JP3497209B2 - 硫酸化糖の脱硫酸化方法 - Google Patents
硫酸化糖の脱硫酸化方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、硫酸化糖の硫酸基を部
分的又は完全に脱硫酸化する方法に関し、更に詳しくは
硫酸化糖の硫酸エステルのうち、第１級水酸基、第２級
水酸基及びアミノ基の何れの基に結合している硫酸基も
脱硫酸化できる方法に関する。
分的又は完全に脱硫酸化する方法に関し、更に詳しくは
硫酸化糖の硫酸エステルのうち、第１級水酸基、第２級
水酸基及びアミノ基の何れの基に結合している硫酸基も
脱硫酸化できる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物活性を有する脱硫酸化糖を提供する
ために、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されてい
る。硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素／メタノ
−ル中で酸触媒により脱硫酸化する方法が知られている
（Kantor T.G. and Schubert M.,J. Amer. Chem. Soc.
79, 152 (1957) ）。しかし、この方法ではグリコシド
結合のメタノリシスによる糖鎖の切断が起こるため低分
子化し、もとの鎖長を有する反応生成物の収量は低下す
る。
ために、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されてい
る。硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素／メタノ
−ル中で酸触媒により脱硫酸化する方法が知られている
（Kantor T.G. and Schubert M.,J. Amer. Chem. Soc.
79, 152 (1957) ）。しかし、この方法ではグリコシド
結合のメタノリシスによる糖鎖の切断が起こるため低分
子化し、もとの鎖長を有する反応生成物の収量は低下す
る。
【０００３】収量よく脱硫酸を行う方法として、ジメチ
ルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピ
リジン等の非プロトン性溶媒中〔Usov A. I., Adamyant
s K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and
Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)〕又
は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド
中〔Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohyd
r. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and
Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)〕で行う
ソルボリシスがある。このソルボリシスの反応機構は、
非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を
用いて行う硫酸化反応の逆反応であることが知られてい
る。この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによ
りＮ−硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法として用いる
ことができる。しかし、第１級又は第２級水酸基に結合
しているＯ−硫酸基を脱離させることはできなかった。
さらに、この方法をオリゴ糖に適用した場合、ＤＭＳＯ
等の溶媒を反応後に除去する操作が煩雑であること、完
全に脱硫酸化するには反応温度を上昇させる必要があ
り、このような反応条件ではグリコシド結合の切断が起
こること、などの問題点がある。他方、糖類の第１級水
酸基に結合した硫酸基を特異的に脱硫酸化する方法とし
て、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
（ＢＴＳＡ）を用いる方法があるが、この方法では第２
級水酸基やアミノ基に結合した硫酸基を脱硫酸化するこ
とはできない（Matsuo, M., Takano, R., Kamei-Hayash
i, K. and Hata, S.,Carbohydr. Res. 241,209-215,(19
93) ）。また、ヘパリンをＢＴＳＡを用いて脱硫酸化し
た場合、脱硫酸化率が高くないという問題点があった。
ルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピ
リジン等の非プロトン性溶媒中〔Usov A. I., Adamyant
s K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and
Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)〕又
は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド
中〔Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohyd
r. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and
Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)〕で行う
ソルボリシスがある。このソルボリシスの反応機構は、
非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を
用いて行う硫酸化反応の逆反応であることが知られてい
る。この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによ
りＮ−硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法として用いる
ことができる。しかし、第１級又は第２級水酸基に結合
しているＯ−硫酸基を脱離させることはできなかった。
さらに、この方法をオリゴ糖に適用した場合、ＤＭＳＯ
等の溶媒を反応後に除去する操作が煩雑であること、完
全に脱硫酸化するには反応温度を上昇させる必要があ
り、このような反応条件ではグリコシド結合の切断が起
こること、などの問題点がある。他方、糖類の第１級水
酸基に結合した硫酸基を特異的に脱硫酸化する方法とし
て、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
（ＢＴＳＡ）を用いる方法があるが、この方法では第２
級水酸基やアミノ基に結合した硫酸基を脱硫酸化するこ
とはできない（Matsuo, M., Takano, R., Kamei-Hayash
i, K. and Hata, S.,Carbohydr. Res. 241,209-215,(19
93) ）。また、ヘパリンをＢＴＳＡを用いて脱硫酸化し
た場合、脱硫酸化率が高くないという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】硫酸化糖の脱硫酸化法
