HU215587B - Process for producing water-soluble polypeptides having high affinity for interferons alfa and beta and cells expressing the same and pharmaceutical preparations containing the same - Google Patents
Process for producing water-soluble polypeptides having high affinity for interferons alfa and beta and cells expressing the same and pharmaceutical preparations containing the same Download PDFInfo
- Publication number
- HU215587B HU215587B HU9203955A HU395592A HU215587B HU 215587 B HU215587 B HU 215587B HU 9203955 A HU9203955 A HU 9203955A HU 395592 A HU395592 A HU 395592A HU 215587 B HU215587 B HU 215587B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polypeptide
- interferon
- soluble
- receptor
- hybrid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás a- és b-interferőnnal szemben nagyaffinitással rendelkező vízőldható pőlipeptidek előállításáraönmagűkban vagy egy másődik pő ipeptiddel képezett hibridekfőrmájában. A találmány értelmében az adőtt pőlipeptidet vagy hibridetkifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztik, majd akifejezett terméket elkülönítik. A fenti pőlipeptideket és hibrideketkódőló DNS-szekvenciák, a fenti pőlipeptideket és hibrideket kifejezősejtek és a fenti pőlipeptideket és hibrideket tartalmazó gyógyászatikészítmények előállítá a, tővábbá interferőn receptőr elleniantitestek előállítása és kiműtatása is a találmány tárgyát képezi. ŕField of the Invention The present invention relates to a method for the preparation of a highly agglomerated polybasic peptide peptide having a high affinity for α- and β-interferers, or in a hybrid mammal with a clotting peptide. According to the invention, the cells which are capable of expressing a peptide or hybrid expression are cultured in a suitable medium and then an isolated product is isolated. Production of the above-described peptide peptides and hybrid coding DNA sequences, cells expressing the above-mentioned peptide peptides and hybrids, and pharmaceutical compositions comprising the above-mentioned peptide peptides and hybrids, are also contemplated by the invention. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás új vízoldható polipeptidek, az azokat kódoló DNS-szekvenciák, a polipeptideket kifejezni képes sejtek, valamint a polipeptideket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A találmány tárgya továbbá eljárás interferon receptor elleni antitestek előállítására, és az ilyen antitestek jelenlétének diagnosztikai kimutatására.The present invention relates to novel water-soluble polypeptides, to DNA sequences encoding them, to cells capable of expressing the polypeptides, and to pharmaceutical compositions containing the polypeptides. The invention further relates to a method for producing antibodies against an interferon receptor and for the diagnostic detection of the presence of such antibodies.
Az a- és β-interferon a különböző biológiai tulajdonságokkal rendelkező kiválasztott fehéijék egyik csoportját képezi, és gerincesek sejtjeiben vírusellenes és burjánzásellenes állapotot hoz létre. [I. Gresser és M. G. Tovay: Biochem. Biophys. Acta 516, 23 (1978)].Interferon α and β form a group of selected proteins with different biological properties and create an antiviral and antifungal state in vertebrate cells. [I. Gresser and M. G. Tovay, Biochem. Biophys. Acta 516, 23 (1978)].
Az α-interferon jelentős hatást fejt ki az immunrendszerre, a sejtrendszerre és a humorális rendszerre, és elsősorban a B-sejtek poliklónos aktiválásában [M. Peters: J. Immunoi. 137, 3153 (1986)], a T-sejtek funkcióinak gátlásában [J. Knop és társai: J. Immunoi. 133, 2412 (1984)] és a hisztokompatibilitás-antigének kifejezésének módosításában [M. Fellous és társai: Eur. J. Immunoi. 9, 446 (1979)] vesz részt. Mindezek a folyamatok szerepet játszanak az autoimmunitás kialakulásában.Interferon α exerts significant effects on the immune system, the cellular system and the humoral system, and primarily on the polyclonal activation of B cells [M. Peters: J. Immunol. 137, 3153 (1986)] for inhibiting T cell function [J. Knop et al., J. Immunol. 133, 2412 (1984)] and modifying the expression of histocompatibility antigens [M. Fellous et al., Eur. J. Immunol. 9, 446 (1979)]. All these processes play a role in the development of autoimmunity.
Bár az interferont a szervezet hasznos tényezőjének tekintik, abnormális termelése oki szerepet játszhat egyes betegségek körfolyamatában, és különböző úgynevezett autoimmun-betegséggel kapcsolatos. Magas interferonszint észlelhető például a lupus erythematosusban, reumás artritiszben, Behcet-szindrómában, cukorbetegségben, többszörös szklerózisban, csontvelőapláziában és a súlyos immunhiányos betegségben szenvedő betegek szérumában és szöveteiben. Közvetlen összefüggés áll fenn a túlzott interferonszint és a rossz prognózisú AIDS-betegség kifejlődése között [E. Buimovivi-Klein és társai: AIDS Rés. 2, 99 (1986)].Although interferon is considered a beneficial factor in the body, its abnormal production can play a causal role in the course of some diseases and is associated with various so-called autoimmune diseases. For example, high levels of interferon can be found in the serum and tissues of patients with lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, Behcet's syndrome, diabetes, multiple sclerosis, bone marrow aplasia, and patients with severe immune deficiency. There is a direct association between excessive interferon levels and the development of poorly predicted AIDS disease [E. Buimovivi-Klein et al., AIDS Slit. 2, 99 (1986)].
Ismeretes, hogy az emberi lupus erythematosus állatmodelljeként szolgáló spontán betegségben szenvedő speciális egértörzshöz (NZB) tartozó egereknek avagy β-interferont beadva súlyosbodik a betegség előrehaladása [H. Heremans és társai: Infect. Immun. 21, 925 (1978), C. Adam és társai: Clin. Exp. Immunoi. 40, 373 (1980)].It is known that mice belonging to a specific murine strain (NZB) of the animal model of human lupus erythematosus or agonizing β-interferon exacerbate the disease [H. Heremans et al., Infect. Immun. 21, 925 (1978), C. Adam et al., Clin. Exp Immunol. 40, 373 (1980)].
Fiatal egerekben nagy mennyiségű interferon beadása növekedésgátló szindrómát, májnekrózist és pusztulást idéz elő [I. Gresser és társai: Natúré 258, 76 (1973)]. Hasonlóképpen, ha nőstény egereket neonatális életszakaszukban bizonyos vírusokkal (pl. Pichinda limfocita choriomeningitis vírussal vagy reovírussal) fertőznek meg, nagy mennyiségű endogén interferon termelődik, ami ugyanazt a halálos szindrómát okozza. Az ilyen vírusokkal születéskor megfertőzött fiatal egerek azonban a- vagy β-interferon beadásával megvédhetők a fenti szindrómától [Y. Riviere és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2135 (1977), Y. Riviere és társai: J. Exp. Med. 152, 633 (1980), T. Clark és társai: J. Virol. 59, 728 (1986)]. Ez a kísérlet meggyőzően bizonyítja az interferonnak a fenti betegség körfolyamatában kifejtett káros szerepét.In young mice, administration of high levels of interferon causes growth inhibitory syndrome, hepatic necrosis and death [I. Gresser et al., Natura 258: 76 (1973). Similarly, when female mice are infected with certain viruses (such as Pichinda lymphocyte choriomeningitis virus or reovirus) during their neonatal life, large amounts of endogenous interferon are produced, causing the same fatal syndrome. However, juvenile mice infected with such viruses at birth can be protected from the above syndrome by administration of interferon α or β. Riviere et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2135 (1977), Y. Riviere et al., J. Exp. Med. 152, 633 (1980), T. Clark et al., J. Virol. 59: 728 (1986)]. This experiment convincingly demonstrates the harmful role of interferon in the course of this disease.
Ismert az is, hogy mind az NK-sejtek aktiválását, mind a hisztokompatibilitás-antigének kifejezésének módosulását - amelyek döntő szerepet játszanak az átültetett csontvelő kilökődésében - az a- vagy a β-interferon szabályozza [C. Chien és társai: Science 246, 66 (1989)]. Afifi és társai [J. Immunoi. 134, 3739 (1985)] kimutatták, hogy ha FI egereket vagy allogén egereket rágcsáló eredetű anti-α- vagy β-interferon-szérummal kezelnek, lehetővé válik a parentális vagy allogén csontvelő átültetése és elszaporodása. Ez a tény azt igazolja, hogy az a- vagy β-interferon-termelés FI hibrid egereken a csontvelő-átültetéssel szembeni ellenállás kialakulásának egyik kulcsfontosságú eleme.It is also known that both NK cell activation and histocompatibility antigen expression modifications, which play a crucial role in the rejection of transplanted bone marrow, are regulated by [alpha] or [interferon]. Chien et al., Science 246: 66 (1989)]. Afifi et al., J. Med. Immunol. 134, 3739 (1985)] have shown that treating FI mice or allogeneic mice with anti-α or β-interferon serum from rodents allows for transplantation and reproduction of parent or allogeneic bone marrow. This fact confirms that production of interferon α or β in FI hybrid mice is a key element in the development of bone marrow transplant resistance.
Ismeretes, hogy az interferonok és altípusaik biológiai hatásai azáltal lépnek fel, hogy az interferonok egy specifikus, a sejtfelülethez nagy affinitást mutató receptorral lépnek kölcsönhatásba [M. Aquet és K. E. Mogensen: Academic Press, London, (1983)].The biological effects of interferons and their subtypes are known to interact with a specific receptor with high affinity for the cell surface [M. Aquet and K.E. Mogensen (Academic Press, London, 1983).
Jelenleg az autoimmun-betegségek és az azokkal kapcsolatos más betegségek (pl. sclerosis multiplex) kezelésére nem áll rendelkezésre megfelelő terápia. Az autoimmun-betegségek ismert kezelési eljárásai nem kielégítőek, és toxikus hatásokkal járnak. A „kilökődésellenes” terápiában használt kezelések gátolják ugyan a betegség tüneteit, az okokat azonban nem szüntetik meg, és ugyanakkor nagyon toxikusak. Nagy szükség van tehát olyan gyógyszerekre, amelyek az autoimmun-betegségek kezelésében és a szervkilökődések megakadályozásában kellően hatásosak, ugyanakkor azonban csak kevéssé toxikusak.At present, there is no adequate therapy for the treatment of autoimmune diseases and related diseases such as multiple sclerosis. Known methods of treating autoimmune diseases are unsatisfactory and have toxic effects. The treatments used in "anti-rejection" therapy suppress the symptoms of the disease, but the causes are not eliminated and at the same time they are very toxic. Thus, there is a great need for drugs that are sufficiently effective in the treatment of autoimmune diseases and in preventing organ rejection, but only of low toxicity.
Nagyon célszerű lenne az a- vagy β-interferon hatását antagonista anyag injektálásával blokkolni, mert ez mind az autoimmun típusú betegségek kezelésében, mind az átültetett szövetek kilökődésének megakadályozásában gyógyászatilag kedvező lenne. Az idegen immunglobulinok injektálásán alapuló, már hatékonynak bizonyult megoldások azonban a humán gyógyászat gyakorlatában nem jöhetnek számításba.It would be highly desirable to block the effect of interferon alpha or β by injecting an antagonist as this would be therapeutically beneficial both in the treatment of autoimmune diseases and in the prevention of rejection of transplanted tissues. However, proven solutions based on the injection of foreign immunoglobulins have not proved effective in the practice of human medicine.
A Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 25-39 (1983) közlemény olyan monoklónos antitestet ismertet, amely egy humán α-interferon fajtát a terminális karboxilcsoportjánál képes blokkolni. Minthogy a receptorhoz kötődésben az α-interferon-molekula N-terminális része vesz részt, ez az antitest a sejtfelületi receptorhoz kötött állapotban is képes felismerni az a-interferon terminális karboxilcsoportját. Ez az antitest azonban nem ismeri fel magát a humán α-interferon receptort, és ez az antitest sem az α-interferon receptor oldható formáival, sem a receptor ellen ható monoklónos antitestekkel nem rokon. Az idézett közleményben leírt antitest alkalmas azonban az α-interferon receptor oldható formáinak kimutatására, mert képes az oldható receptorhoz kötött interferonhoz kapcsolódni. Az így kialakult oldható interferon receptor /interferon/anti-interferon monoklónos antitest komplex az anti-interferon monoklónos antitest Fc-fragmenséhez kapcsolódni képes A-fehérje/Sepharose-gyöngyökkel kicsapható, és a csapadékból kimutatható az oldható interferon receptor.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 25-39 (1983) discloses a monoclonal antibody capable of blocking a human α-interferon species at its terminal carboxyl group. Because the N-terminal portion of the α-interferon molecule binds to the receptor, this antibody is able to recognize the terminal carboxyl group of the α-interferon even when bound to the cell surface receptor. However, this antibody does not recognize the human interferon alpha receptor and is not related to soluble forms of the alpha interferon receptor or to monoclonal antibodies to the receptor. However, the antibody described in that publication is capable of detecting soluble forms of the α-interferon receptor because of its ability to bind to the soluble receptor-bound interferon. The soluble interferon receptor / interferon / anti-interferon monoclonal antibody complex thus formed can be precipitated with protein A / Sepharose beads capable of binding to the Fc fragment of the anti-interferon monoclonal antibody and the soluble interferon receptor can be detected in the precipitate.
Találmányunk azon az új megközelítésen alapul, hogy az a- vagy β-interferon hatásának blokkolására antagonistaként az α-interferon specifikus receptorának oldható formáit használjuk. A természetes receptor génsebészeti eljárásokkal előállított ilyen oldható formáiThe present invention is based on the novel approach of using soluble forms of the specific receptor for interferon-α as antagonists to block the action of α- or β-interferon. Such soluble forms of the natural receptor produced by genetic engineering techniques
HU 215 587 Β megtartják a keringő vagy helyi endogén a-interferont megkötő képességüket, ugyanakkor azonban nem tartalmazzák azt a molekularészt, ami a természetes receptort a sejtfelülethez rögzíti. Ezért az α-interferon specifikus receptorának oldható formái szabadon keringhetnek a szervezetben, és specifitásuk révén csak az avagy β-interferonhoz kötődnek.They retain their ability to bind circulating or local endogenous interferon alpha, but do not contain the moiety that binds the natural receptor to the cell surface. Therefore, soluble forms of the specific receptor for α-interferon are freely circulating in the body and, by virtue of their specificity, bind only to or interferon β.
Az α-interferon specifikus receptorának oldható formái - az antitestekhez hasonlóan - képesek az avagy β-interferonnak a szervezetben kifejtett hatásait blokkolni.Soluble forms of the specific receptor for α-interferon, like antibodies, are capable of blocking the effects of α or interferon in the body.
A találmány értelmében az α-interferon specifikus receptorának ilyen oldható formáit állítjuk elő, amelyeket a továbbiakban vízoldható polipeptideknek nevezünk.The present invention provides such soluble forms of the α-interferon specific receptor, hereinafter referred to as water-soluble polypeptides.
A találmány tárgya tehát eljárás vízoldható polipeptidek, éspedigThe present invention thus relates to a process for water soluble polypeptides
a) az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid és annak delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékai,a) a polypeptide having the amino acid sequence shown in Figure 1 and its derivatives formed by deletion and / or substitution,
b) az 1. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptidek, ésb) polypeptides encoded by the nucleic acid sequence shown in Figure 1, and
c) a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékai előállítására önmagukban vagy egy másik polipeptiddel képezett hibridek formájában.c) for deletion and / or substitution of the polypeptide of the amino acid sequence shown in Figure 2, alone or in the form of hybrids with another polypeptide.
A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az adott polipeptidet vagy hibridet kifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztjük, majd a kifejezett terméket elkülönítjük.According to the invention, cells capable of expressing a given polypeptide or hybrid are cultured in a suitable medium and the expressed product is isolated.
A találmány szerinti eljárással előállítható vízoldható polipeptidek a- és β-interferonnal szemben nagy affinitást mutatnak, ami azt jelenti, hogy a komplex disszociációs állandója 10 9 M-nél kisebb.The water-soluble polypeptides of the present invention have high affinity for interferon α and β, which means that the dissociation constant of the complex is less than 10 9 M.
A „vízoldható” kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptid képes a szervezetben (például az emberi testben) keringeni, majd egy sejthez kötődni.The term "water-soluble" means that the polypeptide is able to circulate in the body (e.g., the human body) and then bind to a cell.
A leírásban a „hibrid” megjelölésen egy, a fentiekben meghatározott vízoldható polipeptid (természetes receptor „oldható” része, módosított teljes receptor vagy például helyettesítéssel módosított természetes receptor „oldható” része) és egy másik polipeptid (például egy immunoglobulin vagy immunoglobulin-ffagmens) fúziós vagy konjugációs termékét értjük.As used herein, the term "hybrid" refers to a fusion of a water-soluble polypeptide (a "soluble" portion of a natural receptor, a modified whole receptor, or a soluble portion of a modified natural receptor, for example) and another polypeptide (e.g., an immunoglobulin or or a conjugation product thereof.
Egyszerűsítés céljából a továbbiakban az „a- és βinterferon receptor” kifejezés helyett az „interferon receptor” kifejezést is használjuk.For the sake of simplification, the term "interferon receptor" is used herein instead of "α- and β-interferon receptor".
A találmány szerint előállítható vízoldható polipeptidek egyik előnyös képviselője az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú vegyület, ami az a- vagy β-interferon természetes natív receptorának extracelluláris oldható része.A preferred embodiment of the water-soluble polypeptides of the present invention is a compound having the amino acid sequence shown in Figure 1, which is an extracellular soluble part of the natural native receptor for interferon alpha or.
Az ebből a polipeptidből delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékok is megtartják a fenti interferonokkal szembeni nagy affinitást. Az 1. ábrán feltüntetett polipeptid deléciókkal és/vagy helyettesítésekkel kialakított származékainak előállítása is a találmány tárgyát képezi.Derivatives formed by deletion and / or substitution of this polypeptide also retain high affinity for the above interferons. It is also an object of the present invention to provide derivatives of the polypeptide shown in Figure 1 by deletions and / or substitutions.
A deléciókkal kapcsolatban megjegyezzük, hogy az 1. ábrán feltüntetett polipeptidben lévő egy vagy több aminosav az a- és β-interferonnal szemben mutatott affinitás kedvezőtlen változása nélkül deletálható.With respect to deletions, it is noted that one or more amino acids in the polypeptide shown in Figure 1 can be deleted without adversely affecting the affinity for interferon α and β.
A deléciók a teljes és natív receptorra is vonatkozhatnak, különösen az oldható rész szintjén. Ily módon például a sejtmembránhoz való kötődés képessége elveszthető, és ezáltal a deletált termék a keringés számára rendelkezésre áll.Deletions may also apply to the full and native receptors, particularly at the soluble level. In this way, for example, the ability to bind to the cell membrane may be lost, thereby rendering the deleted product available to the circulation.
Ha a natív és teljes interferon receptornak a 2. ábrán feltüntetett szekvenciájából indulunk ki, a szekvencia transzmembrán és citoplazmikus szakaszai elhagyhatók.Starting from the sequence of the native and complete interferon receptor shown in Figure 2, the transmembrane and cytoplasmic regions of the sequence may be omitted.
A transzmembrán tartománynak megfelelő 437-457. maradék és a citoplazmikus tartománynak megfelelő 458—557. maradék deletálása például oldható (keringésre képes) formák képződéséhez vezet.437-457 corresponding to the transmembrane domain. residues 458 to 557 corresponding to the cytoplasmic domain. deletion of the remainder leads, for example, to the formation of soluble (circulating) forms.
