DE69034135T2

DE69034135T2 - DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen

Info

Publication number: DE69034135T2
Application number: DE69034135T
Authority: DE
Inventors: Scott C. Chappel
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2010-12-22
Also published as: EP1482053A3; HUT62657A; DK0779362T3; ATE264916T1; JP2004089200A; DE69034135T3; JP3501286B2; FI922863A; JPH05504682A; DE69034135D1; LT3998B; GR3025057T3; IL116046A0; NO922436L; LV10655B; DE779362T1; EP0779362B2; IL116046A; IL96765A0; HK1000786A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veränderung der Expressionseigenschaften eines Gens, das natürlich innerhalb des Genoms einer stabilen Zelllinie oder eines klonierten Mikroorganismus vorhanden ist. In der bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aktivierung und Expression eines Gens, das innerhalb einer stabilen Zelllinie vorhanden ist und normalerweise transkriptionell still oder inert ist. Als Ergebnis wird das Proteinprodukt dieses Gens exprimiert. Dieses Phänomen findet ohne Transfizieren der Zelle mit der DNA statt, die das Produkt kodiert. Statt dessen wird das residente Gen, das für das gewünschte Produkt kodiert, innerhalb einer Zelle identifiziert und durch das Einfügen eines geeigneten regulatorischen Segments durch eine Technik, die homologe Rekombination genannt wird, aktiviert. Es können auch positive und/oder negative selektierbare Marker eingeführt werden, um die Selektion solcher Zellen zu unterstützen, in denen korrekte homologe Rekombinationsvorgänge vorgekommen sind. Als eine zusätzliche Ausführungsform kann ein spezifiziertes Gen für verstärkte Expressionsgeschwindigkeiten amplifiziert werden, egal ob das Gen normalerweise transkriptionell still ist oder durch Mittel der vorliegenden Erfindung aktiviert wurde oder das Produkt endogen exprimiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist wohl bekannt, das jede Zelle innerhalb eines Organismus die genetische Information enthält, die für alle Proteine kodiert, die in dem Organismus zu finden sind. Jedoch wird nur ein sehr geringer Prozentanteil der Gene, die in einem gegebenen Zelltyp vorhanden sind, tatsächlich transkribiert. Die intrazellulären Mechanismen, die die Gruppe von Genen regulieren, die zu transkribieren sind, sind nun verstanden. Zellspezifische Proteine, die im Nukleus vorhanden sind, wechselwirken mit DNA-regulatorischen Segmenten, die mit bestimmten Genen verbunden sind. Diese Wechselwirkung von nuklearen Proteinen mit DNA-regulatorischen Sequenzen ist zur Gentranskription notwendig.
Dieses resultiert in mRNA-Biosynthese und letztendlich in der Expression des kodierten Proteins (Mitchell und Tjian, Science, 245: 371, 1989).
Diese DNA-regulatorischen Segmente oder Elemente für jedes Gen liegen stromaufwärts von, und in einigen Fällen innerhalb oder sogar stromabwärts, der kodierenden Regionen. Durch eine Wechselwirkung mit zellspezifischen nuklearen Proteinen beeinflussen DNA-regulatorische Segmente die Fähigkeit der RNA-Polymerase, dem geschwindigkeitsbeschränkenden Enzym der Proteinexpression, Zugang zu dem Körper des Gens zu erhalten und ein mRNA-Transkript zu synthetisieren. Somit spielen diese DNA-Segmente und die residenten nuklearen Proteine eine kritische Rolle in der Regulation der Expression spezifischer Gene (Johnson und McKnight, Ann. Rev. Biochem., 58: 799, 1989).
Die DNA-regulatorischen Segmente sind Bindungsstellen für die nuklearen Proteine. Diese nuklearen Proteine binden an die DNA-Helix und scheinen ihre Struktur zu verändern, um das gewünschte Gen für die RNA-Polymerase-Erkennung verfügbar zu machen, was die Gentranskription erleichtert. Die Expression von diesen zellspezifischen regulatorischen Proteinen bestimmt, welche Gene innerhalb einer Zelle transkribiert werden und die Geschwindigkeit, mit der diese Expression vorkommen wird. Als ein Beispiel der Spezifität dieses Systems exprimieren Hypophysenzellen, nicht aber Leberzellen Hypophysenproteine, sogar obwohl die Gene für die Hypophysenproteine in allen Leberzellen vorhanden sind. Nuklei der Leberzellen enthalten nicht die spezifischen DNA-bindenden Proteine, die mit den Elementen der Hypophysengene wechselwirken, die resident in den Leberzellen vorhanden sind.
Derzeitig eingesetzte Verfahren zur Exprimierung von Proteinen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie
Mit dem Wissen, dass spezifische DNA-regulatorische Sequenzen notwendig sind, um die Gentranskription innerhalb eines bestimmten Zelltyps zu aktivieren, haben Wissenschaftler fremde Gene innerhalb eines bestimmten Zelltyps durch Gentechnologie exprimiert. Im Allgemeinen werden DNA-regulatorische Segmente, die durch die nuklearen Proteine der Zelle erkannt werden, stromaufwärts von der kodierenden Region eines fremden Gens, das es zu exprimieren gilt, platziert. In dieser Weise kann die fremde DNA nach dem Einfügen in die Zelle exprimiert werden, da die nuklearen regulatorischen Proteine der Zelle nun diese DNA-regulatorischen Sequenzen erkennen. Diese Technologie wurde eingesetzt, um Proteine zu produzieren, die schwer zu erhalten sind oder schwer aus natürlichen Quellen durch traditionelle Aufreinigungsstrategien zu erhalten sind.
Zusätzlich zu den erkennbaren DNA-Sequenzen und dem Gen von Interesse wird ein selektierbarer Marker mit der DNA-Konstruktion verbunden. Auf diese Weise überleben nur solche Zellen nach Kultur in einem Selektionsmedium, welche die DNA aufgenommen haben. Zum Beispiel kann das Gen für Neomycin-Resistenz in den Expressionsvektor eingefügt werden. Nach Transfektion werden Zellen in G418 kultiviert, einem Neomycin-Antibiotikum, das lethal für Säugetierzellen ist. Wenn die Zellen jedoch das Neomycin-Resistenzgen aufgenommen haben, dann werden sie in der Lage sein, den toxischen Wirkungen des Medikaments zu widerstehen. Auf diese Weise verbleiben nur die Zellen in der Kultur, die die transfizierte DNA aufgenommen haben. Es ist selbstverständlich, dass jeglicher selektierbarer Makler verwendet werden könnte, so lange er die Selektion von Zellen zur Verfügung stellt, welche die transfizierte DNA aufgenommen haben. Es ist des Weiteren selbstverständlich, dass die spezifische Position des eingefügten genetischen Materials innerhalb der Zelle nicht kritisch ist. Es ist nur wichtig, dass dieses irgendwo innerhalb des Nukleus aufgenommen wird, da beide, das regulatorische Segment und das fremde Gen (sowie der selektierbare Marker) zusammen eingefügt werden.
Mängel in den derzeitigen Verfahren zur Genexpression
Während die oben genannten Techniken instrumentell für den Ausbau der Gentechnologie waren, waren diese nicht immer die effizientesten Verfahren, um Gene zu exprimieren. Dieses ist durch die Tatsache bedingt, dass das Einfügen von DNA in den Nukleus einer Zelllinie im Allgemeinen durch eine Technik erreicht wird, die als Transfektion bekannt ist. DNA, die zur Expression in der Zelllinie von Interesse entwickelt wurde, wird gefällt und die Zellmembran wird solubilisiert, um die Aufnahme der DNA zu ermöglichen. Wie oben angedeutet, ist die genaue Position, in welche die DNA eingebaut wird, in dem Genom niemals voraussagbar; tatsächlich kann die DNA episomal verbleiben (nicht in das Genom integriert). Dieses resultiert in der mangelnden Voraussagbarkeit von sowohl der Menge an Expression des produzierten Proteins wie auch der Stabilität der Zelllinie.
Ein zweiter Mangel dieser Technik ist die Tatsache, dass die Konstruktion des Expressionsvektors extrem schwer ist, wenn das Gen von Interesse relativ groß ist (größer als 5 –10 Kilobasen). Viele der durch rekombinante DNA-Technologie exprimierten Proteine wurden eher durch cDNAs kodiert als durch wesentlich größere genomische Klone. Dieses wird gemacht, um die Gesamtgröße der Einfügung zu verringern. Während die Verwendung von cDNAs die Gentechnologie leichter handhabbar macht, können die Geschwindigkeiten der Gentranskription und Proteinproduktion als Ergebnis darunter leiden. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Expressionsmengen manchmal stark durch die Verwendung genomischer anstatt der cDNA-Einfügungen erhöht sind (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 836–840, 1988, und Chung und Perry, Mol. Cell. Biol., 9: 2075 –2082, 1989).
Obwohl die für diese Beobachtung verantwortlichen Mechanismen nicht gut verstanden sind, ist bekannt, dass in bestimmten Situationen Verstärkerelemente, die innerhalb Introns vorhanden sind, die transkriptionelle Effizienz des Gens verbessern können. Es gibt auch Beweise dafür, dass Introns oder die Splicing-Vorgänge, welche durch das Vorhandensein von Introns resultieren, eine Auswirkung auf die RNA-Prozessierungsvorgänge haben können, die dem Beginn der Transkription folgen (Buchman und Berg, Mol. Cell. Biol., 8: 4395–4405, 1988). Dieses kann das Transkript stabilisieren und dadurch die Geschwindigkeit der mRNA-Akkumulierung verbessern. In der oben zitierten Veröffentlichung von Brinster et al. wird auch postuliert, dass die Position der Introns innerhalb des Gens für die Phasenverschiebung der Nukleosomen relativ zu dem Promotor wichtig sein können. Der Einfluss verschiedener regulatorischer Elemente auf die Transkription eukaryontischer Gene wird in Khoury et al., Cell., 33: 313–14 (1983), Maniatis et al., Science, 236: 1237–45 (1987) und Muller et al., Eur. J. Biochem., 176: 485–95 (1988) diskutiert.
Drittens, um Eingang in den Nukleus zu finden, muss die transfizierte DNA, einschließlich der gesamten kodierenden Region des fremden Gens, das Cytoplasma nach dem Eintreten durch die permeabilisierte Plasmamembran der Zelle durchqueren. Während dieser Zeit kann die DNA mit lysosomalen Enzymen in Kontakt kommen, die die Inte grität der DNA verändern oder vollständig zerstören können. Somit kann es sein, dass die kodierende Region der DNA nicht mit der identisch ist, die transfiziert wurde.
Das neue Verfahren der Genaktivierung und/oder Expressionsmodifikation, das wir unten beschreiben, kann nicht in der Herstellung mutierter Formen des gewünschten Proteins resultieren, da die kodierende Region des gewünschten Gens keinen enzymatischen Modifikationen ausgesetzt wird.
Zusammengefasst, eine große Menge der unter Verwendung traditioneller Techniken in die Zelle transfizierten DNA und insbesondere die kodierende Region davon wird nicht korrekt transkribiert. Sie kann vor dem Einzug in den Nukleus abgebaut werden, enzymatisch verändert werden, so dass sie nicht das gesamte gewünschte Protein kodieren wird, oder sie kann nicht alle notwendigen regulatorischen Segmente enthalten, die ihre Transkription ermöglichen. Sie kann in einen Teil des Genoms eingefügt werden, der Transkription verhindert. Wenn die cDNA transkribiert wird, kann das Protein von Interesse nicht effizient hergestellt werden, bedingt durch das Auslassen von Introns, welche Verstärker enthalten können oder eine effiziente mRNA-Prozessierung ermöglichen. Schließlich kann sie episomal verbleiben, eine Proteinproduktion unterstützen, aber instabil sein, während die Zellpopulation durch Zellteilung wächst.
