HU217212B - Endogén gének expressziójának módosítása szabályozóelemmel - Google Patents

Endogén gének expressziójának módosítása szabályozóelemmel Download PDF

Info

Publication number
HU217212B
HU217212B HU9202068A HU206892A HU217212B HU 217212 B HU217212 B HU 217212B HU 9202068 A HU9202068 A HU 9202068A HU 206892 A HU206892 A HU 206892A HU 217212 B HU217212 B HU 217212B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
dna
cell line
expression
regulatory
Prior art date
Application number
HU9202068A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT62657A (en
HU9202068D0 (en
Inventor
Scott C. Chappel
Original Assignee
Applied Research Systems, ARS Holding M.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23806064&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU217212(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Applied Research Systems, ARS Holding M.V. filed Critical Applied Research Systems, ARS Holding M.V.
Publication of HU9202068D0 publication Critical patent/HU9202068D0/hu
Publication of HUT62657A publication Critical patent/HUT62657A/hu
Publication of HU217212B publication Critical patent/HU217212B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Eljárás egy sejtvőnal genőmjában nőrmál körülmények között át nemíródó gén aktiválására őly módőn, hőgy képessé teszi a sejtvőnalat azadőtt gén termékének expresszálására. Az eljárás sőrán a DNS-kőnstrűkciót hőmőlóg rekőmbinációval építik be a genőmba és a DNS-kőnstrűkció tartalmaz egy szabályőzó DNS-darabőt, amely képesbefőlyásőlni az adőtt gén expresszióját, amikőr ahhőz működőképesenkapcsőlódik, és egy célzó DNS- darabőt, amely génen belül vagy annakkörnyezetében hőmőlóg az adőtt genőm egy régiójával, valamint akőnstrűkciót őly módőn építik be, hőgy az adőtt szabályőzódarabműködőképesen kapcsőlódik a kérdéses génhez. ŕ

Description

A találmány tárgyát egy stabil sejtvonal vagy klónozott mikroorganizmus genomjában természetesen előforduló gén kifejeződését jellemző tulajdonságok módosítására szolgáló eljárás képezi. A találmányt leginkább a stabil sejtvonalban jelen levő és normál körülmények között nem expresszálódó gén kifejezésére és aktiválására használjuk. Ennek eredményeképpen ezen gén fehérjeterméke keletkezik. Ez a jelenség megtörténik anélkül, hogy a sejtet fertőznénk a terméket kódoló DNS-sel. A kívánt terméket kódoló adott gént azonosítjuk egy sejtben, és aktiváljuk a homológ rekombinációnak nevezett technika alkalmazásával beépített, megfelelő szabályozódarab segítségével. Pozitív és/vagy negatív szelektálómarkerek is beépíthetők azon sejtek kiválasztásának segítésére, amelyekben a megfelelő homológ rekombinációs esemény játszódott le. Egy további megvalósításkor egy speciális gén felszaporítható az expressziós ráta megnövelése érdekében, vagy ezen gén, melynek transzkripciója normál körülmények között nem megy végbe, a találmány szerint aktiválható a termék expressziója érdekében.
A találmány háttere
Jól ismert, hogy egy szervezeten belül minden egyes sejt tartalmaz genetikai információt, amely kódolja mindazokat a fehérjéket, amelyek megtalálhatók a szervezetben. Viszont az adott sejttípusban jelen lévő géneknek valójában csak nagyon kis százaléka íródik át. A sejten belüli mechanizmusok, amelyek szabályozzák az átírandó gének rendjét, már ismertek. A sejtmagban jelen levő sejtspecifikus fehérjék kölcsönhatásba lépnek a szabályozó DNS-darabokkal, amelyek a kérdéses génekhez kapcsolódnak. A nukleáris fehérjék kölcsönhatása a szabályozó DNS-szekvenciákkal szükséges a gén átírásához. Ez eredményezi az mRNS-ek bioszintézisét és végső soron a kódolt fehérje kifejeződését, amint azt Mitchell és Tjian Science, 245: 371, 1989, leírják.
Minden egyes gén szabályozó DNS-darabja vagy eleme a génektől „upstream” helyezkedik el, néhány esetben pedig a kódolórégión belül vagy attól „downstream” található. A szabályozó DNS-darabok a sejtspecifikus nukleáris fehéijékkel való kölcsönhatáson keresztül befolyásolják a fehérjeexpressziót meghatározó enzim, az RNS-polimeráz működését, oly módon, hogy a gén hozzáférhetővé válik számára, és szintetizálja az mRNS-transzkriptumot. így ezek a DNS-darabok és a megfelelő sejtmagi fehérjék kritikus szerepet játszanak a specifikus gének expressziójának szabályozásában, amint azt Johnson és McKnight, Ann. Rév. Biochem., 58: 799, 1989 leírják.
A szabályozó DNS-darabok kötőhelyül szolgálnak a sejtmagi fehérjék számára. A nukleáris fehérjék a DNS-hélixhez kapcsolódnak és láthatóan megváltoztatják annak struktúráját, a megfelelő gént az RNSpolimeráz számára hozzáférhetővé téve, és így megkönnyítve a gén transzkripcióját. A sejtspecifikus szabályozófehéijék expressziója meghatározza, mely gének íródnak át a sejtben, és ennek az expressziónak a szintjét. A rendszer specificitására példa, hogy az agyalapi mirigy sejtjei termelnek hipofízisfehérjéket, de a májsejtek nem, még akkor sem, ha a hipofízisfehérjéket kódoló gének jelen vannak a májsejtekben. A májsejtek sejtmagja nem tartalmaz specifikus DNS-kötő fehérjéket, amelyek kölcsönhatásba lépnek a hipofízisgének elemeivel a májsejtben.
A rekombináns DNS-technológia felhasználásával expresszálódó fehérjék kifejezésére alkalmazott legelterjedtebb módszerek
Azon felismerés révén, hogy egy különleges sejttípusban specifikus DNS-szabályozó szekvenciák szükségesek a géntranszkripció aktiválásához, a kutatók idegen géneket expresszáltattak egy adott sejttípusban genetikai manipuláció segítségével. Általában a sejt nukleáris fehérjéi által felismert DNS-szabályozó elemek az expresszálni kívánt idegen gén kódolórégiójától „upstream” helyezkednek el. Ily módon a sejtbe történő bejuttatás után az idegen DNS expresszálható, mivel a sejt sejtmagja most már felismeri ezeket a szabályozó DNS-szekvenciákat. Ezt a technológiát alkalmazták olyan fehérjék előállítására, amelyeket nehezen tudtak előállítani, vagy a természetesen előforduló forrásokból a hagyományos tisztítási stratégiákkal nehezen tudtak tisztítani.
A felismerhető DNS-szekvenc iákon és az adott génen kívül további szelektálómarkert kapcsolnak a DNSkonstrukcióhoz. így csak azok a sejtek élik túl a szelektív táptalajon történő növesztést, amelyek fölvették a DNS-t. Például a neomicin rezisztenciagénjét tartalmazhatja az expressziós vektor. A fertőzést követően a sejteket G-418, egy neomicinantibiotikum jelenlétében tenyésztik, amely halálos az emlőssejtekre. Ha viszont a sejtek tartalmazzák a neomicin rezisztenciagénjét, képesek lesznek ellenállni a drog mérgező hatásának. Ily módon tehát csak azok a sejtek maradnak fenn a tenyészetben, amelyek fölvették a bejuttatott DNS-t. Nyilvánvaló, hogy bármilyen szelektálómarker használható, amíg lehetővé teszi a bejuttatott DNS-t felvett sejtek kiválasztását. Az is világos továbbá, hogy a sejtben a bejuttatott genetikai anyag helyzete nem különösen jelentős. Csak az a fontos, hogy valahol a sejtmagban legyen, csakúgy, mint szabályozóelem és az idegen gén (és persze a szelektálómarker) együtt.
Hiányosságok a génexpresszió elterjedt módszereiben
Mialatt a fenti technikák kihasználták a genetikai manipuláció eszközeit, nem minden esetben bizonyultak a génexpresszió leghatékonyabb módszereinek. Ennek oka, hogy a DNS-nek a sejtvonal nukleuszába történő beépítése a transzfekciónak ismert technikán keresztül történt. A DNS-t, amelyet a kérdéses sejtvonalban történő expresszióra alakítottak ki, kicsapják, és a sejtmembránt pedig feloldják, hogy lehetővé tegye a DNS behatolását. Amint azt fentebb jelezzük, a pontos hely, ahová a DNS beépül a genomba, soha nem határozható meg előre; valóban a DNS maradhat episzomálisan (nem integrálódott a genomba) is. Ez eredményezi, hogy sem a termelt fehérje expressziójának a szintjét, sem a sejtvonal stabilitását nem tudjuk előre megjósolni.
Egy másik tökéletlensége ennek a technikának, hogy nagyon nehéz az expressziós vektor elkészítése, amikor a kérdéses gén viszonylag nagy méretű (nagyobb, mint 5-10 kilobázis). Számos, rekombináns DNS-technológiával expresszált fehérjét cDNS-ek kódolnak inkább, mint a sokkal nagyobb genomi kiónok. Ezt az inszert méretének csökkentése végett teszik. Amíg a cDNS-ek felhasználása a genetikai átalakítást könnyebbé teszi, ennek eredményét a géntranszkripció és a fehérjetermelés szintje szenvedi meg. Az utóbbi időben Brinster és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 836-840. (1988) valamint Chung és Perry, Mól. Cell. Bioi., 9: 2075-2082 (1989) kimutatták, hogy a genomiális inszertek használata néhány esetben nagymértékben megnöveli az expressziós szintet. Bár nem teljesen ismertek a mechanizmusok, amelyek ezért a jelenségért felelősek, tudjuk, hogy bizonyos esetekben az intronokban jelen lévő enhancer elemek megnövelik a gén transzkripciójának hatékonyságát. Buchmann és Berg, Mól. Cell. Bioi, 8: 4395-4405 (1988) szerint arra is van bizonyíték, hogy az intronok vagy az intronok jelenlétéből következő érési események hatással lehetnek a transzkripció iniciálását követő RNSérési folyamatokra. Stabilizálódhat a transzkriptum, miáltal emelkedik az RNS-felhalmozódás aránya. A fentebb idézett, Brinster és munkatársai által közölt cikkben feltételezik, hogy az intronok elhelyezkedése a génen belül fontos lehet a nukleoszómák promoterhez viszonyított helyzetének kialakulásában. A különböző szabályozóelemeknek az eukariótagének transzkripciójára gyakorolt hatását Khoury és munkatársai Cell, 33: 313-14 (1983), Maniatis és munkatársai Science, 236: 1237-45 (1985) és Muller és munkatársai, Eur. J. Biochem., 176: 485-95 (1988) vizsgálják.
Harmadszor, ahhoz, hogy a bevitt DNS-t az idegen gén kódolórégiójával együtt bejuttassuk a sejtmagba, a sejt átjárhatóvá tett plazmamembránján történő belépés után át kell jutnia a citoplazmán is. Ez alatt az idő alatt a DNS kapcsolatba kerülhet a lizoszomális enzimekkel, amelyek megváltoztatják vagy teljesen tönkre is tehetik az integritását. így a DNS kódolórégiója lehet, hogy már nem azonos a bejutott molekulával.
A gén aktiválásának és/vagy az expresszió módosításának az alábbiakban leírt új módszere nem vezethet a tervezett fehérje mutáns formáinak keletkezéséhez, mivel az adott gén kódolórégióját nem tesszük ki enzimatikus módosításoknak.
Összefoglalásul, a hagyományos technikákkal a sejtbe juttatott nagy mennyiségű DNS, és különösen annak kódolórégiója nem hűen íródik át. Degradálódhat, mielőtt bejutna a nukleuszba, enzimatikusan módosulhat úgy, hogy többé a nem kívánt fehérjét kódolja, vagy nem tartalmazza a transzkripciót lehetővé tevő valamennyi szükséges szabályozódarabot. Lehetséges, hogy a genomon belül olyan pozícióba integrálódott, amely megakadályozza a transzkripciót. Amennyiben cDNS íródik át, lehetséges, hogy a kérdéses fehérje nem termelődik hatékonyan az intronok hiánya (amelyek enhancereket tartalmazhatnak) vagy az mRNS hatékony érésének hiánya miatt. Végül a DNS maradhat episzomálisan termelve a fehérjét, akkor viszont instabil, amikor a sejtpopuláció növekedésekor átmegy a sejtosztódáson.
A legkedvezőbb lenne egy olyan módszer kifejlesztése a génexpresszió indukálására, amely egy olyan sejtvonalat eredményezne, amely rendelkezik valamennyi előnyös tulajdonsággal, de valahogyan elvesztette a hátrányos jellemzőket. Kedvező lenne továbbá, hogy képes legyen expresszálni vagy módosítani az adott gének belső expresszióját a választott sejttípusban. További kívánalom, hogy képes legyen előnyösen kihasználni azt a potenciális előnyt, hogy elviselhet teljes genomi szekvenciákat, amelyek az intronokon belül tartalmazhatnak rejtélyes transzkripcionális enhancereket, amik segítik az intronok megfelelő elhelyezkedését a nukleoszómák helyes kialakulása végett, és a még hatékonyabb mRNS-érési folyamatokat. Ezek az előnyök általában nem találhatók meg a rekombináns DNS-t expresszáló módszerekben a gén mérete miatt. Ha valaki képes lenne egy gént expresszálni, amely már a genomban helyezkedik el, vagyis egy endogén gén, a sejtvonal stabilitása és az expresszió mértéke állandóbb és előre jelezhetőbb lenne.
A találmány összefoglalása
A találmány tárgyát képezi a szakterületen eddig feltárt és fentebb említett hiányosságok kiküszöbölése.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy, a génexpresszió szabályozására és/vagy növelésére szolgáló olyan módszer, amely felhasználja a rekombináns géntechnológia pozitív lehetőségeit, de kiküszöböli annak kedvezőtlen tulajdonságait.
A találmány tárgya továbbá a választott sejtvonalban jelen lévő, de normál körülmények között transzkripcionálisan nem aktív, specifikus gének kifejeződésére szolgáló módszer.
A találmány tárgya még fehérjék expresszálására szolgáló módszer, amely felhasználja az mRNS felhalmozódásáért és/vagy transzkripciójáért felelős teljes genomi szekvenciák előnyeit.
A találmány tárgyát képezi még a kérdéses gén expresszióját egy DNS-szabályozó és/vagy -megsokszorozó elemnek a stabil sejtvonal vagy klónozott mikroorganizmus genomjába, a géntől „upstream”, azon belül vagy annak közelébe történő beépítésével módosító eljárás.
A találmány tárgya továbbá egy olyan gén expreszsziójának módosítására szolgáló eljárás, amely természetesen van jelen egy stabil sejtvonal vagy klónozott mikroorganizmus genomjában, és ugyanakkor beépít olyan jellemzőket, amelyek segítik a megfelelően módosított sejtek kiválasztását.
