HU216874B - Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds - Google Patents
Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds Download PDFInfo
- Publication number
- HU216874B HU216874B HU9502275A HU9502275A HU216874B HU 216874 B HU216874 B HU 216874B HU 9502275 A HU9502275 A HU 9502275A HU 9502275 A HU9502275 A HU 9502275A HU 216874 B HU216874 B HU 216874B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hydroxylation
- culture
- medium
- ncaim
- dione
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány új eljárás 13-alkil-4-gőnén-3,17-diőn-vegyületek 11a-hidrőxilezésére aerőb körülmények között mikrőbiőlógiai útőn végzettfermentációval, őlyan módőn, hőgy a f rmentálást szterőid-11a-őxigenázaktivitással rendelkező Aspergillűs awamőri (NCAIM F 0030), vagyPenicilliűm albidűm (NRRL 2043, ATCC 10 408) főnalas gőmbával, vagy aMező azdasági és Ipari Mikrőőrganizműsők Nemzeti Gyűjteményénél(Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Bűdapest, Natiőnal Cőllectiőnőf Agricűltűral and Indűstrial Micrőőrganisms, Bűdapest, Hűngary) NCAIF 001 229 azőnősítási jel alatt letétbe helyezett Cylindrőcarpőndydiműm var. richter SzB 0599 jelű mikrőőrganizműssal, adőtt esetbenaszkőrbinsavat és/vagy szénfőrrást adagőlva végzik. ŕThe present invention is a novel process for 11a-hydroxylation of 13-alkyl-4-ynyne-3,17-diene compounds under aerobic conditions by microbial pathway fermentation, in anhydrous form, as well as Aspergillus awamy (NCAIM F 0030) having sterol-11a-enigenase activity, orPenicilli. albidom (NRRL 2043, ATCC 10 408) with a spawn steamer, or at the National Collection of Field Horticultural and Industrial Microorganisms (University of Horticulture and Food Industry, Bűdapest, Natiő Cőllectiőnőf Agricűltű and Indűstrial Micrőőrganisms, Bűdapest, Hytisgary) NCAIF 001 229 Cylindrőcarpőndydimme richter is provided with microbial microorganism BB 0599, administered as a dermatologic acid and / or charcoal gap. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás gonánvegyületek, közelebbről 13-alkil-4-gonén-3,17-dion-vegyületek lla-hidroxiszármazékainak előállítására mikrobiológiai hidroxilezéssel.The present invention relates to a process for the preparation of 11a-hydroxy derivatives of gonan compounds, in particular 13-alkyl-4-gonene-3,17-dione compounds, by microbiological hydroxylation.
A 19-norszteroidok igen fontos szteroid hormon- és gyógyszer-alapanyagok, a hidroxilezett származékok pedig fontos kulcs intermedierek a további szintézisekben.19-Norteroids are very important steroid hormone and drug starting materials, and hydroxylated derivatives are important key intermediates in further syntheses.
Miután a szintetikus úton előállított első hidroxi-szteroid igen nagy költség- és munkaráfordítást igényelt, nagy érdeklődést váltottak ki Horváth és Krámli eredményei [Natúré 160 639 (1947)] a mikroorganizmusok biotranszformációs hasznosításáról. Az első gyakorlati eredmények a szteroidok hidroxilezése során jelentkeztek. Ipari méretben is megvalósítható eljárást dolgozott ki a progeszteron lla-hidroxilezésére Peterson és Murray 1952-ben (2 602769 számú USA szabadalmi leírás). Később már 80%-os konverzióval állították elő a 11ahidroxi-progeszteront (2686791 számú és 2686792 számú USA szabadalmi leírás). Az ötvenes években - a törzsgyűjtemények szisztematikus átvizsgálása eredményeképpen - igazolták, hogy a szteránváz minden szénatomja - a C4 és a C13 kivételével - jól hidroxilezhető. AC3 és a C10 hidroxilezésére ritkán adódik lehetőség, mert azokhoz általában más csoportok kapcsolódnak.As the first hydroxy steroid produced synthetically demanded very high cost and labor, the results of Horváth and Krámli (Natúré 160 639 (1947)) on the biotransformation utilization of microorganisms were of great interest. The first practical results came from the hydroxylation of steroids. An industrial scale process for the la-hydroxylation of progesterone was developed by Peterson and Murray in 1952 (U.S. Patent No. 2,602769). Later, 80% conversion was made to 11-hydroxy-progesterone (U.S. Pat. Nos. 26,86791 and 2686792). In the fifties - it confirmed that all of the carbon atoms in the steroid skeleton - - strain collections systematic screening result, with the exception of C 4 to C 13 - hydroxylation well. Hydroxylation of C 3 and C 10 is rarely possible because they are usually joined by other groups.
A 19-norszteroidok hidroxilezésével az ötvenes évek óta eredményesen foglalkoznak. A progeszteron 11 a-hidroxilezéséhez gyakran és sikeresen alkalmazott Rhizopus nigricans törzzsel végeztek biokonverziót 19norszteroidon, nevezetesen a 19-nortesztoszteronon. A fő termékként keletkező 63-hidroxi-származék mellett melléktermékként keletkezett all a-hidroxi-, valamint a ΙΟξ-hidroxi-származék [J. Am. Chem. Soc. 78 1512-1513 (1956)].The hydroxylation of 19-norteroids has been successfully dealt with since the 1950s. The strain Rhizopus nigricans, which has been frequently and successfully used for α-hydroxylation of progesterone 11, has undergone bioconversion on 19norsteroid, namely 19-nortestosterone. In addition to the main 63-hydroxy derivative, the all-α-hydroxy derivative as well as the i-hydroxy derivative [J. Chem. Soc. 78, 1512-1513 (1956)].
A kezdeti eredmények is már elegendő információt szolgáltattak a mikroorganizmusok enzimatikus hidroxilezésének alapvető sajátosságaira vonatkozóan. A szteránvázon a biokonverzió szubsztrátspecifikus, azaz a különböző funkciós csoporttal rendelkező molekulákon az átalakítás más-más pozícióban történhet. Jellemző a régió- és a sztereospecifikusság. A szintetikus úton való átalakításhoz képest feltétlenül előnyt jelent az enyhe körülmények között lejátszódó reakció, valamint az, hogy lehetőség van funkciós csoport bejuttatására nem aktivált helyre is, mikrobiológiai hidroxilezés segítségével.Initial results have already provided sufficient information on the basic properties of enzymatic hydroxylation of microorganisms. In the sterane backbone, bioconversion is substrate specific, i.e., molecules with different functional groups may be converted at different positions. Region and stereospecificity are typical. Mild reaction and the possibility of introducing a functional group into a non-activated site by microbiological hydroxylation are definitely advantages over synthetic conversion.