A teljes Ct- és β-interferon receptort kódoló aminosavak és nukleotidok teljes szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be.The complete sequence of the amino acids and nucleotides encoding the full Ct and β interferon receptor is shown in Figure 2.
Amennyiben a deléciókat a transzmembrán és citoplazmikus (vagy celluláris és intracelluláris) szakaszokon végezzük el, kiküszöbölhetjük a potenciálisan immun epitópokat. A deletált transzmembrán tartományú natív a- és β-interferon receptorok egyik előnye, hogy a rekombináns gazdasejtek szövettenyészetének felülúszójában képesek kiválasztódni.Deletions in the transmembrane and cytoplasmic (or cellular and intracellular) regions can eliminate potentially immune epitopes. One of the advantages of the deletion of the transmembrane native α- and β-interferon receptors is that they are secreted in the supernatant of tissue culture of recombinant host cells.
Miként már említettük, az 1. és 2. ábrán feltüntetett aminosav-szekvenciájú polipeptidekből delécióval származtatható vízoldható polipeptidek is a találmány szerint előállítható vegyületek közé tartoznak.As mentioned above, water-soluble polypeptides which can be derived from the polypeptides having the amino acid sequence shown in Figures 1 and 2 are also compounds of the present invention.
A helyettesítéses variánsok előállítása szintén a találmány tárgyát képezi. Ezeknél az interferon szekvenciájában lévő egy vagy több aminosav eltávolítható vagy más aminosavakkal helyettesíthető oly módon, hogy az aminosav össz-száma változatlan marad.The invention also relates to the preparation of substitutional variants. In these cases, one or more amino acids in the interferon sequence may be removed or replaced with other amino acids so that the total number of amino acids remains unchanged.
A helyettesítések előnyösen az interferon receptor oldható részére vonatkoznak. Ha a receptor oldható részének funkciójában vagy immunológiai azonosságában számottevő változást kívánunk előidézni, olyan nem konzervatív helyettesítéseket és aminosav-maradékokat vagy szekvenciákat választunk ki, amelyek a polipeptidben eredetileg jelenlévő csoportoktól abban különböznek, ami a polipeptid háromdimenziós szerkezetének a helyettesítés közelében való megtartása, valamint a molekula vagy az oldallánc túlnyomó része konjugációjának vagy hidrofobicitásának megmaradása szempontjából a legnagyobb jelentőséggel bír.The substitutions preferably refer to the soluble portion of the interferon receptor. To produce a significant change in the function or immunological identity of the soluble portion of the receptor, non-conservative substitutions and amino acid residues or sequences that are different from the groups originally present in the polypeptide are selected that maintain the three-dimensional structure of the polypeptide near the substitution. or is of most importance for maintaining conjugation or hydrophobicity of the majority of the side chain.
A receptor tulajdonságait módosító helyettesítések közül különösen jelentősek az alábbiak:Among the substitutions modifying the properties of the receptor are the following:
- valamely aminosav-maradéknak (pl. szeril vagy treonil) hidrofób maradékkal (pl. leucil, izoleucil, fenilalanil, alanil vagy valil) történő helyettesítése,- replacement of an amino acid residue (eg seryl or threonyl) with a hydrophobic residue (eg leucyl, isoleucyl, phenylalanyl, alanyl or valyl),
- ciszteinil-maradéknak bármely más maradékkal történő helyettesítése,- replacement of the cysteine residue with any other residue,
- elektropozitív oldalláncot tartalmazó maradéknak (pl. lizil, arginil vagy hisztidinil) elektronegatív maradékkal (pl. glutamil vagy aszpartil) történő helyettesítése,- substitution of an electropositive residue (eg lysyl, arginyl or histidinyl) with an electronegative residue (eg glutamyl or aspartyl),
- nagy térkitöltésű láncot tartalmazó maradéknak (pl. fenilalanil) ilyen részt nem tartalmazó maradékkal történő helyettesítése.- substitution of a residue with a large volumetric chain (eg phenylalanyl) with a residue without such a moiety.
A helyettesítéses variánsok szintén a teljes interferon receptor szerkezetére vonatkozhatnak, és előnyösenSubstituted variants may also refer to the structure of the entire interferon receptor, and preferably
HU 215 587 Β a transzmembrán tartományt érintik. Az ezen a szinten végzett helyettesítések csökkentik a polipeptidnek a lipidsejtekkel vagy membránokkal szembeni affinitását, és igy az a- és β-interferon receptorának oldható formáit eredményezik.21 affect the transmembrane domain. Substitutions at this level reduce the affinity of the polypeptide for lipid cells or membranes and thus result in soluble forms of the α and β interferon receptors.
A transzmembrán szakasz például egy attól eltérő olyan aminosav-szekvenciával (így homopolinukleotid DNS-szekvenciával vagy 5-50 azonos aminosavat például szerint, lizint, arginint, glutamint és aszparaginsavat - vagy más hidrofil aminosavakat tartalmazó bármely szekvenciával) helyettesíthető, ami lehetővé teszi, hogy az oldható receptor a rekombináns gazdasejtek tenyésztésekor a táptalajba választódjon ki.For example, the transmembrane moiety may be replaced by a non-unique amino acid sequence (such as a homopolinucleotide DNA sequence, or any sequence containing 5 to 50 identical amino acids, such as lysine, arginine, glutamine, and aspartic acid - or other hydrophilic amino acids) allowing soluble receptor is secreted into the culture medium when culturing recombinant host cells.
Az 1. és 2. ábrán bemutatott polipeptidekből helyettesítéssel származtatható vízoldható polipeptidek előállítása is a találmány tárgyát képezi.It is also an object of the present invention to provide water-soluble polypeptides which can be derived from the polypeptides shown in Figures 1 and 2.
A fentiekből megállapítható, hogy a találmány szerint előállított polipeptidekben helyettesítések vagy deléciók, valamint az ilyen módosítások kombinációi egyaránt előfordulhatnak.It will be appreciated from the foregoing that substitutions or deletions, and combinations of such modifications, may occur in the polypeptides of the invention.
Általánosságban megállapítható, hogy a helyettesítéssel és/vagy delécióval kapott variánsoknak nincs funkcionális transzmembrán szakasza, és előnyösen intracelluláris (citoplazmás) része sincs.In general, the variants obtained by substitution and / or deletion have no functional transmembrane region and preferably no intracellular (cytoplasmic) part.
Megjegyezzük, hogy a találmány szerint előállított vízoldható polipeptidekből kémiai módosításokkal más variánsok is kialakíthatók. Az ilyen módosítások célja elsősorban az a- és β-interferon receptor jellemző tulajdonságainak javítása. A kémiailag módosított polipeptidek például hidrofil polimereket tartalmazhatnak [ilyen például a szabad aminocsoportot hordozó aminosav-maradékokra (így a lizinre) vagy a szulfhidrilcsoportokra ojtott poli(etilén-glikol)]. A kémiai módosításokkal növelhető a polipeptidek felezési ideje a plazmában, fokozható a polipeptidek oldhatósága és/vagy csökkenthető a polipeptidek immunogén jellege. Ezeket a módosításokat önmagukban ismert módszerekkel - például a 4179337 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon - végezhetjük el.It will be appreciated that other variants of the water-soluble polypeptides of the present invention may be chemically modified. Such modifications are primarily intended to improve the intrinsic properties of the α and β interferon receptors. Chemically modified polypeptides may contain, for example, hydrophilic polymers (such as poly (ethylene glycol) grafted on free amino acid residues (such as lysine) or sulfhydryl groups). Chemical modifications can increase the plasma half-life of polypeptides, increase the solubility of polypeptides, and / or reduce the immunogenicity of the polypeptides. These modifications may be made by methods known per se, such as those described in U.S. Patent No. 4,179,337.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben meghatározott polipeptidek hibridizált (vagy emellett konjugált) módosulatainak előállítása is.The invention also relates to the production of hybridized (or additionally conjugated) forms of the above-defined polypeptides.
A konjugációban (hibridizációban) részt vevő második polipeptid például egy immunokompetens polipeptid lehet. Ilyen polipeptidek például azok, amelyek a hibridizált polipeptiddel kezelt állatban immunválaszokat váltanak ki, vagy amelyek az oldható interferon receptornak meg nem felelő polipeptidrésszel szembeni bármely antitesthez kapcsolódni képesek.For example, the second polypeptide involved in conjugation (hybridization) may be an immunocompetent polypeptide. Such polypeptides are, for example, those that elicit immune responses in an animal treated with the hybridized polypeptide, or that are capable of binding to any antibody to a polypeptide moiety that is not a soluble interferon receptor.
A receptornak meg nem felelő epitópok általában olyan antigéneket tartalmaznak, amelyeket a szervezetben már meglévő antitestek fel tudnak ismemi. Ilyenek például a baktériumok polipeptid-fragmensei, így a βgalaktozidáz.Non-receptor epitopes generally contain antigens that are recognized by antibodies already present in the body. For example, polypeptide fragments of bacteria such as β-galactosidase.
Az immunkonjugációt például in vitro körülmények között keresztkötések kialakításával vagy egy immunogén polipeptidet kódoló DNS-sel transzformált rekombináns sejt tenyészetének felhasználásával végezhetjük el.Immunoconjugation can be accomplished, for example, by crosslinking in vitro or by culturing a recombinant cell transformed with DNA encoding an immunogenic polypeptide.
Előnyös megoldás szerint az immunogén ágenst polipeptid-kötéssel illesztjük be vagy kapcsoljuk hozzá az oldható receptorhoz vagy az oldható receptorból leszármaztató fragmenshez úgy, hogy az oldható receptornak megfelelő epitópokat és legalább egy, az oldható receptortól idegen epitópot tartalmazó polipeptidláncot kapjunk. Ezeket az epitópokat a polipeptidláncnak a receptorral vagy a receptor fragmensével kompatíbilis bármely más lókuszába beiktathatjuk.Preferably, the immunogenic agent is inserted or linked to a soluble receptor or a soluble receptor-derived fragment by binding to a polypeptide to produce epitopes corresponding to the soluble receptor and at least one polypeptide chain that is foreign to the soluble receptor. These epitopes can be inserted into any other locus in the polypeptide chain that is compatible with the receptor or receptor fragment.
Ezek a hibridek különösen előnyösen hasznosíthatók interferonreceptor-ellenes antitestek kialakítására melegvérűek szervezetében. Az így termelt antitestek például diagnosztikai szerekként használhatók az interferon receptorok biológiai mintákban való jelenlétének kimutatására, vagy a natív receptor vagy az interferon oldható receptorának tisztítására alkalmazhatók.These hybrids are particularly useful for the production of anti-interferon receptor antibodies in warm-blooded individuals. The antibodies thus produced can be used, for example, as diagnostic agents to detect the presence of interferon receptors in biological samples or to purify the native receptor or the soluble receptor for interferon.
A konjugált polipeptidek egy másik csoportját alkotják azok az esetenként immunogén hibridek, amelyek a találmány szerint előállított polipeptid C-terminális régiójával konjugált másik vízoldható polipeptiden kívül még egy homopolimert (például pentahisztidint) is tartalmaznak. Ezek a hibridek hordozón rögzített kelátképző szerek (például cinkionok) segítségével könnyen elkülöníthetők a hibridek mellett szennyező anyagokat is tartalmazó keverékekből. A hordozóhoz kötött kelátképző szer segítségével adszorbeált hibridek egyszerűen leoldhatók a hordozóról, majd az így tisztított hibridekből kívánt esetben például enzimes hasítással felszabadítható az oldható interferon receptor.Another class of conjugated polypeptides are occasionally immunogenic hybrids which contain, in addition to another water soluble polypeptide conjugated to the C-terminal region of the polypeptide of the invention, a homopolymer (e.g., pentahistidine). These hybrids can be easily separated from mixtures containing impurities in addition to the hybrids by means of chelating agents (such as zinc ions) fixed on a support. The hybrids adsorbed by the carrier-bound chelating agent may be readily resolved from the support, and the hybrids thus purified may, if desired, release the soluble interferon receptor, for example by enzymatic cleavage.
A hibridek egy további csoportját képezik azok, amelyekkel javítható az oldható receptor kiválasztása. Ezekben a hibridekben az oldható receptor szignál polipeptidjét egy heterológ szignál polipeptid helyettesíti. Ha a gazdasejt ezt a hibridet felismeri, akkor azt fel is használja, és a receptor kiválasztódik.Another class of hybrids are those that improve soluble receptor selection. In these hybrids, the signal polypeptide of the soluble receptor is replaced by a heterologous signal polypeptide. If the host cell recognizes this hybrid, it will use it and the receptor will be secreted.
A szignál polipeptideket a felhasznált gazdasejt jellemzőinek megfelelően választjuk meg. A szignál polipeptid például baktérium-, élesztő-, gomba-, növény-, emlős- vagy víruseredetű szekvencia lehet.The signal polypeptides are selected according to the characteristics of the host cell used. The signal polypeptide may be, for example, a bacterial, yeast, fungal, plant, mammalian, or viral sequence.
A hibridek előnyös csoportját képezik azok, amelyekben a hibridképző második polipeptid speciális szerkezete révén lelassítja a hibrid lebomlását az emberi szervezetben. Az ilyen második polipeptidek igen előnyös képviselői a receptor oldható részénél hosszabb (célszerűen több mint 20 órával hosszabb) felezési idejű plazmafehéqék, amelyek a találmány szerint előállított oldható polipeptidekkel hibridizálva meghosszabbítják az oldható polipeptidek hatásának időtartamát. Ilyen plazmafehéqe például a szérum albumin és az apolipofehéijék. A plazmafehérjék különösen előnyös képviselői az immunoglobulinok, elsősorban a G típusú, kiemelkedően előnyösen a G1 típusú immunoglobulinok.A preferred group of hybrids are those in which the hybrid-forming second polypeptide slows down the breakdown of the hybrid in the human body by a special structure. Highly preferred representatives of such second polypeptides are plasma proteins with a longer half-life (preferably more than 20 hours) than the soluble portion of the receptor, which, when hybridized with the soluble polypeptides of the invention, prolongs the duration of action of the soluble polypeptides. Examples of such plasma proteins are serum albumin and apolipophosphates. Particularly preferred examples of plasma proteins are immunoglobulins, in particular type G immunoglobulins, most preferably type G1 immunoglobulins.
A fenti hibridek az azokkal kezelt állati vagy emberi szervezetben előnyösen nem immunogének, és a plazmafehétjék saját biológiai aktiválásuk révén a betegekben káros mellékhatásokat nem idéznek elő.The above hybrids are preferably non-immunogenic in the animal or human body treated with them, and the plasma proteins, by their biological activation, do not cause adverse side effects in patients.
A találmány szerint előállított vízoldható polipeptideket előnyösen a konstans tartomány szintjén konjugáljuk immunoglobulinokkal. Előnyösen G típusú, célszerűen G1 típusú immunoglobulint használunk.The water-soluble polypeptides of the present invention are preferably conjugated to immunoglobulins at the constant region level. Preferably, a type G immunoglobulin is used, more preferably a G1 type.
HU 215 587 ΒHU 215 587 Β
Az immunoglobulinok és néhány variánsuk ismert, ezek sok képviselőjét rekombináns sejttenyészetekkel állítják elő [Kohler és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980), Morrison és társai: Ann. Rév. Immunoi. 2, 239 (1984)].Immunoglobulins and some variants thereof are known, many of which are produced by recombinant cell cultures [Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (Morrison, 1980), Ann. Port. Immunol. 2, 239 (1984)].
Az a- és β-interferon natív receptora extracelluláris részének aktivitásával rendelkező polipeptidek C-terminális végükön a könnyű lánc vagy nehéz lánc konstans tartománya N-terminális végződésével lehetnek konjugálva.Polypeptides having the activity of the extracellular portion of the α and β interferon native receptors can be conjugated at their C-terminus to the N-terminus of the light chain or heavy chain constant region.
Ily módon a variábilis tartomány helyettesíthető, és legalább a nehéz lánc konstans tartományának CH2 és CH3 átmeneti tartománya funkcionálisan aktív formában megtartható.In this way, the variable region can be replaced and at least the transition regions CH2 and CH3 of the heavy chain constant region can be maintained in a functionally active form.
Erre a célra a megfelelő DNS-szekvencia kialakítható, és a rekombináns sejttenyészetekben kifejezhető.For this purpose, the appropriate DNA sequence can be constructed and expressed in recombinant cell cultures.
Az immunoglobulinok és az a- és β-interferon oldható receptoránál a plazmában hosszabb felezési időt mutató más polipeptidek ugyanígy konjugálhatók a fenti receptorral és variánsaival.Similarly, the polypeptides having a longer plasma half-life at the soluble receptor for immunoglobulins and interferon α and β may also be conjugated to the above receptor and variants.
Az interferon receptor extracelluláris része legfeljebb 427-436 aminosavat tartalmaz, a kezdeti metionintól kiindulva (lásd az 1. ábrát).The extracellular portion of the interferon receptor contains up to 427-436 amino acids, starting from the initial methionine (see Figure 1).
A rögzítési tartományt magában foglaló sejttartományt tartalmazó szekvenciákat általában az immunoglobulinok szekvenciájával konjugáljuk.Sequences containing the cell region comprising the anchoring region are generally conjugated to immunoglobulin sequences.
A konjugáció pontos helye nem döntő jelentőségű tényező. A fentiekben megjelölt kötődési helyek csupán tájékoztató jellegűek, és az a- és β-interferon oldható receptora kiválasztódási vagy rögzítési jellemzőinek optimalizálása céljából a konjugáció számára az oldható interferon más szomszédos helyei is választhatók. Az optimális hely szokásos kísérletek segítéségével határozható meg.The exact location of the conjugation is not critical. The above binding sites are for information only, and other adjacent soluble interferon sites for conjugation can be selected to optimize the secretion or attachment characteristics of the soluble receptor for α- and β-interferon. The optimal location can be determined using standard experiments.
Általában azt találtuk, hogy a hibridek kifejeződnek a sejtben, a rekombináns gazdasejtek szekréciójának mértéke azonban bizonyos fokig változó. Az alábbi táblázatban különböző kapott immunoglobulin-interferonreceptor-fuziókat mutatunk be.In general, hybrids have been found to be expressed in a cell, but the degree of secretion of recombinant host cells varies to some degree. The following table shows the different immunoglobulin interferon receptor fusions obtained.
a) RC1a) RC1
b) (RC1)2(b) (RC1) 2
c) (RCh)2(c) (RCh) 2
d) (RC12)2(RCh)2, ahol „R” az a- és β-interferon oldható receptornak a rögzítés helyét tartalmazó extracelluláris szakaszának egy részét jelenti, míg Cl és Ch rendre a humán immunoglobulin könnyű láncának és nehéz láncának konstans tartományát jelenti. A fenti szerkezetek csupán a fő szerkezeti jellemzőket mutatják be, és például a közös (J) tartományt vagy az immunoglobulinok más szakaszait vagy a diszulfidhidakat nem mutatják. Ha a megkötési aktivitáshoz ilyen szakaszokra szükség van, úgy ezeknek olyan helyzetben kell jelen lenniük, amelyet az a- és β-interferon oldható receptorokban, az aés β-interferon immunoreceptorokban vagy az immunoglobulinban a természetben elfoglalnak.d) (RC12) 2 (RCh) 2, wherein "R" represents a portion of the extracellular portion of the soluble receptor at the α- and β-interferon, and Cl and Ch, respectively, represent the constant region of the human immunoglobulin light chain and heavy chain. . The above structures only show the main structural features and do not, for example, show the common (J) domain or other regions of immunoglobulins or disulfide bridges. If such sequences are required for binding activity, they must be in a position that is naturally occupied by soluble receptors α- and β-interferon, immunoreceptors α-interferon or immunoglobulin.
