HU218090B - Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására - Google Patents

Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU218090B
HU218090B HU998/90A HU199890A HU218090B HU 218090 B HU218090 B HU 218090B HU 998/90 A HU998/90 A HU 998/90A HU 199890 A HU199890 A HU 199890A HU 218090 B HU218090 B HU 218090B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
kgf
protein
cells
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
HU998/90A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT58759A (en
Inventor
Stuart A. Aaronson
Paul W. Finch
Jeffrey S. Rubin
Original Assignee
Stuart A. Aaronson
Paul W. Finch
Jeffrey S. Rubin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23175833&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU218090(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Stuart A. Aaronson, Paul W. Finch, Jeffrey S. Rubin filed Critical Stuart A. Aaronson
Publication of HUT58759A publication Critical patent/HUT58759A/hu
Publication of HU218090B publication Critical patent/HU218090B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

A találmány szerinti eljárás lényegében tiszta, humánkeratinocitanövekedési faktor (KGF) protein vagy KGF-- szerű proteinelőállítására vonatkozik, amelynek látszólagos móltömege NaDodSO4/PAGEmeghatározás szerint mintegy 16–30 kilodalton, specifikus aktivitásalegalább 3,4×104 egység/mg protein, ahol 1 egység aktivitás azt amennyiséget jelenti, amely standard vizsgálati körülmények közöttBALB/MK keratinocitasejtekben a DNS-- szintézis lehetséges maximálisstimulálásának felét váltja ki, és a növekedési faktor mitogén-aktivitása csak a hámsejteket stimulálja, a fibroblasztsejteket nem. Atalálmány tárgya továbbá a fenti proteineket kódoló DNS-szegmensek, aDNS-szegmenseket tartalmazó rekombináns molekulák, az ezekkeltranszfektált gazdasejtek előállítására, valamint a fenti proteinekkelreagáló antitestek előállítására szolgáló eljárás, továbbá a fentiproteineket vagy antitesteket tartalmazó gyógyászati készítményekelőállítására szolgáló eljárás is. ŕ

Description

A találmány növekedési faktorokra, közelebbről az ismert fibroblaszt- (kötőszöveti sejt) növekedési faktorokat (FGF-eket) is magában foglaló család tagjaihoz hasonló polipeptidnövekedési faktor izolálására vonatkozik. A találmány továbbá az új növekedési faktort kódoló komplementer DNS- (cDNS) szegmensek konstruálására is vonatkozik hírvivő RNS-ről (mRNS). A találmány tárgya továbbá a fenti DNS-szegmensek termékeinek szintézise rekombináns sejtekkel és a fenti növekedési faktort kódoló DNS-ek azonosítására és klónozására alkalmas további új termékek előállítása és alkalmazása.
A leírásban használt rövidítések jelentése az alábbi: aFGF savas fibroblaszt- (kötőszöveti sejt) növekedési faktor bFGF bázikus fibroblasztnövekedési faktor
EGF epidermális (felhám) növekedési faktor
HSAC heparin-Sepharose affinitási kromatográfia kb kilobázis kDa kilodalton
KGF keratinocita (szarusejt) -növekedési faktor
NaDodSO4/PAGE nátrium-dodecil-szulfát (SDS)/poliakrilamidgél elektroforézis
RP-HPLC fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia
TGFa a-transzformáló növekedési faktor
A növekedési faktorok jelentős mediátorok a sejtek közötti kommunikálásban. Ezek a fontos molekulák, amelyek általában egy bizonyos sejttípus hatására válnak szabaddá, másik sejttípusba tartozó sejtek szaporodását befolyásolják [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984)]. A növekedési faktorok iránti érdeklődés megnövekedett azóta, hogy bebizonyították azok potenciális szerepét a daganatok képződésében [Spom Μ. B. és Todaro G. J., N. Eng. J. Med., 303, 878-880 (1980)]. A majomszarkóma-vírus v-sis transzformáló génje olyan proteint kódol, amely homológ a vérlemezkéből származó növekedési faktor B láncával [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984); Doolittle R. F„ Hunkapiller M. W. Hood L. E., Devare S. G., Robbins K. C., Aaronson S. A. és Antoniades Μ. N., Science, 221, 275-277 (1983)]. Ezenkívül számos onkogén homológ a növekedésifaktor-receptorokat kódoló génekkel [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984)]. Fentiek következtében a növekedési faktorok és azok receptor médiába jelátalakító útvonalainak jobb megértése valószínűleg betekintést enged mind a normális, mind a rosszindulatú sejtek szaporodásának mechanizmusaiba.
A növekedési faktorok egy, a kötőszöveti sejtekre ható ismert családja a savas növekedési faktort (aFGF), a bázikus növekedési faktort (bFGF) és a hst és int-2 onkogének hasonló termékeit foglalja magában.
Ismeretes továbbá, hogy bizonyos növekedési faktorok - többek között az alább felsoroltak is - heparinkötő tulajdonsággal rendelkeznek: aFGF [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984); Doolittle R. F., Hunkapiller M. W., Hood L. E., Devare S. G., Robbins K. C., Aaronson S. A. és
Antoniades Μ. N., Science, 211, 275-277 (1983)], bFGF [Gospodarowicz D., Cheng J., Lui G.-M., Baird A. és Bohlen P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 6963-6967 (1984); Maciag T., Mehlman T., Friesel R. és Schreiber A. B., Science, 225, 932-935 (1984)], granulocita/makrofág telepképződést stimuláló faktor [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984)] és interleukin 3 [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984)]. A fenti polipeptidfaktorok mindegyikét vázsejtek termelik [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984); Doolittle R. F., Hunkapiller M. W., Hood L. E., Devare S. G., Robbins K. C., Aaronson S. A. és Antoniades Μ. N., Science, 221, 275-277 (1983); és Roberts R., Gallangher J., Spooncer E., Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M , Natúré, 332, 376-378 (1988)]. A fenti faktorok valószínűleg az extracelluláris mátrixban rakódnak le vagy a vázsejtek felületét beburkoló proteoglikánokon [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984); Roberts R., Gallangher J., Spooncer E.. Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M., Natúré, 332, 376-378 (1988)]. Feltételezhető, hogy ezek tárolását, felszabadulását és specifikus célsejtekkel való összekapcsolódását ez a kölcsönhatás szabályozza [Roberst R., Gallangher J., Spooncer E., Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M., Natúré, 332, 376-378 (1988); Vlodavsky I., Folkman J. Sullivan R., Fridman R.. Ishai-Michaeli R., Sasse J. és Klagsbum M., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 2292-2296 (1987)].
Széles körben felismerték azonban, hogy a humán rosszindulatú daganatok döntő többsége hámszövet eredetű [Wright N. és Allison M., The Biology of Epithelial Cell Populations, Oxford University Press, New York, 1. kötet, 3-5. oldal (1984)]. Az embrionális szövetekből származó hámsejtek proliferációjának effektorait leírták ugyan [James R. és Bradshaw R. A., Ann. Rév. Biochem., 53, 259-292 (1984); Doolittle R. F., Hunkapiller M. W., Hood L. E., Devare S. G., Robbins K. C., Aaronson S. A. és Antoniades Μ. N., Science, 221, 275-277 (1983); Waterfield M. D., Sctace G. J., Whittle N. M., Strooband P., Johnson A., Wasteton A., Westermark B., Heldin C.-H., Huang J. S. és Deuel T. F., Natúré, 304, 35-39 (1983)], azonban molekuláris identitásuk és szerkezetük nem ismeretes.
Mivel a hámsejteket befolyásoló embrionális növekedési faktorokkal kapcsolatos tudásunk hiányos, nyilvánvalóan szükség van olyan módszerekre, készítményekre és biológiai vizsgálati módszerekre, amelyek segítségével a hámsejtek proliferációjának szabályozási mechanizmusa jobban megismerhető és vizsgálható, és végső soron a fenti faktorokon alapuló új diagnosztikumokra és gyógyászati készítményekre is szükség van.
A találmány célja a fenti szükségletek kielégítése a proteinizolálási eljárások és a rekombináns DNS-technológiák alkalmazásával, valamint olyan embrionális eredetű proteinfaktorok előállítására alkalmas eszközök kifejlesztése, amelyek láthatólag kapcsolatban vannak a hámsejtek proliferációjával, és amelyeket egyéb
HU 218 090 Β módon nem lehet előállítani. A találmány további célja a hámsejtek szaporodási folyamataival kapcsolatos fenti faktorok molekuláris mechanizmusainak alkalmazása volt.
A találmány a proteinek izolálásának és a rekombináns DNS-technológiáknak fejlesztésére vonatkozik, amelynek segítségével a hámsejtek szaporodását befolyásoló új növekedési faktor az egyéb peptidfaktoroktól mentesen előállítható. A találmány továbbá új DNSszegmensekre és biológiai vizsgálati módszerekre is vonatkozik.
A találmány közelebbről egy új proteinre vonatkozik, amely szerkezeti és/vagy funkcionális jellemzőit tekintve a növekedési faktorok egy ismert családjába tartozik, amely magában foglalja a savas fibroblasztnövekedési faktort (aFGF-et), a bázikus fibroblasztnövekedési faktort (bFGF-et) és a hst és int-2 onkogének hasonló termékeit. Az FGF-polipeptidek családjának ez az új tagja rendelkezik az FGF-polipeptidek heparinkötő tulajdonságával, de csak egyetlen célsejttel szemben mutat specificitást. Ez az új növekedési faktor a hámsejtekkel szemben specifikus és különösen a keratinocitákra hat. Ezért ezt az új faktort keratinocitanövekedési faktornak (KGF-nek) neveztük el. Annak ellenére, hogy fibroblasztokkal szemben nem mutat aktivitást, mivel ez a hatodik ismert tagja az FGF-polipeptidek családjának, a KGF-et FGF-6-nak is nevezhetjük.
Fentieknek megfelelően a találmány egyrészt tisztított K.GF-re vagy KGF-szerű proteinekre és a fenti proteinek előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik. A fenti tisztított faktorokat az ilyen proteinek természetes körülmények közötti kiválasztására képes humán sejtek tenyésztésével és megfelelő izolálási módszerek alkalmazásával állíthatjuk elő. A fenti proteineket biokémiai és biológiai vizsgálatok céljára használhatjuk, amelyek segítségével például KGF-et vagy KGF-szerű polipeptideket kódoló DNS-szegmenseket izolálhatunk.
A találmány szerinti eljárás a KGF-et és a KGFszerű proteineket kódoló DNS-szegmensekre is vonatkozik. Egy alapvető megvalósítási mód szerint a találmány KGF-fel rokon szerkezetű termékeket kódoló DNS-szegmensekre is vonatkozik, ezek az M426 humán embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonalból extrahált, poliadenilált RNS-ből származó 32. vagy 49. számú humán cDNS-klónok és ezek mutánsai vagy rekombinánsai, valamint hasonló DNS-szegmensek lehetnek, amelyeket a fenti humán DNS-szegmensek valamelyikével végzett hibridizációval lehet detektálni, és amely rokon szerkezetű szegmensek KGF-szerű proteineket vagy azok egyes részeit kódolják.
A találmány egyik gyakorlati megvalósítása szerint a találmány szerinti DNS-szegmens megfelelő gazdasejtekben expresszálható és ezáltal KGF-et vagy KGFszerű proteineket termel. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-szegmensek értelmes szálainak transzkripciójából származó mRNS-ekre is.
A találmány további kiviteli alakja egy rekombináns DNS-molekula, amely egy vektorból és egy találmány szerinti DNS-ből áll. Ezek a rekombináns molekulák például egy KGF cDNS-molekulából és az alábbi vektor-DNS-ek valamelyikéből állnak: lambda-bakteriofágklónozó vektor (például pCEV9), DNS-szekvenáló plazmidvektor (például pUC-variáns), bakteriális génexpressziós vektor (például pKK233-2) vagy emlős génexpressziós vektor (például pMMT).
A találmány további kiviteli alakja egy találmány szerinti DNS-sel transzformált sejt, előnyösen emlős sejt. A találmány továbbá a találmány szerinti DNS-sel transzformált sejtekre, például rovarsejtekre, élesztősejtekre és baktériumsejtekre, így például Escherichia coli és Bacillus subtilis sejtekre is vonatkozik. A találmány e szempontból való megvalósítása szerint a transzformáit DNS a sejtekben képes kifejeződni, ezáltal a sejtben megnő a DNS által kódolt KGF vagy KGF-szerű protein mennyisége.
Az elsődleges KGF-transzlációs termék - az azt kódoló cDNS-szekvenciából következtethetően - N-terminális hidrofób régiót tartalmaz, amely valószínűleg szignálszekvenciaként szolgál a szekrécióra, és amely nincs jelen az érett KGF-molekulában. A találmány szerinti génexpresszió legelőnyösebb kiviteli módja szerint a találmány szerinti DNS-sel transzformált sejt a fenti DNS által kódolt proteint olyan (csonka) formában szekretálja, mint a humán embrionális tüdőfibroblasztsejtek.
A találmány a fentieken kívül a találmány szerinti DNS expressziójával vagy a találmány szerinti RNS transzációjával előállított KGF-re vagy KGF-szerű proteinekre is vonatkozik. A fenti proteinek előnyösen szekretált formájukban vannak, azaz hiányzik belőlük a szignálszekvencia. A találmány szerinti proteinfaktorokat funkciójuk tanulmányozására használhatjuk vagy szerkezeti és funkcionális analízisek, például kvantitatív és kvalitatív receptorkötő vizsgálatok céljára megtisztíthatjuk.
Ezenkívül, mivel ezt az új növekedési faktort rekombináns eljárással nagy mennyiségben tudjuk előállítani, lehetővé válik klinikai alkalmazhatóságának vizsgálata is olyan helyzetekben, amikor a hámsejtek növekedésének specifikus serkentése különleges jelentőséggel bír. Ennek megfelelően a találmány KGF-et vagy KGFszerű polipeptideket tartalmazó gyógyászati készítményekre is vonatkozik, a fentiekben vázolt állapotok, például égési sérülések kezelésére vagy transzplantált szaruhártyaszövet növekedésének serkentésére.
A találmány ez utóbbi kiviteli formája szerint az új KGF-szerű proteinek vagy a találmány szerinti módosítatlan DNS-ek vagy RNS-ek proteintermékei, vagy módosított vagy géntechnológiai úton előállított proteintermékek lehetnek. A DNS-szekvenciákban géntechnológiai úton kiváltott mutációk eredményeként a módosított KGF-szerű proteinek egy vagy több aminosavjukban különböznek a megfelelő, természetben előforduló vad típusú proteinek aminosavszekvenciájától. Fentieknek megfelelően a találmány szerinti módosított KGF-szerű proteinek például „kiméra” molekulák lehetnek, amelyek a KGF aminosavszekvenciájának egy darabját és az FGF-peptidek családjából legalább egy másik tag aminosavszekvenciájának egy darabját tartalmazzák.
HU 218 090 Β
Végül hasonló tulajdonságú peptidfaktorokkal végzett hasonló sikeres próbálkozások eredményei szerint az ilyen kiméra KGF-szerű polipeptidek kifejesztése különlegesen jó tulajdonságú, úgynevezett második generációs KGF-szerű peptideket eredményezhet, amelyek klinikai célokra is alkalmazhatók. Ezek a módosított KGF-szerű termékek lehetnek kisebbek, stabilabbak, hatásosabbak és/vagy könnyebben vagy kisebb költséggel előállíthatok, mint a természetes peptidek.
A találmány továbbá új biológiai vizsgálati módszerekre is vonatkozik, a találmány szerinti DNS-szegmensekkel rokon génekből keletkezett proteinek és mRNSek kifejeződésének meghatározására humán sejtekben. Egyik ilyen megvalósítási mód szerint a találmány szerinti DNS-eket próbaként alkalmazhatjuk a megfelelő mRNS-ek egyensúlyi koncentrációjának vagy az indukció kinetikájának meghatározására. A KGF-fel összefüggő cDNS-klónok hozzáférhetősége lehetővé teszi annak meghatározását, hogy a túlzott hámsejtszaporodással jellemzett klinikai állapotok, például diszplázia vagy neoplázia (mint például psoriasis vagy rosszindulatú vagy jóindulatú hámsejttumorok) összefüggésben vannak-e a fenti növekedési faktor abnormális expressziójával.
A találmány továbbá a találmány szerinti DNS-szegmens által kódolt peptid elleni új antitestekre is vonatkozik. A találmány e megvalósítási módja szerint az antitestek eredetük szerint monoklonálisak vagy poliklonálisak lehetnek és természetes, rekombináns vagy kémiai szintetikus eredetű KGF-szerű polipeptidek hatására keletkeznek.
A találmány szerinti antitestek specifikusan kötődnek a KGF-hez vagy egy ilyen peptid szekvenciáját tartalmazó KGF-szerű proteinhez, előnyösen akkor, ha a protein natív (biológiailag aktív) konformációban van. A fenti antitesteket KGF vagy KGF-szerű proteinfaktorok kimutatására vagy tisztítására alkalmazhatjuk. A találmány fenti szempont szerinti legelőnyösebb megvalósítási módja szerint az antitestek semlegesítik a KGFnövekedést serkentő aktivitását, ezáltal lehetővé teszik a mechanizmusok tanulmányozását és végső soron a KGF túltengésének tulajdonítható klinikai állapotok kezelését.
Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az I-1. ábrán látható az M426 humán embrionális fibroblasztból nyert kondicionált közeg heparin-Sepharose affinitást kromatográfiájának eredménye, amely szerint az egér keratinocitákra (BALB/MK) kifejtett mitogénaktivitás több, mint 90%-a eluálódik 0,6 mol/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal.
Az 1-2. ábra mutatja a humán fibroblasztokból nyert mitogén anyag további tisztításának eredményeit HPLC-eljárassal, adszorpciós mátrixszal. Az ábra A része mutatja a BALB/MK mitogénaktivitás profilját fordított fázisú (C4) HPLC-vel. Az ábra B részén látható az A részben bemutatott C4-kromatográfiával kapott kiválasztott frakciók elektroforetikus (NaDodSO4/PAGE) analízise, amely mutatja, hogy a HPLC-frakciók csúcsa egyetlen sávot tartalmaz, ezüsttel festett gélben. Az ábra C része oszlopdiagramon ábrázolja a B részben analizált frakciók által serkentett BALB/MK sejtekben a DNS-szintézist, ami szerint a relatív mitogénaktivitás jó korrelációt mutat az aktivitási profilban látható proteinsáv intenzitásával.
