HU209759B - Method for the preparation of synergistic pharmaceutical composition containing lymphokines and mismatched double-stranded rnas - Google Patents

Abstract

A prod. contg. dsRNA and a lymphokine is claimed as a combined prepn. for simultaneous, separate or sequential use in the treatment of tumour, virus-infected or immune-disregulated cells. The lymphokine is pref. alpha interferon or interleukin 2 (IL-2). The prod. pref. comprises mismatched dsRNA in amt. sufficient to result in a level of 0.01-1000 microgram/ml of the patient's body fluid and IL-2 in an amt. sufficient to result in a level of 100-1 million IL-2 units/kg of the patient's wt.

Description

A találmány tárgya eljárás egy limfokint, azaz interleukin-2-t és össze nem illő kétszálas RNS-t (dsRNS) tartalmazó, daganatos megbetedések kezelésére alkalmas, fokozott hatású gyógyszerkészítmények előállítására.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the preparation of an enhanced pharmaceutical composition comprising a lymphokine, i.e., interleukin-2 and mismatched double-stranded RNA (dsRNA), for the treatment of cancerous diseases.

A limfokinek (interleukin-1, -2 és -3, az interferon, tumor-nekrózis faktor stb.) alkalmazását jelenleg erősen hátráltatja az a tény, hogy terápiás alkalmazási tartományuk szűk és olyan magas dózisok mellett, amelyek az emberi rákos vagy vírusos megbetegedésekben a válaszreakció befolyásolásához szükségesek, rendszerint magas toxicitásúak.Currently, the use of lymphokines (interleukin-1, -2 and -3, interferon, tumor necrosis factor, etc.) is severely hampered by the fact that their therapeutic application range is limited and at high doses that are used in human cancers or viruses they are usually of high toxicity.

Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy olyan készítményeket alkalmazva, melyek interleukin-2 (IL2) mellett kétszálas dsRNS-t is tartalmaznak - a váratlan szinergetikus kölcsönhatás folytán - drámai módon csökkentik a limfokin, azaz az IL-2 szükséges dózisait és egyidejűleg szélesítik a terápiás tartományt.In our studies, we found that using formulations containing double-stranded dsRNA in addition to interleukin-2 (IL2), due to unexpected synergistic interactions, dramatically reduced the required doses of lymphokine, IL-2, and at the same time widened the therapeutic range. .

A találmány tárgya tehát eljárás daganat-ellenes hatású össze nem illő kétszálas RNS-t és interleukin-2t 0,1-10 mg dsRNS/1,000,000 IU IL-2 mennyiségben tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.Accordingly, the present invention relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising an anti-tumor mismatch double-stranded RNA and interleukin-2 in an amount of 0.1-10 mg dsRNA / 1,000,000 IU IL-2.

A kétszálas RNS és az EL-2 specifikus kombinációja rákos betegségek kezelésében jelentősen növeli a humán melanómahordozó állatok túlélését, főleg azért, mivel a kétszálas RNS növeli a limfokinek által aktivált ölő sejtek aktivitását, amelyek az EL-2 való kitétel esetében elsőként keletkeznek. így a találmány szerinti eljárással előállítható készítmények széles körben alkalmazhatók különböző humán rákos megbetedések hatásos kezelésére.The specific combination of double-stranded RNA and EL-2 in the treatment of cancers significantly increases the survival of human melanoma-bearing animals, mainly because double-stranded RNA increases the activity of lymphokine-activated killer cells, which are first produced by EL-2 exposure. Thus, the compositions of the present invention are widely applicable to the effective treatment of various human cancers.

Az alábbiakban alkalmazott rövidítések jelentése a következő:Abbreviations used below have the following meanings:

IL = interleukin rIL=rekombináns interleukinIL = interleukin rIL = recombinant interleukin

NK = természetes ölő sejtNK = natural killer cell

LAK = limfokinek által aktivált ölő sejtekLAK = Killing cells activated by lymphokines

A gyógyászatban jelenleg a limfokinek prototípusaként interleukin-2-t alkalmaznak. Alimfokineket az utóbbi időben rutinszerűen a rekombináns DNS technológiával állítják elő. Az „rIL-2” jelölés a rekombináns EL-2 által aktivált ölő sejtekre vonatkozik. Az ilyen sejtek in vitro oly módon állíthatók elő, hogy [leukaforézissel kapott, azaz a fehérvérsejteknek (leukocitáknak) elektroforézissel történő eltávolítása során kapott] emberi vérsejteket rIL-2 hatásának teszünk ki. A sejteket ezután rendszerint infúzióval visszavisszük a betegbe és legalábbis reméljük, hogy a LAK sejtek, az EL-2-vel való stimuláció folytatása mellett, megölik vagy befolyásolják a tumort. Ajelenleg ismert terápiát az 1. ábrán mutatjuk be. A zárójeleken belüli nyilak azokat az IL-2 dózisokat mutatják, amelyek rendszerint nem adagolhatok be, a domináló toxicitás miatt. A klinikai vizsgálatban megadott toxicitási adatokat és az ilyen toxikus reakciók ellensúlyozására alkalmazott intézkedéseket az 1. és 2. Táblázatban adjuk meg.Interleukin-2 is currently used as a prototype for lymphokines in medicine. Lymphokines have recently been routinely produced by recombinant DNA technology. The term "rIL-2" refers to killer cells activated by recombinant EL-2. Such cells can be produced in vitro by exposing human blood cells (obtained by leukaphoresis, i.e., obtained by electrophoresis to remove white blood cells (leukocytes)) to rIL-2. The cells are then usually returned to the patient by infusion, and at least it is hoped that the LAK cells will kill or affect the tumor while continuing to stimulate with EL-2. The currently known therapy is shown in Figure 1. The arrows inside the brackets indicate doses of IL-2 that would not normally be administered due to the predominant toxicity. The toxicity data provided in the clinical trial and the measures taken to counter such toxic reactions are given in Tables 1 and 2.