Ezek a példák a különböző ligandum/receptor-helyeket tartalmazó bifunkcionális hetero-antitestek olyan képviselői, ahol a VhCh immunoglobulin egy előre meghatározott antigénhez képes kapcsolódni. Más osztályokba tartozó immunoglobulinok nehéz láncainak felhasználása esetén komplexebb szerkezetek keletkeznek (pl. IgM, IgG2, 3,4, IgA, IgE, IgD, előnyösen IgGl).These examples are representative of bifunctional hetero-antibodies containing different ligand / receptor sites where VhCh immunoglobulin is capable of binding to a predetermined antigen. The use of heavy chains of other classes of immunoglobulins results in more complex structures (e.g., IgM, IgG2, 3,4, IgA, IgE, IgD, preferably IgG1).
Előnyös hibridek keletkeznek olyan oldható a- és β-interferon receptor N-terminálisának fúziójával, amely az a- és β-interferon liganduma számára kötődési helyet az immunoglobulin Gl-t befolyásoló funkciókat tartalmazó antitest Fc C-terminális részében tartalmaz. A példákban ilyen hibrideket is bemutatunk.Preferred hybrids are formed by fusion of the N-terminus of the soluble α- and β-interferon receptor, which contains a binding site for the α and β-interferon ligands in the C-terminal portion of an antibody containing immunoglobulin G1-influencing functions. Such hybrids are also illustrated in the examples.
Az ilyen hibridek jellemzően az oldható a- vagy β-interferon receptor első 436 vagy 427 aminosavját tartalmazzák C-terminális végével a K-lánc vagy a Gl-lánc konstans tartományához kapcsolva. Az 1. ábrán bemutatott oldható a- vagy β-interferon receptort kódoló DNS-t a PCR-reakció [Polymerase Chain Reaction, lásd R. K. Saiki és társai: Science 239, 487-491 (1988)] és megfelelő restrikciós enzimekkel való emésztések kombinálásával szintetizálhatjuk, a példákban részletesen leírtak szerint.Typically, such hybrids contain the first 436 or 427 amino acids of the soluble α- or β-interferon receptor linked to the constant region of the K chain or the G1 chain at the C-terminus. The DNA encoding the soluble α or β interferon receptor shown in Figure 1 can be synthesized by combining the PCR reaction (Polymerase Chain Reaction, see RK Saiki et al., Science 239, 487-491 (1988)) and digestion with appropriate restriction enzymes. , as detailed in the examples.
Az (a/b) IFN-receptor cDNS-énak szekvenciájában az 5’ végződéstől lefelé előre meghatározott helyeken komplementer oligonukleotidokat alkalmazunk, a 2. ábrán bemutatott szekvenciának megfelelően.Complementary oligonucleotides are used at the predetermined sites downstream of the 5 'end of the IFN receptor cDNA sequence (a / b) as shown in Figure 2.
A PCR-reakció templátjaként teljes cDNS-t [Uzé és társai: Cell 60(2), 225-234 (1990)] vagy egy lambda bakteriofágot tartalmazó plazmidot alkalmazunk. Kereskedelmi forgalomban beszerezhető cDNS-könyvtárt is felhasználhatunk. A cDNS-ffagmens továbbá teljes RNS-ből vagy jól ismert módszerekkel előállított polis+RNS-ből közvetlenül is szintetizálható [lásd O. Ohara és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5673-5677 (1989), J. Delort és társai: Nucl. Acid Rés. 17, 6439—6448 (1989)]. A cDNS- vagy RNS-könyvtár emberi sejtekből (pl. Daudi, Namalwa) vagy szervekből (pl. emberi lép) is kialakítható lényegében azonos eredménnyel.A complete cDNA (Uzé et al., Cell 60 (2), 225-234 (1990)) or a plasmid containing bacteriophage lambda was used as a template for the PCR reaction. Commercially available cDNA libraries may also be used. The cDNA fragment can also be directly synthesized from total RNA or from polys + RNA prepared by well known methods [see O. Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673-5677 (1989); J. Delort et al., Nucl. Acid Slit. 17, 6439-6448 (1989)]. The cDNA or RNA library can be constructed from human cells (e.g., Daudi, Namalwa) or organs (e.g., human spleen) with substantially the same result.
Noha az interferon receptor egyedi polipeptidnek tűnik, szekvenciájának mégis létezhetnek bizonyos allélikus változatai.Although the interferon receptor appears to be a unique polypeptide, certain allelic variants of its sequence may still exist.
A DNS-fragmenst egy immunoglobulin (ha a humán gyógyászatban felhasználható terméket kívánunk kialakítani, előnyösen egy humán immunoglobulin) könnyű vagy nehéz láncának konstans tartományát kódoló DNS-be illesztjük be.The DNA fragment is inserted into DNA encoding a constant region of a light or heavy chain of an immunoglobulin (preferably human immunoglobulin, if desired).
Az immunoglobulinokat kódoló DNS-ek ismertek, és a kereskedelemben beszerezhetők vagy szintetizálhatok [lásd például Adams és társai: Biochemistry 19, 2711-2719 (1980), Gough és társai: Biochemistry 19, 2702-2710 (1980), Dolby és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6027-6031 (1980), Rice és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7862-7865 (1982), Falkner és társai: Natúré 298, 286-288 (1982), Morrison és társai: Ann. Rév. Immunoi. 2, 239-256 (1984)].DNAs encoding immunoglobulins are known and are commercially available or synthesized (see, e.g., Adams et al., 1980, Biochemistry 19, 2711-2719, Gough et al., Biochemistry 19, 2702-2710, Dolby et al., Proc. . Natl. Acad. Sci. USA 77, 6027-6031 (1980), Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7862-7865 (1982); Falkner et al. (1982) Natur. 298: 286-288; Morrison et al., Ann. Port. Immunol. 2: 239-256 (1984)].
A hibrideket kódoló DNS-eket előnyösen a gazdasejtekbe transzfektáljuk kifejezésük céljából.Preferably, the DNA encoding the hybrids is transfected into host cells for expression.
Ha a gazdasejt már transzfekció előtt nehéz immunoglobulin-láncokat termel, úgy a bifunkcionális hetero-antitestek termelése céljából elegendő az oldható a- és β-interferon receptorok könnyű láncait tartalmazó hibridet transzfektálni. Hasonlóan, ha a gazdasejt márIf the host cell produces heavy immunoglobulin chains before transfection, it is sufficient to transfect a hybrid containing light chains of soluble α and β interferon receptors to produce bifunctional hetero-antibodies. Like if the host cell already
HU 215 587 Β könnyű láncokat kifejez, úgy az oldható a- és β-interferon receptorok nehéz láncait tartalmazó hibridet kódoló DNS transzfektálható a bifunkcionális antitest termelése céljából. Az a- és β-interferon kötődési helyét magában foglaló egy vagy több láncot és változtatható tartományokat magában foglaló egy vagy több láncot tartalmazó bifunkcionális immunoglobulinok kettősen specifikusak, éspedig a- és β-interferonnal, valamint egy előre meghatározott antigénnel szemben. Ezeket a fentiekben ismertetett eljárásokkal vagy in vitro módszerekkel állíthatjuk elő. Az utóbbi esetben például a hibrid F(ab)2 fragmenseit ismert módszerekkel (lásd például a 4444878 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) alakítjuk ki.Expression of light chains, DNA encoding a hybrid containing the heavy chains of soluble α- and β-interferon receptors can be transfected to produce a bifunctional antibody. Bifunctional immunoglobulins containing one or more chains and variable regions comprising the binding site of interferon alpha and β are doubly specific for interferon α and β and a predetermined antigen. These may be prepared by the methods described above or by in vitro methods. In the latter case, for example, the F (ab) 2 fragments of the hybrid are formed by known methods (see, for example, U.S. Patent No. 4,444,878).
Bifunkcionális antitestek alternatív módszerrel oly módon állíthatók elő, hogy a kívánt antigénnel szemben specifikus antitesteket kiválasztó B-sejteket vagy hibridómákat fuzionálunk immunoglobulin/oldható aés β-interferon receptor-hibridet termelő sejtekkel (pl. mielómákkal). A bifunkcionális antitestek az ilyen hibridómák tenyészetének felülúszójából nyerhetők ki.Alternatively, bifunctional antibodies can be generated by fusing B cells or hybridomas that express specific antibodies to the desired antigen with cells producing immunoglobulin / soluble α-interferon receptor hybrids (e.g., myelomas). Bifunctional antibodies can be recovered from the culture supernatant of such hybridomas.
A találmány továbbá a fentiekben ismertetett vízoldható polipeptideket vagy azok második polipeptiddel képezett hibridjeit kódoló DNS-szekvenciák előállítására vonatkozik. Ezeket a DNS-szekvenciákat úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő DNS-ffagmenseket és/vagy nukleinsavakat ismert géntechnológiai módszerekkel a helyes sorrendben összekapcsoljuk egymással, és a kapott terméket PCR-el (polimeráz láncreakció) megsokszorozzuk.The invention further relates to the preparation of DNA sequences encoding the water-soluble polypeptides described above or their hybrids with a second polypeptide. These DNA sequences are prepared by linking the appropriate DNA fragments and / or nucleic acids in the correct order using known genetic engineering techniques and amplifying the resulting product by PCR (polymerase chain reaction).
Az emlős a- és β-interferonokkal szemben nagy affinitást mutató polipeptidek példáiként a prímátok oldható a- és β-interferon receptorait, továbbá a humán, patkány-, egér-, kutya-, macska-, szarvasmarha-, ló- és sertés-eredetű oldható a- és β-interferon receptorokat említjük meg. Az ilyen polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák számos területen alkalmazhatók. Közelebbről ezek a szekvenciák vagy szekvenciarészek, valamint szintetikus vagy félszintetikus másolataik más cDNS-könyvtárak vagy humán vagy állati genomkönyvtárak szűrésére alkalmazhatók, az oldható a- és β-interferon receptorokhoz hasonló más DNS-szekvenciák hibridizáció útján történő szelektálására. Az ilyen DNS-ek, fragmenseik, valamint szintetikus vagy félszintetikus másolataik az oldható aés β-interferon receptorok variánsait képezik, és kiindulási anyagokként használhatók más variánsok mutáció útján történő előállításához. Ezek a mutációk vagy nem képesek megváltoztatni a mutált kodonok által kódolt aminosavak szekvenciáját, vagy megváltoztatják az aminosavakat. Mindkét típusú mutáció előnyösen hasznosítható az oldható a- és β-interferon receptorok termelése vagy felhasználása szempontjából. Ezek a mutációk például nagyobb termelékenységet, egyszerűbb tisztítást vagy nagyobb kötőkapacitást eredményeznek.Examples of high affinity polypeptides for mammalian α and β interferons include soluble α and β interferon receptors in primates, as well as human, rat, mouse, dog, cat, bovine, equine and porcine species. soluble interferon α and β receptors. DNA sequences encoding such polypeptides are useful in a variety of applications. In particular, these sequences or portions of the sequences and their synthetic or semisynthetic copies may be used to screen other cDNA libraries or human or animal genomic libraries by hybridization to other DNA sequences similar to soluble α and β interferon receptors. Such DNAs, fragments, and synthetic or semi-synthetic copies thereof are variants of soluble α and interferon-β receptors and can be used as starting materials for the production of other variants by mutation. These mutations are either unable to alter the sequence of the amino acids encoded by the mutated codons or alter the amino acids. Both types of mutations are advantageously utilized for the production or use of soluble α and β interferon receptors. For example, these mutations result in higher productivity, simpler purification, or higher binding capacity.
Egy alkalmas DNS-szekvencia példájaként a 2. ábrán bemutatott 1-1343. nukleotidból álló szekvenciát említjük meg.An example of a suitable DNA sequence is shown in Figs. a nucleotide sequence.
A természetes a- és β-interferon receptor oldható formáinak variánsait kódoló DNS-t előnyösen olyan formában alkalmazzuk, amely lehetővé teszi annak kifejeződését egy transzkripciós egységben, a tervezett gazdasejttel kompatíbilis emlősök, mikroorganizmusok vagy vírusok transzkripciójára és transzlációjára szolgáló vezérlőelemek vezérlése alatt. A megfelelő sejtek transzformálása, transzfektálása vagy infektálása után ezek a vektorok lehetővé teszik a rekombináns polipeptid kifejeződését. A természetes a- és β-interferon receptor oldható variánsai megfelelő promotorok vezérlése mellett kifejezhetők emlősök, élesztők vagy baktériumok sejtjeiben vagy más sejtekben. Baktérium-, gomba-, élesztővagy emlős-gazdasejtek klónozására és kifejezésére felhasznált vektorokat Pouwels és társai írtak le [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985], a szakkönyv releváns részeire referenciaként hivatkozunk. A kifejező vektor adott esetben, azonban nem szükségszerűen tartalmazhat egy replikációs helyet, valamint egy vagy több, a transzformált sejtek között választást lehetővé tevő szelekciós marker-szekvenciát is.Preferably, the DNA encoding variants of the soluble forms of the natural α- and β-interferon receptor is used in a form that permits its expression in a transcription unit under the control of transcriptional and translational controls for mammals, microorganisms, or viruses compatible with the intended host cell. After transformation, transfection or infection of appropriate cells, these vectors allow expression of the recombinant polypeptide. Soluble variants of the natural α and β interferon receptor may be expressed in cells of mammals, yeast or bacteria or other cells under the control of appropriate promoters. Vectors used for the cloning and expression of bacterial, fungal, yeast or mammalian host cells have been described by Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985), the relevant parts of which are incorporated herein by reference. Optionally, the expression vector may not contain a replication site as well as one or more selectable marker sequences for selection between transformed cells.
A fent ismertetett polipeptideket kódoló DNS-be variációk is illeszthetők be, ezek azonban nem változtathatják meg a leolvasási keretet, és nem hozhatnak létre a kifejezés szempontjából káros szekunderszerkezeteket termelő komplementer szekvenciákat.Variants may be inserted into the DNA encoding the polypeptides described above, but these may not alter the reading frame or create complementary sequences that produce expression-damaging secondary structures.
A természetes interferon receptor oldható variánsainak minősülő polipeptidek kötési aktivitása lényegében megegyezik a természetes receptoréval, azonban - miként már közöltük - a természetes receptorétól eltérő (például javított) jellemzőkkel rendelkező variánsok is kialakíthatók.The polypeptides, which are soluble variants of the natural interferon receptor, have substantially the same binding activity as the natural receptor, but, as stated above, variants with other (e.g. improved) characteristics than the natural receptor may be formed.
Bár a mutációs hely rögzített, maga a mutáció nem az. így például az adott helyen lejátszódó mutáció teljesítményének optimalizálása céljából a kodon vagy a célzott tartomány véletlenszerűen mutálható, és a kapott polipeptid-variánsok a szekunder jellemzők optimális kombinációjára szűrhetők. A helyettesítéses mutációknak a DNS adott helyeire történő beillesztésére szolgáló módszerek jól ismertek, ilyen például az M13-rendszer. A humán receptort kódoló DNS bármely ismert eljárással előállítható, szekvenciáját a 2. ábra mutatja be.Although the mutation site is fixed, the mutation itself is not. For example, to optimize the performance of a mutation at a particular site, the codon or target region may be randomly mutated and the resulting polypeptide variants screened for an optimal combination of secondary characteristics. Methods for inserting substitution mutations at specific sites in the DNA are well known, such as the M13 system. The DNA encoding the human receptor can be produced by any known method, and its sequence is shown in Figure 2.
A fentiekben ismertetett polipeptid szekvenciák klónozására általában prokariótákat alkalmazhatunk. Különösen hasznosnak bizonyult az E. coli 294 (ATCC 31446) törzs, azonban más törzseket, így az E. coli X 1776 (ATCC 31537) törzset is felhasználhatjuk.Generally, prokaryotes may be used to clone the polypeptide sequences described above. E. coli strain 294 (ATCC 31446) proved to be particularly useful, but other strains such as E. coli X 1776 (ATCC 31537) may be used.
Miként már közöltük, az a- és β-interferon receptor oldható variánsai és azok hibridjei baktériumok, élesztők vagy emlősök sejtjeiben vagy más típusú sejtekben fejezhetők ki megfelelő promotor vezérlése mellett. A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen polipeptideket kifejező sejtek előállítása. Ezeket a sejteket úgy állítjuk elő, hogy a gazdasejtet az adott polipeptidet kódoló DNS-szekvenciával transzfektáljuk.As stated above, soluble variants of the α and β interferon receptor and their hybrids can be expressed in bacteria, yeast or mammalian cells or other types of cells under appropriate promoter control. The invention also relates to the production of cells expressing such polypeptides. These cells are prepared by transfecting the host cell with the DNA sequence encoding the polypeptide.
A rekombináns fehérjék kifejezésére prokariótarendszerek - például E. coli - alkalmazhatók. Az E. coli tipikusan a pBR322 (ATCC 37017) egy származékának felhasználásával transzformálható, ez egy E. coli-törzsből leszármaztatható plazmid [Bolivár és társai: Gene 2, 95 (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisz6Prokaryotic systems such as E. coli may be used to express recombinant proteins. E. coli is typically transformed using a derivative of pBR322 (ATCC 37017), a plasmid derived from an E. coli strain (Bolivar et al., Gene 2: 95 (1977)). PBR322 is an ampicillin and tetracycline resis6
HU 215 587 Β tencia-géneket tartalmaz, és egyúttal a transzformált sejtek azonosításának egyszerű eszköze. A pBR322-plazmidnak vagy más mikrobaplazmidoknak a rekombináns DNS-szerkezetben általánosan használt kifejeződést vezérlő szekvenciákat is kell tartalmazniuk, vagy ezeket úgy kell módosítani, hogy tartalmazzanak ilyen vezérlő szekvenciákat.HU 215,587 Β and is a simple means of identifying transformed cells. Plasmid pBR322 or other microbial plasmids must also contain or modify the expression control sequences commonly used in the recombinant DNA construct to include such control sequences.
A fenti vezérlőelemek példáiként a következőket soroljuk fel: laktóz (lac) promotor (ATCC 37121) [J. Mól. Appl. Génét. 1, 139-147 (1989)], β-laktamáz promotor [Chang és társai: Natúré 275, 615 (1987)], triptofán promotor [Miozzari: J. Bact. 133, 1457-1466 (1978)], továbbá hibrid promotorok, például tac (ATCC 37138) [H. de Boer és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)]. Ide tartoznak még a kereskedelmi forgalomban lévő vektorok, így a lambda fág promotort és hőre labilis c 1857-represszort tartalmazó trc vagy a pPLlambda promotort tartalmazó pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország). A vezérlőelemek köre azonban nem korlátozódik a példaként fent felsoroltakra.Examples of the above controls include the lactose (lac) promoter (ATCC 37121) [J. Mole. Appl. Gene. 1, 139-147 (1989)], the β-lactamase promoter (Chang et al., Naturre 275, 615 (1987)), the tryptophan promoter (Miozzari, J. Bact. 133: 1457-1466 (1978)] and hybrid promoters such as tac (ATCC 37138) [H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983). Also included are commercially available vectors such as trc containing the phage lambda promoter and the heat-labile c1857 repressor or pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) containing the pPLlambda promoter. However, the range of controls is not limited to those exemplified above.
Más funkcionális promotorok is alkalmasaknak bizonyultak. A DNS-szekvenciák általánosan ismertek, így ezek megfelelő kötőelemek vagy adapterek felhasználásával konjugálhatók az a- és β-interferon receptor oldható variánsait kódoló DNS-sel. A bakteriális rendszerek promotorai ezenkívül egy úgynevezett ShineDalgamo (SD) szekvenciát is tartalmaznak, az antigént lefelé kódoló DNS-hez operatívan kapcsolva.Other functional promoters have also proved to be suitable. DNA sequences are generally known, so they can be conjugated to DNA encoding soluble variants of the α and β interferon receptors using appropriate binding elements or adapters. The promoters of bacterial systems also contain a so-called ShineDalgamo (SD) sequence operatively linked to DNA encoding downstream of the antigen.
A megfelelő gazdatörzs transzformálása és a transzformáit gazdatörzs megfelelő tenyészetsűrűségig történő tenyésztése után a kiválasztott promotort alkalmas módon (például a hőmérséklet megnövelésével vagy kémiai indukcióval) de-represszáljuk, és a mikroorganizmusokat tovább tenyésztjük. Ezután a mikroorganizmusokat - rendszerint centrifugálással - összegyűjtjük, kémiai vagy fizikai úton lizáljuk, és az extraktumot továbbtisztításra elkülönítjük.After transformation of the appropriate host strain and growth of the transformed host strain to the appropriate culture density, the selected promoter is appropriately repressed (e.g., by increasing temperature or by chemical induction) and the microorganisms are further cultured. The microorganisms are then harvested, usually by centrifugation, lysed chemically or physically, and the extract is isolated for further purification.
A mikroorganizmusokat maximális növekedést biztosító körülmények között levegőztetve, erős keverés közben fermentáljuk egy például 10 literes fermentorban. Előnyösen habzásgátlót használunk. A törzstenyészetet Mott és társai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 88 (1985)] szuperindukciós táptalajon 30 °Con tenyésztjük. A600 = 5 - 6 abszorpciónak megfelelő tenyészetsűrűség elérésekor a hőmérsékletet 42 °C-ra növelve de-represszáljuk a promotort, majd 2-20 (előnyösen 3-6) órával a hőmérsékletváltoztatás után összegyűjtjük a sejteket. A mikroorganizmus-masszát először szűréssel vagy más módon tömörítjük, majd 10 000 g gyorsuláson 4 °C-on 10 percig centrifúgáljuk, végül a kapott pelletet gyorsan megszilárdítjuk. A baktériumtenyészetben termelődött rekombináns fehérjéket a pelletet extrakciójával, majd az extraktum egy vagy több lépésben végzett betöményítésével, sómentesítésével vagy ioncserés vagy kizárásos kromatografálásával különítjük el.The microorganisms are fermented under vigorous agitation under conditions of maximum growth in a fermentor, for example 10 liters. Preferably, an antifoam agent is used. The stock culture was described by Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. At a culture density of 600 = 5-6 absorbances, the promoter is depressed by raising the temperature to 42 ° C and harvesting the cells 2-20 (preferably 3-6) hours after the temperature change. The microbial mass is first compacted by filtration or otherwise, then centrifuged at 10,000 g at 4 ° C for 10 minutes, and finally the resulting pellet is solidified rapidly. The recombinant proteins produced in the bacterial culture are isolated by extraction of the pellet, followed by concentration or desalting of the extract in one or more steps, or ion exchange or exclusion chromatography.
Az a- és β-interferon receptor oldható variánsainak kifejezésére felhasznált mikroorganizmusokat bármely alkalmas módszerrel (például ciklikus fagyasztással-felengedtetéssel, mechanikai feltöréssel vagy vegyszeres úton) lizálhatjuk. Az a- és β-interferon receptor oldható variánsai bizonyos mértékig aggregációra hajlamosak. Az aggregátumképződés csökkentésére az extrakciót és a tisztítást detergens (például Tween 80 vagy Triton XI00) jelenlétében végezhetjük.The microorganisms used to express soluble variants of the? And? Interferon receptor can be lysed by any suitable method (e.g., cyclic freeze-thaw, mechanical fracture, or chemical). Soluble variants of the α and β interferon receptors tend to aggregate to some extent. Extraction and purification may be carried out in the presence of a detergent such as Tween 80 or Triton XI00 to reduce aggregate formation.
Olyan vízoldható polipeptidek esetén, amelyek DNS-szekvenciája nem metioninnal kezdődik, az iniciáló szignál felfelé egy további metionin aminosav belépését eredményezi, és ez képezi a termék N-terminális részét. Noha ezek a további N-terminális metionint tartalmazó termékek is felhasználhatók a találmány szerinti eljárásokban, előnyösebb ezt a metionint előzetesen eltávolítanunk. Az N-terminális metionin eltávolítására szolgáló standard in vivő és ex vitro módszerek jól ismertek.For water-soluble polypeptides whose DNA sequence does not begin with methionine, the initiating signal results in an upstream addition of an additional methionine amino acid, which forms the N-terminal portion of the product. Although these additional N-terminal methionine-containing products can be used in the methods of the invention, it is more preferred to remove this methionine beforehand. Standard in vivo and ex vitro methods for the removal of N-terminal methionine are well known.
A korábbiakban meghatározott polipeptidek vagy hibridek kifejezésére élesztőrendszerek, így előnyösen Saccharomyces-típusok (köztük a könnyen hozzáférhető S. cerevisiae) is felhasználhatók.Yeast systems, such as Saccharomyces types (including readily available S. cerevisiae), may also be used to express the polypeptides or hybrids defined above.
Az alkalmas élesztővektorok általában a következő elemeket tartalmazzák: replikációs origó, az élesztő és E. coli transzformálását lehetővé tevő szelekciós marker [például az E. coli ampicillin-rezisztencia-gén és a S. cerevisiae trpl génje, ami egy triptofán jelenlétében növekedésre képtelen élesztőmutáns (ATCC 44076) szelekciós markerje], és egy az élesztőben szuperexpresszált génből kapott promotor a gén felfelé való transzkripciójának indukálására. Élesztő-gazdaszervezetek számára alkalmas promotorok például a következők: a 3-foszfoglicerát-kináz vagy más glikolízis enzimek promotorja, a savas foszfatáz promotorja (például PH05), és az α-típusú kapcsolófaktorok promotorja. Élesztő-gazdaszervezetek számára alkalmas promotorok továbbá a promotor régiók, így a 2-alkohol-dehidrogenáz [Russel és társai: J. Bioi. Chem. 258, 2674 (1982)]. A promotor és a felfelé irányulva kifejezendő struktúrgén közé egy szignálpeptid (például egy heterológ élesztőfehérje kiválasztását lehetővé tevő faktor szignálpeptidje) is beiktatható [lásd Bittér és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5330 (1984)]. Az élesztő transzformálásának módszerei szakember számára jól ismertek. Egy jellemző módszert Hinnen és társai ismertettek [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], amellyel trp+ transzformánsok szelektálhatok egy 0,67% nitrogéntartalmú élesztőbázist, 0,5% kazaminosavat, 2% glükózt és 10 pg/ml uracilt tartalmazó szelekciós táptalajon. A PH05-promotort magában foglaló vektorokat tartalmazó transzformált gazdatörzsek kezdetben dús táptalajban képezett előtenyészet formájában tenyészthetők, majd a táptalaj szervetlen foszfátkoncentrációjának csökkentésével de-represszálhatók. A törzset szokásos módszerekkel tenyésztjük.Suitable yeast vectors generally include the following elements: an origin of replication, a selectable marker for transformation of yeast and E. coli (e.g., the E. coli ampicillin resistance gene and the S. cerevisiae trpl gene, a yeast mutant unable to grow in the presence of tryptophan). ATCC 44076) and a promoter from a gene overexpressed in yeast to induce upstream transcription of the gene. Suitable promoters for yeast hosts include the promoter of 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, the promoter of acid phosphatase (e.g. PH05), and the promoter of α-type coupling factors. Further suitable promoters for yeast hosts include promoter regions such as 2-alcohol dehydrogenase [Russel et al., J. Bioi. Chem., 258, 2674 (1982)]. A signal peptide (e.g., the signal peptide of a factor enabling the selection of a heterologous yeast protein) can be inserted between the promoter and the upstream structural gene [see Bittér et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5330 (1984)]. Methods for transforming yeast are well known in the art. A typical method is described by Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], by means of which trp + transformants can be selected on a selection medium containing 0.67% nitrogen yeast base, 0.5% casino acid, 2% glucose and 10 pg / ml uracil. Transformed host strains containing the PH05 promoter vectors may be initially cultured in the form of a pre-culture medium in a rich medium and then repressed by reducing the concentration of inorganic phosphate in the medium. The strain is cultured by conventional methods.
A rekombináns polipeptidet oly módon nyerjük ki, hogy a glükozidáz enzimes emésztéssel és ezt követő, detergenssel végzett kezeléssel vagy mechanikai úton (pl. préseléssel) lizált sejtpelletet extraháljuk, majd egy vagy több lépésben betöményítjük, sómentesítjük, ioncserélésnek vagy kizárásos kromatografálásnak vetjük alá. Ha a polipeptid a periplazmatikus térbe választódikThe recombinant polypeptide is recovered by extracting the cell pellet lysed by glucosidase enzymatic digestion followed by detergent treatment or by mechanical means (e.g. compression), then concentrated in one or more steps, desalted, ion-exchanged or excluded by chromatography. When the polypeptide is secreted into the periplasmic space
HU 215 587 Β ki, a sejteket a membrán külső rétegét károsító és a rekombináns polipeptid felszabadulását lehetővé tevő vegyszerrel (pl. EDTA-val) kezeljük, és ezután nyeljük ki a polipeptidet. Ha a polipeptid a táptalajba választódik ki, azt közvetlenül kinyerhetjük.The cells are treated with a chemical that damages the outer membrane layer and allows the release of the recombinant polypeptide (eg, EDTA) and is then swallowed by the polypeptide. If the polypeptide is excreted in the culture medium, it can be recovered directly.
A korábbiakban meghatározott polipeptidek vagy hibridek emlőssejtekben is kifejezhetők alkalmas promotorok vezérlése alatt. Emlős a- és β-interferon receptor oldható variánsainak termelésére sejtmentes rendszereket is felhasználhatunk, a találmány szerint kialakított DNS-ekből leszármaztatható RNS-ek alkalmazása mellett.The polypeptides or hybrids defined above may also be expressed in mammalian cells under the control of suitable promoters. Cell-free systems can also be used to produce soluble variants of the mammalian interferonalpha.- and .beta., Using RNAs derived from the DNAs of the present invention.
Az emlős gazdasejtekben történő kifejezést vezérlő promotorok különböző forrásokból nyerhetők. Ilyenek például a vírus (így polioma, majom SV40-vírus, adenovírus, retrovírus hepatitis B citomegalovírus) genomokból származó promotorok, egyes emlős promotorok (például a humán β-globin gén DNS-áz I-ére érzékeny helyeket tartalmazó promotor), és egyes rovarvírus-promotorok (így a baculovírus-rendszer poliéder promotor). Állati sejtekben való kifejezésre előnyösen használható az adenovírus-2 kései fő promotoqából leszármaztatható vezérlőtartomány.Promoters that control expression in mammalian host cells can be obtained from various sources. These include promoters from the genomes of the virus (such as polyoma, monkey SV40 virus, adenovirus, retroviral hepatitis B cytomegalovirus), some mammalian promoters (e.g., promoter with sites sensitive to the human β-globin gene DNAase I), and some insect viruses. promoters (such as the polyhedron promoter of the baculovirus system). For expression in animal cells, a control region derived from the late main promoter of adenovirus-2 can be advantageously used.
Az SV40 korai és kései tartományait előnyösen az SV40-vírusból különítjük el, a vírus replikációs origóját tartalmazó restrikciós fragmens formájában [lásd Fiers és társai: Nature272, 113 (1978)].The early and late domains of SV40 are preferably isolated from the SV40 virus in the form of a restriction fragment containing the viral origin of replication (see Fiers et al., Nature272, 113 (1978)).
A humán citomegalovírus korai közvetlen tartományát Hind IIIE restrikciós fragmens formájában izoláljuk [Greenaway P. J. és társai: Gene 18, 356-360 (1982)]. Az adenovírus-2 kései promotoiját a 8-17. térképegységeket tartalmazó Hind III restrikciós fragmens alakjában izoláljuk [S. Hu és J. L. Manley: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 820-824 (1981)]. Szülőtípusú sejteredetű eukarióta promotorok is hasznosaknak bizonyultak.The early direct domain of human cytomegalovirus was isolated as a Hind IIIE restriction fragment (Greenaway, P.J. et al., Gene 18: 356-360 (1982)). The late promoter of adenovirus-2 is illustrated in Figures 8-17. isolated as a Hind III restriction fragment containing map units [S. Hu and J.L. Manley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 820-824 (1981)]. Parent cell-derived eukaryotic promoters have also been found to be useful.
Eukarióta-kifejező vektorokban a transzkripciót úgy növeljük, hogy a promotoron kívül aktivátorokat tartalmazó szekvenciákat is beiktatunk. Az aktivátorok DNS-elemek, amelyek azonos oldalon hatnak, néhányszor tíz-háromszáz bázispárt tartalmaznak, és fokozzák a promotor transzkripciót iniciáló képességét. Számos aktivátorról (globin, elasztáz, albumin, inzulin stb.) ismert, hogy emlősgénekre hat. Rendszerint azonban eukarióta sejteket fertőző vírusok aktivátorait használjuk, amelyek közül példaként a következőket soroljuk fel: a replikációs origó kései oldalának SV40 aktivátora (100-270 bázispár), a citomegalovírus korai közvetlen promotorjának aktivátora, a replikációs origó kései oldala poliomájának aktivátora, a replikációs origó kései oldala poliomájának aktivátora és az adenovírus aktivátora. Az eukarióta sejtekben (élesztők, gombák, rovarok, növények, állatok, ember) használt kifejező vektorok továbbá a mRNS kifejezésének befolyásolására képes faktorok transzkripciójának hasításához és lezárásához szükséges szekvenciákat is tartalmazhatnak. A kifejező vektorok szelekciós gént tartalmaznak.In eukaryotic expression vectors, transcription is increased by inserting sequences containing activators in addition to the promoter. Activators are DNA elements that act on the same side and contain ten to three hundred base pairs several times and enhance the promoter's ability to initiate transcription. Many activators (globin, elastase, albumin, insulin, etc.) are known to act on mammalian genes. However, it is common to use activators of viruses that infect eukaryotic cells, such as the SV40 activator of the late origin of replication (100-270 bp), the activator of the early direct promoter of cytomegalovirus, the late origin replication activator of the replication origin, side polyoma activator and adenovirus activator. In addition, expression vectors used in eukaryotic cells (yeasts, fungi, insects, plants, animals, humans) may contain sequences necessary for the transcriptional cleavage and termination of factors capable of influencing mRNA expression. Expression vectors contain a selection gene.
Az emlőssejtek szelekciós markeljei közül példaként a dihidrofolát reduktázt (DHFR), a timidin-kinázt és a neomicint említjük meg. Ha ilyen szelekciós markereket transzfektálunk emlős gazdasejtbe, a szelekciós nyomás hatásának kitett transzformált sejt túlélésre képessé válik. Rendszerint kétféle típusú szelekciós rendszer használatos. Az egyik típus olyan mutáns sejtvonalakat alkalmaz, amelyek növekedése attól függ, hogy a táptalaj tartalmaz-e egyes meghatározott anyagokat vagy sem. Ilyenek például a CHO DHFR-sejtek vagy a rágcsálóeredetű LTK-sejtek, amelyek timidin vagy hipoxantin hozzáadása nélkül nem képesek növekedni. Ha ezekbe a sejtekbe transzfektálással funkcionális DHFR- vagy TK-gént építünk be, a sejtek túlélőképessé válnak, míg a DHFR- vagy TK-génnek nem transzformáit sejtek változatlanul nem növekednek a timidinnel vagy hipoxantinnal ki nem egészített táptalajon.Examples of selection markers of mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR), thymidine kinase and neomycin. When such selection markers are transfected into a mammalian host cell, the transformed cell exposed to the selection pressure becomes capable of survival. Usually, two types of selection systems are used. One type uses mutant cell lines whose growth depends on whether or not the medium contains certain substances. These include, for example, CHO DHFR cells or murine LTK cells that cannot grow without the addition of thymidine or hypoxanthine. When transfected with these cells into a functional DHFR or TK gene, the cells become viable, whereas cells not transformed with the DHFR or TK gene remain unchanged on thymidine or hypoxanthine-supplemented medium.
A másik megoldás a domináns szelekció, ami nem igényel mutáns sejteket. Ekkor például a sejtbe a sejtet egy toxikus anyaggal szemben rezisztenssé tevő gént transzfektálunk, majd azt kifejezzük [lásd Southern és Berg: J. Molec. Appl. Génét. 1, 327 (1982), Mulligan és Berg: Science 20, 1422 (1980), Sugden és társai: Mól. Cell. Bioi. 5, 410-413 (1985)].The other solution is dominant selection, which does not require mutant cells. For example, a gene that renders a cell resistant to a toxic substance is transfected into a cell and expressed as described in Southern and Berg, J. Molec. Appl. Gene. 1, 327 (1982), Mulligan and Berg (1980) Science 20: 1422, Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985).
A sejt bizonyos kromoszómatartományainak növelését vagy replikációját amplifikációnak (sokszorozás) nevezzük, és ezt egy szelekciós ágens [például a DHFR-t inaktiváló metotrexát (MTX)] felhasználásával hozzuk létre. Az MTX mennyiségének növekedésével nő a DHFR-gén amplifikációja vagy másolatszáma, ami a DHFR-termelés növekedését eredményezi. Az amplifikáció foka a táptalaj MTX-koncentrációjának növekedésével nő. A kívánt gén amplifikációját a kívánt gén és a kromoszómában kointegrált DHFR-gén ko-transzfekciójával éljük el. A kívánt gén és a DHFRgén ko-amplifíkációja után a kívánt fehéijét kódoló gén több kívánt fehérjét fejez ki.Increasing or replicating certain chromosomal regions of a cell is called amplification (amplification) and is generated using a selection agent (e.g., methotrexate inactivating DHFR). As the amount of MTX increases, the amplification or copy number of the DHFR gene increases, resulting in an increase in DHFR production. The degree of amplification increases with increasing MTX concentration in the medium. Amplification of the desired gene is accomplished by co-transfection of the desired gene with the DHFR gene cointegrated in the chromosome. After co-amplification of the desired gene and the DHFR gene, the gene encoding the desired protein expresses more desired proteins.
A korábbiakban meghatározott oldható interferon receptor-variánsok kifejezésére a találmány szerint gazdasejtként előnyösen emlőssejteket, köztük majomvesesejteket (COS-7, ATCC CRL 1651) és kínaihörcsögsejteket [CHO-, DHFR-, Urlaub és Chasin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)] használunk.Preferred host cells for expression of the soluble interferon receptor variants as defined above are mammalian cells, including monkey kidney cells (COS-7, ATCC CRL 1651) and Chinese hamster cells [CHO-, DHFR-, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)].