Az 1-3. ábrán látható az RP-HPLC helyett alkalmazható másik tisztítási lépés, amelyben közelítőleg fiziológiás pH-η vizes oldattal működő molekulaszűrőkromatográfiás oszlopot (TSK G3000SW GlasPac) alkalmazunk. így egy mitogénaktivitással rendelkező főcsúcsot kapunk a BALB/MK biológiai vizsgálattal.
Az 1-4. ábrán hasonlítjuk össze a BALB/MK DNSszintézis válaszát a TSK-tisztított mitogénre és egyéb növekedési faktorokra.
Az 1-5. ábrán hasonlítjuk össze a BALB/MK sejtek szaporodási válaszát kémiailag meghatározott összetételű tápközegben a növekedési faktorok különböző kombinációira.
Az I-1. táblázatban foglaljuk össze a különböző tisztítási lépések eredményeit, amelyek azt mutatják, hogy molekulaszűrő-kromatográfiával az aktivitás sokkal jobban visszanyerhető, mint adszorpciós RP-HPLC-vel.
Az 1-2. táblázatban a különböző növekedési faktorok célsejtspecificitási adatait mutatjuk be, amelyek azt bizonyítják, hogy az újonnan izolált faktor erős mitogén hatást fejt ki a keratinocitákra (BALB/MK), ugyanakkor meglepő módon nincs kimutatható hatása fibroblasztokra vagy humán véna saphena belhámsejtekre.
A II-1. ábrán látható a KGF cDNS nukleotidszekvenciája és az abból következtetett aminosavszekvencia, valamint a KGF génből átíródott RNS-ek azonosítása Az ábra A részén látható a humán KGF cDNSklónok sematikus ábrázolása. Az ábra B részén látható a KGF cDNS nukleotidszekvenciája és az abból következtetett aminosavszekvencia. Az ábra C része mutatja a KGF génekből transzkripcióval nyert RNS-ek azonosítását Northern biot analízissel.
A II—2. ábrán látható az FGF proteinek családját alkotó KGF és a KGF-fel rokon molekulák topológiai összehasonlítása, kiemelve a két erősen homológ proteinszakaszt, a feltételezett szignálpeptid-szekvenciákat és a két megőrzött ciszteinmaradékot.
A II—3. ábra mutatja a KGF mRNS-e expressziójának analízisét Northern biot módszerrel, bizonyos humán sejtvonalakban és szövetekben, amely egyetlen 2,4 kb hosszú RNS transzkripciós termék jelenlétét mutatja humán embrionális tüdőfibroblasztokban és felnőtt bőrfibroblasztokban, míg B5/589 hámsejtvonalban vagy HA83 gliasejtvonalban vagy elsődleges véna saphena belhámsejtekben nem mutatható ki átírt RNS.
A II-1. táblázatban foglaljuk össze a heparin KGF mitogénaktivitására kifejtett hatásának összehasonlítását az egyéb növekedési faktorokra kifejtett hatással, amely szerint a timidin BALB/MK sejtek DNS-ébe KGF hatására történő beépülését a heparin gátolja, míg az aFGF és bFGF aktivitása hasonló kezelés hatására fokozódik.
A találmány kiviteli alakját és módjait az alábbiakban ismertetjük közelebbről.
A találmány részben tisztított KGF-re és KGF-szerű proteinekre, valamint az előállításukra szolgáló eljárás4
HU 218 090 Β ra vonatkozik. A találmány egyik elvi kiviteli alakja ebben a vonatkozásban homogén KGF, amelyre jellemző, hogy látszólagos móltömege 28 kD, NaDodSO4/PAGE módszerrel mért mozgékonysága szerint, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás szerint egyetlen csúcsban vándorol és specifikus aktivitása legalább 3,4 xlO4 egység/mg, előnyösen legalább 3,2xl04 egység/mg [az aktivitás 1 egysége definíció szerint azt a mennyiséget jelenti, amely az alább ismertetett standard vizsgálati körülmények között a DNSszintézis lehetséges maximális stimulálásnak felét fejti ki bizonyos hámsejtekben (keratinocitákban)].
A hámsejtekre specifikus új növekedési faktorok azonosítására klónozott BALB/c egérkeratinocita-sejtvonalat [BALB/MK; Weissman Β. E. és Aaronson S. A., Cell, 32, 599-606 (1983)] használunk az ilyen faktorok kimutatására szolgáló indikátorsejtként. A fenti sejtek szaporodása külső forrásból származó hámsejtmitogéntől függ, szérumtartalmú közegben is [Weissman Β. E. és Aaronson S. A., Cell, 32, 599-606 (1983)]. A fenti sejtek tenyésztésére alkalmas, meghatározott kémiai összetételű tápközeg kifejlesztésével lehetővé vált annak bizonyítása, hogy a BALB/MK. sejtek szaporodása két fő mitogén úton mehet végbe. Az egyikhez inzulinszerű I. növekedési faktor (vagy nagy koncentrációban inzulin), a másikhoz epidermális növekedési faktor (EGF), α-traszformáló növekedési faktor (TGFa), savas fibroblasztnövekedési faktor (aFGF) vagy bázikus fibroblasztnövekedési faktor (bFGF) szükséges [Falco J. P. Taylor W. G., DiFiore P. P., Weissman Β. E. és Aaronson Β. E., Oncogene, 2, 573-578 (1988)].
Hámsejtvonalként BALB/MK-t és fíbroblasztsejtként NIH/3T3-t használva különféle humán sejtvonalakból származó kondicionált közegeket vizsgáltunk új hámsejtspecifikus mitogénekre. A találmány szerinti biológiai vizsgálatok lehetővé tették egy, a humán embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonalból felszabadult új növekedési faktor [amelyet keratinocitanövekedési faktornak (KGF) neveztünk] homogén formáig való tisztítását.
Röviden, a KGF-szerű aktivitás kimutatására szolgáló biológiai vizsgálat standard körülmények között az alábbi lépésekből áll:
(i) egérkeratinocitákból (BALB/MK sejtekből) összefüggő sejttenyészetet készítünk, majd 24-72 órán keresztül szérummentes tápközegben tartjuk;
(ii) a vizsgálandó minta hozzáadása után a DNS-szintézis fokozódását 3H-timidinsavval kicsapható DNSbe való beépülésével meghatározzuk.
A mitogénnövekedési faktor célsejtspecificitásának meghatározására a DNS-szintézis fokozódását - a vizsgálandó minta jelenlétében mért timidinbeépülés és a háttér (vizsgálandó minta nélküli) timidinbeépülés arányában kifejezve - hasonlítjuk össze hasonló vizsgálati körülmények között, keratinocitától eltérő sejtekben. Ilyen összehasonlító vizsgálatokban a KGF mitogénaktivitása kifejezett specificitást mutat keratinocitákra, szemben a fibroblasztokkal (legalább 500-szoros a DNS-szintézis fokozódása) és kevésbé, bár még mindig jelentős mértékben eltérő (legalább 50-szeres) aktivitást fejt ki keratinocitákra, mint az egyéb vizsgált hámsejttípusokra (lásd 1-2. táblázatot, valamint az Anyagok és módszerek című kísérleti részt a biológiai vizsgálat standard körülményeire vonatkozóan).
A KGF előállítására szolgáló, sejttenyésztésből és a mitogénaktivitás izolálásából álló eljárás segítségével - amely a találmány értelmében ultraszűrésből, heparin-Sepharose affmitási kromatográfiából (HSAC) és adszorpciós fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiából (RP-HPLC) vagy molekulaszűrő nagynyomású folyadékkromatográfiából (TSK-HPLC) áll - előállítottunk annyi KGF-et, amennyi elegendő volt az anyag fizikai és biológiai tulajdonságainak jellemzésére.
A KGF előállítására szolgáló eljárás KGF-et termelő sejtekből, például M246 humán embrionális fibroblasztokból [Aaronson S. A. és Todaro G. J., Virogoly, 36, 254-261 (1968)] például az alábbi lépésekből áll:
(i) szérumtartalmú tápközegből szérummentes tápközegbe passzált egysejtréteges tenyészetek alkalmazásával kondicionált közeget (például 10 litert) készítünk, és a szérummentes tápközeget további felhasználásig -70 °C-on tartjuk;
(ii) 10 kD móltömeg-kizárású membránt alkalmazva ultraszűréssel, több egymást követő lépésben, időnkénti pufferes hígítással (a kis móltömegű anyagok eltávolításának elősegítésére) koncentráljuk az anyagot, majd ha szükséges, -70 °C-on tároljuk;
(iii) polimer hordozóhoz (például Sepharose-hoz) kötött heparinnal affmitási kromatográfiát végzünk, az eluálást növekvő nátrium-klorid-koncentrációval, gradienselúcióval végezzük;
(iv) kis léptékű, 10 kD móltömeg-kizárású ultraszűrőberendezéssel [például Centricon-10 mikrokoncentrátorral (Amicon)] 10-20-szorosára koncentráljuk az anyagot és -70 °C-on tároljuk.
A tisztítási eljárás következő lépése vagy az (v) vagy a (vi) lépésből áll, az alábbiak szerint:
(v) a HSAC-lépésben kapott aktív frakciókat (0,6 mol/1 koncentrációjú NaCl-oldattal nyert eluátum) szerves oldószerrendszerben RP-HPLC-vel tisztítjuk; vagy (vi) molekulaszűrő HPLC-t alkalmazunk [például TSK-G3000SW GlasPac oszlopon (LKB)] vizes pufferben, közelítőleg fiziológiás pH-értéken (például 0,5 mol/1 NaCl-ot tartalmazó Tris-HCl, pH 6,8), majd -70 °C-on tároljuk az anyagot.
A (vi) lépés szerinti TSK-eljárással tisztított preparátum majdnem olyan tiszta, mint az RP-HPLC-vel előállított készítmény, NaDodSO4/PAGE analízis és ezüstfestés szerint (adatokat nem közöltük); azonban TSK- eljárással sokkal jobb az aktivitás visszanyerése (lásd I-1. táblázat adatait). Ezen túlmenően a TSK-eljárással tisztított anyag specifikus aktivitása nagyobb, mint az RP-HPLC-eljárással tisztított anyagé. A TSKeljárással tisztított KGF nanomól/1 koncentrációnál alacsonyabb koncentrációban stimulálja a DNS-színtézist hámsejtekben, de nem indukál timidinbeépülést fibroblasztok vagy belhámsejtek DNS-ébe összehasonlít5
HU 218 090 Β ható vagy nagyobb koncentrációkban (5 nmol/1 koncentrációig). Az aktivitás savra, hőre és az RP-HPLClépésben alkalmazott oldószerekre érzékeny (az érzékenységre vonatkozó és a további adatokat lásd alább).
Ismert eljárást alkalmazva meghatároztuk a tisztított KGF aminoterminálisától a 2-13. aminosavak szekvenciáját, amelyet az alábbinak találtunk: Asn-AspMet-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val (lásd alább az I. kísérleti részt).
A találmány KGF-et és KGF-szerű polipeptideket kódoló DNS-szegmensekre is vonatkozik. A találmány szerinti DNS-ek például az alábbiak: 32. és 49. számú humán cDNS-klónok, amelyek az M426 humán embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonalból extrahált, poliadenilezett RNS-ből származnak, a fenti ki ónok mutánsai és rekombinánsai és a fenti DN S-szegmensekkel való hibridizálással detektálható DNS-szegmensek.
Amint azt a II. kísérleti részben ismertetjük, a KGFaminosavszekvencia ismert részének megfelelő cDNSklónokat keresve két oligonukleotidpróba-készletet állítottunk elő az alábbi kilenc aminosavból álló szekvenciát kódoló, összes lehetséges nukleotidszekvencia alapján: Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala. Egy cDNS-könyvtárat konstruáltunk a pCEV9 cDNSklónozó vektorban, az M426 humán embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonalból extrahált, poliadenilezett RNS alkalmazásával, amely a növekedési faktor kiindulási forrása volt. A könyvtárat (9χ 105 plakk) 32P-jelzett oligonukleotidokkal szűrve 88 olyan plakkot azonosítottunk, amely mindkét próbával hibridizált.
Az analizált 10 plakk-tisztított klónból egy, a 49. számú klón egy 3,5 kb hosszúságú, beillesztett cDNSszakaszt tartalmaz, míg a többiben a beillesztett szakasz hossza 1,8-2,1 kb. A kisebb kiónok analízise azonos restrikciós helyeket mutatott, és a kisebb kiónok egyik képviselőjét, a 32. számú kiónt a 49. számú klónnal együtt szekvenálva azt találtuk, hogy ezek a cDNS-ek egymással átlapolódnak (II-1. ábra A része). A két cDNS egybevetésével egy 3,85 kb hosszúságú folyamatos szekvenciát kapunk, amely a teljes KGF-et kódoló szekvenciát tartalmazza. Az értelmes szálat képviselő DNS nukleotidszekvenciája és az általa kódolt elsődleges proteinszekvencia a II-1. ábra B részén látható a teljes hosszúságú KGF cDNS-re.
A teljes KGF-kódolószekvenciát tartalmazó fenti cDNS-ek, a 32. és 49. számú cDNS-klónok, valamint a fenti szegmensek rekombináns formái képviselik a találmány szerinti legelőnyösebb DNS-eket.
A cDNS-szekvenciából nyilvánvaló, hogy az elsődleges KGF és a hst transzlációs termékek hidrofób Nterminális régiókat tartalmaznak, amelyek valószínűleg szignálszekvenciaként funkcionálnak, hasonlóan számos egyéb protein hasonló szekvenciáihoz. Ennek megfelelően ez az N-terminális szakasz nincs jelen a humán embrionális fibroblasztok által kiválasztott tiszta, érett KGF-molekulában.
Ezenkívül a KGF még két olyan fő proteint tartalmaz, amely homológ az FGF-ek családjába tartozó többi proteinével, ez a KGF szekvenciájában a 65-156. és a 162-189. aminosavakat tartalmazó rész, amelyeket egymástól rövid, a különböző FGF-proteinekben különböző hosszúságú, nem homológ aminosavszekvencia választ el egymástól. A tisztított KGF szekvenciájában 5 ciszteinmaradék van, amelyekből 2 az FGF-proteinek minden tagjában megőrződik. A KGF szekvenciájában öt pár bázikus maradék található, ami megtalálható az FGF család összes többi tagjában is.
Szakemberek számára magától értetődő, hogy a találmány szerinti DNS-eket és RNS-eket, főleg a fent említett legelőnyösebb DNS-eket hibridizációs eljárásokban (például genom humán DNS-ek Southern biot analízise) alkalmazva genom- vagy cDNS-könyvtárakból rutinszerű szűrővizsgálattal további KGF-szerű proteineket kódoló DNS-ek is találhatók, amelyek szintén a találmány tárgyát képezik. Továbbá a találmány szerinti DNS-eket a fenti módon alkalmazva a KGF-fel kapcsolatos genetikai markerek, például a restrikciós fragmentum hosszúságú polimorfok (RFLP-k) azonosíthatók és kapcsolatba hozhatók az ezekkel vagy más közeli génekkel összefüggő örökletes betegségekkel.
A találmány a KGF DNS-ek módosított formáira is vonatkozik. Fenti vonatkozásban a találmány egyik fontos kiviteli módja szerint az ilyen módosított DNS-ek olyan KGF-szerű proteineket kódolnak, amelyek a KGF aminosavszekvenciájának szegmensei mellett az FGF-peptidek családjába tartozó legalább egy másik tag aminosavszekvenciájának szegmenseit is tartalmazzák. így például, mivel nincs jelentős N-terminális homológia a KGF szekretált formája és az egyéb FGFpeptidek analóg helyzetei között, új szerkezeti és funkcionális tulajdonságú polipeptidek hozhatók létre oly módon, hogy az FGF családba tartozó, eltérő N-terminálist tartalmazó polipeptid N-terminális szekvenciáját kódoló DNS-szegmenssel helyettesítjük a KGF rendes N-terminális szekvenciáját kódoló DNS-szegmenst.
A fenti módosított DNS-ek segítségével előállított kiméra polipeptid annak meghatározására használható, hogy vajon a KGF N-terminális szakasza elegendő-e a KGF jellegzetes célsejt-specificitásának biztosítására. A kimérákkal végzett vizsgálatok abba is betekintést engednek, hogy mely szakaszok játszanak szerepet a heparinnak biológiai aktivitásukra kifejtett eltérő hatásában.
A fenti célokra való alkalmazhatóságot megerősíti egy kiméra molekulával végzett sikeres genetikai tervezési és expressziós vizsgálat, amely szerint a KGF szekretált formájának N-terminális végéről mintegy 40 aminosavat [kezdve az érett KGF aminoterminális cys maradékával (32. aminosav a II-1. ábrán) és befejezve a KGF 78. arg aminosavmaradékával] az aFGF C-terminális magjának mintegy 140 aminosavjához kapcsoltunk (a 39. arg maradéktól kezdve az aFGF kódoló szekvencia C-terminális végéig folytatva). Ez a kiméra tennék a KGF-hez hasonlóan keratinocitákkal szemben mutat célsejt-specificitást, de heparinra nem érzékeny, amiben inkább az aFGF-re emlékeztet, nem a KGF-re. Ez az új KGF-szerű növekedési faktor előnyösen alkalmazható lehet olyan klinikai állapotok esetén, amikor hámsejtspecifikus növekedési faktort kell adagolni az antikoagulánsként szokásosan alkalmazott heparin
HU 218 090 Β jelenlétében. Az ilyen kiméra molekulák szerkesztését és a polipeptid tulajdonságait részletesebben alább, a II. kísérleti részben ismertetjük.
A találmány szerinti egyéb DNS-ek az alábbi rekombináns DNS-molekulák lehetnek, amelyek KGF cDNS-ből és például egy alábbi vektor-DNS-ből állnak: lambda-bakteriofágklónozó vektor (pCEV9), DNS-szekvenáló plazmidvektor (pUC-variáns), bakteriális expressziós vektor (pKK233-2) vagy emlős expressziós vektor (pMMT/neo). A fenti rekombináns DNS-ek szerkesztését a II. kísérleti részben részletesen ismertetjük.
A legelőnyösebb rekombináns molekulák az alábbiak: a KGF szekretált formáját kódoló szekvenciát és egy bakteriális expressziós vektort (például pKK233-2-t) tartalmazó molekula vagy a teljes, elsődleges transzációs terméket (beleértve az N-terminális szignálpeptid-szekvenciát is) kódoló cDNS-t és egy emlős expressziós vektort (például pMMT-t) tartalmazó molekula, amely expressziós vektor képes a beépített DNS-t emlős (például NIH/3T3) sejtekben kifejezni.