Természetesen sok kutatót foglalkoztatott az enzimatikus szteroidhidroxilezés reakciómechanizmusa. Korai tapasztalat szerint a különböző helyzetű hidroxilezéseket elkülöníthető oxigenáz enzimek végzik. Megállapították, hogy az Aspergillus ochraceus 63-hidroxilázának képződését a 1 Ια-hidroxi-progeszteron indukálja (2 802 775 számú és 2 905 593 számú USA szabadalmi leírás); a keletkezett 1 Ια-hidroxi-termék reakcióelegyből való eltávolításával elérték, hogy a nemkívánatos 6β, 1 Ια-dihidroxi-származék képződése visszaszorult.Of course, many researchers were interested in the reaction mechanism of enzymatic steroid hydroxylation. Early experience has shown that hydroxylations at different positions are carried out by separable oxygenase enzymes. It has been found that the formation of Aspergillus ochraceus 63-hydroxylase is induced by 1α-hydroxy progesterone (U.S. Patent Nos. 2,802,775 and 2,905,593); by removing the resulting Ια-hydroxy product from the reaction mixture, it was achieved that the formation of the undesired 6β, 1 1α-dihydroxy derivative was reduced.
A reakciómechanizmusra vonatkozó további információt az a felismerés szolgáltatta, hogy a Reichstein-S vegyületet az Absidia orchidis fonalas gomba 11a- és 11 β-helyzetben is hidroxilezi [Fólia Microbiol. 6 237 (1961); Appl. Microbiol. 11 256 (1963)]. A kétféle 11hidroxi-termék arányán változtatni nem sikerült, bár sok ezer mutánst átvizsgáltak. Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a CH atomra az oxigén bevitelét egyetlen enzim végzi. Az aktív centrumhoz különböző helyzetben kötődhet a szubsztrát és ettől függ a kialakított hidroxilcsoport orientációja. A hidroxilezést végző enzimrendszer membránhoz kötötten, mikroszómákba rendeződve a sejten belül, proteázoktól védett vezikulumokban fejti ki hatását.Further information on the mechanism of reaction was provided by the recognition that Reichstein-S is also hydroxylated at the 11a and 11b positions of the filamentous fungus Absidia orchidis [Folia Microbiol. 6, 237 (1961); Appl Microbiol. 11,256 (1963)]. The ratio of the two 11hydroxy products could not be changed, although thousands of mutants have been screened. It was concluded that oxygen is supplied to the C H atom by a single enzyme. The substrate may be bound to the active site at various positions and will determine the orientation of the hydroxyl group formed. The enzyme system that performs hydroxylation works in a membrane-bound, microsomal, intracellular, protease-protected vesicle.
A 19-norszteroidok hidroxilezésére viszonylag kevés iparilag megvalósítható szteroidhidroxilező eljárást ismerünk, különösen, ha a C13 atomhoz hosszabb szénláncú alkilcsoport kapcsolódik. Az ösztradiént Fusarium és Absidia törzsekkel konvertálva, 15a-hidroxi-származékot kaptak (3 331288 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A nortesztoszteron 1 Ια-hidroxilezését Sehgal és munkatársai írták le Aspergillus ochraceus törzzsel [Can. J. Microbiol. 14 529-532 (1968)]. Csak sok évvel később sikerült a 19-nortesztoszteron gazdaságos 1 la-hidroxilezését megoldani Rhizopus nigricans törzzsel, ami Petzoldt nevéhez fűződik (3248434 számú NSZK-beli szabadalmi leírás).There are relatively few commercially available steroid hydroxylation procedures for hydroxylation of 19-noreroids, especially when a longer alkyl group is attached to the C 13 atom. Conversion of estradiol to Fusarium and Absidia strains yielded a 15α-hydroxy derivative (US Patent 3,332,888). The Ια-hydroxylation of nortestosterone 1 has been described by Sehgal et al., Aspergillus ochraceus strain [Can. J. Microbiol. 14: 529-532 (1968)]. Only many years later, the economical 1α-hydroxylation of 19-nortestosterone with the Rhizopus nigricans strain associated with Petzoldt (US Patent No. 3248434) was successfully solved.
A noretiszteron Ιβ-hidroxilezését több kutatóhelyen, többféle mikroorganizmussal is megoldották, így: Botryodiplodia malorum (3 880 895 számú USA-, 2 546 062 számú NSZK-beli szabadalmi leírás), Acremonium strictum és A. kiliense [Ambrus és munkatársai: Steroids 25 99 (1975)], Calonectria decora (2450106 számú NSZK-beli szabadalmi leírás), Mucor spinosus (2 539 261 számú NSZK-beli szabadalmi leírás) mikroorganizmusokkal. Zakelj-Mavric és munkatársai az igen jó lla-hidroxilező tulajdonsággal rendelkező Rhizopus nigricans törzsből származó 1 Ια-hidroxiláz enzimkomplexszel 19-noretiszteront konvertáltak és meglepetésre 10β- és 6β-hidroxiszármazékok keletkeztek. Ugyanez az enzimkivonat az etiszteront 7β-1ή(ΐΓοχί-6ύ8ΖΙεΓοηΜ konvertálja. A várttól való eltérést azzal magyarázták, hogy az etinilcsoport akadályozza a normális régiospecifitást [FEMS Microbiol. Lett. 33 117-120 (1986)]. A 17alkinil-4-ösztrének 15a-hidroxilezését Penicillium raistrickii törzzsel oldották meg német kutatók (2546062 számú NSZK-beli szabadalmi leírás).Etβ-hydroxylation of norethisterone has been solved at several research sites with a variety of microorganisms, such as Botryodiplodia malorum (U.S. Pat. No. 3,880,895, U.S. Patent 2,546,062), Acremonium strictum and A. kiliense [Ambrus et al., Steroids 99 (1975)], microorganisms of Calonectria decora (U.S. Patent No. 2,450,106), Mucor spinosus (U.S. Patent No. 2,539,261). Zakelj-Mavric et al. Converted the 19-norethisterone from the 1? -Hydroxylase enzyme complex from Rhizopus nigricans, which has a very good la-hydroxylation property, and surprisingly gave 10β- and 6β-hydroxy derivatives. The same enzyme extract converts etisterone to 7β-1ή (ΐΓοχί-6ύ8ΖΙεΓοη.). The deviation from expected is explained by the fact that the ethinyl group interferes with normal seniosity (FEMS Microbiol. Lett. 33, 117-120 (1986)). -hydroxylation with Penicillium raistrickii (German Patent No. 2546062).
A 19-nor-13-etil-szteroidok hidroxilezésével csak a 70-es évektől kezdtek megbirkózni a kutatók. A 13β-εΐί11,3,5(10)-βοηΗϋ·ίέη-3,17β-όίο1 szubsztráton Bacillus megaterium baktériumtörzzsel 16a-hidroxilezést tudtak amerikai kutatók megvalósítani (3 733 254 számú USA szabadalmi leírás). A noretiszteront melléktermékként 11 β-helyzetben is hidroxilező Botryodiplodia malorum törzs a norgesztrelt (13β-είϊ1-17α-εύηί1-17β-1ιί<ΐΓθχί-4gonén-3-on) Cn atomon nem képes hidroxilezni, a 13alkilcsoport gátló hatása miatt (2546062 számú NSZKbeli szabadalmi leírás). A különböző gonánszármazékok ία-hidroxilezésére sok törzset képesnek találtak: Rhizoctonia, Sclerotium, Calonectria, Glomerella törzsekkel (2450106 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A norgesztrel Ια-helyzetű hidroxilezését több kutatócsoport is megoldotta: Calonectria decora törzzsel (2450 106 számú NSZK-beli szabadalmi leírás), Aspergillus clavatus törzzsel (2539261 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A norgesztrel 6β-hidroxilezését Mucor griseocyanusIt was only from the 1970s that researchers began to cope with the hydroxylation of 19-nor-13-ethyl steroids. The 13β-εelί11,3,5 (10) -βοηΗϋ · ίέη-3,17β-όίο1 substrate was capable of 16a-hydroxylation with the bacterial strain Bacillus megaterium (U.S. Pat. No. 3,733,254). The strain Botryodiplodia malorum, which also hydroxylates norethisterone at 11 β-positions, is unable to hydroxylate norgestrel (13β-είϊ1-17α-εύηί1-17β-1ιί <ΐΓθχί-4gonen-3-on) on C n atom, due to the presence of German Patent Specification). Many strains have been found capable of ßα-hydroxylation of various gonan derivatives: Rhizoctonia, Sclerotium, Calonectria, Glomerella (U.S. Patent No. 2450106). The Ια-hydroxylation of norgestrel has been solved by several research groups: Calonectria decora strain (U.S. Patent No. 2,450,106), Aspergillus clavatus strain (U.S. Patent No. 2539261). The 6β-hydroxylation of norgestrel is in Mucor griseocyanus
HU 216 874 Β törzzsel valósították meg (2330159 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). Ugyancsak gonánszármazékok 9ahidroxilezését valósították meg Glomeretta gombatörzzsel (4397 947 számú USA szabadalmi leírás).HU 216 874 Β (German Patent No. 2330159). 9-Hydroxylation of gonan derivatives with Glomeretta fungal strain (U.S. Patent No. 4,397,947) was also performed.
11-fenil-gonán-származékok hidroxilezésével is foglalkoztak német kutatók: 6ct-hidroxi-származékot tudtak létrehozni Streptomyces és Nigrospora törzsekkel, 7a-hidroxi-terméket konvertált egy Streptomyces törzs, 15P-hidroxi-terméket pedig egy Neurospora törzs (3 527 517 számú NSZK-beli szabadalmi leírás).German researchers also dealt with the hydroxylation of 11-phenylgonane derivatives: they were able to create a 6ct-hydroxy derivative with Streptomyces and Nigrospora strains, convert a 7a-hydroxy product with a Streptomyces strain, and a 15P-hydroxy product with a Neurospora strain (No. 3,527,517). patent).
A levodion (13p-etil-4-gonén-3,17-dion) 15a-hidroxiszármazékát két törzzsel is elő tudták állítani: Penicillium raistrickii, illetve Fusarium sp. törzsek voltak alkalmasak a gesztedén fontos intermedierjének, a 15ahidroxi-133-etil-4-gonén-3,17-dionnak az előállítására (2 546 068 számú NSZK-beli szabadalmi leírás).The 15α-hydroxy derivative of levodione (13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione) could be produced by two strains: Penicillium raistrickii and Fusarium sp. strains were suitable for the preparation of an important intermediate of gestestene, 15ahydroxy-133-ethyl-4-gonene-3,17-dione (German Patent No. 2,546,068).
A gonánszármazékok számos hidroxilezési példái között csak egyetlen leírást találtunk, amely a Cjj atom hidroxilezésére vonatkozik. Petzoldt és munkatársai (3 248434 számú NSZK-beli szabadalmi leírás) a 3oxo-4-ösztrén-származékokra, illetve azok 18-alkilhomológjaira a térben nem, csak időben elválasztott két biokonverziós reakciót valósítottak meg. Eljárásuk legnagyobb hátránya az, hogy alacsony szubsztrátkoncentrációt (1 g/1) tudtak alkalmazni, melyet Aspergillus ochraceus törzs 11 α-hidroxilezett, majd Arthrobacter simplex, vagy Bacillus sphaericus hozzáadásával, aerob körülmények között 63 óra alatt az A gyűrű aromatizációja ment végbe. így összesen 42%-os kihozatalt értek el. A már említett alacsony szubsztrátkoncentráció miatt az eljárás ipari gyártásra nem alkalmas.Of the many examples of hydroxylation of gonan derivatives, only one description has been found which relates to the hydroxylation of the C1 atom. Petzoldt et al. (U.S. Patent No. 3,248,434) performed two bioconversion reactions in space, but not in time, on 3oxo-4-estrene derivatives and their 18-alkyl homologues. The main disadvantage of their process was that they were able to use low substrate concentration (1 g / l), which was subjected to aerosolization of ring A by addition of 11 α-hydroxylated strains of Aspergillus ochraceus, followed by addition of Arthrobacter simplex or Bacillus sphaericus under aerobic conditions. a total yield of 42% was achieved. Due to the low substrate concentration mentioned above, the process is not suitable for industrial production.
A találmány célja olyan új fermentációs eljárás kidolgozása, amely lehetővé teszi 13-alkil-gonán-származékok biztonságos és gazdaságos mikrobiológiai 11ahidroxilezését. E cél érdekében olyan mikroorganizmusokat alkalmaztunk, amelyek a 13-alkil-gonán-származékokat a Cn szénatomon megfelelő koncentrációban és méretnövelésre alkalmas technológiai paraméterek megvalósítása mellett biztonságosan hidroxilezik.It is an object of the present invention to provide a novel fermentation process which enables safe and economical microbial 11-hydroxylation of 13-alkylgonan derivatives. To this end, microorganisms have been used which safely hydroxylate the 13-alkylgonane derivatives on the Cn carbon atom at appropriate concentrations and with technological parameters suitable for scaling.
A potenciálisan szteroid-11-oxigenáz enzimmel rendelkező mikroorganizmusok szkrínelése során találtunk olyan mikroorganizmus törzseket, amelyek a kortikoidokat és pregnánvázas szterodiokat jól, de a gonánvázas szteroidokat egyáltalán nem, vagy alig hidroxilezik; és találtunk olyan törzseket, amelyek a 4-ösztrén-3,17dion- és a 13-etil-4-gonén-3,17-dion-vegyületeket a Cn szénatomon α-helyzetben hidroxilezni képesek, bár az ilyen enzimaktivitásuk eddig nem volt ismeretes.Screening for microorganisms with the potential steroid 11-oxygenase enzyme found strains of microorganisms that show good or poor hydroxylation of corticoids and pregnane skeletal steroids; and found strains capable of hydroxylating 4-estrene-3,17-dione and 13-ethyl-4-gonene-3,17-dione at the α-position of the Cn carbon, although such enzyme activity has not been known so far.
További kutatómunkánk során olyan oltósort és táptalaj-összetételt dolgoztunk ki, amelyek az optimális biokonverziós körülményeket és a termékkinyerés szempontjából kedvező paramétereket is biztosítják. A megfelelő táptalajkomponensek kiválasztásával sikerült elérni az alkalmas mikroorganizmusok jól ülepedő pelletes (gyöngy alakú) növekedését (d= 1 -4 mm), midőn a magasabb konvertált szubsztrátmennyiség mellett a szubsztrát a micéliumhoz kötötten, a vízoldékonyabb hidroxitermék pedig teljes mennyiségében a fermentlében található. Az eredeti másfélszeres oldhatósági arány a biokonverzió végére 7,5-szeresre módosul a tenyészetben.In the course of our further research work, we developed a seedling line and medium composition that provides optimal bioconversion conditions and favorable yield parameters. Selection of appropriate media components resulted in well-settled pellet growth (d = 1 -4 mm) of suitable microorganisms, with the higher amount of converted substrate bound to the mycelium and the more water-soluble hydroxy product in the fermentation broth. The original 1.5-fold solubility ratio is modified to 7.5-fold in culture by the end of the bioconversion.
Gyakori nehézséget jelent az igen gyenge vízoldékonyságú szubsztrát bevitele a fermentlébe. Az általánosan használt dimetil-formamidos oldatban történő adagolás kedvező volt, de a kívánt hatást nem érte el. Ezért további, oldódást elősegítő adalékot kerestünk, s megfelelőnek bizonyult egy szorbimakragol oleát (Tween-80) emulgeálószer, egy polietilén-polipropilén diblokk kopolimer alapú (Struktol J—633) habgátló, valamint a βciklodextrin. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy aszkorbinsavat adva a tenyészethez, a biokonverzió hatásfoka számottevő mértékben emelkedik. Utóbbi felismerés annál inkább meglepőnek tekinthető, mert korábban csak emlős monoxigenázoknál említették az aszkorbátot elektrondonorként [Angew. Chem. 84(15) 689-724 (1972)].It is often difficult to introduce a substrate with very low water solubility into the fermentation broth. The addition in the commonly used dimethylformamide solution was favorable but did not achieve the desired effect. Therefore, a further solubility enhancer was sought and a sorbimacragole oleate (Tween-80) emulsifier, a polyethylene-polypropylene diblock copolymer based (Struktol J-633) foam and β-cyclodextrin were found to be suitable. Surprisingly, it has been found that adding ascorbic acid to the culture results in a significant increase in bioconversion efficiency. The latter finding is all the more surprising since ascorbate was previously mentioned as an electron donor only in mammalian monoxygenases [Angew. Chem. 84 (15) 689-724 (1972)].
Kísérleteink során azt is megfigyeltük, hogy a mikrobiológiai hidroxilezés prolongálható, amennyiben biztosítjuk a tenyészet megfelelő energiaellátottságát, alkalmas szénforrás rátáplálásával.In our experiments, it has also been observed that microbiological hydroxylation can be prolonged, provided that the culture is adequately supplied with a suitable carbon source.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás 13-alkil4-gonén-3,17-dion-vegyületek lla-hidroxilezése aerob körülmények között mikrobiológiai úton végzett fermentációval, amely abban áll, hogy a fermentálást szteroidlla-oxigenáz aktivitással rendelkező Aspergillus awamori (NCAIM F 0030, 1966), vagy Penicillium albidum (NRRL 2043, ATCC 10408, 1972) fonalas gombával, vagy a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest; National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary) NCAIM F 001229 azonosítási jel alatt letétbe helyezett Cylindrocarpon dydimum var. richter SzB 0599 jelű mikroorganizmussal, adott esetben aszkorbinsavat és/vagy szénforrást adagolva végezzük.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the la-hydroxylation of 13-alkyl4-gonene-3,17-dione compounds by aerobic microbiological fermentation, which comprises fermentation with Aspergillus awamori (NCAIM F 0030, 1966), or Penicillium albidum (NRRL 2043, ATCC 10408, 1972) or the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (University of Horticulture and Food Industry, Budapest; National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary) NCAIM F 001229 deposited under the sign Cylindrocarpon majorimum var. richter SZB 0599, optionally with ascorbic acid and / or carbon source.
A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazhatjuk például a gonánszármazékok hidroxilezésére eddig nem bevezetett a Penicillium albidum (NRRL 2043, ATCC 10408) és az Aspergillus awamori (NCAIM F 0030) mikroorganizmusokat, valamint a kifejezetten ezzel a tulajdonságokkal rendelkező törzsek kiválasztására szolgáló módszer (3612/94. alapszámú magyar szabadalmi bejelentés) alkalmazásával kapott Cylindrocarpon dydimum var. richter SzB 0599 [a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest) NCAIM F 001229 azonosítási jel alatt 1995. július 25-én letétbe helyezett] új fonalas gomba törzset.For example, the microorganisms Penicillium albidum (NRRL 2043, ATCC 10408) and Aspergillus awamori (NCAIM F 0030) not previously introduced for the hydroxylation of gonan derivatives and strains specifically selected for these properties (3612/94) may be advantageously used. Cylindrocarpon majority var. richter SZB 0599 [filed with the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (University of Horticulture and Food Industry, Budapest) under the accession number NCAIM F 001229 on 25 July 1995] a new filamentous fungal strain.