の開発は、ヒトに対して好ましい生物活性を有する医薬
品として有用な硫酸化糖を提供するために非常に重要で
ある。例えば、硫酸化多糖であるデキストラン硫酸、キ
シラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等は、脂質
代謝改善剤、抗血栓剤として使用されているが、人工的
に硫酸基を導入したものは、導入した硫酸基の位置が特
定できず、多量に硫酸基を導入するに従い組織からの出
血傾向が強まる副作用が生ずることも知られている。ま
た、天然由来の硫酸化糖は、起源の違いにより硫酸基の
位置、量がそれぞれ異なり、各硫酸化糖の生理活性も微
妙に異なる。すなわち、硫酸化糖の硫酸基の位置及び硫
酸化率を効率よくコントロールする技術が求められてい
る。本発明者は、硫酸化糖の生物活性を改善することを
目的として、脱硫酸化率が高く、グリコシド結合の切断
等の副反応のない、硫酸化糖の脱硫酸化方法を開発すべ
く鋭意検討し、本発明に到達した。
の開発は、ヒトに対して好ましい生物活性を有する医薬
品として有用な硫酸化糖を提供するために非常に重要で
ある。例えば、硫酸化多糖であるデキストラン硫酸、キ
シラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等は、脂質
代謝改善剤、抗血栓剤として使用されているが、人工的
に硫酸基を導入したものは、導入した硫酸基の位置が特
定できず、多量に硫酸基を導入するに従い組織からの出
血傾向が強まる副作用が生ずることも知られている。ま
た、天然由来の硫酸化糖は、起源の違いにより硫酸基の
位置、量がそれぞれ異なり、各硫酸化糖の生理活性も微
妙に異なる。すなわち、硫酸化糖の硫酸基の位置及び硫
酸化率を効率よくコントロールする技術が求められてい
る。本発明者は、硫酸化糖の生物活性を改善することを
目的として、脱硫酸化率が高く、グリコシド結合の切断
等の副反応のない、硫酸化糖の脱硫酸化方法を開発すべ
く鋭意検討し、本発明に到達した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、硫酸化
糖を、下式（Ｉ）
糖を、下式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基
を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応
に付すことを特徴とする広範囲の特定位置が選択的に脱
硫酸化された脱硫酸化糖の製造法である。
を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応
に付すことを特徴とする広範囲の特定位置が選択的に脱
硫酸化された脱硫酸化糖の製造法である。
【０００７】すなわち、本発明の方法によれば、硫酸化
糖の第１級水酸基、第２級水酸基及びアミノ基の何れの
基に結合している硫酸基も効率よく脱硫酸化できる。ま
た、反応条件を制御することによって部分的に脱硫酸化
することもできる。
糖の第１級水酸基、第２級水酸基及びアミノ基の何れの
基に結合している硫酸基も効率よく脱硫酸化できる。ま
た、反応条件を制御することによって部分的に脱硫酸化
することもできる。
【０００８】本発明の方法が適用される硫酸化糖は、単
糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖等の糖類の官能基が硫酸
化されたものである。このような硫酸化糖は天然物から
抽出単離されたものであっても、合成されたものであっ
てもよい。特に本発明は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コ
ンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等の
硫酸基を有するグリコサミノグリカンに適用し、これら
糖類の生理活性を改変もしくは改善するために、必要な
位置に必要な個数（置換度）の硫酸基が結合した硫酸化
糖を得るために有用である。
糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖等の糖類の官能基が硫酸
化されたものである。このような硫酸化糖は天然物から
抽出単離されたものであっても、合成されたものであっ
てもよい。特に本発明は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コ
ンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等の
硫酸基を有するグリコサミノグリカンに適用し、これら
糖類の生理活性を改変もしくは改善するために、必要な
位置に必要な個数（置換度）の硫酸基が結合した硫酸化
糖を得るために有用である。
【０００９】本発明では通常脱硫酸化反応を有機溶媒中
で行うので、硫酸化糖は有機溶媒に可溶性の塩として反
応に供される。この様な有機溶媒可溶性塩としては、硫
酸化糖の有機塩基塩が挙げられ、有機塩基としては、ピ
リジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香
族アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ
ブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、
トリオクチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチ
ル−１，８−ナフタレンジアミン等の３級アミン；Ｎ−
メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチル
モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル複
素環アミン等が挙げられる。硫酸化糖の有機塩基塩は、
遊離の硫酸化糖を有機塩基と反応させることによって容
易に得ることができる。
で行うので、硫酸化糖は有機溶媒に可溶性の塩として反
応に供される。この様な有機溶媒可溶性塩としては、硫
酸化糖の有機塩基塩が挙げられ、有機塩基としては、ピ
リジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香
族アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ
ブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、
トリオクチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチ
ル−１，８−ナフタレンジアミン等の３級アミン；Ｎ−
メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチル
モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル複
素環アミン等が挙げられる。硫酸化糖の有機塩基塩は、
遊離の硫酸化糖を有機塩基と反応させることによって容
易に得ることができる。
【００１０】脱硫酸化反応は、通常無水の有機溶媒中、
硫酸化糖に前記式（Ｉ）で示されるシリル化剤を作用さ
せることによって達成される。反応に使用する有機溶媒
は、硫酸化糖の塩の形成に使用した前記の有機塩基（ピ