A KGF DNS-t és bakteriális expressziós vektort tartalmazó rekombináns DNS-ek előállítását a II. kísérleti részben ismertetjük. Röviden, a KGF cDNS-expresszióját E. coliban úgy tesszük lehetővé, hogy kódolószekvenciáját a pKK233-3 plazmid expressziós vektorban a hibrid trk promoter kontrollja alá helyezzük [Amman E. és Brosius J., Gene, 40, 183 (1985)].
Az olyan rekombináns DNS-ek szerkesztését, amelyek KGF DNS-ből és a beépített DNS-t humán vagy állati sejttenyészetekben expresszálni képes emlős vektorból állnak, az ilyen viszonylag egyszerű polipeptidek kifejezésére alkalmas, szakemberek számára jól ismert módszereket használó standard génexpressziós technikával állíthatjuk elő. A találmány szerinti rekombináns DNS egyik specifikus előállítását emlős pMMT vektor segítségével alább ismertetjük, a találmány szerinti rekombináns sejteket leíró részben.
A találmány szerinti DNS-eket és az értelmes szálú RNS-eket a találmány szerinti fehérje-előállítási eljárásokkal kombinálva nagy mennyiségű, lényegében tiszta KGF- vagy KGF-szerű protein előállítására alkalmazhatjuk. Az ily módon nyert, lényegében tiszta KGFproteint ismert módszerek alkalmazásával diagnosztikai vizsgálatokra használhatjuk a fenti protein receptorai jelenlétének kimutatására különféle biológiai folyadékokban és szövetekben.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti DNS-sel transzformált sejtek, előnyösen bakteriális vagy emlős sejtek is, amelyekben a transzformált DNS képes kifejeződni. Ebben a vonatkozásban a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerint DNS-sel transzformált sejt a KGF-proteint teljesen mitogén formában termeli. Legelőnyösebben ezek a proteinek szekretált formában vannak (azaz nem tartalmazzák a szignálszekvenciát). A fenti proteinfaktorokat funkcionális vizsgálatokra alkalmazhatjuk vagy tisztíthatjuk további biokémiai és funkcionális analitikai célokra, például kvalitatív és kvantitatív receptorkötődési vizsgálatokra.
A KGF termelésére alkalmas rekombináns E. coli sejtek előállítását bakteriális pKK233-2 expressziós vektorral a II. kísérleti részben részletesen ismertetjük. Összefoglalóan több rekombináns bakteriális kiónt megvizsgáltunk proteintermelés szempontjából, a szokásos kis léptékű módszerekkel. Az összes rekombináns sejt olyan proteint termelt, amelyet egy aminoterminális KGF-peptid ellen termelődött antitestek felismertek (lásd alább). Az egyik rekombinánst egy liter tápközegben tenyésztve rekombináns KGF-et termeltünk, amely megfelelően stimulálta a timidin beépülését BALB/MK keratinocitasejtek DNS-ébe, de csak igen kis aktivitást mutatott NIH/3T3 fibroblasztokon. A BALB/MK sejtek maximális stimulálásának felét 2-5 ng/ml koncentrációval értük el, standard keratinocitabiológiai vizsgálatban, míg hasonló hatás eléréséhez az M426 sejtekből tisztított KGF-ből 10-15 ng/ml kellett.
liter baktériumsejt-tenyészet mintegy 50 pg Mono-S tisztított rekombináns KGF-et eredményezett. Szakember számára magától értetődő, hogy ez a kezdeti hozam minden különösebb kísérletezés nélkül lényegesen fokozható a szokásos rekombináns DNS-technológiák alkalmazásával.
Rekombináns emlős sejteket (NIH/3T3) is előállítottunk, a teljes KGF cDNS-szekvencia (beleértve az aminoterminális szignálszekvenciát is), és a pMMT/neo vektől' felhasználásával, amely egér metallotionin (MMT) promotert és neomicinrezisztenciára szelektív markergént hordoz. A sejteket KGF-termelés, különösen a humán fibroblasztok által termelt érett (szignálszekvencia nélküli) forma kiválasztása szempontjából értékeltük a találmány szerinti biológiai vizsgálat alkalmazásával. Ugyanezt a vektor-gazdasejt kombinációt sikeresen alkalmazták már néhány hasonló rekombináns polipeptid, többek között a vérlemezke eredetű növekedési faktor (FDGF) A és B láncának nagy koncentrációban való expresszálására is [Sakai R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Nőm G. T., Erlich H. A. és Amheim N., Science, 230, 1350-1354 (1985)]. Ennek megfelelően szakember számára nyilvánvaló, hogy a KGF-et is nagy hozammal lehet előállítani ezzel a módszerrel, a találmány szerinti rekombináns DNS-ek és transzformált sejtek alkalmazásával.
Végül gyógyászati célokra, a hámsejtek szaporodásának specifikus stimulálását igényelő állapotok kezelésére a nagy léptékű előállítást lehet alkalmazni. A polipeptidek helyi (például bőrre vagy a szem szaruhártyájára) vagy szisztemikus adagolására alkalmas gyógyászati készítmények előállítására használható anyagok és módszerek szakemberek számára jól ismertek, és azok egyszerűen adaptálhatók a KGF- vagy KGF-szerű peptidek adagolására.
A találmány továbbá a találmány szerinti DNS-szegmensek által kódolt peptid elleni új antitestekre is vonatkozik. A találmány e kiviteli alakját azok a különféle antitestek képezik, amelyek felismerik a KGF-et. A fenti antitesteket ismert eljárásokkal állíthatjuk elő szokásos immunológiai módszerek alkalmazásával, amelyeket a II. kísérleti részben vázolunk. A fenti antitestek
HU 218 090 Β magukban foglalják a humán fibroblasztokból származó tisztított, érintetlen protein ellen egérben termelődött monoklonális antitesteket; a nyulakban olyan szintetikus peptidek ellen termelődött poliklonális antitesteket, amelyek szekvenciája a KGF cDNS-szekvenciájából következtetett aminosavszekvencián alapul (lásd például a KGF 32-45 aminosavmaradékát tartalmazó peptidet, amelynek szekvenciája NDMTPEQMATNVR az aminosavak ismert egybetűs kódja szerint; lásd II-1. ábrát); és a nyulakban mind a humán fibroblasztok által természetes úton kiválasztott KGF, mind az E. coliban termelt rekombináns KGF (lásd fent) ellen termelődött poliklonális antitesteket.
Minden vizsgált antitest felismeri mind a rekombináns, mind a természetben előforduló KGF-et, szilárd fázisú (ELISA) vizsgálatban és/vagy Western biot analízissel. A találmány szerinti antitestek előnyös képviselői láthatólag semlegesítik a KGF mitogénaktivitását BALB/MK biológiai vizsgálatban.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti antitestek ismert módon előállítható fragmentumai, például a Fab vagy F(ab)’ fragmentumok is, amelyek megtartják az antigénkötő aktivitást. A találmány tárgyát képezik továbbá a hatóanyagként találmány szerinti antitesteket vagy azok aktív fragmentumait tartalmazó gyógyászati készítmények is, amelyeket a polipeptidek adagolására szokásosan alkalmazott anyagok és módszerek alkalmazásával állíthatunk elő, azok KGF-re és KGFszerű proteinekre való szokásos adaptálása után.
A fenti antitestek és aktív fragmentumaik például biológiai vizsgálatokban KGF kimutatására vagy a proteinfaktorok tisztítására alkalmazhatók. Alkalmazhatók ezenkívül ismert módon a KGF receptorának izolálására is, amely - a II. kísérleti részben leírtak alapján - láthatólag nem azonos az egyéb növekedési faktorokéval.
Azokat az előnyös antitesteket, fragmentumaikat és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítményeket, amelyek például a BALB/MK vizsgálat szerint semlegesítik a KGF hámsejtekre kifejtett mitogénaktivitását, a hámsejtek túlzott szaporodásával kapcsolatos betegségek, például diszplázia és neoplázia (mint például a psoriasis vagy a rosszindulatú vagy jóindulatú hámsejtdaganatok) kezelésére használhatjuk.
A találmány továbbá új biológiai vizsgálati eljárásokra is vonatkozik, a találmány szerinti DNS-ekkel kapcsolatos gének expressziója detektálására. Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány szerinti DNSeket próbaként alkalmazzuk a vonatkozó mRNS-ek egyensúlyi koncentrációjának meghatározására. A találmány szerinti, KGF DNS-eket és standard Northern biot módszert alkalmazó biológiai vizsgálatokat részletesen a II. kísérleti részben ismertetjük.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fenti módszerek egyszerűen alkalmazhatók a KGF-szerű proteinek génexpressziójának analízisére is, izolált sejtekben vagy különféle szövetekben. Az ilyen biológiai vizsgálatok például különféle tumorsejtek azonosítására vagy a hámsejt-szaporodási folyamatok genetikai hibáinak felismerésére alkalmazhatók.
Véleményünk szerint a fenti leírás, valamint az alábbi kísérleti rész ismeretében szakemberek a maga teljességében alkalmazni képesek a találmányt. A kísérleti rész pusztán a találmány közelebbi ismertetésére szolgál, a korlátozás szándéka nélkül.
I. kísérleti rész
Hámsejtekre specifikus új növekedési faktor azonosítása és jellemzése
Az alábbiakban ismertetjük azokat a kísérleteket, amelyek a hámsejtekre specifikus növekedési faktor azonosítására vezettek, egy humán embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonal kondicionált közegében. A faktort - amelyet a fenti sejttípusra kifejtett jellegzetes hatása miatt átmenetileg keratinocitanövekedési faktornak (KGF-nek) neveztünk el - ultraszűrés, heparin-Sepharose affínitási kromatográfia és C4 fordított fázisú HPLC-oszlopon végzett hidrofób kromatográfia kombinálásával homogenitásig tisztítottuk, a találmány szerinti eljárásnak megfelelően. A KGF vizsgálataink szerint hőre és savra érzékeny és egyetlen polipeptidláncból áll, amelynek látszólagos móltömege mintegy 28 000 D. A tisztított KGF erős mitogén hatást fejt ki hámsejtekre, nyugvó BALB/MK hámkeratinocitákban több, mint 500szorosára képes fokozni a DNS-szintézist, detektálható aktivitása már 0,1 nmol/1 koncentrációban, maximális aktivitása 1,0 nmol/1 koncentrációban van. A mitogénaktivitás hiánya fibroblasztokra vagy belhámsejtekre azt jelzi, hogy a KGF célsejt-specificitása eltér bármelyik korábban ismert növekedési faktorétól. Mikroszekvenálással meghatározott aminoterminális szekvenciája nem mutat jelentős homológiát egyetlen ismert proteinnel sem. A fenti új növekedési faktor felszabadulása humán embrionális fibroblasztokból azt jelenti, hogy a KGF szerepet játszik a normális hámsejt szaporodásának embrionális kötőszöveti stimulálásában.
(A) Anyagok és módszerek
Kondicionált közeg előállítása
M426 humán embrionális fíbroblasztok [Aaronson S. A. és Todaro G. I, Virology, 36, 254-261 (1968)] korai átoltását 175 cm2 felületű T lombikban szélesztjük és 10-14 napon keresztül 10% borjúszérummal (GIBCO) kiegészített, Dulbecco által módosított Eagle-tápközegben (DMEM; GIBCO) összefüggő tenyészet eléréséig tenyésztjük. Ezután az egyréteges tenyészetet hetente átoltjuk szérumtartalmú tápközegből szérummentes tápközegre, az utóbbi maga a DMEM. A sejteket kétszer 5 ml foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk a 20 ml DMEM hozzáadása előtt. 72 óra múlva a tény észlevet összegyűjtjük és 35 ml szérumtartalmú közeggel helyettesítjük. A kondicionált közeget további felhasználásig -70 °C-on tároljuk.
Ultraszűrés
Mintegy 10 liter kondicionált közeget felolvasztunk, 0,50 mikronos szűrőn (Millipore HAWP 142 50) előszűrjük és 200 ml-re koncentráljuk Pellicon kazettarendszer (Millipore XX42 00K 60) segítségével, a kazetta móltömegkizárása 10 kD (Millipore PTGC 000 05). A koncentrálás után a mintát két egymást követő lépésben hígítjuk 1 liter, 0,3 mol/1 nátrium-kloridot
HU 218 090 Β tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl (pH 7,5) pufferrel, az egyes hígítási lépések után újból ultraszűrést végzünk a Pellicon-rendszerrel. A visszatartott folyadékot - amely az aktivitást tartalmazza - vagy azonnal heparin-Sepharose gyantára visszük, vagy -70 °C-on tároljuk.
Heparin-Sepharose affinitási kromatográfiája (HSAC)
Nt. ultraszűrésnél visszatartott anyagot heparinSepharose gyantára (Pharmacia) visszük, amelyet 0,3 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 7,5) ekvilibráltunk. A gyantát addig mossuk, amíg az optikai sűrűség az alapszintre tér vissza, majd lineárisan növekvő nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk. A frakciókból alikvot mintákat veszünk a timidinbeépülés meghatározására, és az aktív frakciókat 10-20-szorosára koncentráljuk Centricon-10 mikrokoncentrátor (Amicon) segítségével, majd -70 °C-on tároljuk.
Fordított fázisú HPLC (RP-HPLC)
A HSAC-eljárással kapott aktív frakciókat (0,6 mol/1 koncentrációjú nátrium-kloridban) felolvasztjuk, egyesítjük és Centricon-10 berendezéssel <200 pl végtérfogatra koncentráljuk. A mintát Vydac C4 HPLC-oszlopra (The Separations Group, Hesperia, CA) visszük, amelyet 0,1% trifluor-ecetsavat (TFA, Fluka) tartalmazó 20%-os acetonitrillel (Baker, HPLC tisztaság) ekvilibráltunk és lineárisan növekvő acetonitril-gradienssel eluáljuk. A biológiai vizsgálatra kivett alikvotokat azonnal 10-szeresére hígítjuk 50 pg/ml BSA-t (V frakció, Sigma) tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 7,5). A maradék mintát Speed-Vác (Savant) készülékben szárítjuk a szerkezeti analízis elvégzéséhez.
Molekulaszűrő-HPLC
A kétszer koncentrált heparin-Sepharose frakciók mintegy 50 μΐ-ét TS-G3000SW GlasPac oszlopra (LKB) visszük, amelyet 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 6,8) ekvilibráltunk. A mintát ugyanezzel a pufferrel eluáljuk 0,4 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A biológiai vizsgálathoz kivesszük az alikvotokat, majd a frakciókat -70 °C-on tároljuk.
NaDodSO4-poliakrilamidgél elektroforézis (NaDodSO4/PAGE)
A poliakrilamidgélt NaDodSO4-tal állítjuk elő, Laemmli U. K. módszere szerint [Natúré, 227, 680-685 (1970)]. A mintákat 3 percen keresztül forraljuk 2,5 térfogat% 2-merkapto-etanol jelenlétében. A géleket fixáljuk és ezüsttel festjük [Merni C. R., Goldman D., Sedman S. A. és Ebért Μ. H., Science, 211, 1437-1438 (1981)], BioRad reagenseket és protokollt alkalmazva. Molekulatömeg-markerként Pharmacia termékeket használtunk.
DNS-szintézis stimulálása lyukú mikrotitrálólemezt (Falcon No. 3596) előzetesen humán fibronektinnel (Collaborative Research) vonunk be 1 pg/cm2 koncentrációban, majd a rezervoárokba bemérjük a BALB/MK sejteket. Miután az összefüggő tenyészet kialakult, a sejteket 24-72 órán keresztül 5 pg/ml transzferrint (Collaborative Research) és nmol/1 Na2SeO3-et (Baker) tartalmazó, szérummentes közegben tartjuk. A 3H-timidin- (5 pg/ml végkoncentráció, NEN) beépülést a DNS-be 6 órán keresztül mérjük, a mérést a minta hozzáadása után 16 órával kezdjük. A vizsgálat befejezéseként a sejteket egyszer jéghideg, foszfáttal pufferolt sóoldattal és kétszer 5%-os trifluorecetsav-oldattal mossuk. A csapadékot 0,25 mol/1 koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatban oldjuk, folyadékszcintillációs folyadékba (Biofluor, NEN) visszük, és elvégezzük a számlálást.
A DNS-szintézis stimulálását a BALB/MK sejtekre fent leírtak szerint számos más sejtvonalon is meghatározzuk. A NIH/3T3 fíbroblasztokat [Jainchill J. L., Aaronson S. A. és Todaro G. J., J. Virol., 4, 549-553 (1969)] a National Institute of Healthtől, a CCL207 rhesusmajom hörgőhámsejteket [Caputo J. L., Hay R. J. és Williams C. D., In Vitro, 15, 222-223 (1979)] az American Type Culture Collectiontől szereztük be. A Stampfer M. R. és Bartley J. C. [Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 82, 2394-2398 (1985)] szerint előállított B5/589 humán emlőhámsejtvonalat Martha Stampfertől kaptuk (University of Califomia, Berkeley). Az emlősejteket 10% magzati borjúszérummal és 4 ng/ml EGF-fel kiegészített RPMI-tápközegben tenyésztjük. Szérummentes körülmények között alaptápközegként DMEM-et alkalmazunk. A humán véna saphena hámsejtek elsődleges tenyészetét Sharefkin és munkatársai módszere szerint állítjuk elő és tartjuk fenn [Sharefkin J. B., Fairchild K. D., Albus R. A., Cruess D. F. és Rich
N. M., J. Surgical Rés., 41,463-472 (1986)]. A felhámnövekedési faktort és az inzulint a Collaborative Researchtől szereztük be. Az aFGF-et és a bFGF-et a Califomia Biotechnology, Inc.-tól kaptuk. A rekombináns TGFa-t a Genentech, Inc.-tól szereztük be. A tápközegek és a szérum vagy GIBCO, Biofluids, Inc. termék, vagy NIH tápközegegységek voltak.
Sejtszaporodás vizsgálata mm átmérőjű tenyésztőcsészéket egymást követően poli-D-lizinnel (20 pg/cm2, Sigma) és humán fibronektinnel vonunk be, majd mintegy 2,5 xlO4 BALB/MK sejttel beoltjuk. Alaptápközegként alacsony kalciumion-tartalmú Eagle-féle minimál táptalaj és Ham-féle F-12 közeg 1:1 arányú elegyét használjuk, 5 pg/ml transzferrinnel, 30 nmol/1 Na2SeO3-del és
O, 12 mmol/1 etanol-aminnal (Sigma) kiegészítve. A közeget minden 2. vagy 3. napon cseréljük. 10 nap múlva a sejteket formaiinnal (Fisher Scientific Co.) fixáljuk és Giemsa-festéssel (Fisher Scientific Co.) megfestjük.