1. táblázatTable 1

A lak sejt/IL-2-vel végzett kiindulási klinikai vizsgálatban észlelt toxicitásToxicity observed in an initial clinical study with lac cell / IL-2

Toxikus reakció Toxic reaction A betegek %-os hányada Percentage of patients Rosszullét feeling sick 100 100 Transzfuziót igénylő vérszegénység Anemia requiring transfusion 96 96

Toxikus reakció Toxic reaction A betegek %-os hányada Percentage of patients Eozinofilia eosinophilia 96 96 Láz Fever 88 88 Émelygés vagy hányás Nausea or vomiting 84 84 Nehézlégzés Breathing difficulties 80 80 Hidegrázás Chills 76 76 Hasmenés Diarrhea 72 72 Bőrpír vagy bőrkiütés Redness or rash 68 68 Szérum bilirubin >2 mg% Bilirubin serum> 2 mg% 64 64 Súlynövekedés Weight Increase 64 64 Bőrviszketés itchy skin 64 64 Nyelvgyulladás inflammation of the tongue 56 56 Orrvérzés Nose bleeding 52 52 Szérum kreatinin >2 mg% Serum creatinine> 2 mg% 48 48 Trombocitopénia thrombocytopenia 44 44 Konfúzió confusion 32 32

Az adatok a következő helyről származnak:The data comes from:

Rosenberg, S. A., Μ. T. Lotze, L. M. Muul et al. 1985. New Engl. J. Med. 313:1485.Rosenberg, S. A., Μ. T. Lotze, L.M. Muul et al. 1985. New Engl. J. Med. 313: 1485.

2. táblázatTable 2

Az IL-2 bevitele során minden beteg egyidejűleg a következő terápiában részesült, a toxicitás megszüntetéséreAll patients received IL-2 at the same time as the following therapy to eliminate toxicity.

- ACETAMINOFEN (láz és rosszullét)- ACETAMINOFEN (fever and nausea)

- INDOMETACIN (láz és rosszullét)- INDOMETACIN (fever and nausea)

- RANmDIN vagy CIMETIDIN (a gyomor-bél rendszeri vérzés megelőzésére)- RANmDIN or CIMETIDIN (to prevent gastrointestinal bleeding)

- HIDROXIZIN.HCL vagy DIFENHIDRAMIN (általánossá vált, bőrpírrel járó bőrkiütés)- HIDROXIZIN.HCL or DIFENHIDRAMIN (common rash with redness)

- MEPERIDIN (LAK sejtekkel egyidejűleg, a hidegrázás és merevség megszüntetésére)- MEPERIDIN (at the same time as LAK cells to eliminate chills and stiffness)

- ÉMELYGÉST és HASMENÉST GÁTLÓ SZEREK (szükség szerint)- ANTI-ANTI-DIABETES (if necessary)

- DEXAMETAZON (az életveszélyes tünetek ellen)- DEXAMETAZON (against life-threatening symptoms)

A jelentős mellékhatások következtében terápiás hatás csak a limfokinekkel kezelt betegek 10-20%ában tapasztalható (Rosenberg et al., New England Journal of Medicine, 313, 1485, 1985). A leginkább reagáló tumoroknak - ha a limfokineket önmagukban alkalmazzuk - a veserák és a melanőma látszanak, de a találmány széles körben alkalmazható: más típusú rákos megbetegedésekre általában vírusok által kiváltott rendellenességekre és különböző gyulladásos megbetegedésekre. Nincs bizonyíték arra vonatkozóan, hogy hatékonyságuk a rutinszerűen alkalmazott kemoterápiás szerekkel való kombinálás révén növelhető.Due to the significant side effects, only 10-20% of patients treated with lymphokines have a therapeutic effect (Rosenberg et al., New England Journal of Medicine, 313, 1485, 1985). The most responsive tumors, when used as lymphokines alone, are kidney cancer and melanoma, but the invention is widely applicable to other types of cancer, usually viral-induced disorders and various inflammatory diseases. There is no evidence that their efficacy can be enhanced by combination with routine chemotherapeutic agents.

A limfokinek toxicitása a dózistól függ. A 2. ábrán foglaljuk össze a rendelkezésre álló klinikai adatokat. Látható, hogy lOYtesttömeg-kg értéknél nagyobb EL-2 dózisok mellett emberben pusztító toxicitás mutatkozik. Az ilyen dózisokat azonban általában szükségesnek tartják annak érdekében, hogy a tumor visszafejlődését eléqék. Sajnos azonban az EL-2 toxikus hatása következtében a beteg gyakran meghal - a limfokin terápia jelenlegi gyakorlata mellett -, mielőtt a tumor mérhetően kisebbé válna.The toxicity of lymphokines is dose dependent. Figure 2 summarizes the available clinical data. It is seen that EL-2 doses greater than 10 kg body weight show lethal toxicity in humans. However, such doses are generally considered necessary to prevent tumor regression. Unfortunately, due to the toxic effect of EL-2, the patient often dies, in the current practice of lymphokine therapy, before the tumor becomes measurably smaller.

HU 209 759 ΒHU 209 759 Β

A rajzok rövid leírása keretében a következőkre mutatunk rá:A brief description of the drawings will show the following:

Az 1. ábra a jelenlegi tumor-terápiát jellemzi, rekombináns interleukin-2 (rIL-2) és a limfokinek által aktivált ölő sejtek (LAK) alkalmazása mellett. Az adatokat a NIH-nek (Országos Egészségügyi Intézet) a LAK/IL-2 terápiára vonatkozó gyógyászati jegyzőkönyvéből vettük, amint ezt S. A. Rosenberg et al. ismerteti (New England Journal of Medicine, 313, 1485,1985).Figure 1 illustrates current tumor therapy using recombinant interleukin-2 (rIL-2) and lymphokine-activated killer cells (LAK). Data were taken from the NIH (National Institutes of Health) medical protocol for LAK / IL-2 therapy, as described by S. A. Rosenberg et al. (New England Journal of Medicine, 313, 1485, 1985).

A 2. ábra egy oszlopos grafikon; ezen azokat a rendelkezésre álló klinikai adatokat összegezük, amelyek a különböző IL-2 dózisokat a toxicitással hasonlítják össze.Figure 2 is a bar graph; this summarizes the available clinical data comparing different doses of IL-2 with toxicity.

A 3A és 3B ábra oszlop-diagram, amelyen a különböző IL-2 és RNS dózisok mellett megfigyelhető citotoxicitást hasonlítjuk össze humán LAK sejttenyészetben, ahol a hatóanyag-RNS arány 50:1 ill. 25:1.Figures 3A and 3B are bar graphs comparing the cytotoxicity observed at different doses of IL-2 and RNA in human LAK cell culture, with a drug to RNA ratio of 50: 1 and 50%, respectively. 25: 1st

A 4A és 4B ábra oszlop-diagram, amely az emberi LAK sejtek aktivitásának az rIL-2 hatására és a kétszálas RNS-t rIL-2 kombináció hatására fellépő növekedését mutatja be.Figures 4A and 4B are bar graphs showing the increase in human LAK cell activity by rIL-2 and double-stranded RNA by the combination of rIL-2.

