JPS6141547B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Landscapes
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は２ないし10個の炭素原子の17−アルキ
ル側鎖を有するステロイドをキレート化剤の非存
在下で選択的に分解してアンドロスタ−１・４−
ジエン−３・17−ジオン（以下ADDと略記す
る）及びアンドロスト−４−エン−３・17−ジオ
ン（以下ADと略記する）にする突然変異菌であ
りかつ新規な微生物に関する。ADD及びADは有
用なステロイドを製造する重要な中間体である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Industrial Application Field) The present invention is directed to the selective decomposition of steroids having a 17-alkyl side chain of 2 to 10 carbon atoms in the absence of a chelating agent to produce androstalactide. -1・4-
The present invention relates to a novel microorganism that is a mutant strain that produces diene-3,17-dione (hereinafter abbreviated as ADD) and androst-4-ene-3,17-dione (hereinafter abbreviated as AD). ADD and AD are important intermediates in manufacturing useful steroids.
（先行技術）
微生物によつてステロイドを変換することは広
く研究され文献で証明されている。明らかに、最
初のその様な研究はマモリ（Manoli）及びベル
セロン（Vercellone）によりなされ1937年のBer.
70、470及びBre.70 2079にみられる。彼等は醗
酵酵母による17−ケトステロイドの17β−ヒドロ
キシステロイドへの還元を開示した。それ以来、
ペーターソン（Peterson）及びムーレイ
（Murray）が真菌類リゾプス ニグリカンス
（Rhizopusnogricans）によるプロジエステロン
の11−αヒドロキシル化を開示した。（米国特許
2602769号（1952）参照）。より最近ではクライチ
ー（Kraychy）等が米国特許第3684657号
（1972）に17−アルキル側鎖に少くとも８個の炭
素原子を含むステロイドをミコバクテリウム種
NRRL Ｂ−3683を使つて醗酵しアンドロスト−
４−エン−３・17−ジオン、アンドロスト−１・
４−ジエン−３・17−ジオン及び20α−ヒドロキ
シメチル−プレグナ−１・４−ジエン−３−オン
を製造するステロイド17−アルキルの微生物によ
る選択的分解を開示している。更により最近にお
いてはマーシエツク（Marsheck）等が米国特許
第3759791号（1973）に17−アルキル側鎖に少な
くとも８個の炭素原子を含むコレスタン又はスチ
グマスタン系のステロイドのミコバクテリウム種
NRRL Ｂ−3805による醗酵でアンドロスト−４
−エン−３・17−ジオンを微生物によつて選択的
に製造することを開示している。PRIOR ART The conversion of steroids by microorganisms has been widely studied and documented. Apparently, the first such study was done by Manoli and Vercellone in 1937, Ber.
70 , 470 and Bre. 70 2079. They disclosed the reduction of 17-ketosteroids to 17β-hydroxysteroids by fermentation yeast. since then,
Peterson and Murray disclosed 11-α hydroxylation of prodiesterone by the fungus Rhizopusnogricans. (U.S. patent
2602769 (1952)). More recently, Kraychy et al. in U.S. Pat.
Fermented and roasted using NRRL B-3683
4-ene-3・17-dione, androst-1・
The selective microbial degradation of steroid 17-alkyl to produce 4-diene-3,17-dione and 20α-hydroxymethyl-pregna-1,4-dien-3-one is disclosed. More recently, Marsheck et al. (1973) described the use of cholestane- or stigmastane-based steroids containing at least 8 carbon atoms in the 17-alkyl side chain of Mycobacterium species.
Androst-4 by fermentation with NRRL B-3805
The selective production of -ene-3,17-dione by microorganisms is disclosed.
（発明が解決しようとする問題点）
特公昭46−17951、46−16147、46−29193号は
キレート化剤の存在下で微生物によりADD又は
AD系化合物を製造する方法を記載しているが、
これらの方法ではキレート化剤が何れも必須であ
る。(Problems to be solved by the invention) Japanese Patent Publication Nos. 46-17951, 46-16147, and 46-29193 disclose that ADD or
Although it describes a method for producing AD-based compounds,
A chelating agent is essential in all of these methods.
（問題を解決する手段）
２ないし10個の炭素原子の17−アルキル側鎖を
有するステロイドをキレート化剤の組成物非存在
下で選択的に分解しアンドロスタ−1.4−ジエン
−３・17−ジオン（以下ADDと云う）及びアン
ドロスト−４−エン−３・17−ジオン（以下AD
と云う）を醗酵液中に蓄積するそれらの能力によ
つて特徴づけられる突然変異菌はミコバクテリウ
ム属の微生物から本明書細に開示される突然変異
手順又は他の突然変異手順を用いて得ることが出
来る。製造される微生物は新規突然変異微生物ミ
コバクテリウム、フオーツイトウムNRRL Ｂ−
8153及びミコバクテリウム フレイNRRL Ｂ−
8154でありこれらは２ないし10個の炭素原子の17
アルキル側鎖を有するステロイドを選択的に
ADD及びADに分解するのに用いられる。適当な
ステロイド基質の例はシトステロール、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロール
及び２ないし10個の炭素原子の17アルキル側鎖を
有する類似ステロイド類である。これらのステロ
イド基質は純粋なかたちでも粗製形でもよい。(Means of Solving the Problem) Steroids having 17-alkyl side chains of 2 to 10 carbon atoms are selectively decomposed in the absence of a chelating agent composition to produce androsta-1,4-diene-3.17- dione (hereinafter referred to as ADD) and androst-4-ene-3,17-dione (hereinafter referred to as AD
Mutant microorganisms characterized by their ability to accumulate in the fermentation liquor can be isolated from microorganisms of the genus Mycobacterium using the mutagenesis procedures disclosed herein or other mutagenesis procedures. You can get it. The microorganisms produced are new mutant microorganisms, Mycobacterium and Photitium NRRL B-
8153 and Mycobacterium freyi NRRL B-
8154 and these are 17 of 2 to 10 carbon atoms.