A találmány tárgya még egy olyan genom, amelyben a kérdéses gén kódolórégiójának vagy exonjainak közelében szabályozó- vagy megsokszorozóelemek találhatók, amelyek természetes állapotban nem fordulnak elő azokon a helyeken.
A találmány tárgyai még olyan DNS-konstrukciók, amelyek felhasználhatók a találmány homológ rekombinációs módszereinek követésére.
A találmány tárgyai továbbá sejtvonalak és mikroorganizmusok, amelyek a találmánynak megfelelő genomot tartalmaznak.
Mindezek, valamint a találmány tárgyát képező egyéb anyagok és módszerek a homológ rekombináció
HU 217 212 Β technikájával valósíthatók meg, amellyel bárki, szakterületen jártas, elő tudja idézni egy meglévő, de transzkripcionálisan inaktív gén expresszióját, még inkább amplifikációját. Ezzel a technikával szintén módosíthatók egy stabil sejtvonal genomjában természetesen jelen lévő, de nem szükségszerűen csendes vagy inért gén expressziójának jellemzői, mint például a körülmények represszálóvá, indukálóvá tételével vagy az expresszió arányának növelésével.
A találmány módszert kínál egy sejtvonal vagy mikroorganizmus genomjában lévő gén expresszióját jellemző adatok megváltoztatására. A homológ rekombináció módszerével egy DNS-konstrukciót építünk be a genomba. A konstrukció tartalmaz egy szabályozó DNS-darabot, amely képes bármely gén expreszsziójának jellemzőit megváltoztatni, amelyhez működőképesen kapcsolódik a gazdasejtben vagy mikroorganizmusban, valamint egy targetet felismerő darabot, amely homológ a genom azon régiójával, ahová be kívánjuk építeni a szabályozódarabot. A konstrukciót és a beépítési technikát úgy tervezzük meg, hogy az új szabályozódarabot működőképesen kapcsolja a kérdéses génhez. Ily módon, anélkül hogy szükségképpen új exonokat építenénk be, módosítjuk a génexpresszió jellemzőit. Egy kedvelt megvalósítás az, amikor egy gén olyan, hogy a gazdasejtvonalban vagy mikroorganizmusban a DNS-szabályozó régió hatására transzkripcionálisan csendes vagy inért. Ekkor ezt a régiót a homológ rekombinációval célozzuk meg annak a génnek megfelelő pozícióban, amely gén ezáltal aktiválódik a kódolt termék kifejezése érdekében.
A DNS-konstrukció két célzószegmentet tartalmaz, amelyeket egymástól azok az elemek választanak el, amelyeket be kívánunk építeni a genomba, és kedvező, ha határosak a natív génnel.
A konstrukció tartalmaz továbbá legalább egy expresszálódó szelektálómarker-gént, mint például a neomicinrezisztenciát nyújtó gén. Ez a markergén, beleértve a promoterét is, szintén a konstrukció célzórégiói között helyezkedik el.
Egy másik megvalósításkor a konstrukció tartalmaz egy expresszálódó és amplifikálógént annak érdekében, hogy megnöveljük a kérdéses gén expresszióját. Ez a gén, a promoterével együtt, szintén a konstrukció célzórégiói között helyezkedik el. Néhány esetben a szelektálómarker és az amplifikálómarker lehet ugyanaz.
A találmány további megvalósítása során a DNSkonstrukció tartalmaz egy negatív szelektálómarkergént, amely nem expresszál azokban a sejtekben, amelyekben a DNS-konstrukció helyesen épült be. Ez a negatív szelektálómarker-gén a két célzórégión kívül helyezkedik el, így eltávolítódik, amikor a konstrukció helyesen kombinálódott be a génbe a homológ rekombináció révén. A negatív szelektálógénre egy példa a Herpesz szimplex vírus timidin-kináz-génje.
Egy további megvalósítás során lehetséges, hogy módosítsuk egy specifikus gén expressziójának jellemzőit, amely már termeli a kérdéses gén termékét a kérdéses sejtvonalban vagy mikroorganizmusban. Ez megvalósítható egy olyan DNS-konstrukció beépítésével, amely tartalmaz 1 egy expresszáló amplifikálógént, amely megnöveli a kérdéses gén kópiaszámát, amikor a sejtvonal vagy a mikroorganizmus amplifikálókörülmények közé kerül, és/vagy 2 egy promoter/enhancer elemet (vagy egyéb szabályozóelemet), amely például a transzkripció arányának növelésével, a transzláció hatékonyságának növelésével, az mRNS fölszaporodásának növelésével stb. módosítja a kérdéses gén expresszióját. A génexpresszió, amelyet ily módon módosítottunk, lehet egy természetes expresszió, vagy okozhatta a sejtvonal vagy mikroorganizmus előzetes genetikai manipulációja. Az előzetes genetikai manipuláció történhetett hagyományos technikákkal, vagy a találmánnyal összhangban lévő homológ rekombináció módszerével. Az utóbbi esetben a DNS-inszerció, amely az expresszió jellemzőinek módosulását eredményezi lehet ugyanazon genetikai manipulációnak a része, amely a gén expreszsziójához vezet, vagy lehet egy következő lépés.
A találmány tartalmazza a fenti tárgyalás alapján készített konstrukciókat, csakúgy, mint a genomokat, melyeket ezekkel a konstrukciókkal végzett homológ rekombinációnak vetünk alá, ezeket a genomokat tartalmazó sejtvonalakat és mikroorganizmusokat. Tartalmazza még a kívánt terméknek a találmány szerint transzformált sejtek tenyésztésével történő előállításának a folyamatát.
A rajzok rövid leírása
Az 1. ábra bemutatja a találmány szerinti DNSkonstrukció általános képét.
A 2A. ábra bemutatja a DNS-konstrukció genomba történő integrálásának módját nem homológ vagy random rekombináció esetén.
A 2B. ábra bemutatja a DNS-konstrukció genomba történő integrálásának módját homológ rekombináció esetén.
A 3. ábra bemutatja a találmány szerint előnyben részesített homológ rekombinációs vektort.
A 4. ábra bemutatja egy cirkuláris DNS-darab integrációját homológ rekombinációval, amikor csak egy célzó DNS-darabot alkalmazunk.
Az 5. ábra bemutatja a pRSVCAT plazmidot és annak restrikciós helyeit.
A 6. ábra bemutatja a pRSV plazmid készítését és restrikciós helyeit.
A 7. ábra bemutatja a pSV2NEO plazmidot és restrikciós helyeit.
A 8. ábra bemutatja a pSVNEOBAM plazmid készítését és restrikciós helyeit.
A 9. ábra bemutatja a pRSVNEO plazmid készítését és restrikciós helyeit.
A 10. ábra bemutatja a pRSVCATNEO plazmid készítését és restrikciós helyeit.
All. ábra bemutatja a patkány TSHB gén 15,3 kb nagyságú fragmentumát a különböző restrikciós darabjaival.
A 12. ábra bemutatja a pRSVCATNEOTSHB3 plazmid készítését és restrikciós helyeit.
A 13. ábra bemutatja a pRSVCATNEOTSHB35XbaI plazmid készítését és restrikciós helyeit.
HU 217 212 Β
A 14. ábra bemutatja a TSHB nukleotidszekvenciájának egy részét azon régióin belül, amely megfelel a PCR-amplifikációban használt primereknek. A 2-es és a 3-as exont nagybetűkkel jelöltük. Egy 247 bp nagyságú, amplifikált fragmentet a szekvencia alá írt csillagokkal jelöltünk.
A 15. ábra bemutatja azon cDNS elektroforézisének az eredményét, amelyet a különböző sejttenyészetekből izolált RNS-ből szintetizáltunk, és amelyekben a TSHB cDNS-t, ha jelen volt, PCR-rel fölszaporítottuk. A különböző vonalakat reprezentáló sejtek természete a 15. ábrán, a gél alatt látható.
A leginkább alkalmazott megvalósítások részletes leírása
A homológ rekombináció az utóbbi néhány évben kifejlesztett technika, amelyet gének indukálására vagy transzkripcionálisan aktív génekben lévő mutációk kijavítására dolgoztak ki, amint azt Kucherlapati, Prog. in Nucl. Arid Rés. and Mól. Bioi., 36: 301 (1989) leírja. A homológ rekombináció ezen technikáját egyrészt az emlősgenom specifikus régióiba történő mutációk bevitelére dolgozták ki, és az alábbi közleményekben írták le: Thomas és munkatársai, Cell, 44: 419-428, 1986; Thomas és Capecchi, Cell, 51: 503-512, 1987; Doetschman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sri., 85: 8583-8587, 1988; másrészt hibás génekben előforduló specifikus mutációk kijavítását célozták meg vele, amint azt Doetschman és munkatársai, Natúré, 330: 576-578, 1987 leírták.
Ezzel az eljárással a genomba bejuttatni kívánt DNS-darab a kérdéses gén specifikus régiójába irányítható azáltal, hogy a „célzó DNS”-hez kapcsoljuk. A „célzó DNS” a genomi DNS-sel komplementer (homológ) DNS. Amennyiben a homológ egyszálú DNSdarabok (a célzó és a genomi DNS) közel kerülnek egymáshoz, dupla szálú hélixet képezve hibridizálni fognak. A célzó DNS-hez kapcsolódik a genomba beépíteni kívánt DNS-szekvencia.
Számos eljárás van, amellyel a homológ rekombináció megtörténhet. Egy példa a sejtek mitózisa alatt lejátszódó DNS-replikáció.
Egy nem teljesen ismert mechanizmus révén a DNS egy replikációs hólyagnak nevezett lokális régióban kinyílik közvetlenül a sejtosztódás előtt. A két elválasztott DNS-szál szolgálhat templátként az új DNS szintéziséhez. A replikációs villa egyik karja 5’-3’-irányú DNS-kód, amely a DNS-polimeráz enzim számára megfelelő orientációt jelent. A másik szülői DNS-szál 3’-5’-irányú, amelyet viszont a DNS-polimeráz nem tud leolvasni. Ezen DNS-szál replikációját egy speciális mechanizmus kell hogy végezze.
Egy speciális enzim, az RNS-primáz hozzákötődik a DNS 3’-5’-irányú száljához, és szintetizál egy rövid RNS-primert a szál mentén. Ezt az RNS-darabot használva primerként a DNS-polimeráz most már hozzákötődik a primerrel ellátott DNS-hez, és megszintetizálja a DNS-komplementerét az 5’-3’-irányban. Az újonnan szintetizált DNS-darabokat Okazaki-fragmenteknek nevezik. A reakció kezdéséért felelős RNS-primereket a DNS-polimeráz exonukleáz-funkciója eltávolítja, és
DNS-sel helyettesíti. Ez a jelenség addig folytatódik, amíg a polimeráz el nem ér egy primer nélküli DNSszálat, ahol a helyi szintézis folyamata leáll. Ily módon, bár a komplementer szál végig a 3’-5’-irányban szintetizálódik, valójában egy visszafelé haladó „összefuzési” reakcióról van szó 5’-3’-irányban. A „visszafűzési” folyamatban a DNS-en keletkező lyukakat a DNS-ligáznak nevezett enzim foltozza be.
A DNS-kód abszolút hűségének fenntartására a DNS-polimeráz rendelkezik egy javítófunkcióval. A DNS-polimeráz primerrel ellátott DNS-darabokat igényel, amelyeken szintetizálja az új DNS-szálat. Amint föntebb említettük ez lehet egy RNS-sel vagy egy komplementer DNS-sel ellátott egyszálú DNS. Amikor a DNS-polimeráz báziscseréből eredő hibás komplementer DNS-t talál, exonukleázként működhet, és eltávolíthatja a DNS-bázisokat 3’-5’-irányban mindaddig, míg ismét el nem éri a tökéletes bázispárosodást.
Ezzel a háttérismerettel most már lehetővé válik az itt leírt technika alapjainak megértése. A célzó DNS kis darabjait, amelyek komplementerek a genom specifikus régiójával, a DNS-replikáció folyamata alatt összekapcsoljuk a szülői szállal. A sejtbe beépült DNS-nek egy általános tulajdonsága, hogy hibridizál, és ezáltal rekombinálódik a DNS egyéb darabjaival, amelyek homológ régiókat tartalmaznak. Amennyiben a komplementer szál kötődik egy oligonukleotidhoz, amely mutációt vagy eltérő DNS-szekvenciát tartalmaz, a rekombináció eredményeképpen az is beékelődik az újonnan szintetizálódott szálba. A javítófunkció eredményeképpen lehetséges, hogy az új DNS-szekvencia szolgál templátként. Ily módon a bejutott DNS beékelődik a genomba.
Amennyiben az adott gén szekvenciája ismert, a gén kiválasztott régiójával komplementer DNS-darab szintetizálható vagy előállítható egyéb módon is, mint például a natív DNS restrikciós hasításával a régiót kötő specifikus felismerőhelyeken. Ez a darab fog célzóeszközként szolgálni a beépülés során, és fog hibridizálni a genomon belüli homológ régiójával. Amennyiben a hibridizáció a DNS-replikáció alatt történik, ez a DNS-darab és más egyéb, ahhoz kapcsolódó szekvencia is Okazakifragmensként fog viselkedni, és visszakötődik a DNS újonnan szintetizált leány száljába.
A találmány módszere során a célzó DNS-darabokhoz olyan DNS-régiókat kötünk, amelyekről tudjuk, hogy kölcsönhatásba lépnek a sejtben lévő magi szabályozófehérjékkel, és tetszés szerint amplifikálhatók, és szelektálható DNS-markereket hordoznak. így a specifikus fehérjék expresszióját elérhetjük nemcsak magát a gént kódoló DNS bejuttatásával, amint az általában szokás, hanem a transzkripció számára felismerhető szignálokat biztosító szabályozó DNS-darabbal párosodott target régió felhasználásával is. Ezzel a technológiával lehetséges bármilyen, a sejttípusban jelen lévő rokon gén expresszálása és amplifikálása a gén bejuttatása nélkül. Ráadásul ezen gén expresszióját belső genomi DNS szabályozza a gén vagy cDNS részei helyett, így megnövekszik a transzkripció aránya és az mRNS-érés hatékonysága. Továbbá a sejttípusban jelen lévő bármely rokon gén expressziójának jellemzői módosíthatók a megfelelő szabályozó DNS-darab beékelésével anélkül, hogy bevinnénk a kérdéses gén belső kódolórészeit.