Az 5. ábra egy oszlop-diagram, amely a tüdő melanóma áttételek számát ábrázolja 4 különböző csoport esetében, ideértve a kétszálas RNS és az rIL-2 kombinációját.Figure 5 is a bar graph depicting the number of lung melanoma metastases in 4 different groups, including a combination of double-stranded RNA and rIL-2.

A 6. ábra a rosszindulatú melanómát (átültetett bőr alakjában (hordozó, csecsemőmirigy nélküli egerek túlélésére vonatkozó adatokat hasonlítja össze (a napok megadott száma alapján) ugyanazon négy csoport esetében és a 7. ábra az 1. ábrához hasonló oszlop-grafikon, amely az IL-2 bolus alakban bevitt növekvő dózisaival összefüggő toxicitást (emberben) szemlélteti és összehasonlítja a jelenlegi IL-2 dózis-tartományokat a kombinált, tervezett (11-2 + kétszálas RNS) dózisokkal.Figure 6 compares survival data in malignant melanoma (transplanted skin) (carrier-depleted mice) (based on the number of days) for the same four groups, and Figure 7 is a bar graph similar to Figure 1, -2 illustrates toxicity in increasing bolus doses (in humans) and compares current IL-2 dose ranges with combined, planned (11-2 + double-stranded RNA) doses.

A találmány szerinti készítmény alkalmazásának előnyeit azzál a megállapítással összegezhetjük, hogy a kétszálas RNS (mint nem-toxikus összetevő) és egy limfokin (mint toxikus összetevő) szinergetikus kombinációja a szükséges limfokin (különösen IL-2) dózisokat drámai módon lecsökkenti egy mérsékelt toxicitásútól a nem toxikusig terjedő dózis-tartományra és egyidejűleg szélesíti ezek terápiás tartományát. Aszinenergetikus kombináció, különösen akkor, ha limfokin komponensként interferon vagy különböző interleukinek (pl. IL-2) vannak jelen, a leírt gyógyászati eljárások szerint való alkalmazás mellett hatásos az emberi rák - különösen a tüdő- és a veserák -, a rosszindulatú melanóma vagy más betegségek esetében. A kombináció különböző emberi vírusfertőzések kezelése szempontjából is hatásos.The advantages of using the composition of the invention can be summed up by the finding that a synergistic combination of double-stranded RNA (as a non-toxic component) and a lymphokine (as a toxic component) dramatically reduces the required doses of lymphokine (especially IL-2) from a non-toxic up to a toxic dose range and at the same time broadens their therapeutic range. An asynergic combination, particularly when interferon or various interleukins (e.g. IL-2) are present as a lymphokine component, is effective in the treatment of human cancers, particularly lung and kidney cancers, malignant melanoma, or other diseases. The combination is also effective in treating various human viral infections.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények egy kétszálas RNS-t és egy egyidejűleg vagy később bevitelre kerülő interleukint, így interleukin 2-t tartalmaznak, olyan koncentrációkban, amelyek eredményeként magasabb NK és LAK sejt koncentráció érhető el a szervezetben anélkül, hogy a toxicitás növekedne, azaz - ha toxicitás egyáltalán megfigyelhető nagyobb lenne, mint az a toxicitás, amely az egyes komponensek külön-külön való bevitele esetében fellép. Az eredmény a szervezet fokozott tumorellenes, vírusellenes vagy immun-modulátor reakciója. A találmány kiterjed az olyan megoldásokra is, amelyek szerint ezzel a kétszálas RNS/limfokin terápiával együtt egy, a ciklooxigenáz aktivátort gátló anyagot viszünk be. A találmány szerint pl. egyidejűleg indometacint, egy prosztaglandin inhibitort adagolunk, ily módon megszüntetjük a prosztaglandin-felszabadulást.The compositions of the present invention contain a double-stranded RNA and an interleukin, such as interleukin 2, to be administered simultaneously or subsequently at concentrations that result in higher NK and LAK cellular concentrations without increasing toxicity, i.e. - if any, the observed toxicity is greater than the toxicity observed when each component is administered separately. The result is an increased anti-tumor, antiviral, or immune modulatory response in the body. The present invention also encompasses the administration of an inhibitor of cyclooxygenase activator in combination with this double-stranded RNA / lymphokine therapy. According to the invention, e.g. concomitantly, indomethacin, a prostaglandin inhibitor, is administered to stop the release of prostaglandin.

Ennek következtében a keresett NK sejtek természetes inhibitorai kiküszöbölhetők és az NK populáció megfelelően megnövekszik. A találmány tárgyát képezi tehát olyan új kombinációk előállítása is, amelyek kétszálas RNS-t, egy limfokint és egy, a ciklooxigenáz aktivátort gátló anyagot tartalmaznak.As a result, natural inhibitors of the desired NK cells can be eliminated and the NK population is appropriately increased. Thus, the present invention also provides novel combinations comprising double-stranded RNA, a lymphokine, and a cyclooxygenase activator inhibitor.

A kombináció elemeinek mennyisége a klinikai megfigyelések és a terápiás eredmények függvényében változik. A kétszálas RNS komponens mennyisége olyan, hogy az infúzió helyéhez képest disztálisan, közvetlenül a bevitelt követően mérve a szisztémás vérkeringésben 0,1-1000 mikrogramm kétszálas RNS/ml csúcs-vérszint legyen biztosítható. Ha a limfokin egy interferon, előnyösen alfa-interferon, ezt 0,01100,000 IU/ a beteg testfolyadékának ml-e koncentráció eléréséig adagoljuk. Ha limfokinként IL-2-t, előnyösen rIL-2-t alkalmazunk, a bevitt mennyiség a következő tartományon belül helyezkedik el: 10²—10⁶ IL2 egység/ a beteg testtömeg kg-ja. A leghatásosabb, a toxikus reakció szempontjából kezelhető értékek a kb. 103-10⁴ IL-2 egység/testtömeg-kg tartományba esnek.The amount of elements in the combination will vary with clinical observations and therapeutic results. The amount of the double-stranded RNA component is such that a peak blood level of 0.1-1000 micrograms of double-stranded RNA / ml is measured distal to the site of infusion, measured immediately after administration. When the lymphokine is an interferon, preferably interferon alpha, it is administered up to a concentration of 0.01100,000 IU / ml of body fluid of the patient. When IL-2, preferably rIL-2, is used as the lymphokine, the amount administered is in the range of 10 ^{2 to} 10 ⁶ IL 2 units / kg of patient body weight. The most effective values that can be treated for toxic reactions are ca. 103-10 ⁴ IL-2 units / kg body weight.