Selective steroids with alkyl side chains
Used to break down into ADD and AD. Examples of suitable steroid substrates are sitosterol, cholesterol, stigmasterol, campesterol and similar steroids having 17 alkyl side chains of 2 to 10 carbon atoms. These steroid substrates may be in pure or crude form.
２ないし10個の炭素原子の17アルキル側鎖を有
するステロイド類を選択的に分解し醗酵液中に
ADD及びADを蓄積する能力を有することで特徴
づけられる突然変異菌を得るために、ミコバクテ
リウムフオーツイトウムATCC 6842及びミコバ
クテリウム フレイUC 3533はここに開示される
様に突然変異を起こさせられ、新規な実験室でつ
くられた突然変微生物を与えた。 Selectively decompose steroids with 17 alkyl side chains of 2 to 10 carbon atoms into the fermentation liquid.
To obtain mutant strains characterized by having the ability to accumulate ADD and AD, Mycobacterium phaetitium ATCC 6842 and Mycobacterium freyi UC 3533 were mutagenized as disclosed herein. and a novel laboratory-created mutant microorganism.
1974年のATCCカタログはATCC 6842をリス
トに載せる事と並んで次の事を開示している。ジ
エー．シー．クルツ2.（J.C.Cruz2.）冷膿瘍。
Acta Med.リオデジヤネイロ１：１（1936）。培
地9037C″。M.フオーツイトウムATCC6842はス
テロール類を非選択的に小さい分子量の化合物例
えばCO2＋H2Oに分解する。このようにこの微生
物はADD及びADへの選択的ステロイド分解者と
してはふさわしくない。 In addition to listing ATCC 6842, the 1974 ATCC catalog also discloses: J.A. C. Kurz 2. (JCCruz2.) Cold abscess.
Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 9037C″. M. photuitium ATCC 6842 non-selectively degrades sterols to small molecular weight compounds such as CO 2 + H 2 O. This microorganism is thus unsuitable as a selective steroid degrader for ADD and AD. .
ニトロソグアニジンを用いたM.フオーツイト
ウムATCC 6842及びM.フレイ UC 3533｛UC
はジアツプジヨンカンパニー カルチヤー コレ
クシヨン（The Upjohn Conpany Culture
Collection）を表わす。｝の突然変異は２ないし
10個の炭素原子の17−アルキル側鎖を持つステロ
イドを選択的に分解してADDとADをつくる新規
な突然変異菌の製造を生じた。これらの突然変異
微生物は米国イリノイ州ペオリア（Peoria）米国
農務省ノーザンリージヨナル リサーチ ラボラ
トリー（Northern Regional Research
Laboratory）から入手第号NRRL Ｂ−8153及び
NRRL Ｂ−8154を与えられそこで永久収集中に
寄託がなされている。これらの微生物のサブカル
チヤーはこの寄託所からそこに請求することによ
り自由に入手しうる。培養基を入手しうることが
政府の行為により主題の文書をもつて与えられた
特許権を減損せしせて主題発明の実施の権利を構
成するものではないことが理解されるべきであ
る。微生物工業技術研究所の申請書受託番号は微
工研菌寄第3946号（M.フオーツイトウム）及び
第3947号（M.フレイ）である。 M. phorzuitium ATCC 6842 and M. Frey UC 3533 {UC with nitrosoguanidine
The Upjohn Company Culture Collection
Collection). } mutation is 2 or
This resulted in the production of a novel mutant strain that selectively degrades steroids with 17-alkyl side chains of 10 carbon atoms to produce ADD and AD. These mutant microorganisms were collected at the U.S. Department of Agriculture's Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, USA.
No. NRRL B-8153 and
It was awarded NRRL B-8154 and is now on deposit in permanent collection. These microbial subcultures are freely available from this depository upon request there. It is to be understood that the availability of culture medium does not constitute a right to practice the subject invention by governmental action that diminishes the patent rights granted in the subject document. The application accession numbers of the Institute of Microbial Technology are Microtechnology Research Institute No. 3946 (M. Fotuitum) and No. 3947 (M. Frey).