Az emlőssejtek transzformálására szolgáló módszerek jól ismertek. Egy előnyös módszert, amelynek során a DNS-t kalcium-foszfáttal csapják ki, Graham F. és van dér Eb ismertetett [Virology 52, 456-457 (1973)]. Egy másik módszer szerint elektroportálást végeznek [G. Chu és társai: Nucl. Acid. Rés. 15, 1311-1326 (1987)]. Más transzfekciós módszereket is alkalmazhatunk, például a magba való befecskendezést vagy a protoplasztokkal végzett fúziót.Methods for transforming mammalian cells are well known. A preferred method for precipitating DNA with calcium phosphate is described by Graham F. and Van Der Eb (Virology 52: 456-457 (1973)). Another method involves electroporation [G. Chu et al., Nucl. Acid. Gap. 15: 1311-1326 (1987). Other transfection methods may be used, such as nuclear injection or protoplast fusion.
A kívánt vezérlő és kódoló szekvenciákat tartalmazó kifejező vektorokat jól ismert standard módszerekkel alakítjuk ki [lásd például Maniatis T. és társai: Molecular Cloning, 133-134 (Cold Spring Harbor, 1982), továbbá Ausubel és társai (szerk.): Current Protocols in Molecular Biology (kiadó: Greene Publishing Associates és Wiley Interscience, 1987)]. A DNS plazmidjait vagy fragmenseit elkülönítjük, hasítjuk, méret szerint osztályozzuk, majd a kívánt formára hasítjuk.Expression vectors containing the desired control and coding sequences are constructed by standard methods well known in the art (see, e.g., Maniatis T. et al., Molecular Cloning, 133-134 (Cold Spring Harbor, 1982)) and Ausubel et al., Ed. Molecular Biology (Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, 1987). Plasmids or fragments of DNA are isolated, cleaved, sized and then cut to the desired form.
HU 215 587 ΒHU 215 587 Β
A helyes plazmidszekvenciákat ligációs keverékekkel E. coli HB101 vagy E. coli K12 194 (ATCC 31446) törzsben való transzformáció után meghatározzuk. Az ampicillinnel szemben rezisztens transzformánsokat kiválasztjuk. A plazmidokat elkülönítjük a transzformánsokból, és jól ismert módon restrikciós enzimekkel való kezeléssel vagy szekvenciameghatározással elemezzük [lásd Messing és társai: Nucl. Acid. Rés. 9, 309 (1981) és Maxam és társai: Methods in Enzymology 65, 499 (1980)].The correct plasmid sequences were determined after transformation with ligation mixtures in E. coli HB101 or E. coli K12194 (ATCC 31446). Transformants resistant to ampicillin are selected. The plasmids are isolated from the transformants and analyzed by well-known restriction enzyme treatment or sequencing (see Messing et al., Nucl. Acid. Gap. 9, 309 (1981) and Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980).
A gazdasejteket általában kifejező vektorokkal transzformáljuk, majd olyan alkalmas táptalajban tenyésztjük, amely a promotor kifejezését indukáló anyagokat, a transzformánsok szelektálására szolgáló komponenseket vagy a gének amplifikációját elvégző anyagokat tartalmaz. A kiválasztott kifejező tenyészethez alkalmazandó fermentációs körülmények (pl. hőmérséklet, pH) szakember számára jól ismertek.Host cells are generally transformed with expression vectors and cultured in a suitable medium containing promoter expression inducers, components for selection of transformants, or genes for amplification of genes. The fermentation conditions (e.g. temperature, pH) to be used for the selected expression culture are well known to those skilled in the art.
A találmány szerint előállított polipeptideket rekombináns gazdasejtek felülúszóiból izoláljuk és tisztítjuk. A felülúszókat rendszerint ultraszűréssel töményítjük be, majd ioncserés kromatográfiával vagy immunoaffinitással tisztítjuk a várt polipeptidek adszorbeálása és azt követő eluálása céljából. Az antigén aggregátumok képzésére erősen hajlamos. Ezért a tisztítási műveleteket előnyösen detergens (pl. Tween 80, Triton X100 vagy CHAPS) jelenlétében végezzük. A végterméket fehérjékkel (pl. albuminnal) stabilizáljuk. Adott esetben ezek a fehérjék detergenst tartalmazhatnak.The polypeptides of the invention are isolated and purified from supernatants of recombinant host cells. The supernatants are usually concentrated by ultrafiltration and then purified by ion exchange chromatography or immunoaffinity to adsorb the expected polypeptides and subsequently elute. It is highly prone to formation of antigenic aggregates. Therefore, the cleaning operations are preferably carried out in the presence of a detergent such as Tween 80, Triton X100 or CHAPS. The final product is stabilized with proteins (e.g., albumin). Optionally, these proteins may contain a detergent.
Megjegyezzük, hogy a kifejezés vezérlésére szolgáló összes vektor vagy szekvencia és az összes gazdasejt nem működik egyformán minden kifejező rendszerben. A megfelelő vektorok, kifejezést vezérlő szekvenciák és gazdasejtek kiválasztása a jelen találmány oltalmi körén belül a szakember köteles tudásához tartozik. Az alkalmas egysejtű gazdaszervezetek megválasztásakor például a következő tulajdonságokat kell figyelembe venni: a kiválasztott vektorral való összeférhetőség, a találmány szerint előállított DNSszekvenciák által kódolt termék toxicitása, a szekréciós jellemzők, a fehéijehajtogató jellemzők megfelelősége, a fermentációs követelmények, a találmány szerint előállított DNS-szekvenciákkal való kifejezés után nyert rekombináns termékek tisztíthatóságának egyszerűsége.Note that all vectors or sequences for expression control and all host cells do not function equally in all expression systems. The selection of appropriate vectors, expression control sequences and host cells within the scope of the present invention is within the skill of the art. When selecting suitable single-cell hosts, for example, the following properties must be considered: compatibility with the vector selected, toxicity of the product encoded by the DNA sequences of the invention, secretion characteristics, protein folding properties, fermentation requirements, DNA sequences of the invention The ease of purification of the recombinant products obtained after.
A fenti paraméterek figyelembevételével szakember könnyen kiválaszthatja azokat a vektorrendszer /kifejezést vezérlő rendszer/ gazdasejt-kombinációkat, amelyek a találmány szerint előállított DNS-szekvenciákat állati sejtek (pl. CHO- vagy COS-7-sejtek) nagyléptékű fermentációja vagy tenyésztése során kifejezik.Given the above parameters, one skilled in the art will readily select those vector system / expression control system / host cell combinations that express the DNA sequences of the invention during large-scale fermentation or cultivation of animal cells (e.g., CHO or COS-7 cells).
Miként már közöltük, a találmány szerint előállított polipeptidek immunomodulátorokként (elsősorban immunoszupresszánsokként) hasznosíthatók, és a gyógyászatban például autoimmun-betegségek kezelésére, valamint az átültetések kilökődésének megakadályozására alkalmasak. Ezekre a célokra a találmány szerint előállított polipeptideket előnyösen gyógyászati készítmények formájában alkalmazzuk.As stated above, the polypeptides of the invention are useful as immunomodulators (particularly immunosuppressants) and are useful in medicine, for example, for the treatment of autoimmune diseases and for the prevention of transplant rejection. For these purposes, the polypeptides of the invention are preferably used in the form of pharmaceutical compositions.
A találmány tárgya tehát továbbá eljárás gyógyászati készítmény előállítására oly módon, hogy egy a találmány szerint előállított vízoldható polipeptidet gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagok, hígítószerek és/vagy egyéb segédanyagok felhasználásával, szokásos gyógyszertechnológiai műveletekkel gyógyászati készítménnyé alakítunk.The present invention further relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition by converting a water-soluble polypeptide of the invention into pharmaceutically acceptable carriers, diluents and / or other excipients using conventional pharmaceutical technology.
A gyógyászati készítmények például szilárd, félszilárd és folyékony kompozíciók, így tabletták, pilulák, porok vagy injekciós vagy infúziós oldatok lehetnek. Az előnyös kikészítési forma az adagolás módjától és a terápiás felhasználástól függ. A találmány szerint előállított gyógyászati készítményeket más gyógyászatiig jelentős polipeptidek alkalmazásához hasonlóan használhatjuk fel, és a készítmények formája is a más polipeptideket tartalmazó készítményekhez hasonló. így a polipeptidet például liofilizált alakban tárolhatjuk, amiből a felhasználásra kész gyógyszert közvetlenül a felhasználás előtt alakítjuk ki steril víz hozzáadásával, majd ezt szokásos módon, így parenterálisan (például szubkután, intravénás, intramuszkuláris vagy intralezionális úton) adjuk be. A hatóanyagok hatásos dózisa napi 1-5 mg/testtömeg kg nagyságrendű lehet, de megjegyezzük, hogy ennél kisebb vagy a felső határt kétszeresen meghaladó dózisok is káros következmények nélkül beadhatók.The pharmaceutical compositions may be, for example, solid, semi-solid and liquid compositions such as tablets, pills, powders or solutions for injection or infusion. The preferred form of preparation will depend upon the mode of administration and the therapeutic use. The pharmaceutical compositions of the present invention may be used in a manner similar to the use of other pharmaceutically significant polypeptides, and in the form of compositions containing the other polypeptides. Thus, for example, the polypeptide may be stored in lyophilized form, from which the ready-to-use drug is formulated prior to use by the addition of sterile water, and administered by conventional means such as parenterally (e.g., subcutaneously, intravenously, intramuscularly or intralesionally). An effective dose of the active compounds may be in the range of 1-5 mg / kg / day, but it is noted that doses below or twice the upper limit can be administered without adverse effects.
A találmány szerint előállított gyógyászati készítményeket károsan abnormális a- és β-interferon-termelésben szenvedő betegeknek például a következő betegségek kezelése céljából adhatjuk be: lupus erythematosus, Bechet-szindróma, apláziás anémia, diabetes mellitus, sclerosis multiplex, reumatoid arthritis, súlyos immunhiányos betegségek, AIDS. A találmány szerint előállított gyógyászati készítmények továbbá az immunaktivitást módosító tulajdonságaik (pl. NK-sejtek aktiválása vagy hisztokompatíbilis antigének kifejezése) révén olyan betegek kezelésére is alkalmasak, akiknél fennáll az átültetett szervek vagy szövetek kilökődésének veszélye.The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered to patients suffering from abnormal production of α and β interferons for the treatment of, for example, lupus erythematosus, Bechet syndrome, aplastic anemia, diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, severe immune deficiency, AIDS. The pharmaceutical compositions of the present invention are also useful in treating patients at risk of rejection of transplanted organs or tissues by virtue of their immune-modifying properties (e.g., activation of NK cells or expression of histocompatible antigens).
A találmány szerint előállított gyógyászati készítmények hatóanyagai természetük és hatásmechanizmusuk révén mentesek a korábban ismert hatóanyagok (például a kémiai immunoszupresszánsok, így a glükokortikoidok) általános toxicitásától, ezért a jelenlegi klinikai gyakorlatban használatos gyógyszerekhez képest jelentős előrelépést jelentenek. A jelenleg használatos gyógyszerek közül példaként az immunrendszer összes elemének sejtosztódását és citokinszintézisét gátló immunoszupresszorokat és származékaikat (így az adrenális kortikoszteroidokat), továbbá a ciklosporin nevű gyűrűs undekapeptidet említjük meg [az utóbbi szelektíven gátolja az immunrendszer aktiválódását, ami ugyan nyilvánvaló haladást jelent, de emellett számos nem immunológiai toxikus hatása is van, lásd: N. Engl. J. Med. 321 (25), 1725-1738 (1989)].Because of their nature and mechanism of action, the pharmaceutical compositions of the present invention are devoid of the general toxicity of previously known agents (e.g., chemical immunosuppressants, such as glucocorticoids) and therefore represent a significant improvement over drugs used in current clinical practice. Examples of currently used drugs include immunosuppressors and their derivatives (such as adrenal corticosteroids) that inhibit cell division and cytokine synthesis of all elements of the immune system, as well as the cyclic undecapeptide cyclosporin. it also has non-immunological toxic effects, see N. Engl. J. Med. 321 (25): 1725-1738 (1989)].
A találmány szerint előállított polipeptidek az a- és β-interferontól eltérő agonisták vagy antagonisták működésének szabályozására is felhasználhatók.The polypeptides of the invention may also be used to regulate the function of agonists or antagonists other than α and β interferons.
HU 215 587 ΒHU 215 587 Β
A találmány szerint előállított polipeptidek tisztított állapotban arra is felhasználhatók, hogy meghatározzuk az oldható a- és β-interferon receptorok kötődési helyének tercier szerkezetét. A tercier szerkezet ismerete előfeltétele az olyan molekuláris modell kialakításának, amiből a gyógyászatban immunoszupresszorként felhasználható antagonisták vagy vírusellenes vagy tumorellenes szerként alkalmazható agonisták szintézisében hasznosítható szerkezeti következtetések vonhatók le.The polypeptides of the present invention, when purified, can also be used to determine the tertiary structure of the binding sites for soluble α and β interferon receptors. Knowledge of the tertiary structure is a prerequisite for the development of a molecular model from which structural conclusions can be drawn for the synthesis of antagonists for use as therapeutic immunosuppressants or agonists for use as antiviral or antitumor agents.
A találmány szerint előállított polipeptideket diagnosztikai célokra is felhasználhatjuk.The polypeptides of the invention may also be used for diagnostic purposes.
A diagnosztikai célú felhasználások egyik példája az interferon receptor elleni antitestek kialakítása oly módon, hogy melegvérű állatoknak a találmány szerint előállított polipeptidet és egy gyógyászatilag alkalmazható szubsztrátumot adunk be, majd az immunreakció lezajlása után az állatokat kivéreztetjük, és a vérből elkülönítjük az antitesteket. Ezeket a műveleteket szokásos immunbiológiai módszerekkel végezzük. Az így kialakított antitesteket például különféle diagnosztikai mérésekhez vagy farmakológiai modellvizsgálatokhoz használhatjuk fel.One example of diagnostic uses is the generation of antibodies against the interferon receptor by administering to a warm-blooded animal the polypeptide of the invention and a pharmaceutically acceptable substrate, and after the immune response has been completed, the animals are bled and the antibodies are isolated from the blood. These operations are carried out using standard immunobiological techniques. The antibodies thus formed can be used, for example, for various diagnostic assays or pharmacological model tests.
A diagnosztikai célú felhasználások másik példája az a- és β-interferon receptor elleni antitestek jelenlétének kimutatása biológiai mintákban. Az antitesteket önmagában ismert immunbiológiai módszerrel mutatjuk ki, amelynek lényege, hogy a vizsgálandó biológiai mintát az antitesttel komplexet képező anyaggal hozzuk érintkezésbe a komplex kialakulását lehetővé tevő körülmények között, majd kimutatjuk a komplex jelenlétét. A találmány értelmében az antitesttel komplexet képező anyagokként a találmány szerint előállított polipeptideket használjuk.Another example of diagnostic applications is the detection of antibodies to interferon α and β in biological samples. Antibodies are detected by an immunobiological method known per se, which involves contacting the biological sample to be tested with a substance complexed with the antibody under conditions which allow the formation of the complex and detecting the presence of the complex. In accordance with the present invention, the polypeptides of the invention are used as complexing agents with the antibody.
Megjegyezzük, hogy ha kifejezetten mást nem közöltünk, a „találmány szerint előállított (vízoldható) polipeptid” megjelölésen a leírás bevezető részében felsorolt polipeptidek szabad és második polipeptiddel hibridizált formáit egyaránt értjük.It is noted that, unless expressly stated otherwise, the term "(water soluble) polypeptide produced by the present invention" refers to both free and hybridised forms of the polypeptides listed in the introductory part of the specification.
Találmányunk további részleteit a következő példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört a példákra korlátoznánk.The following examples further illustrate the invention without limiting the scope of the invention to the examples.
/. példa/. example
Emlőssejtek által kiválasztott natív a- és ^-interferonok vízoldható receptorának és variánsainak kifejezésére szolgáló vektorok felépítéseConstruction of Vectors for Expression of Water Soluble Receptors and Variants of Native α and β Interferons Selected by Mammalian Cells
1. szekcióSection 1
Natív interferon receptor kifejezésére szolgáló plazmidok felépítéseConstruction of plasmids for expression of native interferon receptor
Teljes cDNS-t tartalmazó és a natív a- és β-interferonok receptorát kódoló DNS-fregmenseket PCRreakció felhasználásával szintetizálunk. Templátként a 2. ábrán bemutatott a- és β-interferonok receptora cDNSének teljes hosszát tartalmazó lambda ZAP-bakterofágot alkalmazunk és a reakció primerjeként specifikus oligonukleotidok szolgálnak. Közelebbről, a lambda ZAP-bakterofágot egy szintetikus oligonukleotid-párral inkubáljuk, amely a cDNS 5’ végén levő antiszemszállal komplementer, az oligo 0:5’ -CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCG GCTCCCAG-3’ szekvenciájú oligonukleotidból és a cDNS 3’ végén levő kódoló szállal komplementer, az oligo-1:3 ’-C AAAAAGTCGTCCTCAATGTG ACCATGGCC-5’ szekvenciájú oligonukleotidból áll.DNA fragments containing complete cDNA and encoding the receptor for native α and β interferons were synthesized by PCR. The template is a lambda ZAP bacterial phage containing the entire length of the receptor cDNA for the α and β interferons and specific oligonucleotides are used as primers for the reaction. Specifically, the lambda bacterial phage ZAP is incubated with a synthetic oligonucleotide pair complementary to the antisense at the 5 'end of the cDNA, the oligonucleotide encoding the oligo 0: 5' -CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCG with the codon gCTCCCAG-3 ', and the oligo-1: 3 '-C consists of an oligonucleotide having the sequence AAAAAGTCGTCCTCAATGTG ACCATGGCC-5'.
Az oligonukleotidokat oly módon építjük fel, hogy a PCR-reakció befejeződése után a kapott DNSfragmensek kettős szála a Pstl-enzim számára az 5’ végződésen és a Kpnl számára a 3’ végződésen restrikciós helyet tartalmaz.The oligonucleotides are constructed such that, after completion of the PCR reaction, the resulting double-stranded DNA fragments contain a restriction site at the 5 'end for PstI and at the 3' end for KpnI.
A PCR-reakciót 100 pl reakciótérfogatban PCRpufferben végezzük el, amely 1-1 mM mennyiségben primereket, 100 pg lambda ZAP-bakterofágot és 1 egység Taq-polimerázt tartalmaz. A reakciókörülmények az alábbiak: 25 ciklus; egy ciklus 95 °C-on egy órán át végzett inkubálásból (denaturálás), 37-40 °C-on 3 percen át történő kezelésből (hibridizáció), majd 72 °C-on 4 percen át történő melegítésből (polimerizáció) áll. Az utolsó ciklus után a reakciót 72 °C-on 10 percen át folytatjuk, és a mintákat 4 °C-on tároljuk. A reakciótermékeket kloroformmal extraháljuk, majd etanolos kicsapás után a termékeket egymás után Kpnl-el és Pstl-el emésztjük. Az 1,7 kb fragmenst (1. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézis után összegyűjtjük és a pSVAdpAl kifejező vektorhoz kapcsoljuk.The PCR reaction was performed in 100 µl reaction volume in PCR buffer containing 1-1 mM primers, 100 µg lambda ZAP bacterophage and 1 unit Taq polymerase. The reaction conditions are as follows: 25 cycles; one cycle consists of incubation at 95 ° C for one hour (denaturation), treatment at 37-40 ° C for 3 minutes (hybridization) and then heating at 72 ° C for 4 minutes (polymerization). After the final cycle, the reaction was continued at 72 ° C for 10 minutes and samples were stored at 4 ° C. The reaction products were extracted with chloroform and after precipitation with ethanol, the products were successively digested with KpnI and PstI. The 1.7 kb fragment (fragment 1) was collected after electrophoresis on low melting point agarose and ligated to the expression vector pSVAdpAl.
A pSVAdpAl kifejező vektort a következőképpen építjük fel:The pSVAdpAl expression vector is constructed as follows:
Az SV40-szekvenciákat a pSV2DHFR-plazmidból kapjuk [Subrami és társai: Molec. Cell. Bioi. 1, 854-864 (1981)]. Ezek a replikációs eredetet, az aktivátort, a korai és kései promotorokat (Pvull-HindlII fragmensek) és a hasítóhelyei (donor és akceptor) által körülvett antigén intronját, valamint a korai tartomány poliadenilezési helyét (Bgl II-Eco Rl-fragmens) tartalmazzák.SV40 sequences were obtained from plasmid pSV2DHFR [Subrami et al., Molec. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981)]. They contain the origin of replication, the activator, the early and late promoters (Pwull-HindIII fragments) and the intron of the antigen surrounded by its cleavage sites (donor and acceptor) and the early domain polyadenylation site (Bgl II-Eco RI fragment).
A 2-adeno kései fő promotor tartományát a pAdD26SVpA-plazmidból (EcoRi-Pstl-fragmens) kapjuk [Kaufman és Shimke: P. A.: J. Mól. Bioi. 159, 601-621 (1982)]. Ez a promotort, a tripartita vezetőt [Zain és társai: Cell. 16, 851 (1979)] és egy hibrid hasítóhelyet tartalmaz, amely a 2-adeno-donor hasítóhelyéből és az immunoglobulin változtatható tartománya akceptorhasító helyéből áll.The 2-adeno late major promoter region was obtained from plasmid pAdD26SVpA (EcoRI-PstI fragment) [Kaufman and Shimke, P. A., J. Mol. Biol. 159: 601-621 (1982)]. This promoter, the tripartite leader [Zain et al., Cell. 16, 851 (1979)] and comprises a hybrid cleavage site consisting of the 2-adeno-donor cleavage site and the acceptor cleavage site of the variable region of the immunoglobulin.
A többszörös klónozóhely a pUC18-plazmidban találttal azonos. Ez a Pstl, Sál I, Acc I, Hinc II, Xba I, Bam Hí, Xma I, Sma I, Kpnl, Sacl, Bán II, EcoRI számára restrikciós helyeket tartalmaz.The multiple cloning site is identical to that found in pUC18. It contains restriction sites for Pst I, Scal I, Acc I, Hinc II, Xba I, Bam HI, Xma I, Sma I, Kpn I, Sac I, Ban II, Eco RI.
A plazmid az E. coli replikációs eredetét és az ampicillinrezisztens gént tartalmazza és a pML-plazmidból származtatták le [Lusky és Botchan: Natúré 293, 79-81 (1981)].The plasmid contains the replication origin of E. coli and the ampicillin-resistant gene and was derived from the plasmid pML (Lusky and Botchan, Natura 293: 79-81 (1981)).
A pSVAdl-plazmidot egymás után Kpnl-el és Pstlel emésztjük, majd foszfatázzal kezeljük és a plazmid fő részét tartalmazó fragmenst (2. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk. A 2. fragmenst az 1. fragmenshez kapcsoljuk és aPlasmid pSVAd1 was digested sequentially with KpnI and PstI, treated with phosphatase, and the fragment containing the major portion of the plasmid (fragment 2) was isolated by low melting point agarose electrophoresis. Fragment 2 is linked to fragment 1 and
HU 215 587 Β kapcsolt keveréket kompetens E. coli HB 101-sejtekbe transzfektáljuk. A transzformált tenyészetet ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és az ampicilinrezisztens telepeket szelektáljuk. Ezekből a transzformánsokból a DNS-plazmidot elkészítjük és analizáljuk; az elemzés során a megfelelő inzert jelenlétét restrikciós enzimekkel vizsgáljuk és a szekvencia helyességének megerősítése céljából az 5’ és 3’ végződéseken az inzert kapcsolódásait szekvencia-analízissel határozzuk meg.The coupled mixture was transfected into competent E. coli HB 101 cells. The transformed culture is poured into petri dishes containing ampicillin-containing medium and the ampicillin-resistant colonies are selected. From these transformants, the DNA plasmid was prepared and analyzed; during the analysis, the presence of the appropriate insert is examined by restriction enzymes and the sequence of the insert at the 5 'and 3' ends is confirmed by sequence analysis to confirm the correctness of the sequence.
A natív sejtreceptor emlőssejtekben történő kifejezéséhez a pSVAdIFRpA-plazmidot alkalmazzuk.The plasmid pSVAdIFRpA was used to express the native cell receptor in mammalian cells.
2. szekcióSection 2
Az a- és ^-interferon receptorok kiválasztott variánsainak kifejezésére szolgáló plazmidokfelépítéseConstruction of plasmids for expression of selected variants of? And? Interferon receptors
A különböző karboxi-terminálisokat tartalmazó re5 ceptor különböző delécióit tartalmazó és a receptor kiválasztott formáit kódoló DNS-fragmenseket PCR-reakció felhasználásával szintetizálunk. Közelebbről, a receptor teljes cDNS-ét tartalmazó lambda ZAP-bakterofágot primerként szolgáló különböző szintetikus oligonukleotid10 párokkal inkubálunk, amelyek az 5’ végen levő antiszemszállal komplementer, azDNA fragments containing different deletions of the re5 receptor containing different carboxy terminals and encoding selected forms of the receptor were synthesized by PCR. Specifically, the lambda ZAP bacterial phage containing the complete cDNA of the receptor is incubated with various synthetic oligonucleotide pairs 10 which are complementary to the 5 'end of the antisense,
5’ végoligo: 5’-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3’ szekvenciájú oligonukleotidot és a cDNS különböző helyein levő kódolószállal komplementer, valamely5 'Ligigo: an oligonucleotide having the sequence 5'-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3 and a coding strand at various sites on the cDNA
3’ végoligo 1: 3’-CGTCCTTTATGGAGATTTACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 2: 3’-TCACTGCGACATACACTCACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 3: 3’-GTCAGACCTTTGTGCGGAACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 4: 3’-GTCACACAGAAAGGAGTTTACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 5: 3’-CTCTGATGAATAACAGATACTCCATGGCC-5’ szekvenciájú oligonukleotidok közül egyet tartalmaznak.3 'end oligo 1: 3'-CGTCCTTTATGGAGATTTACTCCATGGCC-5' 3 'end oligo 2: 3'-TCACTGCGACATACACTCACTCCATGGCC-5' 3 'end oligo 3: 3'-GTCAGACCTTTGTGCGGAACTCCATGGCC-5' 3'AGGG 4ACG-5 '3' end The '3' end contains one of the oligonucleotides having the sequence oligo 5: 3'-CTCTGATGAATAACAGATACTCCATGGCC-5 '.
Az oligonukleotidokat oly módon építjük fel, hogy a PCR-reakció befejeződése után a kapott kettős szálú DNS-fragmensek a Pstl-enzim számára az 5’ végződésen és a Kpnl számára a 3’ végződésen restrikciós helyet tartalmaznak.The oligonucleotides are constructed such that, after completion of the PCR reaction, the resulting double-stranded DNA fragments contain a restriction site at the 5 'end of the PstI enzyme and at the 3' end of the KpnI.
A PCR-reakciót 100 μΐ reakciótérfogatban PCR-pufferben végezzük el, amely 1-1 μΜ mennyiségben primereket, 100 pg lambda ZAP-bakterofágot és 1 egység Taq-polimerázt tartalmaz. A reakciókörülmények az alábbiak: 25 ciklus; minden ciklus 95 °C-on egy percen át végzett inkubálásból (denaturálás), 37-40 °C-on percen át végzett kezelésből (hibridizálás) és 72 °C-on percen át végzett melegítésből (polimerizáció) áll. Az utolsó ciklus után a reakciót 72 °C-on 10 percen át folytatjuk, majd a mintákat 4 °C-on tároljuk. A reakciótermékeket kloroformmal extraháljuk, majd etanolos kicsapás után a termékeket egymás után Kpnl-el és Pstl-el emésztjük. A kívánt fragmenseket alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézis után összegyűjtjük. Az összegyűjtött fragmensek hossza hozzávetőlegesen a következő:The PCR reaction was performed in 100 µΐ reaction volume in PCR buffer containing 1–1 µΜ primers, 100 µg bacterial phage Lambda and 1 unit Taq polymerase. The reaction conditions are as follows: 25 cycles; each cycle consists of incubation at 95 ° C for one minute (denaturation), treatment at 37-40 ° C for one minute (hybridization) and heating at 72 ° C for one minute (polymerization). After the final cycle, the reaction was continued at 72 ° C for 10 minutes and samples were stored at 4 ° C. The reaction products were extracted with chloroform and after precipitation with ethanol, the products were successively digested with KpnI and PstI. The desired fragments were collected after electrophoresis on low melting point agarose. The length of the fragments collected is approximately the following:
1. reakció (5’ vég oligo fragmens 3Reaction 1 (5 'end oligo fragment 3
2. reakció (5’ vég oligo fragmens 4Reaction 2 (5 'end oligo fragment 4
3. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 3): 1,1 kb fragmens 5Reaction 3 (5 'end oligo + 3' end oligo 3): 1.1 kb fragment 5
4. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 4): 0,9 kb fragmens 6Reaction 4 (5 'end oligo + 3' end oligo 4): 0.9 kb fragment 6
5. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 5): 0,6 kb fragmens 7Reaction 5 (5 'end oligo + 3' end oligo 5): 0.6 kb fragment 7
A 3-7-ből származó DNS-fragmenseket külön-külön kapcsoljuk a pSVAdpAl kifejező vektorhoz.The DNA fragments of 3-7 are separately linked to the expression vector pSVAdpAl.
A pSVAdl-plazmidot egymás után Kpnl-el és Pstlel emésztjük, majd foszfatázzal kezeljük és a plazmidPlasmid pSVAd1 was sequentially digested with KpnI and PstI, then treated with phosphatase and
3’ vég oligo 1): 1,3 kb3 'end oligo 1): 1.3 kb
3’ vég oligo 2): 1,3 kb fő részét tartalmazó fragmenst (2. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk. A 2. fragmenst külön-külön kapcsoljuk a 3-7. fragmensekhez és a kapcsolt keveréket kompetens E. coli HB 101-sejtekbe transzfektáljuk. A transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó3 'end oligo 2): The 1.3 kb fragment (fragment 2) was isolated by low melting point agarose electrophoresis. Fragment 2 is linked separately to the sequence of Figures 3-7. fragments and the coupled mixture was transfected into competent E. coli HB 101 cells. The transformed cultures contain medium containing ampicillin
Petri-csészékbe öntjük és a rezisztens telepeket szelektáljuk. Ezekből a transzformánsokból a DNSplazmidot elkészítjük és analizáljuk; az elemzés során a megfelelő inzert jelenlétét restrikciós enzimekkel vizsgáljuk és a szekvencia helyességének megerősítése céljából az 5’ és 3’ végződéseken az inzert kapcsolódásait szekvencia-analízissel határozzuk meg.Pour into petri dishes and select resistant colonies. From these transformants, the DNA plasmid was prepared and analyzed; during the analysis, the presence of the appropriate insert is examined by restriction enzymes and the sequence of the insert at the 5 'and 3' ends is confirmed by sequence analysis to confirm the correctness of the sequence.
A plazmidok elnevezése: pSVAdsIFlpA, pSVAdsIFR2pA, pSVAdsIFR3pA, pSVAdsIFR4pA, pSVAdsIFR5pA. Ezeket a plazmidokat használjuk fel az oldható receptornak és fragmenseinek emlőssejtekben történő kifejezésére.The plasmids are named pSVAdsIFlpA, pSVAdsIFR2pA, pSVAdsIFR3pA, pSVAdsIFR4pA, pSVAdsIFR5pA. These plasmids are used to express the soluble receptor and its fragments in mammalian cells.
2. példaExample 2
CHO-sejtekben történő kifejezés 45 Miután az oldható receptor átmeneti kifejezését teszteltük, az oldható receptort folyamatosan kifejező stabil sejtvonalat felépítjük. Ennek elvégzéséhez gazdasejtként dihidro-folátreduktáz-deficiens vonalat alkalmazunk, éspedig a CHO DUK-X-vonalat hasz50 náljuk [F. Kao és társai: PNAS USA, 64, 1284-1291 (1969); Chasin L. és Urlaub G.: Proc. Natl. Acad. Sci, 77, 4216-4280 (1980)]. E rendszer felhasználásával az oldható a- és β-interferon receptort az egér-DHFR-gént tartalmazó pSV2DHFR-vektorral ko-transzfektáljuk [Subrami és társai: Molec. Cell. Bioi. 1, 854-864 (1981)]. E ko-transzfekció elvégzése előtt az összes plazmidot egy restrikciós enzimmel végzett restrikcióval linearizáljuk, és transzfekció előtt minden plazmidot a pSV2DHFR-plazmiddal külön60 külön összekeverünk oly módon, hogy az SV2DHFR11Expression in CHO Cells After testing for the expression of the soluble receptor, a stable cell line continuously expressing the soluble receptor is constructed. To accomplish this, a dihydrofolate reductase-deficient line was used as the host cell, using the CHO DUK-X line [F. Kao et al., 1969, PNAS USA 64: 1284-1291; Chasin L. and Urlaub G., Proc. Natl. Acad. Sci, 77, 4216-4280 (1980)]. Using this system, the soluble interferon α and β receptor are co-transfected with the pSV2DHFR vector containing the murine DHFR gene [Subrami et al., Molec. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981)]. Prior to this co-transfection, all plasmids were linearized by restriction with a restriction enzyme, and prior to transfection, each plasmid was separately mixed with plasmid pSV2DHFR so that the SV2DHFR11
HU 215 587 Β és IFR-plazmid aránya 1:10 legyen. Ezáltal az IFR-gének kópiáinak egy transzfektánsra eső számát maximalizáljuk. A plazmidok a sejtben polimerek képződése mellett kapcsolódnak, amelyek a gazdasejt kromoszómájában rekombináció segítségével integrálhatók [Haynes és Weismann; Nucl. Acids. Rés. 11, 687-706 (1983); Scahill S. J. és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4654-4658 (1983)]. A patkányés egér-DHFT-t egy α-táptalajban kifejező transzfektánsokat szelektáljuk; az α-táptalaj nukleozidmentes közeg. Ezután a DHFR-t magas szinten kifejező sejtek szelektálása céljából methotrexátot adunk hozzá (MTX; a DHFR-hez kapcsolódó toxikus folát analóg). Az MTX-el szembeni rezisztencia a DHFR magas fokú kifejezésének következménye és gyakran a DHFR-gén amplifikációjának eredménye, amely hosszú kromoszóma-szegmenseket - úgynevezett „amplifikált egységeket” - tartalmazhat [Kaufman és Sharp: Molec. Cell. Bioi. I, 1069-1076 (1981)]. Ily módon a DHFRszekvenciák és oldható a- és β-interferon receptorok ko-integrációja az oldható a- és β-interferon receptorok génjeinek amplifikációját teszi lehetővé.The ratio of the plasmid to the IFR plasmid should be 1:10. Thus, the number of copies of IFR genes per transfectant is maximized. Plasmids are linked in the cell to form polymers that can be integrated into the host cell chromosome by recombination [Haynes and Weismann; Nucl. Acids. Gap. 11: 687-706 (1983); Scahill, S.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4654-4658 (1983). Transfectants expressing rat murine DHFT in an α-medium were selected; α-medium is a nucleoside-free medium. Methotrexate (MTX; a toxic folate analogue associated with DHFR) is then added to select cells expressing high levels of DHFR. Resistance to MTX is a consequence of the high expression of DHFR and is often the result of amplification of the DHFR gene, which may contain long chromosome segments called "amplified units" [Kaufman and Sharp, Molec. Cell. Biol. I, 1069-1076 (1981)]. Thus, co-integration of DHFR sequences with soluble α- and β-interferon receptors allows amplification of soluble α- and β-interferon receptor genes.
A stabilan transzfektált sejtvonalakat 10% magzati borjúszérummal kiegészített szelektív táptalajban [DMEM/HAM FI2 1:1, Gibco] történő klónozással izoláljuk. Ezután a kiónokat a legoldhatóbb a- és β-ϊηterferon receptorokat kifejező klón megtalálása céljából oly módon screeneljük, hogy a kondicionált táptalajt 35C-ciszteinnel történő jelzés után in vivő immunokicsapásnak vetjük alá. Közelebbről, pSVAdIFRpA vagy pSVAdsIFRlpA vagy pSVAdsIFR2pA vagy pSVAdsIFR3pA vagy pSVAdpA vagy pSV2DHFR plazmiddal transzfektált körülbelül 107 CHO-sejtet 5 órán át 37 °C-on 4 ml RPMI cys-táptalajban (Gibco) 100 mCi/ml 35S-ciszteinnel (Amersham) inkubálunk. A sejtek jelzése után 1 ml szűrt kondicionált táptalajt 0,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluoriddal beállítunk és a későbbiekben ismertetésre kerülő módon immunolecsapásnak vetünk alá. A csapadékot elektroforézissel reduktív körülmények között 7,5%-os PAGE-gélen [U. K. Laemmli: Natúré 227, 680-685 (1980)] frakcionáljuk.Stably transfected cell lines were isolated by cloning in selective medium supplemented with 10% fetal bovine serum [DMEM / HAM FI2 1: 1, Gibco]. Clones are then screened for in vivo immunoprecipitation after labeling with 35 C-cysteine to find a clone expressing the most soluble α- and β-β-interferon receptors. Specifically, pSVAdIFRpA or pSVAdsIFRlpA or pSVAdsIFR2pA or pSVAdsIFR3pA or pSVAdpA or pSV2dhfr plasmid transfected about 10 7 CHO cells for 5 hours at 37 ° C with 4 ml RPMI cys medium (Gibco) supplemented with 100 mCi / ml 35 S-cysteine (Amersham) were incubated . After labeling the cells, 1 ml of filtered conditioned medium is adjusted with 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and subjected to immuno-precipitation as described below. The precipitate was fractionated by electrophoresis under reductive conditions on a 7.5% PAGE gel (UK Laemmli, Nature 227: 680-685 (1980)).