Es wäre sehr wünschenswert, ein Verfahren zur Induktion der Genexpression zu entwickeln, das eine Zelllinie produzieren würde, die die positiven Attribute der existierenden Verfahren enthält aber irgendwie die nachteiligen Merkmale umgeht. Es wäre des Weiteren wünschenswert, in der Lage zu sein, die endogene Expression von bestimmten Genen in dem Zelltyp der Wahl zu exprimieren oder modifizieren. Es ist des Weiteren wünschenswert, in der Lage zu sein, die potenziellen Vorteile in Anspruch nehmen zu können, die durch eine vollständige genomische Sequenz erhalten werden können, die kryptische transkriptionelle Verstärker umfasst, die innerhalb Introns vorhanden sein können, durch das geeignete Platzieren von Introns für eine korrekte Nukleosomenphasenverschiebung oder durch effizientere mRNA-Prozessierungsvorgänge. Diese Vorteile sind normalerweise bedingt durch die Größe der Gene nicht mit rekombinanten DNA-Expressionsverfahren möglich. Wenn man in der Lage wäre, ein Gen zu exprimieren, das bereits resident im Genom vorhanden ist, d. h., ein endogenes Gen, dann würden die Stabilität der Zelllinie und die Expressionsgeschwindigkeiten konsistenter und voraussagbarer sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben genannten Mängel im Stand der Technik zu eliminieren.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Exprimierung spezifischer Gene zur Verfügung zu stellen, die in einer ausgewählten Zelllinie vorhanden aber normalerweise transkriptionell still sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Exprimierung von Proteinen zur Verfügung zu stellen, das den ganzen Vorteil vollständiger genomischer Sequenzen in Anspruch nimmt, die für die mRNA-Akkumulierung und/oder Transkription verantwortlich sind.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Veränderung der Expressionseigenschaften eines Gens von Interesse durch das Einfügen von DNA-regulatorischen Segmenten und/oder amplifizierenden Segmenten in das Genom einer stabilen Zelllinie oder eines klonierten Mikroorganismus stromaufwärts, innerhalb oder ansonsten proximal zu dem nativen Gen von Interesse zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Veränderung der Expressionseigenschaften eines Gens zur Verfügung zu stellen, das natürlich in dem Genom einer stabilen Zelllinie oder eines klonierten Mikroorganismus vorkommt und zugleich Eigenschaften einzuführen, die die Selektion von Zellen unterstützen, die korrekt modifiziert wurden.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Genom zur Verfügung zu stellen, das darin proximal zur kodierenden Region oder Exons eines Gens von Interesse ein regulatorisches oder amplifizierendes Segment aufweist, welches dort nicht natürlich vorkommt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, DNA-Konstrukte zur Verfügung zu stellen, die zur Durchführung der homologen Rekombinationsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zelllinien und Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, die die Genome gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden mittels der Technik der homologen Rekombination erreicht, durch die ein Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet die Expression und Amplifikation von residenten, ja sogar transkriptionell stillen Genen bewirken kann. Durch diese Technik kann man auch die Expressionseigenschaften eines Gens modifizieren, das natürlich innerhalb des Genoms einer stabilen Zelllinie vorhanden ist, aber nicht notwendigerweise still oder inert ist, um z. B. die Expression bedingungsabhängig, d. h., reprimierbar oder induzierbar zu machen oder die Geschwindigkeit der Expression zu verstärken.
Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Konstrukt, das zur Veränderung der Expressionseigenschaften eines Gens innerhalb des Genoms einer Zelllinie oder eines Mikroorganismus geeignet ist, zur Verfügung. Das DNA-Konstrukt wird in das Genom durch die Technik der homologen Rekombination eingefügt. Das Konstrukt umfasst ein DNA-regulatorisches Segment, das in der Lage ist, die Expressionseigenschaften eines jeden Gens zu verändern, an welches es operativ innerhalb der Wirtszelllinie oder des Mikroorganismus gebunden ist, so wie ein Zielsegment, das homolog zu einer Region des Genoms ist, wo es für das DNA-regulatorische Segment wünschenswert ist, eingefügt zu werden. Das Konstrukt und die Einfügungstechnik sind so ausgestaltet, dass sie bewirken, dass das neue DNA-regulatorische Segment operativ an das Gen von Interesse gebunden wird. Somit werden ohne die Notwendigkeit des Einfügens von neuen kodierenden Exons die Expressionseigenschaften des Gens verändert. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist das Gen ein solches, welches normalerweise transkriptionell still oder inert innerhalb der Wirtszelllinie oder des Mikroorganismus ist und mittels der DNA-regulatorischen Region, die direkt auf die geeignete Position gerichtet ist, bezüglich des Gens durch Mittel der homologen Rekombination, wodurch das Gen zur Expression seines Genprodukts aktiviert wird.
Das DNA-Konstrukt umfasst zwei Zielsegmente, welche in dem nativen Gen vorzugsweise benachbart sind, während sie in dem Konstrukt durch solche Elemente getrennt sind, die in das Genom einzufügen sind.
Das Konstrukt umfasst des Weiteren mindestens ein exprimierbares selektierbares Markergen, wie das Gen, das Neomycinresistenz zur Verfügung stellt. Dieses Markergen, einschließlich eines Promotors dafür, liegt auch zwischen den zwei Zielregionen des Konstrukts.
Das Konstrukt umfasst ein exprimierbares amplifizierbares Gen, um die Expression des Gens von Interesse zu amplifizieren. Dieses Gen, einschließlich eines Promotors dafür, liegt auch zwischen den zwei Zielregionen des Konstrukts. In einigen Fällen kann der selektierbare Marker und der amplifizierbare Marker der gleiche sein.
Das DNA-Konstrukt umfasst ein negatives selektierbares Markergen, das nicht in Zellen exprimiert wird, in die das DNA-Konstrukt korrekt eingefügt ist. Dieses negative selektierbare Markergen liegt außerhalb der zwei Zielregionen, so dass es entfernt wird, wenn das Konstrukt korrekt in das Gen durch homologe Rekombination eingebaut wird. Ein Beispiel eines solchen negativen selektierbaren Markergens ist das Herpes Simplex Virus Thymidinkinase-Gen.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Expressionseigenschaften eines spezifischen Gens zu verändern, welches bereits ein Produkt in einer Zelllinie oder einem Mikroorganismus von Interesse exprimiert. Dieses kann durch das Einfügen eines DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination erreicht werden, welches (1) ein exprimierbares amplifizierbares Gen umfasst, welches die Kopienzahl des Gens von Interesse erhöht, wenn die Zelllinie oder der Mikroorganismus Amplifikationsbedingungen ausgesetzt wird und/oder (2) ein Promotor-/Verstärkerelement (oder ein anderes regulatorisches Element), welches die Expression des Gens von Interesse verändert, wie z. B. durch das Erhöhen der Geschwindigkeit der Transkription, das Erhöhen der Translationseffizienz, das Erhöhen der mRNA-Akkumulierung, das Induzierbarmachen der Expression, etc., zwei DNA-Zielsegmente (A, B), die homolog zu einer Region des Genoms innerhalb oder proximal zu dem ausgewählten Gen in der Wirtszelllinie sind, wobei eines davon (A) homolog zu einer Region des Genoms ist, die stromabwärts der spezifischen Region lokalisiert ist, an welcher das regulatorische Segment (F) eingefügt ist, und das andere von diesen (B) homolog zu einer Region des Genoms ist, die stromaufwärts von der spezifischen Region lokalisiert ist, an welcher das regulatorische Segment (F) eingefügt ist, einen positiven selektierbaren Marker, und einen negativen selektierbaren Marker und ein amplifizierbares Gen umfasst. Die Genexpression, die in dieser Weise verändert ist, kann eine natürliche Expression sein oder eine Expression, die durch vorherige genetische Manipulation der Zelllinie oder des Mikroorganismus bewirkt wurde. Die vorherige genetische Manipulation kann durch konventionelle Techniken oder mittels homologer Rekombination gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sein. Im letzteren Falle kann die DNA-Einfügung, die in der Veränderung der Expressions-eigenschaften resultiert, als Teil der gleichen genetischen Manipulation erreicht werden, welche in der Expression des Gens resultiert oder sie kann in einem darauf folgenden Schritt durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Konstrukte, die gemäß der oben genannten Diskussion hergestellt werden sowie die Genome, die korrekt einer homologen Rekombination mittels dieser Konstrukte ausgesetzt wurden und die Zelllinien und Mikroorganismen, die diese Genome umfassen.
Zudem ist auch ein Verfahren zur Herstellung des gewünschten Produkts durch Kultivierung der transformierten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine allgemeine Skizze eines DNA-Konstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung.
2A zeigt den Modus der Integration des DNA-Konstrukts in das Genom im Falle einer nicht-homologen oder zufälligen Rekombination.
2B zeigt den Modus der Integration des DNA-Konstrukts in das Genom im Falle einer homologen Rekombination.
3 zeigt die Konstruktion eines bevorzugten homologen Rekombinationsvektors gemäß der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt den Modus der Integration eines zirkulären DNA-Stücks durch homologe Rekombination, wenn nur ein Zielstück der DNA eingesetzt wird.
5 zeigt das pRSVCAT-Plasmid einschließlich die Restriktionsschnittstellen davon.
6 zeigt die Konstruktion des pRSV-Plasmids einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
7 zeigt das pSV2NEO-Plasmid einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
8 zeigt die Konstruktion des pSVNEOBAM-Plasmids einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
9 zeigt die Konstruktion des pRSVNEO-Plasmids einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
10 zeigt die Konstruktion des pRSVCATNEO-Plasmids einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
11 zeigt ein 15,3 kb-Fragment des Ratten-TSHβ-Gens und zeigt verschiedene Restriktionssegmente davon.
12 zeigt die Konstruktion des pRSVCATNEOTSHβ3-Plasmids einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
13 zeigt die Konstruktion des pRSVCATNEOTSHβ3-5Xbal-Plasmids einschließlich der Restriktionsschnittstellen davon.
14 zeigt einen Teil der Nukleotidsequenz von TSHβ zusammen mit den Regionen davon, zu denen jeder Primer zur PCR-Amplifikation korrespondiert. Exons 2 und 3 werden in Großbuchstaben gezeigt. Ein 247-Bp-amplifiziertes-Fragment wird durch unterstrichene Sternchen gezeigt.
15 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese von cDNA, die aus RNA synthetisiert wurde, die aus verschiedenen Zellpopulationen extrahiert wurde und deren TSHβ-cDNA, die durch PCR amplifiziert wurde, wenn sie vorhanden war. Die Art der Zellen, die die verschiedenen Bahnen präsentieren, wird in 15 unter dem Gel gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die homologe Rekombination ist eine Technik, die innerhalb der letzten paar Jahre zum Zielen von Genen entwickelt wurde, um Mutationen in transkriptionell aktiven Genen zu induzieren oder zu korrigieren (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. und Mol. Biol., 36: 301 (1989)). Diese Technik der homologen Rekombination wurde als Verfahren zur Einführung spezifischer Mutationen in spezifische Regionen des Säugetiergenoms entwickelt (Thomas et al., Cell, 44: 419–428, 1986; Thomas und Capecchi, Cell, 51: 503–512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583–8587, 1988) oder um spezifische Mutationen in defekten Genen zu korrigieren (Doetschman et al., Nature, 330: 576–578, 1987).
Durch diese Technik kann ein Stück DNA, von dem man wünscht, dass es in das Genom eingeführt wird, auf eine spezifische Region des Gens von Interesse durch das Anfügen von diesem an die "zielende DNA" gerichtet werden. "Zielende DNA" ist DNA, die komplementär (homolog) zu einer Region der genomischen DNA ist. Wenn zwei homologe Teile einzelsträngiger DNA (d. h., die zielende DNA und die genomische DNA) in großer Nähe sind, dann werden sie hybridisieren, um eine doppelsträngige Helix auszubilden. An diese zielende DNA ist die DNA-Sequenz gebunden, von der man wünscht, dass sie in das Genom eingefügt wird.
Es gibt eine Reihe von Verfahren, durch die homologe Rekombination vorkommen kann. Ein Beispiel ist während des Prozesses der Replikation von DNA während der Mitose in Zellen.
Durch einen Mechanismus, der nicht vollständig verstanden wird, wird parentale doppelsträngige DNA direkt vor der Zellteilung an einer lokalen Region geöffnet, die Replikationsblase genannt wird. Die zwei getrennten Stränge der DNA können nun als Templates dienen, von denen aus neue Stränge synthetisiert werden. Ein Arm der Replikationsgabel hat den DNA-Kode in der 5'- zu 3'-Richtung, welche die geeignete Orientierung ist, in der das Enzym DNA-Polymerase "lesen" kann. Dieses Enzym bindet an den 5'-Teil der einzelsträngigen DNA und beginnt unter Verwendung dieses Stranges als Template, den komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Der andere parentale DNA-Strang wird in der 3'- zu 5'-Richtung kodiert. Er kann in dieser Richtung nicht durch DNA-Polymerase gelesen werden. Damit dieser DNA-Strang repliziert wird, muss ein spezieller Mechanismus vorkommen.
Ein spezialisiertes Enzym, RNA-Primase, bindet sich an den 3'- zu 5'-Strang der DNA und synthetisiert einen kurzen RNA-Primer in Intervallen entlang des Stranges. Unter Verwendung dieser RNA-Segmente als Primer bindet die DNA-Polymerase nun an die geprimte DNA und synthetisiert ein komplementäres DNA-Stück in der 5'- zur 3'-Richtung. Diese Teile neu synthetisierter DNA werden Okazaki-Fragmente genannt. Die RNA-Primer, die für das Starten der Gesamtreaktion verantwortlich sind, werden durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase entfernt und durch DNA ersetzt. Dieses Phänomen wird fortgeführt bis die Polymerase einen nicht-geprimten DNA-Bereich erreicht, an dem der lokale synthetische Prozess stoppt. Somit wird der komplementäre parentale Strang, obwohl er insgesamt in der 3'- zur 5'-Richtung synthetisiert wird, tatsächlich durch "Rückwärtsnähen" in der 5'- zur 3'-Richtung hergestellt. Jegliche Unterbrechungen (Nicks), die in der DNA während des Prozesses des "Rückwärtsnähens" vorkommen können, werden durch ein Enzym, das DNA-Ligase genannt wird, geschlossen.
Um die absolut getreue Wiedergabe des DNA-Kodes aufrecht zu erhalten, ist in der DNA-Polymerase eine Korrekturlesefunktion vorhanden. Die DNA-Polymerase braucht geprimte DNA-Stücke, von denen aus sie einen neuen DNA-Strang synthetisiert. Wie oben erwähnt, kann dieses ein Einzel-DNA-Strang sein, der mit RNA geprimt wurde, oder ein komplementärer DNA-Strang sein. Wenn die DNA-Polymerase falsch gepaarte komplementäre DNA-Stücke findet, kann sie als eine Exonuklease wirken und DNA-Basen in einer 3'- zur 5'-Richtung entfernen bis sie wieder auf perfekte Paarung trifft.
Mit diesem Hintergrund ist es nun möglich, die Basis der hierin beschriebenen Technik zu verstehen. Kleine Teile der zielenden DNA, die komplementär zu einer spezifischen Region des Genoms sind, werden mit dem parentalen Strang während des DNA-Replikationsprozesses in Kontakt gebracht. Es ist eine allgemeine Eigenschaft von DNA, die in eine Zelle eingefügt wurde, zu hybridisieren und dadurch mit anderen DNA-Stücken durch gemeinsame homologe Regionen zu rekombinieren. Wenn dieser komplementäre Strang an ein Oligonukleotid befestigt wird, das eine Mutation oder eine von der DNA unterschiedliche Sequenz enthält, wird dieser auch in den neu synthetisierten Strang als Ergebnis der Rekombination eingebracht. Als Ergebnis der Korrekturlesefunktion ist es für die neue DNA-Sequenz möglich, als Template zu dienen. Dadurch wird die transfizierte DNA in das Genom eingebaut.
Wenn die Sequenz eines bestimmten Gens bekannt ist, kann ein Teil der DNA, die komplementär zu einer ausgewählten Region des Gens ist, synthetisiert oder anderweitig erhalten werden, wie durch geeignetes Schneiden der nativen DNA an spezifischen Erkennungsstellen, die an die Region von Interesse grenzen. Dieses Stück wird als Zielvorrichtung nach dem Einfügen in die Zelle wirken und mit seiner homologen Region innerhalb des Genoms hybridisieren. Wenn diese Hybridisierung während der DNA-Replikation stattfindet, wird dieses DNA-Stück und weitere Sequenzen, die daran befestigt sind, als ein Okazaki-Fragment dienen und wird in den neu synthetisierten Tochter-DNA-Strang rückgenäht.
In der Technik der vorliegenden Erfindung sind an diese Stücke Ziel-DNA Regionen von DNA befestigt, von denen bekannt ist, dass sie mit nuklearen regulatorischen Proteinen wechselwirken, die in der Zelle vorhanden sind und optional amplifizierbare und selektierbare DNA-Marker. Somit kann die Expression spezifischer Proteine nicht durch Transfektion von DNA erreicht werden, die das Gen selbst kodiert und Marker-DNA, wie es am Üblichsten ist, sondern durch die Verwendung zielender DNA (Regionen der Homologie mit dem endogenen Gen von Interesse), die mit DNA-regulatorischen Elementen verbunden ist, die das Gen mit erkennbaren Signalen zur Transkription ausstatten. Mit dieser Technologie ist es möglich, jegliches erkennendes Gen, das in einem Zelltyp vorhanden ist, zu exprimieren und amplifizieren, ohne tatsächlich das Gen zu transfizieren. Zusätzlich wird die Expression dieses Gens durch die gesamte genomische DNA anstatt durch Teile des Gens oder der cDNA kontrolliert, wodurch die Geschwindigkeit der Transkription und die Effizienz der mRNA-Prozessierung verbessert wird. Des weiteren können die Expressionseigenschaften von jeglichem erkennenden Gen, das in einem Zelltyp vorhanden ist, durch geeignetes Einfügen von DNA-regulatorischen Segmenten und ohne das Einfügen der gesamten kodierenden Teile des Gens von Interesse verändert werden.
Gemäß diesen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden neue Verfahren zur Exprimierung von normalerweise transkriptionell stillen Genen von Interesse zur Verfügung gestellt oder zur Veränderung der Expression von endogen exprimierenden Genen von Interesse innerhalb einer differenzierten Zelllinie. Die erkennenden genomischen Sequenzen, von denen es wünschenswert ist, dass sie exprimiert werden, oder deren Expression zu verändern ist, werden mit den notwendigen zellspezifischen DNA-Sequenzen (regulatorische und/oder Amplifikations-Segmente) zur Verfügung gestellt, um die Expression des Gens innerhalb der Zelle zu dirigieren oder modifizieren. Die resultierende DNA wird die DNA-Sequenz umfassen, die für das gewünschte Protein kodiert, die direkt in einer operativen Weise an heterologe (für die erkennende DNA-Sequenz) regulatorische und/oder Amplifizierungs-Segmente gebunden ist. Ein positiver selektierbarer Marker wird optional in der Konstruktion mit umfasst, um das Untersuchen der resultierenden Zellen zu erleichtern. Die Verwendung des Neomycin-Resistenzgens ist bevorzugt, obwohl jeglicher selektierbare Marker eingesetzt werden kann. Negative selektierbare Marker können optional auch verwendet werden. Zum Beispiel kann das Herpes Simplex Virus Thymidinkinase (HSVtk)-Gen als Marker verwendet werden, um gegen zufällig integrierte Vektor DNA zu selektieren. Die fusionierten DNAs oder existierende exprimierende DNAs können amplifiziert werden, wenn die zielende DNA an einen amplifizierbaren Marker gebunden ist.
Daher kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung jegliches Gen, welches normalerweise exprimiert wird, wenn es in seiner spezifischen eukaryontischen Zelllinie vorhanden ist, insbesondere einer differenzierten Zelllinie, zur Expression in einer Zellli nie gezwungen werden, die nicht für dieses spezifisch ist, wobei das Gen in einem stillen Format vorhanden ist. Dieses kommt ohne das tatsächliche Einfügen der vollen DNA-Sequenz für dieses Gen zustande. Zusätzlich kann das Gen oder ein normal exprimierendes Gen für verstärkte Expressionsgeschwindigkeiten amplifiziert werden. Des Weiteren können die Expressionseigenschaften von Genen, die nicht vollständig transkriptionell still sind, genauso modifiziert werden wie die Expressionseigenschaften von Genen in Mikroorganismen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden eukaryontische Zellen, die ein spezifisches Gen von Interesse enthalten, aber normalerweise nicht transkribieren, durch die hierin beschriebenen Techniken induziert, dieses zu tun. Der unten beschriebene homologe Rekombinationsvektor wird in eine klonare Zelllinie eingefügt und nach chemischer Selektion wird er auf die Herstellung eines spezifischen Genprodukts durch jegliche geeigneten Mittel beobachtet, wie z. B. durch den Nachweis von mRNA, die aus dem neu aktivierten Gen transkribiert wird, immunologischer Nachweis des spezifischen Genprodukts oder einen funktionellen Assay für das spezifische Genprodukt.
Die allgemeine Skizze des DNA-Konstrukts, das verwendet wird, um transkriptionell endogene Gene durch homologe Rekombination zu aktivieren, wird in 1 gezeigt.
Im Allgemeinen umfasst das DNA-Konstrukt mindestens zwei und bis zu sechs oder mehrere separate DNA-Segmente. Die Segmente bestehen aus mindestens einem, vorzugsweise zwei, DNA-Zielsegmenten (A und B), die homolog zu einer Region des Zellgenoms innerhalb oder proximal zu dem Gen liegen, von dem erwünscht ist, dass es exprimiert wird, einem positiven Selektionsgen (C), einem amplifizierbaren Gen (D), einem negativen Selektionsgen (E) und einem DNA-regulatorischen Segment (F), welches in der zu transfizierenden Zelle transkriptionell aktiv ist. In der einfachsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung muss nur ein einzelnes Zielsegment (B) und das regulatorische Segment (F) vorhanden sein. Alle anderen Regionen sind optional und stellen bevorzugte Konstrukte zur Verfügung.
Regionen A und B sind DNA-Sequenzen, die homolog zu Regionen des endogenen Gens von Interesse sind, welches transkriptionell aktiv gemacht werden soll. Die spezifischen Regionen A und B des endogenen Gens werden so ausgewählt, dass sie jeweils stromaufwärts und stromabwärts der spezifischen Position gelegen sind, bei der es wünschenswert ist, dass das regulatorische Segment dort eingefügt wird. Obwohl diese Regionen in dem Konstrukt getrennt sind, sind sie in dem endogenen Gen vorzugsweise benachbart. Es kann Gelegenheiten geben, in denen nicht benachbarte Teile des Genoms als Zielsegmente verwendet werden, z. B., wo es wünschenswert ist, einen Teil des Genoms zu deletieren, wie ein negatives regulatorisches Element.
Während zwei Zielregionen, A und B, bevorzugt sind, um die Gesamtregionen an Homologie zu erhöhen und somit die Rekombinationseffizienz zu erhöhen, umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung einer einzelnen Zielregion. In seiner einfachsten Form (wenn nur das regulatorische Segment F und das selektierbare Markergen C und der Promotor C' eingefügt werden sollen) wird ein zirkuläres DNA-Stück eingesetzt, welches diese Elemente zusammen mit der Ziel-DNA umfasst (siehe 4). Auf diese Weise hybridisiert die homologe Region (B) mit ihrem genomischen Gegenstück. Segmente C', C und F werden in den B-Teil des erkennenden Gens nach dem "Crossover"(Übergangs)-Vorgang eingefügt.
Wenn es für die DNA-regulatorische Sequenz wünschenswert ist, stromaufwärts von dem Gen von Interesse eingefügt zu werden, z. B., wenn es wünschenswert ist, ein normalerweise transkriptionell stilles Gen zu aktivieren und exprimieren, ist die Homologieregion vorzugsweise homolog zu einem nicht-kodierenden Teil des Genoms stromaufwärts der kodierenden Teile des Gens von Interesse. Wenn zwei Zielregionen vorhanden sind, kann die stromabwärts gelegene Region (A) einen Teil der kodierenden Region enthalten, obwohl es bevorzugt ist, dass diese auch vollständig stromaufwärts von der kodierenden Region liegt. Es ist des Weiteren bevorzugt, dass die homologen Regionen derart ausgewählt sind, dass die DNA-regulatorische Sequenz stromabwärts des nativen Promotors für das Gen von Interesse eingefügt wird, insbesondere, wenn der native Promotor ein negativer Promotor anstatt eines abgeschalteten positiven Promotors ist.
Die Größe der Zielregionen, d. h., der Homologieregionen, ist nicht kritisch, obwohl je kürzer diese Regionen sind, desto weniger wahrscheinlich ist es, dass diese die geeigneten Homologieregionen finden und an der gewünschten Stelle rekombinieren. Somit, je kürzer die Homologieregionen sind, desto weniger effizient ist die homologe Rekom bination, d. h., desto kleiner ist der Prozentanteil von erfolgreich rekombinierten Klonen. Es wurde vorgeschlagen, dass die minimale Voraussetzung für eine Sequenzhomologie 25 Basenpaare ist (Ayares et al., PNAS, USA, 83: 5199–5203, 1986). Des Weiteren, wenn eines der anderen Elemente des Konstrukts auch in dem Genom der Wirtszelle zu finden ist, dann besteht die Möglichkeit der Rekombination an der falschen Stelle. Jedoch kann die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die exzellente positive und negative Selektierbarkeit auch erfolgreich durchgeführt werden, wenn die Effizienz gering ist. Optimale Ergebnisse werden erreicht, wenn die Gesamtregion an Homologie, einschließlich beider Zielregionen groß ist, z. B. ein bis drei Kilobasen. So lange das regulierbare Segment F operativ an das Gen von Interesse gebunden werden kann, gibt es keine Einschränkung bezüglich der Größe der Zielregion und insbesondere der stromaufwärts gelegenen Zielregion B.
Es kann leicht empirisch bestimmt werden, ob die Zielregionen zu groß sind oder nicht oder ob das regulierbare Segment F zu weit von der kodierenden Region des Gens von Interesse gelegen ist, um operativ daran gebunden zu sein. In einem solchen Fall können die Regionen A und B homolog zu einem unterschiedlichen Abschnitt des Gens von Interesse gemacht werden und der Vorgang wird wiederholt bis das regulierbare Segment F korrekt eingefügt ist, um operativ an das Gen von Interesse gebunden zu sein. Zum Beispiel kann die Restriktionsschnittstelle der kombinierten Region A–B des endogenen Gens geändert werden und der Prozess wiederholt werden. Sobald das Konzept der vorliegenden Erfindung zusammen mit der hierin offenbarten Technik bekannt ist, wäre ein Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet in der Lage, die vorliegende Erfindung bezüglich jedes gegebenen Gens von Interesse in jeglicher Zelllinie oder Mikroorganismen ohne die Verwendung von unzumutbarem Experimentieren herzustellen und zu verwenden.
Region C ist ein positives selektierbares Markergen, welches in der Lage ist, die transfizierte Zelllinie resistent gegen eine normalerweise toxische Umgebung zu machen. Beispiele solcher Gene sind Adenosin-Deaminase (ADA), Aminoglycosid-Phosphotransferase (neo), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPH), Thymidinkinase (tk), Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt), Mehrfach-Medikamentenresistenzgen (MDR), Ornithindecarboxylase (ODC) und N-(Phosphonacetyl)-L-Aspartatresistenz (CAD).
Zusätzlich zu dem positiven selektiven Markergen ist optional ein amplifizierbares Gen in dem Konstrukt in Region D mit umfasst. Amplifizierbare Gene sind Gene, die unter Selektionsdruck zu einer Erhöhung der Kopienzahl führen. Die Kopienzahl eines Gens, das benachbart zu dem amplifizierbaren Gen positioniert ist, wird sich auch erhöhen.
Amplifizierbare Gene, die verwendet werden können, umfassen DHFR, MDR, ODC, ADA und CAD. Die Mitglieder der positiven selektierbaren Markergengruppe und die der amplifizierbaren Gengruppe überlappen, so dass, in der Theorie, anstatt der Verwendung von zwei Genen, eins für positive Selektion und eins zur Amplifikation, ein Gen für beide Zwecke verwendet werden könnte. Jedoch, da die meisten Zelllinien endogene Kopien dieser amplifizierbaren Gene enthalten, werden die Zellen bereits ein wenig resistent gegen die Selektionsbedingungen sein und die Unterscheidung der Zellen, die transfiziert wurden gegenüber solchen, die keine transfizierte DNA erhalten haben, kann schwierig sein. Somit kann in Fällen, in denen ein amplifizierbares Gen erwünscht ist, ein positives Selektionsgen, welches dominant ist, wie HPH, gpt, neo und tk (in tk-Zellen) auch in dem Konstrukt mit umfasst sein. Für einige Anwendungen kann es möglich oder bevorzugt sein, den amplifizierbaren Marker auszulassen. Zum Beispiel, wenn das Gen von Interesse nicht unbedingt amplifiziert werden muss, wie z. B., wenn die transkriptionelle Aktivierung durch die heterologe DNA-regulatorische Sequenz ohne Amplifikation ausreicht. Auch wenn die homologe Rekombinationseffizienz sehr gering ist, kann es notwendig sein, das amplifizierbare Gen wegzulassen, da das Verhältnis von nicht-homologer DNA zu homologer DNA direkt zur homologen Rekombinationseffizienz in Beziehung steht (Letsou, Genetics, 117: 759–770, 1987). Es ist auch möglich, das positive Selektionsgen zu eliminieren und Zellen ausschließlich durch Screening auf die Herstellung des gewünschten Proteins oder der mRNA hin zu untersuchen. Jedoch ist es in den meisten Fällen bevorzugt, mindestens ein positives Selektionsgen mit zu umfassen.
Region E des Konstrukts ist ein negatives selektierbares Markergen. Solch ein Gen wird nicht in Zellen exprimiert, in welchen das DNA-Konstrukt korrekt durch homologe Rekombination eingefügt wird, aber es wird in Zellen exprimiert, in welchen das DNA-Konstrukt nicht korrekt eingefügt wird, wie durch zufällige Integration. Ein solches Gen ist das Herpes Simplex Virus Thymidinkinasegen (HSVtk). Das HSVtk hat eine geringe re Stringenz für Nukleotide und ist in der Lage, Nukleotidanaloga zu phosphorylieren, die normale Säugetierzellen normalerweise nicht phosphorylieren können. Wenn das HSVtk in den Zellen vorhanden ist, werden Nukleotidanaloga wie Acyclovir oder Gancyclovir phosphoryliert und in die DNA der Wirtszelle eingebaut, wodurch die Zelle getötet wird. Das Vorhandensein des negativen selektierbaren Markergens ermöglicht es einem, die positive-negative Selektion für eine homologe Rekombination, wie sie durch Mansour et al. (Nature, 336: 348–352, 1988) beschrieben wird, zu verwenden. Capecchi verwendet eine Strategie, welche den Vorteil der verschiedenen Modi der Integration in Anspruch nimmt, die vorkommen, wenn linearisierte Vektor-DNA durch homologe Rekombination eingefügt wird im Vergleich zu dem Fall, in dem sie durch zufällige Integration eingefügt wird. Wenn die Vektor-DNA zufällig eingefügt wird, wird der Großteil der Einfügungen über die Enden eingefügt (Folger et al., Mol. Cell. Biol., 2: 1372–1387, 1982; Roth et al., Mol. Cell. Biol., 5: 2599–2607, 1985; und Thomas et al., Cell, 44: 419–428, 1986). Auf der anderen Seite, wenn der Vektor durch homologe Rekombination eingefügt wird, wird er durch die Homologieregionen rekombinieren, was den Verlust von Sequenzen außerhalb dieser Regionen bewirkt.
Unter Verwendung des in 1 gezeigten Konstrukts als Beispiel wird der Modus der Integration für die homologe Rekombination im Vergleich zur zufälligen Integration in den 2A und 2B gezeigt. Im Falle der nicht-homologen Rekombination (2A) wird der Vektor über die Enden des Konstrukts eingefügt. Dieses ermöglicht es der Region E, in diesem Fall dem HSVtk-Gen, in das Genom eingefügt zu werden. Jedoch geht das HSVtk-Gen verloren, wenn homologe Rekombination vorkommt (2B). Die erste Runde der Selektion verwendet das geeignete Medikament oder Bedingungen für positive Selektion, die in dem Konstrukt vorhanden sind. Zellen, die durch homologe Rekombination oder zufällige Rekombination integrierte DNA aufweisen, werden diese Runde der Selektion überleben. Die überlebenden Zellen werden dann einem Medikament wie Gancyclovir ausgesetzt, welches all diese Zellen töten wird, die das HSVtk-Gen enthalten. In diesem Fall enthalten die meisten der Zellen, in denen der Vektor durch eine zufällige Einfügung integriert wird, das HSVtk-Gen und werden durch das Medikament getötet, während solche, in denen der Vektor durch homologe Rekombination integriert wurde, das HSVtk-Gen verloren haben und überleben. Dies ermöglicht die Eliminierung der meisten der Zellen, die zufällig integrierte DNA enthalten, was den größten Teil der überlebenden Zellen übrig lässt, die DNA enthalten, welche durch ho mologe Rekombination integriert wurde. Dieses erleichtert die Identifizierung des korrekten Identifikationsvorgangs erheblich.
Der negative Selektionsschritt kann, falls notwenig, auch eliminiert werden. Dieses setzt voraus, dass der Untersuchungsschritt arbeitsintensiver wird und die Notwendigkeit von Techniken, wie der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) oder der immunologischen Untersuchung, besteht.
Die sechste Region (F) enthält das DNA-regulatorische Segment, das verwendet werden wird, um das Gen von Interesse transkriptionell aktiv zu machen. Das geeignete DNA-regulatorische Segment wird abhängig vom zu verwendenden Zelltyp ausgewählt. Das vorzugsweise zu verwendende regulatorische Segment ist eines, von dem bekannt ist, dass es die Expression eines gegebenen Gens in einer differenzierten Wirtszelllinie unterstützt. Zum Beispiel, wenn die Wirtszelllinie aus Hypophysenzellen besteht, welche natürlicherweise Proteine wie Wachstumshormone und Prolactin exprimieren, dann kann der Promotor für jedes dieser Gene als DNA-regulatorisches Element F verwendet werden. Wenn dieser gemäß der vorliegenden Erfindung eingefügt wird, wird das regulatorische Segment operativ an das normalerweise transkriptionell stille Gen von Interesse gebunden sein und wird die Transkription und/oder Expression des Gens in der Wirtszelllinie stimulieren. Auch als promisköse DNA-regulatorische Segmente sind solche verwendbar, die in mehreren Zelltypen funktionieren, wie der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-Promotor. Solange das regulatorische Segment die Transkription und/oder Expression stimuliert oder induziert werden kann, die Transkription und/oder Expression des Gens von Interesse zu stimulieren, nachdem es in die Wirtszelllinie eingeführt wurde, um operativ an das Gen von Interesse mittels der vorliegenden Erfindung gebunden zu sein, kann es in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wenn das regulatorische Segment F mit dem Zielsegment A verbunden wird, ist es wichtig, dass kein Start-Codon aus Versehen in die Sequenz eingeführt wird, da ein solches das Leseraster des Gens, von dem es wünschenswert ist, dass es exprimiert wird, verändern könnte. Natürlich muss das Konstrukt so konstruiert und eingefügt werden, dass das regulatorische Segment F operativ mit dem Gen von Interesse verbunden ist.
Das DNA-regulatorische Segment, die Region F, muss nicht in den Fällen vorhanden sein, in denen es wünschenswert ist, die Transkription eines Gens zu verstärken oder zu amplifizieren, welches bereits in der Zelllinie von Interesse exprimiert wird, entweder weil es natürlich in der Zelllinie exprimiert wird oder weil die Zelllinie zuvor in ihrer DNA manipuliert wurde, um eine solche Expression zu bewirken. In solchen Fällen wird das Einfügen eines amplifizierbaren Gens, der Region D, vorzugsweise mit dem positiven selektierbaren Markergen, der Region C, und optional auch mit einem negativen selektierbaren Markergen, der Region E, ausreichen, um die Kopienzahl des Gens von Interesse zu erhöhen und somit die Gesamtmenge der Transkription zu verstärken.
Alternativ dazu kann ein neues regulatorisches Segment, Region F, das inhärent eine erhöhte (oder anderweitig veränderte) Transkriptionsgeschwindigkeit im Vergleich zu der existierenden regulatorischen Region für das Gen von Interesse unterstützt, mit umfasst sein, um die Transkription des existierenden exprimierten Gens von Interesse weiter zu verstärken. Solche neuen regulatorischen Segmente könnten Promotor oder Verstärker umfassen, welche die Transkriptionseffizienz verbessern.
Regionen C', D' und E' sind Promotorregionen, die verwendet werden, um die Gene jeweils in den Regionen C, D und E voranzutreiben. Diese Promotor sind transkriptionell in den gewählten Zelllinien aktiv und können zu dem Promotor in Region F gleich oder verschieden sein, der verwendet wird, um das endogene Gen von Interesse voranzutreiben. Die spezifische Richtung der Transkription, die in 1 spezifiziert wird, ist nicht kritisch. Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet können jegliche geeignete Platzierung der Gene C, D und E sowie ihrer Promotor C', D' und E' bestimmen, so dass die Promotoren die Expression ihrer assoziierten Gene ohne gleichzeitig die Expression des Gens von Interesse oder jegliche andere Gene des Konstrukts zu unterbrechen stimulieren werden.
Die vorliegende Erfindung kann durch die Bezugnahme auf die Aktivierung der Ratten Thyrotropin-Beta-Untereinheit (TSHβ) in GH₁ (ATCC CCL 82), GH₃ (ATCC CCL 82.1) oder GH₄ CI-Zelllinien (GH) illustriert werden. GH-Zelllinien sind aus einem durch Strahlung induzierten Hypophysentumor in Ratten abgeleitet, der als MtT/W5 (Takemoto, Cancer Res., 22: 917, 1962) bezeichnet wird, und dahingehend adaptiert, durch Tashjian et al., Endocrinology, 82: 342–352, 1968 in Kultur zu wachsen. Diese Zelllinien können subkloniert werden und auf deren Fähigkeit hin untersucht werden, Wachstumshormon und TSHβ herzustellen. Solch eine Untersuchung kann vorzugsweise mittels ei ner Northern-Blot-Analyse durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob mRNA für das Rattenwachstumshormongen vorhanden ist und zu etablieren, dass keine mRNA für das hergestellte TSHβ-Gen vorhanden ist. Die Zelllinien können auch durch Southern-Analyse untersucht werden, um zu bestimmen, dass mindestens eine Kopie des TSHβ-Gens innerhalb des Genoms vorhanden ist. Es werden nur die GH-Zelllinien verwendet, die Wachstumshormon und nicht TSHβ herstellen, aber eine Kopie des TSHβ-Gens enthalten.
Der spezifische homologe Rekombinationsvektor zur Verwendung in GH-Zellen kann auf folgende Weise hergestellt werden (3). Region A kann aus der 5'-stromaufwärts gelegenen nicht-translatierten Region des TSHβ-Gens bestehen, das durch das HindIII-Fragment definiert ist, welches sich von –74 bis –2785 erstreckt, enthalten und die Region B kann das DNA-Fragment enthalten, die sich von der –2785 HindIII-Schnittstelle bis zu einer NcoI-Schnittstelle erstreckt, die ungefähr 2,1 kB weiter stromaufwärts gelegen ist, wie sie von Carr et al. (J. Biol. Chem., 262: 981–987, 1987) und Croyle et al. (DNA, 5: 299–304, 1986) beschrieben wird. Das positive Selektionsgen (Region C) kann ein 1067 Bp-BgIII-SmaI-Fragment sein, das aus dem Plasmid pSV2neo abgeleitet ist (ATCC Nr. 37,149) (Southern et al., J. Mol. Appl., Gen., 1: 327–341, 1982). Das neo-Gen kann durch den Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-Promotor (Region C') angetrieben werden, welcher aus dem NdeI-HindIII-Fragment aus dem Plasmid pRSVcat (ATCC Nr. 37,152) (Gorman et al., PNAS, 79: 6777–6781, 1982) abgeleitet ist. In diesem Beispiel muss kein amplifizierter Marker verwendet werden und daher wird keine Region D benötigt, um die Effizienz der homologen Rekombination zu optimieren. Die Effizienz steht invers in Bezug zu dem Teil der nicht-homologen zu den homologen Sequenzen, die in dem Konstrukt vorhanden sind (Letsou et al., Genetics, 117: 759–770, 1987). Region E oder das negative Selektionsgen kann aus dem HSVtk-Gen bestehen, welches ein 2 kB Xho-Fragment ist, das aus dem Plasmid pMCITK-Plasmid (Capecchi et al., Nature, 336: 348–352, 1988) erhalten wurde. Das HSVtk-Gen in diesem Konstrukt kann durch den Polyoma-Virus-Promotor und Verstärker (Region E'), wie er durch Thomas et al. (Cell, 51: 503–512, 1987) konstruiert wurde, angetrieben werden. In einem zweiten DNA-Konstrukt kann der Polyoma-Promotor durch den oben beschriebenen RSV-Promotor ersetzt werden. Die zur Aktivierung des TSHβ-Gens verwendete DNA-regulatorische Sequenz kann entweder der RSV-Promotor oder der Rattenwachstums-Promotor sein. Der Rattenwachstums-Promotor besteht aus dem SacI-EcoRI-Fragment, das aus dem Plasmid pRGH237CAT erhalten wurde (Larson et al., PNAS, 83: 8283–8287, 1986). Der RSV-Promotor hat den Vorteil, dass er in anderen Zelllinien außer GH-Zellen verwendbar ist, während von dem GH-Promotor bekannt ist, dass er in GH-Zellen aktiv ist und spezifisch induziert werden kann (Brent et al., J. Biol. Chem., 264: 178–182, 1989). Der Rattenwachstumshormon-Promotor und der RSV-Promotor können in der Position F in separaten Konstrukten eingefügt werden.
Nach Transfektion des oben genannten Konstrukts in eine GH-Zelllinie können die Zellen in Medien wachsen gelassen werden, die G418 enthalten. Dieses wird es nur solchen Zellen zu wachsen erlauben, die in ihrem Genom entweder durch homologe Rekombination oder zufällige Integration integrierte Plasmid-DNA aufweisen. Die überlebenden Zellen können in Medien wachsen gelassen werden, die Gancyclovir enthalten. Die Mehrzahl der Zellen, die diese Selektionsrunde überleben, werden solche sein, in denen die Vektorplasmid-DNA durch homologe Rekombination integriert ist. Diese Zellen können untersucht werden, um nachzuweisen, dass sie mRNA produzieren, die mit dem TSHβ-Gen korrespondiert und dass sie das TSHβ-Protein produzieren. Die genomische DNA kann auch um die Gegend der Einfügung des heterologen Promotors sequenziert werden, um sicherzustellen, dass der korrektere Kombinationsvorgang stattfunden hat.
Beispiel – Aktivierung des TSHβ-Gens in Ratten-Hypophysenzellen
Unter Verwendung des folgenden Protokolls wurde die Thyrotropin-Beta-Untereinheit-(TSHβ)-Gentranskription, welche normalerweise nicht in der Ratten-GH₃-Hypophysen-Zelllinie vorkommt, in solchen Zellen durch die Verwendung des Verfahrens der homologen Rekombination aktiviert, um ein aktivierendes Element stromaufwärts auf die TSHβ-kodierende Region zu zielen. Von dem Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-Promoter ist bekannt, dass er effizient in GH₃-Zellen funktioniert (Christian Nelson et al., Nature, 322: 557–562 (1986); Zheng-Sheng Ye et al., The Journal of Biological Chemistry, 263: 7821–7829 (1988)) und er wurde daher als aktivierendes Element ausgewählt. Es wurde ein Plasmidvektor konstruiert, welcher das RSV-aktivierende Element enthält, Teile der 5'-flankierenden Region des TSHβ-Genlocus und einen selektierbaren Medikamentenmarker, Aminoglycosid-Phosphotransferasegen (NEO) zur Isolierung der transfizierten Zellpopulationen. Ribonukleinsäure (RNA) wurde aus gesammelten Medi kamenten resistenten GH₃-Zellpopulationen gesammelt und in komplementäre Deoxyribonukleinsäure (cDNA) umgewandelt. Die cDNA wurde dann durch die Technik der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) auf die Gegenwart von TSHβ-cDNA untersucht. Die Konstruktion der homologen Rekombinationsvektoren und der Kontrollvektoren wird unten zusammen mit den experimentellen Prozeduren und Ergebnissen dargestellt.
PLASMIDKONSTRUKTION
Homologer Rekombinations (HR) – Gerüstvektor (pRSVCATNEO)
Der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-Promotor wird aus dem Plasmid pRSVCAT (Cornelia M. Gorman et al., Proceedings of the National Academy of Science, 79: 6777–6781 (1982)) (5) durch Isolieren des 580 Basen-Paar (Bp) NdeI-HindIII-Fragments abgeleitet, das die funktionelle Promotoreinheit enthält. Die Enden dieses Fragments wurden stumpfendig unter Verwendung eines DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragments und XbaI-Linkern gemacht, die an die stumpfen Enden ligiert wurden. Nach Verdau mit XbaI-Restriktions-Endonuklease und Gelaufreinigung wurde das resultierende Fragment in die XbaI-Schnittstelle von pUC18 ligiert. Eine bakterielle Kolonie, die ein Plasmid mit der RSV-Einfügung in der in 6 gezeigten Orientierung aufweist, wurde als pRSV bezeichnet. Das Aminoglycosid-Phosphotransferasegen (NEO) wurde aus pSV2NEO (P. J. Southern et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 1: 327–341 (1982)) durch das Isolieren des BgIII- und BamHI-Fragments (7) und Ligieren dieses Fragments in die BamHI-Schnittstelle von pRSV (6) kloniert. Ein Plasmid, das das NEO-Gen in der in 8 gezeigten Orientierung enthält, wurde ausgewählt und als pRSVNEOBAM bezeichnet. pRSVNEOBAM wurde mit SmaI verdaut und das 4328 Bp-Fragment, das die RSV-Promotorregion enthält, die Mehrheit des NEO-Gens und pUC18 wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Die Smal-Enden dieses Fragments wurden mit XhoI linkerverbunden, mit XhoI-Restriktionsenzym gespalten und das Plasmid durch Ligation rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid wird in 9 gezeigt und wird pRSVNEO genannt. Dieser letzte Klonierungsschritt resultierte in der Deletion eines 786-Bp-Fragments aus dem 3'-Ende des NEO-Fragments, das nicht für seine funktionale Expression notwendig ist. Diese Konstruktion ergibt ein Plasmid, in welchem das NEO-Gen transkriptionell durch den RSV-Promotor angetrieben wird.
Danach wurde die NdeI-Schnittstelle, die 5' vom RSV-Promotor in pRSVCAT (5) lokalisiert ist, in eine SalI-Schnittstelle umgewandelt. Dieses wurde durch das Verdauen von pRSVCAT mit Ndel, das Auffüllen in den Enden unter Verwendung von DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment und Ligieren von SalI-Linkern an die resultierenden stumpfen Enden erreicht. Die Linker wurden zur Vollständigkeit mit SalI verdaut und das Plasmid durch Ligieren rezirkularisiert. In die neu konstruierte SalI-Schnittstelle wurde das SalI-XhoI-Fragment aus pRSVNEO (9) einkloniert, das den RSV-Promoter und das NEO-Gen enthält. Es wurde ein Plasmid mit dem RSV-Promotor und dem NEO-Fragment, das wie in 10 gezeigt orientiert war, isoliert und pRSVCATNEO genannt. Dieses Plasmid war, wenn es in GH₃-Zellen transfiziert wurde, in der Lage, G418 Resistenz auf solche Zellen zu übertragen, die die Fähigkeit des RSV-Promotors aufzeigen, die Transkription des NEO-Gens voranzutreiben und die Fähigkeit dieser RNA in ein funktionelles Protein translatiert zu werden (Daten werden nicht gezeigt). Gesamt-RNA aus den oben genannten stabilen Transfektanten wurde durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) analysiert, um zu bestimmen, ob das CAT-Gen transkribiert wurde. PCR-Ergebnisse zeigten, dass das CAT-Gen tatsächlich in allen getesteten G418 resistenten Kolonien (Daten werden nicht gezeigt) transkribiert wird, was anzeigt, dass der RSV-Promotor 5' von dem CAT-Gen in der Lage war, die Transkription eines Gens anzutreiben, dass 3' davon lokalisiert war. Dies ist wichtig, da dieser RSV-Promotor für das Vorantreiben der Transkription des TSHβ-Gens verantwortlich ist, wenn der TSHβ-HR-Vektor, der unten beschrieben wird, durch homologe Rekombination in das GH₃-Genom integriert.
TSHβ-HR-Vektor
Es wurde ein Vektor, der in der Lage ist, in das GH₃-Genom durch homologe Rekombination zu integrieren, durch das Einfügen von zwei Bereichen der 5'-flankierenden Regionen der Thyrotropin-Beta-Untereinheit (TSHβ) -Gen in die einzelne Sall und HindIII-Schnittstelle, die in pRSVCATNEO enthalten ist (10), hergestellt. Eine Ratten-Milzgenomische Bibliothek, die Abschnitte von 15 Kilobasen (kB) oder mehr enthielt, die in Lamda DASH kloniert waren, wurde von Stratagene, San Diego, CA, erworben. Unter Verwendung von Standardprotokollen (Current Protocols in Molecolar Biology, Seiten 1.9.1–1.13.6, 6.1.1–6.4.10) wurde ein 15,3 kB-Klon des genomischen Ratten – TSHβ- Gens isoliert, der 9 kB der Sequenz 5' vom ersten Exon umfasst, isoliert. Das 15,3 kB-Fragment bestand aus zwei XbaI-Fragmenten, einem 10,6 kB-Fragment, das mit dem 5'-Ende des 15,3 kB-Fragments korrespondiert, und einem 4,7 kB-Stück, der zur 3'-Region des 15,3 kB-Fragments (11) korrespondiert. Beide dieser großen Xbal-Fragmente wurden in pUC18 subkloniert und Plasmide, die diese Einfügungen in beiden Orientierungen enthalten, wurden isoliert. Das 2,3 kB XbaI-HindIII-Fragment, das in dem 4,7 kB XbaI-Fragment (11) enthalten war, wurde aufgereinigt und die XbaI-Schnittstelle von diesem Fragment wurde in eine HindIII-Schnittstelle durch Auffüllen an den Enden mit Klenow-Fragment und Ligierern mit HindIII-Linkern umgewandelt. Dieses Fragment wurde in die einzelne HindIII-Schnittstelle, die in pRSVCATNEO enthalten ist (10), ligiert. Ein Isolat, das mit einem Plasmid mit dem 2,3 kB-Insert in der korrekten Orientierung korrespondiert, wie es in 12 gezeigt wird, wurde mit Namen pRSVCATNEOTSHβ3 bezeichnet.
Das subklonierte 10,6 kB XbaI-Fragment aus dem Ratten-TSHβ-Klon (11) wurde isoliert und die XbaI-Enden wurden in SalI-Schnittstellen durch das Stumpfenden des Fragments mit DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment und das Verbinden von SalI-Linkern umgewandelt. Dieses 10,6 kB SalI-Fragment wurde dann in die SalI-Schnittstelle von pRSVCATNEOSHB3 kloniert (12). Ein Plasmid, das das Insert in der korrekten Orientierung enthält, wurde identifiziert und pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI genannt (13). Das letztere Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer ATCC 40933 erhalten. Für den Zweck dieser Hinterlegung wurde das Plasmid in pHRTSH umbenannt. Diese Hinterlegung wurde gemäß all den Voraussetzungen des Budapester Vertrags gemacht.
ZELLLINIE
GH₃-Zellen sind eine subklonierte Population von MtT/W5, die aus einem durch Strahlung induzierten Hypophysentumor in Ratten abgeleitet wurden (B. K. Takaemoto, Cancer Research, 22: 917 (1962)) und wurden dahingehend adaptiert, in Kultur durch Tashjian et al., Endocrinology, 82: 342–352 (1968) zu wachsen. Die GH₃-Zellen wurden von der American Type Culture Collection Zellbank erhalten und werden in Kultur durch Wachstum in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 15% Pferdeserum (HS) + 2,5% fetales Rinderserum (FBS) + 1% L-Glutamin (GH₃-Medien) bei 37°C in 5% CO₂ aufbewahrt.
DNA-PRÄPARATION
Herstellung von Plasmid-DNA in großem Maßstab
Alle für stabile Transfektionen verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens für Plasmid-DNA-Aufreinigung im Großmaßstab, wie sie in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Seiten 1.7.1–1.7.2 beschrieben wird, aufgereinigt. Durch das alkalische Lyseverfahren isolierte DNA wurde des Weiteren durch Doppelbanden in einem Cäsiumchlorid-Gradienten aufgereinigt, wie es in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Seiten 1.7.5–1.7.7 beschrieben wird.
Vor der Transfektion wurden die HR-Vektoren entweder mit AatII oder ApaI verdaut. ApaI wurde verwendet, um das Kontrollplasmid pRSVCATNEO zu linearisieren und AatII, um das HR-Plasmid pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI zu linearisieren. Die Position der Schnittstellen von ApaI und AatII sind jeweils in 10 und 13 zu sehen. Nach Verdau mit dem geeigneten Restriktionsenzym wurde die Reaktion Phenol-/Chloroformextrahiert, Chloroform-extrahiert, Ethanol gefällt und einmal mit 70% Ethanol gewaschen. Die Plasmide wurden dann in sterilem deonisierten Wasser (dH₂O) auf eine Konzentration von 1 Mikrogramm/Mikroliter (μg/μl) resuspendiert, wie durch Absorption bei OD₂₆₀ bestimmt wurde. In einem Versuch, die Transkriptionseffizienz und/oder das Verhältnis von homologen Rekombinationspositiven zu solchen, die zufällig integriert wurden, zu erhöhen, wurde pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI mit ApaI verdaut. Verdau mit ApaI schneidet an drei verschiedenen Schnittstellen in pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI und entfernt alle Regionen des Vektors außer denen, die zur homologen Rekombination notwendig sind (13). Nach Verdau mit ApaI wurde die Reaktion elektrophoretisch auf 0,8% Agarosegel behandelt und die oberste Bande, die mit dem 10992 Bp-Fragment korrespondiert, die die zwei 5'-flankierenden Regionen des TSHβ-Gens enthält, die RSV-Promotor – NEO-Region und den TSHβ-Gen-aktivierenden RSV-Promotor, wurde aus dem Gel durch Elektroelution in Dialyseschläuche isoliert. Die elektroeluierte DNA wurde weiter unter Verwendung einer Elutip-Minisäule (Schleicher und Schuell) unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Standardprotokolls aufgereinigt. Die DNA wurde aus der Säule eluiert, Ethanol gefällt, mit 70% Ethanol gewaschen und auf eine Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert.
STABILE TRANSFEKTIONEN Kalziumohosphat-Transfektion
48 Stunden vor der Transfektion wurden 3 × 10⁶ GH₃-Zellen auf 10 Zentimeter (cm)-Platten ausplattiert. Zu jeder Platte wurden 10 μg Vektor-DNA zusammen mit 30 μg ultraschallbehandelter Lachs-Sperma-DNA zu 0,5 Milliliter (ml) Transfektionspuffer hinzugefügt. Der Transfektionspuffer wurde durch das Kombinieren von 4 g NaCl, 0,185 g KCl, 0,05 g Na₂HPO₄, 0,5 g Dextrose, 2,5 g HEPES und dH₂O auf ein Endvolumen von 500 ml und Einstellen des pH auf 7,5 hergestellt. 31 μl 2 molares (M) CaCl₂ wurden zu den 0,5 ml DNA + Transfektionspuffer hinzugefügt und im Vortex gemischt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur für 45 Minuten stehen gelassen. Wenn der DNA-CaCl₂-Transfektionspuffer fertig war, wurde das GH₃-Medium von den GH₃-Zellen entfernt und der DNA-CaCl₂-Transfektionspuffer wurde über die Zellen geschichtet. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen gelassen. Nach 20 Minuten wurden 5 ml GH₃-Medium hinzugefügt und die Platten wurden bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Absaugen des Mediums geschockt und das Hinzufügen für 3,5 Minuten von 5 ml frischem Transfektionspuffer, der 15% Glycerin enthält. Die Zellen wurden 2 × mit PBS gespült und mit 10 ml GH₃-Medium gefüttert. 48 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium entfernt und 10 ml GH₃-Medium, das 400 μg/ml G418 enthält, wurde hinzugefügt.
Elektroporation
Eine Elektroporation wurde unter Verwendung eines BTX 300 Transfektors mit 3,5 Millimeter (mm) Abstandselektroden durchgeführt. 1 × 10⁷ GH₃-Zellen, die in der logarithmischen Phase wachsen, wurden aus ihren Platten durch Trypsinierung entfernt, durch Zentrifugation pelletiert und einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 1,0 ml PBS resuspendiert und auf 2,9 ml Ultra-UV-Wegwert-Küvetten (American Scientific Products) auf Eis transferiert. 10 μg der DNA wurde zu den Zellen hinzugefügt, gemischt und für 5 Minuten zurück auf Eis platziert. Nach 5 Minuten wurden die Elektroden in die Kammer platziert und die Zellen wurden bei einer Einstellung von 750 Mikrofarad mit einem 200 Voltpuls elektroporiert. Die Küvette wurde dann für 10 Minuten auf Eis zurückgestellt. Die Zellen wurden aus der Küvette auf 9 ml GH₃-Medium transferiert, das 1 Penicillin und 1% Streptomycin bei Raumtemperatur in einer 15 ml konischen Röhrchen enthält und für 10 Minuten stehen gelassen. Die gesamte Elektroporation von 1 × 10⁷- Zellen wurde auf drei 10 cm-Platten transferiert, was ungefähr 3 × 10⁶-Zellen pro Platte ergibt. Nach 48 Stunden wurde GH₃-Medium hinzugefügt, das 400 μg/ml G418 enthält.
Transfektion von GH₃-Zellen mit pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (AatII-geschnitten), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaI-geschnitten) und pRSVCATNEO (ApaI-geschnitten)
pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (AatII-geschnitten) –, pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaI-geschnitten) – und pRSVCATNEO (ApaI-geschnitten) – Plasmide wurden in GH₃-Zellen zusammen mit einer Nicht-DNA-Kontrolle sowohl unter Verwendung des Kalzium-Phosphat-Protokolls wie auch des Elektroporations-Protokolls transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen unter G418-Selektion gestellt. Ungefähr 14 bis 21 Tage später wurden die Kolonien für das Auge auf 10 cm-Platten sichtbar und wurden gezählt. In allen der Nicht-DNA-Kontrollen gab es keine sichtbaren Kolonien, was zeigt, dass die G418-Selektion funktionierte und dass das Vorhandensein eines Plasmids, das die RSV-NEO-Region enthält, notwendig war, um eine G418-Resistenz zu vermitteln. An diesem Punkt wurden Kolonien durch das Isolieren von Regionen auf der 10 cm-Platte mit 17 Millimeter weiten Klonierungsringen aufgenommen und gesammelt. Diese großen Klonierungsringe umfassten abhängig von der Dichte der Kolonien pro Platte 10 bis 70 Kolonien und erlaubten es, die GH₃-Zellen in dieser isolierten Region zu entfernen und zur gleichen Zeit durch Trypsinierung zu sammeln. Die trypsinierten Kolonien in jedem Ring wurden auf Platten mit 6 Vertiefungen transferiert und in GH₃-Medien, die G418 enthalten, wachsen gelassen. Nach dem Erreichen von 70% bis 80% Konfluenz wurden 80000 Zellen auf eine Platte mit 24 Vertiefungen transferiert und die verbleibenden Zellen für weitere Untersuchungen zu einem späteren Zeitpunkt kryopreserviert. Die Zellen in den Platten mit 24 Vertiefungen wurden wachsen gelassen bis sie 50 bis 80% Konfluenz erreichten. Gesamt-RNA wurde dann aus diesen GH₃-Zellen durch das folgende Verfahren geerntet.
RNA-ISOLIERUNG AUS TRANSFIZIERTEN GH₃-ZELLEN, DIE IN PLATTEN MIT 24 VERTIEFUNGEN WACHSEN GELASSEN WURDEN
Das Folgende ist eine Modifikation des Protokolls, das durch Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156–159 (1987) beschrieben wurde. Die Medien, die die GH₃-Zellen in den Platten mit 24 Vertiefungen bedecken, wurden entfernt und die Zellen wurden mit 1 ml PBS gewaschen. 1 ml GTC-Lösung wurde hinzugefügt und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. GTC-Lösung wurde durch das Auflösen von 250 g Guanidium-Thiocyanat (Fluka) in 293 ml dH₂O und anschließendes Hinzufügen von 17,6 ml 0,75 M Natriumcitrat pH 7,0 und 26,4 ml 10% Sarcosyl (L-Laurylsarcosin) hergestellt. Kurz vor der Verwendung wurden 360 μl β-Mercaptoethanol pro 50 ml GTC-Lösung hinzugefügt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde 1 ml GTC-Zelllysat zu einem Sarstedt 55.518 Schnappverschlussröhrchen, das 2 ml GTC-Lösung enthält, transferiert. Zu jedem Röhrchen wurden 300 μl 2 M Natriumacetat pH 4,0 hinzugefügt und das Röhrchen wurde Vortex-vermischt. Danach wurden 3 ml dH₂O gesättigtes Phenol hinzugefügt und die Röhrchen wiederum Vortex-vermischt. Zu jedem Röhrchen wurden 600 μl Chloroform : Isoamylalkohol (49 : 1) hinzugefügt und das Röhrchen wurde mit der Hand für 10 Sekunden geschüttelt und für 15 Minuten auf Eis gestellt. Die Röhrchen wurden dann auf einen Sorval RC-5B unter Verwendung eines SM24-Rotors bei 8000 Umdrehungen pro Minute (Upm) für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde auf ein frisches Sarstedt-Röhrchen transferiert, das 3 ml Isopropanol enthält und bei –20°C für 1 Stunde weggestellt. Nach 1 Stunde wurden die Röhrchen in einem Sorval RC-5B, unter Verwendung eines SM24-Rotors, bei 8000 Upm für 20 Minuten bei 4 C zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Pellets in 500 μl GTC-Lösung resuspendiert. Die resuspendierte RNA wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen transferiert, zu dem 500 μl Isopropanol hinzugefügt wurden. Die Röhrchen wurden dann wiederum 1 Stunde bei –20°C abgestellt. Die Eppendorf-Röhrchen wurden für 5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol zweimal gewaschen und trocknen gelassen, bis der Ethanol vollständig verdunstet war. Das Pellet wurde in 20 μl Diethylpyrocarbonat (depc) – behandeltem Wasser resuspendiert und auf 65°C für 5 Minuten erwärmt. Diese RNA wurde dann verwendet, um cDNA in einer der beiden unten beschriebenen Prozeduren herzustellen.
cDNA-REAKTIONEN
Verfahren 1
Der erste Strang cDNA wurde aus 2,5–6,0 Mikrolitern Gesamt-RNA (ungefähr 0,5–6 Mikrogramm) in einem Reaktionsvolumen von 10 – 20 Mikrolitern synthetisiert. Die Gesamt-RNA wurde durch das oben beschriebene Extraktionsverfahren erhalten und wurde für 5–10 Minuten bei 70°C denaturiert und schnell auf Eis abgekühlt, bevor die Reaktionskomponenten hinzugefügt wurden. Die Reaktionsbedingungen waren 50 millimolar (mM) Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM jeweils von dCTP, dATP, dGTP und dTTP (Pharmacia), 40 mM KCl, 500 Einheiten/ml RNasin (Promega Biotech), 85 μg/ml Oligo (dT)_12–18 (Collaborative Research, Inc.) und 15000–20000 Einheiten/ml Moloney murine Leukämievirus – Reverse Transkriptase (Bethesda Research Laboratories), die bei 37°C für 60 Minuten inkubiert wurden. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von EDTA auf 40 mM terminiert und die Nukleinsäure wurde durch Hinzufügen von Natriumacetat in einer Konzentration auf 0,3 M und zwei Volumen Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde sich bei 0°C für 30 Minuten bilden gelassen und wurde durch Zentrifugation in einer Mikrofuge bei 14000 Upm für 30 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in depc-behandeltem Wasser auf ein Volumen von 15–25 Mikroliter resuspendiert.
Verfahren 2
Die Bedingungen zur Synthese des ersten Stranges der cDNA aus RNA wurden nach Carol A. Brenner et al., BioTechniques, Band 7, Nr. 10, Seiten 1096–1103 (1989) adaptiert. 1 ml Gesamt-RNA aus der oben beschriebenen RNA-Herstellungsprozedur wurden zu 9 μl Reaktionspuffer in einem 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen hinzugefügt. Der Reaktionspuffer bestand aus 200 Einheiten Moloney muriner Leukämievirus – Reverse-Transkriptase (MMLVRT, Bethesda Resesarch Labs) und einer Endkonzentration der folgenden Reagenzien: 70 mM Tris-HCl, pH 8,8, 40 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM von jedem dNTP, 4 mM MgCl₂ und 0,45 OD₂₆₀-Einheiten von zufälligen Hexameren (Pharmacia). Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und dann für 1 Stunde bei 42°C abgestellt. Nach einer Stunde wurden die Röhrchen auf 90°C für 1 Minute erhitzt, um die MMLVRT zu deaktivieren und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) – AMPLIFIKATION VON RNA AUS GH₃-ZELLEN
Die folgenden Primer wurden verwendet, um durch PCR TSHβ-cDNA zu amplifizieren, die aus RNA-Transkripten synthetisiert worden waren, die durch GH₃-Zellen als Ergebnis der HR-Plasmide hergestellt wurden, die das endogene TSHβ-Gen durch homologe Rekombination aktivieren.
14 zeigt die Region des TSHβ-Gens, zu der jeder Primer korrespondiert.
PCR-REAKTIONSBEDINGUNGEN
Alle PCR-Reaktionen wurden in einem Ericomp Twinblock Thermocycler durchgeführt. Wenn die PCR-Amplifikation mit cDNA durchgeführt wurde, die durch Verfahren 2 hergestellt wurde, wurden 40 μl zusätzliche Reaktionsmischung direkt zu den 10 μl der cDNA-Reaktion hinzugefügt, was das Gesamtvolumen auf 50 μl bringt. Die Endkonzentrationen der Reagenzien in den 50 μl betrugen 70 mM Tris-HCl, pH 8,8, 40 mM KCl, 0,1 Triton X-100, 2,25 Einheiten Taq-Polymerase (Pharmacia), 0,2 Mikromolar (μM) von jedem Primer, 200 μM von jedem dNTP und 0,8 mM MgCl₂.
Wenn PCR mit cDNA durchgeführt wurde, die durch das oben genannte Verfahren 1 hergestellt wurde, wurden 5 bis 10 μl der resuspendierten cDNA zu 40 bis 45 μl hinzugefügt, die die Endkonzentrationen der folgenden Komponenten enthalten: 70 mM Tris-HCl, pH 8,8, 40 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,25 Einheiten Taq-Polymerase, 0,2 μM von jedem Primer, 200 μM von jedem dNTP und 0,8 mM MgCl₂.
Die Reaktionen wurden dann den folgenden PCR-Zyklen ausgesetzt.
1 Minute bei 94 °C.
30 Sekunden bei 55 °C.
2 Minuten bei 72 °C.
Die oben genannten Zyklen wurden 30 bis 40 mal wiederholt. 10 μl von jeder Reaktionsmischung wurden auf einem 6% Polyacrylamidgel laufen gelassen und auf die Gegenwart eines 247-Bp-PCR-Fragments hin untersucht, welches die Gegenwart von korrekt gespleisster mRNA für TSHβ anzeigen würde.
PCR-ERGEBNISSE ZUR AMPLIFIKATION VON TSHβ-RNA AUS GH₃-ZELLEN UND RATTEN-HYPOPHYSEN GESAMT-RNA
Um zu bestimmen, ob GH₃-Zellen normalerweise TSHβ-RNA synthetisieren, wurde cDNA aus nicht-transfizierten GH₃-Zellen sowie cDNA aus Ratten-Hypophysendrüsen den oben genannten PCR-Reaktionsbedingungen ausgesetzt. Die korrekte 247-Bp-Bande, die die Gegenwart von TSHβ-mRNA anzeigt, war in der positiven Kontrolle der Ratten-Hypophysendrüse-Probe sichtbar, aber es war sogar nach 60 Zyklen keine Bande aus der GH₃-Zell-Gesamt-RNA-Probe (Daten werden nicht gezeigt) visualisiert.
TRANSFEKTIONSERGEBNISSE
Die Zahl der G418-resistenten Kolonien, die auf den 10 cm-Platten vorhanden waren, wurden zwischen 14 und 21 Tagen nach der Zugabe von G418 zu dem Medium tabellarisch aufgenommen.
Gesamt-RNA wurde aus Kolonieansammlungen geerntet; die in den Platten mit 24 Vertiefungen enthalten waren, die oben beschrieben wurden. cDNA wurde aus diesen RNA-Zubereitungen hergestellt und einer PCR-Amplifikation ausgesetzt. Die Anzahl der positiven Kolonien, die TSHβ-mRNA herstellt, wurden durch die Gegenwart eines 247-Bp-Fragments bestimmt, das auf einem Polyacrylamidgel visualisiert wurde. Jede der untersuchten Sammelproben erhielt zwischen 10 und 70 Kolonien. Die geschätzte Zahl der Kolonien pro Sammelprobe pro Transfektion wurde verwendet, um die Zahl G418-resistenter GH₃-Zell-Klone abzuschätzen, in denen die TSHβ-Gentranskription aktiviert war. Wenn eine Sammelprobe positiv getestet wurde, wurde angenommen, dass diese eine positive Kolonie repräsentiert, die in dieser bestimmten Sammelprobe vorhanden war.
Diese Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Aktivierung des normalerweise transkriptionell stillen TSHβ-Gens durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung. Während die Zahl der Kolonien, die für TSHβ-Transkription positiv sind, im Vergleich zu der Anzahl von Kolonien, die G418-resistent sind (ungefähr eine von 10³ G418-resistenten Kolonien) klein ist, ist dieses Ergebnis im Allgemeinen konsistent mit den Häufigkeiten, die für andere homologe Rekombinationsexperimente berichtet werden (Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY (1990), Seiten 56–60). Es wird im Allgemeinen beobachtet, dass die homologe Rekombinationsgeschwindigkeit proportional zur Geschwindigkeit der Transkription des gezielten Gens zu sein scheint (M. Frohman und G. Martin, Cell, 56: 145 (1989); S. L. Mansour et al., Nature, 336: 348 (1988)). Es wird betont, dass die Geschwindigkeit, die nachgewiesen wurde, dreimal höher ist als das, was man für eine zufällige Mutation erwarten würde, die das TSHβ-Gen anschaltet.
Um sicherzustellen, dass die Ergebnisse für jede Koloniesammelprobe reproduzierbar waren und dass die Aktivierung der RNA-Transkription stabil war, wurden Koloniesam melproben, die zuvor eingefroren waren und zu den Sammelproben korrespondieren, die positiv in der ersten Untersuchung getestet wurden, aufgetaut und in Kultur expandiert. Die frisch aufgetauten GH₃ positiven Sammelproben wurden in T 25 Gewebekulturgefäßen ausgesät und expandiert, bis die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichten. 80000 Zellen wurden dann in Platten mit 24 Vertiefungen aus jedem Gefäß ausplattiert und wachsen gelassen bis sie 50 bis 70% konfluent waren. RNA wurde aus den Zellen extrahiert, in cDNA umgewandelt und wiederum auf das Vorhandensein von TSHβ-RNA durch das Laufen lassen von 10 μl von jeder PCR-Reaktion auf einem 6% Polyacrylamidgel untersucht. 15 zeigt die Ergebnisse der repräsentativen PCR-Reaktionen aus der zweiten Untersuchung, wie sie auf einem Polyacrylamidgel durch Ethidiumbromid-Färbung und Fluoreszenz visualisiert wurden. Bahnen 1, 2 und 3 enthalten PCR-Reaktionen, die mit cDNA aus GH₃-Zellen laufen gelassen wurden, die zuvor mit pRSVCATNEO transfiziert worden waren. pRSVCATNEO enthält keinerlei Homologieregionen zu TSHβ und ist somit nicht in der Lage, das TSHβ-Gen durch homologe Rekombination zu aktivieren. Wie auf dem Gel in 15 zu sehen ist, gibt es keine Bande, die mit 247-Bp in diesen Banden korrespondiert, was anzeigt, dass das TSHβ-Gen nicht aktiviert ist. Bahn 6 enthält auch eine negative Kontrolle. In dieser Bahn wurden drei Sammelproben aus Proben von GH₃-Zellen verbunden, die mit pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaI-geschnitten) transfiziert worden waren, die aber negativ für die Transkription des TSHβ-Gens in der ersten Untersuchung waren. Die Abwesenheit des 247-Bp-Fragments in Bande 6 zeigt, dass das transfizierte pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaIgeschnitten) Plasmid, das zufällig in das Genom integriert wurde, nicht in der Lage ist, das 247-Bp-TSHβ-PCR-Fragment herzustellen. Bahnen 7, 8, 9 und 10 umfassen PCR-Reaktionen, die mit cDNA, die aus Gesamt- RNA hergestellt wurden, die aus Ratten-Hypophysendrüsen geerntet wurden, durchgeführt wurden, in Mengen pro Reaktion von 25 Nanogramm, 100 Nanogramm, 200 Nanogramm und 400 Nanogramm. Das Vorhandensein der erwarteten 247-Bp-Bande in diesen Bahnen, die aus cDNA hergestellt wurden, die aus einem Rattengewebe hergestellt wurde, das normalerweise TSHβ produziert, zeigt, dass die PCR-Reaktionsbedingungen korrekt optimiert wurden und dass die PCR-Bande, die in Bahnen 4 und 5 erhalten wurde, die homologen Rekombinations-TSHβ-Positiven enthält, von der korrekten Größe ist. Es waren zwei Sammelproben, die mit pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaI-geschnitten) transfiziert waren, in der ersten Untersuchung positiv, ApaI-107 in Bahn 4 und ApaI-136 in Bahn 5, die wiederum auf TSHβ-Genaktivierung positiv getestet wurden, wie durch das Vorhandensein der korrekten TSHβ-PCR-Bande gezeigt wurde, die aus cDNA amplifiziert wurde, die aus Gesamt-RNA-Extrakten hergestellt wurde, aus solchen Sammelproben, die beweisen, dass die Transkription des TSHβ-Gens stabil aktiviert wurde. Das Vorhandensein der Banden bei 247-Bp in den Bahnen 4 und 5, die RNA aus zuvor positiven ApaI-107 und ApaI-136 enthalten und die Abwesenheit von Banden in den negativen Kontrollen von pRSVCATNEO-transfizierten GH₃-Zellen in Bahnen 1–3 und die pRSVCATNEOTSHβ3-5XbaI (ApaI-geschnittenen) Negativen in Bahn 6 zeigten, dass die Herstellung von TSHβ-RNA in einer Zelllinie, die normalerweise diese RNA nicht produziert, stabil durch homologe Rekombination angeschaltet wurde.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Zelllinie, die hierin beschrieben wird, eingeschränkt. Alle Zelllinien haben genetische Information, die normalerweise still oder inert ist. Die meisten sind in der Lage, nur bestimmte Gene zu exprimieren. Jedoch kann ein normalerweise transkriptionell stilles oder inertes Gen einer solchen Zelllinie aktiviert werden, um das Genprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren und jegliches Gen des Genoms kann in seinen Expressionseigenschaften gemäß der vorliegenden Erfindung verändert werden. Es können sogar zuvor transformierte Zelllinien verwendet werden, solange die vorherige Transformation das Gen von Interesse nicht unterbricht. Der Ursprung der Zelllinie ist nicht wichtig. Die Zelllinie kann eine tierische oder pflanzliche, primäre, kontinuierliche oder unsterbliche sein. Natürlich ist es wünschenswert, dass jegliche solche Zelllinie stabil und unsterblich ist, so dass sie nach Behandlung mit der Technik gemäß der vorliegenden Erfindung kommerziell verwendet werden kann. Klonierte Mikroorganismen, egal ob prokaryontisch oder eukaryontisch, können auch durch die Technik der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Während die vorliegende Erfindung vorzugsweise in Bezug auf die Expression eines normalerweise transkriptionell stillen oder inerten Gens beschrieben wurde, ist diese Technik der vorliegenden Erfindung auch auf die Veränderung der Expressionseigenschaften eines Gens anwendbar, welches natürlich in der Wirtszelllinie exprimiert wird. Zum Beispiel, wenn es wünschenswert ist, die Expression eines Gens von Kulturbedingungen abhängig zu machen oder Ähnlichem, so dass die Expression nach freiem Willen an- und abgestellt werden kann, kann ein geeignetes DNA-regulatorisches Segment wie ein regulierbarer Promotor, der solche Eigenschaften vermittelt, wie Reprimierbar keit oder Induzierbarkeit, eingefügt werden. Zum Beispiel, wenn es bekannt ist, dass der Zelltyp nukleare Steroidrezeptoren enthält, wie Estrogen-, Testosteron- oder Glukokortikoid- oder Thyroxin-Rezeptoren, könnte man die Steroid- oder Thyroxin-Reaktionselemente als Region F verwenden. Solch ein Reaktionselement ist jegliche DNA, welche einen solchen Rezeptor bindet, um eine positive Reaktion relativ zur Transkription auszuüben. Sogar wenn eine Zelle nicht natürlich reaktiv für Glukokortikoide ist, könnte z. B. ein Teil der DNA, welche den Glukokortikoid-Rezeptor kodiert, zu dem Konstrukt hinzugefügt werden oder anderweitig irgendwo in das Genom eingefügt werden, um so die Zelle reaktiv für Glukokortikoide zu machen. Die Verwendung eines regulierbaren Promotors könnte wünschenswert sein, egal ob das Gen von Interesse normalerweise transkriptionell still ist oder nicht. Andere Arten der Regulation können auch durch das Zielen von geeigneten DNA-regulatorischen Elementen auf die exakte Position von Interesse durch die Mittel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Somit ist, während die Stimulierung der Expression von normalerweise transkriptionell stillen Genen die bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung ist, sie in ihrem weitesten Sinn auf die Veränderung der Expressionseigenschaften eines jeden Gens, das endogen in der Wirtszelllinie vorliegt, anwendbar.