主題発明の微生物は前に論じられた米国特許第
3759791号に開示されたミコバクテリウムの種
NRRL Ｂ−3805と区別される。NRRL Ｂ−3805
は主題発明のM.−フオーツイトウム及びM.フレ
イとは明確に異なるミコバクテリウム バツカエ
（M.vaccae）の一般特性を有する。これらの微生
物の比較に対してはデターミネーテイブ バクテ
オロジー（Determinative Bacteriology）第８版
ウイリアムズアンド ウイルキンズ カンパニー
（Williams and Wilkins Company）1974、695〜
696ページのバーギーの便覧（Bergeys Manual）
を参照されたし。 The subject invention microorganisms are disclosed in previously discussed U.S. Pat.
Mycobacterium species disclosed in No. 3759791
Distinguished from NRRL B-3805. NRRL B-3805
has the general characteristics of M. vaccae that are distinctly different from the subject invention's M. folium and M. frey. For a comparison of these microorganisms, see Determinative Bacteriology, 8th edition, Williams and Wilkins Company, 1974, 695-
Bergeys Manual, 696 pages
Please refer to.
M.フオーツイトウム NRRL Ｂ−8153及びM.
フレイ NRRL Ｂ−8154の形態及び薬品感受性
は親培養基のM.フオーツイタム ATCC 6842及
びM.フレイ UC 3533とそれぞれ区別できな
い。M.フオーツイタム及びM.フレイ培養基の両
方共アクチノミセターレス（Actinomycetales）
目のミコバクテリアセア（Mycobacteriaceae）
科に属する抗酸性、非運動性、非胞子形成性桿菌
である。ルニヨン イー．エイチ．（Runyon E.
H）1959 Med.Chin.North America43：273のル
ニヨンの分類によればM.フオーツイトウムは非
色素生成性群ミコバクテリウムであり、即ち急
速に低温で成長して無色のコロニーを比較的単純
な培地上に生成する。M.フレイもまた群ミコ
バクテリウムであるが単純培地上で生育されたと
き濃い黄色ないし橙色である。コロニーを生成す
る。 M. photuitum NRRL B-8153 and M.
The morphology and drug susceptibility of M. frey NRRL B-8154 are indistinguishable from the parent cultures M. freyi ATCC 6842 and M. frey UC 3533, respectively. Both M. fortuitutum and M. freyi cultures are Actinomycetales.
Mycobacteriaceae of the eye
It is an acid-fast, non-motile, non-spore-forming bacillus belonging to the family. Runyon E. H. (Runyon E.
H) According to the classification of Runyon in 1959 Med. Generate above. M. frey is also a member of the group Mycobacterium but is dark yellow to orange in color when grown on simple medium. Generate colonies.
M.フオーツイトウム ATCC 6842及びM.フオ
ーツイタム NRRL Ｂ−8153はそれらのステロ
イド分子に対する作用において明らかに区別でき
る。上に関示されたように、M.フオーツイトウ
ム ATCC 6842はステロイドを分解しAD及び
ADDをつくることに関しステロイドの非選択分
解者であつて炭素源としてステロイドを摂取し究
極的にCO2と水にしてしまうのに対してM.フオ
ーツイトウム NRRL Ｂ−8153はステロイドの
選択分解者であつてADとADDを製造する。この
M.フオーツイトウムNRRL Ｂ−8153の性質はこ
こに開示される様にそれ自身を非常に有用なもの
にしている。更にM.フレイ UC 3533とM.フレ
イ NRRL Ｂ−8154もまたそれらのテロイド分
子に対する作用において区別される。M.フレイ
UC 3533はステロイドを分解しAD及びADDを
つくることに関しステロイドの非選択分解者であ
つて炭素源としてステロイドを摂取し究極的に
CO2と水にしてしまうのに対してNRRL Ｂ−
8154はステロイドの選択分解者であつてADと
ADDを製造する。 M. folitium ATCC 6842 and M. folitium NRRL B-8153 are clearly distinguishable in their effects on steroid molecules. As indicated above, M. phorzitium ATCC 6842 degrades steroids and
Regarding the production of ADD, it is a non-selective decomposer of steroids, ingesting steroids as a carbon source and ultimately converting them into CO 2 and water, whereas M. photuitum NRRL B-8153 is a selective decomposer of steroids. Manufacture AD and ADD. this
The properties of M. folitium NRRL B-8153 make it very useful as disclosed herein. Furthermore, M. Frey UC 3533 and M. Frey NRRL B-8154 are also distinguished in their action on theroid molecules. M. Frey
UC 3533 is a non-selective decomposer of steroids in decomposing steroids and creating AD and ADD, and it takes steroids as a carbon source and ultimately
NRRL B- compared to CO 2 and water
8154 is a selective degrader of steroids and is associated with AD.
Manufacture ADD.
M.フオーツイトウム ATCC 6842及びM.フレ
イ UC 3533のM.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153及びM.フレイ NRRL Ｂ−8154への突然
変異はそれぞれニトロソグアニジンの使用により
達成された。手順の詳細は後述される。突然変異
手順は一般に技術において知られているが、主題
突然変異手順の使用により得られるかも知れない
突然変異菌の型はもしあつたとしても教えている
技術はもとより示唆している公知の技術さえもな
い。またここに開示される突然変異の手順及び変
換の手順はミコバクテリウムに対して詳述されて
いるが同様の又は等しい手順がここに開示される
様に他の属の微生物にも使用できる事が理解され
るべきである。 M. photuitium ATCC 6842 and M. frey UC 3533, M. photuitum NRRL B
Mutations to -8153 and M. Frei NRRL B-8154 were each achieved through the use of nitrosoguanidine. Details of the procedure will be described later. Although mutation procedures are generally known in the art, the types of mutant strains that may be obtained by use of the subject mutation procedures, if any, are not known to the art as taught or even suggested. Nor. Additionally, although the mutagenesis and transformation procedures disclosed herein are detailed for Mycobacterium, similar or equivalent procedures may be used for other genera of microorganisms as disclosed herein. should be understood.