A fenti koncentráció értékekből kiszámítható az egyes komponensek mennyisége a találmány szerinti készítményben például a „The Merck Manual of Diagnosis and Therapy” (1982) 2184. oldalán lévő 262. táblázat alapján. A vértérfogat 8,5-9,0%-a a testtömegnek, így egy 70 kg-os ember vértérfogata 6-6,3 liter. Például a 0,1-1,000 mikrogramm/ml RNS-koncentrációnak megfelelő dózisérték 0,6 mg 6 g, 8,5%-os konverziós faktorral számolva és 0,63 mg 6,3 g 9%-os konverziós faktorral számolva. Tehát a készítmény összetétele, azaz az egyes komponensek mennyisége a készítményben meghatározható bátlázatokból, ha ismerjük a beteg testtömegének alapján kiszámított testfolyadék-értéket.From the above concentration values, the amount of each component in the composition of the invention can be calculated, for example, from Table 262 in The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1982), 2184. Blood volume is 8.5-9.0% of body weight, so a 70 kg person has a blood volume of 6-6.3 liters. For example, a dose corresponding to a concentration of 0.1-1,000 micrograms / ml RNA would be 0.6 mg 6 g calculated with a conversion factor of 8.5% and 0.63 mg 6.3 g calculated with a conversion factor of 9%. Thus, the composition of the composition, that is, the amount of each component in the composition, can be determined from bases if one knows the body fluid value calculated from the patient's body weight.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmény 1,000,000 IU interleukin-2-re számítva 0,1-10 mg dsRNS-t tartalmaz.The pharmaceutical composition of the present invention contains from 0.1 to 10 mg dsRNA per 1,000,000 IU of interleukin-2.

In vitro és in vivő kísérletek egyaránt megerősítik, hogy a kétszálas RNS (és különösen az össze nem illő kétszálas RNS-ek) általában az interleukinokkal (és különösen az IL-2-vei) együtt olyan szinergetikus gyógyászati hatás fellépését biztosítják, amelynek eredménye egy fokozott biológiai válasz (tumorellenes, vírusellenes, immunmodulátor), nagymértékben csökkent toxicitás mellett. Össze nem illő kétszálas RNS-sel végzett kísérletek jellemző módon arra mutatnak, hogy a tumorellenes válaszreakció kiváltásához szükséges IL-2 dózis legalább 30-100-szorosan csökkenthető. A szinergetikus gyógyászati hatás jelentkezik az NK (természetes ölő) sejtekre érzékeny ill. az NK-sejtekreBoth in vitro and in vivo experiments confirm that double-stranded RNA (and, in particular, mismatched double-stranded RNAs), in combination with interleukins (and especially IL-2), provide a synergistic therapeutic effect that results in an enhanced biological response (antitumor, antiviral, immunomodulator) with greatly reduced toxicity. Experiments with mismatched double-stranded RNA typically demonstrate that the dose of IL-2 required to elicit an antitumor response can be reduced by at least 30 to 100-fold. The synergistic therapeutic effect occurs on NK (natural killer) cells that are sensitive or non-sensitive. NK cells

HU 209 759 Β rezisztens tumorsejtek vagy vírussal fertőzött sejtek szintjén egyaránt, de nem korlátozódik erre. Az NK-rezisztens tumor-sejteket vagy vírussal fertőzött sejteket ugyancsak LAK (limfokin által aktivált ölő) sejteknek tekintjük. Ez az aktivitás egyértelműen kimutatható monoklonális antitest markerek alkalmazása segítségével, és ilyen kísérletek során drámai növekedés figyelhető meg egyidejűleg az NK sejtek számában (asialoG_m[ monoklonális antitestek alkalmazásával) és a LAK sejtek számában (Thy 1,2 monoklonális antitestek alkalmazásával). Ezek az antitestek a szakember számára könnyen hozzáférhető monoklonális antitest reagensek közé tartoznak.However, it is not restricted to the level of resistant tumor cells or cells infected with the virus. NK-resistant tumor cells or virus-infected cells are also considered to be LAK (lymphokine-activated killer) cells. This activity can be clearly detected by the use of monoclonal antibody markers, and in such experiments a dramatic increase in the number of NK cells (asialoG _{m [using} monoclonal antibodies) and LAK cells (using Thy 1,2 monoclonal antibodies) is observed. These antibodies are among the monoclonal antibody reagents readily available to those skilled in the art.

Megfigyeléseink során azt is megállapítottuk, hogy olyan vegyületek egyidejű alkalmazása, melyek csökkentik a különböző NK sejtek természetes antagonistáinak (így a prosztaglandinoknak) a biológiai koncentrációit, tovább szélesítik ezt a szinergizmust, lényegében nem-toxikus vagy minimálisan toxikus módon. Az indometacin (60 kg-os beteg esetében napi 25 mg mennyiségben való) alkalmazása például kiugró mértékben fokozza a győgyszer-szinergizmust részben azáltal, hogy csökkenti az endogén prosztaglandin koncentrációt. Az indometacin [az l-(4-klór-benzoil)-5-metoxi 2-metil-lH-indol-3-ecetsav], melyet a betegnek általában szájon át adagolnak, szokásos napi adagja 25-200 mg, ahogyan azt például a Physicians’ Desk Reference 42,1348-1351 (1988) közlemény is ismerteti.It has also been found in our observations that the concomitant use of compounds that reduce the biological concentrations of natural antagonists of various NK cells (such as prostaglandins) further widen this synergism in a substantially nontoxic or minimally toxic manner. For example, the use of indomethacin (25 mg daily in a 60 kg patient) greatly enhances drug synergism, in part by reducing endogenous prostaglandin levels. The usual dose of indomethacin [1- (4-chlorobenzoyl) -5-methoxy-2-methyl-1H-indole-3-acetic acid], which is usually administered orally to the patient, is 25-200 mg daily, such as Physicians' Desk Reference 42,1348-1351 (1988).