Proteinmikroszekvenálás
A C4-oszlop aktív frakcióiból kapott mintegy 4 pg (~ 150 pmol) proteint 50%-os trifluor-ecetsav-oldatban újra feloldjuk, és az oldatot gázfázisú proteinszekvenátorra (Applied Biosystems) visszük fel. Az Edmanféle lebontást 20 ciklusban hajtjuk végre, és az aminosavakat automata on-line HPLC-vei (Model 120A, Applied Biosystems) azonosítjuk.
(Bi Eredmények
Növekedési faktor kimutatása és izolálása
A különféle sejtvonalakból származó kondicionált közegek előzetes szűrővizsgálata azt mutatta, hogy bi9
HU 218 090 Β zonyos fibroblasztvonalakból származó közegek mind BALB/MK, mind NIH/3T3 sejteken kimutatható mitogén aktivitást tartalmaznak. Míg forralással megszüntethető a BALB/MK sejtekre kifejtett mitogénaktivitás, a NIH/3T3 sejtekre kifejtett mitogénaktivitás érintetlenül megmarad. Mivel az EGF [Cohen S., J. Bioi. Chem., 237, 1555-1562 (1962)] és a TGFa [DeLarco J. E. és Todaro G. J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 4001-4005 (1978)] hőstabilitása ismert, arra következtettünk, hogy a BALB/MK sejtekre kifejtett mitogénaktivitás az ismert hámsejt-növekedési faktoroktól eltérő anyagtól származik.
A feltételezett növekedési faktor(ok) tisztítására a fenti aktivitás leggazdagabb forrásaként az M426 humán embrionális fibroblaszt-sejtvonalat választottuk ki. A Pellicon-rendszerrel végzett ultraszűrés megfelelő módszernek bizonyult a mintatérfogat megfelelő mértékű csökkentésére, a soron következő kromatográfiás lépéshez. A tisztítási módszer kidolgozása során kipróbáltuk a szűrő, ioncserélő és izoelektromos fókuszáló kromatográfia különféle kombinációit, de mindegyik elfogadhatatlanul alacsony hozamot adott. Ezzel szemben a heparin-Sepharose affinitási kromatográfia (HSAC), amelyet egyéb növekedési faktorok tisztítására már használtak [Raines E. W. és Ross R., J. Bioi Chem., 257, 5154-5160 (1982); Shing Y., Folkman J., Sullivan R., Butterfield C., Murray J. és Klagsburg M., Science, 223, 1296-1299 (1984); Gospodarowicz D., Cheng J., Lui G.-M., Baird A. és Bohlen P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 6963-6967 (1984); Maciag T., Mehlman T., Friesel R. és Schreiber A. B., Science, 225, 932-935 (1984); Conn G. és Hatcher V. B., Biochem. Biophys., Rés. Comm., 124, 262-268 (1984); Lobb R. R. és Fett J. W., Biochemistry, 23, 6295-6299 (1984)], megfelelőnek bizonyult a találmány szerinti eljárás korai tisztítási lépéseként is. Noha a visszanyert specifikus aktivitás becslése ebben a fázisban még bizonytalan az egyéb faktorok jelenléte miatt, az aktivitás látszólagos hozama 50-70%, és a megfelelő dúsítás mintegy 1000-szeres.
Az M426 humán embrionális fibroblasztsejtekből származó kondicionált közeg heparin-Sepharose affinitási kromatográfiáját az alábbi körülmények között végezzük.
liter M426 kondicionált közeg ultraszűrésénél visszatartott folyadék 150 ml-ét 6 ml ágytérfogatú heparin-Sepharose oszlopra visszük fel 1 óra alatt. Az oszlopot 150 ml 0,3 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 7,5) mosva ekvilibráljuk, majd a visszatartott proteint (a megkötött összes proteinnek kevesebb, mint 5%-át) növekvő nátrium-klorid-koncentráció módosított lineáris gradiensével eluáljuk. A frakciók térfogata 3,8 ml, és a gradienselúció alatt az átfolyási sebesség 108 ml/óra. A megjelölt frakciók 2 μΐ-ét a mikrotitráló rezervoárjába mérjük, amely 0,2 ml végtérfogatban tartalmazza BALB/MK sejtekben a 3H-timidinbeépülés meghatározásához szükséges vizsgálati elegyet (lásd az Anyagok és módszerek ismertetésénél). Az eredményeket az I -1. ábra mutatja.
Az I—1. ábrából látható, hogy a BALB/MK mitogénaktivitás több mint 90%-a 0,6 mol/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal eluálódik a HSAC-oszlopról. Ez az aktivitáscsúcs nem kapcsolódik NIH/3T3 sejtekre kifejtett aktivitással (az erre vonatkozó adatokat nem közöltük). Egy sokkal kisebb BALB/MK mitogénaktivitáscsúcs eluálódik 0,8-1,2 mol/1 koncentrációjú nátriumkloriddal.
A HSAC kromatográfiás ábra reprodukálhatóságának következtében az aktív frakciókat a grandiens és az optikai sűrűség görbéje alapján is azonosíthatjuk. Stabilitási okok miatt azonnali 10-20-szoros koncentrálás szükséges Centricon-10 segítségével, a koncentrátum -70 °C-on néhány hónapon keresztül tárolható.
A végső tisztítást RP-HPLC-vel végezzük, aminosavszekvencia-analízisre alkalmas preparatív C4 Vydacoszlopon. Noha a C4-lépésből kapott aktivitás hozama rendszerint csak néhány %, ez a veszteség az alkalmazott oldószereknek tulajdonítható. Másik kísérletben a készítmény mitogénaktivitása 98%-kal csökken, ha 1 órán keresztül szobahőmérsékleten 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 50%-os acetonitrillel kezeljük. Mindenesetre az 1-2. ábra A részéből látható, hogy a BALB/MK stimuláló aktivitást egyetlen csúcsban kapjuk, amely egybeesik az optikai sűrűség görbéjében egy jól elkülönülő csúccsal. A csúcsfrakciók NaDodSO4/PAGE vizsgálattal a gél ezüstfestése után egyetlen sávot adnak (1-2. ábra B része), és az egyes vizsgált frakciók relatív mitogénaktivitása (1-2. ábra C része) jó korrelációt mutat az aktivitási profil sávjainak intenzitásával.
Az 1-2. ábrán közölt eredményeket az alábbi körülmények között kaptuk.
(A) BALB/MK mitogénaktivitás RP-HPLC tisztítása
C4-oszlopon. A heparin-Sepharose oszlopról
0,6 mol/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal eluált aktív frakciókat Centricon-10-zel koncentráljuk és közvetlenül C4 Vydac-oszlopra visszük fel (4,6x250 mm), amelyet 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 20%-os acetonitrillel (ACN) ekvilibráltunk. Az oszlopot 4 ml ekvilibráló pufferrel mossuk, majd az anyagot növekvő acetonitrilkoncentráció módosított lineáris gradiensével eluáljuk. A frakciók térfogata 0,2 ml, és az átfolyási sebesség 0,5 ml/perc. A 3H-timidinbeépülés BALB/MK sejtekben való meghatározásához vett alikvotokat azonnal 10-szeresre hígítjuk 50 pg marhaszérumalbumint tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú TrisHCl pufferrel (pH 7,5), a vizsgálatot 200-szoros véghígításban végezzük.
(B) Az 1-2. ábra A részében bemutatott C4-kromatográfiás kiválasztott frakciók NaDodSO4/PAGE analízise. Az egyes frakciók felét szárítjuk, NaDodSO4/2merkapto-etanolban újraoldjuk, hővel denaturáljuk és 14%-os poliakrilamidgélben elektroforetizáljuk, majd ezüsttel megfestjük. Az egyes molekulatömeg-markerek (tömeg kD-ban) helyzetét nyilak mutatják.
(C) Az 1-2. ábra B részében analizált frakciók által indukált DNS-szintézis BALB/MK sejtekben. Az aktivi10
HU 218 090 Β tást egy szorzóval fejezzük ki, amely azt mutatja, hogy a stimulálás hányszoros a hátteréhez (100 cpm) viszonyítva.
A HPLC-eljárás helyett molekulaszűrő-kromatográfiás tisztítást is végezhetünk TSK G3000SW GlasPac oszlopon, vizes oldatban, közelítőleg fiziológiás pH-n, amely BALB/MK biológiai vizsgálat szerint egyetlen aktív főcsúcsot eredményez (1-3. ábra). A BALB/MK mitogénaktivitás molekulaszűrő-HPLC tisztítását az alábbi körülmények között végezzük.
A heparin-Sepharose oszlopról 0,6 mol/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal eluált aktív frakciókat Centricon- 10-zel koncentráljuk, majd mintegy 50 pl mintát 8x300 mm-es LKB GlasPac TSK G3000SW oszlopra viszünk, amelyet előzőleg 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 6,8) ekvilibráltunk. A frakciók térfogata 0,2 ml, az átfolyási sebesség 0,4 ml/perc. A frakciókból 2 μΐ alikvotokat a mikrotitráló rezervoárjába mérünk, amely 0,2 ml végtérfogatban tartalmazza BALB/MK sejtekben a 3H-timidinbeépülés meghatározásához szükséges vizsgálati elegyet. A móltömegmarkerek (tömeg kDban) elúciós helyzetét nyilakkal jelöltük.
Az így kapott készítmény majdnem olyan tiszta, mint az RP-HPLC-eljárással kapott, amit NaDodSO4/PAGE analízissel mutattunk ki, ezüstfestést alkalmazva (adatokat nem közöltük), de az aktivitás visszanyerése sokkal jobb, amint az az 1-1. táblázat eredményeiből látható.
1—1. táblázat
Növekedési faktor tisztítása
Tisztítási lépes Protein (mg) Összakti- vitás (egység)* Specifikus aktivitás (egység/mg)
kondicionált közeg (10 liter) l,4xl03a 2,5 χ 104 1,8x10'
ultraszűrés (visszatartott) 1,3 x 103a 3,2 xlO4 2,5x10'
HSAC (0,6 mol/1 NaCl-os eluátum) O,73b 1,6x104 2,2 xlO4
TKS G3000SW 8,4xl0-3b 2,7 xlO3 3,2 xlO5
C4-HPLC 6,lxl0-3b 2,1 xlO2 3,4 xlO4
A visszanyeréseket azzal a feltételezéssel számítottuk ki, hogy a kiindulási anyag teljes mitogénaktivitása az izolált faktornak tulajdonítható. * 1 egység aktivitás definíció szerint a TSK-tisztított faktor általi timidinbeépülés maximális stimulálásának fele BALB/MK sejtekben, amely szerint mintegy 3 ng TSK-tisztított protein fokozza 1 egységgel az aktivitást.
a A proteint Bradford-rcagenssel (BioRad) határozzuk meg [Bradford M., Anal. Biochcm., 72, 248 - 254 (1976)].
b A proteint a 214 nm-cn mért A1 % = 140 érték alkalmazásával határozzuk meg.
A TSK-tisztított anyagot alkalmazzuk rutinszerűen a biológiai vizsgálatokban, mivel ez mutatja a legnagyobb specifikus aktivitást.
Mindkét típusú (azaz HPLC-vel és molekulaszűréssel) tisztított készítményben a mitogénaktivitás görbéje egy, a NaDodSO4/PAGE analízissel jól elkülönülő sávhoz kapcsolódik, amely a kétféle készítményben nem különböztethető meg.
A növekedési faktor fizikai és biológiai jellemzése
A tisztított növekedési faktor becsült móltömege NaDodSO4/PAGE eljárással, redukáló körülmények között (1-2. ábra) és nem redukáló körülmények között is (adatokat nem közöltük) mintegy 28 kD. Ez az érték jól egyezik két különböző méretű oszlopon kapott elúciós helyzetekkel olyan oldószerekben, amelyekben a natív konformáció várhatóan megmarad (TSK G3000SW, 1-3. ábra és superose-12, adatokat nem közöltük). A fenti adatokból következik, hogy a mitogén valószínűleg egyetlen polipeptidláncból áll, amelynek móltömege 25-30 kD.
A mitogénaktivitás hő- és savérzékenységét BALB/MK mitogén biológiai vizsgálattal bizonyítottuk. Míg az aktivitás nem változik 50 °C-on 10 percen keresztül végzett inkubálás hatására, 60 °C-on 10 percen keresztüli inkubálással 68%-kal csökken és 100 °C-on 3 percen keresztül végzett inkubálás után nem mutatható ki aktivitás. 0,5 mol/1 koncentrációjú ecetsavval szobahőmérsékleten 60 percen keresztül kezelve az aktivitás a kontroliénak 14%-ára csökken. Ezzel szemben az ismert EGF növekedési faktor mitogénaktivitása a fenti kezelések egyikével sem csökkent.
A tisztított mitogénfaktor dózis-hatás görbéjét az alábbiak szerint határoztuk meg. A 3H-timidinbeépülést a triklór-ecetsavban oldhatatlan DNS-be - amelyet a háttérbeépüléshez viszonyított szorzóként fejeztünk ki - a vizsgált növekedési faktorok koncentrációjának függvényében meghatároztuk. A növekedési faktor nélkül mért háttérérték 150 cpm. A feltüntetett eredmények két egymástól független kísérlet eredményeinek átlagát jelentik. Az egyes kísérletekben a párhuzamos mintákkal kapott eredmények eltérése az átlagértéktől 10%-on belül volt. Az egyes görbék jelentése:
·- · TSK-tisztított mitogén
A-A EGF aFGF
0-0 bFGF
Az 1-4. ábrán látható eredmények szerint már alacsony, 0,1 nmol/1 koncentráció jelenléte kimutatható mértékben stimulálja a DNS-szintézist. így az aktivitási tartomány összemérhető az egyéb vizsgált ismert növekedési faktorokéval. Lineáris összefüggést mutattunk ki 0,1-1,0 nmol/1 koncentrációtartományban; maximális, 600-szoros stimulálást 1,0 nmol/1 koncentrációban kaptunk. Az új faktor következetesen nagyobb maximális timidinbeépülést indukál BALB/MK keratinocitákban, mint az EGF, aFGF vagy bFGF (1-4. ábra).
A találmány szerinti növekedési faktor megkülönböztető célsejt-specificitásának kimutatására összehasonlítottuk különböző sejttípusokra kifejtett aktivitását az egyéb hámsejtekre ismerten mitogén hatást kifejtő növekedési faktorokéval. Az eredményeket az 1-2. táblázatban ismertetjük.
HU 218 090 Β
1-2. táblázat
Növekedési faktorok célsejt-specificitása*
Növekedési faktor Hámsejt Fibroblaszt Belhámsejt
BALB/MK BS/589 CCL208 NIH/3T3 humán véna saphena
KGF 500-1000 2-3 5-10 <1 <1
EGF 100-200 20-40 10-30 10-20 n. v.
TGFa 150-300 n. v. n. v. 10-20 n. v.
aFGF** 300-500 2-3 5-10 50-70 5
bFGF 100-200 2-3 2-5 50-70 5
* KGF cs az egyéb növekedési faktorok által stimulált maximális timidinbeepülés különféle sejtvonalakban, a háttérbeépüléshez viszonyított szorzóként megadva; az adatok négy különböző kísérlet eredményeinek átlagát jelentik ** Az aFGF általi maximális stimulálásboz heparin (Sigma) jelenléte szükséges, 20 pg/ml. n. v. nem vizsgált
Az 1-2. táblázatban közölt adatokból látható, hogy a találmány szerinti eljárással izolált új növekedési faktor erős mitogénaktivitást fejt ki BALB/MK sejteken, de jelentősen fokozza a timidinbeépülést az egyéb vizsgált hámsejtek DNS-ébe is. Ezzel éles ellentétben nem fejt ki kimutatható mértékben mitogén hatást egér fibroblasztsejtekre (és humán fibroblasztsejtekre sem, eredményeket nem közöltük) vagy humán véna saphena belhámsejtekre.
Ezzel szemben az ismert növekedési faktorok egyike sem stimulálja kiemelt mértékben a keratinocitákat. A TGFa és az EGF jelentős aktivitást mutat fibroblasztokon is, míg az FGF-ek mind az endoteliális sejtekre, mind a fibroblasztokra mitogén hatást fejtenek ki (1-2. táblázat). Hámsejtekre kifejtett specificitása és különösen a keratinocitákkal szembeni érzékenysége miatt neveztük el ideiglenesen az új mitogén faktort keratinocitanövekedési faktornak (KGF).
Annak bizonyítására, hogy a KGF nemcsak stimulálja a DNS-szintézist, hanem a tartós sejtnövekedést is segíti, megvizsgáltuk a BALB/MK sejtek szaporodási képességét teljesen definiált, szérummentes tápközegben, növekedési faktor jelenlétében. A vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük.
Poli-D-lizinnel/fibronektinnel előzetesen bevont, 35 mm-es Petri-csészébe mintegy 2,5 χ 104 BALB/MK sejtet oltunk, transzferrinnel, Na2SeO3-dal, etanol-aminnal és az alább megadott növekedési faktorokkal kiegészített Eagle-féle minimál táptalaj és Ham-féle F -12 közeg 1:1 arányú elegyébe. 10 nap elteltével a lemezeket fixáljuk és Giemsa-festéssel megfestjük. A lemezek képét az 1-5. ábra mutatja, ahol a jelölések az alábbiak:
a lemez: növekedési faktor nélkül b lemez: csak EGF c lemez: csak inzulin d lemez: csak KGF e lemez: EGF+inzulin
A növekedési faktorok végkoncentrációi az alábbiak:
EGF 20 ng/ml inzulin 10 pg/ml
KGF 40 ng/ml
Amint az 1-5. ábrából látható, ebben a kémiailag meghatározott összetételű közegben a KGF kitűnően helyettesíti az EGF-et, de az inzulint vagy az inzulinszerű I. növekedési faktort nem. Eszerint úgy tűnik, hogy a KGF az EGF-fel, aFGF-fel és bFGF-fel közös fő jelátviteli úton hat a BALB/MK sejtek proliferációjára.
KGF N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása mikroszekvenálással A növekedési faktor további jellemzésére mintegy
150 pmol C4-tisztított anyagot aminosavszekvencia-analízisnek vetettünk alá. A 2 -13. ciklusra egyértelmű adatokat kaptunk, amelyekből az alábbi szekvenciát határoztuk meg: X-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-GluGln-Met-Ala-Thr-Asn-Val. A magas háttérzaj miatt az első aminosavat nem tudtuk meghatározni, így ezt X-szel jelöltük a szekvenciában.