A törzset talajmintából izoláltuk, jellemzője, hogy burgonya-dextróz-agaron lapos, gyapjas fehér telepeket képez. Konidiumtartói egyszerűek, a konidiumok kétfélék lehetnek: egysejtű, tojásdad, illetve 1-3 sejtű hosszú ellipszoid, vagy hengeres alakú.The strain was isolated from a soil sample and was found to form flat, woolly white colonies on potato dextrose agar. Conidium supports are simple, conidia can be of two types: unicellular, ovoid, 1-3 cell long ellipsoid, or cylindrical.
A mikroorganizmusok növesztését és a hidroxilezést rázott tenyészetben (240/perc fordulatszámú, 2 cm kitérésű síkrázógépen), valamint fermentorokban végezzük. A tenyésztéshez használt táptalajok összetétele az átalakítást végző mikroorganizmusoktól függően változik: előnyösen alkalmazható nitrogénforrásul szójaliszt, élesztőkivonat, malátakivonat, kukoricalekvárThe growth of the microorganisms and the hydroxylation were performed in shake culture (240 rpm, 2 cm flat plate shaker) and in fermentors. The composition of the culture media varies depending on the microorganisms involved in the transformation: soybean meal, yeast extract, malt extract, corn jam are the preferred sources of nitrogen
HU 216 874 Β és különféle fehérjehidrolizátumok; szénforrásként pedig mono-, oligo- és poliszacharidok - például glükóz, szaharóz és keményítő -, valamint növényi olajok és szerves savak. A 1 Ια-hidroxilezést végző gombákat célszerűen 24-32 °C-on tenyésztjük.EN 216 874 Β and various protein hydrolysates; and carbon sources of mono-, oligo- and polysaccharides, such as glucose, sucrose and starch, and vegetable oils and organic acids. Fungi that carry out 1α-hydroxylation are preferably grown at 24-32 ° C.
A biokonverziót végző mikroorganizmus előtenyésztését az átalakításra szolgáló fermentorban végezzük olyan módon, hogy a tenyészet optimális állapotában adagoljuk a szubsztrátot. Az optimális állapotot a szénforrás felhasználását jelző pH-csökkenés vége jelenti, ami a mikroorganizmustól és a táptalajtól függően 10-24 órás korban következik be. A szubsztrátadagolással egyidőben az oldódást és a biokonverziót elősegítő adalékokat is a fermentlébe juttatjuk, az aszkorbinsavat 0-2 g/1, előnyösen 1 g/1 koncentrációban.The pre-culture of the bioconversion microorganism is carried out in the conversion fermenter by adding the substrate in the optimal state of the culture. The optimum state is the end of the decrease in pH indicating the utilization of the carbon source, which occurs at 10-24 hours depending on the microorganism and the medium. Simultaneously with the addition of the substrate, the dissolution and bioconversion enhancers are added to the fermentation broth at a concentration of 0-2 g / l, preferably 1 g / l.
A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint a szubsztrátum hozzáadását követően szénforrást juttatunk a tenyészethez. A szénforrás hozzáadása egyaránt történhet szakaszosan, vagy folytonosan. így a tenyészet hidroxilező aktivitása hosszabb időn át fenntartható, ami lehetőséget adhat újabb szubsztrátmennyiség átalakítására.In a preferred embodiment of the invention, the carbon source is added to the culture after the substrate is added. The carbon source can be added either batchwise or continuously. Thus, the hydroxylating activity of the culture can be sustained over an extended period of time, which may provide an opportunity to convert additional substrate amounts.
A fermentáció nyomon követésére a szteroid vegyületeket a fermentléből klórozott szénhidrogénekkel, észterekkel, vízzel nem elegyedő ketonokkal vagy alkoholokkal végzett extrakcióval különíthetjük el. A fermentlében található szteroidok minél teljesebb kinyerése érdekében célszerű extrakció előtt a tenyészetet homogenizálni.To monitor the fermentation, the steroid compounds may be isolated from the fermentation broth by extraction with chlorinated hydrocarbons, esters, water-immiscible ketones or alcohols. It is advisable to homogenize the culture prior to extraction to obtain the fullest possible amount of steroids in the fermentation broth.
Az egyes komponensek mennyiségi meghatározása vékonyréteg-kromatográfiás elválasztást követően denzitometrálással történik, előre gyártott Kieselgel 60 F254 (Merck, N°5554) rétegen. Kifejlesztő rendszerként a szóban forgó vegyületek jó elválását biztosító rendszert fejlesztettünk ki, melynek összetétele ciklohexán-etilacetát-etanol (35:56:8). A mérést Shimadzu CS-9000 denzitométerrel, 242 nm hullámhosszon végezzük.Quantitation of the individual components after thin layer chromatography is performed by densitometry on pre-fabricated Kieselgel 60 F 254 (Merck, N ° 5554). As a developmental system, we have developed a system for the good separation of the compounds in question, consisting of cyclohexane-ethyl acetate-ethanol (35: 56: 8). The measurement was performed on a Shimadzu CS-9000 densitometer at 242 nm.
A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket preparatív folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítottuk, és szerkezetüket Ή-NMR és l3C-NMR módszerekkel igazoltuk.The compounds of the present invention were purified by preparative liquid chromatography and confirmed by Ή-NMR and 13 C-NMR.
A találmány kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy tárgykörét ezekre kívánnánk korlátozni.The following examples are intended to illustrate the practice of the present invention without limiting it thereto.
1. példaExample 1
Aspergillus awatnori (NCAIM F 0030) maláta ferdeagaron növesztett 1-4 hetes tenyészetéről 10 ml steril vízzel készített sejtszuszpenzió 3 ml-ével 100 mles Erlenmeyer-lombikban sterilezett 30 ml BK-2 táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő:From a 1-4 week culture of Aspergillus awatnori (NCAIM F 0030) malt slant on agar agar, 30 ml of BK-2 medium sterilized in 100 ml Erlenmeyer flask was inoculated with 3 ml of cell suspension in 10 ml of sterile water as follows:
pepton 30,0 g glükóz 10,0 gpeptone 30.0 g glucose 10.0 g
1000 ml csapvízben.1000 ml tap water.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 °C-on 20 percig végezzük.The pH of the medium was adjusted to 7.3 before sterilization. The medium was sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
A tenyészetet 2 napig növesztjük síkrázógépen, 28 °C-on, majd 5 ml tenyészettel 500 ml-es Erlenmeyerlombikban sterilezett 100 ml BK-A5 táptalajt oltunk. A BK-A5 táptalaj összetétele a következő:The culture was grown for 2 days on a flat shaker at 28 ° C and 100 ml of BK-A5 medium sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask with 5 ml of culture. The composition of BK-A5 medium is as follows:
glükóz 10,0 g diammónium-hidrogén-foszfát 2,0 g karbamid 1,0 g kálium-klorid 0,2 gglucose 10.0 g diammonium hydrogen phosphate 2.0 g urea 1.0 g potassium chloride 0.2 g
1000 ml csapvízben.1000 ml tap water.
A táptalaj pH-ját 6,0-6,3 értékre állítjuk, majd 121 °C-on 20 percen át sterilezzük.The medium is adjusted to pH 6.0-6.3 and sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
A kapott tenyészetet 28 °C-on síkrázógépen 16 órát rázatjuk, majd 0,1 g aszkorbinsavat, valamint 2 ml dimetil-formamidban oldott 0,15 g 4-ösztrén3,17-diont adunk hozzá. További két nap rázatás után a tenyészet vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint 7,5 mg (5%) 1 la-hidroxi-4-ösztrén-3,l 7-diont tartalmaz.The resulting culture was shaken at 28 ° C for 16 hours on a shaker and 0.1 g of ascorbic acid and 0.15 g of 4-estrene-3,17-dione dissolved in 2 ml of dimethylformamide were added. After another two days of shaking, the culture contained 7.5 mg (5%) of 1α-hydroxy-4-estrene-3, 7-dione by TLC.
Ultraibolya színkép (metanolban): Ámax =245 nm.Ultraviolet spectrum (methanol): A max = 245 nm.
Retenciós idő (preparatív folyadékkromatográfia, ISCO prep Si 10 pm, 60A, Davisil, 250x21,2 mm oszlop; n-hexán - THF 62:38, 9 ml/perc eluens): 24,5 perc.Retention time (preparative liquid chromatography, ISCO prep Si 10 µm, 60A, Davisil, 250 x 21.2 mm column; n-hexane-THF 62:38, 9 mL / min eluent): 24.5 min.
Tömegspektrum: 288 'H-NMR δ (ppm): 0,95 (3H, s, 18-Me), 3,92 (1H, m, H-ll), 5,87 (1H, t, H-4) ,3C-NMR δ (ppm): 27,4 (C-l), 35,9 (C-2), 200,5 (C-3), 124,8 (C-4), 166,5 (C-5), 36,0 (C-6), 30,7 (C-7), 39,3 (C-8), 54,8 (C-9), 43,9 (C-10), 71,8 (C-ll), 42,6 (C-12), 48,2 (C-13), 49,2 (C-14), 21,7 (C-15), 35,7 (C-16), 218,6 (C-17), 14,6 (C-18)Mass Spectrum: 288 1 H NMR δ (ppm): 0.95 (3H, s, 18-Me), 3.92 (1H, m, H-11), 5.87 (1H, t, H-4). , 3 C NMR δ (ppm): 27.4 (Cl), 35.9 (C-2), 200.5 (C-3), 124.8 (C-4), 166.5 (C-). 5), 36.0 (C-6), 30.7 (C-7), 39.3 (C-8), 54.8 (C-9), 43.9 (C-10), 71, Δ (C-11), 42.6 (C-12), 48.2 (C-13), 49.2 (C-14), 21.7 (C-15), 35.7 (C-16) ), 218.6 (C-17), 14.6 (C-18)
2. példaExample 2
Penicillium albidum (ATCC 10408) maláta ferdeagaron növesztett 1-4 hetes tenyészetéről 10 ml steril vízzel készített szuszpenzióval 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml BK-2 táptalajt oltunk. A táptalaj összetételét és készítési módját az100 ml BK-2 medium sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask was inoculated from a 1-4 week culture of Penicillium albidum (ATCC 10408) malt slant on agar agar with 10 ml of sterile water. The composition of the medium and the method of preparation are as follows
1. példa tartalmazza. A tenyészetet 2 napig növesztjük síkrázógépen, 26 °C-on, majd 50 ml tenyészettel 1 liter, laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett BK-7 táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő:Example 1 contains. The culture was grown for 2 days on a flat-bed shaker at 26 ° C and then 1 liter of BK-7 medium sterilized in a laboratory glass fermenter was inoculated with 50 ml of the culture:
1000 ml desztillált vízben.1000 ml of distilled water.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,6 értékre állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 °C-on 20 percig végezzük.The medium was adjusted to pH 6.6 before sterilization. The medium was sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
A beoltott fermentort 26 °C-on termosztáljuk és flatblade keverővei 600 fordulat/perc kevertetéssel, valamint 15 liter/óra levegő átáramoltatással inkubáljuk. 24 óra előtenyésztés után hozzáadunk 20 ml 0,2 g Tween-80-at tartalmazó dimetil-formamidban oldott 1,5 g 4-ösztrén3,17-diont és 1,0 g aszkorbinsavat.The inoculated fermentor was thermostated at 26 ° C and incubated with a flatblade mixer at 600 rpm and a flow rate of 15 liters per hour. After 24 hours pre-culture, 1.5 g of 4-estrene-3,17-dione and 1.0 g of ascorbic acid in 20 ml of dimethylformamide containing 0.2 g of Tween-80 are added.
Három nap múlva a tenyészet vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint 0,17 g (11,3%) 11ahidroxi-4-ösztrén-3,17-diont tartalmaz.After 3 days, the culture contained 0.17 g (11.3%) of 11-hydroxy-4-estrene-3,17-dione by TLC.
HU 216 874 ΒHU 216 874 Β
3. példaExample 3
Cylindrocarpon dydimum var. richter SzB 0599 (NCA1M F 001229) maláta ferdeagaron növesztett 1 -4 hetes tenyészetéről 10-10 ml steril vízzel készített szuszpenzióval 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 2x 100 ml BK-2 jelű táptalajt oltunk. A BK-2 jelű táptalaj összetételét és készítését az 1. példa tartalmazza. A tenyészetet 2 napig növesztjük síkrázógépen, 26 °C-on, majd 5-5 ml tenyészettel oltunk 3x100 ml, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett maláta táptalajt. A maláta táptalaj összetétele a következő:Cylindrocarpon magnitude var. Richter SZB 0599 (NCA1M F 001229) from a 1-4 week culture of malted slant agar was inoculated with 2 x 100 ml BK-2 medium sterilized in 10-10 ml sterile water in a 500 ml Erlenmeyer flask. The composition and preparation of BK-2 medium is described in Example 1. The culture was grown for 2 days on a flat shaker at 26 ° C and 5 x 5 mL of culture was inoculated into 3 x 100 mL malt medium sterilized in a 500 mL Erlenmeyer flask. The composition of the malt medium is as follows:
malátakivonat 60 gmalt extract 60 g
1000 ml csapvízben.1000 ml tap water.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,4 értékre állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 °C-on 20 percig végezzük.The medium was adjusted to pH 6.4 before sterilization. The medium was sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
A kapott tenyészetet síkrázógépen, 26 °C-on 2 napig rázatjuk, majd 250 ml tenyészettel oltunk 5 liter, laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett AF-15 jelű táptalajt. Az AF-15 jelű táptalaj összetétele a következő:The resulting culture was shaken on a flat shaker at 26 ° C for 2 days and then inoculated with 250 ml of culture medium in 5 liters of AF-15 sterilized in a laboratory glass fermenter. The composition of AF-15 medium is as follows:
szaharóz (külön sterilezve) 75 g élesztőkivonat 100 g borostyánkősav 5 gsucrose (sterilized separately) 75 g yeast extract 100 g succinic acid 5 g
Struktol J-633 0,5 g liter csapvízben.Structol J-633 in 0.5 g liter of tap water.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,4-re állítjuk. A sterilezést 121 °C-on 60 percig végezzük.The pH of the medium was adjusted to 6.4 before sterilization. Sterilization was carried out at 121 ° C for 60 minutes.
A beoltott fermentort 26 °C-on termosztáljuk és flatblade keverővei 300 fordulat/perc kevertetéssel és 60 liter/óra levegőátáramoltatással inkubáljuk. 18 óra előtenyésztés után hozzáadunk 0,5 g Tween-80 detergenst és 5 ml Struktol J-633 habgátlót tartalmazó 75 ml dimetil-formamidban oldott 22,5 g 133-etil-4-gonén-3,17diont, valamint 100 ml 50%-os szaharózoldatot.The inoculated fermentor was thermostated at 26 ° C and incubated with a flatblade mixer at 300 rpm and air flow at 60 L / h. After 18 hours of pre-culture, 22.5 g of 133-ethyl-4-gonene-3,17 dione in 0.5 ml of Tween-80 detergent and 5 ml of Structol J-633 foam inhibitor are added and 100 ml of 50% sucrose solution.
Két nap után a tenyészet vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint 9,65 g (42,8%) lla-hidroxi13 3-etil-4-gonén-3,17-diont tartalmaz.After two days, the culture contained 9.65 g (42.8%) of 11a-hydroxy-13-ethyl-4-gonene-3,17-dione by thin layer chromatography.
Ultraibolya színkép (metanolban): Ámax =242 nm.Ultraviolet spectrum (methanol): A max = 242 nm.
Retenciós idő (preparatív folyadékkromatográfia, ISCO prep Si 10 μπι, 60A, Davisil, 250x21,2 mm oszlop; n-hexán - THF 62:38,9 ml/perc eluens): 20,7 perc.Retention time (preparative liquid chromatography, ISCO prep Si 10 μπι, 60A, Davisil, 250 x 21.2 mm column; n-hexane-THF 62: 38.9 mL / min eluent): 20.7 min.
Tömegspektrum: 302Mass Spec: 302
Ή-NMR δ (ppm): 0,87 (3H, t, 19-Me), 3,83 (1H, m, H-ll), 5,84 (1H, t, H-4)1 H-NMR δ (ppm): 0.87 (3H, t, 19-Me), 3.83 (1H, m, H-11), 5.84 (1H, t, H-4)
DC-NMR δ (ppm): 27,3 (C-l), 35,9 (C-2), 200,7 (C-3), 124,6 (C-4), 167,0 (C-5), 36,0 (C-6), 30,9 (C-7), 39,1 (C-8), 54,7 (C-9), 44,0 (C-10), 71,2 (C-l 1), 38,3 (C-12), 51,3 (C-13), 50,0 (C-14), 21,1 (C-15), 35,8 (C-16), 217,8 (C-17), 18,7 (C-18), 7,6 (C-19).DCMR δ (ppm): 27.3 (Cl), 35.9 (C-2), 200.7 (C-3), 124.6 (C-4), 167.0 (C-5) , 36.0 (C-6), 30.9 (C-7), 39.1 (C-8), 54.7 (C-9), 44.0 (C-10), 71.2 ( Cl 1), 38.3 (C-12), 51.3 (C-13), 50.0 (C-14), 21.1 (C-15), 35.8 (C-16), 217 , 8 (C-17), 18.7 (C-18), 7.6 (C-19).
4. példaExample 4
A 3. példa szerinti módon, Cylindrocarpon dydimum var. richter SzB 0599 (NCAIM F 001 229) felhasználásával készített második inokulum 300 ml-ével oltunk 6 liter laboratóriumi fermentorban készített BK-A8 jelű táptalajt, melynek összetétele a következő:As in Example 3, Cylindrocarpon majority var. 300 ml of a second inoculum prepared using richter SZB 0599 (NCAIM F 001 229) was inoculated with 6 liters of BK-A8 medium in a laboratory fermenter, the composition of which is as follows:
szaharóz (külön sterilezve) 60 g élesztőkivonat 120 gsucrose (sterilized separately) 60 g yeast extract 120 g
Struktol J-633 0,3 g liter csapvízben.Structol J-633 in 0.3 g liter of tap water.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,4-re állítjuk.The pH of the medium was adjusted to 6.4 before sterilization.
A sterilezést 121 °C-on 60 percig végezzük.Sterilization was carried out at 121 ° C for 60 minutes.