変換手順
主題発明の選択的変換はM.フオーツイトウム
NRRL Ｂ−8153又はM.フレイ NRRL Ｂ−
8154の生育しいる培養基の中において、選ばれた
ステロイド基質を培養期間中に加えるか、又は培
養前に栄養培地中に混入することによつて行うこ
とが出来る。ステロイドは単独で又は別のステロ
イドと組み合わせて加えることができる。制限す
るものではないが好ましい培養基中のステロイド
の濃度範囲は１当り約0.1から約100グラムであ
る。培養基では炭素源例えば資化しうる炭水化物
及び窒素源例えば資化しうる窒素化合物又は蛋白
質物質を含んだ栄養培地中において生育がなされ
る。好ましい炭素源はブドウ糖、ブラウンシユガ
ー、シヨ糖、グリセロール、澱粉、とうもろこし
澱粉、乳糖、デキストリン、糖密などを含む。好
ましい窒素源にはコーンステイープリカー、酵
母、自己分解醸造用酵母とミルク固形物、大豆
粉、綿実粉、コーンミール、ミルク固形物、カゼ
インパンクレチン消化物、フイツシユミール、ジ
スチラース・ソリツドブル動物ペプトン液、肉く
ず及び骨くず、アンモニウム塩などが含まれる。
これらの炭素及び窒素源の組み合わせが有利に使
用できる。微量の金属、例えば亜鉛、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、鉄などは水道水及び精
製されない成分が培地滅菌前に培地成分として使
用されるから加えられる必要はない。Conversion procedure Selective conversion of the subject invention is performed by M. Fortuitum.
NRRL B-8153 or M. Frey NRRL B-
This can be done by adding the selected steroid substrate during the cultivation period or by incorporating it into the nutrient medium before cultivation in the culture medium in which 8154 is grown. Steroids can be added alone or in combination with other steroids. A preferred, but non-limiting, concentration range of steroids in the culture medium is from about 0.1 to about 100 grams per steroid. Growth takes place in a nutrient medium containing a carbon source, such as an assimilable carbohydrate, and a nitrogen source, such as an assimilable nitrogen compound or protein substance. Preferred carbon sources include glucose, brown sugar, sucrose, glycerol, starch, corn starch, lactose, dextrin, molasses, and the like. Preferred nitrogen sources include corn staple liquor, yeast, autolytic brewer's yeast and milk solids, soybean flour, cottonseed flour, cornmeal, milk solids, casein puncretin digest, fruit meal, and distillate solids animal peptone fluid. , meat and bone scraps, ammonium salts, etc.
Combinations of these carbon and nitrogen sources can be used advantageously. Trace metals such as zinc, magnesium, manganese, cobalt, iron, etc. do not need to be added as the tap water and unpurified ingredients are used as media components prior to media sterilization.
変換プロセスは約72時間から15日又はそれ以上
の範囲をとることができる。培養温度は約25℃か
ら約37℃の範囲をとることができ30℃がNRRL
−8153に好ましく、35℃がNRRL Ｂ−8154に好
ましい。 The conversion process can range from about 72 hours to 15 days or more. The culture temperature can range from approximately 25°C to approximately 37°C, with 30°C being the NRRL.
-8153 and 35°C is preferred for NRRL B-8154.
内容物は滅菌空気で通気され撹拌されて微生物
の生育が促進され、またかくして変換過程の有効
性が高められる。 The contents are aerated with sterile air and agitated to promote microbial growth and thus increase the effectiveness of the conversion process.
シリカゲル板｛イー．メルク（E.Merck）ダル
ムシユタツト（Darmstadt）｝及び容量で２：３
の酢酸エチル−シクロヘキサンからなる溶媒系を
使つた薄層クロマトグラフイーによつて証明され
る様に変換過程が完了したら所望の変換されたス
テロイドはこの技術において良く知られた方法で
回収される。例えば、醗酵液と細胞とを含む醗酵
（変換）反応混合物はステロイド用の水に混和し
ない有機溶媒で抽出することができる。適当な溶
媒はジクロルメタン（好ましい）、塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、
トリクロルエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベ
ンゼンなどがある。 Silica gel plate {E. E.Merck Darmstadt} and 2:3 by volume
Once the conversion process is complete, as evidenced by thin layer chromatography using a solvent system consisting of ethyl acetate-cyclohexane, the desired converted steroid is recovered by methods well known in the art. For example, a fermentation (conversion) reaction mixture comprising fermentation broth and cells can be extracted with a water-immiscible organic solvent for steroids. Suitable solvents are dichloromethane (preferred), methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, ethylene chloride,
Examples include trichlorethylene, ether, amyl acetate, and benzene.