3. példaExample 3
Az oldható a- és ^-interferon receptorok tisztításaPurification of soluble α and β interferon receptors
A pSVAdsIFR3pA-szerkezetű, a rekombináns oldható a- és β-interferon receptorokat kifejező CHO-sejtek kiónját szelektáljuk és 1% magzati boíjúszérummal (FCS), 1 g/1 glükózzal és antibiotikumokkal [pl. sztreptomicinnal és penicilinnel (100 g/ml)] és 0,5 mM MTX-szel kiegészített DMEM/HAM F12 (1:1) táptalajban 4 üvegben (Becton és Dickinson) 8 napon át tenyésztjük. A felülúszót összegyűjtjük, 0,2 pm maxi csészén (Gelman Sciences) átszűqük és a kiválasztott fehérjét FPLC mono Q anioncserélő oszlopon (Pharmacia) betöményítjük. Az oszlopot 100 mM Hepest (pH 7), 10% glicerint, 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMFS) és 400 gátlási egység aprotinin kallikreint/ml tartalmazó pufferrel öblítjük, majd nem folyamatos gradiens szerint nátrium-kloriddal (0,2 M-től 1,0 M-ig) eluáljuk. Az oldható receptor az interferon megkötésére képes és ezután a receptor tisztaságának nyomonkövetésére a 125jóddal jelzett interferon megkötését használjuk.A clone of pSVAdsIFR3pA-structured CHO cells expressing recombinant soluble α- and β-interferon receptors was selected and treated with 1% fetal calf serum (FCS), 1 g / l glucose and antibiotics [e.g. streptomycin and penicillin (100 g / ml)] and DMEM / HAM F12 (1: 1) supplemented with 0.5 mM MTX in 4 bottles (Becton and Dickinson) for 8 days. The supernatant was collected, filtered through a 0.2 µm maxi dish (Gelman Sciences), and the selected protein was concentrated on a FPLC mono Q anion exchange column (Pharmacia). The column was rinsed with a buffer containing 100 mM Heps pH 7, 10% glycerol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMFS) and 400 inhibitory units aprotinin kallikrein / ml, followed by a continuous gradient of sodium chloride (0.2). M (1.0 M to 1.0 M). The soluble receptor is capable of binding interferon and subsequently binding the 125 iodine-labeled interferon is used to monitor the purity of the receptor.
A receptort tartalmazó anyagot dializált mono Q oszlopon eluáljuk és Micro-Prodicon típusú készülékben betöményítjük. A 10 000 daltonnál nagyobb molekulatömegű fehérjéket visszatartó membránt használunk. A betöményített anyagot 7,5% poliakril-amidot és 0,1% SDS-t tartalmazó 3 mm-es gélen csapjuk le. Egyidejűleg ugyanezen gél másik oldalán egy mintát (kb. 10 pg) lecsapunk. Elektroforézis után a gél ezen részét elektromos úton polividinil-bifluorid-membránra (Millipore) visszük át, majd 125jóddal jelzett rekombináns humán α-8-interferonnal hibridizáljuk. Ily módon az oldható receptor helyzetét elektroforézis után azonosíthatjuk. A gélnek az oldható receptort tartalmazó részét kivágjuk, molekuláris ultraszűréssel betöményítjük és az SDS eltávolítása céljából dializáljuk.The receptor-containing material was eluted on a dialyzed mono Q column and concentrated in a Micro-Prodicon. A protein retaining membrane with a molecular weight greater than 10,000 daltons is used. The concentrated material was precipitated on a 3 mm gel containing 7.5% polyacrylamide and 0.1% SDS. Simultaneously, a sample (about 10 pg) is precipitated on the other side of the same gel. Following electrophoresis, this portion of the gel was electrophoresed on a polyvinyl bifluoride membrane (Millipore) and hybridized with 125 iodine-labeled recombinant human interferon alpha-8. In this way, the position of the soluble receptor can be identified after electrophoresis. The soluble receptor portion of the gel was excised, concentrated by molecular ultrafiltration, and dialyzed to remove SDS.
4. példaExample 4
Az a- és ^-interferonok oldható receptorai variánsainak kifejezésére szolgáló, humán kappa immunoglobulin konstans tartományához és humán gl immunoglobulin konstans tartományához fuzionált plazmidok felépítéseConstruction of plasmids fused to human kappa immunoglobulin constant region and human gl immunoglobulin constant region to express soluble receptor variants of α and β interferons
A könnyű lánc fúzióiLight chain fusions
Az a- és β-interferonok oldható receptorai kifejezésére szolgáló olyan plazmidokat építünk fel, amelyek a kappa immunoglobulin konstans tartományához fuzionált különböző hosszúságú extracelluláris tartományokat tartalmaznak. Ezen plazmidok elnevezése a továbbiakban: pSVAdsIFRIK, pSVAdsIFR2K és pSVAdsIFR3K.Plasmids for the expression of soluble receptors for interferons α and β are constructed which contain extracellular domains of various lengths fused to the immunoglobulin constant region of kappa. These plasmids are hereinafter referred to as pSVAdsIFRIK, pSVAdsIFR2K and pSVAdsIFR3K.
A pSVAdsIFRIK-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a lizin 436 kodon után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a kappa immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán kappa immunoglobulin treonin 109 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai: Hieter P. A. és társai: Cell 22, 197-207(1980)].Plasmid pSVAdsIFRIK contains the N-terminal portion from the methionine initiation codon to the fusion point downstream of lysine 436, followed immediately by the kappa immunoglobulin constant region starting at codon 109 of the human kappa immunoglobulin [Kabat et al., Hieter PA et al. : Cell 22: 197-207 (1980)].
Hasonlóképpen, a pSVAdsIFR2K-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a glutamát 427 kodon után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a kappa immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán kappa immunoglobulin treonin 109 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Hieter P. A. és társai: Cell 22, 197-207 (1980)].Similarly, plasmid pSVAdsIFR2K contains the N-terminal portion from the methionine initiation codon to the fusion point after glutamate codon 427, which is immediately followed by the kappa immunoglobulin constant region starting at codon 109 of human kappa immunoglobulin [Kabat et al. Hieter, P. A., et al., Cell 22: 197-207 (1980).
Ezeket a plazmidokat a következőképpen építjük fel.These plasmids are constructed as follows.
A kappa immunoglobulin DNS-fragmensét humán lép cDNS-könyvtárból szintetizáljuk (Clontech Laboratories, Inc.). A kívánt cDNS szintetizálása céljából a PCR-reakcióhoz primerként oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek a publikált DNS-szekvencia alapján az előre meghatározott tartományokkal komplementer szekvenciákat tartalmaznak [Hieter P. A. és társai: Cell 22, 197-207 (1980)]. Az oligonukleotid 5’ végződésének szekvenciája a következő:The kappa immunoglobulin DNA fragment was synthesized from a human spleen cDNA library (Clontech Laboratories, Inc.). For the synthesis of the desired cDNA, oligonucleotides containing sequences complementary to predetermined regions based on the published DNA sequence are used as primers for the PCR reaction (Hieter, P. A., et al., Cell 22: 197-207 (1980)). The 5 'end of the oligonucleotide has the sequence:
’ - ACTGTGGCTGCACC ATCTGTCTTCA- 3 ’'- ACTGTGGCTGCACC ATCTGTCTTCA-3'
HU 215 587 Β míg a 3’ végződés szekvenciája az alábbi:EN 215 587 Β while the 3 'end has the sequence:
3’ -CCCTCTCACAATCTCCCTCCATGGCCAG-5 ’ A PCR-reakciót az 1. példában leírt módon végezzük el azzal a változtatással, hogy templátként 1 μg plazmidot alkalmazunk, és a reakció után az elegyet a két szál végének helyreállítása céljából 4 trifoszfát-nukleozid jelenlétében Klenow-polimerázzal kezeljük.3 '-CCCTCTCACAATCTCCCTCCATGGCCAG-5' The PCR reaction was performed as described in Example 1 with the exception that 1 μg of plasmid was used as a template and after the reaction the mixture was reconstituted with Klenow polymerase in the presence of 4 triphosphate nucleosides. treated.
A DNS-t a Kpnl restrikciós enzimmel emésztjük, és a kívánt fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.The DNA was digested with the restriction enzyme Kpn1 and the desired fragment was isolated by low melting point agarose electrophoresis.
Az oldható a- és β-interferon receptorok fragmen5 seit kódoló DNS-fragmenseket azonos módon szintetizáljuk. Az 5’ oligonukleotid 5’ végződése az 1. példában leírttal azonos, azaz ’ -CCGGCTGC AGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3 ’ míg az oligonukleotid 3’ végződése az alábbi:DNA fragments encoding soluble α and β interferon receptor fragments were synthesized in the same manner. The 5 'end of the 5' oligonucleotide is the same as that described in Example 1, i.e., '-CCGGCTGC AGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3', while the 3 'end of the oligonucleotide is as follows:
3’-CTCTTTTGTTTTGGTCCTTTATGGAGATTT-5’ oligo 1 3’-TCGTCACAAAAATCACAGCGACATACACTC-5’ oligo 2 3’-CCACGAGGTTTTGTCAGACCTTTGTGCGGA-5’ oligo 33'-CTCTTTTGTTTTGGTCCTTTATGGAGATTT-5 'oligo 1 3'-TCGTCACAAAAATCACAGCGACATACACTC-5' oligo 2 3'-CCACGAGGTTTTGTCAGACCTTTGTGCGGA-5 'oligo 3
A PCR-reakciókat az 1. példában leírt módon végezzük el azzal a változtatással, hogy az utolsó reakcióciklus után a reakciótermékeket a két szál végének helyreállítása céljából Klenow-polimerázzal kezeljük, majd az IFR1-, IFR2- és IFR3-fragmensek kialakítása céljából PstL restrikciós enzimmel kezeljük.The PCR reactions were performed as described in Example 1, except that after the final reaction cycle, the reaction products were treated with Klenow polymerase to repair the ends of the two strands, and then with PstL to generate IFR1, IFR2 and IFR3 fragments. treated.
A pSVAdAl kifejező vektort egymás után Kpnl és Pstl, majd foszfatáz segítségével emésztjük, és a plazmid legnagyobb részét tartalmazó P-fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.The pSVAdAl expression vector was sequentially digested with KpnI and PstI followed by phosphatase, and the P-fragment containing most of the plasmid was isolated by low melting point agarose electrophoresis.
Három komponenst tartalmazó reakcióban a Pffagmenst az immunoglobulin-fragmenshez és a sIFRlfragmenshez kapcsoljuk. Hasonlóképpen a P-fragmenst az immunoglobulin-fragmenshez és az sIFR2-fragmenshez kapcsoljuk, és végül a P-fragmenst az immunoglobulin-fragmenshez és az sIFR3-fragmenshez kapcsoljuk.In a three-component reaction, the Pffagments are coupled to the immunoglobulin fragment and the sIFR1 fragment. Similarly, the P fragment is linked to the immunoglobulin fragment and the sIFR2 fragment, and finally the P fragment is linked to the immunoglobulin fragment and the sIFR3 fragment.
Minden ligációs keveréket külön-külön kompetens E. coli HB101-baktériumba transzformálunk, a transzformáit tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és az ampicillinrezisztens telepeket szelektáljuk. A plazmidokat a transzformánsokból izoláljuk és analizáljuk; az analízis során az inzertet restrikciós enzimekkel határozzuk meg, vagy az inzert-összeillesztés DNS-szekvenciájának megerősítéséhez szekvencia-meghatározást végzünk. Az a- és βinterferonok oldható receptora fúziójának kifejezéséhez ezeket a plazmidokat alkalmazzuk.Each ligation mixture is transformed individually into competent E. coli HB101, the transformed cultures are plated in Petri dishes containing ampicillin medium and the ampicillin resistant colonies are selected. The plasmids were isolated from the transformants and analyzed; in the assay, the insert is determined by restriction enzymes, or sequencing is performed to confirm the DNA sequence of the insert. These plasmids are used to express the soluble receptor fusion of α- and β-interferons.
A nehéz lánc fúzióiHeavy chain fusions
Az oldható a- és β-interferon receptorok kifejezésére szolgáló, a gl immunoglobulin konstans tartományához fuzionált különböző hosszúságú extracelluláris tartományokat tartalmazó plazmidokat építünk fel. Ezen plazmidokat a továbbiakban a következőképpen nevezzük: pSVAdsIFRlgl, pSVAdsIFR2gl és pSVAdsIFR3gl.Plasmids containing different lengths of extracellular domains fused to the constant region of immunoglobulin gl are fused to express soluble α and β interferons. These plasmids are hereinafter referred to as pSVAdsIFR1gl, pSVAdsIFR2gl and pSVAdsIFR3gl.
A pSVAdsIFRlgl-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a lizin 436 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Ellison J. W. és társai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)].Plasmid pSVAdsIFR1g1 contains the N-terminal portion from the methionine initiation codon to the fusion point after codon 436 of lysine, which is immediately followed by the constant region of immunoglobulin gl, beginning at codon 113 of human gl immunoglobulin [Kabat et al; Ellison J.W. et al., Nucl. Acids Slit. 10: 4071-4079 (1982)].
Hasonlóképpen a pSVAdsIFR2gl-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a glutamát 427 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Ellison J. W. és társai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079(1982)].Similarly, plasmid pSVAdsIFR2gl contains the N-terminal portion from the methionine initiation codon to the fusion point after codon 427 of glutamate, which is immediately followed by the constant region of the immunoglobulin gl, starting at codon 113 of human gl immunoglobulin [Kabab et al; Ellison J.W. et al., Nucl. Acids Slit. 10: 4071-4079 (1982)].
A pSVAdsIFR3gl-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a prolin 360 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Ellison J. W. és társai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)].Plasmid pSVAdsIFR3gl contains the N-terminal portion from the methionine initiation codon to the fusion point downstream of the proline codon 360, which is immediately followed by the constant region of immunoglobulin gl, beginning at codon 113 of human gl immunoglobulin [Kabat et al; Ellison J.W. et al., Nucl. Acids Slit. 10: 4071-4079 (1982)].
Ezeket a plazmidokat a következőképpen építjük fel:These plasmids are constructed as follows:
A gl immunoglobulint kódoló szekvenciát humán lép cDNS-könyvtárból szintetizáljuk (Clontech Laboratories Inc.). A kívánt cDNS szintetizálása céljából a PCR-reakcióhoz primerként oligonukleotideket alkalmazunk, amelyek a publikált DNS-szekvencia alapján [Ellison és társai: Nucl. Acids Rés. 10,4071-4079 (1982)] előre meghatározott tartományokkal komplementer szekvenciát tartalmaznak.The immunoglobulin coding sequence for gl was synthesized from a human spleen cDNA library (Clontech Laboratories Inc.). For the synthesis of the desired cDNA, oligonucleotides are used as primers for the PCR reaction, based on the published DNA sequence [Ellison et al., Nucl. Acids Slit. 10: 4071-4079 (1982)] contain a sequence complementary to predetermined domains.
Az oligonukleotid 5’ végének szekvenciája a következő:The 5 'end of the oligonucleotide has the sequence:
5’ -GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCC-3’ míg a 3’ vég szekvenciája az alábbi:5 '-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCC-3', while the 3 'end has the sequence:
’ -GACAGAGGCCCATTTACTCACCATGGC CAG-5’'-GACAGAGGCCCATTTACTCACCATGGC CAG-5'
A PCR-reakciót a továbbiakban ismertetésre kerülő módon végezzük el.The PCR reaction is performed as described below.
Az s IFR1-, sIFR2- és sIFR3-ffagmens a fentiekben leírtakkal azonos és a kifejező vektorokat a korábbiakban, a könnyű lánc fúziója kapcsán leírtak szerint építjük fel.The IFR1, sIFR2 and sIFR3 fag fragments are the same as described above and the expression vectors are constructed as described above for light chain fusion.
5. példaExample 5
Az oldható a- és β-interferon receptorok E. coliban történő kifejezésére szolgáló vektorok felépítéseConstruction of vectors for expression of soluble interferon α and β in E. coli
Az sIFR E. coliban történő kifejezésére a pHR148 kifejező vektort alkalmazzuk. A pHR148-vektort Rink és társai írták le [Nucl. Acid. Rés. 12, 6369-6387 (1984)]. A HR148-plazmidot egymás után Ncol restrikciós enzimekkel, majd a két szál végénekThe expression vector pHR148 was used to express sIFR in E. coli. The pHR148 vector has been described by Rink et al., Nucl. Acid. Gap. 12: 6369-6387 (1984)]. Plasmid HR148 was sequenced with NcoI restriction enzymes and then the ends of the two strands
HU 215 587 Β helyreállítása céljából 4 trifoszfát nukleozidok jelenlétében Klenow-polimerázzal és Kpnl-lel emésztjük. A foszfatázzal végzett kezelés után a plazmid legnagyobb részét tartalmazó DNS-fragmenst (1. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.For the recovery of HU 215 587 Β, Klenow polymerase and KpnI were digested in the presence of 4 triphosphate nucleosides. After treatment with phosphatase, the DNA fragment (fragment 1) containing the major part of the plasmid was isolated by electrophoresis on low melting point agarose.
Az a- és β-interferonok érett oldható receptorát kódoló DNS-fragmenst (azaz amely nem tartalmaz peptidszignált) PCR-reakcióval templátként a teljes cDNS-t tartalmazó plazmid [UZÉ és társai: Cell 60 (2), 225-234 (1990)] és primerként egy oligonukleotid-pár felhasználásával szintetizáljuk.A DNA fragment encoding the mature soluble receptor for α- and β-interferons (i.e., containing no peptide signal) is a template containing the complete cDNA as a template (UZE et al., Cell 60 (2): 225-234 (1990)). and synthesized using a pair of oligonucleotides as primer.
Az oligonukleotid 5’ végének (az interferon N-terminális tartományából származtatható le) szekvenciája a következő:The 5 'end of the oligonucleotide (derived from the N-terminal region of interferon) has the following sequence:
’ -GGTGGAAAAAATCTAAAATCTCCTCAA AAAG-3’ (oligo 1) míg az oligonukleotid 3’ végének (az interferon transzmembrán régióját éppen megelőző tartományból származtatható le) szekvenciája az alábbi:'-GGTGGAAAAAATCTAAAATCTCCTCAA AAAG-3' (oligo 1), while the 3 'end of the oligonucleotide (derived from the region just prior to the transmembrane region of interferon) is as follows:
’ -TC ACTGCGACATACACTCATCCCATGG CC-5’ (oligo 2).'-TC ACTGCGACATACACTCATCCCATGG CC-5' (oligo 2).
Az oligonukleotidokat oly módon választjuk meg, hogy PCR-fúzió után a szintetizált fragmens a 3’ végződésen egy Kpnl restrikciós enzim helyet és az 5’ végződésen egy „tompa” véget tartalmazzon.The oligonucleotides are selected such that, after PCR fusion, the synthesized fragment contains a Kpn I restriction site at the 3 'end and a "blunt" end at the 5' end.
A PCR-reakciót az 1. példában leírtak szerint végezzük el azzal a változtatással, hogy a reakció után a termékeket a két szál végének helyreállítása céljából Klenow-polimerázzal, majd Kpnl-enzimmel kezeljük. Az 1,3 kb fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk és az 1. fragmenshez ligáljuk.The PCR reaction was performed as described in Example 1 except that after the reaction, the products were treated with Klenow polymerase followed by KpnI to repair the ends of the two strands. The 1.3 kb fragment was isolated by low melting point agarose electrophoresis and ligated to fragment 1.
Egy második DNS-fragmenst hasonlóképpen szintetizálunk azzal a változtatással, hogy az 5’ vég oligonukleotidot az ’ - GG A AA A AATCTA A AATCTCCTC AAA A AG-3’ szekvenciával helyettesítjük.A second DNA fragment is similarly synthesized by the replacement of the 5 'end oligonucleotide with the sequence AG-3' - GG A AA AATCTA A AATCTCCTC AAA.