FASTP-program alkalmazásával végzett számítógépes kutatás szerint [Lipman D. J. és Pearson R. W., Science, 227, 1435-1441 (1985)] a KGF fent megadott N-terminális aminosavszekvenciája egyetlen, a National Biomedicinal Research Foundation adatbankban számon tartott ismert proteinnel sem mutat jelentős homológiát, ami alátámasztja a találmány szerinti eljárással előállított hámsejt-növekedési faktor újdonságát.
Összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy a fenti kísérleti részben közölt vizsgálatokkal azonosítottunk egy humán növekedési faktort, amely a maga nemében egyedülálló specificitást mutat hámsejtekre. Ultraszűrés, HSAC és RP-HPLC vagy TSK molekulaszűrő-kromatográfia alkalmazásával sikerült az anyagot olyan mennyiségben izolálni, amely lehetővé tette a fizikai és biológiai tulajdonságok részletes jellemzését.
Az RP-HPLC-kből származó aktív frakciókban ezüstfestéssel egy 28 000 dalton móltömegnek megfelelő sávot azonosítottunk, és a sáv intenzitása arányos volt a frakciókban mérhető mitogénaktivitások szintjével. Az RP-HPLC-vei kapott sávtól nem megkülönböztethető sáv látható a TSK-ból származó aktív frakciókban is. A tisztított protein nmol/1 koncentrációknál alacsonyabb koncentrációban serkenti hámsejtekben a DNS-szintézist, de fibroblasztokban vagy belhámsejtekben azonos vagy összemérhető koncentrációkban (5 nmol/l-ig) nem
HU 218 090 Β indukálja a timidinbeépülést. Ez a megkülönböztető célsejt-specifitás a tisztított molekulából meghatározott új, N-terminális aminosavszekvenciával együtt arra enged következtetni, hogy a KGF egy új növekedési faktor.
Kémiailag meghatározott összetételű tápközegben a tisztított faktor képes a BALB/MK sejtek szaporodásához szükséges inzulinszerű I. növekedési faktor/inzulin igényt kiegészíteni, ezért bizonyára az EGF-fel, TGFaval és FGF-ekkel közös jelátviteli úton hat. Ezenkívül az új faktor az összes ismert hámsejt mitogénfaktomál erősebb hatást fejtett ki a timidinbeépülés stimulálására BALB/MK sejtekben. Előzetes bizonyítékaink vannak arra vonatkozóan is, hogy ez az új faktor humán keratinociták szekunder tenyészetének proliferációját is képes serkenteni (adatokat nem közöltük).
A KGF kezelése és tárolása bizonyos problémát jelentett a tisztítás során. Savval és hővel szembeni instabilitása mellett liofilízálással vagy dialízissel szemben sem ellenálló. A HSAC után 24 óra alatt teljesen elvesztette aktivitását még akkor is, ha hordozó proteineket, heparint, szilikonozott csövet használtunk vagy akár 4 °C-on, akár -20 °C-on tároltuk. Csak a minta koncentrálásával lehetett az aktivitást megőrizni.
Ezenkívül a szárított, tisztított faktor átvitelére vagy erős savat, vagy detergenst kellett használni az adszorptív tendenciával vagy oldhatatlansággal összhangban, így az aktivitás megőrzésére a tisztított faktort oldatban, nagy koncentrációban -70 °C-on tároltuk, ilyen körülmények között néhány hónapon keresztül stabil maradt.
A KGF heparint kötő képessége ennek a faktornak egyik alapvető tulajdonságát jelentheti, amely kapcsolatban van in vivő funkciójával. Heparinkötő tulajdonságú növekedési faktorok az aFGF [Maciag T., Mehlman T., Friesel R. és Schreiber A. B., Science, 225, 932-935 (1984); Conn G. és Hatcher V. B., Biochem. Biophys. Rés. Comm., 124, 262-268 (1984); és Lobb R. R. és Fett J. W., Biochemistry, 23, 6295-6299 (1984)], a bFGF [Gospodarowitcz D., Cheng J., Lui G. M., Baird A. és Bohlen P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 6963-6967 (1984); és Lobb R. R. és Fett J. W., Biochemistry, 23, 6295-6299 (1984)] és a granulocita/makrofág telepképződést stimuláló faktor és interleukin 3 [Roberts R., Gallagher J., Spooncer E., Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M., Natúré, 332, 376-378 (1988)] is. Ezeket mind vázsejtek termelik [Roberts R., Gallagher J., Spooncer E., Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M., Natúré, 332, 376-378 (1988); Libermann T. A., Friesel R., Jaye M., Lyall R. M., Westermark B., Drohen W., Schmidt A., Maciag T. és Schlessinger I, EMBO J., 6, 1627-1632 (1987); Shipley G. D., Stemfeld M. D., Coffey R. J. és Pittelkow M. R., J. Cell Biochem. Supp., 12A, 125 (1988), abstr. C420]. A fenti faktorok láthatólag az extracelluláris mátrixban rakódnak le vagy a vázsejtek felületét bevonó proteoglikánokon [Roberts R., Gallagher 1, Spooncer E., Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M., Natúré, 332, 376-378 (1988); Vlodavsky I., Folkman J., Sullivan R., Fridman R., Ishai-Michaeli R., Sasse J. és Klagsbum M., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
84, 2292-2296 (1987)]. Feltételezték, hogy tárolásukat, felszabadulásukat és specifikus célsejtekkel való kapcsolódásukat ez a kölcsönhatás szabályozza [Roberts R., Gallagher J„ Spooncer E., Allén T. D., Bloomfield F. és Dexter T. M., Natúré, 332, 376-378 (1988); Vlodavsky I., Folkman 1, Sullivan R., Fridman R, Ishai-Michaeli R., Sasse J. és Klagsbum M., Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 84, 2292-2296 (1987)]. Noha a hámsejtek proliferációjának embrionális eredetű effektorait ismertették [Gilchrest B. A., Karassik R. L., Wilkins L. M., Vrabel M. A. és Maciag T., J. Cell PhysioL, 117, 2325-2340 (1983); Chan K. Y. és Haschke R. H., Exp. Eye Rés., 36, 231-246 (1983); Stiles A. D., Smith Β. T. és Post M., Exp. Lung Rés., Ii, 165-177 (1986)], ezeket nem azonosították. A KGF heparinkötő képessége, humán embrionális fibroblaszt vázsejtekből való felszabadulása és hámsejtek szaporodását stimuláló hatása következtében rendelkezik mindazon tulajdonságokkal, amely a normális hámsejtszaporodás ilyen parakrin mediátorától elvárható.
Az új növekedési faktor meghatározott parciális aminosavszekvenciája lehetővé tette kódolószekvenciájának molekuláris klónozását és a növekedési faktorok ismert családjaival való szerkezeti hasonlóságának meghatározását, amelyeket a II. kísérleti részben ismertetünk.
II. kísérleti rész
A hámsejtek specifikus új növekedési faktor cDNSszekvenciája az FGF család egy új tagját definiálja Az I. kísérleti részben ismertettük az új, keratinocitanövekedési faktornak (KGF) elnevezett heparinkötő növekedési faktor azonosítását és tisztítását, amely hámsejtekre specifikus és különösen keratinocitákra fejti ki hatását. A II. kísérleti részben a KGF-et kódoló cDNS-klónok izolálását és jellemzését ismertetjük, a kísérletileg meghatározott NH2-terminális aminosavszekvencián alapuló szintetikus oligonukleotidok mint hibridizációs próbák alkalmazásával. Nukleotidszekvencia-analízissel egy 582 bp hosszú, nyílt leolvasási keretet azonosítottunk, amely olyan 194 aminosavból álló polipeptidet kódol, amelynek 41-33%-a azonos a heparinkötő savas és bázikus fibroblasztnövekedési faktorokkal (FGF-ek) és a hst és int-2 onkogének hasonló termékeivel. A KGF-génről átíródott RNS-t mind az embrionális, mind a felnőttből származó normális fibroblasztok expresszálják, de a hámsejtek, belhámsejtek és gliasejtek nem. Úgy tűnik, hogy a KGF-et noimális körülmények között az embrionális kötőszövet expresszálja, ami a hámsejtek proliferációjának szabályozásában játszott szerepre utal.
(A I Anyagok és módszerek
CDNS-klónok izolálása
A KGF tisztítását és N-terminális szekvenciájának meghatározását ismertettük [lásd az I. kísérleti részt fent, valamint Rubin J. S., Osada H., Finch P. W., Taylor W. G., Rudikoff S. és Aaronson S. A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), nyomdában]. A dezoxioligonukleotidok 50 pmol mennyiségeit (amelyeket alább ismertetünk) 5’-végen jeleztük, 83 pmol τ-32Ρ-ΑΤΡ
HU 218 090 Β (3000 Ci/mmol, Amersham) és 10 egység T4 polinukleotid-kináz alkalmazásával. A cDNS-klónokat hordozó rekombináns fágot replikalemezzel nitro-cellulóz szűrőkre vittük és a 32P-jelzett dezoxioligonukleotidokkal hibridizáltuk 20% formamidot, 10% dextrán-szulfátot, 10 mmol/1 Tris-HCl-t (pH 7,5), 8xSSC-t, 5xDenhardtféle oldatot és 50 μ/ml denaturált lazacsperma DNS-t tartalmazó oldatban, 42 °C-on. A szűrőket 0,5xSSC-vel, 0,1% SDS-sel mostuk 50 °C-on és Kodak X-omat ARfilmmel előhívtuk.
DNS szekvenálása
A KGF cDNS nukleotidszekvenciáját didezoxilánc terminációs módszerrel határoztuk meg [Sanger F., Nicklen S. és Coulson A. R., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)], a pUC-vektorokba klónozott, átfedő restrikciós fragmensekből [YanischPerron C., Vieira J. és Messing J., Gene, 33, 103-119 (1985)].
Bakteriális expressziós vektor előállítása KGF cDNS expresszálására
A KGF-polipeptid érett, szekretált formáját kódoló cDNS-t a pKK233-2 plazmidexpressziós vektorban a hibrid trk promoter kontrollja alá helyeztük [Amman E. és Brosius J., Gene, 40, 183 (1985)], az alábbiak szerint. A KGF cDNS-ének meghatározott hosszúságú szakaszát - amely az érett, azaz szignálpeptid nélküli KGF-molekula kódolására való információt tartalmazza - megsokszorozzuk polimeráz-láncreakciós (PCR) módszert alkalmazva [Sakai R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Nőm G. T., Erlich H. A. és Amheim N., Science, 230, 1350-1354 (1985)]. A fragmentumot irányítottan beillesztjük a vektorban lévő két hely, mégpedig az SÍ nukleázos emésztéssel tompa végűvé tett Ncol hely és a HindlII hely közé, standard rekombináns DNS-módszerek alkalmazásával. A PCR-módszerrel előállított KGF cDNS-végei az alábbiak: az 5’vég tompa és egy ATG kodonnal kezdődik, amelyet a ciszteinmaradékot meghatározó, 33. számú TGC kodon követ, ami a KGF érett formájának aminoterminális maradéka (lásd II-1. ábrát), majd a teljes KGF-et kódoló szekvencia következik. A cDNS 3’-vége tartalmazza a TAA stopkodont és közvetlenül azután TTGC szekvenciában négy bázist. A PCR-módszerben a cDSN 3’végén a DNS-szintézisnek kívánt helyzetbe való irányítására alkalmazott primer egy HindlII helyet is tartalmaz a megsokszorozott cDNS vektor-DNS-be való beépítésére.
KGF- és KGF-szerüpeptidek elleni antitestek termelése
A humán fibroblasztokból nyert érintetlen, tisztított protein elleni monoklonális antitestek egérben 5 vagy több szubkután injekció beadásával termelődnek. A vérminták szűrővizsgálatát szilárd fázisú (ELISA) módszerrel végezzük, antigénként humán hámsejtekből származó, nagy tisztaságú KGF-et használva. A hibridómákat szokásos módon állítjuk elő, és a felülúszókat ELISA-módszerrel szűrjük KGF-fel reagáló antitestek jelenlétének kimutatására. A pozitív kiónokból szokásos módon sorozatban alklónokat állítunk elő, és a kiválasztott alklónokat aszcitesz tumorként szaporítjuk egérben, nagyobb mennyiségű antitest előállítására. Az aszcitesz folyadékból szokásos módszerekkel (például hidroxi-apatitot vagy immunaffinitási gyantát alkalmazva) nyerjük a tisztított antitesteket.
A szintetikus peptidek elleni poliklonális antitesteket nyúlban termeltetjük, szokásos módszerek alkalmazásával, az alábbiak szerint. A peptideket szilárd fázisú eljárással állítjuk elő és glutáraldehiddel reagáltatva tiroglobulinhoz kötjük. Sorozatban szubkután injekciókat adunk, és a vérmintákat ELISA-val, illetve más módszerrel, így Western biot analízissel és mitogenezis biológiai vizsgálattal szűrjük. Az IgG immunglobulinokat affinitási kromatográfiával izoláljuk, immobilizált G-proteint alkalmazva.
Nyúlban mind humán fibroblasztokból természetesen szekretált, mind E. coliban termelt rekombináns KGF (lásd következő fejezetet) ellen termeltettünk poliklonális antitesteket, az alábbi eljárást alkalmazva:
(i) az indító injekciót és az első emlékeztető injekciót a lágyéki nyirokcsomókba adjuk;
(ii) ezt követően intramuszkulárisan adjuk az emlékeztető injekciókat.
A vérmintákat ELISA, Western biot és a mitogenezis biológiai vizsgálatával szüljük, és az IgG-t ugyanúgy tisztítjuk, mint a szintetikus peptidek elleni antitesteket (lásd fent).
(B) Eredmények
Új növekedési faktort kódoló cDNS izolálása
A KGF-et kódoló szekvenciának megfelelő cDNSklónok kiválasztására két 26 bázis hosszúságú oligonukleotidkészletet állítottunk elő, a tisztított KGF mikroszekvenálásával meghatározott kilenc aminosavat tartalmazó Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala szekvencia alapján [lásd az I. kísérleti rész és Rubin J. S., Osada H., Finch P. W., Taylor W. G., Rudikoff S. és Aaronson S. A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), nyomdában]. Az egyik oligonukleotidkészlet a kilenc aminosavra mind a 256 lehetséges kódolószekvenciát tartalmazta, míg a másik a Thr-t és Pro-t kódoló kodonok degenerált 3-as helyzetében inozinmaradékokat tartalmazott.
Ezzel az utóbbi változtatással a készletben lévő lehetséges kódolószekvenciák számát 16-ra csökkentettük. A tRNS antikodonban lévő inozin hidrogénhidat képes alkotni az adeninnel (A), citozinnal (C) vagy uracillal (U) [Crick F. H. C., J. Mól. Bioi., 19, 548-555 (1966)], és a dezoxiinozint tartalmazó oligonukleotidok a vizsgálatok szerint hatékonyan hibridizálnak a megfelelő cDNS-sel [Ohtsuka E., Matsuki S., Ikehara M., Takashi Y. és Matsubara K., J. Bioi. Chem., 260, 2605-2808 (1985)].
A pCEV9 cDNS-klónozó vektorban cDNS-könyvtárat állítottunk elő [Miki T., Matsui T., Heidaran M. és Aaronson S. A., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989), nyomdában], a növekedési faktor kiindulási forrásából, az M426 humán embrionális tüdőfibroblaszt-sejtvonalból extrahált, poliadenilezett RNS alkalmazásával [Aaronson S. A. és Todaro G. J., Virology, 36, 254-261 (1968)]. A könyvtárat (9 χ 105 plakk) a 32P-jelzett 26 bázist tartalmazó oligonukleotidokkal szűrve 88 olyan
HU 218 090 Β plakkot azonosítottunk, amely mind a kétféle oligonukleotidpróba-készlettel hibridizál.
Szelektált cDNS-klónok jellemzése és szekvenálása
Az analizált 10 plakk-tisztított klónból egy, a 49. számú klón tartalmazott 3,5 kb beépített cDNS-t, míg a többiek 1,8-2,1 kb hosszúságú beépített cDNS-eket tartalmaztak.
A kisebb kiónok analízisével számos közös restrikciós helyet találtunk. A kisebb kiónok egy reprezentásának (32. számú klón) a 49. számú klónnal együtt végzett szekvenálása azt bizonyította, hogy ezek egymást átlapoló cDNS-ek (II-1. ábra A része).
A II-1. ábra A részében a humán KGF cDNS-klónokat sematikusan ábrázoltuk. A szekvenciameghatározásban használt, átlapoló 32. és 49. számú pCEV9-klónok itt a teljes szerkezetet mutató diagram formájában vannak ábrázolva, amelyben a nem transzlatált régiókat egy vonallal jelöltük, és a kódolószekvenciát bekereteztük. A bevonalkázott régió a szignálpeptid szekvenciáját jelöli, míg a nyitott régió az érett proteinét. Megjelöltük a választott restrikciós helyeket is.
Míg a 49. számú klón az mRNS poli(A)-végéből indult ki, a 32. számú klón a könyvtár kialakítása során keletkezett, az oligo(dT) primer hibridizálásával a KGF mRNS 3’ nem kódoló régiójában lévő, adeninben gazdag szekvenciához.
A KGF-polipeptidet kódoló szekvencia leírása
A két cDNS (32. és 49. számú klón) összevetésével megállapítható, hogy a teljes KGF-kódoló szekvencia 3,85 kb hosszúságú, folyamatos szekvencia (II-1. ábra B része).
AII -1. ábra B része a KGF cDNS nukleotidszekvenciáját és az abból következtethető aminosavszekvenciát mutatja. Az ábra magyarázata az alábbi. A nukleotidokat soronként számoztuk, az aminosavakat folyamatosan. A tisztított KGF-ből származó N-terminális aminosavszekvenciát aláhúztuk. A hidrofób N-terminális szakaszt dőlt betűkkel jelöltük. A potenciális aszparaginkötött glikozilezési helyet föléhúzott vonallal jelöltük. A különböző poliadenilezési jeleket (AATTAA és AATACA) az RNS 3’-végéhez közel bekereteztük.
A nukleotid 446-os helyzetében egy feltehetőleg iniciátor ATG kodon található, amely egy 582 bázispárból álló nyílt leolvasási keretet hoz létre, amely az 1030-as helyzetben egy TAA terminátorkodonnal fejeződik be. Ez a nyílt leolvasási keret egy 194 aminosavból álló polipeptidet kódolna, amelynek számított móltömege 22 512 dalton.
Az ATG kodonnal szomszédos szekvencia nem felel meg az eukarióta riboszómák általi optimális iniciálásra feltételezett GCC(G/A)CCATGG úgynevezett consensus-szekvenciának [Kozák M., Nucl. Acids. Rés., 13, 8125-8148 (1987)], azonban az ATG kodontól három nukleotiddal 5’-irányban egy A található. Ebben a helyzetben az A a legjobban megőrződött nukleotid a consensus-szekvenciában. Ezt az ATG kodont 85 nukleotiddal 5’-irányban egy TGA stopkodon követi ugyanebben a leolvasási keretben.
Egy 19 aminosavból álló szekvencia - amely homológ a tisztított KGF kísérletileg meghatározott N-terminális aminosavszekvenciájával - kezdődik 32 aminosavval 3’-irányban a feltételezett iniciátorkodontól. Teljes összhang van a nukleotidszekvenciából következtetett és a kísérletesen meghatározott aminosav-szekvenciak között, az összes egyértelműen meghatározható aminosav esetén.
A KGF- és az egyéb ismert proteinek közötti homológia megállapítására számítógépes kutatást végeztünk a National Biomedical Research Foundation adatbázisában, Lipman és Pearson FASTP programjának alkalmazásával [Lipman D. J. és Pearson R. W., Science, 227, 1435-1441 (1985)]. Ezzel a módszerrel szinte semmiféle egyezést nem találtunk a KGF következtetett elsődleges szerkezete és a savas és bázikus FGF, valamint a hst és int-2 által kódolt rokon proteinek elsődleges szerkezete között.
KGF-génről átíródott mRNS expressziója humán sejtekben
A KGF mRNS humán sejtekben való expressziójának vizsgálata során a KGF-kódoló szekvencia fő részét átlapoló próba (A próba, II -1. ábra A része) egyetlen 2,4 kilobázis hosszúságú transzkripciós terméket detektált a teljes M426 RNS Northern biot analízisével (II -1. ábra C része). Ez lényegesen rövidebb, mint a cDNS-szekvencia hossza, ami 3,85 kb.
Azonban poli(A)-szelektált M426 mRNS-sel végezve a szűrést, egy további, mintegy 5 kb hosszúságú transzkripciós terméket is detektáltunk. Ezenkívül a 49. számú klón nem átírt régiójából (a 3’-végtől a 32. klón végéig) származó próba (B próba, II-1. ábra A része) csak a nagyobb transzkripciós termékkel hibridizált (II -1. ábra C része). Ezért úgy tűnik, hogy a KGF-gén különböző RNS-ekké íródik át. Az FGF család két másik tagja, a bFGF [Abrahamas J. A., Mergia A., Whang J. L·., Tumolo A., Friedman J., Hjerrild K. A., Gospodarowicz D. és Fiddes J. C., Science, 233, 545-548 (1986)] és az int-2 [Mansour S. L. és Martin G. R., EMBO J„ 1, 2035-2041 (1988)] szintén több RNS-t expresszál, amelynek jelentőségét még ezután kell kideríteni.
A II-1. ábra C része a KGF mRNS-ek azonosítását mutatja Northern biot analízissel. Az ábra magyarázata az alábbi. Az a és c sáv a poli(A)-szelektált M426 RNS, a d sáv a teljes celluláris M426 RNS. A szűrőket a 32Pjelzett, 32. számú klónból származó 695 bp BamHI/BclI ffagmenssel (A próba, II-1. ábra A része) (a és b sáv) vagy a 49. számú klónból származó 541 bp Apal/EcoRI ffagmenssel (B próba, II-1. ábra A része) (c és d sáv) hibridizáltuk.
A KGF normális funkcionális szerepének vizsgálatára különféle humán sejtvonalakban és szövetekben megvizsgáltuk transzkripciós termékének kifejeződését. Az eredményeket a II—3. ábrán mutatjuk be, amely a KGF mRNS Northern biot analízisét ábrázolja normális humán sejtvonalakban és szövetekben, a hámsejtekre ismert aktivitást kifejtő egyéb növekedési faktorok mRNS-expressziójával összehasonlítva. A II—3. ábra magyarázata az alábbi. Az összes celluláris RNS-t cézium-trifluor-acetát-gradiens centrifugálással izoláltuk. 10 ng RNS-t denaturáltunk és 1% formaldehidgélben
HU 218 090 Β elektroforetizáltuk. Kíméletes alkalikus denaturálás után (50 mmol/1 NaOH, 30 percen keresztül) az RNS-t nitro-cellulóz szűrőre vittük át, konvektánsként ammónium-acetátot alkalmazva. A szűrőket a KGF-kódoló szekvencia 5’-végéről a 647 bp EcoRI fragmentumot tartalmazó 32P-jelzett cDNS-próbával (A) vagy egyéb növekedési faktor DN S-ekből származó hasonló próbával hibridizáltuk. Az alkalmazott humán sejttípusok az alábbiak: pikkelyessejt-karcinómák (A253, A388 és A431), emlőhámsejtek (S6 és RÍ), Adl2-SV40-nel konzervált keratinociták, elsődleges humán keratinociták, újszülött fitymafibroblasztok (AG1523), felnőtt bőrfibroblasztok (501T) és embrionális tüdőfibroblasztok (WI-38 és M426).
A II-3. ábrából látható, hogy a túlsúlyban lévő, 2,4 kb hosszúságú KGF transzkripciós termék az embrionális, újszülött és felnőtt hámszövetekből származó különféle vázfibroblaszt-sejtvonalak mindegyikében kimutatható, de a normális eredetű hámsejtvonalakból származókéban nem. A transzkripciós terméket kimutattuk a normális felnőtt veséből és gyomor-bél rendszeri szervekből extrahált RNS-ekben is, de a tüdőből vagy agyból extrahált RNS-ekben nem. A KFG RNS-expressziójának éles specificitása a hámszövetekből származó vázsejtekben azt jelzi, hogy ez a faktor természetes szerepet játszik a hámsejtszaporodás embrionális stimulálásában.
Összehasonlításként a hámsejtekre ismert módon ható egyéb növekedési faktorok mRNS-eit is analizáltuk a fent ismertetett szövetekben. A vizsgált hám- és vázsejtvonalak között az aFGF vagy bFGF transzkripciós termékének expressziójára nem találtunk következetes mintát (II-3. ábra). Az EGF transzkripciós terméke nem fejeződött ki ezekben a sejtvonalakban, csak a vesében lehetett kimutatni a különböző szövetek közül. Végül a TGFa transzkripciós terméket nem tudtuk kimutatni a vázfibroblaszt-sejtvonalak egyikében sem, de a hámsejtvonalak mindegyikében kifejeződött, különböző mértékben. A vizsgált szövetek közül alacsony koncentrációban a tüdőben is ki tudtuk mutatni (II—3. ábra).
KGF mitogénaktivitásának gátlása heparinnal
A heparinról kimutatták, hogy lényegesen fokozza az aFGF mitogénaktivitását számos célsejtben in vitro és azt, hogy stabilizálja azt hőinaktiválással szemben [Schrieber A. B., Kenny J., Kowalski W., Friesel J., Mehlman T. és Maciag T., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 6138-6142 (1985); Gospodarowicz O. és Cheng J., J. Cell Physiol., 128, 475-485 (1986)]. Viszont annak ellenére, hogy a bFGF-hez erősen kötődik, a heparin csak minimálisan befolyásolja annak mitogénaktivitását [Gospodarowicz O. és Cheng J., J. Cell Physiol., 128, 475-485 (1986)]. A KGF FGF-ekhez való hasonlósága miatt megvizsgáltuk a heparin hatását a KGF mitogénaktivitására, az alábbiak szerint. A sejteket mikrotitrálólemezbe helyeztük, szérumtartalmú tápközegben összefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztettük, majd a minta hozzáadása előtt 24-72 órán keresztül szérummentes tápközegben tartottuk. A mitogén hatás vizsgálatát az I. kísérleti részben ismertettük [lásd még Rubin J. S., Osada H., Finch P. W., Taylor W. G.,
Rudikoff S. és Aaronson S. A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), nyomdában]. A heparint tartalmazó mintákban a heparin végkoncentrációja 20 pg/ml. A növekedési faktorok koncentrációja minden esetben 50 ng/ml. Az eredmények a 3H-timidinbeépülés fokozódásának szorzószámát jelentik a megadott vizsgált sejtekben, heparin jelenlétében ( + ) vagy anélkül (-). Az egyes értékek két független kísérlet eredményének átlagát jelentik, amelyekben minden egyes pont két párhuzamos minta eredményének átlagát jelenti. A vizsgálati eredményeket a II -1. táblázatban ismertetjük.
II-1. táblázat
Heparin hatása a KGF mitogénaktivitására
Növekedési faktor BALB/MK NIH/3T3
+ - + -
KGF 150 9,5 <1 <1
aFGF 106 259 10,4 68
bFGF 30 124 45,7 70
A II-1. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a timidin KGF hatására való beépülését BALB/MK sejtekbe a heparin jelenléte a tápközegben 16-szorosan gátolta. Ezzel szemben ugyanezen kezelés mind az aFGF, mind a bFGF aktivitását fokozta.
Anti-KGF antitestek előállítása
A kísérleti immunológiában ismert módszerek alkalmazásával - amelyeket a módszerek ismertetésénél foglaltunk össze - különféle antitesteket állítottunk elő, amelyek képesek a KGF- vagy a KGF-szerű proteinek felismerésére. Ezek a következők: humán fibroblasztokból származó érintetlen, tisztított protein ellen egérben termelődött monoklonális antitestek; a KGF cDNS-szekvenciájából következtethető aminosavszekvenciával rendelkező szintetikus peptidek ellen nyúlban termelődött poliklonális antitestek; mind humán fibroblasztokból természetes úton kiválasztott KGF, mind E. coliban termelt rekombináns KGF (lásd alább) ellen nyúlban termelődött poliklonális antitestek.
Három különböző hibridómából származó monoklonális antitesteket tisztítottunk meg. Mind a három felismeri mind a rekombináns, mind a természetes úton kiválasztott KGF-et szilárd fázisú (ELISA) vizsgálatokban. Egyik sem ad keresztreakciót KGF-fel denaturáló körülmények között (Western biot analízissel), és egyik sem semlegesíti a KGF mitogénaktivitását BALB/MK biológiai tesztben.
A poliklonális antitesteket az NDMTPEQMATNVR szekvenciájú szintetikus pepiiddel állítottuk elő, amely szekvencia a KGF 32-44. aminosavmaradékának (lásd II-1. ábra) plusz egy R (arg) maradéknak felel meg, a cDNS által kódolt szekvenciában a 45. helyzetben ténylegesen álló asp maradék helyett. Az asp maradék valószínűleg glikozileződik a természetes KGFpolipeptidben, és ezért az ebből a polipeptidből közvetlenül kapott aminosavszekvenálási adatokban argininnek tűnik (lásd alább az eredmények kiértékelését).
HU 218 090 Β
A fenti szintetikus peptid ellen termelődött poliklonális antitestek mind a természetes, mind a rekombináns KGF-et felismerik ELISA- és Western biot analízisben, az érzékenység igen nagy; már kevés, legfeljebb 10 ng protein is detektálható. Ezek az antitestek azonban nem semlegesítik a KGF mitogénaktivitását BALB/MK biológiai tesztben.
Az érintetlen, természetes KGF-protein elleni poliklonális antiszérum mind ELISA-, mind Western biot analízisben felismeri a KGF-et. Az ilyen antitestek a KGF mitogénaktivitását is gátolják BALB/MK biológiai tesztben.
KGF cDNS-expressziója E. coliban
A polipeptid előállítására a KGF cDNS-t E. coliban expresszáltuk oly módon, hogy kódolószekvenciáját a trp és lac promoterek elemeit magában foglaló hibrid trk promoter kontrollja alá helyeztük a pKK233-2 plazmidban [Amman E. és Brosius J,, Gene, 40, 183 (1985)]. Ezt úgy végeztük, hogy az érett KGF- (azaz szignálszekvencia nélküli) molekula kódolására szükséges információt tartalmazó specifikus hosszúságú KGF cDNS-t PRC (polymerase chain reaction) technikával amplifikáltuk (megsokszoroztuk) [Sakai R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Nőm G. T., Erlich H. A. és Amheim N., Science, 230, 1350-1354 (1985)]. A fragmentumot irányítottan a vektor két helye, mégpedig az SÍ nukleázos emésztéssel tompa végűvé tett Ncol hely és a HindlII hely közé építettük be, standard rekombináns DNS-módszerek alkalmazásával. A szelektált rekombinánsokat cDNS-ük 5’-végén szekvenáltuk, az ATG iniciátorkodonnak a trk promoter szabályozó elemeivel való pontos összehangolásának biztosítására.
Számos rekombinánst megvizsgáltunk proteintermelés szempontjából a szokásos kis léptékű módszerekkel. Összefoglalóan, a kiónokat az exponenciális szaporodási fázis közepéig (OD595 - 0,5) tenyésztettük, izopropil-fi-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) 90 percen keresztül kezeltük, majd a sejteket SDS-poliakrilamidgélen elektroforetizáltuk Western biot analízishez. Az összes vizsgált rekombináns termelt olyan proteint, amelyet egy aminoterminális KGF peptid elleni antitestek felismertek. A további proteinanalízishez kiválasztottunk egy rekombinánst, amelyet az IPTG legerősebben indukált.
Egy liter, 50 pg/ml ampicillint és 12,5 pg/ml tetraciklint tartalmazó NZY tápközegben OD595 - 0,5 optikai sűrűség eléréséig tenyésztettük a baktériumokat, majd 90 percen keresztül IPTG-vel kezeltük. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, 0,2 mol/1 NaCl-ot tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,3) újraszuszpendáltuk és ultrahangos kezeléssel feltártuk a sejteket. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk, és a lizátumot közvetlenül heparin-Sepharose affinitási oszlopra vittük fel.
Western biot analízissel és keratinocitákban a mitogénaktivitás meghatározása szerint a rekombináns KGF 0,5-0,6 mol/1 NaCl-dal eluálódott. A HSAC-vel kapott anyag további tisztítása Mono-S (FPLC) oszlopon (Pharmacia) legalább 90% tisztaságú KGF-készítményt eredményezett, SDS-poliakrilamidgélen elektroforézissel és ezüstfestéssel végzett meghatározás szerint.
A rekombináns KGF hatékonyan stimulálta a timidin beépülését BALB/MK keratinocitasejtekbe, de alig mutatott aktivitást NIH/3T3 fibroblasztokra. Standard keratinocitabiológiai tesztben a BALB/MK sejtek maximális stimulálási félértékét 2-5 ng/ml koncentrációban kaptuk, míg az M426 sejtekből tisztított KGF-re ez a koncentráció 10-15 ng/ml volt. Egy liter baktériumsejt-tenyészetből mintegy 50 pg Mono-S-tisztított rekombináns KGF-et kaptunk.
KGF- és aFGF-szekvenciát tartalmazó kiméra előállítása
A fent ismertetett vizsgálatok azt mutatják, hogy a KGF két megkülönböztető jellemzővel rendelkezik, amelyet a polipeptidet kódoló szekvencia két egymástól elkülönülő szakasza vagy része határozhat meg, mint ahogy ez más többfunkciós polipeptidek kódolószekvenciájában ismert módon előfordul. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára egy kiméra DNS-t szerkesztettünk az alábbiak szerint, amely a KGF N-terminális szekvenciáját kódolja az aFGF C-terminális magjába olíva. A KGF cDNS 5’-végén a 78. és 79. maradékot (arg, illetve ile, lást II-1. ábrát) kódoló kodonok között a Sau3AI restrikciós enzim helyen elvágjuk a cDNS-t és az aFGF cDNS homológ helyével kapcsoljuk, a 39. maradékot (arg) és a 40. aminosavmaradékot kódoló kodonok között. A kapott kiméra DNS 3’- és 5’-végét a pKK233-2 plazmidvektor DNS-éhez kapcsoljuk, ugyanazzal a módszerrel, mint amelyet a polipeptid szekretált formáját kódoló KGF cDNS beépítésére használtunk (lásd a fent ismertetett módszert).
Ha a kimérát hordozó vektorral állítunk elő rekombináns E. coli sejteket, és az expresszió vizsgálatát az érett KGF-re fent ismertetett módon elvégezzük, egy új teiméket kapunk, amely mind a KGF, mind az aFGF tulajdonságaival rendelkezik. A peptidet heparin-Sepharose affinitási kromatográfiával dúsítottuk, és azt tapasztaltuk, hogy az keratinocita célsejtekkel szemben mutat főleg aktivitást a KGF-hez hasonlóan és minimális aktivitást fejt ki fibroblasztokra (NIH/3T3). A fenti kiméra polipeptid mitogénaktivitását azonban a heparin nem gátolja, amely tulajdonság inkább az aFGF-re, mint a KGF-re jellemző. Ténylegesen a keratinocitákra kifejtett mitogénaktivitás fokozódik a heparin hatására ugyanúgy, mint az aFGF esetében. Ennek megfelelően a célsejt-specificitásért és a heparinnal szembeni érzékenységért felelős peptidszakaszok világosan elkülönülnek és a KGF-ben egyszerűen szétválaszthatok egymástól, a találmány szerinti módszert alkalmazva.
Az eredményeket röviden az alábbiakban foglaljuk össze.
A II. kísérleti részben ismertetett kísérletek a találmány különféle alapvető megvalósítási módjait mutatják be. Ezek közé tartozik a KGF-et kódoló cDNS-ek izolálása, az ilyen cDNS-ek expresszálása rekombináns sejtekben, a KGF-fel reagáló különféle antitestek előállítása és egy új, mind a KGF, mind az aFGF aminosavszekvenciájával és azzal kapcsolatos funkcióival rendelkező növekedési faktort kódoló kiméra cDNS előállítá17
HU 218 090 Β sa és expresszálása. A fenti megvalósítási módokkal kapcsolatban az alábbiakat tartjuk érdemesnek kiemelni a találmány jobb megértése szempontjából.
A KGF cDNS-szekvenciából következtethető aminosavszekvencia megegyezik a humán fibroblasztok által kiválasztott KGF-tisztított formájának kísérletileg meghatározott aminosavszekvenciájával. Ezenkívül a szekvencia lehetséges magyarázatot nyújtott arra vonatkozóan is, hogy mely helyzetekben nem lehet közvetlen aminosavszekvenálással azonosítani az aminosavat. A cDNS szekvenciájából következtetve a 32. és 46. aminosavnak ciszteinnek kell lennie, de az Edmanlebontást követően nem mutathatók ki a módosítatlan ciszteinmaradékok hidrolizált származékai. A KGF következtetett aminosavszekvenciájában egy potenciális N-kötött glikozilezési hely is van, ami a 45-47. maradékból álló Asn-X-Ser/Thr. Ha a 45. Asn-maradék glikozilezve lenne, nem lehetne kimutatni az aminosavszekvenálásra itt alkalmazott módszerekkel. Valójában a KGF széles sávként vándorol a NaDodSO4/PAGE lemezen, a tisztított protein alapján várhatónál nagyobb móltömegnél. Ez a nagyobb móltömeg a glikozilezés következménye is lehet.
Az FGF-ek széles célsejt-specificitással rendelkező, heparint kötő mitogének [Thomas K., FASEB J., 1, 434-440 (1987)]. A hst gént mint transzformáló gént azonosították humán gyomordaganatból [Taira M., Yoshida T., Miyagawa K., Sakamoto H., Terada M. és Sugimara T., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 2980-2984 (1987)], szomszédos normális gyomorszövetből [Yoshida T., Miyagawa K., Odagiri H., Sakamoto H., Little P. F. R., Terada M. és Sugimara T., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7305-7309 (1987)] és Kaposi-féle szarkómából [Delli-Bovi P. és Basillico C., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 5660-5664 (1987)] standard NIH/3T3 transzfekciós vizsgálatokkal. Az int-2 gén terméke normális körülmények között egérembrió kifejlődése során expresszálódik [Jakobovits A., Shackleford C. M., Varmus Η. E. és Martin G. R., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 7806-7810 (1986)] és kórosan egéremlőtumor-virus provirális integrálódását követően [Peters G., Brookers S. és Dickson S., Cell, 33, 364-377 (1983)].
A KGF a fibroblasztnövekedési faktorcsalád [Zhan X., Bates B., Hu X. és Goldfarb M., Mól. Cell Bioi., 8, 3487-3495 (1988)] hatodikként azonosított tagja. Noha az FGF-6 elnevezés nem tűnik szerencsésnek, mivel a KGF nem hat fibroblasztokra, azért ez a név is használható erre az új növekedési faktorra, mivel ez mutatja az FGF családdal való szerkezeti rokonságát. Mivel az összes korábban jellemzett növekedési faktor vagy nem hat hámsejtekre mint célsejtekre, vagy számos egyéb érzékeny célsejt között szerepel a hámsejt is, a hámsejtekre kifejtett mitogénaktivitás nagy specificitása, és különösen a keratinociták érzékenysége a maga nemében egyedülállóvá teszi a KGF-et.
Az eddigi vizsgálatok szerint a KGF transzkripciós termék hámszövetekből származó vázsejtekre specifikusnak tűnik, amely a normális hámsejtproliferációban való szerepére enged következtetni. A KGF cDNSklón előállítása lehetővé teszi annak meghatározását, hogy ezen növekedési faktor abnormális expresszálása összefüggésbe hozható-e a hámsejtdiszpláziával és vagy -neopláziával jellemzett kóros állapotokkal. Ezenkívül az a tény, hogy ez az új növekedési faktor rekombináns módszerekkel nagy mennyiségben előállítható, lehetővé teszi klinikai alkalmazásának vizsgálatát olyan esetekben, amikor a hámsejtek specifikus szaporodása különös jelentőséggel bír.
A KGF-szekvencia és az FGF családba tartozó másik öt protein szekvenciája összehasonlításával két fő homológ régiót találtunk, amely a KGF következtetett szekvenciájában a 65-156. és a 162-189. aminosavakat foglalja magában, és ezeket egy rövid, nem homológ aminosavszekvencia választja el egymástól, amelynek hossza a család különböző tagjaiban változó [II-2. ábra; a két proteinrégiót, amelyben a homológia nagymértékű, befeketített területként ábrázoltuk; a bevonalkázott területek a feltételezett szignálszekvenciát jelentik; a két megőrződött ciszteinmaradék helyzetét (C) megjelöltük]. Az int-2 esetében ez a szekvencia 17 aminosavmaradékból áll, míg a hst esetében a két homológ régió összeér. A KGF-ben a közbeékelődött szekvencia öt aminosavmaradékból áll.
Az összehasonlított régiókban a KGF-aminosavszekvencia mintegy 44%-ban azonos az int-2 (egér), 39%-ban azonos a bFGF (humán), 37%-ban azonos az aFGF (humán) és 33%-ban azonos a hst (humán) szekvenciával. Ugyanebben a régióban mind a hat proteinben a maradékok 19%-a azonos, és a konzervatív szubsztitúciókat megengedve a homológia 28%.
A II—2. ábrán látható, hogy a fenti rokon proteinek aminoterminális szakaszai nem homológok és eltérő hosszúságúak. A primer KGF és a hst transzlációs termékek hidrofób N-terminális szakaszokat tartalmaznak, amelyek valószínűleg szignálszekvenciaként szolgálnak [von Heijne G., Nucl. Acids Rés., 14, 4683-4690 (1986)]. Az a tény, hogy ez az N-terminális szakasz az érett KGF-molekulából hiányzik (II-1. ábra B része), szintén alátámasztja ezt a feltételezést. Ezzel szemben az FGF-ek láthatólag szignálszekvencia nélkül szintetizálódnak [Thomas K., FASEB J., 1, 434-440 (1987)]. Az int-2 protein az N-terminális hidrofób maradékok szokatlanul rövid régióját tartalmazza [Moore R., Casey G.. Brooks S., Dixon M., Peters G. és Dickson C., EMBO J., 5, 919-924 (1986)], de ez nem ismert, ha a protein szekretálódik. Ezenkívül az int-2 protein hosszú C-terminális extenziót tartalmaz a család többi tagjához képest.
A tisztított KGF öt ciszteinmaradékot tartalmaz, amelyek közül kettő az FGF családba tartozó összes proteinben megőrződik (II—2. ábra). Figyelemre méltó az öt pár bázikus maradék is a KGF-szekvenciában. Ugyanez a séma megfigyelhető az FGF-családba tartozó többi proteinben is és valószínűleg szerepe van a heparinnal való kölcsönhatásukban [Schwarzbauer J. E., Tamkum J. M., Lemischka I. R. és Hynes R. O., Cell, 35, 42 i -431 (1983)]. A kétbázisos helyek szintén közös célpontok a proteolitikus folyamatokban, és az ilyen folyamatok felelősek lehetnek az egyes KGF-preparátumok18
HU 218 090 Β bán megfigyelhető mikroheterogenitásért (nem közölt adatok).
A KGF cDNS-szekvencia teljes hosszában, de különösen a nem transzlatált 3’-régióban AT-gazdag, ahol az AT-tartalom 70%, míg a feltételezett kódolószekvenciában 60% és a nem transzlatált 5’-régióban 63%. A nem transzlatált 3’-régió nagy számban tartalmaz ATTTA szekvenciát, amely feltételezetten az átmenetileg expresszált, instabil RNS-ek szelektív degradálódásában játszik szerepet [Shaw G. és Kamen R., Cell, 46, 659-667 (1986)]. Nincs klasszikus AATAAA poliadenilezési jel, csak két variáns szekvenciát, az AATTAA és AATACA szekvenciát lehetett kimutatni a poli(A)szekvenciától 24, illetve 19 nukleotidnyira 5’-irányban a cDNS 3’-végén [Bimsteil M. L., Busslinger M. és Strub K„ Cell, 41, 349-359 (1985)].
Feltételezték, hogy a heparin savas FGF-re kifejtett hatása vagy a növekedési faktor aktív konformációja stabilizálásának vagy a savas FGF-fel és annak receptorával való tercier komplex kialakulásának következménye [Schrieber A. B., Kenny J., Kowalski W., Friesel J., Mehlman T. és Maciag Z., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 6138-6142 (1985); Gospodarowicz O. és Cheng J„ J. Cell Physiol., 128,475-485 (1986)]. Ha ez igaz, akkor a heparin vagy a KGF olyan konformációját stabilizálhatja, amely nem olyan aktív, mint a szabad molekula, vagy egy erős komplexet alakít ki, amely nem képes hatékony kölcsönhatásba lépni receptorával.
Míg a KGF heparinkötő képessége az FGF-ekhez való szerkezeti hasonlóságát mutatja, a célsejt-specificitásban észlelt különbség a rokon mitogénekkel összehasonlítva igen jelentős. Az FGF-ek mind az embrionális mezodermális, mind a neuroektodermális eredetű, nem véglegesen differenciálódott sejtek többségének osztódását indukálják. A fibroblasztokon és a vaszkuláris belhámszöveteken kívül a mezodermális eredetű célsejtek közé tartoznak a mioblasztok, kondrociták és osteoblasztok tenyészetei is [Thomas K. A., Giminez-Gallego G., Trends Biochem. Soc., 11, 81-84 (1986)]. Az FGF-ek gliasztrocitákra és neuroblasztokra is mitogén hatást fejtenek ki [Gensburger C., Labourdette J. és Sensembrenner M., FEBS Lett., 217, 1-5 (1987)]. A Kaposi-féle szarkómából izolált (a hst-vei azonos) onkogén terméke szintén stimulálja a NIH/3T3 és a kapilláris belhámsejtek proliferációját [Delli-bovi P., Curatola A. M., Kern F. G., Greco A., Ittman M. és Basilico C., Cell, 50, 729-737 (1987)]. Ez idáig a KGF indukálta mitogenezist csak hámsejtekben lehetett kimutatni, és a detektálható aktivitás hiányát fibroblasztokban vagy belhámsejtekben szintén bizonyítottuk [lásd I. kísérleti részt fent és Rubin, J. S., Osada H., Finch P. W., Taylor W. G., Rudikoff S. és Aaronson S. A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1989), nyomdában]. Ezért valószínűnek tűnik, hogy a KGF az FGF-ektől eltérő sejtfelületi receptoron keresztül hat.
A KGF és az egyéb, FGF családba tartozó proteinek N-terminális szekvenciájában nincs jelentős mértékű homológia. Ezért a KGF-ből és az FGF-ek egyik tagjából kiméra molekulát szerkesztettünk annak meghatározására, hogy egyedül a KGF N-terminális régiója felelős-e a KGF maga nemében egyedülálló célsejt-specificitásáért. Az első ilyen rekombináns polipeptidszekvenciával végzett kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a KGF N-terminális régiója alapvetően kódolja a keratinocitákkal szembeni célsejt-specificitást, míg a KGF heparinnal szembeni érzékenysége a C-terminális mag régiójában van kódolva, amelyet az aFGF szekvenciájával helyettesítettünk. Ez az új KGF-szerű növekedési faktor előnyös lehet a klinikai gyakorlatban olyan esetekben, amikor hámsejtspecifikus növekedési faktort az antikoagulánsként szokásosan alkalmazott heparin jelenlétében kell adagolni. A kimérákkal végzett további vizsgálatok arra nézve is felvilágosítást adhatnak, hogy a C-terminális mag mely specifikus régióinak tulajdonítható a heparin eltérő hatása ezen faktorok biológiai aktivitására.

Claims (79)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált, glikozilezett vagy nem glikozilezett keratinocitanövekedési faktor (KGF) protein, amely (a) MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    H FLPM AIT aminosavszekvenciát, vagy (b) a fenti aminosavszekvencia egy részét, az N-terminális 31 aminosav nélkül, vagy (c) a fenti aminosavszekvenciától egy vagy több aminosav addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával különböző aminosavszekvenciát tartalmaz, amely protein BALB/MK keratinocitasejtek nagyobb mértékű stimulálását váltja ki NIH/3T3 fibroblasztok stimulálásához viszonyítva, ha EGF-hez, TGF-alfához, aFGF-hez és bFGF-hez hasonlítjuk, amelyet az egyes sejttípusokban a 3H-timidin maximális beépülésének százalékában mérünk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti KGF-protein, amelynek BALB/MK keratinocitasejtek maximális stimulálását kiváltó mennyisége kevesebb mint egyszeres stimulálást vált ki a háttérértékhez képest NIH/3T3 fibroblasztokban, ahol egyszeres definíció szerint a kezeletlen sejtekben mért háttér DNS-szintézist jelenti.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti KGF-protein, amelynek 5 n mol/1 mennyisége kevesebb mint egyszeres stimulálást vált ki a háttérértékhez képest NIH/3T3 fibroblasztok bán.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amelynek BALB/MK keratinocitasejtek maximális stimulálását kiváltó mennyisége az aFGF-fel vagy bFGF-fel stimulált NIH/3T3 fibroblasztok maximális timidinbeépülésének kevesebb mint X0-ét váltja ki.
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amelynek BALB/MK keratinocitasejtek maxi19
    HU 218 090 Β mális stimulálását kiváltó mennyisége az EGF-fel vagy TGF-alfával stimulált NIH/3T3 fibroblasztok maximális timidinbeépülésének kevesebb mint /„-ét váltja ki.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti KGF-protein, amelynek 1,0-3 nmol/1 mennyiségével kapott maximális stimulálás BALB/MK keratinocitasejtekben legalább kétszerese az azonos koncentrációtartományban bFGF-fel kapott értéknek.
  7. 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amelynek specifikus aktivitása legalább 3,4 χ 104 egység/mg protein, ahol az aktivitás 1 egysége azt a mennyiséget jelenti, amely BALB/MK keratinocitasejtekben a DNS-szintézis lehetséges maximális stimulálásának felét váltja ki.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely glikozilezett.
  9. 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely nem glikozilezett.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely a
    CNDMTPEQMATNVNCS
    SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
    CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
    NYNIMEIRTVAVGIVA1KGVESEF
    YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
    ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
    FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    HFLPMAIT aminosavszekvenciát tartalmazza.
  11. 11. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely a
    CNDMTPEQMATNVNCS
    SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
    CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
    NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
    YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
    ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
    FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    HFLPMAIT aminosavszekvenciától egy vagy több aminosav addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával különböző aminosavszekvenciát tartalmaz.
  12. 12. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely az
    MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
    VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
    SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
    CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
    NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
    YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
    ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
    FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    HFLPMAIT aminosavszekvenciától egy vagy több aminosav addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával különböző aminosavszekvenciát tartalmaz.
  13. 13. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely (i) a II-1. ábra B része szerinti aminosavszekvencia N-terminális részét tartalmazza, amely a II-1. ábra B része szerinti 32-64. aminosavak közül a KGF-protein hámsejtekre preferenciális mitogénaktivitásának biztosításához elegendő számú aminosavat tartalmaz (ii) egy C-terminális részhez kötve, amely a II-1. ábra B része szerinti 65-156. és 161-189. aminosavakat tartalmazza.
  14. 14. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely (i) a II-1. ábra B része szerinti aminosavszekvencia N-terminális részét tartalmazza, amely a II-1. ábra B része szerinti 32-64. aminosavak közül a KGF-protein hámsejtekre preferenciális mitogénaktivitásának biztosításához elegendő számú aminosavat tartalmaz (ii) egy C-terminális részhez kötve, amely a II -1. ábra B része szerinti 65-194. aminosavakat tartalmazza.
  15. 15. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely a II-1. ábra B része szerinti aminosavszekvencia egy részét tartalmazza, amely a II-1. ábra B része szerinti 32-78. aminosavak közül a KGF-protein hámsejtekre preferenciális mitogénaktivitásának biztosításához elegendő számú aminosavat tartalmaz.
  16. 16. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely a II-1. ábra B része szerinti aminosavszekvencia egy részét tartalmazza, amely a II-1. ábra B része szerinti 32-189. aminosavak közül a KGFprotein hámsejtekre preferenciális mitogénaktivitásának biztosításához elegendő számú aminosavat tartalmaz.
  17. 17. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely az
    MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
    VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
    SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
    CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
    NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
    YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
    ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
    FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    HFLPMAIT aminosavszekvencia egy részét tartalmazza.
  18. 18. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, amely az
    MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
    VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
    SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
    CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
    NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
    YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
    ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
    FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    HFLPMAIT aminosavszekvencia egy részéből áll.
  19. 19. Izolált, glikozilezett vagy nem glikozilezett keratinocitanövekedési faktor (KGF) protein, amely az MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
    HU 218 090 Β
    FVALNQKGIPVRGKK.TKKEQKTA HFLPM ΑΙΤ aminosavszekvencia egy részéből áll, amely rész keratinocitasejtekre mitogénaktivitással rendelkezik és aminoterminálisán tartalmazhat továbbá metionínt is.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti KGF-protein, amelynek specifikus aktivitása legalább 3,4xlO4 egység/mg protein, ahol az aktivitás 1 egysége azt a mennyiséget jelenti, amely BALB/MK keratinocitasejtekben a DNS-szintézis lehetséges maximális stimulálásának felét váltja ki.
  21. 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti KGF-protein, amely aminoterminálisán metionínt tartalmaz.
  22. 22. Gyógyászati készítmény, amely az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti legalább egy KGF-proteint tartalmaz.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, felhámsérülések gyógyulásának gyorsítására vagy javítására történő alkalmazásra.
  24. 24. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti KGFprotein, hámsejtek stimulálására történő alkalmazásra.
  25. 25. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti KGF-protein, felhámsérülések gyógyulásának gyorsítására vagy javítására történő alkalmazásra.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti KGF-protein bőr vagy szem helyi kezelésére történő alkalmazásra.
  27. 27. A 25. igénypont szerinti KGF-protein bőr helyi kezelésére történő alkalmazásra.
  28. 28. Kiméra protein, amely egyetlen polipeptidmolekulában tartalmazza az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti KGF-protein egy részét - amely a II-1. ábra B része szerinti aminosavszekvencia egy része, amely a II— 1. ábra B része szerinti 32-189. aminosavak közül a polipeptidmolekula hámsejtekre preferenciális mitogénaktivitásának biztosításához elegendő számú aminosavat tartalmaz - és a fibroblasztnövekedési faktorok családjába tartozó másik polipeptid legalább egy részét.
  29. 29. A 25. igénypont szerinti kiméra protein, amelyben a KGF-proteinből származó rész a II-1. ábra B része szerinti 32-78. aminosavak közül a polipeptidmolekula hámsejtekre preferenciális mitogénaktivitásának biztosításához elegendő számú aminosavat tartalmazó részt tartalmazza.
  30. 30. A 25. igénypont szerinti kiméra protein, amelyben a fibroblasztnövekedési faktor a savas fibroblasztnövekedési faktor (aFGF).
  31. 31. A 30. igénypont szerinti kiméra protein, amelyben az aFGF-ből származó rész az aFGF azon részében lévő aminosavaknak felel meg, amely a KGF heparinérzékenységért felelős szekvenciájával homológ.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti kiméra protein, amelyben a KGF-ből származó rész a II-1. ábra B része szerinti 32-78. aminosavakból álló szekvenciának és az aFGF-ből származó rész az aFGF 39. aminosavmaradékkal kezdődő C-terminális szekvenciájának felel meg.
  33. 33. Gyógyászati készítmény, amely a 28-32. igénypontok bármelyike szerinti kiméra proteint és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
  34. 34. A 28-32. igénypontok bármelyike szerinti kimé ra protein, heparin jelenlétében hámsejtek specifikus stimulálását igénylő állapotok kezelésére történő alkalmazásra.
  35. 35. A 28-32. igénypontok bármelyike szerinti kiméra protein, felhámsérülések gyógyulásának gyorsítására vagy javítására történő alkalmazásra.
  36. 36. A 28-32. igénypontok bármelyike szerinti kiméra protein, bőr vagy szem helyi kezelésére történő alkalmazásra.
  37. 37. Antitest, amely az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti KGF-proteinre specifikus.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti antitest, amely a humán KGF mitogénaktivitását semlegesíti.
  39. 39. A 37. igénypont szerinti antitest, amely poliklonális antitest.
  40. 40. A 37. igénypont szerinti antitest, amely monoklonális antitest.
  41. 41. A 37. igénypont szerinti antitest, amely az NDMTPEQMATNVR szekvenciájú pepiiddel reagál.
  42. 42. Gyógyászati készítmény, amely a 37. igénypont szerinti legalább egy antitestet és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
  43. 43. A 37-41. igénypontok bármelyike szerinti antitest, hámsejtek KGF általi stimulálásának specifikus gátlását igénylő állapotok kezelésére történő alkalmazásra.
  44. 44. Rekombináns DNS-molekula, amely keratinocitanövekedési faktor (KGF) proteint kódol, amely (a) MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
    H FLPM AIT aminosavszekvenciát, vagy (b) a fenti aminosavszekvencia egy részét, az N-terminális 31 aminosav nélkül, vagy (c) a fenti aminosavszekvenciától egy vagy több aminosav addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával különböző aminosavszekvenciát tartalmaz, amely protein BALB/MK keratinocitasejtek nagyobb mértékű stimulálását váltja ki NIH/3T3 fibroblasztok stimulálásához viszonyítva, ha EGF-hez, TGF-alfához, aFGF-hez és bFGF-hez hasonlítjuk, amelyet az egyes sejttípusokban a 3H-timidin maximális beépülésének százalékában mérünk.
  45. 45. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, amely olyan KGF-proteint kódol, amelynek BALB/MK keratinocitasejtek maximális stimulálását kiváltó mennyisége kevesebb mint egyszeres stimulálást vált ki a háttérértékhez képest NIH/3T3 fibroblasztokban, ahol egyszeres definíció szerint a kezeletlen sejtekben mért háttér DNS-szintézist jelenti.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, amely olyan KGF-proteint kódol, amelynek 5 nmol/1 mennyisége kevesebb mint egyszeres stimulálást vált ki a háttérértékhez képest NIH/3T3 fibroblasztokban.
    HU 218 090 Β
  47. 47. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, amely olyan KGF-proteint kódol, amelynek BALB/MK keratinocitasejtek maximális stimulálását kiváltó mennyisége az aFGF-fel vagy bFGF-fel stimulált NIH/3T3 fibroblasztok maximális timidinbeépülésének kevesebb mint X0-ét váltja ki.
  48. 48. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, amely olyan KGF-proteint kódol, amelynek BALB/MK keratinocitasejtek maximális stimulálását kiváltó mennyisége az EGF-fel vagy TGF-alfával stimulált NIH/3T3 fibroblasztok maximális timidinbeépülésének kevesebb mint %0-ét váltja ki.
  49. 49. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, amely olyan KGF-proteint kódol, amelynek 1,0-3 nmol/1 mennyiségével kapott maximális stimulálás BALB/MK keratinocitasejtekben legalább kétszerese az azonos koncentrációtartományban bázikus FGFfel kapott értéknek.
  50. 50. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, amely olyan KGF-proteint kódol, specifikus aktivitása legalább 3,4 χ 104 egység/mg protein, ahol az aktivitás 1 egysége azt a mennyiséget jelenti, amely BALB/MK keratinocitasejtekben a DNS-szintézis lehetséges maximális stimulálásának felét váltja ki.
  51. 51. A 44-50. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-molekula, amely a CNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT aminosavszekvenciát kódolja.
  52. 52. Rekombináns DNS-molekula, amely all. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  53. 53. Rekombináns DNS-molekula, amely a 12. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  54. 54. Rekombináns DNS-molekula, amely a 13. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  55. 55. Rekombináns DNS-molekula, amely a 14. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  56. 56. Rekombináns DNS-molekula, amely a 18. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  57. 57. Rekombináns DNS-molekula, amely a 19. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  58. 58. Rekombináns DNS-molekula, amely a 21. igénypont szerinti KGF-proteint kódolja.
  59. 59. Rekombináns DNS-molekula, amely a 28. igénypont szerinti kiméra proteint kódolja.
  60. 60. Rekombináns DNS-molekula, amely a 30. igénypont szerinti kiméra proteint kódolja.
  61. 61. Rekombináns DNS-molekula, amely a 31. igénypont szerinti kiméra proteint kódolja.
  62. 62. Rekombináns DNS-molekula, amely a 32. igénypont szerinti kiméra proteint kódolja.
  63. 63. Rekombináns DNS-molekula, amely a 44-62. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát és egy vektort tartalmaz.
  64. 64. A 63. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, amelyben a vektor egy plazmid, egy bakteriofágklónozó vektor, egy DNS-szekvenáló plazmidvektor, egy bakteriális génexpressziós vektor vagy egy emlősgén-expressziós vektor.
  65. 65. Rekombináns gazdasejt, amely egy 44-62. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
  66. 66. Rekombináns gazdasejt, amely egy 63. vagy 64. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmaz.
  67. 67. A 65. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, amelyben a sejt egy emlőssejt, egy rovarsejt, egy élesztősejt vagy egy baktériumsejt.
  68. 68. A 66. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, amelyben a sejt egy emlőssejt, egy rovarsejt, egy élesztősejt vagy egy baktériumsejt.
  69. 69. Eljárás az 1. igénypont szerinti KGF-protein előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, 65-68. igénypontok bármelyike szerinti sejtet a protein expresszálására alkalmas körülmények között tenyésztőközegben tenyésztünk.
  70. 70. A 69. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a KGF-proteint izoláljuk.
  71. 71. A 69. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS-molekula a natív KGF promoter DNS-étől eltérő promoter DNS-t tartalmaz a KGF-proteint kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolva.
  72. 72. A 71. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS-molekula a KGF-proteint kódoló natív DNS-t tartalmazza.
  73. 73. A 69-72. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt egy E. coli sejt.
  74. 74. Eljárás az 1 -21. igénypontok bármelyike szerinti KGF-protein vagy a 28-32. igénypontok bármelyike szerinti kiméra protein előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) a proteint tartalmazó első oldatot heparinnal érintkeztetjük a protein és a heparin kötődését biztosító körülmények között, (ii) a kapott heparin-protein komplexet az első oldatból elválasztjuk, és (iii) a heparin-protein komplexből a proteint disszociáltatjuk.
  75. 75. Eljárás KGF mRNS transzkripciós termék koncentrációjának meghatározására, azzal jellemezve, hogy (i) szövetekből vagy sejtekből mRNS-t izolálunk, (ii) az mRNS-t egy KGF-proteint kódoló DNS-próbához illesztjük, és (iii) a kapott DNS-RNS hibrid mennyiségét meghatározzuk.
  76. 76. Eljárás KGF-protein kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy (i) a testfolyadékból vagy szövetmintából származó polipeptideket egy 38. igénypont szerinti antitesttel reagáltatjuk, és (ii) a kapott antitest-polipeptid komplexet detektáljuk.
    HU 218 090 Β
  77. 77. Kompozíció, amely az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti KGF-proteint vagy a 28-32. igénypontok bármelyike szerinti kiméra proteint tartalmaz.
  78. 78. Eljárás hámsejtek növekedésének stimulálására in vitro, azzal jellemezve, hogy a hámsejtekhez egy ΊΊ.
    igénypont szerinti kompozíciót adunk hámsejtek stimulálását kiváltó mennyiségben.
  79. 79. A 78. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek keratinociták.
HU998/90A 1989-01-31 1990-01-30 Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására HU218090B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30428189A 1989-01-31 1989-01-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT58759A HUT58759A (en) 1992-03-30
HU218090B true HU218090B (hu) 2000-05-28

Family

ID=23175833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU998/90A HU218090B (hu) 1989-01-31 1990-01-30 Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

Country Status (22)

Country Link
US (8) US5707805A (hu)
EP (2) EP0555205B1 (hu)
JP (6) JP3298874B2 (hu)
KR (1) KR950012805B1 (hu)
AT (1) ATE197800T1 (hu)
AU (2) AU647732B2 (hu)
CA (2) CA2349875C (hu)
DE (2) DE69033668T2 (hu)
DK (1) DK0555205T3 (hu)
ES (1) ES2153816T3 (hu)
FI (1) FI114711B (hu)
GE (1) GEP20022681B (hu)
HU (1) HU218090B (hu)
IE (1) IE20020188A1 (hu)
LT (1) LT3472B (hu)
LU (1) LU91237I2 (hu)
LV (1) LV10284B (hu)
NL (1) NL300230I2 (hu)
NO (2) NO308312B1 (hu)
RU (1) RU2250213C2 (hu)
SG (1) SG46699A1 (hu)
WO (1) WO1990008771A1 (hu)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG46699A1 (en) 1989-01-31 1998-02-20 Jeffrey S Rubin DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
GB9203533D0 (en) * 1992-02-19 1992-04-08 Erba Carlo Spa Use of the conjugate between a fibroblast growth factor and a saporin in treating ocular pathologies
US5965530A (en) * 1993-03-26 1999-10-12 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
WO1994023032A1 (en) * 1993-03-26 1994-10-13 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
US7084119B2 (en) 1993-06-29 2006-08-01 Chiron Corporation Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
BR9407035A (pt) * 1993-06-29 1996-03-12 Chiron Corp Fragmento de fator de crescimento de queratinócitos conjugado composição terapêutica molécula de DNA vetor de expressão célula hospedeira processo para produzir fragmento de fator de crescimento de queratinócitos processo para cicatrização de ferimento e processo de tratamento de doença hiperproliferativa da epiderme
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
EP0785950B1 (en) * 1994-10-13 2003-04-16 Amgen Inc., Keratinocyte growth factor analogs
WO1996011950A1 (en) * 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Method of treating diabetes mellitus using kgf
US6008328A (en) * 1994-10-13 1999-12-28 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
IL147575A (en) * 1994-10-13 2004-05-12 Amgen Inc Method for purifying keratinocyte growth factors
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6077692A (en) * 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
ATE274056T1 (de) 1995-10-11 2004-09-15 Chiron Corp Kombination pdgf, kgf, igf und igfbp zur wundheilung
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
US20030144202A1 (en) * 1996-10-15 2003-07-31 Amgen Inc. Uses of keratinocyte growth factor-2
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
DE19716098A1 (de) * 1997-04-17 1998-10-22 Univ Ludwigs Albert Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden
US6228839B1 (en) 1997-12-19 2001-05-08 Emory University Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status
CA2316015A1 (en) * 1997-12-22 1999-07-01 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
WO1999041282A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor-2
US6335317B1 (en) 1998-04-10 2002-01-01 Emory University Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status
US7022683B1 (en) 1998-05-13 2006-04-04 Carrington Laboratories, Inc. Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation
US5929051A (en) * 1998-05-13 1999-07-27 Carrington Laboratories, Inc. Aloe pectins
US6313103B1 (en) 1998-05-13 2001-11-06 Carrington Laboratories, Inc. Pectic substance as a growth factor stabilizer
US6372494B1 (en) * 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US6783546B2 (en) 1999-09-13 2004-08-31 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6371984B1 (en) 1999-09-13 2002-04-16 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6395414B1 (en) 2000-02-11 2002-05-28 General Motors Corporation Staged venting of fuel cell system during rapid shutdown
US6376112B1 (en) 2000-02-11 2002-04-23 General Motors Corporation Controlled shutdown of a fuel cell
US6413662B1 (en) 2000-02-22 2002-07-02 General Motors Corporation Fuel cell system shutdown with anode pressure control
JP2001302691A (ja) * 2000-04-17 2001-10-31 Nichirei Corp ヒトｋｇｆに対する抗体
EP1357931A2 (en) * 2001-01-08 2003-11-05 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
HUP0303199A2 (hu) 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Eljárás T-sejt-epitópok azonosítására és csökkentett immunogenitású molekulák előállítására
US7494669B2 (en) 2001-02-28 2009-02-24 Carrington Laboratories, Inc. Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides
CA2457781A1 (en) * 2001-08-21 2003-02-27 Chiron Corporation Kgf polypeptide compositions
US7202066B2 (en) * 2002-01-29 2007-04-10 Carrington Laboratories, Inc. Combination of a growth factor and a protease enzyme
GB0206309D0 (en) * 2002-03-16 2002-05-01 Axordia Ltd Isolated cells
US20050074773A1 (en) * 2002-08-20 2005-04-07 Shimkets Richard A. Methods for diagnosing and treatment of conditions that alter phosphate transport in mammals
AU2005317166B2 (en) 2004-12-15 2009-09-10 Biovitrum Ab (Publ) Therapeutic formulations of keratinocyte growth factor
US20080119433A1 (en) * 2006-07-06 2008-05-22 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
PL2125878T3 (pl) * 2007-01-05 2013-08-30 Helix Biomedix Inc Krótkie, aktywne biologicznie peptydy do komórkowych i immunologicznych modulacji
WO2011008904A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Tabor Aaron T Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
US9682093B2 (en) 2012-03-30 2017-06-20 Charles R. Drew University Of Medicine And Science Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders
KR102277147B1 (ko) * 2017-12-13 2021-07-13 건국대학교 산학협력단 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096825A (en) * 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
US4444760A (en) * 1983-06-17 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor
US4473679A (en) 1983-12-12 1984-09-25 Borg-Warner Chemicals, Inc. Thermoplastic acrylic elastomers
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US4868113A (en) 1986-03-03 1989-09-19 Rorer Biotechnology, Inc. Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor
US4983679A (en) 1986-05-29 1991-01-08 E. I. Dupont De Nemours And Company β-(keto or sulfonyl)esters from reaction of silylketene acetal and acyl or sulfonyl compound
HU219883B (hu) 1988-03-17 2001-08-28 Novo-Nordisk A/S Heparinkötő proteinek, ezeket kódoló DNS és a proteineket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint eljárás ezek előállítására
SG46699A1 (en) 1989-01-31 1998-02-20 Jeffrey S Rubin DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
BR9407035A (pt) * 1993-06-29 1996-03-12 Chiron Corp Fragmento de fator de crescimento de queratinócitos conjugado composição terapêutica molécula de DNA vetor de expressão célula hospedeira processo para produzir fragmento de fator de crescimento de queratinócitos processo para cicatrização de ferimento e processo de tratamento de doença hiperproliferativa da epiderme
WO1996011950A1 (en) 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Method of treating diabetes mellitus using kgf

Also Published As

Publication number Publication date
EP1016716A3 (en) 2000-07-12
NL300230I2 (nl) 2006-09-01
NO972259D0 (no) 1997-05-16
AU684278B2 (en) 1997-12-11
US5707805A (en) 1998-01-13
DK0555205T3 (da) 2001-03-05
AU647732B2 (en) 1994-03-31
US5654405A (en) 1997-08-05
DE69033668D1 (de) 2001-01-04
NO972617D0 (no) 1997-06-06
US5741642A (en) 1998-04-21
AU5049690A (en) 1990-08-24
JP2000102396A (ja) 2000-04-11
ES2153816T3 (es) 2001-03-16
KR950012805B1 (en) 1995-10-21
US6833132B1 (en) 2004-12-21
HUT58759A (en) 1992-03-30
JP2001157594A (ja) 2001-06-12
JP2006149407A (ja) 2006-06-15
EP0555205B1 (en) 2000-11-29
EP1016716A2 (en) 2000-07-05
AU6598694A (en) 1994-09-08
EP0555205A1 (en) 1993-08-18
LTIP667A (en) 1995-01-31
JP3088983B2 (ja) 2000-09-18
JP3802329B2 (ja) 2006-07-26
NO972617L (no) 1997-06-06
GEP20022681B (en) 2002-04-25
SG46699A1 (en) 1998-02-20
JP2716416B2 (ja) 1998-02-18
DE122006000021I1 (de) 2006-07-13
JP3298874B2 (ja) 2002-07-08
KR910700257A (ko) 1991-03-14
IE20020188A1 (en) 2002-06-26
RU2250213C2 (ru) 2005-04-20
LT3472B (en) 1995-10-25
CA2349875A1 (en) 1992-09-16
JP3802292B2 (ja) 2006-07-26
EP0555205A4 (en) 1992-06-02
JPH10243800A (ja) 1998-09-14
CA2349875C (en) 2010-02-09
US5665870A (en) 1997-09-09
NO308310B1 (no) 2000-08-28
DE69033668T2 (de) 2001-04-12
LV10284B (en) 1995-04-20
NO972259L (no) 1997-05-16
US6420531B1 (en) 2002-07-16
NL300230I1 (nl) 2006-07-03
JPH08277227A (ja) 1996-10-22
WO1990008771A1 (en) 1990-08-09
ATE197800T1 (de) 2000-12-15
US5731170A (en) 1998-03-24
FI114711B (fi) 2004-12-15
CA2038398C (en) 2002-01-22
NO308312B1 (no) 2000-08-28
CA2038398A1 (en) 1992-09-16
LV10284A (lv) 1994-10-20
FI913637A0 (fi) 1991-07-30
LU91237I2 (fr) 2007-02-22
US6709842B1 (en) 2004-03-23
JPH04504415A (ja) 1992-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU218090B (hu) Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
Rubin et al. Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells.
Sano et al. Detection of high levels of heparin binding growth factor-1 (acidic fibroblast growth factor) in inflammatory arthritic joints.
DK169708B1 (da) Komplex sonde, DNA-sekvens, som hybridiserer med sonden, og som koder for en fysiologisk aktiv del af faktor VIII:C, og ekstrachromosomalt element indeholdende en sådan DNA-sekvens
CA2263890C (en) Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d)
NL8900178A (nl) Groei regulerende clycoproteinen.
SK43097A3 (en) Method for purifying keratinocyte growth factors
US20070253963A1 (en) Epithelial cell specific growth factor keratinocyte growth factor (KGF)
IE83398B1 (en) DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
AU641816B2 (en) Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
NO308309B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av et hovedsaklig rent keratinocyttvekstfaktor (KGF) protein
DD296700A5 (de) Verfahren zur herstellung einer fuer das amphiregulin-gen kodierenden nucleotidsequenz und von modifizierten zellen, welche diese nucleotidsequenz enthalten.