A találmány részletes leírása keretében hivatkozunk arra, hogy a kétszálas RNS biokémiai katalizátorként hat és toxikus jelenségek fellépése nélkül fokozza az IL-2 hatására képződött LAK sejtek specifikus tumorsejt-ölő aktivitását. Ez a következő sejttenyésztési kísérletekkel igazolható. A 7860 jelű humán vese tumor sejtvonalat Petri csészékben tenyésztjük és különböző potenciális ölő sejtek hatásának tesszük ki. A normál egyénekből kapott perifériás vérsejteket „effektor sejteknek” (ölő sejteknek), a vesetumor sejteket pedig „cél sejteknek” nevezzük. A pusztítás mértékét (citotoxicitást) mérhetjük például rendkívüli életképességű törzsek vagy radioizotópok alkalmazásával. Az elhalt daganatsejtek általában leadják a felvett radioaktív prekurzorokat (melyek a metabolizmus keretében lennének hasznosíthatók) és nem képesek a továbbiakban extracelluláris tápanyagok felvételére stb. A 3. ábra azt mutatja be, hogy az AMPLIGEN, egy össze nem illő kétszálas RNS készítmény, lényegesen növeli a humán LAK sejtek aktivitását (ezeket normál egyének véréből állítottuk elő) ahhoz a szinthez képest, amely IL-2-vel egyedül elérhető lenne. A 3. ábra a különböző dózisú IL-2 és egy állandó kétszálas RNS dózis alkalmazása esetén fellépő citotoxicitást hasonlítja össze. (1000 egység/ml IL-2 dózis mellett már bekövetkezik a maximális sejt-pusztítás és ez tovább nem fokozható kétszálas RNS hozzáadásával). Feltűnő, hogy a katalizátor, a kétszálas RNS ebben a rendszerben, egyedül alkalmazva, teljesen hatástalan. A tumorsejtek elölésére kifejtett hatás ezért nem tekinthető két, extrém aktivitású anyag hatása egyszerű számtani összegének. Hasonló eredményekről számol be a 4. ábra, amely megerősíti ennek a figyelemreméltó jelenségnek a reprodukálhatóságát, amely egyaránt érvényes egy olyan sejtre, amelyben neonantigének kifejeződése megy végbe vagy vírusfertőzés, vagy az autoimmun válasz zavarai következtében.In the detailed description of the present invention, it is noted that double-stranded RNA acts as a biochemical catalyst and enhances the specific tumor cell killing activity of IL-2-induced LAK cells without causing toxic effects. This can be confirmed by the following cell culture experiments. The human kidney tumor cell line 7860 is cultured in Petri dishes and exposed to various potential killer cells. Peripheral blood cells from normal individuals are called "effector cells" (killer cells) and renal tumor cells are called "target cells". The degree of killing (cytotoxicity) can be measured, for example, using highly viable strains or radioisotopes. Dead tumor cells usually release uptake of radioactive precursors (which would be useful for metabolism) and are no longer able to absorb extracellular nutrients, etc. Figure 3 shows that AMPLIGEN, a mismatched double-stranded RNA preparation, significantly increases the activity of human LAK cells (derived from the blood of normal individuals) compared to levels that would be achieved by IL-2 alone. Figure 3 compares cytotoxicity at different doses of IL-2 with a constant dose of double-stranded RNA. (At 1000 units / ml IL-2, maximum cell death is already occurring and cannot be further enhanced by the addition of double-stranded RNA). It is striking that the catalyst, double-stranded RNA, used alone in this system, is completely ineffective. Therefore, the effect on the killing of tumor cells cannot be considered as a simple arithmetic sum of the effects of two substances of extreme activity. Similar results are reported in Figure 4, which confirms the reproducibility of this remarkable phenomenon, which applies to a cell in which the expression of neonantigens occurs either due to viral infection or disruption of the autoimmune response.

Külön kísérletekben azt is kimutattuk, hogy a kétszálas (össze nem illő) RNS nem indukálja a limfocitákban az IL-2 termelést. A tenyészet IL-2 koncentrációját a CILL [citotoxikus T-limfocita (sejt) vonal] vizsgálattal határoztuk meg. A közölt koncentrációk átlagértékét ± SEM (az átlagérték standard hibája) adtuk meg. A kétszálas RNS inkább - feltételezhetően - különböző más módokon befolyásolhatja az IL-2 limfokin rendszert: pl. megváltoztathatja bizonyos antigéneknek a célsejteken megfigyelhető sűrűségét és ennek következtében a pusztítás! hatásfok növekszik. A kétszálas RNS és az IL-2 tehát együttesen megváltoztathatja az ölő hatás következményeit, pl. növelheti az effektor/célsejt kötés hatásfokát, különböző citotoxikus faktorok termelését vagy növelheti az ölő sejtek rotációját az egyik tumor-célsejtből a másik tumor-célsejtbe.In separate experiments, we have also shown that double-stranded (mismatched) RNA does not induce IL-2 production in lymphocytes. The concentration of IL-2 in the culture was determined by the CILL (cytotoxic T-lymphocyte (cell) line) assay. The mean of the concentrations reported is ± SEM (standard error of the mean). Rather, double-stranded RNA may be thought to influence the IL-2 lymphokine system in various other ways, e.g. can change the density of certain antigens on target cells and consequently the destruction! efficiency increases. Thus, double-stranded RNA and IL-2 may together alter the effects of the killing effect, e.g. it can increase effector / target cell binding efficiency, the production of various cytotoxic factors, or increase the rotation of killer cells from one tumor target cell to another tumor target cell.

Az állatkísérletek megnövekedett túlélést és a daganat terjedése mértékének csökkenését mutatják. A megnövekedett túlélést és a csökkent tumor-terjedést állatkísérletekben limfokin/kétszálas RNS kombinációkkal mutatjuk ki olyan esetekkel összehasonlítva, amelyekben egyedül vagy a limfokint, vagy a kétszálas RNS-t alkalmazzuk. Csecsemőmirigy nélküli egér csoportok esetében a talpba „BRD” jelű emberi melanóma tumor sejteket injektálunk. A csecsemőmirigytől megfosztott egerek nem képesek - idegenként - kivetni szervezetükből az emberi tumort. Végül a nem kezelt egerekben a tumorsejtek szaporodnak, átterjednek a tüdőre és az állatok elpusztulnak. Az 5. ábrán bemutatott kísérlet esetében a kezelt egereknek 10³—10⁴ egység/kg (kb. 2500 egység/egér) IL-2 dózisokat adtunk be, valamint 500 mikrogramm kétszálas RNS-t (ez egy 60 kg-os egyén esetében kb. 100-300 mg-mal egyenértékű), hetenként kétszer. A cél az volt, hogy mindkét biológiai hatóanyag vonatkozásában szimuláljuk a biztonságos emberi dózisokat és meghatározzuk, hogy a biztonságos dózis egyben hatásos-e?Animal studies have shown increased survival and reduced tumor spread. Increased survival and reduced tumor proliferation are demonstrated in animal experiments with lymphokine / double-stranded RNA combinations compared to cases using either lymphokine or double-stranded RNA alone. In groups of mice without thymus, human melanoma tumor cells labeled "BRD" were injected into the foot. Thymus-deprived mice are unable - as foreigners - to expel human tumors from their bodies. Finally, in untreated mice, tumor cells proliferate, spread to the lungs, and the animals die. In the experiment shown in Figure 5, treated mice received doses of 10 ^{3 to} 10 ⁴ units / kg (approximately 2500 units / mouse) of IL-2 and 500 micrograms of double-stranded RNA (approximately 60 for an individual weighing 60 kg). 100-300 mg twice a week). The aim was to simulate safe human doses for both biological agents and to determine whether the safe dose is effective at the same time.

Az 5. ábrán bemutatott adatok szerint drámai csökkenés következik be a kétszálas RNS-t és IL-2-t tartalmazó kombinációval kezelt állatok tüdő-áttételeinek számában. Ez nyilvánvalóan váratlan volt azon eredmények alapján, amelyeket a két anyaggal külön-külön végzett kezeléssel értünk el. A tüdő-áttételek számának ez a csökkenése egyben összefüggésben áll a túlélési idő növekedésével (1. a 6. ábra adatait). A gyógyszerkészítmény nem-toxikus komponense - az össze nem illő kétszálas RNS - dózisának növelésével most lehetségessé válik a túlélés korlátozás nélküli növelése. Hasonló eredményeket kapunk alfa-interferonnal (20,000 IRU): ennek az össze nem illő kétszálas RNS-sel (500 mikrogramm hetenként kétszer) alkotott kombinációja a tumorgátlás további fokozódását (p kisebb, mint 0,02) eredményezi. Egy fontos körülmény, hogy a limfokin/kétszálas RNS kombinációk nem okoznak kimutatható toxikus tüneteket az állatokban. Az állatok normálisan táplálkoznak, elérik a várt súlyt és vérük összetétele a normálisnak felel meg.The data shown in Figure 5 show a dramatic decrease in the number of lung metastases in animals treated with a combination of double-stranded RNA and IL-2. This was obviously unexpected based on the results obtained by treatment with the two substances separately. This decrease in the number of lung metastases is also associated with an increase in survival time (Figure 1 in Figure 6). By increasing the dose of the non-toxic component of the drug composition, the mismatched double-stranded RNA, it is now possible to increase unrestricted survival. Similar results are obtained with interferon alpha (20,000 IRU): its combination with mismatched double-stranded RNA (500 micrograms twice weekly) results in further enhancement of tumor inhibition (p less than 0.02). An important consideration is that lymphokine / double-stranded RNA combinations do not cause detectable toxic symptoms in animals. The animals feed normally, reach the expected weight, and have a normal blood composition.

HU 209 759 ΒHU 209 759 Β

A gyógyszer-szinergizmus az ember szintjén meghatározott előnyöket mutat. A 7. ábrán látható, hogy a találmány szerinti kombinációs terápia a klinikumban csökkenti általában a limfokinek és különösen az IL-2 toxicitását. Az IL-2 toxicitására vonatkozó adatokat Litze és Rosenberg határozta meg megbízhatóan és a jelenlegi eredmények arra mutatnak, hogy az IL-2 a szokásosan alacsony koncentráció-tartományban (10³10⁴ egység/kg) csak akkor lesz hatásos, ha kétszálas RNS-sel kombináljuk. Ha viszont nem kombináljuk kétszálas RNS-sel, ebben a biztonságos dózis-tartományban gyakorlatilag hatástalan lesz.Drug synergism has certain benefits at the human level. Figure 7 shows that the combination therapy of the invention reduces the toxicity of lymphokines in general and IL-2 in particular in the clinic. The toxicity data for IL-2 were reliably determined by Litze and Rosenberg and current results indicate that IL-2 will only be effective in the normally low concentration range (10 ³ 10 ⁴ units / kg) if it is double-stranded with RNA. combine. However, if not combined with double-stranded RNA, it will be virtually ineffective within this safe dose range.

Vírusos betegségek esetében hasonló terápiás előnyök érhetők el, egyrészt a már említett okok, másrészt egyéb tényezők következtében. Azok a terápiás beavatkozások pl., amelyek HÍV fertőzések esetében csak az immunelégtelenséget (az IL-2-re reagáló helyeket) támadják meg, láthatóan az ellenkező eredményt érik el. Vegyük figyelembe pl., hogy az ú.n. T4 segítő sejtek (TAC receptorokkal) reagálnak az IL-2re, de az AIDS áldozatai esetében az IL-2 azoknak a sejteknek a szaporodását váltja ki, amelyek a HÍV által közvetlenül sebezhetők és ennek eredményeként a betegség rosszabbodása lép fel (A. S. Fauci - H. C. Lane, Annals Institute Pasteur/Virology-Immunology, sajtó alatt, 1987). így azáltal, hogy ésszerű mennyiségben kétszálas RNS-t adagolunk az IL-2-höz, az IL-2 (és valószínűleg más limfokinek, pl. az interferon és a TNS) hasznos antivirális spektruma szélesíthető és továbbfejleszthető.In the case of viral diseases, similar therapeutic benefits can be obtained, both for the reasons already mentioned and for other factors. Therapeutic interventions, for example, which target only immune deficiency (sites responsive to IL-2) in HIV infections, appear to have the opposite effect. Note, for example, that so-called T4 helper cells (with TAC receptors) respond to IL-2, but in AIDS victims, IL-2 triggers the proliferation of cells that are directly damaged by HIV, and as a result aggravation of the disease (AS Fauci - HC Lane, Annals Institute Pasteur / Virology-Immunology, 1987). Thus, by adding a reasonable amount of double-stranded RNA to IL-2, the useful antiviral spectrum of IL-2 (and possibly other lymphokines such as interferon and TNS) can be broadened and enhanced.

Az össze nem illő kétszálas RNS a makromolekuláris RNS egy ismert alakja (1. a 4,024,222 és a 4,130,641 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), amelyben a kettős spirál destabilizálódása megakadályozza a bázispár-képződést. Az össze nem illő kétszálas RNS jól ismert interferon-termelést indukáló tulajdonságai révén, amelyek a per se interferon indukciótól eltérő mechanizmusra utalnak.The mismatched double-stranded RNA is a known form of macromolecular RNA (US Patent Nos. 4,024,222 and 4,130,641) in which the destabilization of the double helix prevents base pair formation. The mismatched double-stranded RNA is well known for its interferon-inducing properties, suggesting a mechanism other than interferon induction per se.

Az össze nem illő kétszálas RNS egyik jellegzetes, a gyógyászatban alkalmazható változata az a szintetikus kétszálas RNS, amelyet a poliriboinozinsav és a poliribocitidiL/uridilsav komplexei alkotnak. Ilyen pl. az rI_n-r/Cx, U vagy G/n összetételű anyag, amelyben x értéke 4-29, pl. a leírásban AMPLIGEN^R-nek nevezett, rI_n r/Ci₂U/_n általános képletű vegyület (az AMPLIGEN elnevezés a HEM Research, Inc., Rockville, Maryland, amerikai egyesült államokbeli cég lajstromozott védjegye). Vizsgáltunk számos össze nem illő kétszálas RNS polimert, amelyek az AMPLIGEN-hez hasonlóan viselkednek. A kétszálas össze nem illő RNS-ek terápiás előnyeinek kulcsa - más, természetes és/vagy szintetikus kétszálas RNS-ekkel szemben - az, hogy toxicitásuk emberben és állatban csökkent. Lampson et al. pl. a 3,666,646 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban korábban leírt olyan kétszálas RNS komplexeket, amelyek képesek különböző, inerferonszerű hatásokat indukálni, de az ilyen vegyületek toxicitása kizárt bármilyen klinikai alkalmazást a rák vagy hasonló betegségek kezelésében.A typical therapeutic variant of mismatched double-stranded RNA is the synthetic double-stranded RNA formed by complexes of polyribosinic acid and polyribocytidyl / uridylic acid. Such as rI _is -r / Cx, U, or G / n, wherein x is from 4 to 29, e.g. of rI _n r / U ₂ Ci / _n compound herein called Ampligen ^R unto (Ampligen the name of HEM Research, Inc., Rockville, Maryland, U.S. Company registered trademark). A number of mismatched double-stranded RNA polymers that behave similarly to AMPLIGEN were tested. The key to the therapeutic benefits of double-stranded mismatched RNAs over other natural and / or synthetic double-stranded RNAs is their reduced toxicity in humans and animals. Lampson et al. e.g. No. 3,666,646; U.S. Pat.

„Össze nem illő kétszálas RNS” kifejezéssel azokat az RNS-eket jelöljük, amelyekben a szembenálló szálak közötti hidrogén kötések (bázis-felfűződés) aránylag sértetlen, azaz átlagosan minden egymást követő 29 bázis-maradék közül 1-nél kevesebb bázispár válik szét. Ennek megfelelően kell értenünk az „össze nem illő” kétszálas RNS kifejezést.The term "mismatched double-stranded RNA" refers to RNAs in which the hydrogen bonds between the opposing strands (base-stranding) are relatively intact, that is to say, on average less than 1 of each of 29 consecutive base residues is separated. We need to understand the term "mismatched" double-stranded RNA accordingly.

A kétszálas RNS lehet egy poliinozinát/policitidilát komplex, amely meghatározott mennyiségben uracil vagy guanidin bázisokat tartalmaz, pl. 30 ilyen bázis közül 1-5-öt: polil. poli/C4-29x nagyobb, mint U vagyThe double-stranded RNA may be a polynosinate / polycytidylate complex containing a defined amount of uracil or guanidine bases, e.g. 1-5 of 30 such bases are polyl. poly / C4-29x greater than U or

G. Az össze nem illő kétszálas RNS lehet egy polil. poliC, U általános képletű vegyület, amelyben a C/U arány kb. 13-1, és a polil és a poliC, U ülepedési együtthatója külön-külön 9-nél kisebb és egymástól 2 egységgel tér el, azaz értéke előnyösen kb. 6,5-7,5.G. The mismatched double-stranded RNA may be a polyl. polyC, U, wherein the C / U ratio is ca. 13-1, and the deposition coefficient of the polyl and polyC, U are each less than 9 and differ from each other by 2 units, that is, preferably of the order of approx. 6.5-7.5.

A kétszálas RNS képlete lehet a következő is: rI_n.(C₁₂.₁₃U)_n. A kétszálas RNS-re más megfelelő példákat a következőkben mutatunk be.The dsRNA may be of the following formula of:. RI _n (. ₁₂ C ₁₃ U) _n. Other suitable examples of double-stranded RNA are shown below.

A találmány szerinti eljárásban előnyben részesítjük olyan össze nem illő kétszálas RNS-ek alkalmazását, amelyek poli(C_nU) és poli(C_nG) általános képletű kopolinukleotidokon alapulnak és ezekben n értéke 4-29 közötti egész szám. Ezek a poliriboinozin- és a poliribocitidilsav komplexeinek össze nem illő analógjai, amelyek úgy állíthatók elő, hogy az rI_n.rC_n komplexet páratlan bázisoknak (uracilnak vagy guaninnak) a poliribocitidilát (rC_n) szál hosszában való beépítésével módosítjuk. Egy másik megoldás szerint a kétszálas RNS a poli(I). poli(C) összetételű kétszálas RNS-ből vezethető le, a poliriboinozinsav (rl_n) ribozil-gerincének módosításával, pl. 2’O-metil-ribozil-maradékok beépítésével. Ezeket az össze nem illő rI_n.iC_n analógokat - amelyek közül kitüntetettek az rI_n.r(C₁₂,U)_n általános képletűek- Carter és Ts’o úja le a 4,130,641 és 4,024,222 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyeket e hivatkozás révén a jelen leírás részeivé teszünk. Az ezekben ismertetett kétszálas RNS-ek általában alkalmasak a találmány szerint való felhasználásra.In the method of the present invention, it is preferred to use mismatched double-stranded RNAs based on the copolinucleotides of the formulas poly (C _n U) and poly (C _n G), wherein n is an integer from 4 to 29. These are incompatible analogues of the polyriboinositin and polyribocytidylic acid complexes, which can be obtained by modifying the rI _n .rC _n complex by incorporation of unpaired bases (uracil or guanine) along the length of the polyribocytidylate (rC _n ) strand. Alternatively, the double-stranded RNA is poly (I). derived from poly (C) double-stranded RNA by modification of the ribosyl backbone of polyriboinosinic acid (r _n ), e.g. By incorporation of 2'O-methyl ribosyl residues. These mismatched rI _{n. I} C _n analogs, of which rI _n. R (C ₁₂ , U) _n are preferred, are described by Carter and Ts'o in U.S. Patent Nos. 4,130,641 and 4,024,222. U.S. Pat. The double-stranded RNAs described herein are generally suitable for use in the present invention.

A találmány szerint alkalmazható össze nem illő kétszálas RNS-ekre jellegzetes példák a következők:Typical examples of mismatched double-stranded RNAs for use in the present invention include:

poli(I). poli(C₄,U) poli(I). poli(C₇,U) poli(I). poli(C₁₃,U) poli(I). poli(C₂₂,U) poli(I). poli(C₂₀,G) poli(I). poli(C₂₉,G) és poli(I). poli (C_p)23G nagyobb p.poly (I). poly (C ₄ , U) poly (I). poly (C ₇ , U) poly (I). poly (C ₁₃ , U) poly (I). poly (C ₂₂ , U) poly (I). poly (C ₂₀ , G) poly (I). poly (C ₂₉ , G) and poly (I). poly (C _p ) 23G higher p.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények össze nem illő szálas RNS-t és IL-2-t tartalmaznak aktív komponensként, a gyógyászatban elfogadható vivőanyaggal vagy hígítóval együtt. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények közé tartoznak azok is, ameyleket parenterális bevitelre alkalmas gyógyászati vivőanyaggal készítünk ki.The pharmaceutical compositions of the present invention contain mismatched fiber RNA and IL-2 as the active component, together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The pharmaceutical compositions of the present invention also include those prepared with a pharmaceutical carrier suitable for parenteral administration.

A találmány szerinti eljárás során például intravénás felhasználásra alkalmas injekciós oldatokat állíthatunk elő, melyeknél a dsRNS mennyisége szokásosan 10-től 1200 mg.For example, the present invention provides injectable solutions for intravenous use, typically containing 10 to 1200 mg of dsRNA.

Vizsgálatainknál általában az alábbi összetételű intravénás injekciós oldatot alkalmaztuk.In general, the following formulations were used for intravenous injection.

HU 209 759 ΒHU 209 759 Β

Példa: Injekciós készítmény előállítása Fiziológiás (normál) sóoldatban feloldottunk 300 pg dsRNS-t és 1,000,000 nemzetközi egységnek megfelelő mennyiségű IL-2-t, és az oldatot ismert módon sterilizáltuk.Example: Preparation of Injection Preparation 300 pg dsRNA and 1,000,000 International Units of IL-2 were dissolved in physiological (normal) saline and sterilized in a known manner.

Claims (2)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS 1. Eljárás daganat-ellenes hatású, össze nem illő kétszálas RNS-t (dsRNS) és egy limfokint tartalmazó szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy limfokinként interleukin-2-t, 1,000,000 IU-ra számítva 0,1-10 mg mennyiségű dsRNS-sel, valamint gyógyászatilag alkalmas vivő5 anyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.CLAIMS 1. A process for the preparation of a synergistic pharmaceutical composition comprising an anti-tumor, mismatched double-stranded RNA (dsRNA) and a lymphokine, characterized in that 0.1 to 10 mg of dsRNA per 1,000,000 IU is interleukin-2 as lymphokine. and a pharmaceutically acceptable carrier to form a pharmaceutical composition. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy össze nem illő kétszálas RNS-ként egy rI_n.r/(C₁₂U)_n általános képletű vegyületet - ahol n érté10 ke 4-29 - alkalmazunk.2. The method of claim 1, wherein the mismatched double-stranded RNA is a compound of the formula R _{1 n} / r / (C ₁₂ U) _n wherein n is from 4 to 29. HU 209 759 BHU 209 759 B Int. Cl.⁵: A 61 K 45/05Int Cl ⁵ : A 61 K 45/05 A JELENLEGI TERÁPIA AZ IL-2-VEL ES LAK SEJTEKKEL dCURRENT THERAPY WITH IL-2 LAK CELLS d cxi __1cxi __1 LO _OLO _O 44 44 Φ Φ 44 44 P P Φ Φ •rj • rj -P -P Φ Φ P P T3 T3 ra to fi fiction Φ Φ '© '© ra to 44 44 P P 44 44 Φ Φ P P fi fiction P P -P -P o She '© '© P P T3 T3 A THE fi fiction o She Φ Φ © © © © Ό Ό A THE ra to 44 44 P P © © '© '© CO CO 44 44 P P P P N N P P fi fiction ra to P P o She 'Φ 'Φ -μ -μ fi fiction A THE 44 44 X X P P *Φ * Φ © © Φ Φ ώ ώ © © 44 44 44 44 >> >> fi fiction A THE Φ Φ fi fiction •rl • rl © © f’a f'a P P '© '© © © fi fiction fi fiction ε ε •n> • n> o She 'Φ 'Φ '© '© A THE A THE fi fiction ε ε 44 44 Φ Φ © © Φ Φ A THE Φ Φ fi fiction fi fiction A THE Φ Φ >5 > 5 Φ Φ fi fiction fi fiction ra to Lf\ lf \ Φ Φ '© '© ra to '© '© r-1 r-1 ε ε •rl • rl r—1 r-1 ra to A THE N N © © •S • S •rl • rl Φ Φ '© '© N N fi fiction N N fi fiction fi fiction Φ Φ © © 'Φ 'Φ Φ Φ O SHE 44 44 a the fi fiction A THE ra to o She ra to © © •rl • rl A THE •rl • rl 44 44 ra to © © ra to fi fiction Ό Ό 44 44 '© '© Φ Φ ·© · © fi fiction fi fiction A THE Φ Φ o She 60 60 r—1 r-1 A THE © © 44 44 © © \ \ © © 44 44 fi fiction P P fi fiction o She £ £ fi fiction Φ Φ A THE © © o She A THE © © fi, fiction A THE fi fiction 60 60 © © © © O SHE fi fiction • • fi fiction fi fiction (V (V 44 44 • • o She A THE •rl • rl cn cn A THE ε ε © © ra to ra to fi fiction '© '© o She '© '© o She • • • • o She • • o She A THE co co A THE A THE o She o She Ό Ό © © © © © © A THE •rl • rl ra to I I I I 1 1 Ό Ό fi fiction ra to •rl • rl A THE A THE A THE A THE •rl • rl N N fi fiction © © © © © © N N fi fiction •rl • rl fi fiction fi fiction fi fiction 'Φ 'Φ A THE -P -P fi fiction fi fiction Ό Ό « « • • • • O SHE •rl • rl Φ Φ CM CM lf\ lf \ ra to i—1 i-1 rH rh A THE © © C\J C \ J 44 44 I I W W 3 3 Hl hl <4 <4 Φ Φ H H A THE A THE © © A THE