Ezekkel a szempontokkal összhangban új módszereket kínálunk a normál körülmények között transzkripcionálisan nem aktív gének expresszálására vagy az endogén kifejeződő gének expressziójának módosítására egy differenciált sejtvonalban. Az expresszálni vagy az expressziójukat módosítani kívánt rokon, genomi szekvenciákat a szükséges sejtspecifikus DNS-szekvenciákkal (szabályozó- és/vagy amplifikálódarabok) együtt biztosítjuk a sejten belüli génexpresszió irányítása vagy módosítása végett. A keletkező DNS tartalmazni fogja a kívánt fehérjét kódoló DNS-szekvenciát közvetlenül, működőképesen kapcsolódva a heterológ (a rokon DNS-szekvenciához képest) szabályozó- és/vagy amplifikálódarabokhoz. A konstrukcióba tetszés szerint lehet pozitív szelektálómarkert beépíteni a kapott sejtek átvizsgálásának segítése érdekében. Kedvelt a neomicinrezisztencia-gén használata, de bármilyen egyéb szelektálható marker is alkalmazható. Használható még tetszés szerint negatív szelektálómarker is. Például a Herpes szimplex vírus timidin kináz- (HSVtk) enzimgénje használható markerként a random módon integrálódó vektor DNS-szelektálására. Az összekapcsolt vagy kivágott expresszálódó DNS-ek amplifikálhatók, amennyiben a célzó DNS egy amplifikálható markerhez kapcsolódik.
így a találmány módszerének megfelelően bármilyen gén, amely normál körülmények között akkor expresszál, amikor a saját specifikus, eukarióta-, leginkább differenciált sejtvonalban van jelen, rákényszeríthető, hogy expresszálódjon egy nem arra specifikus sejtvonalban is, amelyben egyébként nem nyilvánul meg. Ez valójában megtörténik a gén teljes szekvenciájának beépítése nélkül. Ráadásul az a gén vagy egy normál körülmények között expresszálódó gén amplifikálható nagyobb expressziós ráta elérése érdekében. Továbbá a transzkripcionálisan nem teljesen inaktív gének expressziójának jellemzői is módosíthatók, csakúgy, mint a mikroorganizmusokban lévő gének expressziós jellemzői.
A találmány egyik megvalósításakor az itt leírt technikával indukálunk olyan eukariótasejteket, amelyek tartalmazzák, de normál körülmények között nem írják át a kérdéses gént. Az alább leírt homológ rekombinációs vektort juttatjuk be egy klónozott sejtvonalba, majd kémiai szelekciót alkalmazva megvizsgáljuk egy specifikus géntermék keletkezését valamilyen megfelelő módszerrel, mint például az újonnan aktivált génről átíródó mRNS kimutatása, a specifikus géntermék immunológiai kimutatása vagy a specifikus géntermék funkcionális vizsgálata.
Az endogén gének transzkripciójának homológ rekombinációval történő aktiválására használt DNS-konstrukciók általános felépítését az 1. ábrán mutatjuk be.
Általánosságban egy DNS-konstrukció legalább kettő, de lehet hat vagy még több is, elkülönített DNSdarabból áll. A darabok között találunk legalább egy, de inkább kettő DNS-célzódarabot A és B, amelyek homológok a sejt genomjának egy régiójával, amelyen belül vagy annak közelében a gént C, egy amplifikálható gént D, egy negatív szelektálógént E és egy DNSszabályozó darabot F, amely transzkripcionálisan aktív a fertőzött sejtben. A találmány legalapvetőbb megvalósításakor mindössze egy célzódarab B és szabályozódarab F kell hogy jelen legyen. Valamennyi egyéb régió tetszőlegesen választható, és a kívánt konstrukciókat produkálják.
Az A és B régiók DNS-szekvenciák, amelyek homológok a kérdéses endogén génnel, amelyet át kívánunk íratni. A gén specifikus A és B régióit úgy választjuk ki, hogy attól a helytől, amelyre a szabályozóelemet be akarjuk építeni, upstream és downstream helyezkedjenek el. Bár ezek a régiók a konstrukcióban el vannak választva, az endogén génben leginkább folyamatosan helyezkednek el. Előfordulhat olyan eset is, hogy a genomnak nem folyamatos részét használjuk célzódarabokként, például amikor azt akarjuk elérni, hogy a genom egy részét kiejtsük mint egy negatív szabályozóelemet.
Amíg két célzórégió, A és B előnyösebb annak érdekében, hogy növeljük a teljes homológia régióját, és ezáltal a rekombináció hatékonyságát, a találmány eljárása magában foglalja a csak egy célzórégió felhasználását is. Legegyszerűbb formájában (amikor csak az F szabályozóelem és a C markergén, valamint a C promoter épül be) egy cirkuláris DNS-darabot alkalmazunk, amely a célzó DNS-sel együtt tartalmazza ezeket az elemeket. Ily módon a homológ régió B hibridizál a saját genomi partnerével. A C’, C és F darabok a rokon gén B részébe épültek be az átkereszteződési eseményt követően.
Amennyiben az a kívánalom, hogy a szabályozó DNS-szekvenciát a kérdéses géntől upstream helyzetben építsük be, mivel például egy normál körülmények között át nem íródó gént akarunk expresszálni, a legjobb, ha a homológ régió a kérdéses gén kódolórégiójától upstream lévő genom nem kódoló részével mutat homológiát. Amikor két célzórégió van jelen, a downstream régió A tartalmazhatja a kódolórégió egy részét, bár előnyösebb, ha az upstream régiót teljes egészében hordozza. Kedvező továbbá, ha a homológ régiókat úgy választjuk meg, hogy a szabályozó DNS-szekvenciákat a kérdéses gén natív promoterétől downstream építjük be, különösen akkor, ha a natív promoter egy negatív promoter, nem pedig egy kikapcsolt pozitív promoter.
A célzórégiók (a homológ régiók) mérete nem kritikus, bár a rövidebb régiók kevésbé valószínű, hogy megtalálják a megfelelő homológ régiót, és rekombinálódnak a kívánt helyre. így a rövidebb homológ régiók kevésbé hatékonyak a homológ rekombináció szempontjából, mivel a sikeresen rekombinálódott kiónok százalékos aránya sokkal kisebb lesz. Ayares és munkatársai, PNAS, USA, 83: 5199-5203, 1986, szerint a szükséges minimális homológia legalább 25 bázispámyi kell, hogy legyen. Továbbá, ha konstrukció bármely más eleme szintén megtalálható a gazdasejt genomjában, megvan annak a valószínűsége, hogy a rekombináció rossz helyen játszódik le. Bár a találmány kiváló pozitív és negatív szelektálhatósága lehetővé teszi, hogy sikeresen hajtsuk végre azt akkor is, ha a hatékonyság alacsony. Optimális eredményeket érünk el, amennyiben a teljes homológ régió, beleértve mindkét célzórégiót is, nagy, például 1-3 kilobázis. A kérdéses génhez működőképesen kapcsolt F szabályozódarab mérete nem korlátozza a célzórégió méretét, és különösen nem az uptstream elhelyezkedő B régiót.
Empirikusan könnyű meghatározni, hogy a célzórégió túl hosszú, vagy az F szabályozóelem helyezkedik el túl messzire a gén régiójától, amelyhez működőképesen kapcsolódik. Ilyen esetben az A és a B régiók homológokká tehetők a kérdéses gén különböző régiójával, és a folyamat ismétlődik addig, amíg az F szabályozóelem helyesen illeszkedik, és így működőképesen kapcsolódik a kérdéses génhez. Például a kérdéses gén kombinálódott A-B régiójának restrikciós helye megváltoztatható, és a folyamat ismételhető. A találmány koncepciója, amelyet itt közzé teszünk, ismert a szakterületeken jártasak előtt, és ők képesek használni ezt a találmányt bármely adott gén és sejtvonal vagy mikroorganizmus vonatkozásában anélkül, hogy további kísérletezésre lenne szükség.
A C régió egy pozitív szelektálómarker-gén, ami képes szelektált sejtvonalat előállítani, amely normál körülmények között rezisztens a környező mérgekkel szemben. Ilyen génekre példák az adenozindeamináz (ADA), aminoglükozid-foszfotranszferáz (Neo), dihidrofolát-reduktáz (DHFR), hidromycin-B-foszfotranszferáz (HPH), timidin-kináz (tk), xantin-guaninfoszforiboziltranszferáz (gpt), többszörös drogrezisztenica-gén (MDR), ormitin-dekarboxiláz (ODC) és N-(foszfonacetil)-L-aszpartát-rezisztencia (CAD).
A pozitív szelektálómarker-gén mellett a konstrukció a D régióban tartalmazhat egy amplifikálógént is. Az amplifikálógének azok a gének, amelyek a kópiaszám növekedéséhez vezetnek szelekciós nyomás alatt. Az amplifikálógén melletti gén kópiaszáma szintén megnövekszik. A használható amplifikálógének közé tartoznak: DHFR, MDR, ODC, ADA és CAD. A pozitív szelektálómarker-gének csoportjának azon tagjai esetében, amelyek átfedésben vannak az amplifikálógének csoportjával, ahelyett, hogy két gént használnánk, egyet a pozitív szelekcióra és egyet az amplifikálásra, egy gént használhatunk mindkét cél megvalósítására. Mivel a legtöbb sejtvonal tartalmazza ezen amplifikálógének kópiáit, a sejtek már valamilyen módon rezisztensek lesznek a szelekciós körülményekre, és nehéz lesz megkülönböztetni azokat a sejteket, amelyeket DNS-sel fertőztünk, azoktól, amelyek nem vettek fel DNS-t. Azokban az esetekben, amikor egy amplifikálógén is kívánatos, egy pozitív szelektálógént, amely domináns, szintén tartalmaznia kell a konstrukciónak (ilyen például a HPH, gpt, neo és a tk). Néhány alkalmazás esetében lehetséges, vagy kívánatos, hogy elhagyjuk az amplifikálómarkert. Például a kérdéses gént nem szükséges amplifikálni, amikor a heterológ DNS-szabályozó szekvenciával történő transzkripciós aktiválás elegendő amplifikálás nélkül. Amennyiben a homológ rekombináció hatékonysága nagyon alacsony, szükség lehet arra, hogy kihagyjuk az amplifikálógént, mivel a nem homológ és homológ DNS aránya közvetlenül hatással van a homológ rekombináció hatékonyságára, amint azt Letsou, Genetics, 117: 759-770, 1987 leírja. Az is lehetséges, hogy kiküszöböljük a pozitív szelektálógént, és a sejteket a kívánt fehérje- vagy mRNS-termelésre vizsgáljuk meg. A legtöbb esetben kívánatos azonban, hogy legalább egy pozitív szelektálógént beiktassunk.
A konstrukció E régiója egy negatív szelektálógén. Ilyen gén nem exresszálódik azokban a sejtekben, ahol a DNS-konstrukció a homológ rekombináció révén helyesen épült be, de kifejeződik azokban, amelyekben nem megfelelően, random módon integrálódott. Egy ilyen gén a Herpesz szimplex vírus timidin-kináz-génje (HSVtk). A HSVtk kismértékben ragaszkodik a nukleotidokhoz, és képes azon nukleotidok foszforilálására, amelyre a normál emlőssejtek nem képesek. Ha a HSVtk jelen van a sejtekben, olyan nukleotidanalógok, mint az acilklovir és ganciklovir foszforilált állapotba kerülnek, és beépülnek a gazdasejt DNS-ébe, és ezáltal megölik a sejtet. A negatív szelektálómarker-gén jelenléte lehetővé teszi a pozitív és negatív szelekciót a homológ rekombináció után, amint azt Mansour és munkatársai Natúré, 336: 348-352, 1988 közleményükben leírják.
Capecchi azt a stratégiát követi, amely kihasználja, hogy az integrálódás eltérő módon megy végbe, amikor linearizált vektor DNS épül be homológ rekombinációval, mint amikor random módon történik az integrálódás. Amikor a vektor DNS-random módon integrálódik, az inszertek többsége a végeken keresztül épül be, amint azt az alábbi közleményekben olvashatjuk: Folger és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 2: 1372-1387, 1982; Roth és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 5: 2599-2607, 1985; Thomas és munkatársai, Cell, 44: 4319-428, 1986. Másrészt, ha a vektor homológ rekombinációval épül be, a homológ régiókon keresztül fog rekombinálódni, ami ezen régiókon kívül eső szekvenciák elvesztését okozza.
Az első ábrán bemutatott konstrukció felhasználásával a 2A. és 2B. ábrákon demonstráljuk a homológ rekombinációval történő integrálódás módját, összehasonlítva a random integrációval. A nem homológ rekombináció esetében (2A. ábra) a vektor a konstrukció végein keresztül épül be. Ez lehetővé teszi az E régiónak, jelen esetben a HSVtk génnek, hogy beékelődjön a genomba. Egyébként, amikor homológ rekombináció történik (2B. ábra) a HSVtk gén elvész. Az első szelekciós lépésben a konstrukcióban jelen lévő pozitív szelekciónak megfelelő mérget vagy körülményeket használjuk fel. Azok a sejtek, amelyek akár homológ rekombináció, akár random integráció révén bejutott DNS-t tartalmaznak, túlélik a szelekciónak ezt a lépését. A túlélő sejteket ezután például glanciklovír méregnek tesszük ki, amely megöli mindazokat a sejteket, amelyek tartalmazzák a HSVtk gént. Ebben az esetben a legtöbb sejt, amelyben a vektor random módon épült be, tartalmazza a HSVtk gént, és így a méreg hatására elpusztul, mialatt azok, amelyekben a vektor homológ rekombinációval integrálódott, elveszítették a HSVtk gént, és túlélik a szelekciót. Ez lehetővé teszi a legtöbb olyan sejtnek az eltávolítását, amelyek random módon integrálódott DNS-t tartalmaznak, meghagyva a homológ rekombinációval integrálódott DNS-t tartalmazó sejtek többségét. Ez nagyban meggyorsítja a megfelelő rekombinációs esemény azonosítását.
Ha szükséges, a negatív szelekciós lépés szintén kihagyható. Ez viszont sokkal munkaigényesebb átvizsgálást igényel, amelyhez hozzátartozik olyan technikák alkalmazása is mint a polimeráz-láncreakció (PCR) vagy immunológiai tesztelés.
A hatodik régió F tartalmazza azt a szabályozóelemet, amely kérdéses gént transzkripcionálisan aktívvá teszi. A megfelelő DNS-szabályozó darabot a felhasználni kívánt sejttípus alapján választjuk ki. A leginkább használni kívánt szabályozódarab az, amelyről tudjuk, hogy segíti az adott gén expresszióját a differenciálódott gazdasejtvonalban. Például, amennyiben a gazdasejtvonal hipofízissejtekből áll, amelyek eredendően expresszálnak növekedésihormont és prolaktint, bármelyik gén promotere használható DNS-szabályozó elemként F. Amikor a találmány szerint beépített szabályozóelem működőképesen kapcsolódik a gazdasejtvonalban eredendően át nem íródó kérdéses génhez, stimulálja annak a génnek a transzkripcióját és/vagy az expresszióját. Szintén használhatók olyan tetszőleges DNS-szabályozó darabok, amelyek működnek különböző sejttípusokban, mint például a Rous-szarkómavírus (RSV) promotere. Minden olyan szabályozóelem, amely stimulálja a kérdéses gén transzkripcióját és/vagy az expresszióját, vagy indukálható a transzkripciót és/vagy az expressziót stimuláló hatása, miután a gazdasejtvonalban a találmány szerint működőképesen hozzákapcsolódott a kérdéses génhez, felhasználható a találmányban. Lényeges, hogy amikor az F szabályozószegment kapcsolódik az A célzódarabhoz, véletlenül se kerüljön startkodon a szekvenciába, mivel ennek megjelenése meg tudná változtatni az expresszálni kívánt gén leolvasási keretét. Természetesen a konstrukciót úgy kell elkészíteni és bejuttatni, hogy az F szabályozóelem működőképesen kapcsolódjon a kérdéses génhez.
A DNS-szabályozó elem, az F régió jelenléte szükséges azokban a példákban, ahol kívánatos a kérdéses sejtvonalban már expresszáló gén transzkripciójának növelése vagy a génnek az amplifikálása, azért, mert eredetileg is expresszálódik abban a sejtvonalban, vagy pedig azért, mert a sejtvonal DNS-ében előzetesen történt olyan manipuláció, amely ilyen expressziót okozott. Ilyen példák során egy pozitív szelekciót biztosító markergénnel (C régió), és ha akarjuk, egy negatív szelekciót lehetővé tevő markergénnel (E régió) együtt beépített amplifikálógén elegendő a kérdéses gén kópiaszámának növelésére, és így a transzkriptum teljes mennyiségének folszaporítására. Egy másik megoldásként egy új szabályozóelem (F régió) beépítése a kérdéses, már meglevő és expresszálódó gén transzkripciójának további növelésére öröklődőén segít egy megnövekedett (vagy másképp módosított) transzkripciórátát, összehasonlítva a kérdéses gén létező szabályozórégiójával. Egy ilyen új szabályozószegment tartalmazhat promotereket vagy enhancereket, amelyek emelik a transzkripció hatékonyságát.
A C’, D’ és E’ promoterrégiókat jelentenek, amelyeket a C, D és E régiókban lévő gének irányítására használunk. Ezek a promoterek transzkripcionálisan aktívak a kiválasztott sejtvonalban, és megegyezhetnek vagy eltérhetnek a kérdéses belső gén irányítására használt F régióban lévő promotertől. A transzkripciónak az
1. ábrán bemutatott speciális irányítása nem lényeges. A szakterületen jártasak meghatározhatják a C, D és E gének és azok C’, D’ és E’ megfelelő promoterének elhelyezkedését úgy, hogy a promoterek stimulálják a velük asszociált gének expresszióját anélkül, hogy ezzel párhuzamosan valamilyen módon megzavarnák a kérdéses gén vagy a konstrukció bármely egyéb génjének kifejeződését.
A találmány illusztrálható a patkány GHrben lévő tirotropin béta-alegységének (TSHB) (ATCC CCL 82) GH,, GH3 (ATCC CCL 82.1) vagy GH4C1 sejtvonalban (GH) történő aktiválásával. A GH sejtvonalak Takemoto, Cancer Rés., 22: 917, 1962 által leírt módon egy patkányban radioaktív sugárzással indukált agyalapimirigytumorból (MtT/W5) származnak, és Tashjian és munkatársai, Endocrinology, 82: 342-352, 1968, adaptálták sejttenyészetben történő növesztéshez. A sejtek szubklónozhatók és átvizsgálhatok növekedésihormon és TSHBtermelő képességre. Egy ilyen előnyös átvizsgálást mód lehet a Northern biot analízis, annak meghatározására, hogy megtalálható-e bennük a patkány növekedésihormon-génjének mRNS-e, és annak megállapítására, hogy nem termelődik a TSHB génről mRNS. A sejtvonalak átvizsgálhatok Southern analízissel is, annak meghatározására, hogy a TSHB génnek legalább egy példánya jelen van a genomban. Csak azokat a GH sejtvonalakat használjuk fel, amelyek termelnek növekedési hormont, és nem képződik bennük TSHB, de tartalmazzák a TSHB gén egy kópiáját.
A GH sejtekben használható specifikus homológ rekombinációs vektort a következő módon tervezzük (3. ábra). Az A régió állhat a Hindin ffagmenttel meghatározott TSHB gén 5’-végi, nem transzlálódó régiójából, amely -74-től -2785 bázispárig teljed, és a B régió tartalmazhatja a DNS-fragmentet, amely a -2785 pozícióban található Hindin helytől a körülbelül 2,1 kbnyire távolabb, upstream lévő Ncol helyig nyúlik, amint aztCarrés munkatársai, J. Bioi. Chem., 262: 981-987, 1987 és Croyle és munkatársai, DNA, 5: 299-304, 1986 leírják. A pozitív szelektálógén (C régió) lehet a pSV2neo plazmidból (ATCC No. 37, 149) származó 1067 bp-nyi 5g/II-57«aI ffagment, melyről Southern és munkatársai, J. Mól. Appl. Gén., 1:327-341, 1982 számoltak be. A neo gént irányíthatja a Rous-szarkómavírus (RSV) promotere (C régió), amely a Gorman és munkatársai, PNAS, 79: 6777-6781, 1982 által leírt pRSVcat plazmid (ATCC No. 37, 152) Ndel-Hindlll fragmentjéből származik. Ebben a példában nincs szükség amplifikálómarker használatára, és így nincs szük8 ség a D régióra sem a homológ rekombináció hatékonyságának optimalizálása érdekében. A hatékonyság, Letsou és munkatársai, Genetics, 117: 759-770, 1987, szerint fordítottan arányos a konstrukcióban jelen levő homológ és nem homológ szekvenciák arányával. Az E régió vagy a negatív szelektálógén állhat a HSVtk génből, amely a Capecchi és munkatársai, Natúré, 336: 348-352, 1988 által leírt pMCITK plazmidból származó, 2 kb méretű Xhol fragmentumból származik. Abban a konstrukcióban a HSVtk gént a poliómavírus promotere és enhancere (E régió) irányíthatja, amint azt Thomas és munkatársai, Cell, 51: 503-512, 1987, konstrukciójukban összeállították. Egy második DNS-konstrukcióban a poliómapromotert a fentebb leírt RSV promoter helyettesítheti. A TSHB gént aktiválására használt DNS-szabályozó szekvencia lehet akár az RSV promoter, akár a patkány-növekedésihormongén promotere. A patkány-növekedésihormongén promotere a Larson és munkatársai, PNAS, 83: 8283-8287, 1986, által leírt pRGH237CAT plazmidból származó SacI-EcoRI fragmentből áll. Az RSV promoter előnyösebben használható fel a GH sejteken kívüli más egyéb sejtvonalban is, míg a GH promoterről Brent és munkatársai, J. Bioi. Chem., 264: 178-182, 1989 közleményéből tudjuk, hogy aktívak GH sejtekben és specifikusan indukálhatok. A patkányhormon-promoter és az RSV promoter elkülönített konstrukciókban az F helyzetbe építhető be.
A fenti konstrukció GH sejtekbe történő bejuttatását követően a sejtek növekedhetnek G418-at tartalmazó táptalajban. Ez teszi lehetővé, hogy csak azok nőjenek föl, amelyek akár homológ, akár random rekombinációval, a genomjukba integrálódott plazmiddal rendelkeznek. A túlélő sejtek növekedhetnek ganciklovirt tartalmazó táptalajban. A szelekciónak ezt a lépését túlélő sejtek többségében a vektor plazmid DNS-e homológ rekombinációval integrálódott. Ezeket a sejteket átvizsgálhatjuk, annak bemutatására, hogy a TSHB génnek megfelelő mRNS-t termelik, és előállítják a TSHB fehérjét. A heterológ promoter beépülése körüli genomi DNS-szekvenciája is meghatározható, hogy biztosak legyünk abban, hogy a helyes rekombinációs esemény zajlott le.
Példa - A TSHfi gén aktiválása patkány-hipofizissejtekben
A következő protokoll felhasználásával aktiváltuk a tirotropin béta-alegységét kódoló (TSHB) gén transzkripcióját, amely normál körülmények között nem történik meg patkány GH3 sejtvonalban. Az aktiválást a homológ rekombinációs folyamat felhasználásával végeztük megcélozva egy, a TSHB kódolórégiótól upstream elhelyezkedő aktiválóelemet. Mivel a Rous-szarkómavírus (RSV) promoterről Christian Nelson és munkatársai, Natúré, 322: 557-562 (1986), valamint Zhend-Sheng Ye és munkatársai, The Journal of Biological Chemistry, 263: 7821-7829 (1988) kimutatták, hogy hatékonyan működik GH3 sejtekben, ezért ezt választottuk aktiválóelemként. Készítettünk egy plazmidvektort, amely tartalmazta az RSV aktiváló elemet, a TSHB génlókusz 5’-végi régióját és egy szelektáló antibiotikummarkért, az aminoglükozid-foszfotranszferáz-gént (NEO) a fertőzött sejtpopulációk szelektálására. Az összegyűjtött antibiotikumrezisztens GH3 sejtpopulációkból kivontuk a ribonukleinsavat (RNS), és átalakítottuk komplementer dezoxi-ribonukleinsavvá (cDNS). A cDNS-t ezután polimeráz-láncreakció (PCR) segítségével átvizsgáltuk TSHB cDNS jelenlétére. A homológ rekombinációs és a kontrollvektorok készítését az alábbiakban ismertetjük a kísérleti eljárásokkal és az eredményekkel együtt.
Plazm idkészítés
Homológ rekombinációs (HR) gerincvektor (pRSVCATNEO)
A Rous-szarkómavírus promoter a Cornelia M. Gorman és munkatársai, Proceedings of National Academy of Science, 79: 6777-6781 (1982) által leírt pRSVCAT plazmidból (5. ábra) származott, a funkcionális promoter egységet tartalmazó, 580 bázispámyi (bp) Ndel-Hindlll fragment izolálásával. A ffagment végeit a DNS-polimeráz I Klenow fragmentjével feltöltve tettük tompává, és a tompa végekhez A7»al linkért ligáltunk. Xbal restrikciós endonukleázzal végzett emésztés és gélen történt tisztítás után a keletkező ffagmentet a pUC18 Xbal helyére ligáltuk. A 6. ábrán bemutatott orientációban lévő RSV inszertet tartalmazó plazmidot hordozó telepet pRSV-nek neveztük. Az aminoglükozid-foszfotranszferáz-gént (NEO) a P. J. Southern és munkatársai, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1: 327-341 (1982) leírt pSV2NEO plazmidból klónoztuk, a őgll és EawHI fragment (7. ábra) izolálásával és a pRSV (6. ábra) plazmid őczmHI helyére történő ligálásával. A NEO gént a 8. ábrán bemutatott orientációban tartalmazó plazmidot felszedtük, és elneveztük pRSVNEOBAM-nak. A pRSVNEOBAM-ot S'/wal-gyel emésztettük és az RSV promoterrégiót, a NEO gén nagyobbik részét és a pUC18-at tartalmazó, 4328 bp méretű fragmentet gélelektroforézissel izoláltuk. A fragment Smal végeit Xhol linkerrel láttuk el, Xhol restrikciós enzimmel hasítottuk, majd ligálással újra összekapcsoltuk kör alakúvá. A keletkező plazmidot a 9. ábrán mutatjuk be, és pRSVNEO-nak hívjuk. Az utolsó klónozási lépés 786 bp-nyi darab elvesztését eredményezte a NEO fragmentből, amely nem szükségszerű a gén funkcióképes expressziójához. Ez a konstrukció eredményezett egy olyan plazmidot, amelyben a NEO gén transzkripcióját egy RSV promoter irányítja.
A következő lépésben a pRSVCAT plazmidban az RSV promoter 5’-végén elhelyezkedő Ndel helyet alakítottuk át Sáli hellyé. Ezt követte a pRSVCAT emésztése AWel-gyel, a végek feltöltése DNS-polimeráz I Klenow ffagment segítségével, és a keletkező tompa végekhez Sáli linkerek kapcsolása. A linkereket Sallgyel emésztettük és ligálással újra körré alakítottuk. Az újonnan készített SaB helyre klónoztuk a pRSVNEO (9. ábra) plazmidból származó, RSV promotert és a NEO gént tartalmazó Saíl-Xhol ffagmentet. Izoláltuk az RSV promotert és a 10. ábrán bemutatott orientációban lévő NEO fragmentet tartalmazó plazmidot, és elneveztük pRSVCATNEO-nak. Ez a plazmid, amikor GH3 sejtekbe juttattuk, képes volt G418-cal szemben
HU 217 212 Β rezisztenssé tenni a sejteket, demonstrálva, hogy az RSV promoter képes a NEO gén transzkripcióját irányítani, és hogy az RNS funkcióképes fehérjévé transzlálódik (be nem mutatott adatok). A stabilan átalakított össz-RNS-t polimeráz-láncreakcióval (PCR) elemeztük annak meghatározására, hogy vajon a CAT gén átíródott-e. A PCR-eredmények azt mutatták, hogy a CAT gén valóban átíródott valamennyi tesztelt, G418 rezisztens telep esetében (be nem mutatott adatok), jelezve, hogy a CAT gén 5’ RSV promotere képes volt a 3’-végen elhelyezkedő gén transzkripciójának irányítására. Ez lényeges, mert ez az RSV promoter lesz felelős a TSHB gén transzkripciójának irányításáért, amikor az alább leírt TSHB HR vektor homológ rekombináció révén integrálódik a GH3 genomba.
TSHfiHR vektor
A GH3 genomba homológ rekombinációval integrálódni képes vektort úgy készítettük el, hogy tirotropin béta-alegység- (TSHB) génjének 5’-farki régióját beépítettük a pRSVCATNEO plazmidban (10. ábra) található Sáli és Hindiii helyekre. A 15 kb vagy nagyobb inszerteket tartalmazó, lambda DASH-ba klónozott patkánylép-genomiálisklóntár a Stratagene-től, San Diego, CA származik. A Current Protocols in Molecular Biology, pp. 1.9.1-1.13.6, 6.1.1-6.4.10 című kiadványban leírt standard protokollok felhasználásával a patkány genomi TSHB génjének 15,3 kb méretű kiónját izoláltuk, amely tartalmaz az első exon 5’-végéből 9 kbnyi szekvenciát. A 15,3 kb méretű fragment két Λ7>αΙ fragmentet tartalmaz, amelyek közül az egyik egy 10,6 kb-nyi darab az 5’-végi, a másik egy 4,7 kb nagyságú rész pedig a 15,3 kb méretű fragment 3’-régiójának felel meg (11. ábra). Mindkét Xbai fragmentet tovább klónoztuk pUC18-ba, és izoláltuk az inszerteket mindkét orientációban tartalmazó plazmidokat. A 4,7 kb Xbai fragmentben lévő 2,3 kb méretű Xbai-Hindiii fragmentet (11. ábra) izoláltuk és az Xbai helyét átalakítottuk Hindiii hellyé, a végek Klenow fragmenttel történő feltöltésével és a Hindiii linkerek odaligálásával. Ezt a fragmentet ligáltuk a pRSVCATNEO-ban található egyszeri Hindiii helyre. Egy izolátumot, amely megfelelt a 2,3 kb-nyi inszertet a megfelelő orientációban tartalmazó plazmidnak, amint azt a 12. ábrán bemutatjuk, pRSVCATNEOTSHB3-nak neveztünk el.
A patkány TSHB klónból származó, továbbklónozott, 10,6 kb méretű Xbai fragmentet izoláltuk, és az A7?al végeket Sáli helyekké alakítottuk át tompa végek kialakításával DNS-polimeráz I Klenow fragment segítségével és Sáli linkerek hozzákapcsolásával. Ezután ezt a 10,6 kb méretű Sáli fragmentet klónoztuk a pRSVCATNEOTSHB3 Sáli helyére (12. ábra). Az inszertet a megfelelő orientációban tartalmazó plazmidot azonosítottuk, és elneveztük pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI-nek (13. ábra). Ezt az utóbbi plazmidot letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, Rockwille, MD, és megkapta az ATCC 40933-as raktári számot. A letétbe helyezés végett a plazmidot újra neveztük pHRTSH-nak. A letétbe helyezés minden tekintetben kielégíti a Budapesti Egyezmény kívánalmait.
Sejtvonal
A GH3 sejtek az MtT/W5-ből származó szubklónozott populáció, amely MtT/W5 eredetileg Β. K. Takemoto, Cancer Research, 22: 917 (1962) szerint patkányban sugárzással indukált agyalapimirigy-tumorból származik, és Tashjian és munkatársai, Endocrinology, 82: 342-352 (1968) adaptálták sejttenyészetben történő növesztésre. A GH3 sejtek az American Type Culture Collection sejtbankjából származtak, és Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM)+15% lószérum (HS) + 2,5% magzati bovinszérum (FBS)+1% L-glutamin (GH3 médium), 37 °C-on, 5% CO2-ban növesztve tartottuk fenn.
DNS-preparálás
Nagy mennyiségű plazmid DNS-preparálás
A stabil transzformációkra használt valamennyi plazmidot a Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, pp. 1.7.1-1.7.2. kézikönyvben leírt, nagy mennyiségű plazmid tisztítására használt alkálikuslízismódszerrel tisztítottuk. Az alkálikus lízis módszerével izolált DNS-t két sávként tovább tisztítottuk céziumklorid-gradiensen a Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, pp. 1.7.5-1.7.7. kézikönyvben szintén leírt módon.
A fertőzés előtt a HR vektorokat JníII-vel vagy Apaigyei emésztettük. Az Apal-et a pRSVCATNEO kontrollplazmid linearizálására használtuk, az /fa/II-vel a pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI HR plazmidot hasítottuk lineáris molekulává. Az Apai és az Aatll hasítási helyek elhelyezkedése a 10. és 13. ábrákon látható. A megfelelő restrikciós enzimmel végzett emésztés után a reakciót fenol/kloroformmal, majd kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk, és egyszer megmostuk 70%-os alkohollal. A plazmidokat újra szuszpendáltuk steril, deionizált vízben (dH2O) úgy, hogy a végén a koncentrációja 1 mikrogramm/mikroliter legyen, melyet OD260-on határoztunk meg. A fertőzés hatékonyságának és/vagy a homológ rekombinációval kapott pozitívoknak a random integrálódottakhoz viszonyított arányának növelését célzó egyik kísérletben a pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI plazmidot Apai-gyei emésztettük. Az Apai emésztés három különböző helyet vág a pRSVCATNEOTSHB35XbaI plazmidon, és eltávolítja a vektor valamennyi régióját a homológ rekombinációhoz szükséges részek kivételével (13. ábra). Az Apai-gyei végzett emésztés után 0,8%-os agarózgél-elektroforézissel elválasztottuk a sávokat, és a 10,992 bp-nak megfelelő fragmentet egy dialízishártyába eluáltuk elektromos erőtérben. Ez a fragment tartalmazta a TSHB gén 5’-farki régióit, az RSV promotert, a NEO régiót és a TSHB gént aktiváló RSV promotert. Az elektroeluált DNS-fragmentet Schleicher and Schuell típusú elutip minioszloppal tovább tisztítottuk a használati utasításban ajánlott módszer szerint. A DNS-t eluáltuk az oszlopról, etanollal kicsaptuk, 70%os etanollal megmostuk és újra szuszpendáltuk 1 pg/μΐ koncentrációban.
Stabil transzfekciók
Kalcium-j'oszfátos transzfekció órával a fertőzés előtt 3χ 106 GH3 sejtet kikentünk 10 cm átmérőjű lemezre. Minden egyes lemez ese10
HU 217 212 Β tében 10 pg vektor DNS-t adtunk 30 pg szonikált heringsperma-DNS-sel együtt 0,5 ml transzfekciós pufferhez. A transzfekciós puffért 4 g NaCl, 0,185 g KC1, 0,05 g Na2HPO4, 0,5 g dextróz, 2,5 g HEPES és dH2Oból készítettük 500 ml végtérfogatban a pH=7,5 beállításával. 31 μΐ 2 mólos CaCl2-oldatot adtunk a 0,5 ml DNS+transzfekciós puffer keverékéhez, majd vortexeltük. Ezt az oldatot szobahőmérsékleten hagytuk állni 45 percig. Amikor a DNS-CaCl2 transzfekciós puffer kész volt, eltávolitottuk a GH3 sejtekről a puffért, és rájuk rétegeztük a DNS-CaCl2 transzfekciós puffért. A sejteket állni hagytuk szobahőmérsékleten 20 percig. A 20 perc után 5 ml GH3 táptalajt adtunk és a lemezeket 37 °C-on indukáltuk 6 órán keresztül. Ezután a sejteket a táptalaj átlevegőztetésével és 5 ml, 15% glicerint tartalmazó, friss transzfekciós puffer hozzáadásával 3,5 percig sokkoltuk. A sejteket kétszer öblítettük PBSsel, és 10 ml GH3 táptalajjal megetettük. 48 órával a fertőzés után a táptalajt eltávolitottuk, és hozzáadtunk 10 ml, 400 pg/ml G418-tartalmú GH3 táptalajt.
Elektroporálás
Az elektroporálást egy BTX 300-as Transfektor alkalmazásával hajtottuk végre 3,5 mm-es zsebelektródokkal. A logaritmikus fázisban növekvő 107 GH3 sejteket tripszinezéssel eltávolitottuk a lemezeikről, centrifugálással kiülepítettük, és egyszer megmostuk PBSsel. A sejteket újra szuszpendáltuk 1 ml PBS-ben, és jégen áttettük 2,9 ml-es eldobható UV küvettába (American Scientific Products). 10 pg DNS-t adtunk a sejtekhez, összekevertük, és 5 percre visszatettük jégre. 5 perc után az elektródokat beletettük a kamrába, és elektroporáltuk 750 μFarad és 200 V-os erőtérben. Küvettát ezután visszatettük a jégre 10 percig. A sejteket a küvettákból átraktuk 9 ml, 1% penicillin- és 1% streptomycintartalmú GH3 táptalajba egy 15 ml-es, szűkülő aljú csőbe, és állni hagytuk 10 percig. Az 1 χ 107 elektroporált sejt teljes mennyiségét átvittük 3 db 10 cm átmérőjű lemezre, ami körülbelül 3χ 106 sejt/lemezt eredményezett. 48 óra után hozzáadtunk 400 μg/ml G418 tartalmú GH3 táptalajt.
A GH3 sejtek fertőzése pRSVCATNEOTSHB3SXbal (AatlI-vel hasítva), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Apai-gyei hasítva) és pRSVCA TNEO (Apai-gyei hasítva) plazmidokkal pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ΛαίΠ-vel hasítva), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ΛραΙ-gyel hasítva) és pRSVCATNEO (ΛραΙ-gyel hasítva) plazmidokat bejuttattuk GH3 sejtekbe egy DNS nélküli kontrollal együtt a kalcium-foszfátos módszerrel és elektroporálással is. A bejuttatás után 48 órával G418-szelekciónak vetettük alá a sejteket. Körülbelül 14-21 nappal később a telepek szemmel is láthatóvá váltak a 10 cm átmérőjű lemezen, és megszámoltuk őket. Egyik DNS nélküli kontroliban sem volt látható telep jelezve, hogy a G418-szelekció működik, és az RSV-NEO régiót tartalmazó plazmid jelenlétére szükség volt a G418 rezisztencia biztosítására. Ennél a fázisnál a telepeket fölszedtük, és a 10 cm-es lemezen 17 mm átmérőjű klónozógyűrűvel régiókat gyűjtöttünk. Ezek a nagy klónozógyűrűk 10 és 70 közötti telepeket tartalmaztak az egy lemezen lévő telepek sűrűségének függvényében, és lehetővé tették az izolált régióban levő GH3 sejtek eltávolítását és összegyűjtését ugyanabban az időben tripszinezéssel. A tripszinezett telepeket minden egyes gyűrűből 6 mérőhelyes lemezekre raktuk át, és hagytuk nőni G418-at tartalmazó GH3 táptalajban. Miután elértük a 70-80%-os tömegsűrűséget, 80 000 sejtet áttettünk egy 24 mérőhelyes lemezre, és a maradék sejteket fagyasztással tartósítottuk egy későbbi időpontban történő további vizsgálat céljából. A 24 mérőhelyes lemezen lévő sejteket addig növesztettük, amíg elérték az 50-60%-os tömegsűrűséget. Ezekből a GH3 sejtekből az alábbi módszerrel össz-RNS-t gyűjtöttünk.
RNS-izolálás a 24 mérőhelyes lemezeken növesztett, transzfektált GH3 sejtekből
Az alábbiakban leírt eljárás a Chomczynski és Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987) által leírt módszer módosítása. A 24 mérőhelyes lemezen a GH3 sejteket fedő táptalajt eltávolitottuk, és a sejteket 1 ml PBS-sel mostuk. Hozzáadtunk 1 ml GTC oldatot, és a sejteket szobahőmérsékleten inkubáltuk 5 percig. A GTC oldatot 250 g guanídium-tiocianát (Fluka) 293 ml dH2Oban történő feloldásával, majd 17,6 ml 0,75M Na-citrát, pH=7,0 és 26,4 ml 10%-os szarkozil (L-lauril-szarkozin) hozzáadásával készítettük. Közvetlenül a felhasználás előtt adtunk 50 ml GTC oldathoz 360 μΐ B-merkapto-etanolt. Állni hagytuk szobahőmérsékleten 5 percig, majd 1 ml GTC-sejt lizátumot átpipettáztunk egy 2 ml GTC oldatot tartalmazó Sarstedt 55,518 zárható csőbe. Minden csőhöz hozzáadtunk 300 μΐ 2 M-os nátrium-acetátot (pH=4,0), és vortexeltük. A következő lépésben 3 ml dH2O-val telített fenolt adtunk hozzá, és a csöveket ismét vortexeltük. Minden csőhöz adtunk 600 μΐ kloroform: izoamil-alkohol (49:1) elegyet, a csöveket kézzel ráztuk 10 másodpercig, majd jégre tettük 15 percre. A csöveket ezután lecentrifugáltuk Sorval RC-5B centrifugán SM24 rotorban 8000 fordulat/perc sebességgel 20 percig 4 °C-on. A vizes fázist átvittük egy 3 ml izopropanolt tartalmazó, új Sarstedt csőbe, és -20 °C-ra tettük egy órára. Az egy óra elteltével a csöveket lefugáltuk egy Sorval RC—5B centrifugán SM24 rotorban 8000 fordulat/perc sebességgel 20 percig 4 °C-on. A felülúszót eltávolitottuk, és a csapadékot felszuszpendáltuk 500 μΐ GTC oldatban. Az újraoldott RNS-t egy 1,5 ml Eppendorf csőbe pipettáztuk át, amelyhez 500 μΐ izopropanolt adtunk. A csöveket még egyszer visszatettük -20 °C-ra egy órára. Az Eppendorf csöveket 5 percig lecentrifúgáltuk mikrocentrifugán, és a felülúszót elöntöttük. A csapadékot kétszer mostuk 70%-os alkohollal, és száradni hagytuk, amíg az etanol teljesen el nem párolog. A csapadékot újra szuszpendáltuk 20 μΐ, dietil- pirokarbonáttal (DEPC) kezelt vízben, és felmelegítettük 65 °C-ra 5 percig. Ezt az RNS-t használtuk cDNS-készítésre az alább leírt két folyamat egyikében.
cDNS-reakciók
I. Módszer
Az első szál cDNS-t 2,5-6,0 mikroliter össz-RNSből (ez körülbelül 0,5-6 mikrogramm mennyiséget jelentett) szintetizáltuk. Az össz-RNS-t a fentebb leírt extrakciós módszerrel nyertük, 5-10 percig denaturál11 tűk 70 °C-on, majd a reakciókomponensek hozzáadása előtt jégen lehűtöttük. Az alábbi reakciókörülményeket alkalmaztuk: 50 mM Tris.HCl (pH = 8,3), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM minden egyes nukleotid (dCTP, dATP, dGTP és dTTP a Pharmaciától) koncentrációja, 40 mM KC1, 500 egység/ml RNasin (Promega Biotech), 85 pg/ml oligo(dT)|2_18 (Collaborativ Research Inc.), és 15 000-20 000 egység/ml Moloney murin leukémiavírus reverz transzkriptáza (Bethesda Research Laboratories), inkubálás 37 °C-on 60 percig. A reakciót 40 mM EDTA-koncentráció beállításával állítottuk le, a nukleinsavat nátrium-acetát (0,3 M) és két térfogat etanol hozzáadásával kicsaptuk. A csapadékképződést 0 °C-on, 30 percig hagytuk lejátszódni, majd a mikrocentrifugán kiülepítettük 14000 fordulat/perc sebességgel 30 percig. A csapadékot 70%-os alkohollal mostuk, megszárítottuk, és 15-25 mikroliter DEPC-cel kezelt vízben újra feloldottuk.
2. Módszer
Az első cDNS-szál szintézisének körülményeit Carol A. Brenner és munkatársai BioTechnics, Vol. 7, No. 10, pp. 1096-1103 (1989) közleményéből adaptáltuk. A fentebb leírt módon készített RNS-ből 1 μΐ ossz RNS-t adtunk 9 μΐ reakciópufferhez egy 0,5 ml-es Eppendorf csőben. A reakciópuffer tartalmazott 200 egység Moloney murin leukémiavírus reverz transzkriptázt (MMLVRT, Bethesda Research Laboratories) és az alábbi reagenseket: 70 mM Tris.HCl pH=8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 1 mM minden egyes dNTP-ből, 4 mM MgCl2 és 0,45 OD260 egység random hexamert (Pharmacia). Keverés után a csöveket szobahőmérsékleten inkubáltuk 10 percig, és ezután 42 °C-ra tettük egy órára. Egy óra elteltével a csöveket 90 °C-ra melegítettük 1 percre az MMLVRT inaktiválása végett, majd lehűtöttük szobahőmérsékletre.
GH3 sejtekből származó RNS amplifikálása polimeráz-láncreakcióval (PCR)
A TSHB gént homológ rekombinációval aktiváló HR plazmidok eredményeképpen a GH3 sejtekben termelt RNS-ből szintetizált TSHB cDNS amplifikálására a következő primereket használtuk.
Primer 5’ 3’
TSHB5 AGTATATGATGTACGTGGACAGG
TSHB3 CACTTGCCACACTTGCAGCTCAGG
A 14. ábra mutatja a TSHB gén primereknek megfelelő régióit.
A PCR-reakció körülményei
Valamennyi PCR-reakciót az Ericomp Twinblock típusú hőciklusos inkubátorban hajtottuk végre. Ha a PCR-amplifikációt a 2. módszerrel készített cDNS-en végeztük 40 μΐ további reakciókeveréket adtunk közvetlenül a 10 μΐ cDNS-reakcióhoz 50 μΐ-re kiegészítve. Az 50 μΐ végtérfogatban a reagensek végső koncentrációi 70 mM Tris.HCl pH=8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 2,25 egység Taq polimeráz (Pharmacia), 0,2 μΜ primer, 200 μΜ dNTP és 0,8 mM MgCl2 voltak.
Amennyiben a PCR-t az 1. módszerrel készült cDNS-en végeztük 5-10 μΐ újra oldott cDNS-t adtunk 40-45 μΐ, a következő összetevőket tartalmazó pufferhez: 70 mM Tris.HCl pH = 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton X-100, 2,25 egység Taq polimeráz (Pharmacia), 0,2 μΜ primer, 200 μΜ dNTP és 0,8 mM MgCl2.
A reakciókat a következő PCR-ciklusoknak vetettük alá:
perc 94 °C-on, másodperc 55 °C-on, perc 72 °C-on.
Ezeket a ciklusokat 30-40-szer megismételtük. Minden reakciókeverékből 10 μΐ-t megfuttattunk 6%os poliakrilamid gélen, és megvizsgáltuk, hogy jelen van-e benne egy 247 bp-nyi PCR-fragment, amely jelzi a helyesen érett TSHB mRNS jelenlétét.
A GH3 sejtekből és patkány-agyalapimirigysejtek össz-RNS-éből származó TSHfi RNS amplifikálásának PCR-eredményei
Annak meghatározására, hogy a GH3 sejtek normál körülmények között szintetizálnak-e TSHB RNS-t, fertőzetlen GH3 sejtekből és patkány-agyalapimirigysejtekből készült cDNS-t vetettünk alá a fenti PCR-körülményeknek. A megfelelő, 247 bp méretű íragmentet láttuk a patkány-agyalapimirigyből származó pozitív kontrollmintában, míg a GH3 sejtek ossz RNS-éből nem kaptunk látható csíkot még 60 ciklus után sem (be nem mutatott adat).
Fertőzési eredmények
A 10 cm-es lemezeken megjelenő G418-cal szemben rezísztens telepek számát táblázatba foglaltuk az antibiotikumnak a táptalajhoz történő hozzáadását követő 14. és 21. nap között.
Fertőzési módszer Telepek száma a 10 cm-es lemezen
pRSVCATNEO pRSVCATNEOTSHB3- 5XbaI
Apai vágás AatlI vágás
Kalciumfoszfátos 1 48 13 29
Kalciumfoszfátos 2 - 21 58
Elektroporálás 1 - 1295 415
Elektroporálás 2 - 1051 723
A 24 mérőhelyes lemezen lévő telepekből össz-RNSt izoláltunk a fentebb leírt módon. Belőlük cDNS-t készítettünk, és PCR-amplifikálásnak vetettük alá. A TSHB mRNS-t termelő telepek számát a poliakrilamid gélen látható, 247 bp-nyi fragmentekkel határoztuk meg. Minden egyes átvizsgált mérőhely 11 és 70 közötti telepből állt. A fertőzésenként! és lemezenkénti telepek becsült számát használtuk a G418 rezísztens GH3 sejtklónok számának becslésére, amelyekben a TSHB gént aktiváltuk. Amennyiben egy lemez pozitívnak bizonyult, feltételeztük, hogy ez egy pozitív telepet jelentett abban a lemezben.
HU 217 212 Β
Plazmid G418 rezisztens telepek TSHB RNS pozitív
pRSVCATNEO 60 0
pRSVCATNEOTSHB3- 5XbaI (Λΰ/Π-vel emésztve) 4942 3
pRSVCATNEOTSHB3- 5XbaI (Jpal-gyel emésztve) 8580 6
Ezek az eredmények mutatják, hogy a normál körülmények között át nem íródó TSHB gént sikeresen aktiváltuk a találmány módszerével. Mialatt a TSHB transzkripciójára pozitív telepek száma kicsi a G418 rezisztens telepek számához képest (megközelítőleg minden 103 G418 rezisztens telep közül egy) ez az eredmény általában megfelel az egyéb homológ rekombinációs kísérletekben leírt aránynak. Ilyen adatokról számolt be Michael Krieger, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual, Stockton Press, New York NY (1990) pp. 56-60 kézikönyvben. Széles körben megfigyelték, például M. Frohman és G. Martin, Cell, 56: 145 (1989) és S. L. Mansour és munkatársai, Natúré, 336: 348 (1988), hogy a homológ rekombináció rátája arányos a célzott gén transzkripciós rátájával. Meg kell jegyezni, hogy a bemutatott ráta három nagyságrenddel nagyobb, mint ami TSHB génre vonatkozó random mutációnál várható.
Annak biztosítására, hogy a kapott adatok reprodukálhatók és az RNS-transzkripció aktiválása stabil, az előzetesen lefagyasztott telepgyűjtemény közül a pozitívnak bizonyultakat felolvasztottuk és táptalajban felnövesztettük. A frissen felolvasztott pozitív GH3 sejteket T25 szövettenyésztő lombikokba inokuláltuk, és növesztettük a telítési érték 70-80%-ának eléréséig. Minden egyes lombikból 80 000 ezer sejtet lemezeltünk ki 24 helyes lemezekre, és a telítés 50-70%-áig növesztettük őket. A sejtekből RNS-t izoláltunk, cDNS-sé írattuk át, és még egyszer átvizsgáltuk TSHB RNS jelenlétére. Valamennyi PCR-reakcióból 10 μΐ-t futtattunk meg 6%-os poliakrilamid gélen. A 15. ábra mutatja a második átvizsgálás reprezentatív PCR-reakcióinak eredményeit poliakrilamid gélen etídium-bromid-fluoreszcenciával láthatóvá téve. Az 1., 2. és a 3. sávok tartalmazzák a pRSVCATNEO plazmiddal fertőzött GH3 sejtekből származó cDNS-sel végzett PCR-reakciókat. A pRSVCATNEO nem tartalmaz TSHB-vel homológ régiót, így nem képes homológ rekombináció révén a TSHB gént aktiválni. Amint az a 15. ábrán lévő gélen látható, nincs 247 bp-nak megfelelő csík, amely jelzi, hogy a TSHB gén nincs aktiválva. A 6. sáv szintén egy negatív kontrollt tartalmaz. Ebben a sávban három különböző GH3 sejtpopulációt kevertünk össze, amelyeket pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Ápol hasítás) plazmiddal fertőztünk, de az első átvizsgáláskor negatívnak bizonyultak, mert nem találtunk bennük TSHB géntranszkriptumot. A 247 bp-nyi fragment hiánya a 6. sávban mutatja, hogy a bejuttatott és random módon integrálódott pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI plazmid nem képes a 247 bp-nyi TSHB PCR-fragment termeltetésére. A 7., 8., 9. és 10. sávok tartalmazzák azokat a PCR-reakciókat, amelyeket a patkány agyalapi mirigyének sejtjeiből gyűjtött RNS-ekből készült cDNSekkel végeztünk. A kiindulási mennyiségek 25 ng, 100 ng, 200 ng és 400 ng voltak. A várt 247 bp-nyi fragment jelenléte, amely a TSHB-t normál körülmények között expresszáló patkányszövetből készített cDNS-ből származott, mutatta, hogy a PCR-körülményeket helyesen optimalizáltuk, és hogy a 4. és 5. sávban látható homológ rekombinációs TSHB csík a helyes méretet adja. A pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Apaigyei hasítva) plazmiddal transzformált sejtek, amelyek pozitívaknak bizonyultak az első átvizsgálás során (a 4. sávban lévő Apai-107 és az 5. sávban lévő Apai-136) a megismételt tesztelés során is pozitív TSHB-aktiválást mutattak, amint azt a helyes méretű TSHB PCR-csík jelenléte mutatja, amelyet ugyanazon sejtek össz-DNSéből készült cDNS-ből amplifikáltunk, bizonyítva, hogy a TSHB gén transzkripciója stabilan aktiválódott. Az előzetesen pozitívaknak bizonyult Λ/μΙ-107 és ApaI-136 sejtekből származó RNS-t tartalmazó 4. és 5. sávokban lévő 247 bp-nyi fragment jelenléte és a csíkok hiánya a negatív kontrollokban [a pRSVCATNEO plazmiddal transzformált GH3 sejtek az 1-3. sávokban és a 6. sávban lévő pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (4pal-gyel hasított) negatív kontrollok] mutatta, hogy a TSHB RNS termelődése, azokban a sejtvonalakban, amelyek normál körülmények között nem termelik ezt az RNS-t, a homológ rekombináció révén stabilan végbemegy.
A találmány nem korlátozódik kizárólag az itt leírt sejtvonalra. Valamennyi sejt tartalmaz normál körülmények között csendes vagy inért genetikai információt. A legtöbb csak bizonyos gének expresszálására képes. Bármelyik ilyen sejtvonal normál körülmények között csendes, vagy inért gén termékének expressziója aktiválható a találmánynak megfelelő módon, és a genom bármely génjének expressziós jellemzői módosíthatók a találmány eljárásával. Még előzetesen transzformáit sejtvonalak is felhasználhatók, amennyiben az előzetes transzformálás nem zavarta a kérdéses gént. A sejtvonal forrása nem lényeges. A sejtvonal lehet állati, növényi, elsődleges, folyamatos vagy fenntartható. Természetesen az a kívánatos, hogy egy ilyen sejtvonal stabil és fenntartható legyen, így a találmánynak megfelelő technikával végzett kezelés után az expresszió kereskedelmi forgalomban hasznosítható. Klónozott mikroorganizmusok, akár prokarióták, akár eukarióták, szintén kezelhetők a találmány szerinti technikával.
Mialatt a találmányt elsősorban a normál körülmények között transzkripicionálisan csendes vagy inért gének expressziójára vonatkozólag írtuk le, a találmány technikája alkalmazható a természetes körülmények között a gazdasejtvonalban kifejeződő gén expressziós jellemzőinek módosítására. Például, amennyiben az a kívánalom, hogy egy gén expressziójának megjelenése a tenyésztés körülményeitől vagy ehhez hasonló paraméterektől függjön oly módon, hogy az expresszió akaratlagosan be- és kikapcsolható legyen, egy megfelelő szabályozó DNS-darab, mint például egy szabályozó promoter építhető be, amely biztosítja ezen a jellemzőket, mint például a represszálhatóság és az indukálhatóság. Például, ha ismert, hogy a sejt sejtmagi szteroid receptorokat tartalmaz, mint az ösztrogén-, tesztoszteron- vagy glükokortikoid- vagy tiroxinreceptorok, a szteroid- vagy tiroxin-receptorok fölhasználhatók F régióként. Ilyen elem lehet bármilyen DNS, amely megköt egy receptort, és így pozitív hatással van a transzkripcióra. Még olyan sejt esetében is, amely természetes állapotában nem reagál a glülokortikoidokra, például egy glükokortikoid-receptort kódoló DNS-darab adható a konstrukcióhoz, vagy más módon beilleszthető valahová a genomba, és ily módon érzékennyé teszi a sejtet a glükokortikoidokra. Egy szabályozópromoter használata kívánatos lehet, amennyiben a kérdéses gén normál körülmények között transzkripcionálisan vagy csendes, vagy nem. A találmány módszere szerint egyéb szabályozási módokhoz is hozzájuthatunk a megfelelő szabályozó DNS-darabnak a kérdéses pozícióba történő beépítésével.
így, bár a találmányt leginkább a normál körülmények között transzkripcionálisan csendes gének expressziójának befolyásolására alkalmazzuk, szélesebb értelemben alkalmazható bármely gazdasejtvonalban lévő belső gén expressziós jellemzőinek módosítására.
A homológ rekombináció speciális technikája nem képezi a találmány újdonságrészét. Ilyen technikák már ismertek és azok, akik járatosak a szakterületen, meg fogják érteni, hogy bármilyen ehhez hasonló technika használható, amely lehetővé teszi a szabályozó DNSszekvencia bejuttatását a kérdéses gén előre eltervezett, megfelelő helyére. Amikor az előnyben részesített technikát közzétesszük, ami a szekvencia bármelyik végén két homológ régióval ellátott, linearizált konstrukció beépítésre történő felhasználása, bármely egyéb technikát is, amely megfelel a funkciónak, például cirkuláris konstrukció fölhasználása, szintén a találmányba kívánjuk foglalni. A találmány kritikus tulajdonsága a homológ rekombináció technikájának felhasználása szabályozó DNS-szakasz beépítésére, amely az expresszió jellemzőinek módosulását okozza az alkalmazott sejtvonalban, amikor működőképesen kapcsolódik egy olyan génnel a sejtvonal genomjában, amely gén normál körülmények között leginkább csendes. Egy másik lehetőség, hogy beépítünk egy szabályozószekvencia nélküli amplifikálható DNS-darabot a sejtvonal genomjában, megfelelően közel egy génhez, amely már átíródik, ily módon ez a gén felszaporodik az amplifikálható szekvencia felszaporítása során. Nem elengedhetetlenül szükséges, hogy szelektálómarkert is tartalmazzon a szekvencia. A szelekció a DNS-konstrukció bejuttatását követően alapulhat egyedül a kérdéses gén termékének kimutatásán, vagy a táptalajban, illetve a sejtekben megjelenő mRNS-ek detektálásán. Továbbá egy olyan megvalósítás során, amikor egy szabályozóelemet építünk be, az amplifikálás nem feltétlenül szükséges a működőképességhez. Ugyanez igaz a negatív szelektálómarker-génre is, amely megkönnyíti az átvizsgálási folyamatot, de nem szükséges a találmány sikeres megvalósításához. így az alapmegvalósításhoz csak a DNSszabályozó elem vagy az amplifikálható darab beépítése szükséges a kívánt specifikus pozícióban. Pozitív és/vagy negatív szelektálhatómarker-gének fölhasználása a kiválogatás technikájában kívánatos, csakúgy, mint egy amplifikálható gén hozzáadása egy olyan megvalósítás során, amelyben egy szabályozódarabot adunk hozzá.