リジン等）が好ましいが、有機塩基の代わりに、アセト
ニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４
−ジオキサン等の非プロトン性溶媒を使用してもよい。
硫酸化糖に前記式（Ｉ）で示されるシリル化剤を作用さ
せることによって達成される。反応に使用する有機溶媒
は、硫酸化糖の塩の形成に使用した前記の有機塩基（ピ
リジン等）が好ましいが、有機塩基の代わりに、アセト
ニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４
−ジオキサン等の非プロトン性溶媒を使用してもよい。
【００１１】シリル化剤である式（Ｉ）で表される化合
物において、Ｒは同一又は異なりアルキル基又はアリー
ル基を示し、好ましくは炭素数１〜６の低級アルキル
基、フェニル基である。すなわち、式（Ｉ）における
（Ｒ)3ＳｉＯとしては、トリメチルシリルオキシ、トリ
エチルシリルオキシ、ジメチルイソプロピルシリルオキ
シ、イソプロピルジメチルシリルオキシ、メチルジ−ｔ
−ブチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキ
シ、ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ、トリイソプロ
ピルシリルオキシ等が例示される。式（Ｉ）で表される
シリル化剤として最も好ましいものは、２−トリメチル
シロキシペント−２−エン−４−オンである。
物において、Ｒは同一又は異なりアルキル基又はアリー
ル基を示し、好ましくは炭素数１〜６の低級アルキル
基、フェニル基である。すなわち、式（Ｉ）における
（Ｒ)3ＳｉＯとしては、トリメチルシリルオキシ、トリ
エチルシリルオキシ、ジメチルイソプロピルシリルオキ
シ、イソプロピルジメチルシリルオキシ、メチルジ−ｔ
−ブチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキ
シ、ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ、トリイソプロ
ピルシリルオキシ等が例示される。式（Ｉ）で表される
シリル化剤として最も好ましいものは、２−トリメチル
シロキシペント−２−エン−４−オンである。
【００１２】反応は、室温〜１００℃において数分〜数
十時間で終了する。室温より低い温度では反応が十分に
進行せず、１００℃以上の温度では硫酸化糖のグリコシ
ド結合が開裂するおそれがある。反応条件、特に反応温
度を変化させることによって脱硫酸化の程度を制御する
ことができる。例えば、７０〜８０℃、３０分〜６時間
程度では存在する硫酸基の部分的な脱硫酸化を行うこと
ができ、８５〜１００℃、１０分〜数時間程度の反応で
は、より完全な脱硫酸化を行うことができる。
十時間で終了する。室温より低い温度では反応が十分に
進行せず、１００℃以上の温度では硫酸化糖のグリコシ
ド結合が開裂するおそれがある。反応条件、特に反応温
度を変化させることによって脱硫酸化の程度を制御する
ことができる。例えば、７０〜８０℃、３０分〜６時間
程度では存在する硫酸基の部分的な脱硫酸化を行うこと
ができ、８５〜１００℃、１０分〜数時間程度の反応で
は、より完全な脱硫酸化を行うことができる。
【００１３】シリル化剤の使用量は、硫酸化糖の全水酸
基（非置換及び置換水酸基の全て）１モルに対して２〜
１００倍モル程度である。シリル化剤の使用量を変化さ
せることによっても脱硫酸化の程度を制御することがで
きる。部分的に脱硫酸化を行う場合には２〜１６倍モル
程度、より完全に脱硫酸化を行う場合にはそれ以上の量
のシリル化剤を使用すればよい。
基（非置換及び置換水酸基の全て）１モルに対して２〜
１００倍モル程度である。シリル化剤の使用量を変化さ
せることによっても脱硫酸化の程度を制御することがで
きる。部分的に脱硫酸化を行う場合には２〜１６倍モル
程度、より完全に脱硫酸化を行う場合にはそれ以上の量
のシリル化剤を使用すればよい。
【００１４】脱硫酸化反応の終了後、未反応のシリル化
剤を非反応性とすることにより反応を停止させる。例え
ば、反応液に水を加え、又は／及び反応液を水に対して
透析することによって目的を達成することができる。
剤を非反応性とすることにより反応を停止させる。例え
ば、反応液に水を加え、又は／及び反応液を水に対して
透析することによって目的を達成することができる。
【００１５】かくして、硫酸化糖から部分的又は完全に
硫酸基が除去された脱硫酸化糖を得ることができる。な
お、脱硫酸化反応後、脱硫酸化糖の水酸基等の官能基は
シリル化されているが、例えば反応液に水を加え又は／
及び反応液を水に対して透析することによりシリル基除
去される。さらに、必要に応じて常法に従ってシリル基
の除去反応を行うこともできる。この反応は、例えば上
記の処理を行った溶液を、アルカリ条件下又は加熱条件
下に置くことによって行う。
硫酸基が除去された脱硫酸化糖を得ることができる。な
お、脱硫酸化反応後、脱硫酸化糖の水酸基等の官能基は
シリル化されているが、例えば反応液に水を加え又は／
及び反応液を水に対して透析することによりシリル基除
去される。さらに、必要に応じて常法に従ってシリル基
の除去反応を行うこともできる。この反応は、例えば上
記の処理を行った溶液を、アルカリ条件下又は加熱条件
下に置くことによって行う。
【００１６】脱硫酸化糖にアニオン性の官能基が存在す
る場合、それに対する対イオンを溶液中に存在させて塩
を形成させることができる。例えば、シリル基除去反応
後の脱硫酸化糖の水溶液に水酸化アルカリ金属（水酸化
ナトリウム等）を添加し、必要に応じて透析した後、凍
結乾燥等の非加熱条件下における脱水工程に付すことに
よって、脱硫酸化糖のアルカリ金属塩を得ることができ
る。
る場合、それに対する対イオンを溶液中に存在させて塩
を形成させることができる。例えば、シリル基除去反応
後の脱硫酸化糖の水溶液に水酸化アルカリ金属（水酸化
ナトリウム等）を添加し、必要に応じて透析した後、凍
結乾燥等の非加熱条件下における脱水工程に付すことに
よって、脱硫酸化糖のアルカリ金属塩を得ることができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、実施例及び試験例により本発明を更に
詳細に説明するが、これらは本発明の範囲をなんら制限
するものではない。硫酸化糖の分析は以下の方法に基づ
いて行った。
詳細に説明するが、これらは本発明の範囲をなんら制限
するものではない。硫酸化糖の分析は以下の方法に基づ
いて行った。
【００１８】硫酸化糖の分析法
１）硫酸基の定量
硫酸化糖及び脱硫酸化糖の硫酸基の定量は、新生化学実
験講座３，糖質II ｐ３７，ｐ８１（東京化学同人刊）
に記載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫
酸イオンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着
させた後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを
電気電導度計を用いて検出、定量した。すなわち、３０
０μg の硫酸化糖に３N −塩酸１mlを加え、１００℃で
１８時間加水分解した。その溶液を乾燥した後、１mlの
水に溶解した。ミリポア限外ろ過膜（０．４５μm ）で
ろ過した後、硫酸イオン含量をＨＰＬＣ（Waters ILC-
1）によるイオン交換クロマロトグラフィーで分析し
た。カラムに IC Pak Anion（Waters, ４．６mm×５c
m）を用い、１．３mM四ホウ酸ナトリウム、１．５mMグ
ルコン酸ナトリウム、６mMホウ酸、０．２５％グリセリ
ン及び１２％アセトニトリルの組成の移動相を使用し
て、０．８ml／分の流速で展開した。硫酸イオンの検出
には電気電導度計（Waters 430）を用いた。
験講座３，糖質II ｐ３７，ｐ８１（東京化学同人刊）
に記載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫
酸イオンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着
させた後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを
電気電導度計を用いて検出、定量した。すなわち、３０
０μg の硫酸化糖に３N −塩酸１mlを加え、１００℃で
１８時間加水分解した。その溶液を乾燥した後、１mlの
水に溶解した。ミリポア限外ろ過膜（０．４５μm ）で
ろ過した後、硫酸イオン含量をＨＰＬＣ（Waters ILC-
1）によるイオン交換クロマロトグラフィーで分析し
た。カラムに IC Pak Anion（Waters, ４．６mm×５c
m）を用い、１．３mM四ホウ酸ナトリウム、１．５mMグ
ルコン酸ナトリウム、６mMホウ酸、０．２５％グリセリ
ン及び１２％アセトニトリルの組成の移動相を使用し
て、０．８ml／分の流速で展開した。硫酸イオンの検出
には電気電導度計（Waters 430）を用いた。
【００１９】２）13Ｃ−ＮＭＲ
硫酸化糖の水酸基の性質を判定する目的で、骨格炭素の
核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液
でのスペクトルは、８０℃、７５．４MHz(General Elec
toric Company, QE-300)で測定した。
核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液
でのスペクトルは、８０℃、７５．４MHz(General Elec
toric Company, QE-300)で測定した。
【００２０】３）酵素消化による構造解析
デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等のグ
リコサミノグリカン（ムコ多糖）は構成二糖単位の種々
の位置が硫酸化されており、本発明による脱硫酸化反応
により、どの位置の硫酸が除去されるかを知ることは、
これらのグリコサミノグリカンの生理活性を改変する際
に重要である。
リコサミノグリカン（ムコ多糖）は構成二糖単位の種々
の位置が硫酸化されており、本発明による脱硫酸化反応
により、どの位置の硫酸が除去されるかを知ることは、
これらのグリコサミノグリカンの生理活性を改変する際
に重要である。
【００２１】このようなグリコサミノグリカンの硫酸基
位置の分析は、次のようにして行うことができる。すな
わち、脱硫酸化反応の処理前後のグリコサミノグリカン
を酵素で消化し、生成した不飽和糖を含む二糖（不飽和
二糖；図１参照）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）で分析した〔新生化学実験講座３，糖質II ｐ４
９〜６２に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵
素とＨＰＬＣを組合せた構造解析」参照〕。なお、コン
ドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸に対してはコンドロ
イチナ−ゼＡＢＣを、ヘパリンに対してはヘパリン分解
酵素を用いて酵素消化を行った。
位置の分析は、次のようにして行うことができる。すな
わち、脱硫酸化反応の処理前後のグリコサミノグリカン
を酵素で消化し、生成した不飽和糖を含む二糖（不飽和
二糖；図１参照）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）で分析した〔新生化学実験講座３，糖質II ｐ４
９〜６２に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵
素とＨＰＬＣを組合せた構造解析」参照〕。なお、コン
ドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸に対してはコンドロ
イチナ−ゼＡＢＣを、ヘパリンに対してはヘパリン分解
酵素を用いて酵素消化を行った。
【００２２】ａ）コンドロイチナ−ゼＡＢＣによる消化
吉田らの方法〔生化学，57,1189 (1985)〕により、デル
マタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（１０mg/m
l)２０μl に、０．４M トリス−塩酸(pH ８．０) ２０
μl 、０．４M 酢酸ナトリウム２０μl 、０．１％ウシ
血清アルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コン
ドロイチナ−ゼＡＢＣ（５U/mL）を２０μl 加えて、３
７℃で２時間反応させた。
マタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（１０mg/m
l)２０μl に、０．４M トリス−塩酸(pH ８．０) ２０
μl 、０．４M 酢酸ナトリウム２０μl 、０．１％ウシ
血清アルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コン
ドロイチナ−ゼＡＢＣ（５U/mL）を２０μl 加えて、３
７℃で２時間反応させた。
【００２３】ｂ）ヘパリン分解酵素による消化
新実験生化学講座３，糖質II ｐ５４〜５９（東京化学
同人刊）の方法により、ヘパリン０．１ mg を２mM酢酸
カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム (pH７．０) ２
２０μl に溶解して、２０mUのヘパリナ−ゼ、２０mUの
ヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加えて、３７℃で２時間反応
させた。なお、脱硫酸化処理によってアミノ基に結合し
た硫酸基が脱離する。このような脱硫酸化ヘパリンには
ヘパリン分解酵素が作用しなくなる。このため、酵素反
応に先立ってアミノ基をアセチル化する必要がある。Ｎ
−アセチル化は炭酸ナトリウムまたはダウエックス(Dow
ex) −１（ＨＣＯ3 -型）イオン交換樹脂を含む水溶液
中、無水酢酸によって定量的に進行する〔「糖鎖工
学」、（株）産業調査会 バイオテクノロジー情報セン
ター発行、３２４頁参照〕。
同人刊）の方法により、ヘパリン０．１ mg を２mM酢酸
カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム (pH７．０) ２
２０μl に溶解して、２０mUのヘパリナ−ゼ、２０mUの
ヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加えて、３７℃で２時間反応
させた。なお、脱硫酸化処理によってアミノ基に結合し
た硫酸基が脱離する。このような脱硫酸化ヘパリンには
ヘパリン分解酵素が作用しなくなる。このため、酵素反
応に先立ってアミノ基をアセチル化する必要がある。Ｎ
−アセチル化は炭酸ナトリウムまたはダウエックス(Dow
ex) −１（ＨＣＯ3 -型）イオン交換樹脂を含む水溶液
中、無水酢酸によって定量的に進行する〔「糖鎖工
学」、（株）産業調査会 バイオテクノロジー情報セン
ター発行、３２４頁参照〕。
【００２４】ｃ）ＨＰＬＣによる分析
コンドロイチナ−ゼＡＢＣ又はヘパリン分解酵素消化を
行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル
８５２型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津
ＰＮＨ2 カラム，４．０mm×２５０mm）を使用し、２
３２nmでの吸光度を測定した。流速１ml／分で、１６mM
リン酸水素ナトリウムを６０分間に０％から５０％まで
上昇させて溶出した。溶出した種々の位置に硫酸基を有
する不飽和二糖のピーク（図２中の各記号で各ピークに
対応する不飽和二糖を表す）を同定した。
行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル
８５２型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津
ＰＮＨ2 カラム，４．０mm×２５０mm）を使用し、２
３２nmでの吸光度を測定した。流速１ml／分で、１６mM
リン酸水素ナトリウムを６０分間に０％から５０％まで
上昇させて溶出した。溶出した種々の位置に硫酸基を有
する不飽和二糖のピーク（図２中の各記号で各ピークに
対応する不飽和二糖を表す）を同定した。
【００２５】４）ゲルろ過
硫酸化糖の３％溶液１０μl をＨＰＬＣによるゲルろ過
で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PWX1 （東ソ−、
７．８mm×３０cm）を用い、溶離液に０．２M硫酸カリ
ウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。硫酸
化糖の検出には示差屈折計（島津，ＡＩＤ−２Ａ）を用
いた。
で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PWX1 （東ソ−、
７．８mm×３０cm）を用い、溶離液に０．２M硫酸カリ
ウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。硫酸
化糖の検出には示差屈折計（島津，ＡＩＤ−２Ａ）を用
いた。
【００２６】 実施例１
メチル α−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム
塩（Ｇａｌ−６Ｓ；１．１４２mg／ml）及びメチル α
−ガラクトピラノシド−３硫酸ピリジニウム塩（Ｇａｌ
−３Ｓ；０．８４９mg／ml）のそれぞれを含む水溶液、
各１００μl にガスクロマトグラフィー分析の内部標準
として、メチル α−グルコピラノシド（Ｍｅ−Ｇｌ
ｃ）の水溶液（１．０００mg／ml）１００μl を加えて
凍結乾燥し、脱硫酸化反応の試料とした。凍結乾燥した
試料に乾燥ピリジン１００μl と２−トリメチルシロキ
シペント−２−エン−４−オン（以下ＴＰＥＮＯＮとい
う）各１００μl を加え、封管後４０℃で５時間加熱し
て脱硫酸化反応を行った。完全にＯ−トリメチルシリル
化してガスクロマトグラフィー分析を行うために、トリ
メチルシリルイミダゾールを反応液に加えて、８０℃で
２０分間加熱した。この溶液各１μl をガスクロマトグ
ラフィーで分析し、遊離したメチル α−ガラクトピラ
ノシド量を定量したところ、Ｇａｌ−６Ｓの５２．２４
％、Ｇａｌ−３Ｓの１０．９１％が脱硫酸化されてい
た。また、ＴＰＥＮＯＮ処理前後に各硫酸化糖の硫酸基
を定量したところ、処理前のＧａｌ−６Ｓ及びＧａｌ−
３Ｓの硫酸基含量は何れも３５．１％であったが、ＴＰ
ＥＮＯＮ処理後には、それぞれ１６．５％及び３０．８
％であった。この結果から明らかなように、ＴＰＥＮＯ
Ｎを用いると第１級水酸基及び第２級水酸基に結合した
硫酸基のいずれも脱硫酸化することができる。一方、脱
硫酸化剤として公知のＢＴＳＡを用いて同様に反応を行
ったところ、Ｇａｌ−６Ｓはほぼ完全に脱硫酸化された
が、Ｇａｌ−３Ｓは２．１２％しか脱硫酸化されなかっ
た。すなわち、ＢＴＳＡを用いても第２級水酸基に結合
した硫酸基は、ほとんど脱硫酸化されない。
塩（Ｇａｌ−６Ｓ；１．１４２mg／ml）及びメチル α
−ガラクトピラノシド−３硫酸ピリジニウム塩（Ｇａｌ
−３Ｓ；０．８４９mg／ml）のそれぞれを含む水溶液、
各１００μl にガスクロマトグラフィー分析の内部標準
として、メチル α−グルコピラノシド（Ｍｅ−Ｇｌ
ｃ）の水溶液（１．０００mg／ml）１００μl を加えて
凍結乾燥し、脱硫酸化反応の試料とした。凍結乾燥した
試料に乾燥ピリジン１００μl と２−トリメチルシロキ
シペント−２−エン−４−オン（以下ＴＰＥＮＯＮとい
う）各１００μl を加え、封管後４０℃で５時間加熱し
て脱硫酸化反応を行った。完全にＯ−トリメチルシリル
化してガスクロマトグラフィー分析を行うために、トリ
メチルシリルイミダゾールを反応液に加えて、８０℃で
２０分間加熱した。この溶液各１μl をガスクロマトグ
ラフィーで分析し、遊離したメチル α−ガラクトピラ
ノシド量を定量したところ、Ｇａｌ−６Ｓの５２．２４
％、Ｇａｌ−３Ｓの１０．９１％が脱硫酸化されてい
た。また、ＴＰＥＮＯＮ処理前後に各硫酸化糖の硫酸基
を定量したところ、処理前のＧａｌ−６Ｓ及びＧａｌ−
３Ｓの硫酸基含量は何れも３５．１％であったが、ＴＰ
ＥＮＯＮ処理後には、それぞれ１６．５％及び３０．８
％であった。この結果から明らかなように、ＴＰＥＮＯ
Ｎを用いると第１級水酸基及び第２級水酸基に結合した
硫酸基のいずれも脱硫酸化することができる。一方、脱
硫酸化剤として公知のＢＴＳＡを用いて同様に反応を行
ったところ、Ｇａｌ−６Ｓはほぼ完全に脱硫酸化された
が、Ｇａｌ−３Ｓは２．１２％しか脱硫酸化されなかっ
た。すなわち、ＢＴＳＡを用いても第２級水酸基に結合
した硫酸基は、ほとんど脱硫酸化されない。
【００２７】実施例２及び比較例１
ヘパリン−ピリジニウム塩（硫酸基の位置及び量比は後
述の表２参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶か
し、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０
℃で２時間加熱した後、反応液を大過剰の水に対して１
夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウム溶液を加
えてpH９に調整し、再び大過剰の水に対して３日間透析
した。この間、透析外液の水を１日に２回交換した。透
析後、非透析画分を凍結乾燥して部分脱硫酸ヘパリン−
ナトリウム塩を得た（収量１３８mg）。一方、比較例と
して、ヘパリン−トリブチルアンモニウム塩１８６mgを
乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＢＴＳＡ４mlを添
加し、２０℃で３０分間放置した。反応液を大過剰の水
に対して１夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウ
ム溶液を加えてpH９〜１０に調整し、再び大過剰の水に
対して３日間透析した。この間、透析外液の水を１日に
２回交換した。透析後、非透析画分を凍結乾燥して部分
脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩を得た（収量１４０m
g）。上記それぞれの方法で得られた脱硫酸ヘパリン−
ナトリウム塩の各種分析結果を表１に示す。
述の表２参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶か
し、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０
℃で２時間加熱した後、反応液を大過剰の水に対して１
夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウム溶液を加
えてpH９に調整し、再び大過剰の水に対して３日間透析
した。この間、透析外液の水を１日に２回交換した。透
析後、非透析画分を凍結乾燥して部分脱硫酸ヘパリン−
ナトリウム塩を得た（収量１３８mg）。一方、比較例と
して、ヘパリン−トリブチルアンモニウム塩１８６mgを
乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＢＴＳＡ４mlを添
加し、２０℃で３０分間放置した。反応液を大過剰の水
に対して１夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウ
ム溶液を加えてpH９〜１０に調整し、再び大過剰の水に
対して３日間透析した。この間、透析外液の水を１日に
２回交換した。透析後、非透析画分を凍結乾燥して部分
脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩を得た（収量１４０m
g）。上記それぞれの方法で得られた脱硫酸ヘパリン−
ナトリウム塩の各種分析結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】表中、ウロン酸含量は、グルクロノラクト
ンを標準物質とし、カルバゾール−硫酸法（T.Bitter,
H.N.Muirの改良法による）によって測定し、ウロン酸を
−Ｃ6 Ｈ7 Ｏ6 Ｎａ−（Ｍｗ＝１９８) として計算し
た。硫酸基含量は、ロジゾン酸法によって測定し、硫酸
基を−ＳＯ3 Ｎａとして計算した。モル比は、カルバゾ
ール・硫酸法におけるヘパリン中のウロン酸の発色率が
通常の５０％増とされているため、これを補正して算出
した。ＴＰＥＮＯＮによって脱硫酸化したヘパリンにつ
いて13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。なお、比較の
ために未処理のヘパリン、ソルボリシスによってＮ−脱
硫酸化したヘパリン〔Y.Inoue et al, Carbohydr. Re
s.,46, 87-95(1976)の方法による〕及び完全脱硫酸化ヘ
パリン〔A.Ogamo et al, Carbohydr. Res.,193,165-172
(1989) の方法による〕についても13Ｃ−ＮＭＲスペク
トルを測定した。その結果、イズロン酸２−硫酸（Ｉｄ
ｏＡ−２Ｓ）の硫酸基の一部が脱離したこと（ＩｄｏＡ
−２ＳのＣ−１のピークの他にイズロン酸（ＩｄｏＡ）
のＣ−１のピークが出現した）、グルコサミン部分の６
−硫酸が脱離したこと（グルコサミンのＣ−６のピーク
が出現した）、グルコサミン部分の６−硫酸の一部が脱
離したこと（Ｎ−脱硫酸化ヘパリンのグルコサミン６−
硫酸のＣ−１のピークと同位置のピークの左側に完全脱
硫酸化ヘパリンのグルコサミンのＣ−１と同位置のピー
クが出現した）などが判明した。
ンを標準物質とし、カルバゾール−硫酸法（T.Bitter,
H.N.Muirの改良法による）によって測定し、ウロン酸を
−Ｃ6 Ｈ7 Ｏ6 Ｎａ−（Ｍｗ＝１９８) として計算し
た。硫酸基含量は、ロジゾン酸法によって測定し、硫酸
基を−ＳＯ3 Ｎａとして計算した。モル比は、カルバゾ
ール・硫酸法におけるヘパリン中のウロン酸の発色率が
通常の５０％増とされているため、これを補正して算出
した。ＴＰＥＮＯＮによって脱硫酸化したヘパリンにつ
いて13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。なお、比較の
ために未処理のヘパリン、ソルボリシスによってＮ−脱
硫酸化したヘパリン〔Y.Inoue et al, Carbohydr. Re
s.,46, 87-95(1976)の方法による〕及び完全脱硫酸化ヘ
パリン〔A.Ogamo et al, Carbohydr. Res.,193,165-172
(1989) の方法による〕についても13Ｃ−ＮＭＲスペク
トルを測定した。その結果、イズロン酸２−硫酸（Ｉｄ
ｏＡ−２Ｓ）の硫酸基の一部が脱離したこと（ＩｄｏＡ
−２ＳのＣ−１のピークの他にイズロン酸（ＩｄｏＡ）
のＣ−１のピークが出現した）、グルコサミン部分の６
−硫酸が脱離したこと（グルコサミンのＣ−６のピーク
が出現した）、グルコサミン部分の６−硫酸の一部が脱
離したこと（Ｎ−脱硫酸化ヘパリンのグルコサミン６−
硫酸のＣ−１のピークと同位置のピークの左側に完全脱
硫酸化ヘパリンのグルコサミンのＣ−１と同位置のピー
クが出現した）などが判明した。
【００３０】実施例３及び比較例２
コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩（鮫由来；６−硫
酸：４−硫酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表３参
照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴ
ＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加
熱した後、実施例２と同じ操作で部分脱硫酸コンドロイ
チン硫酸−ナトリウム塩を得た（収量１５６mg）。ＴＰ
ＥＮＯＮ処理前後に硫酸基を定量したところ、処理前の
硫酸基含量は１９．８％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理
後には３．６％となっていた。一方、比較例２として、
コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩２００mgを、ＢＴ
ＳＡ４mlを使用した他は上記と同じ操作で反応及び精製
を行い、部分脱硫酸コンドロイチン硫酸−ナトリウム塩
を得た。上記各反応生成物及び未処理のコンドロイチン
硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。そ
の結果、ＴＰＥＮＯＮ処理コンドロイチン硫酸では、コ
ンドロイチン４−硫酸に由来するピークが消滅し、全て
脱硫酸化されてコンドロイチンが生じるためにピークが
単純化されたが、ＢＴＳＡ処理コンドロイチン硫酸で
は、６−硫酸が脱硫酸化されて生成したコンドロイチン
及びコンドロイチン４−硫酸の両方のピークが認められ
た。
酸：４−硫酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表３参
照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴ
ＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加
熱した後、実施例２と同じ操作で部分脱硫酸コンドロイ
チン硫酸−ナトリウム塩を得た（収量１５６mg）。ＴＰ
ＥＮＯＮ処理前後に硫酸基を定量したところ、処理前の
硫酸基含量は１９．８％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理
後には３．６％となっていた。一方、比較例２として、
コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩２００mgを、ＢＴ
ＳＡ４mlを使用した他は上記と同じ操作で反応及び精製
を行い、部分脱硫酸コンドロイチン硫酸−ナトリウム塩
を得た。上記各反応生成物及び未処理のコンドロイチン
硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。そ
の結果、ＴＰＥＮＯＮ処理コンドロイチン硫酸では、コ
ンドロイチン４−硫酸に由来するピークが消滅し、全て
脱硫酸化されてコンドロイチンが生じるためにピークが
単純化されたが、ＢＴＳＡ処理コンドロイチン硫酸で
は、６−硫酸が脱硫酸化されて生成したコンドロイチン
及びコンドロイチン４−硫酸の両方のピークが認められ
た。
【００３１】実施例４
デルマタン硫酸−ピリジニウム塩（６−硫酸：４−硫
酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表４参照）２００mg
を乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４
mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、実
施例２と同じ操作で部分脱硫酸デルマタン硫酸−ナトリ
ウム塩を得た（収量１４８mg）。ＴＰＥＮＯＮ処理前後
に硫酸基を定量したところ、処理前の硫酸基含量は１
５．３％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には４．４％
となっていた。上記反応生成物及び未処理のデルマタン
硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。そ
の結果、脱硫酸化されて生じたＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミンのＣ−４に由来するピークが出現し、イズロ
ン酸のＣ−１のピークのパターンが変化していた。
酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表４参照）２００mg
を乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４
mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、実
施例２と同じ操作で部分脱硫酸デルマタン硫酸−ナトリ
ウム塩を得た（収量１４８mg）。ＴＰＥＮＯＮ処理前後
に硫酸基を定量したところ、処理前の硫酸基含量は１
５．３％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には４．４％
となっていた。上記反応生成物及び未処理のデルマタン
硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。そ
の結果、脱硫酸化されて生じたＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミンのＣ−４に由来するピークが出現し、イズロ
ン酸のＣ−１のピークのパターンが変化していた。
【００３２】試験例
（１）酵素消化による構造解析
実施例２〜４で得られた、部分脱硫酸化されたヘパリ
ン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸のそれぞれ
について、更に詳しい構造変化を調べるために、２糖単
位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。また、比較
のために脱硫酸化を行っていない各硫酸化糖も同様に分
析した。酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異
性体（図１）のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを図２に示
す。また、各種異性体のＨＰＬＣ画分の量比（％）を、
表２にヘパリン、表３にコンドロイチン硫酸、表４にデ
ルマタン硫酸について示す。
ン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸のそれぞれ
について、更に詳しい構造変化を調べるために、２糖単
位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。また、比較
のために脱硫酸化を行っていない各硫酸化糖も同様に分
析した。酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異
性体（図１）のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを図２に示
す。また、各種異性体のＨＰＬＣ画分の量比（％）を、
表２にヘパリン、表３にコンドロイチン硫酸、表４にデ
ルマタン硫酸について示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】
【００３６】図２及び表２〜４より以下のことが明かと
なった。すなわち、ヘパリンでは、ＴＰＥＮＯＮ処理に
よってウロン酸の２位水酸基、グルコサミンの２位アミ
ノ基及び６位水酸基の全てが硫酸化されたΔＤｉＨＳ−
ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが殆ど無くなり、殆どもしくは
全く存在しなかったΔＤｉＨｓ−ＯＳ（全てが脱硫酸化
されたもの）及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ（ウロ
ン酸の２位及びグルコサミンの６位が硫酸化されたも
の）が著しく増加していた。すなわち、２位アミノ基に
結合した硫酸基は著しく減少し、その他の硫酸基も相当
量減少していた。コンドイチン硫酸では、６−硫酸、４
−硫酸、４，６−ジ硫酸等の混合物を用いたが、ＴＰＥ
ＮＯＮ処理によってガラクトサミンの６位水酸基が硫酸
化されたΔＤｉ−６Ｓ及び４位水酸基が硫酸化されたΔ
Ｄｉ−４Ｓが相当量減少し、ΔＤｉ−０Ｓ（全てが脱硫
酸化されたもの）が著しく増加していた。デルマタン硫
酸では、殆んどが４−硫酸であり、６−硫酸が少量混ざ
っているものを用いたが、ＴＰＥＮＯＮ処理によってガ
ラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−４Ｓ
が相当量減少し、ΔＤｉ０Ｓ（全てが脱硫酸化されたも
の）が著しく増加していた。
なった。すなわち、ヘパリンでは、ＴＰＥＮＯＮ処理に
よってウロン酸の２位水酸基、グルコサミンの２位アミ
ノ基及び６位水酸基の全てが硫酸化されたΔＤｉＨＳ−
ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが殆ど無くなり、殆どもしくは