別の方法としては、醗酵液及び細胞が最初に慣
用の方法例えば過又は遠心分離で分離され、つ
いで別々の適当な溶媒で抽出される。細胞は水混
和性溶媒又は水に混和しない溶媒のいずれかで油
出できる。細胞が無くなつた醗酵液は水と混和し
ない溶媒で抽出できる。 Alternatively, the fermentation broth and cells are first separated by conventional methods such as filtration or centrifugation and then extracted separately with a suitable solvent. Cells can be extracted with either water-miscible or water-immiscible solvents. The cell-free fermentation liquid can be extracted with a water-immiscible solvent.
抽出物は珪藻土を通して過され液は減圧蒸
留されて乾固される。生じる所望の変換されたス
テロイドを含む残溜物は次に酢酸エチル−シクロ
ヘキサン（20：80）の最少量に溶かすことができ
る。この溶液は乾燥シリカゲル上で酢酸エチル−
ベンゼン（20：80）の溶媒系を用いてクロマトグ
ラフにかけることができる。ADD及びADは酢酸
エチル−クロロホルム（15：85）の溶媒系で溶す
ることによつてシリカゲルから分離することがで
きる。化合物はついで溶媒の蒸発とヘキサンでの
再結晶化により別々のものとして単離することが
できる。 The extract is filtered through diatomaceous earth and the liquid is distilled under reduced pressure to dryness. The resulting residue containing the desired converted steroid can then be dissolved in a minimum amount of ethyl acetate-cyclohexane (20:80). This solution was purified on dry silica gel with ethyl acetate.
It can be chromatographed using a solvent system of benzene (20:80). ADD and AD can be separated from silica gel by dissolving in a solvent system of ethyl acetate-chloroform (15:85). The compounds can then be isolated separately by evaporation of the solvent and recrystallization from hexane.
主題発明変換方法の所望生成物は既知ステロイ
ド中間体ADD及びADである。これらの化合物は
有用はステロイドホルモンの合成における中間体
として有用である。例えばADDは米国特許
3274183中に開示された方法に従つてエストロン
をつくるのに使用することができる。またADは
米国特許2143453、：2253798：226488及び
2356154に開示された方法に従つてテストステロ
ンをつくるのに使用できる。 The desired products of the subject invention conversion process are the known steroid intermediates ADD and AD. These compounds are useful as intermediates in the synthesis of steroid hormones. For example, ADD is a US patent
It can be used to make estrone according to the method disclosed in No. 3,274,183. AD is also US Patent No. 2143453, 2253798: 226488 and
It can be used to make testosterone according to the method disclosed in No. 2,356,154.
次の実施例は主題発明の方法及び生成物の例示
であるが制限的に解釈されるべきではない。別に
注意がさられない限りすべてのパーセントは対重
量によりかつすべての溶媒混合比は対容量によ
る。 The following examples are illustrative of the methods and products of the subject invention but are not to be construed as limiting. All percentages are by weight and all solvent mixing ratios are by volume unless otherwise noted.
実施例 １
突然変異M.フオーツイトウム NRRRL Ｂ−
8154のM.フオーツイトウム ATCC 6842から
の製造
(a) ニトロソグアニジン変異誘起
M.フオーツイトウム ATCC 6842が28℃で
次の滅菌種培地中で生育される。Example 1 Mutant M. phortuitum NRRRL B-
Preparation of 8154 from M. phorzuitium ATCC 6842 (a) Nitrosoguanidine mutagenesis M. phorzuitium ATCC 6842 is grown in the following sterile seed medium at 28°C.
ニユートリエントブロス｛デイフコ（Difco）｝
８ｇ/
酵母ブロス １ｇ/
グリセロール ５ｇ/
蒸留水 補充分量 １
PHは1N NaOHで121℃20分間の滅菌に先だつ
て7.0に調節する。Nutrition Broth {Difco}
8g/yeast broth 1g/glycerol 5g/distilled water Replenishment quantity 1 PH is adjusted to 7.0 with 1N NaOH prior to sterilization at 121°C for 20 minutes.
細胞は約５×108／mlの密度に生育され、遠
心分離で小さく丸められついで等容量の滅菌
0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.6で洗われる。洗
われた細胞は等容量のクエン酸緩衝液中に再懸
濁され試料が力価測定のために除かれ（細胞計
数）かつニトロソグアニジンが最終濃度50μ
ｇ／mlまで加えられる。細胞懸濁液は37℃で水
浴中において30分間培養されそのあと試料は再
度力価測定のために除かれ残りは遠心分離され
て等容量の滅菌0.1M燐酸カリウムPH7.0で洗わ
れる。最後に、細胞は炭素源を除いたものから
なる滅菌された最少塩類培地に再懸濁される。 Cells were grown to a density of approximately 5 x 10 8 /ml, rounded into small pieces by centrifugation, and then sterilized into equal volumes.
Washed with 0.1M sodium citrate PH5.6. Washed cells were resuspended in an equal volume of citrate buffer, samples were removed for titration (cell counting) and nitrosoguanidine was added to a final concentration of 50 μl.
g/ml. The cell suspension is incubated in a water bath at 37° C. for 30 minutes, after which the sample is removed for titration again and the remainder is centrifuged and washed with an equal volume of sterile 0.1 M potassium phosphate PH 7.0. Finally, the cells are resuspended in sterile minimal salts medium minus the carbon source.
NH4NO3 0.1 ｇ/
K2HPO4 0.25 ｇ/
MgSO4・7H2O 0.25 ｇ/
NaCl 0.005ｇ/
FeSO4・7H2O 0.001ｇ/
蒸 留 水 １への補充十分量
PHは1N HClで121℃20分間の滅菌に先だつて
7.0に調節される。細胞はついで突然変異菌を
選別するために扁平培養基に出される。 NH 4 NO 3 0.1 g/ K 2 HPO 4 0.25 g/ MgSO 4・7H 2 O 0.25 g/ NaCl 0.005 g/ FeSO 4・7H 2 O 0.001 g/ Distilled water Sufficient amount to replenish to 1 PH is 1N HCl Prior to sterilization at 121°C for 20 minutes
Adjusted to 7.0. The cells are then placed on flat plates to select for mutant bacteria.
(b) 突然変異体M.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153の選別及び単離
上に記された様に突然変異誘起がなされた細
胞は希釈され次のものからなる培地を含む扁平
培養基上に広げられる。｛フレーザー及びジエ
レル（Fraser and Jerrel）1963 J.Biol.
Chem.205：291〜295を修正したもの｝
グリセロール 10.0 ｇ/
K2HPO4 0.5 ｇ/
NH4Cl 1.0 ｇ/
MgSO4・7H2O 0.5 ｇ/
FeCl3・6H2O 0.05ｇ/
蒸 留 水 １への補充に十分な量
寒天（15ｇ/）が加えられ培地は121℃で30分
間オートクレーブにかけられついで滅菌ペトリ
皿に注がれる。(b) Mutant M. photuitum NRRL B
Selection and Isolation of -8153 Cells mutagenized as described above are diluted and spread on flat plates containing medium consisting of: {Fraser and Jerrel 1963 J.Biol.
Modified Chem.205:291-295} Glycerol 10.0 g/ K 2 HPO 4 0.5 g/ NH 4 Cl 1.0 g/ MgSO 4・7H 2 O 0.5 g/ FeCl 3・6H 2 O 0.05 g/ Distilled water Sufficient agar (15 g/) is added to replenish the medium and the medium is autoclaved at 121° C. for 30 minutes and then poured into sterile Petri dishes.
この培地での生育は突然変異誘起手順でつく
られた大部分の栄養的オーキソトローフ（栄養
要求変異株）を除き、例えば化学的に限定され
た培地上で生育するためにビタミン、生育因子
などを要求する培養株は除かれる。28℃で約７
日間培養した後、生じる集落は突然変異株を選
別するのに適当な試験扁平培養基にレプリケー
トされついでグリセルロールを基準にした培地
を含む対照扁平培養基上にもどされる。試験扁
平培養基はピーターソン（Peterson）、ジー．
イー．（G.E.）、エイチ．エル．ルイス（H.L.
Lewis）及びジエー．アール．デービス（J.R.
Dauis）1962。「寒天培地中のコレステロール
及び他の水不溶性炭素源の均一分散液の調製」
ジエー．リピツド リサーチ（J.Lipid
Research）３：275〜276に記された様につく
られる。これらの扁平培養基中の最少塩類培地
は実施例１の(a)部中に前記された通りである。
寒天（15ｇ/）及びシトステロール又はアン
ドロステンジオン（AD）などの適当な炭素源
（1.0ｇ/）が加えられ生じる懸濁液は30分間
121℃でオートクレーブにかけられる。滅菌さ
れた熱い混合物はついて滅菌混合容器に注がれ
若干分間混合され、ついで滅菌ペトリ皿に注が
れる。発泡がこの手順において問題になりがち
であるが混合物が熱い時に混合しかつ溶けた寒
天扁平培養基の表面を炎にあてることによつて
減じることができる。この方法で均一な水不溶
の炭素源の分散液が得られ、これは非常に均一
なしかし不透明な寒天扁平培養基の調製を促進
する。 Growth on this medium is limited, except for most auxotrophs created by mutagenesis procedures, which require vitamins, growth factors, etc. to grow on chemically defined media. Cultures that do this are excluded. Approximately 7 at 28℃
After incubation for days, the resulting colonies are replicated onto suitable test flat plates to select for mutant strains and then placed back onto control flat plates containing a glycerol-based medium. The test flat culture medium was prepared by Peterson, G.
E. (GE), H. L. Lewis (HL
Lewis) and J. R. Davis (JR
Dauis) 1962. "Preparation of homogeneous dispersion of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar medium"
J.A. Lipid Research (J.Lipid
Research) 3:275-276. The minimal salt medium in these flat culture media is as described above in part (a) of Example 1.
Agar (15 g/) and a suitable carbon source (1.0 g/) such as sitosterol or androstenedione (AD) are added and the resulting suspension is incubated for 30 min.
Autoclaved at 121°C. The sterile hot mixture is poured into a sterile mixing container, mixed for a few minutes, and then poured into a sterile Petri dish. Foaming tends to be a problem in this procedure, but can be reduced by mixing when the mixture is hot and exposing the surface of the molten agar plate to a flame. In this way a homogeneous water-insoluble carbon source dispersion is obtained, which facilitates the preparation of highly uniform but opaque agar flats.
対照扁平培養基上で生育するがADを唯一の
炭素源として含む試験扁平培養基上では生育し
ない集落は栄養寒天扁平培養基上に塗沫するこ
とによつて精製される。28℃で生育の後、個々
のクローンは栄養寒天扁平培養基から滅菌つま
ようじで拾われ炭素源としてADを含む格子を
入れられた扁平塩養基に接種することにより再
試験される。それでもなお親株と異なる表現型
を示す精製された単離物は次いで振とうフラス
コ中で評価される。 Colonies that grow on control flats but not on test flats containing AD as the sole carbon source are purified by spreading onto nutrient agar flats. After growth at 28°C, individual clones are picked from nutrient agar plates with sterile toothpicks and retested by inoculating them into gridded plates containing AD as a carbon source. Purified isolates that nevertheless exhibit a different phenotype from the parent strain are then evaluated in shake flasks.
(c) 振とうフラスコ評価
振とうフラスコ（500ml）は次の成分からな
る生成変換培地100mlを含む。(c) Shake flask evaluation A shake flask (500 ml) contains 100 ml of production transformation medium consisting of the following components:
グリセロール 10.0 ｇ/
K2HPO4 0.5 ｇ/
NH4Cl 1.0 ｇ/
MgSO4・7H2O 0.5 ｇ/
FeCl3・6H2O 0.05ｇ/
蒸 留 水 補充に十分量 １
大豆粉（１ｇ/）が培地中に混合され次に
シトステロール（10ｇ/）も培地に混合され
る。フラスコが121℃で30分間オートクレーブ
にかけられた後、それらは28℃に冷やされ次に
10mlの次の様に調製された種生育菌が接種され
る。 Glycerol 10.0 g/ K 2 HPO 4 0.5 g/ NH 4 Cl 1.0 g/ MgSO 4・7H 2 O 0.5 g/ FeCl 3・6H 2 O 0.05 g/ Distilled water Sufficient amount for replenishment 1 Soy flour (1 g/) Mixed into the medium and then sitosterol (10g/) is also mixed into the medium. After the flasks were autoclaved at 121 °C for 30 min, they were cooled to 28 °C and then
10 ml of seed culture bacteria prepared as follows is inoculated.
(b)部分から精製された単離物は28℃で寒天斜
面培養基上に生育される。斜面培養基から取ら
れた一ループの細胞は次の成分からなる100ml
の滅菌種培地を含む500mlのフラスコに接種す
るのに使用される。 The purified isolate from part (b) is grown on agar slants at 28°C. One loop of cells taken from a slant culture medium contains 100 ml of
is used to inoculate a 500 ml flask containing sterile seed medium.
ニユートリエントブロス（デイフコ） ８ｇ/
酵母抽出物 １ｇ/
グリセロール ５ｇ/
蒸 留 水 補充十分量 １
PHはフラスコを121℃で20分間オートクレー
ブにかけるに先立つて1N NaOHで7.0に調節さ
れる。種フラスコは28℃で72時間培養される。 Nutrient Broth (Difco) 8g/ Yeast Extract 1g/ Glycerol 5g/ Distilled Water Sufficient Replenishment 1 PH is adjusted to 7.0 with 1N NaOH prior to autoclaving the flask at 121°C for 20 minutes. Seed flasks are incubated for 72 hours at 28°C.
上に開示された様に10mlの種生育菌がついで
100mlの滅菌変換培地を含む500mlのフラスコの
各各に接種されるのに使用される。フラスコは
ついで28℃ないし30℃で回転振とう機上で培養
され種種の間隔で試が取り上げられる。10mlの
サンプルが除かれ３容量の塩化メチレンと振と
うして抽出される。抽出物の部分はシリカゲル
と上記溶媒系即ち、２：３（容積）酢酸エチル
−シクロヘキサンを用いて薄層クロマトグラフ
イーで分析されまた、気液クロマトグラフイー
で分析される。ADD及びADの存在の証明が親
株M.フオーツイトウム ATCC 6842からつく
られた新規突然変異株によるシトステロールの
選択的分解を確なものとする。 Then add 10 ml of seed culture as disclosed above.
Each is used to inoculate each 500 ml flask containing 100 ml of sterile conversion medium. The flasks are then incubated on a rotary shaker at 28°C to 30°C, and samples are removed at seed intervals. A 10 ml sample is removed and extracted by shaking with 3 volumes of methylene chloride. A portion of the extract is analyzed by thin layer chromatography using silica gel and the above solvent system, 2:3 (by volume) ethyl acetate-cyclohexane, and by gas-liquid chromatography. The demonstration of the presence of ADD and AD confirms the selective degradation of sitosterol by the new mutant strain created from the parent strain M. phortuitum ATCC 6842.
実施例 ２
シトステロールのADD及びADへの変換
使用された培地は実施例１の(c)中のものと同じ
である。Example 2 Conversion of sitosterol to ADD and AD The medium used is the same as in Example 1 (c).
この培地が30分間121℃でオートクレーブにか
けて滅菌されそれから30℃に冷やされついで実施
例１、(c)に記された様に調製された突然変異株ミ
コバクテリウムM.フオーツイトウム BRRL Ｂ
−8153の種培養基の10部分で接種される。接種さ
れた混合物は30℃で336時間深部生育を促進する
ために撹拌しながら培養される。培養に続き、混
合物はジクロルメタンで抽出される。抽出物は無
水硫酸ナトリウム上で乾燥され、溶媒は減圧蒸留
で除かれる。生じる残留物は最少量の酢酸エチル
−シクロヘキサン（20：80）中に溶解される。こ
の溶液は次に乾燥シリカゲル上で酢酸エチル−ベ
ンゼン（20：80）溶媒系を用いてクロマトグラフ
にかけられる。アンドロスト−４−エン−３・17
−ジオン及びアンドロスタ−１・４−ジエン−
３・17−ジオンの存在は薄層クロマトグラフイー
により示される。これらの化合物は酢酸エチル−
クロロホルム（15：85）溶媒系で溶出してシリカ
ゲルから分離される。化合物は次に溶媒蒸発及び
ヘキサンでの再結晶化で単離される。収率は5.0
ｇ／リツトル。 This medium was sterilized by autoclaving at 121° C. for 30 minutes, then cooled to 30° C., and the mutant strain Mycobacterium M. photuitum BRRL B prepared as described in Example 1, (c)
- Inoculated with 10 portions of 8153 seed culture medium. The inoculated mixture is incubated at 30°C for 336 hours with agitation to promote deep growth. Following incubation, the mixture is extracted with dichloromethane. The extract is dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent is removed by vacuum distillation. The resulting residue is dissolved in a minimum amount of ethyl acetate-cyclohexane (20:80). This solution is then chromatographed on dry silica gel using an ethyl acetate-benzene (20:80) solvent system. Androst-4-en-3・17
-dione and androsta-1,4-diene-
The presence of 3,17-dione is shown by thin layer chromatography. These compounds are ethyl acetate-
It is separated from the silica gel by elution with a chloroform (15:85) solvent system. The compound is then isolated by solvent evaporation and recrystallization from hexane. Yield is 5.0
g/liter.
実施例 ３
実施例２中のM.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153をM.フレイ NRRL Ｂ−8154に替えかつ
又実施例２中の培養温度30℃に替えて、ADDと
ADの混合物が得られる。収率は１ｇ／リツト
ル。Example 3 M. phortuitum in Example 2 NRRL B
-8153 to M. Frey NRRL B-8154 and the culture temperature of 30℃ in Example 2, ADD and
A mixture of AD is obtained. Yield: 1g/liter.
実施例 ４
実施例２及び３中のシトステロールをコレステ
ロールに替えてADDとADの混合物が得られる。Example 4 A mixture of ADD and AD is obtained by replacing sitosterol in Examples 2 and 3 with cholesterol.
実施例 ５
実施例２及び３中においてシトラステロールを
スチグマステロールに替えて、ADDとADの混合
物が得られる。Example 5 By replacing citrus sterol with stigmasterol in Examples 2 and 3, a mixture of ADD and AD is obtained.
実施例 ６
実施例２及び３中のシトステロールをカンペス
テロールに替えてADDとADの混合物が得られ
る。Example 6 A mixture of ADD and AD is obtained by replacing sitosterol in Examples 2 and 3 with campesterol.
実施例 ７
実施例２〜６のステロイドの任意の組み合わせ
を実施例２及び３中のシトステロールの外に又は
シトラステロールの代わりに加えることにより、
ADDとAD混合物が得られる。Example 7 By adding any combination of steroids of Examples 2-6 in addition to or in place of sitosterol in Examples 2 and 3,
A mixture of ADD and AD is obtained.
Claims (1)
有するステロイドの存在下で、好気的条件下で、
水性栄養培地中で醗酵液中にアンドロスタ−１・
４−ジエン−３・17−ジオン及びアンドロスト−
４−エン−３・17−ジオンをキレート化剤の非存
在下に於ても蓄積する能力があることを特徴とす
るミコバクテリウムフオルツイツムNRRL Ｂ−
8153及びミコバクテリウム フレイ NRRL Ｂ
−8154から選ばれる新規な人工的に造られた突然
変異株。1 17 Under aerobic conditions in the presence of a steroid containing 2 to 10 carbon atoms in the alkyl side chain,
Androstar-1 in the fermentation broth in an aqueous nutrient medium.
4-Diene-3,17-dione and androst-
Mycobacterium fortitutum NRRL B- characterized by its ability to accumulate 4-ene-3,17-dione even in the absence of a chelating agent.
8153 and Mycobacterium Frey NRRL B
A novel artificially created mutant strain selected from −8154.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66256376A | 1976-03-01 | 1976-03-01 | |
| US662563 | 1976-03-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60133884A JPS60133884A (en) | 1985-07-17 |
| JPS6141547B2 true JPS6141547B2 (en) | 1986-09-16 |
Family
ID=24658223
Family Applications (1)
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