Az „expresszió módosítása” kifejezést úgy használjuk a leírás és a szabadalmi igénypontok során, amint azt ezennel az expresszió lezárásának kivételével definiáljuk, mint egy mutáció, deléció, stopkodon vagy más, belső gént tartalmazó nukleotidszekvencia homológ rekombinációval történő beépítését a kérdéses génbe oly módon, hogy megakadályozza a kérdéses termék expreszszióját. Schwarzenberg és munkatársai, PNAS (USA), 87: 3210-3214 (1990) bemutatják a homológ rekombináció felhasználását specifikus mutációk bejuttatására, és hogy miként lehet a sejt termékeinek expresszióját öröklődőén lezárni ily módon. A találmány nem kíván körülírni egy ilyen folyamatot. A találmány során az „expresszió módosítását” oly módon valósítjuk meg, hogy szabályozó- és/vagy amplifikálórégiókat építünk be homológ rekombinációval a kívánt specifikus helyzetben. A leginkább használt módosítás, amikor aktiváljuk és/vagy megnöveljük a kérdéses termék expresszióját.
A leírás során használjuk azt a kifejezést, hogy a DNS-szabályozó elem „működőképesen kapcsolódik” egy génnel. Ez a terminológia azt próbálja kifejezni, hogy a szabályozó DNS-darab úgy helyezkedik el egy kérdéses génhez viszonyítva, hogy egy ilyen gén transzkripcióját a szabályozó DNS-darab irányítja. A szabályozóelem leginkább a géntől upstream helyzetben van, de lehet downstream vagy a génen belül is, úgy, hogy biztosítsa valamilyen módon a gén expressziójának szabályozását. A szabályozó DNS-darab lehet promoter, terminátor, operátor, enhancer, silencer, csillapító vagy egyéb hasonló, illetve ezek kombinációja.
A találmány leírásában és a szabadalmi igénypontokban használjuk továbbá az „upstream” és „downstream” kifejezéseket, amelyek jelentik az 5’ vagy a 3’ irányultságot a kérdéses gén kódolószálához viszonyítva.
A fent említett specifikus megvalósítások teljes mértékben feltárják a találmány természetét, így mások könnyűszerrel módosíthatják és/vagy adaptálhatják azokat a különböző alkalmazások során anélkül, hogy eltérnének az általános elvtől. Az ilyen adaptálásokat és módosításokat azonosaknak tekintjük a leírt megvalósításokkal. Lényeges annak megértése, hogy az itt alkalmazott kifejezések és terminológiák a leírást szolgálják, és nem jelentenek korlátozást.

Claims (26)

1. Eljárás egy sejtvonal genomjában normál körülmények között át nem íródó gén aktiválására, azzaljellemezve, hogy egy sejtvonalat egy gén kifejeződésének induká14
HU 217 212 Β lására képes DNS-szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS-molekulával és a génben vagy annak környezetében levő genom régiójával homológ célzó DNS-szekvenciával transzformálunk, és a szabályozószekvenciát homológ rekombinációval inzertáljuk a genom régiójába, és a génhez kapcsolódó aktív szabályozószekvenciával rendelkező transzformánsokat szelektáljuk.
2. Eljárás egy sejtvonal genomjában levő gén expressziós jellemzőinek módosítására, azzal jellemezve, hogy egy sejtvonalat egy gén kifejeződésének a gén meglévő szabályozószekvenciájától eltérő módosítására képes DNS-szabályozó szekvenciát tartalmazó DNSmolekulával és a génben vagy annak környezetében levő genom régiójával homológ célzó DNS-szekvenciával transzformálunk, és a szabályozószekvenciát homológ rekombinációval inszertáljuk a genom régiójába, és a génhez kapcsolódó aktív szabályozószekvenciával rendelkező transzformánsokat szelektáljuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy sejtvonalat egy gén kifejeződésének amplifikálására képes kifejezhető, amplifikálható gént tartalmazó DNS-molekulával és a génben vagy annak környezetében levő genom régiójával homológ célzó DNS-szekvenciával transzformálunk, és a szabályozószekvenciát homológ rekombinációval inszertáljuk a genom régiójába, és a génhez kapcsolódó aktív szabályozószekvenciával rendelkező transzformánsokat szelektáljuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukció tartalmaz még legalább egy expresszáló szelektálómarker-gént, amelyet az expreszszáló amplifikálógénnel együtt építünk be.
5. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukció két célzódarabot tartalmaz, amelyek homológok a genom egy részével az adott génen belül vagy annak közelében, és egyik célzódarab az adott szabályozódarabtól upstream, a másik pedig attól downstream helyezkedik el.
6. Az 1., 2. vagy a 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukció tartalmaz még legalább egy expresszálódó szelektálómarkergént, amelyet az adott szabályozódarabon belülre építünk be.
7. Az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukció tartalmaz egy negatív szelektálómarker-gént is.
8. Az 1., 2., 5., 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukció tartalmaz expresszálható, amplifikálható gént is az adott szabályozóelemen belül.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal egy állati sejtvonal.
10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal egy emlőssejtvonal.
11. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal egy növényi sejtvonal.
12. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott géntermék expressziójának kiváltásához a beépítési lépést követően az alábbi lépéseket hajtjuk végre:
kiválogatjuk az adott sejtvonal azon kiónjait, amelyek expresszálják az adott szelektálómarker-gén termékét;
a kiválogatott kiónokat szaporítjuk az adott géntermék expresszióját lehetővé tevő körülmények között; és a gén termékét összegyűjtjük.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szelektálómarker-gén a neomicinrezisztencia-génje, és a szelekciós lépésként a neomicinrezisztenciával rendelkező telepeket kiválasztjuk.
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-konstrukciót alkalmazunk, mely egy negatív szelektálómarker-gént tartalmaz a célzószegmenthez képest olyan helyzetben, hogy amikor az adott konstrukció homológ rekombinációval helyesen épül be, akkor ez a darab nem ékelődik be, miáltal a negatív szelektálómarker nem expresszálódik azokban a sejtekben, amelyekben az adott DNS-konstrukció helyesen épült be, és így a szelekciós lépést azon kiónok kiválogatása jelenti, amelyek nem expresszálják a negatív szelektálómarker-gént.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a negatív szelektálómarker-gén a Herpesz szimplex vírus timidin-kináz-génje, és a szelekciós lépésben azon kiónokat válogatjuk, amelyek túlélik azt a táptalajt, amely megöli az adott gént expresszáló sejteket.
16. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtvonalgenomot állítunk elő, mely rendelkezik egy DNS-szabályozó darabbal, amely működőképesen kapcsolódik egy természetesen előforduló génnel egy előzetesen meghatározott DNS-szekvenciával jellemzett beépülési helyen, és a DNS-szabályozó darab a természetben nem fordul elő a genomnak ebben a helyzetében.
17. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtvonalat állítunk elő, mely képes expresszálni egy, a sejtvonal genomjában normál körülmények között csendes gén által kódolt génterméket, ahol a genomba beépülve található egy, normál körülmények között át nem íródó génhez működőképesen kapcsolt DNS-szabályozó darab, amely előidézi az adott sejtvonalban a géntermék expresszióját.
18. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtvonalat állítunk elő, mely képes megnövelni egy géntermék expreszszióját ahhoz a sejtvonalhoz képest, amelyből származik, ahol a géntermék a sejt genomjában található belső gén expressziós terméke, a genomban, génben vagy annak közelében található egy működőképesen beépült, külső DNS-szabályozó elem és/vagy amplifikálógén, amely képes a sejtvonal által előállított géntermék expresszióját fokozni.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtvonalat állítunk elő, melyben a külső DNS-szabályozó elem és/vagy amplifikálógén egy, nem a genomból származó DNS-szabályozó elem.
HU 217 212 Β
20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtvonalat állítunk elő, melyben a külső DNS-szabályozó elem és/vagy amplifikálógén egy, nem a genomból származó amplifikálógén.
21. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtvonalat állítunk elő, melyben a DNS-szabályozó elem képes kiváltani egy géntermék expresszióját, amely normál körülmények között az adott sejtvonalban vagy mikroorganizmusban kifejeződik.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtvonalat állítunk elő, melyben a beépített DNS-szabályozó darab egy DNS-konstrukció része, amely tartalmazza az adott DNS-szabályozó elemet és legalább egy szelektálómarker-gént.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtvonalat állítunk elő, melyben a DNSkonstrukció tartalmaz még egy amplifikálógént is.
24. Eljárás egy géntermék kinyerésére egy sejtvonalból, azzal jellemezve, hogy a 14-23. igénypontok szerint módosított sejtvonalat tenyésztjük olyan körülmények között, amely lehetővé teszi az adott géntermék expresszióját, és azt összegyűjtjük.
25. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan, előzetesen meghatározott gazdasejtbe történő beépítésre szolgáló DNSkonstrukciót állítunk elő, mely tartalmaz egy DNS-szabályozó darabot, amely a gazdasejtben képes módosítani a gének expressziós jellemzőit, amikor azokhoz működőképesen kapcsolódik, és egy DNS-célzódarabot, amely homológ a gazdasejtvonalban előzetesen kiválasztott gén genomi régiójával.
26. Az 1 -23. igénypontok bármelyik szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan, előzetesen meghatározott gazdasejtbe történő beépítésre szolgáló DNS-konstrukciót állítunk elő, mely tartalmaz egy expresszáló amplifikálógént, amely a gazdasejtben képes egy gén fölszaporítására, amikor ahhoz eléggé közel épül be, és egy célzó DNS-darabot, amely homológ a gazdasejtvonalban előzetesen kiválasztott gén genomi régiójával.
HU9202068A 1989-12-22 1990-12-21 Endogén gének expressziójának módosítása szabályozóelemmel HU217212B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45478389A 1989-12-22 1989-12-22

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9202068D0 HU9202068D0 (en) 1992-10-28
HUT62657A HUT62657A (en) 1993-05-28
HU217212B true HU217212B (hu) 1999-12-28

Family

ID=23806064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202068A HU217212B (hu) 1989-12-22 1990-12-21 Endogén gének expressziójának módosítása szabályozóelemmel

Country Status (26)

Country Link
EP (5) EP1484412A3 (hu)
JP (3) JP3501286B2 (hu)
KR (1) KR0176693B1 (hu)
AR (1) AR245776A1 (hu)
AT (2) ATE264916T1 (hu)
AU (1) AU645294B2 (hu)
BG (1) BG60624B1 (hu)
BR (1) BR9007937A (hu)
CA (1) CA2071989C (hu)
DE (3) DE69034135T3 (hu)
DK (2) DK0505500T3 (hu)
ES (2) ES2104690T3 (hu)
FI (1) FI107391B (hu)
GR (1) GR3025057T3 (hu)
HK (2) HK1000547A1 (hu)
HU (1) HU217212B (hu)
IL (4) IL116046A (hu)
LT (1) LT3998B (hu)
LV (1) LV10655B (hu)
NO (1) NO311896B1 (hu)
OA (1) OA09594A (hu)
RO (1) RO109864B1 (hu)
RU (1) RU2128227C1 (hu)
UA (1) UA42675C2 (hu)
WO (1) WO1991009955A1 (hu)
ZA (1) ZA9010392B (hu)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048729A (en) * 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
ES2127458T3 (es) * 1989-11-06 1999-04-16 Cell Genesys Inc Produccion de proteinas utilizando recombinacion homologa.
GB9008746D0 (en) * 1990-04-18 1990-06-13 Connaught Lab The use of autologous promoters to express gene products in bordetella
US5643753A (en) 1990-04-18 1997-07-01 Connaught Laboratories Limited Use of autologous promoters to express gene products in bordetella
KR100259933B1 (ko) * 1991-05-06 2000-06-15 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 게놈 엘리먼트를 이용한 유전자 조작 및 발현방법
NZ245015A (en) * 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US6692737B1 (en) 1991-11-05 2004-02-17 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6054288A (en) * 1991-11-05 2000-04-25 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) * 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
AU4383293A (en) * 1992-05-19 1993-12-13 Tsi Corporation Production of transgenics by joining regulatory and coding regions in vivo
AU4401993A (en) * 1992-06-04 1993-12-30 Exemplar Corporation Insertion of heterologous dna outside of known chromosomal genes
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6531124B1 (en) 1992-07-10 2003-03-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5733753A (en) * 1992-12-22 1998-03-31 Novo Nordisk A/S Amplification of genomic DNA by site specific integration of a selectable marker construct
DK153992D0 (da) * 1992-12-22 1992-12-22 Novo Nordisk As Metode
HU221513B (en) 1993-12-23 2002-10-28 Merck & Co Inc Homologous recombination antibody expression system
AU738395B2 (en) * 1994-05-13 2001-09-20 Transkaryotic Therapies, Inc. DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6124439A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockefeller University OB polypeptide antibodies and method of making
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6124448A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockfeller University Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US6818220B1 (en) 1994-11-14 2004-11-16 Licentia Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof
US6645933B1 (en) 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
US6130071A (en) * 1997-02-05 2000-10-10 Helsinki University Licensing, Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) ΔCys156 protein and gene, and uses thereof
US6737513B1 (en) 1996-06-07 2004-05-18 Icos Corporation Macrophage derived chemokine (MDC) and chemokine analogs and assay to identify modulators of MDC activity, and therapeutic uses for same
US6498015B1 (en) 1995-06-07 2002-12-24 Icos Corporation Methods of identifying agents that modulate the binding between MDC and an MDC receptor
US7018627B1 (en) 1995-06-07 2006-03-28 Icos Corporation Macrophage derived chemokine (MDC), MDC analogs, MDC inhibitor substances, and uses thereof
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
US6361946B1 (en) 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
US7063958B1 (en) 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US7148004B1 (en) 1997-01-16 2006-12-12 The Rockefeller University Oligonucleotides of the OB-R isoforms and methods of diagnosing body weight
US7084252B1 (en) 1996-01-16 2006-08-01 The Rockefeller University DB, the receptor for leptin
US7619079B2 (en) 1996-02-14 2009-11-17 The Rockefeller University Db, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof
KR20000048820A (ko) 1996-10-01 2000-07-25 게론 코포레이션 텔로머라제 역전사 효소
US5925544A (en) * 1996-11-18 1999-07-20 Novo Nordisk A/S Method of homologous recombination followed by in vivo selection of DNA amplification
US7125714B2 (en) 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US5888809A (en) * 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
KR100641969B1 (ko) 1997-07-23 2006-11-06 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
CN1151258C (zh) * 1997-07-23 2004-05-26 罗切诊断学有限公司 通过内源基因活化制备***
US6897066B1 (en) * 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US5932465A (en) 1997-10-16 1999-08-03 Icos Corporation Phosphodiesterase 8A
AU757930B2 (en) * 1997-12-01 2003-03-13 Roche Diagnostics Gmbh Optimization of cells for endogenous gene activation
CA2321224A1 (en) 1998-02-23 1999-08-26 Icos Corporation Phosphodiesterase 10
US6479256B1 (en) 1998-03-04 2002-11-12 Icos Corporation Lectomedin materials and methods
US6200951B1 (en) 1998-03-12 2001-03-13 Icos Corporation Chitinase chitin-binding fragments
US6541623B1 (en) 1998-04-03 2003-04-01 Hyseq, Inc. Interleukin—1 receptor antagonist and uses thereof
US6294655B1 (en) 1998-04-03 2001-09-25 Hyseq, Inc. Anti-interleukin-1 receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6426191B1 (en) 1998-04-03 2002-07-30 Hyseq, Inc. Assays involving an IL-1 receptor antagonist
US6337072B1 (en) 1998-04-03 2002-01-08 Hyseq, Inc. Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof
US6071691A (en) * 1998-04-27 2000-06-06 Oregon Health Science University Materials and methods for modulating differentiation
US6492138B1 (en) 1998-05-21 2002-12-10 Amgen Canada Inc. Polynucleotides encoding a novel SHC-binding protein
AU4213999A (en) * 1998-05-27 1999-12-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
US6476211B1 (en) 1998-07-16 2002-11-05 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
AU762392B2 (en) 1998-07-16 2003-06-26 Arca Biopharma, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6387645B1 (en) 1998-07-16 2002-05-14 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6447771B1 (en) 1999-03-19 2002-09-10 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6773911B1 (en) 1998-11-23 2004-08-10 Amgen Canada Inc. Apoptosis-inducing factor
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
ES2337322T3 (es) 1998-12-23 2010-04-22 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Inhibidores de la respuesta al sabor amargo.
US6780977B1 (en) 1999-01-29 2004-08-24 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6783959B1 (en) 1999-01-29 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6899875B1 (en) 1999-01-29 2005-05-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6350447B1 (en) 1999-01-29 2002-02-26 Hyseq, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
CA2364267A1 (en) * 1999-02-19 2000-08-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US6335013B1 (en) 1999-03-19 2002-01-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
WO2000058479A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Amgen Inc. Beta secretase genes and polypeptides
AU779689B2 (en) 1999-06-16 2005-02-03 Icos Corporation Human poly(ADP-ribose) polymerase 2 materials and methods
US6632665B1 (en) 1999-08-09 2003-10-14 Wake Forest University Human gene encoding 3′-5′ exonuclease
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US6900043B1 (en) 1999-09-21 2005-05-31 Amgen Inc. Phosphatases which activate map kinase pathways
US6344549B1 (en) 1999-10-14 2002-02-05 Icos Corporation ATR-2 cell cycle checkpoint
CA2388599A1 (en) 1999-10-22 2001-05-03 Pharmacia & Upjohn Company Drosophila g protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
US7314716B2 (en) 1999-11-19 2008-01-01 Mount Sinai School Of Medicine Gustducin γ subunit materials and methods
US6635742B1 (en) 2000-01-25 2003-10-21 Nuvelo, Inc. Antibodies specific for semaphorin-like polypeptides
US6586390B1 (en) 2000-01-21 2003-07-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel prothrombinase-like polypeptides and polynucleotides
US6465620B1 (en) 2000-01-21 2002-10-15 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel von Willebrand/Thrombospondin-like polypeptides and polynucleotides
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US7514239B2 (en) 2000-03-28 2009-04-07 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof
AU2001274894A1 (en) 2000-05-22 2001-12-03 Pharmacia And Upjohn Company Novel matrix metalloproteinases
MXPA02012747A (es) 2000-06-28 2003-09-25 Amgen Inc Moleculas del receptor de linfopoietina estromica timica y sus usos.
AU2001271839A1 (en) 2000-07-05 2002-01-14 Pharmacia And Upjohn Company Human ion channels
GB0018876D0 (en) 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
US6787684B2 (en) 2000-10-16 2004-09-07 E. & J. Gallo Winery Lipoxygenase genes from Vitis vinifera
ATE505204T1 (de) 2000-12-20 2011-04-15 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US7338771B2 (en) 2001-07-10 2008-03-04 Alexey Pronin Use of specific T2R taste receptors to identify compounds that block bitter taste
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
DE60232149D1 (de) 2001-06-20 2009-06-10 Dainippon Sumitomo Pharma Co Verfahren zur förderung des nukleinsäuretransfers
EP2293067B1 (en) 2001-06-26 2016-04-20 Senomyx, Inc. T1R hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
US7662924B2 (en) 2002-02-22 2010-02-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Beta chain-associated regulator of apoptosis
WO2003100007A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Schering-Plough Ltd. Eta-1 gene and methods for use
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CN1909926A (zh) 2002-10-08 2007-02-07 阿雷斯贸易股份有限公司 能够结合il－18bp和抑制第二细胞因子活性的细胞因子的用途
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CA2802143C (en) 2003-01-14 2018-06-19 Dana-Farber Cancer Institute Sparc encoding polynucleotide as a cancer therapy sensitizer
EP1639005B1 (en) 2003-06-27 2017-05-03 Monell Chemical Senses Center Taste receptors of the t1r family from domestic cat
NZ545747A (en) 2003-08-06 2010-06-25 Senomyx Inc T1R hetero-oligomeric taste receptors, cell lines that express said receptors, and taste compounds
US7645733B2 (en) 2003-09-29 2010-01-12 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
JP4954550B2 (ja) * 2003-12-19 2012-06-20 大日本住友製薬株式会社 新規な核酸導入法
WO2005116069A2 (en) 2004-04-14 2005-12-08 Monell Chemical Senses Center Taste receptors of the t1r family from domestic dog
EA013071B1 (ru) 2004-04-23 2010-02-26 ФАРМАЦИЯ ЭНД АПДЖОН КОМПАНИ ЭлЭлСи Способ получения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (pprsv) и способ получения pprsv вакцины
IL161673A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Applied Research Systems Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
DK1797183T3 (da) 2004-09-02 2012-10-01 Univ Yale Regulering af onkogener med mikrornas
US7785807B2 (en) 2004-12-13 2010-08-31 Monell Chemical Senses Center Voltage-gated, pH-sensitive anion channel and its novel splice variant involved in taste sensation
EP3072522B1 (en) 2005-01-06 2019-04-24 Novo Nordisk A/S Anti-kir combination treatments and methods
WO2006101629A2 (en) 2005-02-17 2006-09-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated SODIUM CHANNEL PROTEIN TYPE III α-SUBUNIT SPLICE VARIANT
SI2567976T1 (sl) 2005-03-23 2017-11-30 Genmab A/S Protitelesa usmerjena proti cd38 za zdravljenje multiplega mieloma
US8354384B2 (en) 2005-06-23 2013-01-15 Yale University Anti-aging micrornas
CA2612613A1 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Mara Rossi Method for the determination of poloxamers
US7972813B2 (en) 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
EP1937718B1 (en) 2005-10-20 2017-12-06 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
ES2434494T3 (es) 2005-12-08 2013-12-16 Amgen, Inc. Células huésped mejoradas y métodos de cultivo
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
KR101387563B1 (ko) 2006-04-21 2014-04-25 세노믹스, 인코포레이티드 고효능의 조미용 향료를 포함하는 식품 조성물 및 이의 제조 방법
AU2008251467B2 (en) 2007-05-11 2014-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treatment of skin ulcers
BRPI0721697A2 (pt) 2007-05-11 2014-08-05 Univ Jefferson " métodos para tratar e/ou prevenir uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo, para tratar e/ou prevenir um indivíduo com ou em risco de demência vascular, para tratar e/ou prevenir uma doença ou distúrbio associado com uma barreira hematoencefálica anormal em um indivíduo, para diminuir o acúmulo beta amilóide no cérebro de um indivíduo, para tratar e/ou prevenir mal de alzheimer em um indivíduo e para prevenir ou reduzir o risco de desenvolver mal de alzhheimer, e, uso de um agente que inibe a expressão e/ou atividade da proteína lp-pla2."
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
EP2191271B1 (en) 2007-07-27 2016-01-13 Universiteit Gent Permissive cells and uses thereof
NZ583350A (en) 2007-08-21 2012-03-30 Senomyx Inc Heteroaryl-hydantoin derivatives as bitter taste inhibitors
GB0803076D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
UA105016C2 (uk) 2008-10-10 2014-04-10 Амген Інк. Fgf21 мутанти і їх застосування
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
KR101860572B1 (ko) 2009-05-05 2018-05-24 암젠 인크 Ｆｇｆ２１ 돌연변이체 및 이의 용도
CN102712688B (zh) 2009-09-23 2015-06-24 通益制药有限公司 重组人红细胞生成素(epo)的纯化方法、由此纯化的epo以及包含纯化的epo的药物组合物
EP2325194A1 (en) 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2528933A1 (en) 2010-01-28 2012-12-05 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
JP2013523184A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
JP6093696B2 (ja) 2010-06-09 2017-03-08 ゲンマブ エー／エス ヒトｃｄ３８に対する抗体
JP6055404B2 (ja) 2010-06-15 2016-12-27 ゲンマブ エー／エス 組織因子に対するヒト抗体薬物結合体
KR101578586B1 (ko) 2010-09-14 2015-12-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 Peg화된 에리트로포이에틴의 정제 방법
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
WO2013009971A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Detection and screening method and materials useful in performance thereof
EP2739734A1 (en) 2011-08-03 2014-06-11 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority d/b/a Carolina Healthcare System Treatment of fibrosis using microrna-19b
US11458157B2 (en) 2011-12-16 2022-10-04 Targetgene Biotechnologies Ltd. Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence
WO2015024977A1 (en) 2013-08-20 2015-02-26 Lek Pharmaceuticals D.D. CELL CULTURE MEDIUM AND PROCESS FOR CONTROLLING α-AMIDATION AND/OR C-TERMINAL AMINO ACID CLEAVAGE OF POLYPEPTIDES
US11390885B2 (en) 2014-09-15 2022-07-19 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (SCNT) efficiency by removing histone H3-lysine trimethylation
KR20220158870A (ko) 2016-07-15 2022-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법
JP7137625B2 (ja) 2017-12-29 2022-09-14 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｐｅｇ化タンパク質組成物を提供するための方法
ES2909454T3 (es) 2017-12-29 2022-05-06 Hoffmann La Roche Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
WO2019129877A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0225887B1 (en) * 1985-04-08 1994-06-08 Amgen Inc. A method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
EP0273085A1 (en) * 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
ZA88319B (en) * 1987-02-06 1988-08-12 Lubrizol Enterprises, Inc. Ocs enhancer
GB8807683D0 (en) * 1988-03-31 1988-05-05 Ici Plc Regulation of gene expression
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
WO1991005052A1 (en) * 1989-09-28 1991-04-18 Leningradsky Gosudarstvenny Universitet Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae
ES2127458T3 (es) * 1989-11-06 1999-04-16 Cell Genesys Inc Produccion de proteinas utilizando recombinacion homologa.
NZ245015A (en) 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production

Also Published As

Publication number Publication date
EP1482053A3 (en) 2007-10-17
HUT62657A (en) 1993-05-28
DK0779362T3 (da) 2004-05-10
ATE264916T1 (de) 2004-05-15
JP2004089200A (ja) 2004-03-25
DE69034135T3 (de) 2012-08-23
JP3501286B2 (ja) 2004-03-02
FI922863A (fi) 1992-06-18
JPH05504682A (ja) 1993-07-22
DE69034135D1 (de) 2004-05-27
LT3998B (en) 1996-06-25
GR3025057T3 (en) 1998-01-30
IL116046A0 (en) 1996-01-31
NO922436L (no) 1992-06-19
LV10655B (en) 1995-08-20
DE779362T1 (de) 2001-04-05
EP0779362B2 (en) 2012-06-13
IL116046A (en) 2007-03-08
IL96765A0 (en) 1991-09-16
HK1000786A1 (en) 2005-01-14
IL164252A0 (en) 2005-12-18
EP0505500A1 (en) 1992-09-30
EP0779362B1 (en) 2004-04-21
EP1375666A3 (en) 2007-09-26
ES2151463T1 (es) 2001-01-01
RU2128227C1 (ru) 1999-03-27
UA42675C2 (uk) 2001-11-15
FI107391B (fi) 2001-07-31
DE69031172T2 (de) 1998-03-12
CA2071989A1 (en) 1991-06-23
HK1000547A1 (en) 1998-04-03
AU7183691A (en) 1991-07-24
BR9007937A (pt) 1992-11-17
HU9202068D0 (en) 1992-10-28
DK0505500T3 (da) 1997-08-25
AR245776A1 (es) 1994-02-28
DE69034135T2 (de) 2004-08-26
ES2104690T3 (es) 1997-10-16
DE69031172D1 (de) 1997-09-04
CA2071989C (en) 1999-07-27
LV10655A (lv) 1995-04-20
BG60624B1 (bg) 1995-10-31
ATE156189T1 (de) 1997-08-15
AU645294B2 (en) 1994-01-13
EP0779362A1 (en) 1997-06-18
JP2004000233A (ja) 2004-01-08
WO1991009955A1 (en) 1991-07-11
JP3740134B2 (ja) 2006-02-01
ES2151463T3 (es) 2004-10-01
EP1482053A2 (en) 2004-12-01
EP0505500B1 (en) 1997-07-30
RO109864B1 (ro) 1995-06-30
NO311896B1 (no) 2002-02-11
ES2151463T5 (es) 2012-10-29
ZA9010392B (en) 1992-01-29
NO922436D0 (no) 1992-06-19
LTIP1595A (en) 1995-07-25
EP1375666A2 (en) 2004-01-02
DK0779362T4 (da) 2012-07-30
EP1484412A3 (en) 2007-10-17
KR0176693B1 (ko) 1999-04-01
EP1484412A2 (en) 2004-12-08
OA09594A (en) 1993-04-30
FI922863A0 (fi) 1992-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU217212B (hu) Endogén gének expressziójának módosítása szabályozóelemmel
US5272071A (en) Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
Hanson et al. Analysis of biological selections for high-efficiency gene targeting
EP0883344B2 (en) Therapeutic molecules generated by trans-splicing
EP3464587B1 (en) Compositions and methods for enhancing homologous recombination
US20080182331A1 (en) Procedure for specific replacement of a copy of a gene present in the recipient genome by the integration of a gene different from that where the integration is made
WO1997016533A1 (en) Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
CN111373041A (zh) 用于基因组编辑和调节转录的crispr/cas***和方法
EP1583837A1 (en) Targeted transgenesis using the rosa26 locus
EP1975228A1 (en) Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest
Hussain et al. Construction of a dominant selectable marker using a novel dihydrofolate reductase
EP1967585B1 (en) Method for gene amplification
US20230287459A1 (en) Single generation targeted gene integration
WO2024026344A1 (en) Modulating cellular repair mechanisms for genomic editing
WO2005062812A2 (en) A rAAV-BASED SYSTEM FOR SOMATIC CELL GENE DISRUPTION