replicating recombinant-made retroviral particles used as antiviral agents and immunogens
AU658818B2 (en) * 1989-12-21 1995-05-04 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Method of delivering molecules into eukaryotic cells using tat protein conjugate
AU7312891A (en) 1990-02-12 1991-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Satellite cell proliferation in adult skeletal muscle
ATE199647T1 (de) * 1991-05-14 2001-03-15 Univ Connecticut Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
PT584348E (pt) * 1992-03-11 2005-10-31 Powderject Vaccines Inc Vacina genetica para virus da imunodeficiencia
WO1993023552A1 (en) 1992-05-21 1993-11-25 Government Of The United States As Represented By Secretary Department Of Health And Human Services Targeting gene expression to living tissue using jet injection
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization

Also Published As

Publication number Publication date
EP0681483A1 (en) 1995-11-15
NZ262582A (en) 1997-10-24
ATE302854T1 (de) 2005-09-15
AU675702B2 (en) 1997-02-13
DK0681483T3 (da) 2005-11-21
HUT73099A (en) 1996-06-28
US8304234B2 (en) 2012-11-06
IL108449A (en) 2011-09-27
HU9502229D0 (en) 1995-09-28
DE69434469D1 (de) 2005-09-29
WO1994016737A1 (en) 1994-08-04
CA2153593C (en) 2010-04-13
ES2249760T3 (es) 2006-04-01
AU6232094A (en) 1994-08-15
JP3701966B2 (ja) 2005-10-05
IL108449A0 (en) 1994-04-12
PT681483E (pt) 2005-11-30
JPH08509694A (ja) 1996-10-15
US20060222629A1 (en) 2006-10-05
CA2153593A1 (en) 1994-08-04
EP0681483B1 (en) 2005-08-24
DE69434469T2 (de) 2006-06-14
EP0681483A4 (en) 1997-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU219767B (hu) Készítmények és eljárások genetikai anyag sejtbe történő beviteléhez
RU2174845C2 (ru) Композиции и способы доставки генетического материала
US5981505A (en) Compositions and methods for delivery of genetic material
US5739118A (en) Compositions and methods for delivery of genetic material
US5962428A (en) Compositions and methods for delivery of genetic material
US8536145B2 (en) Methods of inducing mucosal immunity
US7001759B1 (en) Compositions and methods for delivery of genetic material
EP1473369B1 (en) Compositions and methods for delivery of genetic material
KR100328195B1 (ko) 유전자물질전달용조성물및전달방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees