HU205366B

HU205366B - Process for producing water-soluble primycin complexes and pharmaceutical compositions comprising such active ingredient

Info

Publication number: HU205366B
Application number: HU885948A
Authority: HU
Inventors: Tamas Keresztes; Gabor Kulcsar; Andras Koever; Dr Koever Katalin Erdoedine; Pasztor Katalin Gergelyne
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1992-04-28
Also published as: GB9015636D0; ES2024731A6; BE1003462A4; JPH03503532A; IT8922446A1; SE501887C2; US5441940A; ATA901889A; SE9002251D0; FR2642760B1; DK170290D0; GB2232981A; GB2232981B; FR2642760A1; FI903635A0; AT398975B; CH679930A5; SE9002251L; WO1990005735A1; DK170290A

Description

A találmány tárgya eljárás vízoldható primycinkomplex előállítására és az Ai (Rf=0,33) és A₃ (R_f=0,38) képletű komponensek elválasztására önmagukban vagy a két komponens keveréke formájában oly módon, hogy a vízoldhatatlan primycint 1-3 szénatomos alkoholos közegben ciánecetsav-etil-észterrel, vagy acetilacetonnal, vagy malonsav-dinitrillel reagáltatjuk nátrium- vagy kálium-metoxid vagy -etoxid, valamint 01% ólomvegyület - előnyösen 15 ppm ólom-acetát jelenlétében, és a kapott 40-60 mg/ml vízoldékonyságú terméket elkülönítjük és kívánt esetben a kapott anyagot szilikagél oszlopkromatografáljuk n-butanol:etanol:ecetsav:víz=38:2:10:50 elegy felső fázisa 1% vizes oldatát használva eluálószerként és Ai és A₃ képletű 50 mg/ml vízoldékonyságú keveréket kapunk és kívánt esetben a kapott kétkomponensű keveréket, adszorbensként ammónium ciklusú karboxi-metil-cellulózt használva, ioncserélő kromatografálásnak vetjük alá, az elúciót vizes ammónium-hidrokarbonát-oldattal hajtjuk végre és így az 50 mg/ml vízoldékonyságú A₃ képletű komponenst kinyerjük és kívánt esetben mmól ecetsavat tartalmazó abszolút metanollal az elúciót folytatjuk és tiszta formában a 10 mg/ml vízoldékonyságú Ai képletű komponenst kinyerjük.

Ismeretes, hogy a primyicin antibiotikumkomplex három fő és több, mint tíz ún. minor komponensből áll (J. Chromatogr. 295, 141-151, 1984). Az említett, valamint a 153 593 sz., 158 241 sz., a 177 299 sz., a 179 140 sz., a 194 493 sz., a 195 514 sz. magyar szabadalmi leírások szerint előállított, valamint a primycinnel kapcsolatos egyéb szabadalmi leírásokban, illetve irodalmi helyeken szerepló' primycinkomplexek és az azokból előállított származékok, illetve komponensek vízben igen rosszul oldódnak és a tiszta komponensek előállítása bonyolult, hosszadalmas eljárást igényel.

Találmányunk lényege az, hogy a 146 332, ill. a 153 593 számú magyar szabadalmi leírásokban leírtak alapján előállított primycinkomplexből egy egyszerű eljárással, a J. Aberhart és mtsai. (J.A.C.S. 92, 5816/1970) által közölt összegképlettel megegyező, vízben jól oldódó terméket állítottunk elő. Az általunk ily módon előállított vízoldékonyságú komplexből melynek vékonyréteg-kromatogramja megegyezik a kiindulási termékével - viszonylag egyszerű eljárással a fentebb már említett primycin főkomponenseket különítjük el, melyek megó'rzik vízoldékony tulajdonságukat és összegképletük megegyezik az irodalomban közöltekkel.

Ismeretes, hogy a primycinkomplexnek és komponenseinek nagy az antimikrobás hatékonysága. A terápiás felhasználásnál, ill. a megfelelő hatóanyag-tartalmú gyógyszerformák előállításánál komoly nehézséget jelent alacsony oldhatóságuk (pl. Embrimycin® Gél, hatóanyag-tartalom: 0,2%.

E probléma megoldható az általunk előállított vízoldékony termékkel/termékekkel, hiszen ebből/ezekból akár 50-100 mg/ml koncentrációjú vizes oldat is készíthető.

Kísérleteink során először a vízoldékony primycinkomplexet állítottuk elő, melyhez kiindulási anyagként a már korábban említett magyar szabadalmi leírások (146 332; 153 593) alapján előállított primycinkomplexet használtuk, mely Blaskó szerint (Blaskó Katalin, kandidátusi értekezés, 1982) ionofor tulajdonságú.

Saját, korábbi kísérleteink szerint a fenti primycinkomplex a koncentráció és az idő függvényében 1-10 pmól/ml koncentrációban gátolja a vázizomrostok felszíni membránjának nyugalmi K⁺-csatornáit, és ennek következményeképpen csökken a membránpotenciái, mely maga után vonja a kontraktilis rendszer funkciójának módosulását is. A primycin-antibiotikum egyedülálló abban a tekintetben, hogy a magas komplexicitással rendelkező' molekulában együtt van jelen egy guanidin- és egy arabinózegység. így mind a biológiai hatásért, mind fizikokémiai sajátságaiért a nem polién típusú makrolid lakton, ill. az ehhez kapcsolódó guanidin-, ill. arabinózcsoport a felelős. Ezeket együttesen alakítják ki amfipatikus - azaz hidrofil-hidrofób - sajátságaik révén az antibiotikum membránon át történő orientációját és kötődését. Feltételezhető továbbá, hogy a primycin csatornaképzó' tulajdonsága dimerek, vagy nagyobb polimerek képződésével függ össze.

A fenti kölcsönhatások részleges vagy teljes megbontása jelentó'sen befolyásolhatja a molekula polaritását, és egyben oldékonysági viszonyait is. A molekula guanidincsoportjának részleges vagy teljes protonáltsága jelentó'sen befolyásolhatja a felületi töltéseloszlást (bruttó polaritás), amely direkt vagy indirekt módon csökkenti, vagy éppen elősegíti az intermolekuláris kölcsönhatások kialakulását.

A találmány szerinti eljárásban a vízoldékony primycinkomplexek előállítása során alkalmazható vegyületek a következők: pl. propargil-aldehid, formilecetsav-etil-észter, ciánecetsav-etil-észter, malonsavdinitril, metil-etinil-keton, acetil-aceton, oc-formil-βetoxi-propionsav-észterek, melyek közül előnyösen a ciánecetsav-etil-észtert alkalmaztuk. Reakciós közegként 1-3 C-atomos, vízmentes alkoholok alkalmazhatók, előnyösen abszolút etil-alkoholban végeztük a reakciót, melyet a már vízmentes „Reanal” etil-alkoholból Grignard-reakcióval készítettünk. Egyébként a kísérletek folyamán alkalmazott vízmentes oldószereket „molekulaszitával” (Sigma molecular sieve 0,30,4 nm) együtt tároltuk.

Katalizátorként nátrium/káhum-metilát/etilát, eló'nyösen nátrium-metilát alkalmazható, s az egyes reakciók az alkalmazott etil-alkohol refluxhó'mérsékletén

3-6 óráig tartottak. A reakciók befejeztével aktív szenes (Charcoal activ „Merck”) kezelést/derítést alkalmaztunk, mely után szűrés (glass microfibre paper GF/C „Whatman”) és részleges vákuumbepárlás (Rotavapor R 110 „Büchi”) következett.

A bepárlás folyamán a reakcióközegként alkalmazott etil-alkoholt folyamatosan vízmentes metil-alkoholra cseréljük le, és a kis térfogatra történő bepárlást követően abszolút éterrel/acetonnal végezzük el a kicsapást. A kapott termék fehér színű, és a további azonosítási vizsgálatok céljára pulverizált formában

HU 205 366 A vákuum-szárítópisztolyban (blaugél, kloroform/etanol, 65 °C) 24 órán keresztül tartjuk.

A vízoldékonyság primycinkomplex jellemző adatait - összehasonlítva a kiindulási anyagként alkalmazott primycinkomplexével - az 1. táblázat szemlélteti.

1.táblázat

	Vízoldhatatlan kiindulási primycin	Vízoldható primycin- végtermék
Empirikus forma Olvadáspont Biológiai aktivitás Vízoldhatóság	C55H104N3O17 180-184 °C 0,05 pg/ml 0,04 mg/ml	C55H104N3O17 162-164 °C 0,1-0,5 pg/ml 40-60 mg/ml

A vízoldékonyság primycinkomplex előállítása során valójában nem alakul ki a korábban vélt heteroaromás gyűrű, azaz a pirimidinvázas vegyületek szintézisét reprezentáló kondenzációs reakció nem eredményez semmiféle gyűrűzáródást. Valószínűnek tűnik, hogy a reakció során olyan „intermedier” keletkezik, mely alapvetően megváltoztatja a makrolidgyűrű OHcsoportjának orientációját. Ez eredményezi végsó' fokon a vízoldékonyság igen kifejezett növekedését, és ez teszi lehetővé a fő komponensek viszonylag egyszerű elkülönítését. Ennek magyarázatára a későbbiek során visszatérünk.

Összegezve az eddigieket, megállapítható, hogy a fenti eljárás segítségével minden esetben, jól reprodukálható módon, vízben jól oldódó primycinkomplexet tudunk készíteni, amelyhez kiindulási anyagként bármely gyári terméket, közvetlenül, mindennemű előzetes tisztítás nélkül alkalmazni tudjuk, előnyösen az ólomszennyezett primycinkomplexet. Tapasztalataink szerint ugyanis az ólom előnyösen befolyásolja mind a vízoldékony primycinkomplex kitermelését - mely általában 80-85% - mind pedig az elérhető maximális vízoldhatóságot, amely 50-100 mg/ml koncentrációt jelent.

Vizsgálataink szerint az „ólomszennyezett” gyári primycinkomplex 6-10 ppm ólmot tartalmaz (Atomabszorpciós spektrum, Perkin-Elmer Mód. fo.). Ha a vízoldható primycinkomplexet közvetlenül az EBRIMYCIN antibiotikumkomplexből készítjük, a kitermelés csökken (50-60%), és a kapott termék maximálisan csak 5-10 mg/ml koncentrációban oldódik vízben. A fentiek ellensúlyozhatók, ha a reakció során 15-20 ppm ólmot alkalmazunk ólom-acetát formában.

Első megközelítésben csupán a vízoldékonyság az, mely lényeges különbséget jelent az általunk kidolgozott eljárás által kapott primycinkomplex és az eredeti, gyári termék között. A megváltozott szolvatációs tulajdonságok révén viszont alapjaiban módosulhatnak az asszociációs viszonyok is, megváltozhatnak az ún. heterogenitási arányok, s ezáltal a rendszer - bizonyos értelemben - „hozzáférhetőbbé” válik. Nos, ez a „hozzáférhetőség”, a fenti jelenségek együttes hatása biztosította, hogy a viszonylag gyors és jól reprodukálható kromatografikus lépések alkalmazásával sikerült biológiailag aktív, kétkomponensű, ill. egykomponensű termékeket izolálni.

A vízoldható termékkel kapcsolatban még egy igen fontos és jellemző tulajdonságot kell megemlítenünk, melyet már korábbi kísérleteinkben is több alkalommal tapasztaltunk. Nevezetesen azt, hogy vizes oldatban egy spontán gélesedési folyamat játszódik le, és ez a mindenkori hatóanyag-koncentrációtól függ, hogy mennyi időt vesz igénybe. 5-10 mg/ml koncentrációban 1-2 nap, 20-40 mg/ml anyagtartalom esetén kb. 6-12 óra, de 50 mg/ml-nél magasabb koncentrációnál már 1-2 óra is elegendő a teljes gélesedéshez. Minden valószínűség szerint, a molekulában lévő OH-csoportok orientáció-változásával van összefüggésben a vízoldékony termékek koncentráció-, hőmérséklet- és időfüggő polimerizálhatósága (2. ábra).

A kialakult gél teljesen áttetsző, stabil és plusz oldószer hatására sem változik. E jellemző asszociációs tulajdonság lehetőséget nyújthat ún. polimerizált gélek vagy liofilezett hártyák alkalmazására olyan területeken, ahol igen nagy fontossággal bír a lokális magas hatóanyag-koncentráció. A könnyen elkészíthető kolloidális gyógyszerforma segítségével a hatóanyag-koncentráció tág határok között változtatható, mellőzni lehet mindennemű gélképző ágenst, nem beszélve a nagyobb hatóanyag-koncentráció érdekében alkalmazott etil-alkoholt, melynek kellemetlen mellékhatásai közismertek.

A kétkomponensű vízoldékonyság primycin előállításánál kiindulási anyagként a már tárgyalt vízoldékony primycinkomplex szerepelt. A primycinkomplex komponenseinek elválasztására jelen esetben szilikagél-oszlopkromatográfiát alkalmaztunk. A felhasznált szilikagél „Reanal” kiszerelésű import Kieselgel-60 (0,063-0,2 mm, ill. 0,2-0,5 mm). Ionmentes vízből (,,HERCO”-patron) történő többszöri dekantálás és mosás után az alkalmazott gélszuszpenziót vákuumban buborékmentesítettük. Kromatográfiás oszlopként „flow adapter”-rel ellátott „Pharmacia” oszlopot (2,6*230 cm) alkalmaztunk. A folyamatos áramlást „Gilson” minipuls-2 négycsatornás perisztaltikus pumpával biztosítottuk. A kísérlet folyamatos ellenőrzést, frakciószedést, regisztrálást „Gilson” folyadékkromatográfiás berendezés (differenciál spektrométer Holochrome modell HM, frakciószedő modell 201, kétcsatornás szervopotenciometrikus rekorder modell N₂) szolgáltatta.

Az anyagfelvitel vizes oldatból történt 5-10 mg/ml koncentrációban (3. ábra). A kísérlet első részében vizes elúciót, ill. mosást alkalmaztunk, melynek folyamán a primycinkomplex minor komponenseinek jelentős része eltávolítható (a 3. ábrán A-val jelzett). Az elúció folyamán az egyes csúcsfrakciókat vékonyrétegkromatográfia alkalmazásával ellenőriztük. Gyári kész réteget alkalmaztunk („Merck” DC-Alufolien vagy DC-Plastikfolien Kieselgel-60 F254). Szolvensként nbutil-alkohol:etil-alkohol:ecetsav:víz=38:2:10:50 v/v elegyének felső fázisát (Partridge) használtuk, s a de3

HU 205 366 A tektálásra az irodalomból ismert reagensek közül a vanilin-kénsavat (105 °C) alkalmaztuk. Az oszlopon kötődött anyagot - mely fő tömegében az (A3+A1) komponenst tartalmazta - a fenti Partridge elegy, vízzel készített 1%-os oldatával eluáltuk.

Az összegyűjtött csúcsfrakciókat bepároltuk, fokozatos dehidrálás (deszt. metanol, absz. metanol) után kis térfogatból absz. éterrel/acetonnal kicsaptuk. így a vízoldékony primycinkomplexbóT közvetlenül, egyszeri kromatografikus lépésben egy kétkomponensű az A3+A1 vízoldható, biológiailag aktív termék nyerhető. A tisztán kétkomponensű termék kitermelése a kiindulási anyaghoz (vízoldható primycinkomplex) viszonyítva általában 50-60%. Az (A3+A1) komponensek elúciója folyamán kezdetben a még jelen lévő', maradék minor komponensek eluálódnak, majd később tisztán, az említett két komponens és végül az elúciógram leszálló tartományban a szennyezésként jelen lévő, magasabb Rf-értékkel jellemzett, a korábbi szabadalmakban C komponensnek nevezett anyag eluálódik.

A fentiek után kísérletet tettünk a két fő komponens, azaz A ; és Ai szeparálására. Korábbi kísérleteink folyamán egyre inkább nyilvánvalóvá vált, hogy a két fő komponens közel azonos adszorptív tulajdonsággal jellemezhető, és így a teljes elválasztásuk hosszadalmas, nehezen kézben tartható folyamatot igényel, nem beszélve az igen nagymérvű anyagveszteségről.

A primycin hatásmechanizmusának vizsgálatával kapcsolatos kutatásaink folyamán mindvégig nagy fontosságot tulajdonítottunk a primycin töltésszerkezet-változásnak. Hiszen a megváltozott töltésszerkezet alapvetően módosíthatja: 1. a primycinmolekula membránorientáltságát (ti. csakis egy diszkrét orientáció biztosíthatja pl. az antibakterális és toxikus hatások szétkapcsolását); 2. a molekula, ill. az egyes komponensek adszorptív tulajdonságait.

A vízoldékony primycinkomplexszel végzett korábbi gélkromatográfiás (Sephadex LH-20) kísérletek eredményei arra engedtek következtetni, hogy a polaritást, s egyben az asszociációs viszonyok megváltozása jelentősen befolyásolhatja a primycin heterogenitását. Más szóval, az egyes csúcsfrakciók komponenseinek részaránya az alkalmazott oldószerrendszer dielektromos sajátságainak függvénye. Ezen kísérleti tapasztalatok és eredmények felhasználásával próbálkoztunk az ioncserés kromatográfia alkalmazásával, melynek egyik, esetünkben előnyösen alkalmazott változatát az alábbiakban közöljük.

Az egykomponensű, homogén, vízoldható termékek, azaz A ; és Ai izolálásának kiindulási anyagául az előzőekben tárgyalt kétkomponensű A3+A1 vízoldható primycin szolgált, melyet vizes közegből (4-5 mg/ml koncentrációban) eluáltunk az NHJ-ciklusú karboximetil-cellulóz-oszlopon (CM-52 Cellulose, preswollen, „Whatman”; oszlopméret: 2,6*5 cm, „Pharmacia” K26/flow adaptro). A kísérleti körülményeket és a B komponensre (A₃) kapott elúciógramot a 4. ábra szemlélteti.

Vízzel történő kimosás után 5-8 mM vizes ammónium-hidrokarbonáttal végeztük az elúciót, melynek csúcsfrakciói a tiszta, homogén B komponens (azaz A₃) szolgáltatták. (A másik komponens - az Aj - a CM-cellulóz-oszlopon marad.) Az ammónium-hidrokarbonátos frakciókat összegyűjtöttük, és kevés n- butil-alkohol hozzáadásával (habzásgátlás) közel szárazra pároltuk. Többszöri vizes mosás/bepárlás alkalmazása után (ammónium-hidrokarbonát eltávolítása) először deszt. metanollal, majd később absz. metanollal teljes dehidrálást végeztünk, s végül kis térfogatból absz. éterrel kicsaptuk az anyagot, melyet a szűrés folyamán kevés vízmentes acetonnal átmostunk. A kiindulási anyagra (kétkomponensű vízoldékony primycin) számolt kitermelés általában 45-50%, op.: 159-161 °C (összehasonlításképpen a vízoldható primycinkomplexé: 162-164 °C, a kétkomponensű vízoldható termékét pedig 165-168 °C).

A vízoldhatóság kb. 2-6 mg/ml értékre csökken, s mind ez, mind pedig az alacsonyabb olvadáspontérték a termékben maradt minimális mennyiségű „kötött” NHÍ, Nl I I ICOi-ot jelenthet. Ennek eltávolítására az egykomponensű (azaz A₃ terméket vizes közegből, H⁺ciklusú karboxi-metil-cellulózra kötöttük fel, s a teljes vizes elúció, ill. kimosás után a CM-cellulózt fokozatosan dehidratáltuk deszt. metanol, ill. absz. metanol alkalmazásával. Végezetül 10 mM ecetsav/absz. metanol eleggyel eluáltunk. Kis térfogatra történő bepárlás után absz. metanollal több ízben mostuk, és az ismételt bepárlás után, kis térfogatból az egykomponensű terméket (A3) absz. acetonnal kicsaptuk. Üvegszűrőn (G4) szűrtük és ismételt acetonos mosás után szárítottuk a már korábban leírtak szerint.

Az így kapott termék ismételten eléri a korábbi jó vízoldhatóságát, és olvadáspontja 164-166 °C, szemben a korábbi 159-161 °C értékkel. Az ismételt ioncsere alkalmazása folytán az anyagveszteség-maximum 5-10%.

A másik egykomponensű vízoldható primycint (Ai), illetően - mivel ez az előzőekben tárgyalt CM-52 cellulóz - NHÍ-oszlop ammónium-hidrokarbonátos eluálása után az oszlopon marad - a következőképpen járunk el.

Az (Ai) elúciójának (NH4HCO3) befejezése után az oszlopot vízzel mossuk (a szabad ammónium-hidrokarbonát teljes eltávolítása érdekében), majd fokozatosan dehidráljuk először deszt. metanollal, majd később absz. metanollal. Az anyag elúcióját absz. metanolban oldott 10 mM ecetsavval végezzük. Kis térfogatra történő bepárlás után, többszöri absz. metanolban történő újraoldást alkalmazunk, majd ismételt bepárlást (a szabad ecetsav eltávolítása érdekében). Végezetül az egykomponensű vízoldékony primycint (Ai) kis térfogatból absz. acetonnal kicsapjuk.

A termék vízben jól oldódik, op.-ja 167-168 °C. E komponens esetében már semmiféle utólagos ioncsere nem szükséges, mert az ecetsavas elúció folyamán a maradék és „kötött” NHÍ, ill· NH4HCO3 ammóniumacetát formában eluálódik, és az acetonos kicsapás folyamán oldatban marad.

Az eddigiek alapján megállapíthatjuk, hogy a korábbi szabadalmi leírásokban közölt primycinkomplexbóT

HU 205 366 A vízoldékony primycinkomplexet állítottunk elő, melynek felhasználásával, eló'ször a két fő' komponenst együttesen tartalmazó vízoldható primycint, majd a komponensek szétválasztásával egykomponensű vízoldható termékeket állítottunk elő. A biológiai értékmérés és a vékonyréteg-kromatográfia összehasonlító eredményeit az 5. ábra tartalmazza. A két primycinkomplex szerkezeti képlete azonos.

Az előzőekben beszámoltunk a vízoldékony primycinkomplex sajátos gélesedési tulajdonságáról. A komponensek szétválasztása után azt tapasztaltuk, hogy vizes oldatban egy adott koncentráció esetén, időben csökken a gélesedés sebessége. Míg az egykomponensű termékek vizes közegben 5-10 mg/ml koncentrációban napokig eltarthatok (maximum egy hét) minden különösebb változás nélkül, addig pl. a kétkomponensű primycin estében 1-2 nap, a vízoldható komplexnél pedig 24 órán belül bekövetkezik a gélesedés. Valószínűnek tartjuk, hogy vízoldékony termékek időfüggő gélesedése konformációváltozással, ill. a hidroxilcsoportok orientációjával van összefüggésben.

Korábbi vizsgálati adatokból ismert a primycin nagyfokú elektrolitérzékenysége. Összhangban mind ezzel, mind a primycin ionofor tulajdonságával - saját kísérleteink szerint - kationokkal reveltálható a hidroxilcsoportok orientációja, miközben nagymértékben, reverzibilisen csökken a primycin oldékonysága. Ugyanakkor megfelelő koncentrációban alkalmazott cukoroldatokban (pl. izot. glükóz) mind a polimerizáció, mind az elektrolit (kation) érzékenység nagymértékben kivédhető.

A biológiai értékmérés eredményei sajátos jelenséget bizonyítanak, miszerint az egyes komponensek más-más ti terrel jellemezhetők. Az eltérő' aktivitásértékek arra utalnak, hogy mind a kétkomponensű vízoldható primycin, mind az egyes komponensek valószínűen különböző' módon fejtik ki antibakteriális hatásukat. Hatásmechanizmusuk során különböző támadásponttal rendelkezhetnek. Ebből adódik az a jelenség, hogy egymás hatását szinergetizálni képesek (v.o. „Eljárás új, nagy hatékonyságú szinergetikus készítmények előállítása” szolgálati találmány, No. 2051/85).

A mellékelt NMR-spektrum felvételek (6-11. ábrák, NMR-Spektrométer, Bruker WP SY 200) alapján az alábbiakat állapíthatjuk meg.

A vízoldékony primycinkomplex előállításánál alkalmazott reakció során semmiféle gyűrűzáródás nem jön létre. A ¹³C-NMR-spektrum szerkesztés alapján egyértelműen megállapítható, hogy a vizsgált molekula négy kvatemer szénatomot tartalmaz, és a karbonilszén 176,7 ppm-nél található. A guanidincsöpört kvaterner szénatomja 158,8 ppm-nél, és a maradék két kvatemer szénatom pedig 145,7, ill. 135,8 ppm-nél jelentkezik (6. ábra). A korábbiakban feltételezett gyűrűzáródás még további két kvatemer szénatom jelenlétét igényelné.

Az alkalmazott „kondenzációs reakció” folyamán az NMR-spektrumok szerint - nagy valószínűséggel egy intermedier keletkezik (6. ábra, 170,4 ppm-nél jelentkező kvatemer karbonil???-jel). A kapott vízoldékony primycinkomplexet, melyet abszolút oldószeres rendszerből preparáltunk (ekkor még látható a jel), a továbbiakban vizes közegben kromatografáljuk, melynek során a feltételezett intermedier hidrolízise vagy szelektív adszorpciója révén a rendszerből eltávolítható. (A szilikagél- kromatográfia alkalmazásával kapott kétkomponensű vízoldható primycinben már nem látható a fentijei.)

A továbbiakban a ¹³C-NMR-spektrum szerkesztés alapján (DEPT), valamint a J-modulált spin-acho technika alkalmazásával meghatároztuk a fő komponensekben jelen lévő különböző rendű (kvatemer, CH-, CH2-, CH3-) szénatomok számát. így a vizsgált molekulában négy kvatemer szén található (a kémiai eltolódásértékeket lásd fentebb), továbbá 22 metin-szén (105,6 ppm-nél az arabinóz anomer szene és 129,1, ill. 124,9 ppm-nél a két telítetlen kötés CH-szene található), 22-23 metilén-szén (e bizonytalanságot a hasonló kémiai környezetben lévő metilén-szenek jeleinek véletlen egybeesése okozza), és végül 6 metil-szén.

Ennek alapján megállapítható, hogy a vízoldékony primycinkomplex fő komponenseinek összegképletre gyakorlatilag megfelel a már korábban közölt irodalmi adatokkal. A vízoldható primycinkomplex NMR-spektrumában két epimer jelei különülnek el, amelyek az 5a. ábrán feltüntetett helyeken az OH-, CH₃- és butilcsoport-szubsztituensek eltérő térállása miatt, kémiai eltolódás révén doublet (kettős jel) formájában tükröződnek.

OH-csoportok a 4, 8, 12, 16, 28, 30, 32, 34, 36, valamint a 21’ helyeken

CH₃-csoportok a 3, 15, 21, 23 és a 20’ helyeken

-CH2-CH2-CH2-CH₃ (butil)-csoport a 17. C- atomnál

A feltételezett szerkezet részleteinek igazolása (OH-, CH₃- csoportok és egyéb szubsztituensek helye és esetleges térállása) további, nagyobb terű készüléken történő' méréseket igényel.

A kétkomponensű vízoldható primycin ¹³C-NMRspektrum a 7. ábrán, és a már különválasztott, egykomponensű termékek felvétele a 10., ill. all. ábrán látható.

Visszatérve a vízoldható primycinkomplex spektrumára (6. ábra), és ezt összevetve a kétkomponensű vízoldható termékével (7. ábra) megállapítható, hogy a fő komponensek, azaz A₃, ill. Ai mennyiségi aránya fordított, azaz, míg az elsó' esetben (6. ábra) az (A₃) van túlsúlyban, addig a már kétkomponensű rendszer esetében (7. ábra) az (Ai). A komponensek mennyiségi arányainak változása összhangban van a kísérleteink folyamán alkalmazott vékonyréteg-kromatográfiás eredményekkel (5. ábra jobb oldalán látható összehasonlító futtatás).

A ¹³C-NMR-spektrumok alapján (10., ill. 11. ábrák) arra a következtetésre jutottunk, hogy a két fő komponens az (A₃ és Ai) szénatomjainak számát tekintve gyakorlatilag azonosnak mondható azzal a megjegyzéssel, hogy a metilén-szenek számában - a már korábban említett bizonytalanságok miatt - egy szénatom számban differencia lehet.

A két fő komponens megfelelő szénatomjainak kémiai eltolódásaiban észlelt minimális differenciák (me5

HU 205 366 A lyek esetenként gyakorlatilag elhanyagolhatók) arra utalhatnak, hogy a két fő komponens között lényeges különbség nincs, esetleg konformációbeli különbség, ill. monomer-dimer kölcsönhatás kialakulhat (8. ábra).

A találmányunk tárgyát képező eljárás részleteit (anyagok, módszerek, metodikai megoldások stb.) az alábbi példákban ismertetjük.

Anyagok és módszerek

Kísérleteink során alkalmazott oldószerek, vegyszerek mind analitikailag legtisztább készítmények voltak (Merck, Fluka, Reanal, Whatman, Macherey-Nagel Co., Sigma). Egyes oldószerek tisztítását, vagy további tisztítását (abszolutálás) magunk végeztük. A vízmentes oldószereket molekulaszitán (molecular siever 34 Á) tároltuk.

Az oszlopkromatografikus elválasztások esetében az alábbi termékeket alkalmaztuk:

Kieselgel-60 (0,063-0,2; ill. 0,2-0,5 mm) Reanal import.

Karboxi-metil-cellulóz MN 2100 CM „MachereyNagel” és CM-52, preswollen, microgranuler „Whatman”.

A vékonyréteg-kromatográfia alkalmazott rétegei a következó'k voltak:

DC-Alufolien Kieselgel-60 F254 20·20 cm/0,2 mm „Merck”

No: 5554

DC-Plastikfolien Kieselgel 60 F254 20·20 cm/0,2 mm „Merck”

No: 5735

Polygram Sil. G/UV254 20*20 cm/0,25 mm „Macherey-N agel”

Folyadékromatográfiás berendezés: „Gilson” Medical Electronics, differenciál spektrométer (UV-motor, Holochrome HM, frakciókollektor, modell 201, regisztráló, modell N₂, Minipuls-2 perisztaltikus pumpa).

A vékonyréteg-kromatogram indikálását, módosított vanilin-kénsav reagenssel végeztük. 250 mg p.a. vanaibnt 100 ml absz. etil-alkoholban oldottunk. -10 °C-ra történő hűtés után 2,5 ml cc. kénsavat csepegtettünk az oldathoz. Spray (hajtógáz: nitrogén) vagy a reagensen történő áthúzás (merítés) módon alkalmaztuk. A rétegeket hideg levegőáramban történő szárítás után 105 °C-on 2-3 percig aktiváltuk.

A „Sakaguchy”-reakciót két változatban alkalmaztuk:

I. A kellően megszárítot rétegeket 8-OH-kinolin 0,2%-os acetonos oldatával hidegen kezeltük, majd szárítás után (hideg levegőáramban) 0,2% Br2-t tartalmazó 0,5 N nátrium-hidroxiddal a rétegeket lefújtuk, és hidegen szárítottuk.

II. 2,5 g nátrium-hidroxidot oldunk 5 ml vízben. Hűtés után (2-5 °C) 45 ml előre hűtött metanollal hígítjuk, majd szűrjük és 50 mg 8-OH-kinolint benne feloldunk. Ez képezi az egyik reagenst. A másik esetében 50 ml 10%-os, előhűtött (2-5 °C) etil-alkoholban 250 mg N-bróm-szukcinimidet oldunk. A kezelést az I. változat szerint végezzük. Kísérleteink során több ízben alkalmaztunk Sakaguchy-reakciót oldatban (víz, szerves oldószerek) lévő primycin kimutatására. Ebben az esetben az irodalomban már leírt, ill. módosított mikrokémiai módszert alkalmaztuk az alábbiakban közölt módosítással. A méréseket N-bróm-szukcinimiddel (NBS) végeztük.

A standard hígítást sort argininre vettük fel, és a kialakult színt 520 nm-nél Opton-spektrofotométerben mértük. Alkalmazott reagensek, melyeket minden esetben frissen készítettünk:

1. 0,01%-os lúgos alfa-naftol, amely 0,2%-os alfanaftol etanolos oldatából készült 10%-os NaOH vizes oldatával történő hígítással.

2. 0,45%-os NBS-oldat (10%-os etil-alkoholban).

3.40%-os, vizes karbamidoldat.

A meghatározásokat 0 °C-on végeztük. Eltérve az eredeti leírástól, a reakcióelegy térfogata 1,7 ml volt, mely a következőket tartalmazta:

vizsgálandó oldat	Imi
lúgos alfa-naftol	0,4 ml
NBS-reagens	0,1 ml
karbamidoldat	0,2 ml

Irodalmi adatokból ismert, hogy a Sakaguchy-reakció különböző alkoholokra és általában oxovegyületekre igen érzékeny. így pl. a primycin esetében már 20% alkoholtartalom (metil-, etil-,) az 520 nm-nél mért extinkció jelentős csökkenését eredményezi. E csökkenés viszont nem a kialakult színintenzitással, hanem annak spektrális eltolódásával van összefüggésben (alacsonyabb hullámhossz felé tolódás). Abban az esetben, amikor a primycint nem tiszta vízben, hanem szerves oldószeren vagy keverékben (pl. butanoketanol:víz=l:l:2) oldjuk, a Sakaguchy-reakció által kialakult jellemző szín a butanolos fázisba kvantitatíve átrázható, mely fázis színének abszorpciós maximuma 480 nm.

A primycin biológiai értékmérését agardiffúziós technikával végeztük. Tesztorganizmusként Bacillus subtilis ATCC 6633-at használtunk.

1. A B. subtilis (ATCC 6633) tenyésztésére alkalmazott táptalaj (Schaeffer-táptalaj, Nutrient Both No.

2./oxid) összetétele:

Beef extrakt	3,2 g
Pepton	3,2 g
NaCI	1,6 g
MgSO4*7H₂O	0,25 g
KC1	1,0 g
FeSO4*7H₂O	287 ggC

900 ml vízben oldva.

A kész oldatot 30 percig 1,5 atm nyomáson autoklávozzuk, majd a pH-t 7,0-7,2-re állítjuk 10 N NaOH-dal (5-6 csepp) és 90 ml-enként szétöntjük a megfelelő tárolóedényekben és mindegyikhez 10-10 ml-t adunk az alábbi oldatokból:

a) CA(NO₃)₂*4H₂O

236 mg (10‘³ M) 100 ml d. vízben

b) MnCl₂*4H₂O

1,979 mg (10'⁵ M) 100 ml d. vízben

HU 205 366 A

2. Az ún. titráló táptalaj összetétele a következő:

Húskivonat (Beef Extráét „Difco”)	5g
Pepton (Bacto Peptone „Difco”)	0,5 g
Na₂HPO₄	0,1 g
KH2PO4	0,1 g

100 ml deszt. vízben oldani, forralni két óráig, majd a pH-t beállítani 8-ra. A még meleg oldatot szűrjük, és kihűlés után 900 ml deszt. vizet adunk hozzá, és literenként 20 g agart (Bacto Agár „Difco”), melyet Kochfazékban oldunk, és az oldat pH-ját még meleg állapotban ismételten ellenőrizzük. A kész oldatot 100 ml-enként szétöntjük a megfelelő tárolóedényekbe, és 1,5 atm nyomáson 20 percig autoklávozzuk.

A titráló lemezeket a fenti táptalajból készítettük oly módon, hogy annak 100 ml-es mennyiségét alkalmanként vízfürdőben felolvasztjuk, majd a 40-50 °C-ra visszahűtött, még folyékony táptalajba 0,5 ml B. subtilis (ATCC 6633) tenyésztett spóraszuszpenziót óvatosan (Habzásmentesen) belekeverünk. Végül mindezt üvegtálcára (30·30·3 cm méretű, 3^1 mm-es falvastagságú üveglemezből szilikongumi-ragasztással készült tepsi) öntjük, s a megdermedt agarlemezbe 0,5-1 órás 37 °C-on történő' preinkubálás után 42 db 10 mm átmérőjű lyukakat vágunk.

Aprimycin biológiai értékmérésénél alkalmazott standard preparátumból, az általunk minden esetben, mint kiindulási anyagként kezelt termékbők, valamint a vizsgálandó anyagainkból vízben, vagy butanoketanol:víz=l:l:2 oldószerrendszerben 20-50 gg/ml-es oldatokat készítettünk. Ezekből d. vízzel/pufferrel (0,15 M foszfátpuffer, pH 7,6) 0,05-0,1, 0,5-1,0, ill. 2,0 gg/ml koncentrációjú hígításokat készítettünk. Ezekből párhuzamosonként 0,1-0,1 ml-t a titráló tápagarlemezen lévő lyukakba helyezünk. A18-20 órás inkubálás (termosztátban, 37 °C-on) után a biológiai aktivitásnak megfelelően kialakult diffuzív kioltási gyűrűk (zónák) átmérőit lemérve (mm), és a nyert értékeket a standard hígítás! sor koncentrációinak függvényében szemi-logaritmikusan ábrázolva, az ismeretlen aktivitásoknak megfelelő értékeket extrapolálunk.

Példák

1. példa

Vízoldékony primycinkomplex előállítása

250 ml-es, csiszolatos gömblombikba 500 mg (0,46 mM) jól elporított primycin (Pb-szennyezett) és 100 ml absz. etil-alkoholt teszünk és nátronmész CaCI:-os csővel ellátott visszafolyatós hűtővel refluxáljuk az elérhető maximális oldódásig (kb. 15-30 perc). Ezután 50 μΐ ciánecetsav-etil-észtert (0,46 mM) adunk a rendszerhez, melyet kevés absz. etanollal bemosunk. 15 perces reflux után összesen 25 mg nátrium-metilátot (0,46 mM) három közel egyenlő részletben, 30 perces időeltolódással a reakcióelegyhez adjuk, ügyelve arra, hogy minden egyes részlet, kevés (1-2 ml) desztillált etil-alkohollal (96%) bemosunk. Már az első adag nátrium-metilát után észrevehetően tisztul a reakcióelegy, fokozatosan feloldódik a primycin teljes mennyisége, és a reakcióközeg halvány rózsaszínű lesz. A reakcióidő (4 óra) leteltével az elegyet kihűlés után szűrjük (G-4), majd kis térfogatra bepároljuk (Rotavapor R 110, „Büchi”). Ezután absz. metil-alkohol alkalmazásával fokozatosan lecseréljük a reakcióközeg etanoltartalmát oly módon, hogy a kis térfogatra történő bepáriás után, mindig absz. metanolban oldjuk a kivált terméket. Ezzel azt érjük el, hogy a kezdetben az absz. etanolban csak korlátozottan oldódó termék az absz. metanolban olyannyira oldhatóvá válik, hogy néhány ml-ben is oldatban marad. E maradék, néhány ml-es absz. metanolos közegből absz. éterrel kicsapjuk az anyagot. Szűrjük (G-4 üvegszűrój, absz. acetonnal mossuk és szárítjuk (vákuum-szárítópisztoly, blaugel, kloroform/etanol fp.: 65-70 °C).

Kitermelés 410 mg (82%) vízoldható primycinkomplex (vékonyréteg-kromatogramja az 5. ábrán látható). Vízoldhatóság: 50 mg/ml. Op.: 162-164 °C. Biológiai aktivitás: 0,08-0,2 gg/ml B. subtilis.

2. példa

Kétkomponensű vízoldékony primycin előállítása

Kiindulási anyagként az 1. példában szereplő vízben oldható primycinkomplex szolgált. A primycinkomplex komponenseinek elválasztására szilikagél-oszlopkromatográfiát alkalmaztunk. A szilikagélt (Kieselgel60, 0,2-0,5 mm, Reanal import) ionmentes vízből (HERCO-patron) többszöri mosással és dekantálással tisztítottuk, és a már homogén gélszuszpenziót az oszlopkészítés előtt vákuumban (vízlégszivattyú) buborékmentesítettük.

Oszlopméret: 2,6*230 cm („Pharmacia” flow adapterrel ellátott). Anyagfelvitel: 500 mg vízoldható primycinkomplex, folyamatosan adapteren át, 5-10 mg/ml vizes oldatból (melyet előzőleg G-3 üvegszűrőn szűrtünk) történt. A kísérlet első részében vizes elúciót alkalmaztunk. Áramlási sebessége 130 ml/óra volt, azaz 25 ml/h/cm². A frakciótérfogat: 24 ml. A kísérleti körülményeket és a teljes kiértékelést a 3. ábra szemlélteti.

A vizes mosás befejezése után a kétkomponensű A₃+Ai primycint a Partridge keverék (n- butanoketanol:ecetsav:víz=38:2:10:50 arányú elegyének felső fázisa) 1%-os vizes oldatával eluáltuk. Az elúció folyamán az egyes csúcsfrakciókat vékonyrétegen ellenőriztük. A két komponenst tartalmazó csúcsfrakciókat összegyűjtöttük, kevés normál n-butil-alkohol hozzáadásával (habzásgátlás) kis térfogatra töményítettük (Rotavapor), majd fokozatosan dehidrálást végeztünk, először deszt. metanol, majd absz. metanol alkalmazásával. Végül kis térfogatból a kétkomponensű terméket absz. éterrel, acetonnal mostuk, szárítópisztolyban szárítottuk. Kitermelés 260 mg (52%). Op.: 165-168 °C, vízoldhatóság: 50 mg/ml, biológiai aktivitás: 0,05-0,1 gg/ml (B. subtilis).

3. példa

Egykomponensű, azaz Aj homogén vízoldható primycin előállítása

Kiindulási anyagul a 2. példában tárgyalt kétkomponensű, vízoldható primycin szolgált. A komponensek el7

HU 205 366 A választására ammóniunT-ciklusú karboxi-metil-cellulóz ioncserés kromatográfiát alkalmaztunk. A vízben szuszpendált H⁺-ciklusú cellulózt (CM-52 Cellulose, preswollen, mikrogranular, „Whatman”) 1 M ammónium-hidrokarbonáttal ciklizáltuk, majd többszöri vizes mosás és dekantálás után vákuumban buborékmentesítettük, majd oszlopot készítettünk (oszlopméret: 2,6*5 cm, flow adapterrel ellátott „Pharmacia” oszlop). A kétkomponensű, vízoldható primycint 4-5 mg/ml koncentrációban vizes közegből kötöttük fel az NHí-ciklusú karboxi-metil-cellulóz-oszlopra (450 mg). Átfolyási sebesség: 150 ml/óra, azaz 29 ml/óra/cm². Frakciótérfogat: 24 ml. A kísérleti körülményeket, s az (A3) kapott elúciógramot, és a vékonyréteg-kromatográfiás eredményeket a 4. ábra szemlélteti.

A kísérlet első részében vizes elúciót/mosást alkalmaztunk. A vízzel történő teljes kimosás után 5 mM vizes ammónium- hidrokarbonáttal eluáltunk, melynek csúcsfrakciói a tiszta homogén A3-t eredményezte. Az ammónium-hidrokarbonátos, egykomponensű primycint tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, kevés normál butil-alkohol hozzáadásával közel szárazra pároltuk. Többszöri vizes mosás, ill. bepárlás alkalmazása után - mely az illékony ammónium-hidrokarbonát eltávolítását szolgálta -, először deszt. metanollal, majd később absz. metanollal teljes dehidrálást végeztünk, s az anyagot végül kis oldószer- téréfogatból absz. éterrel kicsaptuk. Szűrés (G-4 üvegszűró'), acetonos mosás, ill. szárítás után 190 mg (42%) egykomponensű A3 primycin, op.: 159-161 °C, vízoldhatóság: kb. 5 mg/ml (a termékben maradható minimális mennyiségű „kötött” NHÍ-, ammónium-karbonát miatt), biológiai aktivitás: 0,5-1 pg/ml (B. subtilis).

Korábban, a leíró részben beszámoltunk arról, hogy a fenti vízoldhatóságbeli csökkenést (mely valószínűleg a fentebb már említett ammónium-hidrokarbonát miatt következik be) H⁺-ciklusú karboxi-metil-cellulóz ioncsere ismételt alkalmazásával megszüntethetjük. A felkötést vizes közegből végeztük (2—4 mg/ml koncentrációban), és a teljes vizes kimosás után az ioncserélőt fokozatosan dehidratáljuk először deszt., majd később absz. metanol alkalmazásával. A végső elúciót 10 mM ecetsavat tartalmazó absz. metanollal végezzük. Az eluátumot bepárlás előtt G-4 üvegszűrőn, vagy „Whatman” Glass Fibre-en szűrjük, majd kis térfogatta történő bepárlás után az egykomponensű terméket absz. acetonnal kicsapjuk. A további eljárás megegyezik a fentebb már leírtakkal. Az így kapott egykomponensű A3 primycin vízoldhatósága: 40-50 mg/ml, op.: 164-166 °C, szemben a korábbi 159-161 °C értékkel. Az ismételt ioncsere alkalmazásakor tapasztalt anyagveszteség maximuma 10%.

4. példa

Egykomponensű Αγ homogén, vízoldható primycin előállítása

A harmadik példában tárgyalt, a komponensek (A₃és Ai) elválasztására alkalmazott NHí-ciklusú karboximetil-cellulóz ioncserés kromatográfia során alkalmazott ammónium-hidrokarbonátos elúcióval az A₃ kom8 ponenst izoláltuk. Az (Aj) komponens az oszlopon marad. Ezért az (Ai) elúciójának befejezése után az oszlopot vízzel mossuk (a teljes ammónium-hidrokarbonát eltávolítása érdekében), majd fokozatosan dehidráljuk deszt., ill. absz. metanol alkalmazásával. Az anyag teljes elúcióját absz. metanolban oldott 10 mM ecetsavval végezzük. Az eluátumokat szűrés után (G-4 üvegszűrőn) kis térfogatra bepároljuk, és az egykomponensű Aj terméket absz. acetonnal kicsapjuk. További eljárás megegyezik a 3. példánál leírtakkal.

A termék vízben jól oldódik: 50 mg/ml, op.: 164168 °C, biológiai aktivitás: 0,03-0,06 pg/ml (B. subtilis). Kitermelés 150 mg (33%) a 3. példában megadott kétkomponensű termék kiindulási mennyiségére (450 mg) számolva.

5. példa

Vízoldékony primycinkomplex előállítása mg (0,05 mM) ólomszennyezett primycinhez 50 ml absz. etil-alkoholt teszünk és az elérhető maximális oldódásig refluxáljuk (kb. 15 perc). Ezután 7 mg (0,1 mM) malonsav-dinittilt adunk a rendszerhez, melyet kevés absz. etanollal bemosunk. További refluxálás folyamán a primycin teljes mennyisége feloldódik, s az oldat gyengén sárgásbarna színű lesz. 6-7 óra elteltével az oldatot szűrjük, majd aktív szenes derítést végzünk. A színtelen oldatot vákuumban közel szárazra pároljuk (Rotavapor R 110, „Btichi”) s a kivált terméket absz. metanolban oldjuk. E műveletet egyszer-kétszer megismételjük. Végezetül kis térfogatra (2-3 ml) történő bepárlás után absz. éterrel kicsapást végzünk. Kb. 1-2 órai 2^1 °C-on történő tárolás után a kicsapott terméket szűrjük (G-4 üvegszűró) és szárítjuk (vákuum-szárítópisztoly). A gyengén piszkosfehér színű termék kitermelése 55-60%. Vízoldékonyság 10-15 mg/ml, alkoholban jól oldódik. Olvadáspont 167 °C, mely 150 °C-tól barnás elszíneződést mutat. Biológiai aktivitás 30-35% a kontrolihoz viszonyítva.

6. példa

Vízoldékony primycinkomplex előállítása

250 mg (0,23 mM) alaposan elporított primycin (Pbszennyezett) 100 ml 96%-os etil-alkoholhoz mérünk, majd 15-20 perces refluxálás után 25 mg (0,6 mM) NaHCO3-ot és 5 ml (50 mM) acetil-acetont adunk a rendszerhez. További 1-2 órai refluxálás után a primycin majdnem teljes mennyisége feloldódik s az így kapott sötét okker színű oldatot szűrés után vákuumban szárazra pároljuk. Absz. metanolban történő oldás után a bepárlás műveletét megismételjük. A terméket absz. metanolban oldva melegen aktív szénnel derítjük, majd szűrés után kis térfogatra (3—4 ml) bepároljuk és száraz acetonnal kicsapjuk és 1-2 órára jégszekrénybe helyezzük. A szűrés (G-4) és szárítás (vákuumban) után nyert termék gyengén sárgás színű s a kitermelés 4550%. Olvadáspont 158 °C (barnás elszíneződés). Vízoldékonyság 1 mg/ml, alkoholban jól oldódik. Biológiai aktivitása 80-85% a kontrolihoz viszonyítva. Pikrátja mind vízben, mind alkoholban nagyon jól oldódik (op.: 154 °C) viszont baktericid hatása nincs.

Claims

1. Eljárás vízoldható primycinkomplex elállítására és az Ai (Rf=0,33) és A3 (Rf=0,38) képletű komponensek elválasztására önmagukban vagy a két komponens keveréke formájában, azzal jellemezve, hogy a vízoldhatatlan primycint 1-3 szénatomos alkoholos közegben ciánecetsav-etil-észterrel, acetil-acetonnal, malonsavdinitrillel vagy propargil-aldehiddel, formilecetsav-etilészterrel, metil-etinil-ketonnal vagy egy «-formil-(j-etoxi-propionsav-észterrel reagáltatjuk nátrium- vagy kálium-metoxid vagy -etoxid, valamint 0-1% ólomvegyület, előnyösen 15 ppm ólom-acetát jelenlétében, és a kapott 40-60 mg/ml vízoldékonyságú terméket elkülönítjük és kívánt esetben a kapott anyagot szilikagéloszlopon kromatografáljuk n-butanol:etanol:ecetsav:víz=38:2:10:50 elegy felső fázisa 1% vizes oldatát használva eluálószerként és a kapott Ai és A₃ képletű 50 mg/ml vízoldékonyságú kétkomponensű keveréket, kívánt esetben adszorbensként ammónium ciklusú karboxi-metil-cellulózt használva, ioncserélő kromatografálásnak vetjük alá, az elúciót vizes ammónium-hidrokarbonát-oldattal hajtjuk végre, az 50 mg/ml vízoldékonyságú A3 képletű komponenst kinyerjük és kívánt esetben 10 mmól ecetsavat tartalmazó abszolút metanollal az elúciót folytatjuk és tiszta formában a 10 mg/ml vízoldékonyságú Ai képletű komponenst kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót ciánecetsav-etil-észter jelenlétében hajtjuk végre.

3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-3 szénatomos alkoholként etanolt alkalmazunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót nátrium-metoxid jelenlétében hajtjuk végre.

5. Az 1^1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 15-20 ppm mennyiségű oldékony ólomvegyület jelenlétében hajtjuk végre.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oldékony ólomvegyületként ólom-acetátot alkalmazunk.

7. Eljárás gyógyászati vagy állatgyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerint előállított vízoldható primycint vagy az Ai és A₃ képletű komponensek keverékét vagy az Ai vagy A₃ képletű vízoldható vegyületeket külön-külön a gyógyszertechnológiában szokásos vivó'anyagokkal elkeverjük és gyógyszerkészítménnyé vagy állatgyógyászati készítménnyé alakítjuk.