Die spezifische Technik der homologen Rekombination ist nicht per se ein neuer Teil der vorliegenden Erfindung. Solche Techniken sind bekannt und Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass eine jegliche solche Technik in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, solange sie es erlaubt, die DNA-regulatorische Sequenz auf die gewünschte Position bezüglich des Gens von Interesse zu richten. Während eine bevorzugte Technik unter Verwendung eines linearisierten Konstrukts mit zwei homologen Regionen an jedem Ende der Sequenzen offenbart wird, die eingefügt werden sollen, kann jede andere Technik diese Funktion erfüllen, wie z. B. die Verwendung zirkulärer Konstrukte, von der vorgesehen ist, dass sie auch von der vorliegenden Erfindung mit umfasst wird. Das kritische Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von homologen Rekombinationstechniken, um eine DNA-regulatorische Sequenz einzufügen, welche die Veränderung der Expressionseigenschaften in der Zelllinie oder dem Mikroorganismus, der verwendet wird, bewirkt, wenn sie operativ mit einem Gen in dem Genom der Zelllinie verbunden wird, vorzugsweise einem, welches normalerweise transkriptionell still ist oder um eine amplifizierende Sequenz einzufügen, ohne eine regulatorische Sequenz, die ausreichend nahe an einem Gen in dem Genom der Zelllinie ist, welches bereits transkribiert, um die Amplifikation eines solchen Gens nach Amplifikation mit der amplifizierenden Sequenz zu bewirken. Es ist nicht unbedingt notwendig, dass ein selektierbarer Marker mit umfasst ist. Eine Selektion kann ausschließlich auf dem Nachweis des Genprodukts von Interesse oder mRNAs in den Medien oder Zellen nach Einfügen des DNA-Konstrukts basieren. Des Weiteren ist in der Ausführungsform, in welcher eine regulatorische Sequenz eingefügt wird, die Amplifikation, während sie wünschenswert ist, nicht kritisch für die Durchführbarkeit. Das Gleiche ist wahr für das negative Selektionsgen, welches das Screening-Verfahren leichter macht, aber nicht kritisch für den Erfolg der Erfindung ist. Somit erfordert die Grundausführungsform lediglich das Einfügen des DNA-regulatorischen Segments oder des amplifizierbaren Segments in die spezifische gewünschte Position. Jedoch ist die Zugabe von positiven und/oder negativen selektierbaren Marker-Genen zur Verwendung in den Selektionstechniken bevorzugt, genauso wie das Hinzufügen eines amplifizierbaren Gens in der Ausführungsform, in welcher ein regulatorisches Segment hinzugefügt wird.
Der Begriff "Veränderung der Expression" wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, wird hiermit dahingehend definiert, dass er die Terminierung der Expression durch das Einfügen einer Mutation, Deletion, eines Stopkodons oder einer anderen Nukleotid-Sequenz, einschließlich eines gesamten Gens in das Gen von Interesse durch homologe Rekombination, um das Produkt von Interesse daran zu hindern, dass es exprimiert wird, ausschließt. Der Stand der Technik lehrt die Verwendung einer homologen Rekombination zum Einfügen spezifischer Mutationen und die Expression eines Zellprodukts kann inhärent durch Mittel davon terminiert werden (siehe z. B. Schwartzberg et al., PNAS (USA), 87: 3210–3214 ('990)). Das vorliegende Verfahren soll eine solche Prozedur nicht mit umfassen. In der vorliegenden Erfindung wird die "Veränderung der Expression" durch die Mittel des Einfügens regulatorischer und/oder amplifizierender Regionen in einer spezifischen gewünschten Stelle durch Mittel der homologen Rekombination erreicht. Die bevorzugten Veränderungen sind solche, welche die Expression des Produkts von Interesse aktiv eren und/oder verstärken.
Wann immer die vorliegende Beschreibung den Begriff verwendet, dass ein DNA-regulatorisches Segment "operativ mit einem Gen verbunden ist", dann ist diese Terminologie dahingehend vorgesehen, dass sie bedeutet, dass das DNA-regulatorische Segment in Bezug auf das Gen von Interesse so positioniert ist, dass die Transkription dieses Gens durch das DNA-regulatorische Segment reguliert wird. Das regulatorische Segment liegt vorzugsweise stromaufwärts des Gens, kann aber auch stromabwärts oder in dem Gen vorliegen, unter der Voraussetzung, dass es funktioniert, um die Expression des Gens in irgendeiner Weise zu regulieren. Das DNA-regulatorische Segment kann ein Promotor, Terminator, Operator, Verstärker, "Silencer", Attenuator oder Ähnliches oder eine Kombination davon sein.
Wann immer die Begriffe "stromaufwärts" oder "stromabwärts" in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, soll dieses jeweils in der 5'-Richtung oder der 3'-Richtung relativ zu dem kodierenden Strang des Gens von Interesse bedeuten.
Die vorangegangene Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen offenbart die allgemeine Natur der Erfindung so vollständig, dass andere solche spezifischen Ausführungsformen leicht für verschiedene Anwendungen modifizieren und/oder anpassen können, ohne dass sie von dem allgemeinen Konzept abweichen. Jegliche solche Adaptionen und Modifikationen sind dahingehend vorgesehen, dass sie von der Bedeutung und dem Äquivalenzbereich der offenbarten Ausführungsformen mit umfasst sind. Es ist zu verstehen, dass die Begriffe und die eingesetzte Terminologie dem Zweck der Beschreibung und nicht als Einschränkung dient.

Claims

Ein DNA-Konstrukt, das zur Verwendung in der Veränderung der Expressionseigenschaften eines ausgewählten Gens in einer zuvor bestimmten eukaryontischen Wirtszelllinie geeignet ist und zum Zielen von besagtem ausgewählten Gen durch homologe Rekombination geeignet ist, wobei das Konstrukt: ein DNA-regulatorisches Segment (F), welches die Expression von besagtem ausgewählten Gen aktiviert und/oder verstärkt, wenn dieses damit verbunden ist, zwei DNA-Zielsegmente (A, B), die homolog zu einer Region des Genoms innerhalb oder proximal zu dem ausgewählten Gen in der Wirtszelllinie sind, wobei eines davon (A) homolog zu einer Region des Genoms ist, die stromabwärts von der spezifischen Region lokalisiert ist, an welcher das regulatorische Segment (F) eingefügt ist, und das andere von beiden (B) homolog zu einer Region des Genoms ist, die stromaufwärts von der spezifischen Region lokalisiert ist, an welcher das regulatorische Segment (F) eingefügt ist, einen positiven selektierbaren Marker, einen negativen selektierbaren Marker, und ein amplifizierbares Gen umfasst.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 1 beansprucht wird, worin das DNA-regulatorische Segment (F) ein Promotor ist.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 1 oder 2 beansprucht wird, worin mindestens das DNA-Zielsegment B homolog zu einer nicht-kodierenden Region des Genoms ist.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der Ansprüche 1–3 beansprucht wird, worin das DNA-Zielsegment A einen Teil des ausgewählten Gens umfasst.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der Ansprüche 1–4 beansprucht wird, worin der positive selektierbare Marker eine transkriptionell aktive Promotorregion aufweist, die sich von dem DNA-regulatorischen Segment (F) unterscheidet.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der Ansprüche 1–5 beansprucht wird, worin der negative selektierbare Marker eine transkriptionell aktive Promotorregion aufweist, die sich von dem DNA-regulatorischen Segment (F) unterscheidet.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der Ansprüche 1–6 beansprucht wird, worin das amplifizierbare Gen eine transkriptionell aktive Promotorregion aufweist, die sich von dem DNA-regulatorischen Segment (F) unterscheidet.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 1–7 beansprucht wird, worin der positive selektierbare Marker aus Adenosindeaminase (ADA), Aminoglycosid-Phosphotransferase (neo), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-Phosphotransferase (BHP), Thymidinkinase (tk), Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt), Mehrfachmedikamentenresistenzgen (MDR), Ornithindecarboxylase (ODC) und N-(Phosphonacetyl)-L-Aspartatresistenz (CAD) ausgewählt ist.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der Ansprüche 1–8 beansprucht wird, worin der negative selektierbare Marker das Herpes Simplex Virus Thymidinkinasegen (HSVtk) ist.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 1–9 beansprucht wird, worin das amplifizierbare Gen aus DHFR, MDR, ODC, ADA und CAD ausgewählt ist.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin das DNA-Konstrukt linearisiert ist.
Ein DNA-Konstrukt, wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin das DNA-Konstrukt zirkulär ist.
Verwendung eines DNA-Konstrukts, wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, zur Veränderung der Expressionseigenschaften eines ausgewählten Gens in einer vorbestimmten eukaryontischen Wirtszelllinie.
Verwendung eines DNA-Konstrukts, wie es in einem der Ansprüche 1–12 beansprucht wird, zur Proteinexpression in einer vorbestimmten Wirtszelllinie.
Verwendung wie sie in Anspruch 13 oder 14 beansprucht, worin die eukaryontische Wirtszelle eine stabile Zelllinie ist.
Verwendung wie sie in einem der Ansprüche 13–15 beansprucht wird, worin die eukaryontische Wirtszelle eine differenzierte Zelllinie ist.
Eine eukaryontische Wirtszelle, die mit einem DNA-Konstrukt transfiziert ist, wie es in einem der Ansprüche 1–12 beansprucht wird.
Ein Genom, das ein DNA-Konstrukt umfasst, wie es in einem der Ansprüche 1–12 beansprucht wird.
Verwendung einer Zelle, wie sie in Anspruch 17 beansprucht wird, zur Herstellung eines eines Genprodukts.
Verwendung wie sie in Anspruch 19 beansprucht wird, worin das Genprodukt die mRNA von besagtem Gen ist.
Verwendung wie sie in Anspruch 19 beansprucht wird, worin das Genprodukt das Proteinprodukt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts, das den Schritt der Kultivierung der Zelle gemäß Anspruch 17 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 22, das des Weiteren den Schritt der chemischen Selektion umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, das des Weiteren den Schritt des Überwachens zur Herstellung des spezifischen Genprodukts des neu aktivierten Gens in der eukaryontischen Wirtszelllinie umfasst.