A ligációs termékeket E. coli HBlOl-törzsbe transzformáljuk és a transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészébe öntjük. Az ampicillinrezisztens telepeket szelektáljuk, a plazmidokat a transzformánsokról izoláljuk és analizáljuk; az elemzés során restrikciós enzimekkel emésztjük és az inzert fúziós pontja szekvenciájának megerősítése céljából szekvenciameghatározást végzünk el.The ligation products are transformed into E. coli strain HB101 and the transformed cultures are poured into a petri dish containing ampicillin medium. Ampicillin-resistant colonies were selected, plasmids were isolated from the transformants and analyzed; digestion with restriction enzymes and sequencing to confirm the fusion point of the insert.
Az oldható receptor E. coliban történő kifejezéséhez a ptrpIFRl és ptrpIFR2 elnevezésű plazmidokat alkalmazzuk. A rekombináns fehérje kifejezése céljából a transzformánsokat 1,0 abszorpciós (A650) érték eléréséhez 20-50 ml tenyészőközegben M9 táptalajba [Rink és társai: Nucl. Acid. Rés. 12, 6369-6387 (1984)] helyezzük. Ezután a sejteket centrifugáljuk, mossuk, az oldható interferon-receptort a feltört sejtekről extraháljuk és tisztítjuk. Az oldható a- és β-interferon receptort Western biot vagy dót biot analízissel, a továbbiakban ismertetésre kerülő módon határozzuk meg.The plasmids ptrpIFR1 and ptrpIFR2 are used to express the soluble receptor in E. coli. To express the recombinant protein, transformants were obtained in 20-50 ml of culture medium in M9 medium to obtain a 1.0 absorbance (A650) value [Rink et al., Nucl. Acid. Gap. 12: 6369-6387 (1984)]. The cells are then centrifuged, washed, and the soluble interferon receptor extracted from the disrupted cells and purified. Soluble interferon-α and β-receptor were determined by Western biot or biot analysis as described below.
6. példaExample 6
Humán interferon oldható receptorának meghatározására szolgáló módszerekMethods for determining the soluble receptor for human interferon
Az oldható receptor meghatározásának módszerei a receptor azon képességén alapulnak, hogy humán a-interferonhoz specifikus módon kötődni képes.Methods for determining the soluble receptor are based on the ability of the receptor to bind specifically to human interferon alpha.
a) Immunokicsapás(a) Immunoassay
A humán a- és β-interferonok oldható receptorának meghatározása azon alapul, hogy az oldható receptor és 125jóddal jelzett humán α-8-interferon között komplex képződik, amely 125I-IFN-nek az α-2-interferon terminális aminorésze ellen irányított monoklonális antitesthez történő kapcsolódását gátolja [H. Amheiter és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 2539 (1983)]. Miután az interferon receptorához kötődött, a molekula terminális aminorésze az antitest számára nem hozzáférhető [H. Amheiter és társai (1983)]. A szabadon maradó 125I-IFN-t az anti-IFN-antitesttel komplexbe visszük, majd A-sepharose fehérje (Pharmacia) hozzáadásával kicsapjuk. Az anti-IFN-antitestet az A-fehérjével a gyártó instrukciói szerint konjugáljuk.The determination of the soluble receptor for human α- and β-interferons is based on the formation of a complex between the soluble receptor and 125 iodine-labeled human interferon α-8, which is directed against the 125 I-IFN monoclonal terminal portion of interferon α-2. inhibits its binding to an antibody [H. Amheiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 2539 (1983). Once bound to the interferon receptor, the terminal amino portion of the molecule is not accessible to the antibody [H. Amheiter et al., 1983]. The remaining 125 I-IFN is complexed with the anti-IFN antibody and precipitated by the addition of A-sepharose protein (Pharmacia). The anti-IFN antibody is conjugated to protein A according to the manufacturer's instructions.
A meghatározandó oldható receptorok 50 μΐ borátpufferrel (pH 8,3; 0,1 M H3BO3, 0,025 M Na2B4O7, 0,075 M NaCl, 0,1% NP40) képezett sorozathígításait 81 Bq per ffnol fajlagos aktivitású 125jóddal jelzett a-2interferon konstans mennyiségével (75 pmol) összekeverjük [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzymol. 119C, 267 (1986)] és egy órán át 4 °C-on inkubáljuk. Konstans mennyiségű A-anti-IFN-fehérjét 50 μΐ térfogatban felvesszük, amelyhez 50 μΐ borát-puffert (pH 8,3; 0,2 M H3BO3, 0,05 M Na2B4O7, 0,15 M NaCl, 0,1% NP40) adunk. Az elegyet egy órán át 4 °Con keverjük, majd Eppendorf-féle mikrocentrifúgában 10,000 g mellett egy percen át centrifugáljuk és a felülúszót elöntjük. A csapadékot borátpufferrel (pH 8,3; 0,1 M H3BO3, 0,025 M Na2B4O7, 1 M NaCl, 0,5% NP40) hatszor, 40 mM HEPES-sel (pH 8) és 2% glicerinnel kétszer, 40 mM HEPES-sel (pH 8) és 1 M karbamiddal egyszer, végül 40 mM HEPES-sel (pH 8) kétszer mossuk. A csapadékban levő immunkomplex radioaktivitásának megszámlálása - az interferon-antiinterferon komplexképződés gátlási görbéjével összehasonlítva - az ily módon tesztelt minta oldható a- és β-interferon receptor tartalmának meghatározását teszi lehetővé.Serial dilutions of soluble receptors to be determined in 50 μΐ borate buffer (pH 8.3; 0.1 MH 3 BO 3 , 0.025 M Na 2 B 4 O 7 , 0.075 M NaCl, 0.1% NP40) with 125 Iodine with specific activity of 81 Bq per ffnol (75 pmol) of labeled α-2 interferon (KE Mogensen and G. Uze, Methods in Enzymol. 119C, 267 (1986)] and incubated for 1 hour at 4 ° C. A constant volume of A-anti-IFN protein was added in 50 μΐ volume with 50 μΐ borate buffer pH 8.3; 0.2 MH 3 BO 3 , 0.05 M Na 2 B 4 O 7 , 0.15 M NaCl , 0.1% NP40). After stirring for one hour at 4 ° C, the mixture is centrifuged in an Eppendorf microcentrifuge at 10,000 g for one minute and the supernatant discarded. The precipitate was borne six times with borate buffer, pH 8.3; 0.1 MH 3 BO 3 , 0.025 M Na 2 B 4 O 7 , 1 M NaCl, 0.5% NP40, and 2% Wash twice with glycerol, once with 40 mM HEPES (pH 8) and 1 M urea, and finally twice with 40 mM HEPES (pH 8). Counting the radioactivity of the immune complex in the precipitate, as compared to the inhibition curve of the interferon-anti-interferon complex, allows the amount of soluble α- and β-interferon receptor to be determined in the sample so tested.
b) Humán a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása a jelzett interferon sejtreceptorához történő kötődésének gátlása útjánb) Determination of soluble receptor for human α and β interferons by inhibiting the binding of labeled interferon to the cell receptor
Az a- és β-interferonok oldható receptorainak sorozathígításait 30 percen át 4 °C-on l25jóddal (fajlagos radioaktivitás 25 Bq per fmol) jelzett rekombináns humán α-8-interferon változó koncentrációjú mennyiségeivel (0,50, 100, 125, 500,1000 és 2000 NE /ml) inkubáljuk. Ezután különböző 125I-IFN oldható receptorkeverékekhez 107 sejt/ml végső koncentrációban Daudi humán limfoidsejteket adunk, és 2 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A sejteket centrifugáljuk (800 g mellett, 10 percen át), majd a felülúszót elöntjük. Ezután 0,5% magzati borjúszérumot (Flow Laboratories) tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal háromszor mossuk és a sejtekhezThe a- and β-interferons, soluble receptors of serial dilutions for 30 min at 4 ° C with labeled recombinant l25 iodine (specific radioactivity 25 Ci per fmol) human α-interferon 8 Varying concentrations of the quantities of (0.50, 100, 125, 500, 1000 and 2000 IU / ml). Daudi human lymphoid cells are then added to various 125 I-IFN soluble receptor mixtures at a final concentration of 10 7 cells / ml and incubated for 2 hours at 4 ° C. The cells were centrifuged (800 g for 10 minutes) and the supernatant discarded. Then washed three times with RPMI 1640 medium containing 0.5% fetal bovine serum (Flow Laboratories) and added to the cells.
HU 215 587 Β kötött radioaktivitást LKB 1270 típusú gamma-számlálóval történő számlálással meghatározzuk.Bound radioactivity is determined by counting on a LKB 1270 gamma counter.
Az a- és β-interferonok oldható receptorának mennyiségét az interferon sejtreceptorához történő specifikus kötődésének gátlási görbéjéből határozzuk meg. A fajlagos megkötés a 125I-IFN önmagában és 100szoros nem jelzett interferon-fölösleg jelenlétében felvett megkötési görbéi közötti különbség.The amount of soluble receptor for α and β interferons is determined from the inhibition curve of specific binding of interferon to the cell receptor. Specific binding is the difference between the binding curves of 125 I-IFN alone and 100 times unlabelled excess interferon.
c) a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása „ Western biot” módszerrelc) determination of the soluble receptor for α and β interferons by the Western biot method
Az a-interferon receptor jelenlétére vizsgálandó mintát a 30,000 daltonnál nagyobb molekulatömegű fehérjéket visszatartó Amicon Centricon 30 típusú membrán felhasználásával betöményítjük. A mintákat 60 mM trisz-HCl-pufferben (pH 6,8; 1,25% SDS, 1 mM PMFS és 400 gátlási egység kallikrein/ml aprotinin/ felvesszük, és 0,1% SDS-t tartalmazó 7,5% poliakrilamid gélen lecsapjuk. Standard körülmények között végzett elektroforézis után a mintákat „félszilárd” típusú elektrotranszfer-készülékben (Nova Biot) 200 mA mellett egy óra alatt 39 mM glicint, 48 mM trisz-bázist (pH 8,3) és 18% metanolt tartalmazó pufferben polivinidil-bifluorid-membránra (Millipora) visszük át. Az átvitel után a membránt 20 mM trisz-bázist, 0,2% Tween 20-t (pH 7,8) és 10% lefölözött tejet tartalmazó pufferrel (Regilait, Franciaország) keverés közben 25 °C-on 4 órán át keverjük. Ezután 10 10 M 125I-a-8-interferonnal (fajlagos aktivitás 50 Bq per fentamól) 2 órán át 25 °C-on keverés közben a fenti pufferben hibridizáljuk. A membránt ugyanezen puffer aliquot részeivel ötször mossuk, majd levegőn szárítjuk és röntgensugárzásra érzékeny filmnek tesszük ki.The sample to be tested for the presence of the α-interferon receptor is concentrated using an Amicon Centricon 30 membrane retaining protein with a molecular weight greater than 30,000 daltons. Samples were taken up in 60 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8; 1.25% SDS, 1 mM PMFS and 400 inhibitory units kallikrein / ml aprotinin / ml) and 7.5% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. After electrophoresis under standard conditions, the samples were polyvinidyl in a buffer containing 39 mM glycine, 48 mM tris base (pH 8.3) and 18% methanol in an "semi-solid" type electrotransfer (Nova Biot) at 200 mA for one hour. Bifluoride membrane (Millipora) After transfer, the membrane was agitated at 25 ° C with 20 mM tris base, 0.2% Tween 20 (pH 7.8) and 10% skimmed milk (Regilait, France). Stir at C for 4 hours, then hybridize with 10 10 M 125 Ia-8-interferon (specific activity 50 Bq per Phenol) for 2 hours at 25 DEG C. with stirring and wash the membrane five times with aliquots of the same buffer. then air-dried and exposed to X-rays y film.
A rekombináns humán a-8-(a-8)-interferont '^jóddal jelezzük, a korábbiakban leírt klóramin-módszer [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzym. 119C, 267 (1986)] módosításával. Ez 25 Bq per fmol vagy 6 Bq per nemzetközi interferonegység fajlagos radioaktivitásnak felel meg.Recombinant human α-8- (α-8) -interferon is labeled with iodine, the chloramine method described above [K. E. Mogensen and G. Uze, Methods in Enzym. 119C, 267 (1986)]. This corresponds to a specific radioactivity of 25 Bq per fmol or 6 Bq per international interferon unit.
d) Humán a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása „ dót biot” módszerrel(d) Determination of the soluble receptor for human α and β interferons by the 'dot biot' method
A meghatározandó oldható receptorok preparátumainak sorozathígításait 50 μΐ, 39 mM glicint és 48 mM trisz-bázist (pH 8,3) tartalmazó pufferben végezzük el és polivinidil-bifluorid-membránnal (Millipore) töltött „Bio-Biot” típusú készülék (Biorad) mélyedéseiben ülepedni hagyjuk.Serial dilutions of the soluble receptor preparations to be assayed were made in 50 μΐ buffer containing 39 mM glycine and 48 mM tris base (pH 8.3) and sedimented in wells of a Bio-Biot device (Biorad) filled with polyvinyldilifluoride membrane (Millipore). forget it.
A membránt 4 órán át 25 °C-on keverés közben 20 mM trisz-bázist, 0,2% Tween 20-t (pH 7,8) és 10% fölözött tejet tartalmazó pufferrel (Regilait, Franciaország) kezeljük. Ezután ugyanebben a pufferben ,25I-IFN α-8-cal 10-10 M (fajlagos aktivitás 25 Bq per fmol) mellett 25 °C-on 2 órán át keverés közben hibridizáljuk, majd keverés közben a fenti puffer aliquot részeivel ötször mossuk és röntgensugárzásra érzékeny filmnek tesszük ki. Az autoradiograf analízise és standard görbével történő összehasonlítás segítségével a membránhoz kötődő 125I-IFN mennyisége meghatározható és ebből a vizsgált mintában az oldható receptor koncentrációja megállapítható.The membrane was treated with a buffer containing 20 mM tris base, 0.2% Tween 20 (pH 7.8) and 10% skimmed milk (Regilait, France) for 4 hours at 25 ° C. Then, in the same buffer, 25 I-IFN α-8 10 with 10 M (specific activity 25 Ci per fmol) at 25 ° C for 2 hours and hybridized with stirring, and the above buffer and aliquots were washed five times and parts of stirring exposed to X-ray sensitive film. By autoradiographic analysis and comparison with a standard curve, the amount of 125 I-IFN bound to the membrane can be determined and the concentration of soluble receptor in the test sample can be determined.
A rekombináns humán a-8-(a-8)-interferon '^jóddal történő jelzését a klóramin T-módszer [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzymol. 119C. 267 (1986)] módosításával végezzük el. Ez 25 Bq per fmol vagy 6 Bq per nemzetközi interferonegység fajlagos radioaktivitásnak felel meg.Labeling of recombinant human α-8- (α-8) -interferon-1-iodine was performed using the chloramine T method [K. E. Mogensen and G. Uze, Methods in Enzymol. 119C. 267 (1986)]. This corresponds to a specific radioactivity of 25 Bq per fmol or 6 Bq per international interferon unit.
7. példaExample 7
Gyógyászati készítményMedical preparation
Alábbi összetételű injekciós készítményt állítunk elő:An injection composition is prepared as follows:
Komponens MennyiségComponent Quantity
3. példa szerinti termék 100 mgExample 3 100 mg
Injekciós készítményekben felhasználható excipiens 2 mlExcipients for injection can be used in 2 ml
Claims (10)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9001298A FR2657881A1 (en) | 1990-02-05 | 1990-02-05 | New water-soluble polypeptides, DNA sequences, new cells, process for preparation, applications and compositions containing the said polypeptides |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9203955D0 HU9203955D0 (en) | 1993-03-29 |
HUT65413A HUT65413A (en) | 1994-06-28 |
HU215587B true HU215587B (en) | 1999-01-28 |
Family
ID=9393388
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9203955A HU215587B (en) | 1990-02-05 | 1991-04-17 | Process for producing water-soluble polypeptides having high affinity for interferons alfa and beta and cells expressing the same and pharmaceutical preparations containing the same |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2657881A1 (en) |
HU (1) | HU215587B (en) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6475983B1 (en) * | 1991-04-17 | 2002-11-05 | Medisup International N.V. | Water-soluble polypeptides having a high affinity for α and β interferons |
US6429186B1 (en) | 1991-05-10 | 2002-08-06 | Genentech, Inc. | Ligand antagonists for treatment of breast cancer |
EP0563487A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-06 | Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. | Monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type I interferon |
US5821078A (en) * | 1992-09-03 | 1998-10-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Nucleic acid encoding interferon-α/β binding protein |
IL106591A (en) * | 1992-09-03 | 2008-03-20 | Yeda Res & Dev | Interferon alpha/beta binding protein, its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
-
1990
- 1990-02-05 FR FR9001298A patent/FR2657881A1/en active Granted
-
1991
- 1991-04-17 HU HU9203955A patent/HU215587B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU9203955D0 (en) | 1993-03-29 |
FR2657881A1 (en) | 1991-08-09 |
FR2657881B1 (en) | 1994-08-19 |
HUT65413A (en) | 1994-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3507507B2 (en) | Hybrid of interferon-α and immunoglobulin linked via non-immunogenic peptide | |
EP2650020B1 (en) | Trimeric OX40-immunoglobulin fusion protein and methods of use | |
JP4637913B2 (en) | Human interferon beta mutant | |
JP3155024B2 (en) | Type II interleukin-1 receptor | |
JP4145356B2 (en) | P-selectin ligand protein | |
EP1003781B1 (en) | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use | |
JPH04164099A (en) | Tnf-bound protein | |
IE83679B1 (en) | Type II interleukin-1 receptors | |
JPH02500484A (en) | Novel proteins with factor 8 activity, methods for producing them using genetically engineered cells, and pharmaceutical compositions containing them | |
US6475983B1 (en) | Water-soluble polypeptides having a high affinity for α and β interferons | |
AU2011265482B2 (en) | Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use | |
JPH09508009A (en) | Ligands that bind Fas antigen | |
KR20010100980A (en) | Opg fusion protein compositions and methods | |
CA2134030C (en) | Soluble interferon .alpha.-receptor, its preparation and use | |
AU2013263717B2 (en) | Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use | |
EP0736600A2 (en) | Use of an "immunodeficiency-virus suppressing lymphokine (ISL)" to inhibit the replication of viruses, in particular of retroviruses | |
JPH08242882A (en) | New daf and its preparation | |
JPH0678772A (en) | Alpha chain or portion of human interleukin-5 acceptor, particularly dna for coding shil5r alpha, vector containing said dna, host cell transformed by said vector and method for production and use thereof | |
HU215587B (en) | Process for producing water-soluble polypeptides having high affinity for interferons alfa and beta and cells expressing the same and pharmaceutical preparations containing the same | |
EP0625990B1 (en) | Glycoprotein complexes and glycoproteins | |
HU211284A9 (en) | New water soluble polypeptides, dns-sequences, new celles, process for producing above mentioned polypeptides, use thereof, compositions containing them |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DNF4 | Restoration of lapsed final protection | ||
HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: MEDISUP INTERNATIONAL N.V., ING TRUST (ANTILLES) N |
|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |