FI114711B - Epiteelisoluille spesifistä kasvutekijää koodittava DNA - Google Patents

Epiteelisoluille spesifistä kasvutekijää koodittava DNA Download PDF

Info

Publication number
FI114711B
FI114711B FI913637A FI913637A FI114711B FI 114711 B FI114711 B FI 114711B FI 913637 A FI913637 A FI 913637A FI 913637 A FI913637 A FI 913637A FI 114711 B FI114711 B FI 114711B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
kgf
protein
dna molecule
cell
cells
Prior art date
Application number
FI913637A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI913637A0 (fi
Inventor
Jeffrey S Rubin
Paul W Finch
Stuart A Aaronson
Original Assignee
Jeffrey S Rubin
Paul W Finch
Stuart A Aaronson
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23175833&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI114711(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Jeffrey S Rubin, Paul W Finch, Stuart A Aaronson filed Critical Jeffrey S Rubin
Publication of FI913637A0 publication Critical patent/FI913637A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI114711B publication Critical patent/FI114711B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

114711
Epiteelisoluille spesifistä kasvutekijää koodittava DNA
Keksinnön ala Tämä keksintö koskee kasvutekijöitä, erityisesti 5 polypeptidikasvutekijän eristämistä, joka on samankaltainen kuin tekijäryhmä, joka sisältää tunnettuja fibroblas-tikasvutekijöitä (FGFriä). Tämä keksintö koskee myös komplementaaristen! DNA-segmenttien (cDNA-segmenttien) konstruoimista tätä uutta kasvutekijää koodittavasta lähetti-10 RNA:sta (mRNA:sta). Lisäksi tämä keksintö koskee mainitunlaisten DNA-segmenttien tuotteiden syntetisoimista yhdis-telmäsolujen kautta ja tätä kasvutekijää koodittavien DNA:iden identifioinnin ja kloonauksen mahdollistamien tiettyjen muiden uusien tuotteiden valmistusta ja käyttöä.
15 Tässä hakemuksessa käytetyt lyhenteet aFGF hapan fibroblastikasvutekijä bFGF emäksinen fibroblastikasvutekijä EGF epidermaalinen kasvutekijä HSAC hepariini-Sepharoseaffiniteettikromato- 20 grafia ke kiloemäs * '* kD kilodalton » >
* I
.* KGF keratinosyyttikasvuteki j ä ·.,· NaDodS04/PAGE natriumdodekyylisulfaatti (SDS-) poly- * » a | 25 akryyliamidigeelielektroforeesi RP-HPLC käänteisfaasisuurtehonestekromatograf ia ;* TGFo; transformoiva kasvutekijä a.
Keksinnön tausta
Kasvutekijät ovat tärkeitä solujen välisen kommu- *!!! 3 0 nikoinnin välittäjiä. Näitä tehokkaita molekyylejä erittää • · yleensä yksi solutyyppi ja ne vaikuttavat muiden solutyyp-· pien prol if eräät ioon (katso viite 1-1 jäljempänä kokeelli- : sessa osassa I). Kiinnostusta kasvutekijöihin ovat lisän neet todisteet niiden mahdollisesta osallistumisesta kas- • · * • · # .’I! 35 vainten kehittymiseen (viite II-2, Kokeellinen osa II).
• » • · *** Simian-sarkoomaviruksen transformoiva geeni v-sis koodit- 114711 2 taa proteiinia, joka on homologinen verihiutaleista peräisin olevan kasvutekijän B-ketjulle (1-1, 1-2) . Lisäksi joukko onkogeenejä on kasvutekijäreseptoreja koodittavien geenien homologeja (1-1) . Niinpä lisääntynyt tietämys kas-5 vutekijöistä ja niiden reseptorivälitteisistä signaalien transduktioreiteistä antaa todennäköisesti syvempää tietoa sekä normaalien että pahanlaatuisten solujen kasvumekanis-meista.
Yhteen tunnettuun ryhmään kasvutekijöitä, jotka 10 vaikuttavat sidekudossoluihin, kuuluvat hapan fibroblasti-kasvutekijä (aFGF), emäksinen kasvutekijä (bFGF) ja niille sukua olevat hst- ja int-2-onkogeenien tuotteet.
Lisäksi on tunnettua, että joillakin kasvutekijöillä, mukaan luettuina seuraavat, on hepariinia sitovia 15 ominaisuuksia: aFGF (1-20, 1-21); bFGF (1-19, 1-20); gra- nulosyytti/makrofagipesäkestimulointitekijä (I — 1); inter-leukiini 3 (1-3) . Kutakin näistä polypeptiditekijöistä tuottavat stroomasolut (1-1, 1-2, 1-25). Tällaiset tekijät näyttävät kerääntyvän solun ulkopuoliseen matriksiin tai 20 stroomasolujen pintaa peittäville proteoglykaaneille (1-1, 1-25) . On väitetty, että tämä vuorovaikutus säätelee nii- • '* den varastoitumista, vapautumista ja kontaktia spesifisten β * ; : kohdesolujen kanssa (1-25, 1-28).
On kuitenkin laajasti tunnustettua, että ehdotto- * « » | ’ : 25 masti suurin osa ihmisten pahanlaatuisista sairauksista on ; · lähtöisin epiteelikudoksista (1-5) . On kuvattu alkeistuki- *. kudoksista peräisin olevia epiteelisolujen proliferaation aikaansaavia aineita (1-1, 1-2, 1-3), niiden molekyylien identiteettejä ja rakenteita ei kuitenkaan ole selvitetty.
[ '. 30 Tällaisia epiteelisoluihin vaikuttavia alkeistuki- kudoksen kasvutekijöitä koskevien tietojen puutteellisuu-' den valossa on ilmeistä, että on ollut tarve saada aikaan : menetelmiä, koostumuksia ja biologisia määrityksiä, jotka parantaisivat epiteelisolujen proliferaation säätelymeka- /·! 35 nismien ymmärtämistä ja analysointia, ja viime kädessä 114711 3 niihin osallistuviin tekijöihin perustuvia uusia diagnostisia tuotteita ja hoitoja.
Tämän keksinnön ajatuksen mukaisesti käytetään proteiinien eristysmenetelmiä ja yhdistelmä-DNA-tekniikkaa 5 tällaisten tarpeiden täyttämiseen ja keinojen kehittämiseen sellaisten alkeistukikudosperäisten proteiinitekijöi-den tuottamiseksi, jotka näyttävät liittyvän epiteelisolujen proliferaatioprosesseihin ja joita ei voitaisi muuten tuottaa. Tämän keksinnön ajatuksen mukaisesti sovelletaan 10 myös näiden epiteelisolujen kasvuprosesseihin liittyvien tekijöiden molekulaarisia mekanismeja.
Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö koskee proteiinien eristyksen ja yh-distelmä-DNA-tekniikan kehitysaskeleita, joihin kuuluu 15 epiteelisoluihin vaikuttavien, muita peptiditekijäitä sisältämättömien uusien kasvutekijäproteiinien tuotanto. Keksinnön piiriin kuuluu myös uusia DNA-segmenttejä ja biologisia määritysmenetelmiä.
Tämä keksintö koskee erityisesti uutta proteiinia, 20 jolla on happaman fibroblastikasvutekijän (aFGF), emäksisen fibroblastikasvutekijän (bFGF) ja niille sukua olevat : ’* hst- ja int-2-onkogeenien tuotteet sisältävän tunnetun ; *,* kasvutekijäryhmän tunnusmerkillisiä rakenteellisia ja/tai toiminnallisia ominaisuuksia. Tässä FGF-polypeptidiryhmän 25 uudessa jäsenessä ovat tallella FGF:ien hepariininsito- • « ·;··· misominaisuudet, mutta sille on kehittynyt ainutlaatuinen kohdesoluspesifisyys. Tämä kasvutekijä näyttää olevan spesifinen epiteelisolujen suhteen ja on erityisen aktiivinen kerätinosyyttien suhteen. Siksi tämä uusi tekijä on nimet-'! ! 30 ty "keratinosyyttikasvutekijäksi" (KGF) . Huolimatta aktii- visuuden puuttumisesta fibroblastien suhteen KGF:ää voi-V · daan kutsua myös FGF-6:ksi, sillä se on FGF- : polypeptidiryhmän kuudes tunnettu jäsen.
Niinpä osa tästä keksinnöstä koskee puhdistettua 35 KGF:ää tai KGF:n kaltaisia proteiineja ja menetelmiä näiden proteiinien valmistamiseksi. Tällaisia puhdistettuja 4 114711 tekijöitä voidaan valmistaa viljelemällä ihmissoluja, jotka luonnostaan erittävät näitä proteiineja, ja käyttämällä tämän keksinnön käytännön puolen mukaisia eristysmenetel-miä. Näitä proteiineja voidaan käyttää biokemiallisiin ja 5 biologisiin tutkimuksiin, jotka johtavat esimerkiksi KGF-tai KGF:n kaltaisia polypeptidejä koodittavien DNA-segmenttien eristämiseen.
Tämä keksintö koskee myös mainitunlaisia DNA-segmenttejä, jotka koodittavat KGF- tai KGF:n kaltaisia pro-10 teiineja. Keksinnön yksi pääsuoritusmuoto koskee KGF:lie sukua olevia tuotteita koodittavia DNA-segmenttejä, joita ovat seuraavat: ihmisen cDNA-kloonit 32 tai 49, jotka on johdettu ihmissikiön keuhkotibroblastisolulinjasta M426 eristetystä polyadenyloituneesta RNA:sta; näiden kloonien 15 muodostamat yhdistelmät ja mutantit; ja niille sukua olevat DNA-segmentit, jotka voidaan detektoida minkä tahansa edellä mainitun ihmis-DNA-segmentin kanssa tapahtuvan hyb-ridisaation perusteella ja jotka koodittavat KGF:n kaltaisia proteiineja tai niiden osia.
20 Tämän keksinnön yhdessä käytännön suoritusmuodossa keksinnön mukaisilla DNA-segmenteillä on kyky ilmentyä sopivissa isäntäsoluissa ja tuottaa siten KGF:ää tai KGF:n * kaltaisia proteiineja. Keksintö koskee myös mRNA:ita, joi- > ta syntyy tämän keksinnön mukaisten DNA-segmenttien koo- 25 dittavien säikeiden transskription seurauksena.
* Keksinnön yksi toinen suoritusmuoto koskee yhdis-telmä-DNA-molekyyliä, joka käsittää vektorin ja tämän keksinnön mukaisen DNA:n. Näistä yhdistelmämolekyyleistä ovat esimerkkejä molekyylit, jotka käsittävät KGF-cDNA:n ja ' ! 30 minkä tahansa seuraavista vektori-DNA:ista: bakteriofagi- i » * » λ-kloonausvektori (esimerkiksi XpCEV9); DNA-sekventointi-v ‘ plasmidivektori (esimerkiksi jokin pUC-variantti); baktee- ^ rigeeni-ilmentymisvektori (esimerkiksi pKK233-2) ,- tai ni- ' -t säkäsgeeni-ilmentymisvektori (kuten pMMT) .
• i » ,'i; 35 Keksinnön yksi lisäsuoritusmuoto koskee solua, edullisesti nisäkässolua, joka on transformoitu keksinnön 5 114711 mukaisella DNA:11a. Lisäksi keksintö koskee soluja, mukaan luettuina hyönteissolut, hiivasolut ja bakteerisolut, kuten Escherichia coli- ja B. subtilis -solut, jotka on transformoitu keksinnön mukaisella DNA:11a. Keksinnön tä-5 män puolen yhden toisen suoritusmuodon mukaisesti transformoivalla DNA:11a on kyky ilmentyä solussa ja suurentaa siten solussa tämän DNA:n koodittaman KGF- tai KGF:n kaltaisen proteiinin määrää.
cDNA-sekvenssistä ennustettu pääasiallinen KGF-10 translaatiotuote sisältää N-terminaalisen hydrofobisen alueen, joka toimii todennäköisesti erityssignaalisekvens-sinä ja jota ei ole läsnä valmiissa KGF-molekyylissä. Tämän keksinnön geeni-ilmentymispuolen edullisimmassa suoritusmuodossa keksinnön mukaisella DNA:11a transformoitu so-15 lu erittää mainitun DNA:n koodittaman proteiinin (typistetyssä) muodossa, jota erittävät ihmissikiön keuhkofibro-blastisolut.
Vielä lisäksi tämä keksintö koskee KGF- tai KGF:n kaltaisia proteiineja, joita tuotetaan keksinnön mukaisen 20 DNA:n ilmentymisen tai keksinnön mukaisen RNA:n translaation kautta. Nämä proteiinit ovat edullisesti erittyneessä · muodossa (ts. niistä puuttuu ilmeinen signaalisekvenssi) .
• V Näitä proteiinitekijöitä voidaan käyttää toimintatutkimuk- : siin ja puhdistaa lisärakenne- tai -toiminta-analyysejä, 25 kuten kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia reseptorisitou- • } ·; | tumismäärityksiä, varten.
. Lisäksi kyky tuottaa suuria määriä tätä uutta kas- i vutekijää yhdistelmä-DNA-menetelmin antaa mahdollisuuden testata sen kliininen käyttökelpoisuus tilanteissa, joissa *! \ 30 epiteelisolujen kasvun spesifinen stimulointi on erityisen tärkeää. Niinpä tämän keksinnön piiriin kuuluu KGF- tai : KGF: n kaltaisia polypeptide j ä käsittäviä farmaseuttisia koostumuksia, jotka on tarkoitettu käytettäviksi mainitunlaisten tilojen hoitoon, mukaan luettuna esimerkiksi palo-: 35 vammojen parantaminen tai siirretyn sarveiskalvokudoksen stimulointi.
6 114711
Keksinnön tämän suoritusmuodon mukaan uudet KGF:n kaltaiset proteiinit ovat keksinnön mukaisten "muuntamat -tornien" DNA:iden ja mRNAriden proteiinituotteita tai muunnettuja tai geeniteknisin menetelmin aikaansaatuja prote-5 iinituotteita. DNA-sekvensseissä aiheutettujen mutaatioiden seurauksena muunnettujen KGF:n kaltaisten proteiinien aminohapposekvenssissä on yksi tai useampia eroja vastaaviin luonnossa esiintyviin "villin tyypin" proteiineihin nähden. Tämän keksinnön tämän puolen yhden suoritusmuodon 10 mukaisesti muunnettuihin KGF:n kaltaisiin proteiineihin kuuluvat "kimeeriset" molekyylit, jotka sisältävät segmenttejä KGF:n ja vähintään yhden toisen FGF-peptidiryhmän jäsenen aminohapposekvensseistä.
Kun tunnetaan tulokset, joita on saatu analogisil-15 la menestyksellisillä lähestymistavoilla muiden ominaisuuksiltaan samankaltaisten peptiditekijoiden suhteen, pitäisi mainitunlaisten kimeeristen KGF .-n kaltaisten poly-peptidien kehittämisen lopulta johtaa KGF:n kaltaisten peptidien parempiin "toisen sukupolven" muotoihin kliini-20 siä tarkoituksia varten. Nämä muunnetut KGF:n kaltaiset tuotteet saattaisivat olla esimerkiksi pienempiä, stabii- • · • '· limpia, tehokkaampia ja/tai helpompia tai halvempia val- j V mistaa.
: : : Tämä keksintö koskee lisäksi uusia biologisia mää- 25 ritysmenetelmiä mRNA: iden ihmissoluissa tapahtuvan ilmen-tymisen ja keksinnön mukaisiin DNA-segmentteihin liitty-vistä geeneistä syntyneiden proteiinien määrittämiseksi. Yhden tällaisen suoritusmuodon mukaisesti tämän keksinnön mukaisia DNA:itä voidaan käyttää koettimina niihin liitty-;y 30 vien mRNA:iden induktion stationaaritasojen tai kinetiikan *·;·* määrittämiseksi. KGF: ään liittyvien cDNA-kloonien saata- : : : vuus antaa mahdollisuuden määrittää, liittyykö tämän kas- vutekijän epänormaali tuotanto kliinisiin tiloihin, joille on tunnusmerkillistä epiteelisolujen liikakasvu, mukaan t « < ;;; 35 luettuina dysplasia ja neoplasia (esimerkiksi psoriasis ’···* tai pahan- tai hyvänlaatuiset epiteelikasvaimet) .
7 114711 Tämä keksintö koskee myös uusia vasta-aineita, joita on valmistettu tämän keksinnön mukaisen DNA-segmentin koodittamaa peptidiä vastaan. Keksinnön tässä suoritusmuodossa vasta-aineet ovat alkuperältään monoklonaa-5 lisiä tai polyklonaalisia, ja niitä muodostetaan käyttämällä luonnon, yhdistelmä-DNA- tai synteettisistä lähteistä saatuja KGF:lie sukua olevia polypeptidejä.
Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet sitoutuvat spesifisesti KGF- tai KGF:n kaltaiseen proteiiniin, joka 10 sisältää mainitunlaisen peptidin sekvenssin, edullisesti proteiinin ollessa luonnossa esiintyvässä (biologisesti aktiivisessa) konformaatiossaan. Näitä vasta-aineita voidaan käyttää KGF:n detektointiin tai puhdistukseen, tai vasta-aineita voidaan käyttää KGF- tai KGF:n kaltaisten 15 proteiinitekijoiden detektointiin tai puhdistukseen. Kek sinnön tämän puolen edullisimmassa suoritusmuodossa vasta-aineet kumoavat KGF:n kasvua edistävän aktiivisuuden ja mahdollistavat siten mekanismitutkimukset ja viime kädessä sellaisten kliinisten tilojen hoidon, joihin liittyy liian 20 korkea KGF-pitoisuus.
Piirustusten lyhyt kuvaus • · ; · Kuvio 1 esittää ihmissikiön fibroblasteista M426
• t I
| saadun säädetyn alustan hepariini-Sepharose-affiniteetti- : .* kromatografiän tuloksia. Noin 150 ml ultrasuodatusreten- 25 taattia, joka oli peräisin litroista säädettyä M426-.n • i alustaa, lisättiin hepariini-Sepharose-kolonnille (kerrok-sen tilavuus 6 ml) tunnin aikana. Kun kolonni oli pesty * tasapainotuspuskurilla (150 ml) , joka sisälsi 20 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5, ja 0,3 mol/1 NaCl:a, pidättynyt prote-30 iini (<5 % retentaatin kokonaisproteiinista) eluoitiin ’;·* muunnetulla lineaarisella gradientilla, jossa NaCl-pitoi- : : : suus kasvoi. Fraktion koko oli 3,8 ml ja virtausnopeus gradienttieluoinnin aikana 108 ml/h. 2 μΐ merkittyjä fraktioita siirrettiin mikromaljan syvennyksiin, joiden sisäl-35 lön lopullinen tilavuus oli 0,2 ml, H-tymidiinin sisälly- *···* tyksen määrittämiseksi BALB/ MK-soluissa osassa Menetelmät 8 114711 kuvatulla tavalla. Tulokset osoittavat, että yli 90 % mi-togeenisesta aktiivisuudesta hiiren keratinosyyttien (BalB/MK) suhteen eluoitui NaCl-liuoksella (0,6 mol/1).
Kuvio 2 valaisee tuloksia, jotka saatiin puhdis-5 tettaessa edelleen ihmisen fibroblasteista saatua mitogee-nia käyttämällä adsorptiivisella matriksilla varustettua HPLC:tä. Kuva A esittää BALB/MK-mitogeeniaktiivisuuden käänteisfaasi - (C4) -HPLC-käyrää. Kuva B esittää kuvassa A esitetystä C4-kromatografiästä otettujen valittujen frak-10 tioiden elektroforeettista (NaDodS04/PAGE) analyysiä ja osoittaa, että HPLC-huippufraktiot sisälsivät yhden vyöhykkeen hopealla värjätyllä geelillä. Kuva C on pylväsdiagrammi, joka esittää kuvassa B analysoiduilla fraktioilla laukaistua DNA-synteesiä BALB/MK-soluissa ja osoittaa, et-15 tä suhteellinen mitogeeninen aktiivisuus korreloi hyvin proteiinivyöhykkeen intensiteetin kanssa aktiivisuuskäyrän alueella. Yksityiskohtaisemmin kuviossa esitetään (A) BALB/MK-mitogeeniaktiivisuuden käänteisfaasi-C4-HPLC. Aktiiviset fraktiot, joitka eluoituivat hepariini-Sepharo-20 sesta NaCl-pitoisuudella 0,6 mol/1, käsiteltiin Centricon- 10-laitteella ja laitettiin suoraan C4-Vydac-kolonnille : '· (4,6 x 250 mm), joka oli tasapainotettu 0,1 % trif- j V luorietikkahappoa ja 20 % asetonitriiliä (ACN) sisältäväl- lä liuoksella. Kun kolonni oli pesty eluointipuskurilla ·*·’: 25 (4 ml) , näyte eluoitiin muunnetulla lineaarisella gradien- ·;·· tiliä, jossa ACN-pitoisuus kasvoi. Fraktioiden koko oli 0,2 ml ja virtausnopeus 0,5 ml/min. Näytteet 3H-tymidiinin sisällytyksen määrittämiseksi BALB/MK-soluissa laimennettiin heti 10-kertaiseen tilavuuteen liuoksella, joka si'll! 30 sälsi 50 Mg/ml naudan seerumialbumiinia ja 20 mmol/1 • » • ·
Tris-HCl:a, pH 7,5, ja testattiin laimennettuina 200-ker-ί.ί · täiseen lopputilavuuteen. (B) Kuvassa A esitetystä C4- : kromatograsiasta saatujen valittujen fraktioiden NaDod- S04/PAGE-analyysi. Puolet kustakin fraktiosta kuivattiin, !!! 35 liuotettiin uudelleen NaDodS04: iin/2 -merkaptoetanoliin, *·* denaturoitiin lämmöllä ja käsiteltiin elektroforeettisesti 9 114711 14-%:isessa polyakryyliamidigeelissä, joka sitten värjättiin hopealla. Kunkin moolimassamarkkerin (massa kD:ina) asema osoitetaan nuolella. (C) Kuvassa B analysoitujen fraktioiden laukaisema DNA-synteesi BALB/MK-soluissa. Ak-5 tiivisuus ilmoitetaan stimulaation suhteena tausta-arvoon, joka oli 100 pulssia/min.
Kuvio 3 esittää yhtä RP-HPLC:lle vaihtoehtoista puhdistusvaihetta, jossa käytetään seulontakromatografiaa, joka tehdään eluoimalla kolonni (TSK G300SW GlasPac) lä-10 hellä fysiologista pH:ta olevalla vesiliuoksella, ja joka johti suureen mitogeeniaktiivisuuspiikkiin biologisessa BALB/MK-määrityksessä. Tarkemmin kuvio esittää BALB/MK-mi togeeni akti ivisuuden molekyyli seulonta-HPLC-Kromatogra-fiaa (TSK 3000SW) . Noin 50 μΐ Centricon-käsiteltyä 15 HSAC:sta saatua 0,6 mol/1 NaCl-liuoksella eluoituneiden fraktioiden yhdistelmää laitettiin LKB GlasPak TSK G3000SW -kolonnille (8 x 300 mm) , joka oli ennalta tasapainotettu 20 mmol/1 Tris-HCl:a (pH 6,8) ja 0,5 mol/1 NaClra sisältävällä liuoksella, ja eluoitiin 0,2 ml:n 20 fraktioina virtausnopeudella 0,4 ml/min. 2 μΐ-.η näytteet siirrettiin mikromaljan syvennyksiin, joissa lopputilavuus : oli 0,2 ml, 3H-tymidiinin sisällytyksen määrittämiseksi • · ' • *,· BALB/MK-soluissa. Moolimassamarkkerien (massa kD:ina) elu- .* : oitumisasemat on osoitettu nuolilla.
• i » 25 Kuvio 4 valaisee TSK-puhdistetulla mitogeenilla • t ·;··; aikaansaatua BALB/MK-DNA-synteesivastetta verrattuna muil- la kasvutekijöillä aikaansaatuun vasteeseen. 3H-tymidiinin sisällytys trikloorietikkahappoon liukenemattomaan DNA:hän ilmoitettuna stimulaation suhteena tausta-arvoon, mitat- *111 30 tiin ilmoitettujen kasvutekijöiden pitoisuuden funktiona.
« » *·;’ Ilman lisättyä näytettä mitatut tausta-arvot olivat - 150 pulssia/min. Tulokset edustavat kahden riippumattoman kokeen keskiarvoja. Rinnakkaismääritysten tulokset poikke- • · · sivat kussakin kokeessa korkeintaan 10 % keskiarvosta.
35 TSK-puhdistettu mitogeeni, .-EGF, A-A; aFGF, .- ’···* bFGF, o-o.
10 114711
Kuviossa 5 verrataan BALB-MK-solujen kasvuvastetta erilaisiin kasvutekijäyhdistelmiin kemiallisesti määritellyssä alustassa reaktiona erilaisiin kasvutekijäyhdistelmiin. Viljelmät siirrostettiin tiheyteen 2,5-104 so-5 lua/malja 35 mm:n petrimaljoille, jotka oli ennalta päällystetty poly-D-lysiinillä/fibronektiinillä seoksessa, joka sisälsi suhteessa 1:1 Eaglen minimialustaa ja Hamin F12-alustaa ja oli täydennetty transferriinillä, Na2Se03:llä, etanoliamiinilla ja jäljempänä ilmoitetta-10 villa kasvutekijöillä. Maljat kiinnitettiin ja värjättiin Giemsalla 10 vrk:n kuluttua. Selitykset: a) ei kasvueki-jöitä; b) pelkkä EGF, c) pelkkä insuliini; d) pelkkä KGF; e) EGF + insuliini. Kasvutekijöiden loppupitoisuudet olivat seuraavat: EGF, 20 ng/ml; insuliini, 10 Mg/ml; KGF, 15 40 ng/ml.
Taulukossa 1-1 esitetään yhteenveto erilaisten puhdistusvaiheiden tuloksista, ja se osoittaa, että seu-lontakromatografiällä saatiin paljon parempi aktiivisuus-saanto kuin adsorptiivisella RP-HPLC:llä.
20 Taulukossa 1-2 esitetään tietoja erilaisten kasvu tekijöiden kohdesoluspesifisyydestä, ja se osoittaa, että i ’ juuri eristetyllä tekijällä oli voimakas mitogeeninen vai-
• · I
• ‘,ί kutus kerätinosyytteihin (BALB/MK) ja, täysin päinvastai- : : : sesti, sillä ei ollut havaittavissa olevia vaikutuksia ih- * · · 25 misen jalkavarren laskimon endoteelisolujen fibroblastei- • » ····.' hin.
• >
Kuvio 6 esittää KGF-cDNA:n nukleotidisekvenssiä ja * siitä pääteltyä aminohapposekvenssiä samoin kuin KGF- geenistä kopioitujen RNA:iden identifiointia. Kuva A on 'li; 3 0 kaavioesiys ihmisen KGF-cDNA-klooneista. Kuva B esittää • « *;** KGF-cDNA-nukleotidi- ja ennustettua aminohapposekvenssiä.
l/· ' C: KGF-geenien RNA-transskriptien identifiointi Northern- täpläanalyysillä. Tarkemmin kuviossa esitetään: (A) Kaa- • · · viomainen esitys ihmisen KGF-cDNA-klooneista. Osittain • · · • · · !!! 35 päällekkäiset pCEV9-kloonit 32 ja 49, joita käytettiin i · *** sekvenssin määrittämisessä, esitetään koko rakennetta ku- 11 114711 vaavan kaavion yläpuolella, jossa kaaviossa transloitumat-tomat alueet on merkitty viivalla ja koodattava sekvenssi laatikolla. Varjostettu alue tarkoittaa signaalipeptidin ja valmiin proteiinin avoimen alueen sekvenssejä. Näkyviin 5 on merkitty valittuja restriktiokohtia. (B) KGF-cDNA- nukleotidi- ja ennustetut aminohapposekvenssit. Nukleotidien numerot merkitty oikeaan reunaan; aminohapot on numeroitu pitkin sekvenssiä. Puhdistetusta KGF:stä johdettu N-terminaalinen peptidisekvenssi on alleviivattu. Hydrofobi-10 nen N-terminaalinen alue on merkitty kursivoituna. Mahdollinen asparagiiniin kytketty glykosylaatiokohta on merkitty yläpuolisella viivalla. Polyadenylaatiosignaalivarian-tit AATTAA ja AATACA, jotka ovat lähellä RNA:n 3'-päätä, on laatikoitu. (C) KGF-mRNA:iden identifiointi Northern-15 täpläanalyysillä. Kaistat a ja c: poly(A)-valikoitu M426-RNA; kaista d, koko M426-solu-RNA. Suodattimet hybridisoi-tiin kloonista 32 saadun 32P-leimatun 695 ep:n BamHI-BclI-fragmentin kanssa (koetin A, kuvio 6A) , kaistat a ja b, tai kloonista 49 saadun 541 ep:n Apal-EcoRI-fagmentin 20 kanssa (koetin B, kuvio 6A), kaistat C ja d.
Kuvio 7 valaisee sukulaismolekyylien, KGF mukaan-; ’·· luettuna, muodostaman FGF-ryhmän topologista vertailua ja • / painottuu niihin kahteen proteiinin alueeseen, joille on : : yhteistä voimakas homologia, otaksuttuihin signaalipepti- • 25 disekvensseihin ja kahteen säilyneeseen kysteiiniryhmään.
« > • : Ne kaksi proteiinin aluetta, joille on yhteistä korkea ho- . mologia, on esitetty tummennettuina. Varjostetut laatikot • · osoittavat oletetut signaalipeptidisekvenssit. Kahden säilyneen kysteiiniryhmän (C) asemat on merkitty näkyviin.
’il; 30 Kuvio 8 esittää (Northern-täplä-) analyysejä • * *··** KGF:ään liittyvän mRNA:n ilmentymisestä valituissa normaa-
t · I
ί J : leissa ihmisen solulinjoissa ja kudoksissa ja osoittaa, että yksi 2,4 ke:n transskripti oli läsnä ihmissikiön
«M
keuhkofibroblasteista ja aikuisen ihon fibroblasteista pe- * » · 35 räisin olevassa RNA-.ssa, samalla kun transskriptia ei ha- i t *···* vaittu epiteelisolulinjassa (B5/589) , hermotukikudossolu- 12 114711 linjassa (HA83) eikä ihmisen jalkavarren laskimon endotee-lisolujen primaariviljelmissä. Tarkemmin kuvio 8 esittää normaaleissa solulinjoissa ja kudoksissa olevan KGF-mRNA:n Northern-täpläanalyysin ja vertaamisen muiden kasvuteki-5 joiden mRNA-ilmentymiseen, joilla on tunnettu aktiivisuus epiteelisolujen suhteen. Solun kokonaismRNA:t eristettiin cesium-trifluoriasetaattigradienttisentrifugoinnilla. 0 yg RNA:ta denaturoitiin ja käsiteltiin elektroforeettisesti l-%:isissa formaaldehydigeeleissä. Miedolla emäksellä teh-10 dyn denaturoinnin (50 mmol/1 NaOH:a, 3 0 min) jälkeen RNA siirrettiin nitroselluloosasuodattimiin käyttämällä kulje-tusaineena ammoniumasetaattia. Suodattimet hybridisoitiin 32P-leimatun-cDNA-koettimen kanssa, joka sisälsi 647 ep.-n EcoRI-fragmenttia KGF:ää koodittavan sekvenssin (A) 5- 15 päästä, tai muista kasvutekijä-DNA:ista saatujen samankaltaisten koettimien kanssa. Käytettiin seuraavia ihmissolu-tyyppejä: suomusolukarsinoomat (A253, A388 ja A41); rinta-epiteelisolut (S6 ja Rl); Adl2-SV40:llä kuolemattomiksi tehdyt keratinosyytit; primaariset ihmisen keratinosyytit; 20 vastasyntyneen esinahkafibroblastit, AG1523; aikuisen ihon fibroblastit (501T); sikiön keuhkofibroblastit (WI-38 ja ; · M426).
• Taulukossa II-1 verrataan hepariinin vaikutusta KGF:n ja muiden kasvutekijöiden mitogeeniseen aktiivisuu- ;v; 25 teen, ja se osoittaa, että hepariini inhiboi KGF-vastee- * » • : j na esiintyvän tymidiinin sisällytyksen BALB/MK-solujen DNA:han; sekä aFGF.-n että bFGF:n aktiivisuus sen sijaan kasvoi saman käsittelyn vaikutuksesta.
Edullisten suoritusmuotojen kuvaus 3 0 Tämän keksinnön yksi osa koskee puhdistettuja KGF- ;** proteiineja tai KGF:n kaltaisia proteiineja ja menetelmiä I· l näiden proteiinien valmistamiseksi. Keksinnön tämän puolen pääsuoritusmuoto koskee homogeenista KGF:ää, jolle on tun- * * * nusmerkillistä NaDodS04/PAGE:ssa tapahtuvaan liikkumiseen I)'. 35 perustuva näennäinen moolimassa noin 28 kD, liikkuminen *·· yhtenä piikkinä käänteisfaasisuurtehonestekromatografiässä 13 114711 ja ominaisaktiivisuus vähintään noin 3,4.104 yksikköä/mg, | edullisesti vähintään noin 3,2.10s yksikköä/mg, jolloin yk si aktiivisuusyksikkö on määritelmän mukaan määrä, joka aiheuttaa puolet suurimmasta mahdollisesta DNA-synteesin 5 stimulaatiosta tietyissä epiteeli (kerätinosyytti) -soluissa jäljempänä esitettävissä standardimääritysolosuh-teissa.
Epiteelisolutyypeille spesifisten uusien kasvutekijöiden identifioimiseksi käytettiin klonaalista BALB-c-10 hiiren keratinosyyttisolulinjaa, josta käytetään merkintää BALB/MK (1-6), indikaattorisoluna mainitunlaisten tekijöiden detektoimiseksi. Näiden solujen kasvu riippuu ulkopuolisesta epiteelisolumitogeenilähteestä jopa seerumia sisältävässä kasvualustassa (1-6). Kemiallisesti määritellyn 15 alustan kehittäminen näille soluille on tehnyt mahdolliseksi osoittaa, että BALB/MK-solujen proliferäätioon tarvitaan kaksi mitogeenista pääreittiä. Toiseen osallistuu insuliinin kaltainen kasvutekijä I (tai insuliini korkeana pitoisuutena) ja toiselle riittää epidermaalinen kasvute-20 kijä (EGF), transformoiva kasvutekijä a (TGFa), hapan fibroblast ikasvutekij ä (aFGF) tai emäksinen fibroblastikasvu- : ’ · tekijä (bFGF) (1-7) .
• · • ’/ Käyttämällä BALB/MK:ta prototyyppiepiteelisolulin- : : : jana ja NIH/3T3:a sen fibrioblastivastineena, tutkittiin :1·1: 25 erilaisista ihmissolulinjoista saaduista säädetyistä alus- • f toista uusia epiteelisoluspesifisiä mitogeeneja. Nämä kek-sinnön mukaiset biologiset määritykset antoivat mahdollisuuden puhdistaa homogeeniseksi yksi tällainen uusi kasvutekijä, jota vapauttaa ihmissikiön keuhkofibroblastilinja *;;; 30 ja josta käytetään tässä nimeä kratinosyyttikasvuteki j ä • · '·;·1 (KGF) .
:: : Lyhesti esitettynä KGF:n kaltaisen aktiivisuuden biologinen määritys standardiolosuhteissa käsittää seuraa-vat vaiheet: • » » * · · • « · • > · » 14 114711 (i) Hiiren kerätinosyyttejä (BALB/MK-soluja) kasvatetaan viljelmässä yhtenäiseksi kerrokseksi ja pidetään sitten yllä 24 - 72 tuntia seerumittomassa alustassa; (ii) tutkittavien näytteiden lisäämisen jälkeen 5 määritetään DNA-synteesin stimulaatio 3H-tymidiinin sisäl- lytyksellä hapolla saostettavissa olevaan DNA:hän.
Mitogeenisen kasvutekijän solukohdespesifisyyden määrittämiseksi voidaan DNA-synteesin stimulaatiota, joka ilmoitetaan stimuloidun synteesin suhteena lisätyn tutkitit) tavan näytteen poissa ollessa tapahtuvaan tymidiinin taus-tasisällytykseen, verrata analogiseen stimulaatioon, joka havaitaan muissa soluissa kuin keratinosyyteissä samanlaisissa määritysolosuhteissa. Tällaisissa vertailuissa KGF:n mitogeeninen aktiivisuus on huomattavan spesifinen kera-15 tinosyyttien suhteen fibroblasteihin verrattuna (vähintään noin 500-kertainen stimulaatio), ja aktiivisuus on vähemmän mutta merkitsevästi suurempi (vähintään noin 50-kertainen) kerätinosyyttien kuin muiden esmerkkeinä käytettyjen epiteelisolutyyppien suhteen (lisätietoja taulu-20 kossa 1-2, biologisen määrityksen standardiolosuheita kuvataan yksityiskohtaisesti luvun Kokeellinen osa I kohdas-; · sa Materiaalit ja menetelmät).
• Käyttämällä KGF:n tuotantomenetelmää, jossa käyte- : j) tään viljeltyjä soluja ja eristetään mitogeeninen aktiivi- 25 suus ja joka sisältää ultrasuodatuksen, hepariini-Sepha- • ! rose-affiniteettikromatografiän (HSAC) ja adsorptiivisen . ·, käänteisfaasisuurtehonestekromatografiän (RP-HPLC) tai vaihtoehtoisesti molekyyliseulonta-HPLC:n (TSK-HPLC), eristettiin tämän keksinnön mukaisesti riittävä määrä tätä 30 ainetta molekyylin fysikaalisten ja biologisten ominai- • * ·;’ suuksien yksityiskohtaisen karakterisoinnin mahdollistami- • · » ' : *· seksi .
Yhteenvetona esitettynä menetelmä KGF:n tuottami- » * » \t seksi tuotantokykyisistä soluista, kuten ihmissikiön fib- 35 roblasteista M426 (1-8) , käsittää esimerkiksi seuraavat * · vaiheet: 15 114711 (i) säädetyn kasvualustan valmistus (esimerkiksi 10 1) käyttämällä yksisolukerrosviljelmiä, joita kierrätetään seerumia sisältävästä seerumittomaan alustaan, ja seerumittoman talteenotetun tuotteen säilytys lämpötilassa 5 -70 °C jatkokäyttöön asti; (ii) konsentrointi ultrasuodatuksella käyttämällä kalvoja, joiden moolimassaläpäisyraja on 10 kD, muutamassa peräkkäisessä vaiheessa, joiden välissä tehdään laimennus puskurilla (moolimassaltan alhaisten materiaalien poista- 10 misen helpottamiseksi, ja sen jälkeen mahdollinen säilytys lämpötilassa -70 °C; (iii) affiniteettikromatografia polymeerialustaan (esimerkiksi Sepharose) kiinnitetyllä hepariinilla eluoi-den gradientilia, jossa NaCl-pitoisuus kasvaa; 15 (iv) konsentrointi vähintään 10 - 20-kertaiseen väkevyyteen pienikokoisilla ultrasuodatusvälineillä, joiden moolimassaläpäisyraja on 10 kD (esimerkiksi Centricon-10-mikroväkevöintilaite, valmistaja Amicon), ja säilytys lämpötilassa -70 °C.
20 Puhdistusprosessin seuraava vaihe käsittää joko vaiheen (v) tai vaihtoehtoisesti vaiheen (vi), jotka ovat seuraavat: ; .· (v) edeltävästä HSAC-vaiheesta saatujen aktiivis- ' ten fraktioiden (yhdistetyt fraktiot 0,6 mol/1 NaCl-liu- : : 25 oksessa) käänteisfaasi-HPLC orgaanisissa liuotinjärjestel- * t *; · missä; tai (vi) molekyyliseula-HPLC (esimerkiksi TSK-G3000SW Glas-Pak-kolonnilla, valmistaja LKB) vesipohjaisessa puskurissa lähellä fysiologista pH-arvoa (esimerkiksi Tris- ", 30 HC1, pH 6,8/0,5 mol/1 NaCl), jota seuraa säilytys lämpöti- lassa -70 °C.
V TSK-vaiheella (vi) saatu valmiste oli lähes yhtä : puhdasta kuin RP-HPLC:stä saatu hopeavärjätyllä NaDodS04/ |*( PAGE:lla arvioituna (tuloksia ei esitetä), mutta TSK- » t i !!! 35 lähestymistavalla saatiin aikaan paljon parempi aktii- visuussaanto (taulukko 1-1). Lisäksi TSK-puhdisteulla ma- 16 114711 teriaalilla on suurempi spesifinen aktiivisuus kuin RP-HPLC-materiaalilla. Edellä kuvatulla TSK-menettelyllä valmistettu KGF stimuloi DNA-synteesiä epiteelisoluissa nano-molaarisuusaluetta pienempinä pitoisuuksina, mutta ei on-5 nistunut indusoimaan tymidiinin sisällytystä fibroblastien tai endoteelosolujen DNA:hän vertailukelposina tai suurempia pitoisuuksina (pitoisuuteen 5 nmol/1 asti). Aktiivisuus oli herkkä hapolle, lämmölle ja RP-HPLC-vaiheessa käytetyille liuottimille. (Herkkyystietoja ja valmistusme-10 netelmää koskevia lisäyksityiskohtia esitetään luvussa Kokeellinen osa I.) Käyttämällä alalla hyvin tunnettuja standardimenetelmiä määritettiin asemille 2-13 puhdistetun KGF:n ami-nopäästä lukien seuraava yksiselitteinen aminohappose-15 kvenssi: Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val (katso Kokeellinen osa I).
Tämän keksinnön piiriin kuuluu myös DNA-segment-tejä, jotka koodittavat PGF- ja KGF:n kaltaisia polypepti-dejä. Keksinnön mukaisista DNA:ista ovat esmerkkejä DNA:t, 20 joista käytetään tässä seuraavia nimityksiä: ihmissikiön keuhkofibroblastisolulinjasta M426 eristetystä poly-adenyloituneesta RNA:sta johdetut ihmis-cDNA-kloonit 32 ja : 49; näiden kloonien yhdistelmät ja mutantit; ja niille su- | ; kua olevat DNA-segmentit, jotka voidaan detektoida näiden 25 DNA-segmenttien kanssa tapahtuvan hybridisaation kautta.
·; · Kuten luvussa Kokeellinen osa II kuvataan, KGF- aminohapposekvenssin tunnettua osaa vastaavan cDNA:n etsimiseksi muodostettiin kaksi oligonukleotidikoetinyhdistel-mää, jotka perustuivat kaikkiin mahdollisiin nukleotidise-’ * *3 0 kvensseihin, jotka koodittavat yhdeksän aminohapon sek- ·;· venssiä Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala. cDNA-kirjasto *·_: : muodostettiin cDNA-kloonausvektorissa XpCEV9 käyttämällä polyadenyloitunutta RNA:ta, joka oli eristetty ihmissikiön keuhkofibroblastisolulinjasta M426, joka oli tämän kasvu-;;; 35 tekijän alkuperäinen lähde. Kirjaston (9.105 pesäkettä) ’*·’ tutkiminen 32P-leimatuilla oligonukleotideilla antoi tu- 17 114711 lokseksi 88 pesäkettä, jotka hybridisoituivat kummankin koettimen kanssa.
Analysoiduista 10 pesäkepuhdistetusta kloonista yhdessä, josta käytetään merkintää klooni 49, oli 3,5 ke:n 5 cDNA-insertti, kun taas muissa oli inserttejä, joiden koko oli alueella 1,8 - 2,1 ke. Pienempien kloonien analysointi osoitti muutamia yhteisiä restriktiokohtia, ja yhden tyypillisen pienemmän kloonin, josta käytetään merkintää klooni 32, sekventointi yhdessä koonin 49 kanssa osoitti, 10 että ne olivat osittain päällekkäisiä cDNA:itä (kuvio 6A) . Näiden kahden cDNA:n asettaminen kohdakkain muodosti jatkuvan sekvenssin, jonka pituus oli 3,85 ke ja joka sisälsi koko KGF:ää koodittavan sekvenssin. Täysmittaista yhdis-telmä-KGF-cDNA-sekvenssiä vastaavat koodittavan säikeen 15 DNA-nukleotidisekvenssi ja ennustettu kooditettu primaarinen proteiinisekvenssi esitetään kuviossa 6B.
Nämä DNA:t, cDNA-kloonit 32 ja 49 samoin kuin näiden segmenttien yhdistelmämuodot, jotka käsittävät koko KGF:ää koodittavan sekvenssin, ovat edullisimpia tämän 20 keksinnön mukaisia DNA:itä.
cDNA-sekvenssistä käy ilmi, että primaariset KGF-: · ja hst-translaatiotuotteet sisältävät hydrofobisia N-ter- • minaalisia alueita, jotka toimivat todennäköisesti signaa- : .* lisekvensseinä pääteltynä yhdenkaltaisuudestaan erilaisten : : 25 muiden proteiinien mainitunlaisten sekvenssien kanssa.
·; | Niinpä tätä N-terminaalista aluetta ei ole läsnä puhdiste- .· , tussa valmiissa KGF-molekyylissä, jota ihmissikiön fibro- * blastit erittävät.
Lisäksi KGF:lie on yhteistä kaikkien muiden FGF-*!*.; 30 ryhmän jäsenten kanssa kaksi suurta homologia-aluetta, **· jotka kattavat ennustetun KGF-sekvenssin aminohapot 65 - : 156 ja 162 - 189 ja joita erottaa lyhyt, ei-homologinen aminohapposarja, jonka pituus on erilainen ryhmän eri jä-\ senissä. KGF:n puhdistetun muodon sekvenssi sisältää viisi 35 kysteiiniryhmää, joista kaksi on säilynyt kaikissa FGF- » · *·· ryhmän sukulaisproteiineissa. Koko KGF-sekvenssin alueella 18 114711 esiintyy viisi emäksisten ryhmien muodostamaa paria. Tämä sama malli on havaittu muissa FGF-ryhmän jäsenissä.
Ammattimiehelle pitäisi olla ilmeistä, että käyttämällä hybridisaatiomenetelmissä (kuten ihmisen genomi-5 DNA:iden Southern-täpläanalyyseissä) tämän keksinnön mukaisia DNA:itä ja RNA:ita, erityisesti edellä lueteltuja edullisimpia DNA:itä, on mahdollista ilman tarpeettomia kokeita tutkia genomi- tai cDNA-kirjastoja toisten KGF:n kaltaisten DNA:iden löytämiseksi, jotka ovat tämän keksin-10 nön suoja-alan piirissä. Käyttämällä siten tämän keksinnön mukaisia DNA:ia voidaan lisäksi identifioida geneettisiä markkereita, jotka liittyvät KGF-geeniin, kuten restrik-tiofragmenttien pituuspolymorfismejä (RFLP.-itä), ja yhdistää niitä perinnöllisiin kliinisiin tiloihin, joihin liit-15 tyy tämä geeni tai muita läheisiä geenejä.
Tämän keksinnön piiriin kuuluu myös KGF-DNA:iden muunnettuja muotoja. Keksinnön tämän puolen yhden pääsuo-ritusmuodon mukaisesti mainitunlaiset muunnetut DNA:t koodattavat KGF:n kaltaisia proteiineja, jotka käsittävät 20 KGF:n ja vähintään yhden muun FGF-peptidiryhmän jäsenen aminohapposekvenssisegmenttejä. Niinpä, koska ei ole ole-: ''· massa merkitsevää N-terminaalista homologiaa KGF:n erittyjä neen muodon ja muiden FGF-sukulaisproteiinien analogisten asemien välillä, voidaan esimerkiksi luoda polypeptidejä, 25 joilla on uusia rakenteellisia ja toiminnallisia ominai-·_ suuksia, liittämällä DNA-segmenttejä, jotka koodittavat .· *. FGF-ryhmän jonkin toisen polypeptidin muista erottuvia N-terminaalisia segmenttejä, KGF-DNA-segmenttiin sen tavallisen NH2-terminaalisen segmentin tilalle.
30 Kimeeriset polypeptidit, joita on tuotettu tällai- * » ''y' silla muunnetuilla DNA:illa, ovat käyttökelpoisia sen mää- rittämiseen, riittäkö KGF:n NH2-terminaalinen alue saamaan aikaan sen ainutlaatuisen kohdesoluspesifisyyden. Kimee-risten molekyylien tutkimisen pitäisi myös antaa tietoa ;;; 35 siitä, mitkä alueet saavat aikaan hepariinin erilaiset ’···* vaikutukset niiden biologisiin vaikutuksiin.
19 114711 Tämän lähestymistavan käyttökelpoisuus on itse asiassa jo vahvistettu muodostamalla ja tuottamalla menestyksellisesti kimeerinen molekyyli, jossa on noin 40 aminohappoa KGF:n erittyneen muodon NH2-päästä (alkaen val-5 miin KGF:n muodon aminoterminaalisesta cys-ryhmästä, numero 32 kuviossa 6, ja päättyen KGF-ryhmään 78, arg) on kytketty noin 140 aminohappoon aFGF:n C02-terminaalisesta ydinosasta (alkaen ryhmästä 39, arg, ja jatkuen aFGF:ää koodittavan sekvenssin C-terminaaliseen päähän). Tämä kilo meerinen tuote suosii kohdesoluina keratinosyyttejä, kuten KGF:kin, mutta siltä puuttuu hepariiniherkkyys, joka piirre on vastaava kuin aFGF.-llä KGF:n sijasta. Tällä uudella KGF:n kaltaisella kasvutekijällä voi olla etuja kliinisissä sovellutuksissa, joissa on toivottavaa antaa epitee-15 lisoluille spesifistä kasvutekijää hepariinin, yleisesti käytettävän antikoagulantin, läsnä ollessa. Lisäyksityis-kohtia tämän kimeerisen molekyylin konstruoinnista ja po-lypeptidin ominaisuuksista kuvataan luvussa Kokeellinen osa II.
20 Muihin tämän keksinnön mukaisiin DNA:ihin kuuluvat yhdistelmä-DNA-molekyylit, jotka käsittävät KGF-cDNA:n ja ; minkä tahansa seuraavista vektori-DNA: ista: bakteriofa- V gi λ -kloonausvektori (XpCEV9); DNA-sekventointiplasmidi- : : : vektori (pUC-variantti) ; bakteeri-ilmentymisvektori 25 (pKK233-2); tai nisäkäsilmentymisvektori (pMMT/neo) . Täl- ·;·.! laisista yhdistelmä-DNA: ista ovat esimerkkejä kokeellisis- sa osissa yksityiskohtaisesti kuvattavat konstruktiot.
* · ·
Edullisimpiin yhdistelmämolekyyleihin kuuluvat , seuraavat: molekyylit, jotka käsittävät KGF:n erittynyttä » f · ;;; 30 muotoa koodittavan sekvenssin ja bakteeri-ilmentymis- • » ’*;** vektorin (esimerkiksi pKK233-2) tai cDNA:n, joka koodittaa : : : koko primaarista translaatiotuotetta (mukaan luettuna NH2- terminaalinen signaalipeptidi), ja nisäkäsilmentymisvekto-rin (esimerkiksi pMMT), jolla on kyky saada insertoidut • · · ;;; 35 DNA:t ilmentymään nisäkässoluissa (esimerkiksi NIH/3T3).
• » 20 114711 KGF-DNA:n ja bakteeri-ilmentymisvektorin sisältävien yhdistelmä-DNA:iden konstruoimista kuvataan luvussa Kokeellinen osa II. Lyhyesti ilmaistuna KGF-cDNA saatettiin ilmentymään polypeptidin tuottamiseksi E. colissa si-5 joittamalla sen kooditussekvenssi hybridi-trk-promoottorin ohjaukseen plasmidi-ilmentymisvektoriin pKK233-2 (11-31).
Yhdistelmä-DNA:itä, jotka käsittävät KGF-DNA:n ja nisäkäsvektorin, jolla on kyky saada insertoidut DNA:t ilmentymään viljellyissä ihmis- tai eläinsoluissa, voidaan 10 konstruoida tavanomaisin geeninilmentämismenetelmin käyttämällä alalla hyvin tunnettuja menetelmiä mainitunlaisen suhteellisen yksinkertaisen polypeptidin tuottamiseksi.
Yhtä keksinnön tämän puolen mukaista yhdistelmä-DNA-erityissuoritusmuotoa, jossa käytetään nisäkäsvektoria 15 pMMT, kuvataan tarkemmin jäljempänä tässä osassa tämän keksinnön mukaisten yhdistelmäsolujen yhteydessä.
Tämän keksinnön mukaista DNA:itä ja koodittavan (sense-) säikeen käsittäviä RNA-.ita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten proteiinintuotantomenetelmien yhtey-20 dessä valmistettaessa suuria määriä suurin piirtein puhdasta KGF:ää tai KGF:n kaltaisia proteiineja. Siten val-> '* mistettua suurin piirtein puhdasta KGF-proteiinia voidaan ‘,· käyttää tunnetuin menetelmin diagnostisissa tutkimuksissa ·. tämän proteiinin reseptorien läsnäolon määrittämseksi eri- 25 laisista elimistönesteistä ja kudosnäytteistä.
;··· Niinpä tämä keksintö käsittää myös solun, edulli- sesti bakteeri- tai nisäkässolun, joka on transformoitu keksinnön mukaisella DNA:11a ja jossa transformoiva DNA on ilmentymiskykyinen. Keksinnön tämän puolen yhdessä edulli- “!! 30 sessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisella DNA:11a trans- 0 0 formoitu solu tuottaa täysin mitogeenisessa muodossa ole-·' vaa KGF-proteiinia. Nämä proteiinit ovat edullisimmin erittynyttä muotoa vastaavia (ts. niistä puuttuu ilmeinen signaalisekvenssi). Näitä proteiinitekijöitä voidaan käyt-35 tää toimintatutkimuksiin ja puhdistaa biokemiallisia ja 21 114711 toiminnallisia lisäanalyysejä, kuten kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia reseptorisitoutumismäärityksiä, varten.
E. coli -yhdistelmäsoluja KGF:n tuottamiseksi konstruoitiin käyttämällä bakteeri-ilmentymisvektoria 5 pKK233-2 luvussa Kokeellinen osa II kuvattavalla tavalla.
Lyhyesti esitettynä muutamista yhdistelmäbakteeriklooneis-ta testattiin proteiinintuotanto tavanomaisin pienimittakaavaisin menetelmin. Kaikki tutkitut yhdistelmät syntetisoivat proteiinia, jonka aminoterminaalista KGF-peptidiä 10 vastaan muodostetut vasta-aineet tunnistivat (katso jäljempänä) . Kasvatettiin 1 l:n viljelmässä yhtä yhdistelmää, joka tuotti yhdistelmä-KGF:ää, joka tehokkaasti stimuloi tymidiinin sisällytystä BALB/MK:n keratnosyyttisolujen DNA:hän, mutta vaikutti vain mariginaalisesti NIH/3T3-15 fibroblasteihin. Puolet BALB/ML-solujen maksimistimulaati-osta tavanomaisessa biologisessa kerätinosyyttimäärityk-sessä saavutettiin pitoisuudella 2-5 ng/ml, kun taas vastaava pitoisuus oli 10 - 15 ng/ml M426-soluista puhdistetulla KGF:11ä.
20 Yhdestä litrasta bakteerisoluja saatiin noin 50 μg
Mono-S-puhdistettua yhdistelmä-KGF:ää. Geeni-ilmentymis-; ’ alan ammattimiehille lienee ilmeistä, että tätä alkusaan- • ‘ / toa voidaan parantaa olennaisesti ilman tarpeettomia ko- : /ί keiluja käyttämällä erilaisia tunnettuja yhdistelmä-DNA- : 25 menetelmiä.
• ·· Konstruoitiin myös yhdistelmänisäkässoluja (NIH/ . ·. 3T3-hiiri) käyttämällä koko KGF-cDNA-kooditussekvenssiä (mukaanluettuna NH2-terminaalinen signaalipeptidi) ja vek-toria pMMT/neo, joka sisältää hiiren metallotioniini (MMT) 'il,1 3 0 -promoottorin ja selektiivisen neomysiiniresitenssimarkke- • i rigeenin. Soluista tutkitaan KGF-tuotanto, erityisesti ih- > < * : misen fibroblastien tuottaman valmiin muodon (josta puut- tuu signaalipeptidi) eritys, käyttämällä tämän keksinnön • · · *. mukaisia biologisia määrityksiä. Tätä samaa vektorin ja III 3 5 isäntäsolun yhdistelmää on käytetty menestyksellisesti • · *·*' muutamien muiden samankaltaisten yhdistelmäpolypeptidien 22 114711 tuottamiseen, mukaan luettuna suuret määrät verihiutalepe-räisen kasvutekijän (PDGF) A- ja B-ketjuja (11-32). Niinpä ammattimiehet ymmärtänevät, että tällä tavalla voidaan saavuttaa suuria yhdistelmä-KGF-saantoja käyttämällä edel-5 lä mainittuja tämän keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA:itä ja transformoituja soluja.
Suurimittaista tuotantoa voidaan viime kädessä käyttää kliinisen testaamisen mahdollistamiseen tilojen yhteydessä, jotka vaativat epiteelisolujen kasvun spesi-10 fistä stimulaatiota. Materiaalit ja menetelmät framaseut-tisten koostumusten valmistamiseksi polypeptidien paikallista (esimerkiksi ihoon tai silmän sarveiskalvoon) tai systeemistä antoa varten ovat alalla hyvin tunnettuja, ja niitä voidaan helposti soveltaa KGF- ja KGF:n kaltaisten 15 peptidien antamisen ilman tarpeettomia kokeiluja.
Tämä keksintö käsittää myös uusia vasta-aineita, joita on valmistettu tämän keksinnön mukaisen DNA-seg-mentin koodittamaa peptidiä vastaan. Keksinnön tästä suoritusmuodosta ovat esimerkkeinä useat vasta-ainelajit, 20 jotka tunnistavat KGF:n. Niitä on valmistettu käyttämällä kokeellisen immunologian alalla tunnettuja tavanomaisia : ” menetelmiä luvussa Kokeellinen osa II hahmotellulla taval- » > * • .· la. Näihin vasta-aineisiin kuuluvat seuraavat: Monoklonaa- liset vasta-aineet, joita on muodostetu hiirissä ihmisen i 25 fibroblasteista peräisin olevaa koskematonta, puhdistettua ·; j proteiinia vastaan; polyklonaaliset vasta-aineet, joita on muodostettu kaniineissa synteettisiä peptidejä vastaan, joiden sekvenssit perustuvat KGF-cDNA-sekvenssistä ennus-tettuihin aminohapposekvensseihin [esimerkiksi peptidi, ‘11! 30 jolla on KGF:n ryhmien 32 - 45 sekvenssi, nimittäin • · NDMTPEQMATNVR (käytettäessä tavanomaisia yksikirjaimisia * · · V ·' merkintöjä aminohapoille; katso kuvio 6)]; polyklonaaliset • * * it>>: vasta-aineet, joita on muodostettu kaniineissa sekä ihmi- , X sen fibroblasteista luonnossa erittynyttä KGF:ää että E.
• · · 35 colissa tuotettua yhdistelmä-KGF:ää vastaan (ks. edellä).
* · 23 114711
Kaikki testatut vasta-aineet tunnistavat yhdistelmän samoin kuin luonnossa esiintyvän KGF:n kiinteäfaa-si(ELISA-)määrityksessä ja/tai Western-täplämäärityksessä. Jotkut esimerkkivasta-aineet, jotka ovat edullisia tämän 5 keksinnön mukaisia vasta-aineita, näyttävät kumoavan KGF:n mitogeenisen aktiivisuuden biologisessa BALB/MK-määri-tyksessä.
Tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden fragmentit, kuten Fab- tai F(ab)'-fragmentit, joissa on jäljellä 10 antigeenisitoutumisaktiivisuus ja joita voidaan valmistaa alalla hyvin tunnetuin menetelmin, ovat myös tämän keksinnön suoja-alan piirissä. Lisäksi tämä keksintö käsittää tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden tai niiden aktiivisten fragmenttien farmaseuttisia koostumuksia, joita 15 voidaan valmistaa käyttämällä alalla hyvin tunnettuja materiaaleja ja menetelmiä farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, jotka on tarkoitettu polypeptidien antamiseen ja joita voidaan helposti soveltaa KGF- tai KGF:n kaltaisten peptidien antoon ilman tarpeettomia kokeiluja.
20 Näitä vasta-aineita ja niiden aktiivisia fragment teja voidaan käyttää esimerkiksi KGF:n detektointiin bio-: '* logisissa määrityksissä tai näiden proteiinitekijöiden j ’.· puhdistamiseen. Niitä voidaan käyttää myös alalla hyvin : f ·* tunnettuihin lähestymistapoihin KGF-reseptorin eristämi- 25 seen, joka näyttää olevan erilainen kuin kaikkien muiden
* I
*:··,· tunnettujen kasvutekijöiden reseptorit, kuten kuvataan lu- vussa Kokeellinen osa II.
• t ·
Edullisia vasta-aineita ja niiden fragmentteja ja farmaseuttisia koostumuksia, jotka BALB/MK-määrityksen mu-30 kaan kumoavat KGF: n mitogeenisen aktiivisuuden epitee-* lisolujen suhteen, voidaan käyttää esimerkiksi kliinisten V · tilojen hoitoon, joille on tunnusmerkillistä epiteelisolu- : : jen liiallinen kasvu, mukaan luettuina dysplasia ja neo plasia (esimerkiksi psoriasis tai pahan- tai hyvänlaatui- • · · !!! 35 set epiteelikasvaimet) .
• » « » • · » 24 114711 Tämä keksintö käsittää lisäksi uusia biologisia määritysmenetelmiä keksinnön mukaisiin DNA:ihin liittyvien geenien ilmentymisen detektoimiseksi. Joissakin suoritus-muotoesimerkeissä tämän keksinnön mukaisia DNA:itä käytet-5 tiin koettimina niihin liittyvien mRNA:iden stationaaripi-toisuuksien määrittämiseksi. Menetelmä näiden keksinnön mukaisten biologisten määritysten tekemiseksi, joissa käytetään KGF-DNA:ita ja tavanomaista Northern-täplämene-telmää, kuvataan yksityiskohtaisesti luvussa Kokeellinen 10 osa II.
Ammattimies ymmärtänee, että tällaisia menetelmiä voidaan ilman tarpeettomia kokeiluja käyttää KGF:n kaltaisia proteiineja koodittavien geenien joko eristetyissä soluissa tai erilaisissa kudoksissa tapahtuvan ilmentymisen 15 analysointiin. Tällaiset biologiset määritykset voivat olla käyttökelpoisia esimerkiksi erilaisten kasvainsoluryh-mien tai epiteelin kasvuprosesseihin liittyvien perinnöllisten häiriöiden identifiointiin.
Otaksutaan, että ammattia normaalisti hallitseva 20 pystyy ilman yksityiskohtaisempaa selittämistä, edellä olevaa kuvausta ja jäljempänä olevien kokeellisten osien mukaisia menetelmiä käyttämällä, hyödyntämään tätä keksin- : töä koko sen laajuudessa. Kokeellisissa osissa oleva mate- • riaali esitetään vain valaisutarkoituksessa, ellei toisin 25 mainita, eikä sitä tulisi siksi pitää liitteenä olevia pa- · tenttivaatimuksia millään tavoin rajoittavana.
; '_· Kokeellinen osa I
Epiteelisoluille spesifisen uuden kasvutekijän , identifiointi ja karakterisointi ’! 30 Tässä osassa kuvataan kokeellista työtä, joka joh- ti epiteelisoluille spesifisen kasvutekijän identifioin- I i i V : tiin ihmissikiön keuhkofibroblastisolulinjan säädetystä • * * kasvualustasta. Tämä tekijä, joka on tilapäisesti nimetty , kerätinosyyttikasvutekijäksi (KGF) , koska se on pääasiassa !!! 35 aktiivinen tämän solutyypin suhteen, puhdistettiin homo- » t “ geeniseksi ultrasuodatuksen, hepariini-Sepharose-affini- 25 114711 teettikromatografiän ja C4-käänteisfaasi-HPLC-kolonnilla tehdyn hydrofobisen kromatografiän yhdistelmällä noudattamalla tämän keksinnön mukaisia menetelmiä. KGF:n havaittiin olevan labiili sekä happojen että lämmön vaikutuksen 5 alaisena, ja se koostui yhdestä polypeptidiketjusta, jonka näennäinen moolimassa on noin 28 000 daltonia. Puhdistettu KGF oli voimakas mitogeenin epiteelisoluille ja pystyi stimuloimaan DNA-synteesin lepotilassa olevissa BALB/MK-hiiren epidermaalisissa kerätinosyyteissä yli 10 500-kertaiseksi aktiivisuuden ollessa havaittavissa pitoisuudella 0,1 nmol/1 ja maksimiarvossaan pitoisuudella 1,0 nmol/1. Mitogeenisen aktiivisuuden puuttuminen sekä fibroblastien että endoteelisolujen suhteen, osoitti, että KGF:llä oli erilainen kohdesoluspesifisyys kuin millään 15 aiemmin karakterisoiduista kasvutekijöistä. Mikrosekven-tointi osoitti aminoterminaalisen sekvenssin, jolla ei oli merkittävää homologiaa minkään tunnetun proteiinin kanssa. Tämän uuden kasvutekijän vapautuminen ihmissikiön fib-roblasteista osoittaa, että KGF osallistuu normaalin epi-20 teelisolujen proliferaation alkeistukikudosstimulaatioon.
Menetelmät ja materiaalit i '· Säädettyjen kasvualustojen valmistus t * ) j Varhainen sukupolvi ihmissikiön fibroblasteja M426 ; ; ; (1-8) siirrostettiin T-pullojen pinnoille (175 cm2) ja 25 kasvatettiin yhtenäiseksi kasvustoksi 10 - 14 vrk Dulbec- f » ,· con muunnetussa Eagle-alustassa (DMEM; GIBCO) , jota oli , , täydennetty lisäämällä 10 % vasikan seerumia (GIBCO) . Kun yksisolukerrokset olivat kasvaneet yhtenäisiksi, niitä kierrätettiin viikottain seerumia sisältävän ja seerumit-30 toman alustan välillä, joista viimeksi mainittu koostui i pelkästä DMEM:stä. Solut pestiin kahdesti fosfaattipusku-roidulla fysiologisella suolaliuoksella (5 ml) ja lisät-! tiin sitten 20 ml DMEMrää. Viljelmänesteet otettiin tal teen 72 tunnin kuluttua ja korvattiin 35 ml :11a seerumia ! 35 sisältävää alustaa. Säädetty alusta säilytettiin lämpöti lassa -70 °C jatkokäyttöön asti.
26 114711
Ultrasuodatus
Sulatettiin noin 10 1 säädettyä alustaa, esisuoda-tettiin se 0,50 μτη:η suodattimen läpi (Millipore HAWP 142 50) ja väkevöitiin 200 ml:ksi käyttämällä Pellicon-5 kasettijärjestelmää (Millipore XX42 00K 60) ja kasettia, jonka moolimassaerotusraja oli 10 kD (Millipore PTGC 000 05). Konsentroinnin jälkeen näyte laimennettiin kaksi kertaa peräkkäin liuoksella (1 1) , joka sisälsi 20 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5, ja 0,3 mol/1 NaCl:a, ja ultrasuodatet-10 tiin kunkin laimennuksen jälkeen Pellicon-järjestelmällä. Retentaattiin jäävä aktiivisuus laitettiin joko hepariini-Sepharose-hartsille tai varastoitin lämpötilassa -70 °C.
Hepariini-Sepharose-affiniteettikromatografia (HSAC) 15 Ultrasuodatuksesta saatu retentaatti laitettiin hepariini-Sepharose-hartsille (Pharmacia), joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 20 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5, ja 0,3 mol/1 NaCl:a. Hartsi pestiin perusteellisesti, kunnes optinen tiheys oli palautunut pohja-arvoon, 20 ja käsiteltiin sitten gradientilla, jossa NaCl-pitoisuus kasvoi asteittain lineaarisesti. Kun fraktioista oli otettu näytteet biologista tymidiininsisällytysmääritystä varten, valitut fraktiot konsentroitiin 10 - 20-kertaiseen väkevyyteen Centricon-10-mikrokonsentrointilaitteella ; 25 (Amicon) ja varastoitiin lämpötilassa -70 °C.
Käänteisfaasi-HPLC (RP-HPLC) : , HSAC: sta saadut aktiiviset fraktiot (yhdistelmä 0,6 mol/1 NaCl-liuoksessa) sulatettiin, yhdistettiin ja väkevöitiin edelleen Centricon-10:llä lopputilavuuteen ·;;; 30 <200 μΐ. Näyte laitettiin Vydac-C4-HPLC-kolonnille (the
Separations Group, Hesperia, CA) , joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA,
Fluka) ja 20 % asetonitriiliä (Baker, HPLC-laatu), ja elu-oitiin gradientilla, jossa asetonitriilipitoisuus kasvoi 35 lineaarisesti. Biologista määritystä varten otetut näyt-'···’ teet laimennettiin välittömästi 10-kertaisella ylimäärällä 27 114711 liuosta, joka sisälsi 50 Mg/ml BSA:a (Fraction V, Sigma) ja 20 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5. Loppuosa näytteestä kuivattiin Speed-Vac-laitteessa (Savant) rakenneanalyysiä varten.
5 Molekyyliseula-HPLC
Noin 50 μΐ kahdesti konsentroituja hepariini-Sepharose-fraktioita laitettiin TSK-G3000SW Glas-Pac -kolonnille, joka oli tasapainotetti liuoksella, joka sisälsi 20 mmol/1 tris-HCl:a, pH 6,8, ja 0,5 mol/1 NaCl:a.
10 Näyte eluoitiin tällä puskurilla virtausnopeudella 0,4 ml/min. Kun oli otettu näytteet biologista määritystä varten, fraktiot säilytettiin lämpötilassa -70 °C.
NaDodS04-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (NaDodS04/PAGE) 15 Valmistettiin NaDodS04: a sisältävät polyakryy- liamidigeelit Laemmlin menettelyllä (1-9) . Näytteitä keitettiin 3 minuuttia 2-merkaptoetanolin (2,5 til-%) läsnä ollessa. Geelit kiinnitettiin ja värjättiin hopealla (Ι-ΙΟ) käyttämälä BioRadin reagensseja ja käsittelyohjelmaa.
20 Moolimassamarkkerit olivat Pharmacialta.
DNA-synteesin stimulaatio • 96-syvennyksiset mikromaljat (Falcon nro 3596) • « i | esipäällystettiin ihmisen fibronektiinillä (Collaborative ; research), jota käytettiin 1 μg/cm2, ennen BALB/MK-solujen ’’ 25 siirrostamista. Kun solut olivat kasvaneet yhtenäiseksi : kerrokseksi, niitä pidettiin yllä 24 - 72 tuntia seerumit- tomassa alustassa, joka sisälsi 5 Mg/ml transferriiniä (Collaborative Research) ja 30 nmol/1 Na2SeC>3:ä (Baker). 3H-tymidiinin (loppupitoisuus 5 /xCi/ml, NEN) sisällytys t 30 DNA:hän mitattiin 6 tunnin aikana aloittaen 16 tunnin kuluttua näytteiden lisäämisestä. Määritys päätettiin pese-; mällä solut solut kerran jääkylmällä fosfaattipuskuroidul- ; la fysiologisella suolaliuoksella ja kahdesti 5-%:isella trikloorietikkahappoliuoksella. Saostuma liuotettiin uu-;; 35 delleen NaOH-liuokseen (0,25 mol/1), siirrettiin tuikelas- ’·*·* kentanesteeseen (Biofluor, NEN) ja tehtiin laskenta.
28 114711
Erilaisten muiden solulinjojen DNA-synteesin stimulaatiota seurattin edellä BALB/MK-solujen yhteydessä kuvatulla tavalla. NIH/3T3-fibroblastien (1-11) saantipaikka oli the National Institutes of Health, kun taas reesusapi-5 nan keuhkoepiteelisolut CCL208 toimitti the American Type Culture Collection. IHmisen rintaepiteelisolulinjan B5/ 589, joka oli preparoitu viitteessä 1-13 kuvatulla tavalla, toimitti Martha Stampfer (University of California, Berkeley). Rintasoluja kasvetattiin RPMI 1640:ssä, jota 10 täydennettiin naudan sikiöseerumilla (10 %) ja EGF;llä (4 ng/ml). Kun ylläpito tapahtui seerumitomissa olosuhteissa, oli perusalustana DMEM. Ihmisen jalkavarren laskimon endoteelisolujen primaariviljelmät preparoitiin ja pidettiin yllä kirjallisuudessa kuvatulla tavalla (1-14).
15 Epidermaalinen kasvutekijä ja insuliini olivat Collaborative Researchiltä. Happaman FGF:n ja bFGF:n toimitti California Biotechnology, Inc. Yhdistelmä-TGFa: toimitti Ge- nentech, Inc. Alustat ja seerumin toimitti joko GIBCO, Biofluids, Inc. tai NIH:n kasvualustayksikkö.
20 Proliferaatiomääritys
Viljelymaljat (halkaisija 35 mm) esipäällystettiin • ' - peräkkäin poly-D-lysiinillä (20 Mg/cm2) (Sigma) ja ihmisen j fibronektiinillä ja siirrostetiin niille sitten noin 2,5.
; 104 BALB/MK-solua. Perusalusta oli seos, joka sisälsi suh-
* * I
25 teessä 1:1 Eaglen vähän Ca2+:a ja minimimäärän välttämät-tömiä ravintoaineita sisältävää alustaa ja Hamin F-12-, alustaa ja joka oli täydennetty transferriinillä (5 μ$/τη1) , Na2Se03:llä (30 nmol/1) ja etanoliamiinilla (Sigma) (0,2 mmol/1) . Alusta vaihdettiin joka 2. tai 3.
30 päivänä. 10 vrk:n kuluttua solut kiinnitettiin formalii-nilla (Fisher Scientific Co.) ja värjättiin Giemsalla : (Fisher Scientific Co.).
Proteiinin mikrosekventointi
Noin 4 Mg (150 pmol) C4-kolonnin aktiivisista 35 fraktioista saatua proteiinia liuotettiin uudelleen '·*’ 50-%:iseen TFArhan ja laitettiin kaasufaasiproteiinise- 29 114711 kventointilaitteeseen (Applied Biosystems). Toteutettiin 20 Edman-hajotussykliä ja aminohappojohdannaiset identifioitiin automaattisella on-line-HPLC:llä (malli 120A, Applied Biosystems).
5 Tulokset
Kasvutekijän detektointi ja eristäminen
Eri solulinjöistä saatujen säädettyjen alustojen alustava tutkiminen osoitti, että joistakin fibroblasti-linjöistä saadut alustat sisälsivät sekä BALB/MK- että 10 NIH/3T3-soluilla detektoitavissa olevia mitogeenisia aktiivisuuksia. Keittäminen tuhosi aktiivisuuden BALB/MK-solujen suhteen, kun taas mitogeeninen vaikutus NIH73T3-soluihin säilyi muuttumattomana. EGF:n (1-15) ja TGFarn (1-16) tunnetun lämpöstabiiliuden perusteella pääteltiin, 15 että mitogeeninen aktiivisuus BALB/MK-solujen suhteen saattaisi aiheutua aineesta, joka on muu kuin nämä tunnetut epiteelikasvutekijät.
M426, ihmissikiön keuhkofibroblastilinja, valittiin tämän aktiivisuuden tuotantokykyisimpänä lähteenä 20 otaksuttujen yhden tai useamman kasvutekijän puhdistamiseen. Pellicon-järjestelmällä tehtävä ultrasuodatus tarjo-·· si kätevän tavan pienentää näytteen tilavuus sopivaksi • / myöhempää kromatograiaa varten. Puhdistusohjelman kehittä- : misen aikana kokeiltiin seulonta-, ioninvaihto- ja • ·'. 25 isoelektrisen fokusointikromatografiän erilaisia yhdistel- miä, mutta kaikki johtivat hyväksyttävää matalampiin saan-töihin. Hepariini-Sepharose-af f initeettikromatograf ia • < i (HSAC), jota on käytetty muiden kasvutekijöiden puhdistamisessa (1-17 - 1-22), osoittautui sen sijaan käyttökel- ·;;; 30 poiseksi varhaisena puhdistusvaiheena tämän keksinnön yh- *···* teydessä. Vaikka arviot talteensaadusta ominaisaktiivisuu- : desta olivat epävarmoja tässä vaiheessa muiden tekijöiden todennäköisen läsnäolon vuoksi, näennäinen aktiivisuus- *, saanto oli 50 - 70 %, joka vastaa noin 1 000-kertaista ri- • » · ”* 35 kastumista.
« < t » · * 30 114711
Kuten kuviossa 1 esitetään, yli 90 % mitogeenises-ta aktiivisuudesta BALB/MK:n suhteen eluoitui HSAC-kolonnista 0,1 mol/1 NaCl-liuoksella. Tämä aktiivisuus-piikki ei liittynyt mihinkään NIH/3T3-soluihin kohdistu-5 vaan aktiivisuuteen (tuloksia ei esitetä). NaCl-pitoi-suuden ollessa 0,8 - 1,2 mol/1 saatiin johdonmukaisesti paljon pienempi mitogeenisen BALB/MK-aktiivisuuden piikki.
HSAC-mallin toistettavuuden ansiosta aktiiviset fraktiot pystyttiin identifioimaan oletustasolla gradien-10 tin ja optista tiheyttä kuvaavan käyrän perusteella. Nopea konsentrointi 10 - 20-kertaiseen väkevyyteen Centricon- 10:llä havaittiin välttämättömäksi stabiiliuden kannalta, joka saatiin sitten säilymään muutamia kuukausia lämpötilassa -70 °C.
15 Lopullinen puhdistus saatiin aikaan C4-Vydac- kolonnilla toteutettavalla RP-HPLC:llä, joka on aminohap-posekvenssianalyysiin soveltuva preparatiivinen menetelmä.
Vaikka C4-vaiheen aktiivisuussaanto oli tavallisesti vain muutamia prosentteja, voitiin tämän häviön katsoa johtu-20 van käytetyistä liuottimista. Toisissa kokeissa käsittely 0,l-%:isella TFA:lla/50-%:isella asetonitriilillä tunnin • '· ajan huoneenlämpötilassa alensi valmisteen mitogeenista • aktiivisuutta 98 %. Kuten kuviossa 2 osoitetaan, saatiin : kuitenkin aikaan yksi BALB/MK-soluja stimuloivaa aktiivi- • « » ·*·*. 25 suutta vastaava piikki, joka sopii yhteen optista tiheyttä ...j kuvaavassa käyrässä olevan muista erottuvan piikin kanssa.
Piikkiä vastaavat fraktiot antoivat yhden vyöhykkeen Na-DodS04/PAGE:ssa värjättäessä geeli hopealla (kuvio 2B), ja kunkin testatun fraktion suhteellinen mitogeeninen aktii- I ; · h 30 visuus (kuvio 2C) korreloi hyvin vyöhykkeiden intensitee- * * * * tin kanssa aktiivisuuskäyrän alueella.
: : : Yksi edellä kuvatulle HPLC-menetelmälle vaihtoeh- toinen puhdistusmenetelmä, jossa käytetään seulontakroma-tografiaa, joka tehdään TSK G3000SW GlasPak -kolonnilla ;;; 35 eluoiden lähellä fysiologista pH-arvoa olevalla vesiliuok- ···’ sella, johti yhteen suureen aktiivisuuspiikkiin biologi- 31 114711 sessa BALB/MK-määrityksessä (kuvio 3) . Tämä valmiste oli lähes yhtä puhdas kuin RP-HPLC:stä saatu hopeavärjätyn Na-DodS04/PAGE:n mukaan arvosteltuna (tuloksia ei esitetä), mutta aktiivisuussaanto oli paljon parempi (taulukko 1-1).
5 TSK:11a puhdistettua materiaalia käytettiin rutiininomaisesti biologisiin tutkimuksiin, koska sen ominaisaktiivisuus oli korkeampi.
Kummassakin puhdistettujen valmisteiden tyypissä (ts. HPLCrllä ja molekyyliseulonnalla puhdistetussa) mito-10 geenien aktiivisuus liittyi yhteen muista erottuvaan vyöhykkeeseen NaDodS04/PAGE: ssa, joka näytti täysin samanlaiselta näillä kahdella valmisteella.
Kasvutekijän fysikaalinen ja biologinen karakterisointi 15 Puhdistetun tekijän arvioitu moolimassa oli noin 28 kD pelkistävissä (kuvio 1) ja pelkistämättömissä olosuhteissa (tuloksia ei esitetä) tehdyn NaDodS04/PAGE :n perusteella. Tämä arvo sopi hyvin yhteen sen kanssa, missä asemassa se eluoitui kahdesta eri kokolajittelukolonnista, 20 joita eluoitiin liuottimilla, joiden odotettiin säilyttävän luontainen konformaatio (TSK-G3000-SW, kuvio 1, ja Su-; · perose-12, tuloksia ei esitetä). Näiden tulosten perus- : ; teella mitogeeni näyttää koostuvan yhdestä polypeptidiket- justa, jonka moolimasa on 25 - 30 kD.
25 Mitogeenisen aktiivisuuden lämpö- ja happoherkkyys ; osoitettiin käyttämällä biologista BALB/MK-mitogeneesi- määritystä. Aktiivisuuteen ei vaikuttanut 10 minuutin in-kubointi lämpötilassa 50 °C, mutta se heikkeni 68 % inku-boitaessa 10 min lämpötilassa 60 °C ja oli vähentynyt de-30 tektointirajan alapuolelle 3 minuutin kuluttua lämpötilas- » » ’···’ sa 100 °C. Käsittely etikkahapolla (0,5 mol/1) 60 minuuttia huoneenlämpötilassa johti aktiivisuuden ale-nemiseen 14 %:ksi vertailuarvosta. Sen sijaan mikään näis- * > * *. tä käsittelyistä ei heikentänyt tunnetun kasvutekijän, » I · 35 EGF:n, mitogeenista aktiivisuutta.
32 114711
Kuvion 4 esittämä puhdistetun kasvutekijän annos-vastekäyrä valaisee sitä, että niinkin pieni pitoisuus kuin 0,1 nmol/1 johti havaittavissa olevaan DNA-synteesin stimulaatioon. Niinpä aktiivisuusalue oli vertailukelpoi-5 nen muiden tähän mennessä analysoitujen kasvutekijöiden vastaavan alueen kanssa. Lineaarinen riippuvuus havaittiin pitoisuusalueella 0,1 - 1,0 nmol/1; stimulaatio oli maksimiarvossaan, 600-kertainen, pitoisuudella 1,0 nmol/1. Tämä uusi tekijä indusoi johdonmukaisesti tymidiinin korkeamman 10 maksimisisällytyksen kuin EGF, aFGF tai bFGF BALB/MK-keratinosyyteissä (kuvio 4).
Tämän tekijän muista eroava kohdesoluspesifisyys osoitettiin vertaamalla sen aktiivisuutta eri solutyyppien suhteen muiden kasvutekijöiden aktiivisuuksiin, joilla 15 tiedetään olevan mitogeeninen aktiivisuus epiteelisolujen suhteen. Kuten taulukossa 1-2 osoitetaan, tällä juuri eristetyllä tekijällä oli voimakas mitogeeninen vaikutus BALB/MK-soluihin, mutta se indusoi myös osoitettavissa olevan tymidiinin sisällytyksen muiden testattujen epitee-20 lisolujen DNA:han. Tällä tekijällä ei sen sijaan ollut havaittavissa olevia mitogeenisia vaikutuksia hiiren (tai ' ihmisen, tuloksia ei esitetä) fibroblasteihin eikä ihmisen i ’,· jalkavarren laskimon endoteelisoluihin.
// Vertailun vuoksi mainittakoon, että yksikään muis- : : 25 ta tunnetuista kasvutekijöistä ei näyttänyt stimuloivan * ensisijaisesti kerätinosyyttejä. TGFarlla ja EGFrllä oli voimakas vaikutus fibroblasteihin, kun taas FGF:t olivat mitogeenisia endoteelisolujen samoin kuin fibroblastien suhteen (taulukko 1-2) . Epiteelisoluspesifisyytensä, ja / 30 erityisesti kerätinosyyttien herkkyyden, vuoksi tämä uusi ‘1’ mitogeeni nimettiin tilapäisesti keratinosyyttikasvuteki- !/ ' jäksi (KGF) .
Sen todistamiseksi, että KGF ei pelkästään stimu- loi DNA-synteesiä, vaan tukee myös pitkään kestävää solu-3 5 jen kasvua, tutkittiin BALB/MK-solujen kykyä kasvaa täysin i l määritellyssä, seerumittomassa alustassa, jota on täyden- 33 114711 netty tällä kasvutekijällä. Kuten kuviossa 5 osoitetaan, KGF toimi erinomaisena EGF:n muttei insuliinin (eikä insuliinin kaltaisen kasvutekijän I) korvaajana tässä kemiallisesti määritellyssä alustassa. Niinpä KGF näyttää toimi-5 van EGFille, aFGF:lie ja bFGF:lie yhteisen tärkeän signaa-linvälitysreitin kautta BALB/MK-solujen proliferaation ollessa kyseessä.
Mikrosekventolnti paljastaa KGF:n ainutlaatuisen N-terminaalisen aminohapposekvenssin 10 Tämän kasvutekijän karakterisoimiseksi edelleen tehtiin aminohapposekvenssianalyysi noin C4-puhdistetusta materiaalista (noin 150 pmol). Detektoitiin yksi sekvenssi tuloksen ollessa yksiselitteinen syklien 2-13 kohdalla, joka sekvenssi oli seuraava: X-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu- 15 Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val. Korkea taustakohina esti ensimmäisen aseman määrittämisen, jota merkitään siksi kirjaimella X.
Tietokonehaku, jossa käytettiin FASTP-ohj elmaa (1-24) osoitti, että KGF:n N-terminaalinen aminohappose-20 kvenssi ei ollut merkitsevästi homologinen minkään the National Biomedical Research Foundationin tietopankissa ole- • · : ” van proteiinin kanssa, mikä tukee tämä epiteelikasvuteki- • · * | jän uutuutta.
Tulosten pohdinta 25 Tässä kokeellisessa osassa kuvatuissa tutkimuksis- ; j sa identifioitiin ihmisen kasvutekijä, jolla on ainutlaa- . tuinen spesifisyys epiteelisolujen suhteen. Käyttämällä ultrasuodatusta, HSAC:tä ja RP-HPLC:tä tai TSK-seulontakromatografiaa tämän keksinnön mukaisesti eristet-30 tiin riittävä määrä materiaalia tämän molekyylin fysikaa-l’ listen ja biologisten ominaisuuksien yksityiskohtaisen ka- V ί rakterisoinnin mahdollistamiseksi.
: : RP-HPLC:n aktiivisista fraktioista detektoitiin ’·, hopealla värjäytyvä vyöhyke, joka vastaa moolimassaa noin III 35 28 000 daltonia, ja tämän vyöhykkeen intensiteetti oli verrannollinen näiden fraktoiden mitogeeniaktiivisuuspi- 34 114711 toisuuteen. Vyöhyke, joka ei ollut erotettavissa RP-HPLC-fraktioiden antamasta vyöhykkeestä, havaittiin TSK-kromatografiästä saaduissa aktiivisissa fraktioissa. Puhdistettu proteiini stimuloi DNA-synteesiä epiteelisoluissa 5 nanomolaarisuusaluetta pienempinä pitoisuuksina, mutta ei onnistunut indusoimaan tymidiinin sisällytystä fibroblas-tien tai endoteelisolujen DNA:han vertailukelpoisina tai suurempia pitoisuuksina (pitoisuuteen 5 nmol/1 asti). Tämä muista eroava kohdesoluspesifisyys yhdistettynä puhdiste-10 tusta molekyylistä määritettyyn uuteen N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin, joita on vain yksi, johtaa päätelmään, että KGF edustaa uutta kasvutekijää.
Kemiallisesti määritellyssä alustassa puhdistettu tekijä pystyi korvaamaan BALB/MK-solujen kasvun vaatiman 15 insuliinin kaltaisen kasvutekijä I:n/insuliinin ja siksi sen täytyy toimia EGF:lie, TGFoi.-lle ja FGF.-ille yhteisen signaalinvälitysreitin kautta. Lisäksi tämä uusi tekijä stimuloi tymidiinin sisällytystä BALB/MK-soluihin tehokkaammin kuin mikään tunnetuista epiteelisolumitogeeneista.
20 On olemasa alustavia todisteita siitä, että tällä tekijällä on myös kyky tukea ihmisen keratinosyyttien sekundaa-i risten viljemien proliferaatiota (tuloksia ei esitetä) .
; KGF:n käsittely ja säilytys olivat ongelmallisia ' : sen puhdistuksen aikana. Luontaisen happo- ja lämpöherk- : 25 kyytensä lisäksi se oli epästabiili kylmäkuivauksessa tai : dialyysissä. HSAC:n jälkeen tapahtui aktiivisuuden täydel- , linen häviäminen 24 tunnissa huolimatta kantajaproteiini en, hepariinin, proteaasi-inhibiittoreiden tai silikonikä-siteltyjen putkien käytöstä tai säilyttämisestä lämpöti-30 lassa 4 tai -20 °C. Vain konsentroimalla näyte tässä vai-;·' heessa voitiin sen aktiivisuus säilyttää.
: : ί Lisäksi kuivatun, puhdistetun tekijän siirtämisek- ; si oli välttämätöntä käyttää joko vahvaa happoa tai pinta- aktiivista ainetta adsorptiotaipumuksen tai liukenematto-;;; 35 muuden vuoksi. Niinpä aktiivisuuden säilyttämiseksi puh- '··*’ distettu tekijä säilytettiin suurina pitoisuuksina liuok- 35 114711 sessa lämpötilassa -70 °C, jolloin se pysyi stabiilina muutamia kuukausia.
KGF:n kyky sitoa hepariinia saattaa merkitä tämän tekijän yhtä perusominaisuutta, jolla on tekemistä sen 5 toiminnan kanssa in vivo. Kasvutekijöihin, joilla on hepa-riininsitomisominaisuuksia kuuluvat aFGF (1-20 - 1-22), bFGF (1-19, 1-22), granulosyytti-/makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä ja interleukiini 3 (1-25). Kutakin näistä tuottavat stroomasolut (1-25 - 1-27) . Tällaiset tekijät 10 näyttävät kerääntyvän solujen ulkopuoliseen matriksiin tai stroomasolujen pintaa peittäville proteoglykaaneille (1-25, 1-28). On väitetty, että tämä vuorovaikutus säätelee niiden varastoitumista, vapautumista ja kontaktia spesifisten kohdesolujen kanssa (1-25, 1-28). Vaikka on ku- 15 vattu myös alkeistukikudosperäisiä epiteelisolujen proli-feraatioon vaikuttavia aineita (1-29 - 1-31), ei ole selvitetty, mitä yhdisteitä ne ovat. Hepariininsitomisominai-suudet, vapautuminen ihmissikiön fibroblastistroomasoluis-ta ja epiteelisolutropismi antavat KGF:lle kaikki ominai-20 suudet, joita odotetaan tällaiselta epiteelisolujen normaalin kasvun eritysvälitysaineelta.
Tämän uuden kasvutekijän määritetty osittainen '/· aminohapposekvenssi on mahdollistanut sen koodittavan sek- : venssin kloonamisen molekyylitasolla ja sen ja tunnettujen ; 25 kasvutekijäryhmien rakenteellisen sukulaisuuden määrittä- : misen jäljempänä luvussa Kokeellinen osa II kuvattavalla tavalla.
Kokeelliseen osaan I liittyvät kirjallisuusviitteet ’ 3 0 1-1. James, R. ja Bradshaw, R. A. Ann. Rev. Bio- chem. 53 (1984) 259 - 292 ; , : 1-2. Doolittle, R. F., Hunkapiller, M. W., Hood, I ; L. E., Devare, S. G., Robbins, K. C., Aaronson, S. A. ja
Antoniades, M. N., Science 221 (1983) 275 - 277 t » '; 35 1-3. Waterfield, M. D., Scrace, G. J., Whittle, i N., Strooband, P., Johnson, A., Wasteton, A., Westermark, 36 114711 B., Heidin, C.-H., Huang, J. S. ja Deuel, T. F., Nature 304 (1983) 35 - 39 1-4. Hunter, T. ja Cooper, J. A., Ann. Rev. Bio-chem. 54 (1985) 897 - 930 5 1-5. Wright, N. ja Allison, M. , The Biology of
Epithelial Cell Populations, vol. 1. Oxford University Press, New York 1984, s. 3 - 5 1-6. Weissman, B. E. ja Aaronson, S. A., Cell 32 (1983) 599 - 606 10 1-7. Falco, J. P., Taylor, W. G. , DiFiore, P. P.,
Weissman, B. E. ja Aaronson, S. A., Oncogene 2 (1988) 573 - 578 1-8. Aaronson, S. A. ja Todaro, G. J., Virology 36 (1968) 264 - 261 15 1-9. Laemmli, U. K., Nature 227 (1970) 680 - 685 1-10. Merril, C. R., Goldman, D., Sedman, S. A. ja Ebert, M. H., Science 211 (1981) 1437 - 1438 1-11. Jainchill, J. L., Aaronson, S. A. ja Todaro, G. J., J. Virol. 4 (1969) 549 - 553 20 1-12. Caputo, J. L. , Hay, R. J. ja Williams, C.
D., In Vitro 15 (1979) 222 - 223 1-13. Stampfer, M. R. ja Bartley, J. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 2394 - 2398 : 1-14. Sharefkin, J. B., Fairchild, K. D., Albus, j' : 25 R. A., Cruess, D. F. ja Rich, N. M., J. Surgical Res. 41 ,.. : (1986) 463 - 472 t t 1-15. Cohen, S., J. Biol. Chem. 237 (1962) 1555 - • * * * 1562 1-16. DeLarco, J. E. ja Todaro, G. J. Proc. Natl.
·;;; 30 Acad. Sci. USA 75 (1978) 4001 - 4005 '·;·* 1-17. Raines, E. W. ja Ross, R., J. Biol. Chem.
IY: 257 (1982) 5154 - 5160 1-18. Shing, Y., Folkman, J., Sullivan, R., Butterfield, C., Murray, J. ja Klagsburn, M. , Science 223 35 (1984) 1296 - 1299 • » I » 37 114711 1-19. Gospodarowicz, D., Cheng, J., Lui, G.-M.,
Baid, A. ja Bohlen, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6963 - 6967 ; 1-20. Maciag, T., Mehlman, T., Friesel, R. ja ! 5 Schreiber, A. B., Science 225 (1984) 932 - 935 1-21. Conn, G. ja Hatcher, V. B., Biochem. Bio-phys. Res. Comm. 124 (1984) 262 - 268 1-22. Lobb, R. R. ja Fett, J. W. , Biochemistry 23 (1984) 6295 - 6299 10 1-23. Bradford, M. , Anal. Biochem. 72 (1976) 248 - 254 1-24. Lipman, D. J. ja Pearson, R. W., Science 227 (1985) 1435 - 1441 1-25. Roberts, R., Gallagher, J. , Spooncer, E., 15 Allen, T. D., Bloomfield, F. ja Dexter, T. M., Nature 332 (1988) 376 - 378 1-26. Libermann, T. A., Friesel, R. , Jaye, M. ,
Lyall, R. M., Westermark, B., Drohen, W., Schmidt, A., Maciag, T. ja Sclessinger, J. , EMBO J. 6 (1987) 1627 - 20 1632 1-27. Shipley, G. D., Sternfeld, M. D., Coffey, R.
! '* J. ja Pittelkow, M. R. , J. Cell. Biochem. Supp. 12A (1988) • 125, tiivistelmä C420 : 1-28. Vlodavsky, I., Folkman, J., Sullivan, R. , ; 25 Fridman, R., Ishai-Michaeli, R., Sasse, J. ja Klagsburn, j M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 2292 - 2296 . ,·. 1-29. Gilchrest, B. A., Karassik, R. L., Wilkins, L. M., Vrabel, M. A. ja Maciag, T., J. Cell. Physiol. 117 (1983) 2325 - 240.
;;; 3 0 1-30. Chan., K. Y. ja Haschke, R. H., Exp. Eye
Res. 36 (1983) 231 - 246 1‘. : 1-31. Stiles, A. D., Smith, B. T. ja Post, M. ,
Exp. Lung Res. 11 (1986) 165 - 177 ! 38 114711
Kokeellinen osa II
Uuden epiteelisoluspesifisen kasvutekijän cDNA- sekvenssi määrittelee FGF-ryhmän uuden jäsenen
Edellisessä luvussa, Kokeellinen osa I, kuvatussa 5 työssä identifioitiin ja puhdistettiin uusi hepariinia sitova kasvutekijä, josta käytetään nimitystä kerätinosyyt-tikasvutekijä (KGF) ja joka on erityisen aktiivinen kera-tinosyyttien suhteen ja näyttää olevan spesifinen epiteelisoluille. Tässä toisessa kokeellisessa osassa kuvataan 10 KGF:ää koodittavien cDNA-kloonien eristämistä ja karakterisointia käyttämällä hybridisaatiokoettimina synteettisiä oligonukleotideja, jotka perustuvat kokeellisesti määritettyyn NH2-terminaaliseen aminohapposekvenssiin. Nukleo-tidisekvenssianalyysi osoitti 582 emäsparin (ep) avoimen 15 lukukehyksen, joka koodittaisi 194 aminohapon polypepti-diä, joka on 41 - 33-%:isesti identtinen hepariinia sitovan happaman ja emäksisen fibrblastikasvutekijän (FGF:ien) ja nille sukua olevien hst- ja int-2-onkogeenituotteiden kanssa. KGF-geenin RNA-transskripti ilmentyy sekä sikiöstä 20 että aikuisesta peräisin olevissa normaaleissa fibroblas-teissa muttei epiteeli-, endoteeli- eikä gliasoluissa.
• ’'· Niinpä KGF näyttää normaalisti syntyvän alkeistukikudok- • sessa, mikä osoittaa sen osallistuvan epiteelisolujen pro- : 1 if eräät ion säätelyyn.
; 2 5 Materiaalit ja menetelmät 1 · . : cDNA-kloonien eristäminen KGF : n puhdistamista ja N-terminaalista sekventoin-tia on kuvattu aiemmin (katso Kokeellinen osa I ja II-3). Kohdassa Tulokset kuvattujen deoksioligonukleotidien yh- *(;; 30 distelmät (50 pmol) leimattiin 51-päästä käyttämällä 83 pmol r-32P-ATP:tä (3000 Ci/mmol, Amersham) ja 10 yksik-: : köä T4-polynukleotidikinaasia. cDNA-kloone j a sisältävälle yhistelmäfaagille tehtiin replikasiirrostus nitroselluloo-sasuodattimille ja hybridisointi 32P-leimattuj en deok-
;;; 35 sioligonukleotidien kanssa yön yli lämpötilassa 42 °C
• I
’*“* seoksessa, jonka koostumus oli 20 % formamidia, 10 % 39 114711 dekstraanisulfaattia, 10 mmol/1 Tris-HCl:a (pH 7,5), 8 x SSC, 5 x Denhardtin liuos ja 50 Mg/ml denaturoitua lohen-maiti-DNA:ta. Suodattimet pestiin 0,5 x SSC:llä, joka sisälsi 0,1 % SDS:a, lämpötilassa 50 °C ja kuvattiin Kodak | 5 X-omat AR -filmille.
[ DNA-sekventointi ! KGF-cDNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin dide- oksiketjunpäättämismenetelmällä (11-26) osittain päällekkäisistä retriktiofragmenteista, jotka oli alikloonattu 10 pUC-vektoreihin (11-27).
Bakteeri-iImentyrnisvektorin konstruointi KGF- cDNA: ta varten KGF-cDNA, joka koodittaa polypeptidin valmista, erittynyttä muotoa, sijoitettiin hybridi-trk-promoottorin 15 säätelyn alaiseksi plasmidi-ilmentymisvektoriin pKK233-2 (11-31) seuraavasti. Tämän aikaansaamiseksi tiettyä aluetta KGF-cDNA:ta, joka sisälsi valmiin KGF-molekyylin (ts. signaalipeptidiään sisältämättömän) koodittamiseen tarvittavan informaation, lisättiin käyttämällä polymeraasiket-20 jureaktio (PCR) -menetelmää (11-32). Tämä fragmentti si joitettiin suunnatusti vektorissa olevien kahden kohdan, Sl-nukleaasipilkonnalla tylppäpäiseksi tehdyn Ncol-kohdan ja HindiII-kohdan, väliin käyttämällä tavanomaisia yhdis-: telmä-DNA-menetelmiä. PCR-menetelmällä valmistetun KGF- ; : 25 cDNAm päät olivat seuraavat; 5'-pää oli tylppä ja alkoi · ATG-kodonilla, jota seurasi cys-ryhmää vastaava kodoni .TGC, numero 33, joka on KGF:n valmiin muodon aminotermi-naalinen ryhmä (katso kuvio 6), ja sitten koko KGF:n koo-ditussekvenssi. Lopetuskodoni, TAA; ja sitä välittömästi 30 seuraavat neljä emästä, TTGC, sisältyivät myös cDNA:n 3'- **;·' päähän. Aluke, jota käytettiin PCR-menetelmässä ohjaamaan : DNA-synteesi haluttuun asemaan cDNA.-n 3'-päässä, sisälsi
HindiII-kohdan lisätyn cDNA:n sijoittamiseksi vektori-DNA: hän.
35 40 114711 KGF:n ja KGF:n sukulaispeptidien vastaisten vasta-aineiden tuotanto
Monoklonaalisia vasta-aineita muodostettiin hiirissä ihmisen fibroblasteista peräisin olevaa muuttumaton-5 ta, puhdistettua proteiinia vastaan käyttämällä vähintään 5 ihonalaista injektiota. Verinäytteet tutkittiin kiin-teäfaasi (ELISA) -määrityksellä käyttämällä antigeeninä ihmisen epiteelisoluista saatua hyvin puhdasta KGF-.ää. Hybridoomat valmistettiin tavanomaisin menetelmin ja su-10 pernatantit tutkittiin ELISA-määrityksellä KGF:n kanssa reagoivien vasta-aineiden detektoimiseksi. Positiivisista klooneista tehtiin alikloonaussarja tavanomaisin menetelmin ja valittuja aliklooneja kasvatettiin vesivatsakas-vaimina hiirissä suurten vasta-ainemäärien tuottamiseksi.
15 Vasta-aineet puhdistettiin vesivatsanesteistä käyttämällä tavanomaisia menetelmiä (esimerkiksi hydroksiapatiitti-tai immuuniaffiniteettihartseja).
Polyklonaalisia vasta-aineita muodostettiin synteettistä peptidiä vastaan kaniineissa tavanomaisin mene-20 telmin seuraavasti. Peptidit valmistettiin kjiinteäfaasi-menetelmällä ja kytkettiin tyroglobuliiniin reaktiolla • ’· glutaarialdehydin kanssa. Toteutettiin sarja ihonalaisia j injektioita ja tutkittiin verinäytteet ELISA:lla samoin : kuin muilla menetelmillä, mukaan luettuna Western- 25 täpläanalyysi ja biologinen mitogeneesimääritys. IgG- immunoglobuliinit eristettiin af f initeettikromatograf iällä käyttämällä immobi li soitua proteiini G:tä.
Polyklonaalisia vasta-aineita muodostettiin kaniineissa sekä luonnossa ihmisen fibroblasteista erittyvää ;; 30 KGF:ää että E. colissa tuotettua yhdistelmä-KGF:ää (katso seuraava osa) vastaan käyttämällä seuraavaa ohjelmaa: ; : : i) Ensimmäinen injektio ja ensimmäinen tehostean- ; nos annettiin nivusalueen imusolmukkeisiin; ii) seuraavat tehosteannokset annettiin lihaksen-;;; 35 sisäisesti.
41 114711
Verinäytteet tutkittiin ELISA:11a samoin kuin Western- täpläanalyysillä ja biologisella mitogeneesimäärityk-sellä ja IgG puhdistettiin edellä synteettisten peptidien vastaisten vasta-aineiden yhteydessä kuvatulla tavalla.
5 Tulokset
Uutta kasvutekijää koodittavien cDBA-kloonien eristäminen KGF:ää koodittavaa sekvenssiä vastaavien cDNA-kloonien etsimiseksi muodostettiin kaksi 26 emäksen pi-10 tuisten oligonukleotidien yhdistelmää, jotka perustuivat 9 aminohapon sekvenssiin Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala, joka oli määritetty mikrosekventoimalla puhdistettu KGF (katso edellä oleva Kokeellinen osa I ja viite II-3) . Toinen oligonukleotidiyhdistelmä sisälsi näitä yhdeksää 15 aminohappoa vastaavien kaikkien mahdollisten kooditusse- kvenssien (256 kpl) seoksen, kun taas toinen sisälsi ino-siiniryhmät Thr:a ja Pro:a vastaavien kodonien degeneroituneessa kolmannessa asemassa.
j Tämä viimeksi mainittu malli pienensi yhdistel- ! 20 mässä olevien mahdollisten kooditussekvenssien lukumäärän 16:ksi. tRNA-antikodonissa oleva inosiini voi muodostaa ,· *’* vetysidoksia A:n, C:n tai U:n kanssa (II-4) , ja deoksi- | inosiinia sisältävien oligonukleotidien on osoitettu hyb- : ridisoituvan tehokkaasti vastaavan cDNA-.n kanssa (II-5) .
·'·*. 25 cDNA-kirjasto muodostettiin cDNA-kloonausvekto- : rissa, pCEV9-.ssä (II-6) , käyttämällä ihmissikiön keuhko- fibroblastisolulinjasta M426, tämän kasvutekijän alkuperäisestä lähteestä, eristettyä polyadenyloitua RNA:ta (II-7) . Kirjaston (9.105 pesäkettä) tutkiminen 32P-leimatuilla 30 26-meerioligonukleotideilla antoi tulokseksi 88 pesäkettä, jotka hybridisoituivat kummankin oligonukleotidikoetinyh-; :: distelmän kanssa.
i ·
I 1 I
42 114711
Valittujen cDNA-kloonien karakterisointi ja sek- ventointi
Analysoiduista 10 pesäkepuhdistetusta kloonista yksi, jolle annettiin merkintä klooni 49, sisälsi 3,5 ke:n 5 cDNA-insert in, kun taas muissa oli 1,8 - 2,1 ke:n insert- tejä.
Pienempien kloonien analysointi osoitti muutamia yhteisiä restriktiokohtia. Yhden tyypillisen pienemmän kloonin, josta käytetään merkintää klooni 32, sekventointi 10 kloonin 49 ohella osoitti, että ne olivat osittain pääl lekkäisiä cDNA:ita (kuvio 6A) . Klooni 49 syntyi alkaen viestin poly(A)-hännästä, kun taas klooni 32 syntyi kirjaston muodostamisen aikana oligo(dT)alukkeen hybridisoi-J tuessa runsaasti A: ta sisältävän sekvenssin kanssa KGF- j 15 mRNA:n 3'-pään koodittamattomalla alueella.
' KGF-polypeptidiä koodittavan sekvenssin kuvaus
Kahden cDNA:n (kloonit 32 ja 49) asettaminen kohdakkain osoitti jatkuvan 3,85 kem sekvenssin, joka sisälsi koko KGF:ää koodittavan sekvenssin (kuvio 6B). ATG, jo-20 ka oli todennäköisesti aloituskodoni, sijaitsi nukleoti-diasemassa 446, jolloin muodostui 582 emäsparin avoin lu-I 1 kukehys, joka päättyi asemassa 1030 olevaan TAA-lopetus- • ',· kodoniin. Tämä avoin lukukehys koodittaisi 194 aminohapon : i polypeptidiä, jonka laskennallinen moolimassa on 22 512 25 daltonia.
·; · ATG-kodonin vieressä oleva sekvenssi ei vastannut ehdotettua konsensussekvenssiä GCC (G/A) CCATGG, joka olisi « optimaalinen eukaryoottiribosomien aikaansaaman initiaation kannalta (II-8), kolmen nukleotidin päässä ATG-kodonin 30 edellä oli kuitenkin A. Tässä asemassa oleva A on tämän konsensussekvenssin parhaiten säilynyt nukleotidi. Tätä ·'_! ί ATG-kodonia edelsi 85 nukleotidin päässä samassa lukuke- hyksessä oleva TGA-lopetuskodoni.
19 aminohapon sekvenssi, joka oli homologinen puh-35 distetun KGF:n kokeellisesti määritetylle NH2-päälle, al- ·** koi 32 aminohappoa ehdotetun initiaatiokodonin jälkeen.
43 114711
Ennustettu ja kokeellisesti määritetty aminoahapposekvens-si olivat täysin vastaavia, siinä määrin kuin yksiselit-j teisiä tulkintoja pystyttiin tekemään.
KGF:n ja minkä tahansa tunnetun proteiinin välisen 5 homologian etsimiseksi tehtiin tietokonehaku the National Biomedical Research Foundationin tietokannasta käyttämällä Lipmanin ja Pearsonin FASTP-ohjelmaa (II-9). Tällä lä-i hestymistavalla osoitettiin silmiinpistävä sukulaisuus KGF:n ja happaman ja emäksisen FGF:n samoin kuin hst:n ja 10 int-2:n koodittamien sukulaisproteiinien ennustettujen primaarirakenteiden välillä.
KGF-geenin mRNA-transskriptien. ilmentyminen ihmis-soluissa
Tehtäessä alustavia yrityksiä tutkia KGF-mRNA:n 15 ilmentymistä ihmissoluissa koetin, joka kattoi pääosan 1 KGF:ää koodittavasta sekvenssistä (koetin Am kuvio 6A) , detektoi yhden 2,4 ke:n transskriptin koko M426-RNA-.n Northern-täpläanalyysissä (kuvio 6C) . Tämä oli huomattavasti lyhyempi kuin yhdistelmä-cDNA-sekvenssi, 3,85 ke.
20 Tutkittaessa poly(A)-valikoitua M426-RNA:ta detek- toitiin kuitenkin lisätransskripti, jonka pituus oli noin : 5 ke. Lisäksi koetin, joka oli peräisin kloonin 49 trans- • · t • */ loitumattomalta alueelta, 3'-suuntaan kloonin 32 päästä : j : (koetin B, kuvio 6A) , hybridisoitui ainoastaan suurempaan 25 viestiin (kuvio 6C) . Niinpä näyttää siltä, että KGF-geeni -·· \ kopioituu vaihteleviksi RNA:iksi. FGF-geeniryhmän kahdessa , muussa jäsenessä, bFGF:ssä (11-29) ja int-2-.ssa (11-30) esiintyy myös useita RNA:ita, joiden merkitystä ei vielä ole määritetty.
30 KGF:n normaalin toiminnallisen roolin tutkimiseksi ’ ** tarkasteltiin sen transskriptin ilmentymistä erilaisissa : : ihmissolulinjoissa ja -kudoksissa. Kuten kuviossa 8 esite- ; tään, vallitseva 2,4 ke:n KGF-transskripti detektoitiin kaikissa sikiö-, vastasyntynyt- ja aikuislähteiden epiteeli 35 likudoksista peräisin olevissa stroomafibroblastilinjoissa muttei normaalilähteistä saaduissa epiteelisolulinjoissa.
44 114711 Tämä transskripti detektoitiin myös normaalin aikuisen munuaisista ja ruuansulatuselimistä, muttei keuhkoista eikä aivoista, eristetyssä RNA:ssa. Epiteelikudosten stroo-masoluissa tapahtuvan KGF-RNA-ilmentymisen silmiinpistävä 5 spesifisyys osoitti, että tämä tekijä osallistuu normaalisti epiteelisolujen kasvun alkeistukikudosstimulaatioon.
Vertailun vuoksi analysoitiin myös epiteelisoluihin tunnetusti vaikuttavien muiden kasvutekijöiden mRNA:ita edellä luetelluissa kudoksissa. Analysoitujen 10 epiteeli- ja stroomasolulinjojen kesken ei esiintynyt yhdenmukaista aFGF- tai bFGF-transskriptien ilmentymismallia (kuvio 8) . EGF-transskripti ei ilmentynyt yhdessäkään samassa solulinjassa; se havaittiin erilaisten kudosten joukosta ainoastaan munuaiskudoksessa. Lopuksi mainittakoon, 15 että TGFoj-viestiä ei detektoitu yhdessäkään stroomafibro-blastilinjassa ja se ilmentyi vaihtelevalla voimakkuudella kaikissa epiteelisolulinjoissa. Sitä detektoitiin myös pieninä pitoisuuksina tutkittujen kudosten joukosta munuaiskudoksessa (kuvio 8).
20 Hepariinin inhiboiva vaikutus KGFznmitogeeniseen aktiivisuuteen
Hepariinin on osoitettu voimistavan olennaisesti aFGF:n mitogeenista aktiivisuutta erilaisten viljeltyjen , ; kohdesolujen suhteen ja stabiloivan sitä lämmön aiheutta- ; 25 maa inaktivoitumista vastaan (11-21, 11-22). Huolimatta t : sitoutumisestaan tiukasti bFGF:ään, hepariinilla oli hyvin . vähäinen vaikutus sen mitogeeniseen aktiivisuuteen (II- 22). KGF:n ja FGF:ien sukulaisuuden vuoksi tutkittiin hepariinin vaikutusta KGF:n mitogeeniseen aktiivisuuteen.
'h, 30 Kuten taulukossa II-l osoitetaan, tymidiinin sisällytys « i BALB/MK-soluihin reaktiona KGFrään väheni l/16-osaan, kun • * · : : kasvualustaan sisällytettiin hepariinia. Sekä aFGF:n että bFGF:n aktiivisuus sitä vastoin kasvoi saman käsittelyn • t · vaikutuksesta.
» * I
• 9 I
35
• I
IM
45 114711
An.ti-KGF-vasta-aineid.en tuotanto
On valmistettu muutamia vasta-ainelajeja, jotka tunnistavat KGF- tai KGF:n kaltaisia polypeptidejä, käyttämällä kokeellisen immunologian alalla tunnettuja tavan-5 omaisia menetelmiä, joista on esitetty yhteenveto edellä menetelmäosassa. Niihin kuuluvat monoklonaaliset vasta-aineet, joita muodostetaan hiirissä ihmisen fibroblasteis-ta peräisin olevaa, muuttamatonta, puhdistettua proteiinia vastaan; polyklonaaliset vasta-aineet, joita muodostetaan 10 kaniineissa synteettisiä peptidejä vastaan, joiden sekvenssit perustuvat KGF-cDNA-sekvenssistä ennustettuihin aminohapposekvensseihin; polyklonaaliset vasta-aineet, joita muodostetaan kaniineissa sekä ihmisen fibroblasteis-ta luonnossa erittyvää KGF:ää että E. colissa tuotettua 15 yhdistelmä-KGF:ää vastaan (katso seuraava osa).
On puhdistettu kolmesta eri hybridoomasta saatuja monoklonaalisia vasta-aineita. Kaikki kolme tunnistavat yhdistelmän samoin kuin luonnossa esiintyvän KGF:n kiin-teäfaasi (ELISA) -määrityksessä. Yksikään ei ristireagoi 20 KGF:n kanssa denaturoivissa olosuhteissa (Western-täplä- analyysissä) eikä kumoa KGF:n mitogeenista aktiivisuutta : *1 * biologisessa BALB/MK-määrityksessä.
« · t | V Polyklonaalisia vasta-aineita muodostettiin käyt- : tämällä synteettistä peptidiä, jonka aminohapposekvenssi 25 oli NDMTPEQMATNVR, joka vastaa ryhmiä 32 - 44 KGF:ssä ; (katso kuvio 6) ja sisältää lisäksi R-ryhmän (arg) asemas- »'; . sa 45 cDNA:n todellisuudessa koodittaman asp-ryhmän sijas ta. Asp-ryhmä todennäköisesti glykosyloituu luonnon KGF-polypeptidissä ja näytti siksi olevan ryhmä arg aminohap-* 30 posekventointituloksissa, joita saatiin suoraan mainitusta polypeptidistä (katso jäljempänä osa Tulosten pohdinta).
I : Tällä synteettisellä peptidillä muodostetut polyklonaali- ; ; set vasta-aineet tunnistavat sekä luonnossa esiintyvän et tä yhdistelmä-KGF:n ELISA- ja Western-täpläanalyyseissä » 35 vähintään herkkyydellä, joka on niinkin pieni kuin 10 ng ‘ * proteiinia. Nämä vasta-aineet eivät kuitenkaan kumoa KGF:n 46 114711 mitogeenista aktiivisuutta biologisessa BALB/MK-määri-tyksessä.
Muuttamattoman, luonnollisen KGF-proteiinin vastaiset polyklonaaliset antiseerumit tunnistavat KGF:n sekä 5 ELISA- että Western-täplämäärityksessä. Tällaiset vasta-aineet näyttävät myös inhiboivan KGF:n aktiivisuutta biologisessa BALB/MK-määrityksessä.
KGF-cDNA:n ilmentyminen E. colissa KGF-cDNA saatettiin ilmentymään polypeptidin tuot-10 tamiseksi E. colissa sijoittamalla sen kooditussekvenssi hybridi-trk-promoottorin (käsittää elementtejä trp- ja lac-promoottoreista) säätelyn alaisuuteen plasmidiin pKK233-2 (11-31). Tämän tekemiseksi määrätyn pituista osaa KGF-cDNA:sta, joka sisälsi valmista (ts. signaalipeptidiä 15 sisältämätöntä) KGF-molekyyliä koodattavan informaation, lisättiin käyttämällä polymeraasiketjureaktiomenetelmää (11-32). Fragmentti sijoitettiin suunnatusti vektoriin kahden kohdan, Sl-nukleaasipilkonnalla tylppäpäiseksi teh-i dyn Ncol-kohdan ja HindiII-kohdan, väliin käyttämällä ta- 20 vanomaisia yhdstelmä-DNA-menetelmiä. Valitut yhdistelmät sekventoitiin cDNA:n 5'-päästä sen tarkistamiseksi, että ATG-aloituskodoni oli oikeassa kohdasssa trk-promoottorin : säätelyelementteihin nähden.
, Tutkittiin muutamista yhdistelmistä proteiinin 25 tuotanto tavanomaisin pienimittakaavaisin menetelmin. Ly- hyesti esitettynä kloonit kasvatettiin eksponentiaalisen vaiheen keskivaiheille (OD595 «0,5), käsiteltiin isopropyy-Ιϊ-β-D-tiogalaktopyranosidilla (IPTG, 1 mmol/1) 90 min ja . käsiteltiin solu-uutteet elektroforeettisesti SDS-polyak- 3 0 ryyliamidigeeleillä Western-täpläanalyysiä varten. Kaikki ’·;** tutkitut yhdistelmät syntetisoivat proteiinia, jonka ami- : noterminaalista KGF-peptidiä vastaan muodostetut vasta- aineet tunnistivat. Valittiin yksi yhdistelmä, jolla IPTG-induktio oli voimakkain, proteiinin jatkoanalysointia var-;;; 35 ten.
Il» 47 114711
Kasvatettiin 1 1 bakteereja NZY-liemessä, joka sisälsi 50 μg/ml ampisilliinia ja 12,5 Mg/ml tetrasykliiniä, 0D595-arvoon «0,5 ja käsiteltiin 90 min IPTG:llä. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen 5 liuokseen, joka sisälsi 50 mmol/1 natriumfosfaattia (pH 7,3) ja 0,2 mol/1 NaCl:a, ja hajotettiin äänikäsittelyllä. Solujätteet poistettin sentrifugoimalla ja lysaatti laitettiin suoraan hepariini-Sepharose-affiniteettikolonniin.
Määritettynä Western-täpläanalyysillä ja mito-10 geenisellä aktiivisuudella keratinosyyteissä yhdistelmä- KGF eluoitui NaCl-pitoisuudella 0,5 - 0,6 mol/1. HSAC- materiaalin puhdistaminen edelleen Mono-S- (FPLC) -kolonnilla (Pharmacia) antoi tulokseksi KGF-valmisteen, jonka puhtausasteeksi arvioitiin >90 % elektroforeettisen ana-| 15 lyysin perusteella, jossa käytettiin SDS-polyakryyli- amidigeelejä ja hopeavärjäystä.
Yhdistelmä-KGF stimuloi tehokkaasti tymidiinin sisällytystä BALB/MK-keratinosyyttisoluihin, mutta vaikutti vain mariginaalisesti NIH/3T3-fibroblasteihin. Puolet 20 BALB/MK-solujen maksimistimulaatiosta saavutettiin tavan omaisessa biologisessa kerätinosyyttimäärityksessä pitoisuudella 2-5 ng/ml; vastaava pitoisuus oli 10 - 15 ng/ml : M426-soluista puhdistetulla KGFcllä. Yhdestä litrasta bak- : teerisoluja saatiin noin 50 /zg Mono-S-puhdistettua yhdis- ** 2 5 telmä-KGF: ää.
; · KGF- ja aFGF-sekvenssejä sisältävien kimeeristen molekyylien konstruointi
• · I
Edellä kuvatut tutkimukset osoittivat, että . KGF:llä oli kaksi erottuvaa ominaisuutta, jotka saattaisi- 30 vat olla polypeptidisekvenssin eri osien tai alueiden koo- dittamia, kuten tiedetään tapahtuvan muiden multifunktio-: : : naalisten polypeptidien kooditussekvessien yhteydessä. Tä- män mahdollisuuden testaamiseksi konstruoitiin seuraavasti *, kimeerinen DNA-segmentti, joka kooditti KGF:n NH2-termi- ;;; 35 naalista sekvenssiä liitettynä aFGFrn C-terminaaliseen ydinosaan. Tehtiin katkaisu Sau3AI-restriktioentsyymi- 48 114711 kohdassa (GATC) KGF-cDNA:n 5-päässä ryhmiä 78 ja 79 (arg ! ja vastaavasti ile; katso kuvio 6) vastaavien kodonien alueella ja liitettiin katkaisukohta aFGF-cDNA:ssa olevaan homologiseen kohtaan aminohappoja 38 (arg) ja 40 vastaavi-5 en kodonien kohdalla. Tämän kimeerisen DNA.-n 3'- ja 51-päät liitettiin plasmidin pKK233-2 vektori-DNA:hän samalla menetelmällä, kuin mitä käytettiin polypeptidin erittynyttä muotoa koodittavan KGF-cDNA:n insertointiin (katso edellä kohta Menetelmät).
10 Kun konstruoitiin yhdistelmä-E. coli -soluja käyt tämällä kimeerisen molekyylin sisältävää vektoria ja tehtiin edellä valmiin KGF:n yhteydessä kuvatulla tavalla il-mentymistestit, saatiin uusi tuote, jolla oli sekä KGF:n että aFGF:n ominaisuuksia. Peptidi rikastettiin hepariini-15 Sepharose-kromatografiällä ja havaittiin, että se suosi KGF:n tavoin kohdesoluina keratinosyyttejä ja vaikutti hyvin heikosti fibroblasteihin (NIH/3T3). Tämän kimeerisen polypeptidin mitogeeninen aktiivisuus ei kuitenkaan ole herkkä hepariinin aiheuttamalla inhibitiolle, mikä ominai- 2 0 suus pätee aFGF.-ään KGF:n sijasta. Itse asiassa hepariini edistää mitogeenista aktiivisuutta keratinosyyttien suh- : '·’ teen kuten myös aFGF:n kohdalla. Niinpä peptidialueet, - * · * V jotka saavat aikaan kohdesoluspesifisyyden ja hepa- j : riiniherkkyyden ovat selvästi eri alueita ja helposti ero- 25 tettavissa toisistaan KGF:ssä tämän keksinnön mukaisin me- .·· nettelyin.
·. Tulosten pohdinta Tässä osassa kuvatut kokeet valaisevat tämän keksinnön muutaman pääsuoritusmuodon käytännön toteutusta.
3 0 Niihin kuuluvat KGF: ää koodittavien cDNA.-iden eristäminen, tällaisten cDNA:iden ilmentäminen yhdistelmäsoluissa, eri-ϊ laisten KGF.-n kanssa reagoivien vasta-aineiden tuottaminen . ; ja kimeerisen cDNA-.n konstruoiminen ja ilmentäminen, joka cDNA koodittaa uutta kasvutekijää, jolla on sekä KGF:n et-35 tä aFGF:n aminohapposekvenssejä ja niihin liittyviä toi minnallisia ominaisuuksia. Näihin suoritusmuotoihin liit- 49 114711 tyvät seuraavat seikat voidaan myös mainita tämän keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi.
KGF-cDNA:sta ennustettu sekvenssi sopi yhteen ihmisen fibroblastien erittämästä puhdistetusta KGF:n muo-5 dosta määritetyn aminohapposekvenssin kanssa. Lisäksi tämä sekvenssi tarjosi mahdollisia selityksiä niiden asemien kohdalla, joissa aminohappoja ei voitu varmuudella määrittää suoralla aminohapposekventoinnilla. Ryhmien 32 ja 46 ennustetaan cDNA-sekvenssinperusteella olevan kysteiinejä, 10 eivätkä muuntumattornien kysteiiniryhmien hydrolysoituneet johdannaiset ole detektoitavissa Edman-hajotuksella. Ennustettu KGF-sekvenssi sisälsi myös yhden mahdollisen N-kytketyn glykosylaatiokohdan (asn-X-Ser/Thr), ryhmät 45-47. Jos Asn 45 olisi glykosyloitunut, se ei tulisi j 15 detektoiduksi tässä käytetyillä aminohapposekventointime- netelmillä. Itse asiassa KGF liikkuu leveänä vyöhykkeen NaDodSCu/PAGE:11a puhdistetulle proteiinille ennustettua moolimassaa suuremman moolimassan kohdalla. Tähän voidaan katsoa olevan syynä glykosyloituminen.
20 FGF:t ovat hepaiinia sitovia mitogeeneja, joilla on laaja kohdesoluspesifisyys (11-10). hst-geeni on iden-• tifioitu tavanomaisilla NIH/3T3-transfektiomäärityksillä transformoivaksi geeniksi, jota on saatu ihmisen vatsakas-; vaimesta (11-11) , sen lähellä olevasta normaalista vatsa- ; ; 25 kudoksesta (11-12) ja Kaposin sarkoomasta (11-13). int-2- - t geeni ilmentyy normaalisti hiiren embryogeneesin aikana (11-14) ja virheellisesti hiiren rintakasvainviruksen pro-virusintegraation jälkeen (11-15).
. KGF on kuudes fibroblastikasvutekijäryhmän identi- 30 fioitava jäsen (11-28) . Vaikka nimi FGF-6 ei näytä sopi-*y’ valta, koska KGF:Itä puuttuu aktiivisuus fibroblastien : : suhteen, voidaan tätä nomenklaturiaa käyttää myös tälle kasvutekijälle osoittamaan sen rakenteellinen sukulaisuus FGF-ryhmän kanssa. Koska kaikki aiemmin karakterisoidut 35 kasvutekijät joko sulkevat pois epiteelisolut kohdesolujen '··* joukosta tai sisällyttävät ne lukuisten herkkien koh- 50 114711 desolujen joukkoon, KGF:n mitogeenisen aktiivisuuden voimakkaasti epiteelisoluspesifinen luonne, ja erityisesti kerätinosyyttien herkkyys, tekee KGF:stä ainulaatuisen.
Tähän asti tehdyissä tutkimuksissa KGF-trans-5 skriptin ilmentyminen näyttää olevan spesifinen epiteeli-kudoksista peräisin oleville stroomasoluille, mikä viittaa toimintaan normaalissa epiteelisolujen proliferaatiossa. KGF-cDNA-kloonin saatavuus antaa mahdollisuuden määrittää, voiko tämän kasvutekijän epänormaali tuotanto liittyä 10 kliinisiin tiloihin, joille on tunnusmerkillistä epiteelisolujen dysplasia ja/tai neoplasia. Lisäksi kyvyn tuottaa suuria määriä tätä uutta kasvutekijää yhdistelmä-DNA-menetelmillä pitäisi antaa mahdollisuus testata sen kliinistä käyttökelpoisuutta tilanteissa, joissa epiteelisolu-15 jen erityisellä kasvulla on erityisen suuri merkitys.
KGF-sekvenssin asettaminen kohdakkain FGF-ryhmän viiden muun proteiinin kanssa osoitti kaksi tärkeää homo-logia-aluetta, jotka kattoivat aminohapot 65 - 156 ja 162 - 189 ennustetussa KGF-sekvenssissä ja joita erotti 20 lyhyt, epähomologinen aminohapposarja, jonka pituus vaih-teli ryhmän eri jäsenten kesken (kuvio 7) . int-2-.n ollessa I · : ’·· kyseessä tämän sekvenssin pituus oli 17 ryhmää, kun taas • V hst:ssä nämä kaksi homologista aluetta olivat peräkkäin.
' KGF: ssä välisekvenssi koostui viidestä aminohaposta.
25 Kohdakkain olevien alueiden kohdalla KGF-amino- ;.·· happosekvenssi oli noin 44-% risesti identtinen int-2:m (hiiri), 30-%:isesti identtinen bFGF-.n (ihminen),
• I I
37-%:isesti identtinen aFGFn (ihminen) ja 33-%:isesti . identtinen hst:n (ihminen) kanssa. Tällä samalla alueella t · · 30 kaikki kuusi proteiinia olivat identtisiä 19 %-.n kohdalla • · ryhmistä, ja otettaessa huomioon säilyttävät korvautumiset :y. : niiden homologia-aste oli 28 %.
Kuten kuviossa 7 esitetään, näiden sukulaisprotei- • · * nien aminopäät ovat epähomologisia ja vaihtelevan pitui- • » * 35 siä. Primaarinen KGF ja hst-translaatiotuotteet sisältävät
• I
·*' hydrofobisia N-terminaalisia alueita, jotka toimivat to- 51 114711 dennäköisesti signaalisekvensseinä (11-16). Se, että tätä N-terminaalista aluetta ei ole läsnä valmiissa KGF-molekyylissä (kuvio 6B) , tukee edelleen tätä päätelmää.
FGF:t sitä vastoin syntetisoidaan ilmeisesti ilman signaa-5 lipeptidejä (11-10). int-2-proteiini sisältää epätyypillisen lyhyen N-terminaalisista hydrofobisista ryhmistä koostuvan alueen (11-17) , mutta ei tiedetä, erittyyko tämä proteiini. Lisäksi int-2-proteiini sisältää tämän ryhmän muihin jäseniin verrattuna pitkän C-terminaalisen jatkeen.
10 Puhdistettu KGF sisältää viisi kysteiiniryhmää, joista kaksi on säilynyt kaikissa FGF-ryhmän sukulaispro-teiineissa (kuvio 7) . Huomionarvoisia ovat myös viisi paria emäksisiä ryhmiä, joita esiintyy koko KGF-sekvenssin alueella. Tämä sama malli on havaittu muissa FGF-ryhmän 15 jäsenissä ja saattaa liittyä niiden vuorovaikutukseen he-pariinin kanssa (11-18). Kaksiemäksiset kohdat ovat myös proteolyyttisen käsittelyn yleisiä kohteita, ja tällainen käsittely saattaisi aiheuttaa joissakin KGF-valmisteissa havaitun mikroheterogeenisuuden (tuloksia ei julkaistu).
20 KGF-cDNA-sekvenssi sisälsi runsaasti A:ta ja T:tä koko alueellaan mutta erityisesti transloitumattomalla 3'- • « • ’·· pään alueella, jossa A- ja T-pitoisuus oli 70 %, kun taas • · · | * : oletetussa koodittavassa sekvenssissä se oli 60 % ja 5'- ·. pään transloitumattomalla alueella 63 %. 3 '-pään transloi- ·'·*. 25 tumaton alue sisälsi suuren määrän ATTTA-sekvenssejä, joi den on ehdotettu liittyvän tilapäisesti ilmentyvien, epästabiilien RNA:iden valikoituun hajoamiseen (11-19). Klassista AATAAA-polyadenylaatiosignaalia ei ollut läsnä, mutta kaksi varianttisekvenssiä, AATTAA ja AATACA (11-20) de-30 tektoitiin 24 ja vastaavasti 19 nukleotidin päässä po-;·’ ly (A) sekvenssin edellä cDNA:n 3'-päässä.
! : : On ehdotettu, että hepariinin vaikutus happamaan FGFrään johtuu joko kasvutekijän aktiivisen konformaation stabiloitumisesta tai tertiaarisen kompleksin muodostuma-;;; 35 sesta happaman FGF:n ja sen reseptorin kanssa (11-21, II- '*··’ 22) . Jos tämä pitää paikkansa, hepariini saattaa stabiloi- 52 114711 da KGF:n konformaatiota, joka ei ole yhtä aktiivinen kuin vapaa molekyyli, tai muodostaa tiukan kompleksin, joka ei i pysty tehokkaasti olemaan vuorovaikutuksessa reseptorinsa | kanssa.
j 5 Vaikka kyky sitoa hepariinia heijastaa KGF:n ra-
Ikenteellista samankaltaisuutta FGF-.ien kanssa, ovat erot näiden sukulaismitogeenien kohdesoluspesifisyyksissä huo- ! mättäviä. FGF:t indusoivat sikiön mesodermistä ja neuroek- todermistä peräisin olevien vähiten lopullisesti erilais-10 tuneiden solujen jakautumista. Fibroblastien ja verisuonten endoteelikudosten lisäksi kuuluvat mesodermiperäisiin kohteisiin viljelmässä myoblastit, kondrosyytit ja osteo-blastit (11-23). FGF:t ovat mitogeenisia myös glia-astrosyyttien ja neuroblastien suhteen (11-24). Kaposin 15 sarkoomasta eristetyn, hst:n kanssa identtisen onkogeenin j tuote stimuloi myös NIH/3T3- ja hiussuonten endoteelisolu- jen prol if eräät iota (11-25) . Tähän mennessä KGF-.n in-dusoimaa mitogeneesia on havaittu ainoastaan epiteelisoluissa ja on myös osoitettu havaittavissa olevan ak-20 tiivisuuden puuttuminen fibroblasteista ja endotee- lisoluista (katso edellä Kokeellinen osa I ja viite II-3).
: *·· Siksi näyttää todennäköiseltä, että KGF toimii eri solu- • ',· pintareseptorin kautta kuin FGF:t.
: KGF:n ja muiden FGF-ryhmän proteiinien välillä ei ***: 25 ole merkitsevää N-terminaalista homologiaa. Niinpä konst- ruoitiin kimeerisiä molekyylejä KGF:n ja prototyyppi-FGF:n : ;·. välillä sen määrittämiseksi, riittääkö KGF-.n N-termi- naalinen alue saamaan aikaan sen ainutlaatuisen kohdesoluspesif isyyden . Ensimmäisellä tällaisella yhdistelmä-; 30 polypeptidillä saadut tulokset osoittavat, että KGF:n N- terminaalinen alue koodittaa olennaisilta osiltaan kera-• : tinosyyttispesifisyyttä, kun taas KGF:n hepariiniherkkyys kooditetaan jossakin C-terminaalisella ydinalueella, joka korvattiin aFGF-sekvensseillä. Tällä uudella KGF:n kaltai-, ; 35 sella kasvutekijällä saattaa olla etuja kliinisissä sovel- lutuksissa, joissa on toivottavaa antaa epiteelispesifistä 114711 : 53 f kasvutekijää hepariinin, yleisesti käytetyn antikoagulan-tin, läsnä ollessa. Kimeereillä tehtävien lisätutkimusten pitäisi myös antaa tietoa siitä, mitkä nimenomaiset alueet C-terminaalisessa ytimessä aiheuttavat hepariinin erilai-5 set vaikutukset biologiseen aktiivisuuteen.
Kokeelliseen osaan II liittyvät kirjallisuusviitteet II-1. James, R. ja Bradshaw, R. A., Ann. Rev. Bio-chem. 53 (1984) 259 - 292 10 II-2. Sporn, M. B. ja Todaro, G. J. , N. Eng. J.
Med. 303 (1980) 878 - 880 II-3. Rubin, J. S., Osada, H., Finch, P. W. , Taylor, W. G., Rudikoff, S ja Aaronson, S. A., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA (1989), painossa 15 II-4. Crick, F. H. C., J. Mol. Biol. 19 (1966) 548 - 555 II-5. Ohtsuka, E., Mat suki. S., Ikehara, M., Ta-kashi, Y ja Matsubara, K., J. Biol. Chem. 260 (1985) 2605 - 2608 20 II-6. Miki, T., Matsui, T., Heidaran, M. ja Aaron son, S. A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989), painossa ’* II-7. Aaronson, S. A. ja Todaro, G. J., Virology V 36 (1968) 254 - 261 •J II-8. Kozak, M., Nucl. Acids Res. 13 (1987) 8125 - 25 8148 >· II-9. Lipman, D. J. ja Pearson, R. W. , Science 227 . ·. (1985) 1435 - 1441 11-10. Thomas, K., FASEB J., 1 (1987) 434 - 440 II-11. Taira, M., Yoshida, M. ja Sugimara, T., ;;* 30 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 2980 - 2984 • * *;·’ 11-12. Yoshida, T., Miyagawa, K., Odagiri, H., Sa- • t · · kamoto, H., Little, P. F. R. , Terada, M. ja Sugimara, T.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 7305 - 7309 11-13. Delli-Bovi, P. ja Basillico, C., Proc.
I I t *;;;* 35 Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 5660 - 5664 • » • i • * » 54 114711 11-14. jakobovits. A., Shackleford, S. M., Varmus, H. E. ja Martin, G. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7806 - 7810 11-15. Peters, G., Brookes, S. ja Dickson, S., 5 Cell 33 (1983) 364 - 377 11-16. von Heijne, G. , Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4683 - 4690 11-17. Moore, R. , Casey, G. , Brookes, S., Dixon, M., Peters, G. ja Dickson, C. EMBO J. 5 (1986) 919 - 924 10 11-18. Schwarzbauer, J. E., Tamkun, J. M. , Le- mischka, I. R. ja Hynes, R. 0., Cell 35 (1983) 421 - 431 11-19. Shaw, G. ja Kamen, R., Cell 46 (1986) 659 - 667 11-20. Birnstein, M. L., Busslinger, M. ja Strub, 15 K., Cell 41 (1985) 349 - 359 11-21. Schrieber, A. B., Mehlman, T. ja Maciag, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 6138 - 6142 11-22. Gospodarowizc, O. ja Cheng, J. , J. Cell Physiol. 128 (1986) 475 - 485 20 11-23. Thomas, K. A. ja Giminez-Gallego, G.,
Trends Biochem. Soc. 11 (1986) 81 - 84 • * : 11-24. Gensburger, C., Labourdette, G. ja Sensem- :’'·* brenner, M. , FEBS Lett. 217 (1987) 1 -5 : II-25. Delli-Bovi, P., Curatola, A. M. , Kern, F.
t * » 25 G., Greco, A., Ittman, M. ja Basilico, C., Cell 50 (1987) • · ....: 729 - 737 11-26. Sanger, F., Nicklen, S. ja Coulson, A. R. ,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463 - 5467 11-27. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. ja Messing, ;; 30 J., Gene 33 (1985) 103 - 119 11-28. Zhan, X., Bates, B., Hu, X. ja Goldfarb, : M., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3487 - 3495 : 11-29. Abrahams, J. A., Mergia, A., Whang, J. L.,
Tumolo, A., Friedman, J., Hjerrild, K. A., Gospodarowicz, 35 D. ja Fiddes, J. C., Science 233 (1986) 545 - 548 * » * 55 114711 11-30. Mansour, S. L. ja Martin, G. R. , EMBO J. 1 (1988) 2035 - 2041 11-31. Amman, E. ja Brosius, J., Gene 40 81985) 183 5 11-32. Sakai, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mul- lis, K. B., Norn, G. T., Erlich, H. A. ja Arnheim, N. , Science 230 (1985) 1350 - 1354 11-33. Beckman, P. M., Betsholtz, C., Heidin, C-H., Westermark, B., DiMarco, E., DiFiore, P. P., Robbins, 10 K. C. ja Aaronson, S. A., Science 241 (1988) 1346 - 1349.
Taustan kuvauksen tämän esityksen saattamiseksi loppuun kukin julkaisuista artikkeleista, patenteista ja patenttihakemuksista, joka tähän mennessä on mainittu tässä hakemuksessa, mainitaan täten viitteenä.
15 Keksintöä on kuvattu edellä jossakin määrin yksi- ! tyiskohtaisesti selkeyden ja ymmärrettävyyden vuoksi. Lie nee myös ilmeistä, että voidaan tehdä erilaisia yhdistelmiä muodon ja yksityiskohtien suhteen poikkeamatta keksinnön suoja-alan piiristä.
20
Taulukko 1-1 ; *” Kasvutekijän puhdistus ; ,· Puhdistusvaihe Proteiini (mg) Kokonaisaktiivisuus Ominaisaktiivisuus ; (yksikköä)* (yksikköä/mg) ; * ; 2 5 Säädetty alus- 1,4 x 103a 2,5 x 104 1,8 x 101 j ta (10 1)
Ultrasuodatus 1,3 x 103a 3,2 x 104 2,5 x 101 (retentaatti) WSAC 0,73b 1,6 x 104 2,2 x 104 *, 3 0 yhdistelmä • * ‘' 0,16 mol/1 : _: : Naci TSK-G3000 SW 8,4 x 10~3b 2,7 x 103 3,2 x 105' C4-HPLC 6,1 x 10-3b 2,1 x 102 3,2 x 104 • * » » 35 56 114711
Saannot laskettiin olettaen, että kaikki lähtöaineessa oleva mitogeeninen aktiivisuus johtui eristetystä tekijästä .
* Yksi aktiivisuusyksikkö määritellään puoleksi TSK-5 puhdistetun tekijän indusoimasta tymidiinin sisällytyksen maksimistimulaatiosta biologisessa BALB/MK-määrityksessä, jolloin noin 3 ng TSK-puhdistettua tekijää stimuloi 1 ak-tiivisuusyksikön.
a Proteiini määritettiin käyttämällä Bradford-reagenssia, 10 jonka toimitti BioRad (1-23) .
b Proteiini määritettiin käyttämällä arvoa A1%2i4 = 140.
Taulukko 1-2
Kasvutekijöiden kohdesoluspesifisyys 15 Kasvu- Epiteelisolut Fibroplastit Endoteelisolut tekijä BALB/MK BS/589 CCL208 NIH/3/3S ihmisen jalkavarren laskimo KGF 500-1000 2-3 5-10 <1 <1 EGF 100-200 20-40 10-30 10-20 n.d.
TGFa 150-300 n.d. n.d. 10-20 n.d.
20 aFGF* 300-500 2-3 5-10 50-70 5 bFGF 100-200 2-3 2-5 50-70 5 * I · • • KGF:n ja muiden kasvutekijöiden stimuloiman tymidiinin ί, · maksimisisällytyksen vertaaminen erilaisissa solulinjois- :''': 25 sa, ilmoitettuna stimuloidun sisällytyksen suhteena taus- : * ta-arvoon.
; Nämä tulokset edustavat neljän eri kokeen yhteenvetoa.
* aFGF:n aikaansaama maksimistimulaatio vaati hepariinin , (Sigma, 20 μg/ml) läsnäoloa.
! 30 n.d. = ei määritetty * 57 114711
Taulukko II-1
Hepariinin vaikutus KFG:n mitogeeniseen aktiivisuuteen
Kasvutekijä BALB/MK NIH/3/3 5 + - + KGF 150 9,5 <1 <1 aFGF 106 259 10,4 68 bFGF 30 124 45,7 70 10 Solut siirrostettiin mikromaljoille, kasvatettiin yhtenäiseksi kasvustoksi seerumipitoisessa alustassa ja laitettiin sitten seerumittomaan alustaan 24 - 72 tunniksi ennen näytteen lisäämistä. Mitogeneesimääritykset tehtiin kuvatulla tavalla (katso edellä Kokeellinen osa I ja viite 15 II-3). Ilmoitetuissa tapauksissa hepariinia sisällytettiin kasvualustaan lopupitoisuudeksi 20 μ9/τη1. Kaikkien kasvutekijöiden pitoisuus oli 50 ng/ml. Tulokset edustavat 3H-tymidiinin sisällytyksen stimulaatiosuhdetta ilmoitetussa määrityssolussa hepariinin läsnä (+) tai poissa (-) olles-20 sa. Kukin arvo edustaa kahden riippumattoman kokeen tulosten keskiarvoa; kussakin kokeessa kukin arvo puolestaan edustaa kahden rinnakkaismittauksen keskiarvoa.
• t * » » > i t ' • t % I # > • * i I i » I t • I » « k ! 1 t » I > ♦ * *

Claims (44)

58 114711
1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa kerätinosyyttikasvutekijä (KGF) -prote- 5 iinia, joka sisältää: a) seuraavan aminohapposekvenssin, b) segmentin seuraavasta aminohapposekvenssistä ilman 31:tä N-terminaalista aminohappoa, tai c) aminohapposekvenssin, joka eroaa seuraavasta 10 aminohapposekvenssistä yhden tai useamman aminohapon lisäyksellä, poistumisella tai korvautumisella: MHKWILTWILPTLLYRSCFHI ICL VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS 15 SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM 20 FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT, ‘(J jossa kyseinen proteiini, verrattuna EGF:ään, TGF-alfa:an, aFGF:ään ja bFGF:ään, aikaansaa BALB/MK-keratinosyytti-25 soluissa voimakkaamman stimulaation suhteessa NIH/3T3-; fibroblasteihin, mitattuna prosentteina maksimaalisesta H3-tymidiinin liittämisestä kussakin solutyypissä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF- * ' 30 proteiinia, jolloin sellainen määrä proteiinia, joka saa • » aikaan maksimistimulaation BALB/MK-keratinosyyteissä, saa ί , : aikaan pienemmän kuin yksinkertaisen stimulaation NIH/3T3- • ; fibroblasteissa suhteena tausta-arvoon, jolloin yksinker taisella tarkoitetaan käsittelemättömien solujen DNA- • i » • i * * ‘ * 3 5 taustasynteesiä. • · » · i » t 59 114711
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF- proteiinia, joka proteiini 5 nM pitoisuutena aiheuttaa pienemmän kuin yksikertaisen stimulaation NIH/3T3-fibro- 5 blasteissa suhteessa tausta-arvoon.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF- proteiinia, jolloin sellainen määrä proteiinia, joka aiheuttaa maksimistimulaation BALB/MK-keratinosyyttisoluis- 10 sa, aiheuttaa pienemmän kuin l/50-osan suurimmasta mahdollisesta tymidiinin sisäänotosta aFGF:llä tai bFGFrllä stimuloiduissa NIH/3T3-fibroblasteissä.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF- 15 proteiinia, jolloin sellainen määrä proteiinia, joka aiheuttaa maksimistimulaation BALB/MK-keratinosyyttisoluissa, aiheuttaa pienemmän kuin l/10-osan suurimmasta mahdollisesta sisäänotosta EGF:llä tai TGF-alfa:lla stimuloiduissa NIH/3T3-fibroblasteissä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF- proteiinia, joka konsentraatioalueella 0,1-3 nM, aikaan- ; saa BALB/MK-keratinosyyttien maksimistimulaation, joka on • vähintään kaksinkertainen verrattuna emäksisellä FGF:llä j' 25 saatavaan stimulaatioon samalla konsentraatioalueella.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA- t molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF- proteiinia, jonka spesifinen aktiivisuus on vähintään noin 3,4xl04 yksikköä/mg proteiinia, jolloin yksi aktiivisuus- y 30 yksikkö määritellään määräksi, joka aiheuttaa puolet KGF- • » '· ’ proteiinin aiheuttamasta DNA-synteesin mahdollisesta mak- ; simistimulaatiosta BALB/MK-keratinosyyttisoluissa.
. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yh- distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo- 35 dittaa seuraavaa aminohapposekvenssiä: 60 114711 CNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF 5 YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yh- distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo-dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka eroaa seuraavasta aminohapposekvenssistä yhden tai useamman aminohapon lisäyksellä, poistumisella tai korvau-15 tumisella: CNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN 20 NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT 25
10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo- • · · dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka eroaa seuraavasta aminohapposekvenssistä yhden tai ·;;; 30 useamman aminohapon lisäyksellä, poistumisella tai korvau- *···1 tumisella: • · · 1 » 61 114711 MHKWILTWILPTLLYRSCFHI ICL VGTI SLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN 5 NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT 10
11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo-dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää (i) N-termi-naalisen segmentin kuvan 6B aminohapoista, joka sisältää riittävän 15 määrän kuvan 6B aminohapoista 32-64, jotta aikaansaadaan KGF-proteiinin haluttu mitogeeninen aktiivisuus epiteelisolussa, sitoutuneena (ii) C-terminaaliseen alueeseen, joka sisältää kuvan 6B aminohapot 65-156 ja 161-189.
12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen 20 yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo- dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää (i) N-terminaalisen i '·· segmentin kuvan 6B aminohapoista, joka sisältää riittävän • määrän kuvan 6B aminohapoista 32-64, jotta aikaansaadaan : ; : KGF-proteiinin haluttu mitogeeninen aktiivisuus epitee- i'·1; 25 lisolussa, sitoutuneena (ii) C-terminaaliseen alueeseen, ; joka sisältää kuvan 6B aminohapot 65-194.
13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo-dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää segmentin kuvan 6B ‘ 3 0 aminohapoista, joka sisältää riittävän määrän kuvan 6B aminohapoista 32-78, jotta aikaansaadaan KGF-proteiinin I · haluttu mitogeeninen aktiivisuus epiteelisolussa. 62 114711
14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo-dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää segmentin kuvan 6B aminohapoista, joka sisältää riittävän määrän kuvan 6B 5 aminohapoista 32-189, jotta aikaansaadaan KGF-proteiinin haluttu mitogeeninen aktiivisuus epiteelisolussa.
15 CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA 20 HFLPMAIT
: ’*· 16. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo- : ; : dittaa KGF-proteiinia, joka koostuu segmentistä seuraavas- 25 ta aminohapposekvenssistä: » . MHKWILTWILPTLLYRSCFHI ICL V G T I SLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF : 30 CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN i NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF : YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ; ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA 35 HFLPMAIT 63 114711
15. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koo-dittaa KGF-proteiinia, joka sisältää seuraavan aminohap- 10 posekvenssin segmentin: MHKWILTWILPTLLYRSCFHI ICL V G T I SLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa keratino-syyttikasvutekijä (KGF) -proteiinia, joka koostuu seuraa-van aminohapposekvenssin segmentistä: 5 MHKWILTWILPTLLYRSCFHI ICL V G T I SLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN 10 NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK ELI LENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT, 15 jolloin mainitulla segmentillä on mitogeeninen aktiivisuus keratinosyyttisoluille ja jossa mainittu segmentti voi edelleen sisältää aminoterminaalisen metioniinin.
18. Jonkin patenttivaatimuksista 1-17 mukainen 20 yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa KGF-proteiinia, joka sisältää aminoterminaalisen metioniinin.
19. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, : että se koodittaa kimeeristä proteiinia, joka sisältää yh- : 25 dessä polypeptidimolekyylissä osan jossakin patenttivaati- *| muksista 1-18 määriteltyä KGF-proteiinia, joka osa KGF- . proteiinia on segmentti kuvan 6B aminohapoista, joka si sältää riittävän määrän kuvan 6B aminohapoista 32-189, jotta aikaansaadaan polypeptidimolekyylin haluttu mitogee-30 ninen aktiivisuus epiteelisolussa ja ainakin yhden muun • · ·;* polypeptidiosan fibroblastien kasvutekijäryhmästä.
: 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen yhdistelmä- : DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa kimee ristä proteiinia, jossa mainittu segmentti sisältää riit- ;;; 35 tävän määrän kuvan 6B aminohappoja 32-78, jotta aikaansaa- • · daan polypeptidimolekyylin haluttu mitogeeninen aktiivi- 64 114711 suus epiteelisolussa ja ainakin yhden muun polypeptidiosan fibroblastien kasvutekijäperheestä.
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa kimee- 5 ristä proteiinia, jossa fibroblastin kasvutekijä on hapan fibroblastin kasvutekijä (aFGF).
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa kimee-ristä proteiinia, jossa polypept idiosa aFGF-.stä vastaa 10 niitä aminohappoja siinä osassa aFGF:tä, joka on samanlainen kuin hepariinille herkkyyden aiheuttava KGF:n sekvenssi .
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa kimee- 15 ristä proteiinia, jossa mainittu segmentti KGF:stä vastaa kuvan 6B aminohappoja 32-78 ja mainittu polypeptidiosa aFGF:stä on aFGF:n karboksyylipää, alkaen aminohaposta numero 39.
24. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, 20 että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-23 mukaisen DNA:n ja vektorin.
: *' 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen yhdistelmä- j V DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että mainittu vektori on :j; plasmidi, bakteriofaagikloonausvektori, DNA-sekvensointi - 25 plasmidivektori, bakteerin geeniekspressiovektori tai ni-säkkään geeniekspressiovektori.
26. Yhdistelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että t · · i se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-23 mukaisen . DNA-molekyylin. = * *
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen solu, tun- ;·* nettu siitä, että se on nisäkässolu, hyönteissolu, hii- : : : vasolu tai bakteerisolu.
28. Yhdistelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 24 tai 25 mukaisen DNA- • * · ;;; 35 molekyylin. » » > 65 114711
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu solu on nisäkässolu, hyön-teissolu, hiivasolu tai bakteerisolu.
30. Menetelmä keratinosyyttikasvutekijä (KGF) 5 -proteiinin tai kimeerisen proteiinin tuottamiseksi, joka sisältää a) seuraavan aminohapposekvenssin, b) segmentin seuraavasta aminohapposekvenssistä ilman 31:tä N-terminaalista aminohappoa, tai 10 c) aminohapposekvenssin, joka eroaa seuraavasta aminohapposekvenssistä yhden tai useamman aminohapon lisäyksellä, poistumisella tai korvautumisella MHKWILTWILPTLLYRSCFHI ICL 15 VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK 20 ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM FVALNQKGI PVRGKKTKKEQKTA H F L P M A I T, • jolloin kyseinen proteiini verrattuna EGF:ään, TGF-; 25 alfa:an, aFGF:ään ja bFGF:ään, aikaansaa BALB/MK-kerati- nosyyttisoluissa voimakkaamman stimulaation suhteessa NIH/3T3-f ibroblasteihin, mitattuna prosentteina maksimaalisesta H3-tymidiinin liittämisestä kussakin solutyypissä, tunnettu siitä, että viljellään jonkin patenttivaati-·; y 30 muksista 26 - 29 mukaista solua sellaisella alustalla ja '•y* sellaisissa olosuhteissa, joissa mainittua proteiinia tuo- : ; : tetaan. • * • · · • · * I » 66 114711
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edelleen eristetään KGF-proteiini tai kimeerinen proteiini.
32. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että mainittu yhdistelmä-DNA-molekyyli sisältää muun promoottori-DNA:n kuin natiivin KGF:n promoottori -DNA:n toiminnallisesti liitettynä KGF-proteiinia koodattavaan DNA:hän.
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-molekyyli sisältää natiivin DNA:n, joka koodittaa KGF-proteiinia.
34. Jonkin patenttivaatimuksista 30 - 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on E. coli-solu.
35. Menetelmä KGF-proteiinin tai kimeerisen prote-15 iinin tuottamiseksi, joita koodittaa jonkin patenttivaatimuksista 1-23 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että i) saatetaan ensimmäinen liuos, joka sisältää mainittua proteiinia, kosketuksiin hepariinin kanssa sellai- 20 sissa olosuhteissa, joissa proteiini sitoutuu hepariiniin, jolloin muodostuu hepariini-proteiini -kompleksi, ii) eristetään hepariini-proteiini -kompleksi mai- : nitusta ensimmäisestä liuoksesta, ja ' [ i lii) erotetaan mainittu proteiini proteiini-hepa- 25 riini -kompleksista
• 36. Menetelmä KGF-RNA -transkriptiotason määrittä- :miseksi, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vaiheet: i) eristetään mRNA kudoksista tai soluista, ' 30 ii) pariutetaan mainittu mRNA (a) DNA-koettimen * · kanssa, joka käsittää kuvan 6B mukaisen nukleiinihappo-sekvenssin tai käsittää segmentin kuvan 6B mukaisesta nuk-: leiinihapposekvenssistä; tai (b) DNA-koettimen kanssa, jo ka on patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-molekyyli tai pa-35 tenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin segmentti; ja * » > 67 114711 iii) määritetään DNA-RNA-hybridin määrä.
37. Menetelmä epiteelisolujen kasvun stimuloimi-seksi in vitro, tunnettu siitä, että siinä lisätään epiteelisolujen kasvun stimuloimiseen riittävä määrä minkä 5 tahansa patenttivaatimuksen 1-23 mukaisen DNA:n koodit -tamaa KGF-proteiinia tai kimeeristä proteiinia.
38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut solut ovat keratinosyyt-tej ä.
39. Menetelmä spesifisesti jonkin patenttivaati muksista 1-18 mukaisen DNA-molekyylin koodittamaa KGF-proteiinia vastaan suunnatun vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että injektoidaan eläin antigeenillä, joka on jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukaisen DNA- 15 molekyylin koodaama KGF-proteiini tai on jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukaisen DNA-molekyylin koodaaman KGF-proteiinin segmentti, ja saadaan tällainen vasta-aine.
40. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine neutraloi ihmisen KGF:n 20 mitogeenisen aktiivisuuden.
41. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on polyklonaalinen vas- j: ta-aine.
42. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, ; 25 tunnettu siitä, että vasta-aine on monoklonaalinen vas- * I : ta-aine.
, ···, 43. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine reagoi peptidiin NDMTPEQMATNVR. *; 30
44. Menetelmä KGF-proteiinin osoittamiseksi näyt- teessä, tunnettu siitä, että • > » • I i * » » 68 114711 i) polypeptidejä kehonesteen tai kudoksen näytteestä saatetaan reagoimaan spesifisesti jonkin patenttivaatimuksista 1-18 mukaisen DNA-molekyylin koodittamaa KGF-proteiinia vastaan suunnatun vasta-aineen kanssa vas- 5 ta-ainepolypeptikompleksin muodostamiseksi, ja ii) osoitetaan mainittu kompleksi. » • i · Iti * 1 » » 69 114711
FI913637A 1989-01-31 1991-07-30 Epiteelisoluille spesifistä kasvutekijää koodittava DNA FI114711B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30428189A 1989-01-31 1989-01-31
US30428189 1989-01-31
US9000418 1990-01-30
PCT/US1990/000418 WO1990008771A1 (en) 1989-01-31 1990-01-30 Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI913637A0 FI913637A0 (fi) 1991-07-30
FI114711B true FI114711B (fi) 2004-12-15

Family

ID=23175833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI913637A FI114711B (fi) 1989-01-31 1991-07-30 Epiteelisoluille spesifistä kasvutekijää koodittava DNA

Country Status (22)

Country Link
US (8) US5707805A (fi)
EP (2) EP0555205B1 (fi)
JP (6) JP3298874B2 (fi)
KR (1) KR950012805B1 (fi)
AT (1) ATE197800T1 (fi)
AU (2) AU647732B2 (fi)
CA (2) CA2349875C (fi)
DE (2) DE69033668T2 (fi)
DK (1) DK0555205T3 (fi)
ES (1) ES2153816T3 (fi)
FI (1) FI114711B (fi)
GE (1) GEP20022681B (fi)
HU (1) HU218090B (fi)
IE (1) IE20020188A1 (fi)
LT (1) LT3472B (fi)
LU (1) LU91237I2 (fi)
LV (1) LV10284B (fi)
NL (1) NL300230I2 (fi)
NO (2) NO308312B1 (fi)
RU (1) RU2250213C2 (fi)
SG (1) SG46699A1 (fi)
WO (1) WO1990008771A1 (fi)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG46699A1 (en) 1989-01-31 1998-02-20 Jeffrey S Rubin DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
GB9203533D0 (en) * 1992-02-19 1992-04-08 Erba Carlo Spa Use of the conjugate between a fibroblast growth factor and a saporin in treating ocular pathologies
US5965530A (en) * 1993-03-26 1999-10-12 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
WO1994023032A1 (en) * 1993-03-26 1994-10-13 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
US7084119B2 (en) 1993-06-29 2006-08-01 Chiron Corporation Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
BR9407035A (pt) * 1993-06-29 1996-03-12 Chiron Corp Fragmento de fator de crescimento de queratinócitos conjugado composição terapêutica molécula de DNA vetor de expressão célula hospedeira processo para produzir fragmento de fator de crescimento de queratinócitos processo para cicatrização de ferimento e processo de tratamento de doença hiperproliferativa da epiderme
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
EP0785950B1 (en) * 1994-10-13 2003-04-16 Amgen Inc., Keratinocyte growth factor analogs
WO1996011950A1 (en) * 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Method of treating diabetes mellitus using kgf
US6008328A (en) * 1994-10-13 1999-12-28 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
IL147575A (en) * 1994-10-13 2004-05-12 Amgen Inc Method for purifying keratinocyte growth factors
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6077692A (en) * 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
ATE274056T1 (de) 1995-10-11 2004-09-15 Chiron Corp Kombination pdgf, kgf, igf und igfbp zur wundheilung
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
US20030144202A1 (en) * 1996-10-15 2003-07-31 Amgen Inc. Uses of keratinocyte growth factor-2
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
DE19716098A1 (de) * 1997-04-17 1998-10-22 Univ Ludwigs Albert Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden
US6228839B1 (en) 1997-12-19 2001-05-08 Emory University Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status
CA2316015A1 (en) * 1997-12-22 1999-07-01 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
WO1999041282A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor-2
US6335317B1 (en) 1998-04-10 2002-01-01 Emory University Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status
US7022683B1 (en) 1998-05-13 2006-04-04 Carrington Laboratories, Inc. Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation
US5929051A (en) * 1998-05-13 1999-07-27 Carrington Laboratories, Inc. Aloe pectins
US6313103B1 (en) 1998-05-13 2001-11-06 Carrington Laboratories, Inc. Pectic substance as a growth factor stabilizer
US6372494B1 (en) * 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US6783546B2 (en) 1999-09-13 2004-08-31 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6371984B1 (en) 1999-09-13 2002-04-16 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6395414B1 (en) 2000-02-11 2002-05-28 General Motors Corporation Staged venting of fuel cell system during rapid shutdown
US6376112B1 (en) 2000-02-11 2002-04-23 General Motors Corporation Controlled shutdown of a fuel cell
US6413662B1 (en) 2000-02-22 2002-07-02 General Motors Corporation Fuel cell system shutdown with anode pressure control
JP2001302691A (ja) * 2000-04-17 2001-10-31 Nichirei Corp ヒトｋｇｆに対する抗体
EP1357931A2 (en) * 2001-01-08 2003-11-05 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
HUP0303199A2 (hu) 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Eljárás T-sejt-epitópok azonosítására és csökkentett immunogenitású molekulák előállítására
US7494669B2 (en) 2001-02-28 2009-02-24 Carrington Laboratories, Inc. Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides
CA2457781A1 (en) * 2001-08-21 2003-02-27 Chiron Corporation Kgf polypeptide compositions
US7202066B2 (en) * 2002-01-29 2007-04-10 Carrington Laboratories, Inc. Combination of a growth factor and a protease enzyme
GB0206309D0 (en) * 2002-03-16 2002-05-01 Axordia Ltd Isolated cells
US20050074773A1 (en) * 2002-08-20 2005-04-07 Shimkets Richard A. Methods for diagnosing and treatment of conditions that alter phosphate transport in mammals
AU2005317166B2 (en) 2004-12-15 2009-09-10 Biovitrum Ab (Publ) Therapeutic formulations of keratinocyte growth factor
US20080119433A1 (en) * 2006-07-06 2008-05-22 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
PL2125878T3 (pl) * 2007-01-05 2013-08-30 Helix Biomedix Inc Krótkie, aktywne biologicznie peptydy do komórkowych i immunologicznych modulacji
WO2011008904A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Tabor Aaron T Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
US9682093B2 (en) 2012-03-30 2017-06-20 Charles R. Drew University Of Medicine And Science Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders
KR102277147B1 (ko) * 2017-12-13 2021-07-13 건국대학교 산학협력단 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096825A (en) * 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
US4444760A (en) * 1983-06-17 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor
US4473679A (en) 1983-12-12 1984-09-25 Borg-Warner Chemicals, Inc. Thermoplastic acrylic elastomers
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US4868113A (en) 1986-03-03 1989-09-19 Rorer Biotechnology, Inc. Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor
US4983679A (en) 1986-05-29 1991-01-08 E. I. Dupont De Nemours And Company β-(keto or sulfonyl)esters from reaction of silylketene acetal and acyl or sulfonyl compound
HU219883B (hu) 1988-03-17 2001-08-28 Novo-Nordisk A/S Heparinkötő proteinek, ezeket kódoló DNS és a proteineket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint eljárás ezek előállítására
SG46699A1 (en) 1989-01-31 1998-02-20 Jeffrey S Rubin DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
BR9407035A (pt) * 1993-06-29 1996-03-12 Chiron Corp Fragmento de fator de crescimento de queratinócitos conjugado composição terapêutica molécula de DNA vetor de expressão célula hospedeira processo para produzir fragmento de fator de crescimento de queratinócitos processo para cicatrização de ferimento e processo de tratamento de doença hiperproliferativa da epiderme
WO1996011950A1 (en) 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Method of treating diabetes mellitus using kgf

Also Published As

Publication number Publication date
EP1016716A3 (en) 2000-07-12
NL300230I2 (nl) 2006-09-01
NO972259D0 (no) 1997-05-16
AU684278B2 (en) 1997-12-11
US5707805A (en) 1998-01-13
DK0555205T3 (da) 2001-03-05
AU647732B2 (en) 1994-03-31
US5654405A (en) 1997-08-05
DE69033668D1 (de) 2001-01-04
NO972617D0 (no) 1997-06-06
US5741642A (en) 1998-04-21
AU5049690A (en) 1990-08-24
JP2000102396A (ja) 2000-04-11
ES2153816T3 (es) 2001-03-16
KR950012805B1 (en) 1995-10-21
US6833132B1 (en) 2004-12-21
HU218090B (hu) 2000-05-28
HUT58759A (en) 1992-03-30
JP2001157594A (ja) 2001-06-12
JP2006149407A (ja) 2006-06-15
EP0555205B1 (en) 2000-11-29
EP1016716A2 (en) 2000-07-05
AU6598694A (en) 1994-09-08
EP0555205A1 (en) 1993-08-18
LTIP667A (en) 1995-01-31
JP3088983B2 (ja) 2000-09-18
JP3802329B2 (ja) 2006-07-26
NO972617L (no) 1997-06-06
GEP20022681B (en) 2002-04-25
SG46699A1 (en) 1998-02-20
JP2716416B2 (ja) 1998-02-18
DE122006000021I1 (de) 2006-07-13
JP3298874B2 (ja) 2002-07-08
KR910700257A (ko) 1991-03-14
IE20020188A1 (en) 2002-06-26
RU2250213C2 (ru) 2005-04-20
LT3472B (en) 1995-10-25
CA2349875A1 (en) 1992-09-16
JP3802292B2 (ja) 2006-07-26
EP0555205A4 (en) 1992-06-02
JPH10243800A (ja) 1998-09-14
CA2349875C (en) 2010-02-09
US5665870A (en) 1997-09-09
NO308310B1 (no) 2000-08-28
DE69033668T2 (de) 2001-04-12
LV10284B (en) 1995-04-20
NO972259L (no) 1997-05-16
US6420531B1 (en) 2002-07-16
NL300230I1 (nl) 2006-07-03
JPH08277227A (ja) 1996-10-22
WO1990008771A1 (en) 1990-08-09
ATE197800T1 (de) 2000-12-15
US5731170A (en) 1998-03-24
CA2038398C (en) 2002-01-22
NO308312B1 (no) 2000-08-28
CA2038398A1 (en) 1992-09-16
LV10284A (lv) 1994-10-20
FI913637A0 (fi) 1991-07-30
LU91237I2 (fr) 2007-02-22
US6709842B1 (en) 2004-03-23
JPH04504415A (ja) 1992-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI114711B (fi) Epiteelisoluille spesifistä kasvutekijää koodittava DNA
CA2263890C (en) Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d)
NL8900178A (nl) Groei regulerende clycoproteinen.
WO2000037642A9 (en) Method of enhancing the biological activity of ligands
SK43097A3 (en) Method for purifying keratinocyte growth factors
JPH10262668A (ja) 血管形成誘導因子をコードするタンパク質コード配列を包含するｄｎａ配列
US7026291B1 (en) Epithelial cell specific growth factor, keratinocyte growth factor (KGF)
RU2376375C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFastBac-G2R-IgG, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ, КОДИРУЮЩИЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК, И ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА, КОДИРУЮЩИЙ УЧАСТОК ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНА G, И ШТАММ БАКУЛОВИРУСА BvG2RIgG, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ РАСТВОРИМЫЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ БЕЛКА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ, И ФРАГМЕНТА ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНА G ЧЕЛОВЕКА
IE83398B1 (en) DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
NL8900724A (nl) Nieuwe polypeptiden met groeifactoraktiviteit en nucleinezuurvolgordes die voor de polypeptiden coderen.
NO308309B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av et hovedsaklig rent keratinocyttvekstfaktor (KGF) protein
DD296691A5 (de) Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen ein epitop von amphiregulin