全く存在しなかったΔＤｉＨｓ−ＯＳ（全てが脱硫酸化
されたもの）及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ（ウロ
ン酸の２位及びグルコサミンの６位が硫酸化されたも
の）が著しく増加していた。すなわち、２位アミノ基に
結合した硫酸基は著しく減少し、その他の硫酸基も相当
量減少していた。コンドイチン硫酸では、６−硫酸、４
−硫酸、４，６−ジ硫酸等の混合物を用いたが、ＴＰＥ
ＮＯＮ処理によってガラクトサミンの６位水酸基が硫酸
化されたΔＤｉ−６Ｓ及び４位水酸基が硫酸化されたΔ
Ｄｉ−４Ｓが相当量減少し、ΔＤｉ−０Ｓ（全てが脱硫
酸化されたもの）が著しく増加していた。デルマタン硫
酸では、殆んどが４−硫酸であり、６−硫酸が少量混ざ
っているものを用いたが、ＴＰＥＮＯＮ処理によってガ
ラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−４Ｓ
が相当量減少し、ΔＤｉ０Ｓ（全てが脱硫酸化されたも
の）が著しく増加していた。
【００３７】（２）ゲルろ過
ＴＰＥＮＯＮ処理前後のヘパリン、コンドロイチン硫
酸、デルマタン硫酸について、ゲルろ過によって分子量
変化を調べ、結果を表５に示した。
酸、デルマタン硫酸について、ゲルろ過によって分子量
変化を調べ、結果を表５に示した。
【００３８】
【表５】
【００３９】 表５に示したように分子量分布の変化は
殆んど認められず、ＴＰＥＮＯＮ処理による硫酸化糖の
グリコシド結合の切断（低分子化）は起こらなかった。
殆んど認められず、ＴＰＥＮＯＮ処理による硫酸化糖の
グリコシド結合の切断（低分子化）は起こらなかった。
【００４０】
【発明の効果】本発明による脱硫酸化反応は、ＢＴＳＡ
を用いる場合とは異なり、アミノ基に結合している硫酸
基を優先的に脱硫酸化するが、第１級水酸基及び第２級
水酸基の何れの基に結合している硫酸基も効率よく脱硫
酸化し、グリコシド結合には影響を与えない方法であ
る。すなわち、第１級水酸基に結合している硫酸基（例
えば、ヘパリン、コンドロイチン６−硫酸の６−Ｏ−硫
酸基）に特異的なＢＴＳＡによる脱硫酸化とは異なった
機構によって脱硫酸化が進むものと考えられる。また、
ＢＴＳＡによる脱硫酸化と比較して、より完全な脱硫酸
化を行うことが可能で、反応条件を制御すれば部分的な
脱硫酸化も可能である。
を用いる場合とは異なり、アミノ基に結合している硫酸
基を優先的に脱硫酸化するが、第１級水酸基及び第２級
水酸基の何れの基に結合している硫酸基も効率よく脱硫
酸化し、グリコシド結合には影響を与えない方法であ
る。すなわち、第１級水酸基に結合している硫酸基（例
えば、ヘパリン、コンドロイチン６−硫酸の６−Ｏ−硫
酸基）に特異的なＢＴＳＡによる脱硫酸化とは異なった
機構によって脱硫酸化が進むものと考えられる。また、
ＢＴＳＡによる脱硫酸化と比較して、より完全な脱硫酸
化を行うことが可能で、反応条件を制御すれば部分的な
脱硫酸化も可能である。
【図１】グリコサミノグリカンを酵素消化することによ
って生成する各種不飽和二糖の各種異性体の構造と略称
の関係を示すものである。
って生成する各種不飽和二糖の各種異性体の構造と略称
の関係を示すものである。
【図２】酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異
性体のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを示すグラフであ
る。
性体のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを示すグラフであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C08B 37/00,37/18
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (6)
- 【請求項１】 硫酸化糖を下式（I） 【化１】 〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基
を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応
に付することを特徴とする脱硫酸化糖の製造法。 - 【請求項２】 硫酸化糖を有機溶媒可溶性塩とし、反応
を有機溶媒中で行う請求項１記載の脱硫酸化糖の製造
法。 - 【請求項３】 有機溶媒可溶性塩がピリジニウム塩であ
り、有機溶媒がピリジンを含む有機溶媒である請求項２
記載の脱硫酸化糖の製造法。 - 【請求項４】 脱硫酸化反応後、更にシリル化された水
酸基のシリル基を除去する請求項１記載の脱硫酸化糖の
製造法。 - 【請求項５】 硫酸化糖の有機溶媒可溶性塩に、有機溶
媒中で下式（Ｉ）記載のシリル化剤を作用させることに
より得られうる脱硫酸化された硫酸化糖であって、前記
硫酸化糖がコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸であ
り、脱硫酸化された硫酸化糖が脱硫酸化されたコンドロ
イチン硫酸の場合、△Ｄｉ−４Ｓが５．６％又は△Ｄｉ
−０Ｓが８１．２％であり、脱硫酸化されたデルマタン
硫酸の場合、△Ｄｉ−４Ｓが２１．１％又ば△Ｄｉ−０
Ｓが７１．３％である脱硫酸化糖。 【化３】 〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基
を示す〕 - 【請求項６】 ヘパリンの有機溶媒可溶性塩に、有機溶
媒中で下式（Ｉ）記載のシリル化剤を作用させることに
より得られうる脱硫酸化ヘパリンであって、ヘパリン分
解酵素による消化産物をＨＰＬＣにより解析した際に、
△ＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ又は△ＤｉＨＳ−ｄｉ
（Ｕ，Ｎ）Ｓが実質的に検出されないことを特徴とする
脱硫酸化ヘパリン。 【化４】 〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基
を示す〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20914893A JP3497209B2 (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 硫酸化糖の脱硫酸化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20914893A JP3497209B2 (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 硫酸化糖の脱硫酸化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0762001A JPH0762001A (ja) | 1995-03-07 |
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| Ｒｙｏ Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２年，５６（１０），１５７７−１５８０ |
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