Az előtenyésztés során 300 fordulat/perc kevertetést és 60 liter/óra levegőátáramoltatást biztosítunk. Az előtenyészet 17 órás korában hozzáadunk 200 ml vízben oldott 80 g β-ciklodextrint és 6 g aszkorbinsavat, majd közvetlenül utána 120 ml dimetil-formamidban oldott 27 g ^-etil-4-gonén-3,l 7-diont. A levegőztetést és kevertetést mikroprocesszoros szabályzó vezérli úgy, hogy az oldott oxigéntartalom ne legyen kevesebb a beoltatlan táptalaj telítési értékének 30%-ánál.The pre-cultivation provides agitation of 300 rpm and air flow of 60 liters / hour. 80 g of β-cyclodextrin in 200 ml of water and 6 g of ascorbic acid were added at 17 hours to the pre-culture, followed immediately by 27 g of N-ethyl-4-gonene-3,7-dione in 120 ml of dimethylformamide. Aeration and agitation are controlled by a microprocessor controller so that the dissolved oxygen content is not less than 30% of the saturation value of the uninoculated medium.
A kétnapos tenyészet vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint 12,1 g (44,8%) 11α-ύίύΓθχί-13βetil-4-gonén-3,l 7-diont tartalmaz.The two-day culture contained 12.1 g (44.8%) of 11α-ύίύΓθχί-13β-ethyl-4-gonene-3,7-dione by TLC.
5. példaExample 5
Cylindrocarpon dydimum var. richter SzB 0599 (NCAIM F 001229) Blake-edényben, maláta agaron növesztett 1-4 hetes tenyészetéről 50 ml steril desztillált vízzel való lemosással 2 db 3000 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 500 ml BK-2 táptalajt oltunk. A tenyészeteket 26 °C-on síkrázógépen inkubáljuk 60 órát, majd 50 ml tenyészettel oltunk 5 liter laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett maláta táptalajt. A tenyésztés 26 °C-on, flat-blade keverővei 300 fordulat/perc kevertetéssel, és 60 liter/óra levegőátáramoltatással történik. 32 óra tenyésztés után az oltófázisból 4 liter tenyészettel oltjuk a 80 liter csapvízzel készült AF-15 jelű fő fázis táptalajt, melynek összetételét és készítését a 3. példa tartalmazza.Cylindrocarpon magnitude var. richter SZB 0599 (NCAIM F 001229) In a Blake dish, wash 500 ml BK-2 medium sterilized in a 3000 ml Erlenmeyer flask with 50 ml sterile distilled water from a 1-4 week culture of malt agar. The cultures were incubated at 26 ° C on a flat shaker for 60 hours and then 50 ml of the culture was inoculated with 5 liters of laboratory medium sterilized malt medium. Cultivation is performed at 26 ° C with a flat-blade mixer at 300 rpm and air flow at 60 L / h. After 32 hours of culture, 4 liters of inoculum is inoculated into the main phase AF-15 medium with 80 liters of tap water, the composition and preparation of which is given in Example 3.
A tenyésztést 26 °C-on 150 fordulat/perc fordulatszámmal kevertetve és 500 liter/óra levegőátbuborékoltatással végezzük. A tenyészet 17 órás korában hozzáadunk 80 g aszkorbinsavat és 1600 ml 8 g Tween-80-at és 80 g Struktol J-633-at tartalmazó dimetil-formamidban oldott 360 g 13 P-etil-4-gonén-3,17-diont.The culture was performed at 26 ° C with stirring at 150 rpm and air bubbling at 500 L / h. At 17 hours of the culture, 360 g of 13? -Ethyl-4-gonene-3,17-dione in 80 ml of ascorbic acid and 1600 ml of dimethylformamide containing 8 g of Tween-80 and 80 g of Structol J-633 are added.
További 2 napig folytatjuk a fermentációt, amikor vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint a tenyészet 184 g (51,5%) 11α-1ιί0Γθχί-13β-εΰ1-4^οηέη3,17-diont tartalmaz.Fermentation was continued for a further 2 days when TLC showed 184 g (51.5%) of 11α-1ιί0Γθχί-13β-εΰ1-4 ^ οη ^η3,17-dione.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9502275A HU216874B (en) | 1995-08-01 | 1995-08-01 | Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9502275A HU216874B (en) | 1995-08-01 | 1995-08-01 | Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9502275D0 HU9502275D0 (en) | 1995-09-28 |
HUT75737A HUT75737A (en) | 1997-05-28 |
HU216874B true HU216874B (en) | 1999-09-28 |
Family
ID=10987090
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9502275A HU216874B (en) | 1995-08-01 | 1995-08-01 | Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
HU (1) | HU216874B (en) |
-
1995
- 1995-08-01 HU HU9502275A patent/HU216874B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU9502275D0 (en) | 1995-09-28 |
HUT75737A (en) | 1997-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mahato et al. | Current trends in microbial steroid biotransformation | |
US4035236A (en) | Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione | |
Lo et al. | Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by a mutant of Mycobacterium sp. | |
US5166055A (en) | Microbiological preparation of 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids | |
WO1997021830A1 (en) | MICROBIAL 11α-HYDROXYLATION OF STEROIDS | |
US4397947A (en) | Microbial process for 9α-hydroxylation of steroids | |
EP0011235B1 (en) | 9-alpha-hydroxy-3-oxopregna-4,17(20)-diene-20-carboxylic acid and its methyl ester and methods for the microbiological production thereof | |
US4062729A (en) | Microbial transformation of steroids | |
US4039381A (en) | Composition of matter and process | |
US4293644A (en) | Process for preparing androst-4-ene-3,17-dione | |
US4528271A (en) | Process for the intensification of microbiological conversions of steroids using cyclodextrin additives | |
HU216874B (en) | Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds | |
Holland et al. | Microbial hydroxylation of acetylaminosteroids | |
US4042459A (en) | Composition of matter and process | |
US4304860A (en) | Process for the microbial transformation of steroids | |
JPS6141547B2 (en) | ||
US3419470A (en) | 11-microbiological hydroxylation of steroids in presence of dimethylsulfoxide | |
US4097335A (en) | Microbial transformation of steroids | |
US4211841A (en) | Process for microbial transformation of steroids | |
US4177106A (en) | Process for preparing 3aα-H-4α-[3'-propanol]-7aβ-methylhexahydro-1,5-indanedione hemiketal | |
US4329432A (en) | Mycobacterium fortuitum strain | |
US4176123A (en) | Steroid intermediates | |
US4345030A (en) | Microorganism mutant conversion of sterols to androsta-4-ene-3,17-dione | |
US4293646A (en) | Composition of matter and process | |
EP1066399A1 (en) | Process for the microbial conversion of phytosterols to androstenedione and androstadienedione |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HC9A | Change of name, address |
Owner name: RICHTER GEDEON NYRT., HU Free format text: FORMER OWNER(S): RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR RT., HU |
|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |