HU203130B - Process for producing avermectine derivatives - Google Patents

Description

A találmány elágazó láncú aminosav-transzamináz és/vagy elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező Streptomyces avermitilis törzsekkel végzett fermentációs eljárás természetes, illetve nem-természetes avermektinek termelésére.

A 4,310,519 és a 4,429,042 számú amerikai szabadalmi leírásokban leírják, az erős parazitaellenes hatással rendelkező rokon természetű hatóanyagok komplexeit, az avermektineket, valamint ezek előállítását Streptomyces avermitilis törzsek így a S. avermitilis ATCC 31267, 31271 és 31272 törzsek levegőztetett fermentációjával. Az utóbbi két törzs a S. avermitilis ATCC 31267 ultraibolya besugárzás után nyert tenyészeteinek lefagyasztott, illetve fagyasztva szárított tenyészete.

Az 1987. március 18-án publikált 214,731 számú európai szabadalmi leírásban számos olyan vegyűletet írnak le (ezekre itt mint nem- természetes avermektinekre hivatkozunk), melyek hasonlóak a természetes, vagy ismert avermektinekhez, ám a 25-ös helyzetben új szubsztituens csoportot tartalmaznak. Ebben a szabadalmi leírásban megadják a fenti nem-természetes avermektinek előállítását egy avermektin-termelő mikroorganizmus bizonyos meghatározott karbonsavak, ezek származékai, illetve előanyagai jelenlétében végzett fermentációjával. Az említett új C-25- szubsztituált avermektinek termelésére használt S. avermitilis törzsek a S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 és az NCIB 12121. Az utóbbi mikrooroganizmus, melyet a 214,731 számú európai szabadalmi leírás ismertet, a S. avermitilis ATCC 31271 törzs származéka. Félszintetikus tápolajokban tenyésztve nagyobb mennyiségben termel újfajta C-25-szubsztituált avermektineket. Az ATCC 31267, 31272 és az NCIB 12121 sorszámú törzsek az új C-25- szubsztituált származékok mellett különböző mennyiségben termelhetik az ismert, vagy természetes avermektineket, ahol a 25ös helyzetben levő szubsztituens izopropil-, vagy (S)szek-butil-(l-metil-propil)-csoport.

Az avermektinek szénváza (melyet az (I) általános képletben mutatnak be) ecetsavból, illetve propionsavból, a természetes avermektinek C-25-szubsztituense pedig L-izoleucinból [R=(S)- szek-butil], vagy L-valinból (R-izopropil) származik [Fisher és Mrozik, „Macrolide Antibiotics”, Acedemic Press (1984), Ch. 14].

Az „ismert” vagy „természetes” avermektinek alatt azokat a S. avermitilis ATCC 31267, 31271 és 31272 sorszámú törzsek által termelt avermektineket értjük, ahol a 25-ös helyzetben levő szubsztituens vagy izopropil-, vagy (S)-szek-butil-(l-metil- propil)-csoport. Azokat az avermektineket, ahol a 25-ös helyzetben található szubsztituens nem izopropil- vagy szék- butilcsoport (S-forma), az alábbiakban új, vagy nem természetes avermektineknek nevezzük.

A fent említett amerikai szabadalmi leírásokban megadott S. avermitilis törzsek termelte „természetes” hatóanyag-csoportot átfogóan C-076-nak nevezik. E csoport nyolc különböző, bár közeli rokonságban levő vegyületből áll, melyeket C-076, Alá, Alb, A2a, A2b,

Bla, Blb, B2a és B2b jellel jelölnek. Az „a”-val jelölt vegyületsorozat azokat a természetes avermektineket jelenti, ahol a 25-ös helyzetben levő szubsztituens (S)szek-butil-csoport, míg a „b”-sorozat a 25-ös helyzetben izopropil-szubsztituenst tartalmazókat jelöli. Az „A”, illetve „B” megjelölés az 5-ös helyzetben metoxi-, illetve hidroxilcsoportot tartalmazó avermektinekre utal. Végül az „1” a 22-23-as helyen kettőskötést és R¹ helyében hidrogénatomot a „2” pedig a 22-es helyen hidrogénatomot, és a 23-as helyen hidroxilcsoportot tartalmazó avermektinekre vonatkozik, ahol a 22-23 helyen egyes kötés van.

A jelen leírásban nem alkalmazunk hasonló jelöléseket a nem- természetes avermektinek 25-ös helyzetben levő szubsztituenseire vonatkozóan. Az Al, A2, B1 és B2 jelöléseket a fentiekben leírt szerkezetű természetes avermektineknek megfelelő, nem-természetes avermektinek jelölésére tartjuk meg.

Elágazó szénláncú α-ketonsav-dehiderogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok előállításáról Bacillus subtilis [Willecke és Pardee, J. Bioi. Chem., 246, 5264-72. (1971)] és Pseudomonas putida esetében [Martin és munkatársai, J. Bacteriology, 115, 198-204. (1973)] már beszámoltak, Streptomyces-ek esetében azonban még nem.

Schulman és munkatársai [J. Antibiot. 38 (11), 1494-1498. (1985)] írták le a lényegében kizárólag Alá és A2a avermektin-aglikonokat termelő S. avermitilis Agly-1 mutáns törzset. Úgyszintén beszámoltak a S. avermitilis Agly-1 törzs sinefungin jelenlétében végzett fermentációjáról, melynek során B-avermektin ágiikon- komponensek megnövekedett mennyiségében termelődtek. Hasonlóan, az avermektineket jól termelő S. avermitilis 08 törzset sinefungin O-metil-transzferáz inhibitor jelenlétében fermentálva, az ágiikon C-5-ös helyzetében, és az oleandróz diszacharid-részen 0-metil-csoportot nem tartalmazó avermektinek termelődtek.

A 4,378,353 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik a C-076-tal rokon vegyületeket, valamint azok előállítását a S. avermitilis ATCC 31272 törzsből ultribolya besugárzással nyert MA-5218 jelű mutáns törzs tenyésztésével. A mutáns az ATCC 31780 azonosító számot kapta. A nevezett mutáns által termelt, C-076-tal rokon vegyületekből hiányzik a C-076 furán-gyűrűje. Továbbá, az ismertetett vegyületek közül néhányban az egyik, vagy mindkét oleandróz cukkorrész felhasadt, míg másokban az 5-ös helyzetben levő csoport ketoncsoporttá oxidálódott.

O-metil-csoportot nem tartalmazó avermektineket termelő S. avermitilis O-metil-transzferáz-mutánsok három osztályáról számoltak be Ruby és munkatársai [6th International Symposium on the „Biology of Actinomycetes”, Debrecen, Hungary, August 2630.(1985)], és Schuman és munkatársai [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 744-747. (1987)]. Az első mutáns osztály elsősorban B-avermektineket termel, mivel nem képesek a makrociklusos lakton-gyűrű C-5-ös hidroxilcsoportjának metilálására. A második

HU 203 130 Β osztály a demetil-avermektineknek nevezett, 3’-0,3”O-bisz-demetil-avermektineket termeli (ezek olyan avermektinek, ahol mindkét oleandróz monoszaccharid-maradék 3-as helyzetében hiányzik az O-metilszubsztituens). A harmadik osztályba tartozó mutánsok egyetlen helyen sem tudják metilálni az alapvegyületet.

Sculman és munkatársai [Fed. Proc., 44, 931. (1985)] megnóvekedett B-avermektin-termelést írnak le a S. avermitilis olyan anyagok jelenlétében végzett fermentációjával, mint a sinefungin, az S-adenozil-ationin és az S-adenozil-homocisztein, melyek gátolják az aglikon-rész C-5-ös hidroxilcsoportjának az avermektin-B-O-metil-transzferáz által katalizált metilálását. O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező, és avermektin-B komponenseket megnövekedett menynyiségben termelő Streptomyces avermitilis mutánsokra hivatkoznak Schulman és munkatársai az Antimicrobial Agents and Chemotharapy, 29,620-624. (1986) folyóiratban megjelent közleményükben is.

A S. avennitilis törzs sejtjeit mutagenizálva, elágazó láncú 2- oxosav-dehidrogenáz- vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsokat kapunk. Az így előállított, egyszeresen blokkolt mutánsok mutagenezise sem elágazó láncú 2oxosav-dehidrogenáz-, sem elágazó láncú aminosavtranszmináz-aktivitással nem rendelkező mutánsokhoz vezet. A mutánsok többé nem képesek lényeges menynyiségben természetes avermektinek előállítására kívülről adott RCOOH általános képletű vegyületek hiányában, ahol az R izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoport, vagy olyan vegyületek hiányában, melyek RCOOH általános képletű vegyületekké képesek alakulni a fermentációs folyamat során. Meglepő és váratlan módon azonban a mutánsok természetes, és nem-természetes avermektineket termelnek, ha a fermentációt kívülről hozzáadott RCOOH általános képletű vegyületek jelenlétében, illetve az ilyen RCOOH általános képletű vegyületek előanyagai jelenlétében végezzük, ahol is az R izopropil- vagy (S)-szek-butil-, vagy az in leírt más csoport. Még meglepőbb, hogy az itt leírt, mindössze az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással nem rendelkező, és így az Lizoleucin vagy az L-valin lebontására képtelen mutánsok képesek a vegyületek széles skáláját bevonni az avermektin bioszintézisébe, természetes avermektinektől mentes, nem-természetes avermektineket termelve.

Legalább ilyen meglepő az is, hogy az itt leírt, elágazó láncú amionosav-transzaminázzal nem rendelkező mutánsok, melyek képtelenek az L-izoleucin, az L-valin vagy az L-leucin lebontására, és ezt a három aminosavat igénylik is növekedésükhöz, szintén képesek más vegyületek beépítésével természetes avennektinektől mentes, nem-természetes avermektineket termelni.

A természetes avermektinek nyolc különböző, de közeli rokonságban álló vegyület összetett keverékeként termelődnek; lásd az (I) általános képletet, ahol R-izopropil-, és (S)-szek-butil-csoport. Habár lényegében tisztán kinyerhetők (lásd a 4,429,042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), a módszer legjobb esetben is munkaigényes. A 214,731 számú európai szabadalmi leírásban közöltek szerint eljárva, a nem-természetes avermektinek termelése során különböző mennyiségben néhány természetes avermektin is termelődik, mivel a nem-természetes avermektinek előállítására használt S. avermitilis mikroorganizmus sejtjeiben az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz, valamint az L-valin és az L-izoleucin aminosavak is jelen vannak.

A termékek számának, illetve komplexitásának a minimumra való csökkentése, illetve egy adott avermektin tisztaságának növelése érdekében kívánatos, hogy választhassunk a természetes vagy a nem-természetes avermektinek termelése között.

Elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzseket avermektin-termelő S. avermitilis törzsek, elsősorban a S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272, vagy az NCIB 12121 mutagenezisével állítunk elő. Az említett deficiens törzsek egyikének vagy másikának további mutagenezise mindkét aktivitást nélkülöző törzseket eredményez. A mutánsok nem képesek természetes avermektinek szintézésére, kivéve, ha fermentációs táptalajuk izopropil- vagy szek-butil-(S-forma)-csoportot hordozó zsírsavat, vagy annak előanyagát tartalmazza. A mutánsok képesek természetes vagy nem-természetes avermektinek termelésére, ha fermentációjukat levegőztetett körülmények között, vizes közegben, a megfelelő primer savat, vagy a fermentáció során ez utóbbivá átalakulni képes vegyületet tartalmazó táptalajban végezzük.

Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitás hiányával jellemezhető mutánsokat a mutagenizált telepek közül ¹⁴CO₂ teszt alapján választjuk ki. Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitás hiányát jelzi a módszer szerint az, hogy a permeábilissá tett telepek nem fejlesztenek C¹⁴ jelzett szén-dioxidot [¹⁴Cl]-2oxo-izokapronsav vagy [¹⁴C-l]-2-oxo-3-metil-valeriánsav vagy [¹⁴C-l]-2-oxo-3-metil-vajsav szubsztrátból.

A mutagenizált telepek közül annak alapján választjuk ki az aminosav-transzamináz-aktivitás hiányával jellemezhető mutánsokat, hogy ezek nem képesek Lizoleucin-, L-leucin- és L-valin-mentes táptalajokon növekedni. A gyakorlatban a glükózt és sókat tartalmazó, a kazaminsavban megtalálható minden egyes aminosavval kiegészített agar táptalajon növő egyedi telepeket L-izoleucin-, L-leucin- és L-valin-mentes, egyébként azonos összetételű táptalajra visszük át. Az itt leírt kizárólag az elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok az avermektinek termeléséhez előanyagként el tudják használni a 2-oxosavakat.

Meglepő és váratlan, hogy az itt leírt, az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- és/vagy az elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok megtartják avermektin-, elsősorban pedig nem-természetes avermektin- termelő képességüket. A

HU 203 130 Β természetes zsírsav-acil-koenzim A- származékok képzésének hiánya a szokásos táptalajokon letális mutációt eredményezhetne, ha a membrán épsége a nevezett származékoktól függ; vagy, ha a 2-oxosavak felhalmozódása az előbbi mutánsban citotoxikus hatású. Továbbá, egyik mutánstól sem lenne elvárható, hogy az L-izoleucin vagy az L-valin lebontásának eredményeként acetil-CoA-t és propionil-CoA-t legyen képes előállítani, mivel ez a mutánsokban hiányzó enzimaktivitást kívánná meg. Mivel ezek az acil-CoA-származékok, amint azt fentebb már jeleztük, szükségesek az avermektin bioszintéziséhez, feltételezhető, hogy a muténsok nem-természetes avermektin termelése súlyosan sérült. Meglepetésre, nem ez a helyzet.

Az itt leírt mutánsokban az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- aktivitás hiánya megakadályozza az elágazó láncú zsírsav-acil-CoA szintézisét az L-izoleucin, az L-leucin és az L-valin lebontási termékeiből, így meggátolja a természetes avermektinek szintézisét. Hasonló módon, az elágazó láncú aminosav- transzamináz-negatív S. avermitilis mutánsokban is hiányzik az elágazó láncú zsírsav-acil-CoA szintézis, és így a természetes avermektinek szintézisére is képtelenek. A zsírsav-acil-CoA hiánya két okra vezethető vissza. Először: az ilyen, transzamináz-negatív mutánsok nem tudnak elágazó láncú 2- oxosavakat szintetizálni a táptalajból származó izoleucinból, leucinból és valinból a szokásos transzaminációs reakcióval. Másodszor: ezekben a transzamináz-mutánsokban az elágazó láncú

2-oxosavaknak a sejt elágazó láncú aminosav-bioszintézis útján való keletkezését meggátolja az, hogy a fermentációs táptalaj ezeket az aminosavakat szükségszerűen tartalmazza. A fenti aminosavak, mint az anyagcsere-út végtermékei, a jól ismert enzim-represszió, és feed-back gátlás útján megakadályozzák ezen bioszintetikus út működését (és a 2-oxosav köztestermékek termelését). Az aktív, elágazó láncú 2-oxosavak hiánya hathatósan gátolja az elágazó láncú zsírsav-acil-CoA zsírsav-acil-CoA szintézist.

A jelen találmány tárgya tehát eljárás a fenti 2-oxosav- dehidrogenáz-negatív, illetve transzamináz-negatív mutánsok, valamint az elágazó láncú tmaszamináznegatív és 2-oxosav-dehidrogenáz-negatív mutációkat együttesen hordozó mutánsok felhasználására.

Az „avermektin” vagy „avermektinek” megnevezés a továbbiakban az (I) általános képlet szerinti vegyületekre vonatkozik, ahol a 25-ös helyzetben található szubsztituens (R) az álábbiakban ismertetésre kerülő csoportok valamelyike lehet.

Az itt leírt mutánsok különösen értékesek a nemtermészetes avermektinek termelése szempontjából, az alábbiakban részletezett, és példákkal szemléltetett eljárásokban. Különösen alkalmasak bizonyos preferált avermektinek, így olyan vegyületek előállítására, ahol a C-25 szubsztituense 4-6 szénatomos cikloalkil- vagy cikloakenilcsoport, esetleg egy vagy két 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituálva; l-(metil-tio)-etilcsoport, vagy egy 5- vagy 6-tagú, egy oxigén- vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos csoport, így 3-tienil- vagy 3-furil-csoport.

A Streptomyces avermitilis faj avermektin-teimelő törzseinek mutagén kezelését az ismert eljárásokat követve, bármely mutagén ágenst felhasználhatva végezhetjük, illetve az ultraibolya- és röntgen-besugárzást alkalmazhatunk a mutagén ágensek közül az N-metilN’-nitro-N-nitrozóguanidinnal, az etil-metán-szulfonáttal, salétromossavval és a nitrogénmustárokkal, például az N-metil-bisz(2-klór-etil)aminnal vagy más, hasonló anyagokkal végezhetünk kezeléseket. A mutagén kezelést a természetes avermektinek termelésére képes S. avermitilis törzsek, például a S. avermitilis ATCXC 31272 spóráin, vagy vegetatív tenyészetein végezhetjük el.

A követekző eljárások jól ismertek a szakemberek előtt. A mutagenizált telepek közül olyan biokémiai vizsgálati módszer alapján választjuk ki az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz- hiányos mutánsokat, amely nagyszámú, random módon mutagenizált baktériumtelep [¹⁴C-l]-2-oxosavakból történő ¹⁴CO₂-fejlesztésének vizsgálatát teszi lehetővé [Tábor és munkatársai, J, Bact., 128, 485-486. (1976)],

A módszer szerint a mutáns telepeket mikroliter lemezek lyukaiban, megfelelő táptalajban, növesztjük, permeábilissá tesszük a sejteket toluollal, és [^,4C-1]2-oxosavat [például 2-oxo-izokapronsavat] adunk minden lyukba, majd a tenyészet feletti levegőrétegben vizsgáljuk a ¹⁴CC>2 jelenlétét. A [¹⁴C-l]-2-oxo-izokapronsav helyett [¹⁴C-l]-2-oxo-3-metil-valeriánsavat vagy [¹⁴C-l]-2- οχο-3-metil-butirilsavat is használhatunk. A ¹⁴CO₂ termelését kényelmesen ellenőrizhetjük a felszabaduló ¹⁴CC>2 elnyelését szolgáló, bárium-hidroxiddal telített, nedves szűrőpapírt helyezve az egyes lyukak fölé: az esetleg keletkezett, jelzett bárium-karbonát autoradiográfiával kimutatható. Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással nem rendelkező mutánsok autoradiogramja közelítőleg megegyezik a vak kontroliéval, azaz a mutánsokból nem kapunk jelzett bárium- karbonátot.

Az így nyert mutánsokat újabb mutagén kezelésnek vetjük alá, bármely fent említett mutagén ágens felhasználásával. Az elágazó láncú aminosav-transzferázaktivitással nem rendelkező mutánsokat a mutagenizált telepek közül úgy választjuk ki, hogy ezek a mutánsok nem képesek M9/glükóz jelű minimál táptalajon növekedni, hacsak a táptalaj nem tartalmaz L-izoleucint, L-leucint és L-valint (ILV). Mindhárom aminosavra szükség van ahhoz, hogy a növekedés meginduljon. Kimutatható továbbá, hogy az említett transzamináz-negatív mutánsok nem növekednek a transzamináz-reakciók szubsztrátjaként szolgáló, mindhárom ketosavval kiegészített táptalajon. Mindhárom ketosav (2-oxo-3-metil-valeriánsav, 2-oxo-izokapronsav, 2-oxo-izovaleriánsav) transzaminációját, tehát egyetlen transzamináz enzim katalizálja. Különösen érdekesek a kétszeresen blokkolt, sem az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz, sem az elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok, hiszen természetes avermektineket termelő tenyészetekké való visszaalakulásuk valószínűsége igen kicsi. Az egyszeresen blokkolt mutánsok bizo-41

HU 203 130 Β nyos körülmények között természetes avermektineket termelő tenyészetekké alakulhatnak vissza.

Egy adott mikroorganizmus törzs kívánt alléljának mutagenezissel való előállításán túl, egy más törzsben előállított, vagy azonosított kívánatos alléit protoplaszt fúzióval is bevihetünk az adott törzs kromoszómájába. Például, egy sem elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz, sem elágazó láncú aminosavtranszamináz- aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzs és egy, mindkét előbbi aktivitással rendelkező S. avermitilis törzs protoplasztjainak fúziójával olyan S. avermitilis törzset hozhatunk létre, melynek csak az elágazó láncú aminosav- transzamináz aktivitása hiányzik. Amint azt az e tárgyban járatos szakemberek jól tudják, a protoplaszt fúziós eljárás lehetővé teszi a különböző vonalakon kiválasztott, kívánatos allétok egyetlen törzsben való kombinációját. Az itt leírt S. avermitilis JC923 (ATCC 53669), elágazó láncú aminosav-transzamináz-hiányos törzs is e módszer terméke.

A találmány szerinti mutánsok morfológiai és tenyésztési jellemzői lényegében megegyeznek a 4,429,042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban foglaltakkal. A jelen találmány szerinti mutánsok megkülönböztető jellemzője az itt leírtak szerint meghatározott, elágazó láncú 2-oxosav- dehidrogenáz- és/vagy az elágazó láncú aminosav-transzamináz- aktivitás hiánya. Az említett aktivitások hiánya ahhoz vezet, hogy e mutánsok az RCOOH általános képletű zsírsavaktól [ahol az R izopropil- vagy (S)szek-butil-csoport], vagy a fermentáció során ilyen RCOOH általános képletű zsírsavakká általakítható vegyületektől lényegében mentes, definiált táptalajban növekedve nem képesek természetes avermektinek bioszintézisére. Az American Type Culture Collection által vezetett rendszertani vizsgálatok megerősítették, hogy a fenti ^1XCO₂ vizsgálat alapján kiválasztott 1-3 és HL-026 mutáns törzsek közeli rokonságban állnak a 4,429,042 számú amerikai szabadalmi leírásban megadott ATCC 31272 szülőtörzzsel, azonban néhány különbség itt megállapítható. így az 1-3 (ATCC 53567) törzs lényegesen kevesebb spóraláncot fejleszt, mint az ATCC 31272, a HL-026 (ATCC 53568) mutáns törzs pedig gyakorlatilag nem fejleszt légmicéliumot és spórákat, ám az az igen kevés spóralánc, amely létrejön, hasonlójellegű az ATCC 31272 spóraláncaihoz.

A HL-026 mutáns törzs további jellegzetessége, hogy a másik két törzsnél kevesebb melanin pigmentet termel, és egyedülálló módon egyáltalán nem termeli ezt a pigmentet tirozin-tartalmú agaron. Végül, a 4,429,042 számú amerikai szabadalmi leírásban az ATCC 31272 törzsre megadott leírással ellentétben, nem volt kimutatható a mutánsok vagy az ATCC 31272 törzs növekedése szacharózt egyedüli szénforrásként tartalmazó táptalajon. Az 1-3 és a HL-026 mutánsok csak az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással nem rendelkeznek. Az 1-3 (ATCC 53567) mutáns törzs további mutagenezisével nyert, kétszeresen hiánymutáns PGS-119 (ATCC 53670) törsz, illetve a protoplaszt-fuzióval előállított JC-923 (ATCC 53669) törzs rendszertanilag hasonló viszonyban van az ATCC 31272 törzzsel, mint az 1-3 mutáns törzs.

A Streptomyces avermitilis 1-3, HL-026, PGS-119 és JC-923 törzseket a Budapesti Szerződéssel összhangban, a Maryland-i Rockville-ban, az American Type Culture Colletion törzsgyűjteményében helyeztük letétbe; ez az elismert gyűjtemény biztosítja a letétek állandóságát, és a szabadalmi jogok elnyerése után a közönség számára való gyors hozzáférhetőséget. A fenti törzsek a Streptomyces avermitilis ATCC 53567, 53568, 53670 és 53669 sorszámot kapták.

A szabadalom elbírálásának ideje alatt a letét csak az United States Patent and Trademark Office megbízottja által fejogosított személyek számára férhetőhozzá, a 37 CFR 1.14 és 35 USC 122 szerint, és azon országok szabadalmi jogszabályaival összehangban, ahol ezen szabadalom megfelelőit vagy utódait benyújtják. A letétbe helyezett mikroorganizmusok hozzáférhetőségét érintő valamennyi korlátozás végérvényesen megszűnik a szabadalmi védettség megszerzésével.

A S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 és NCIB 12121 törzsek mindegyike termeli az (I) általános képlet szerinti természetes avermektineket, ahol a 22-23-as-helyzetben levő szaggatott vonal az esetleges kettőskötést jelenti; a kettőskötés hiányában R¹ hidroxilcsoportot egyébként hidrogénatomot jelent R² a (Π) képletű 4’-(a-L-oleandrozil)a-L-oleandrozil-oxicsoportot; R³ hidrogénatomot vagy metilcsoportot; és ahol R izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoprotot jelent.

A 4,285,963 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy olyan, (I) általános képletű avermektint ismertetnek, ahol a 25-ös helyzetben egy metil- vagy egy etilcsoport található, az R* hidroxil-, az R³ pedig metilcsoport.

Az itt leírt, nem-természetes avermektinekben R az alábbiakban meghatározott, izopropil- vagy (S)-szekbutil-csoporttól különböző szubsztituens.

Az (I) általános képletű vegyületek bioszintéziséhez nélkülözhetetlen vegyületek a S. avermitilis sejtekben találhatók meg. Ezek, vagyis az L-valin, az L-leucin és az L-izoleucin, jelenlegi ismereteink szerint az avermektinek bioszintézisébe lépve 2-oxosavakká alakulnak, majd az oxosavakat az elágazó láncú 2-oxosavdehidrogenáz dekarboxilálja, és ezzel párhuzamosan a terméket koenzim-A-hoz kapcsolja. Jelenlétük magyarázza az (I) általános képletű izopropil- és ^-szekbutil- vegyületek egyidejű termelését. Ez'síermészetesen felveti az izopropil-származékoknakaaz (S)szek-butil-származékoktól való elválasztásának problémáját.

Amikor a találmány szerinti mutánsokat a megfelelő primer vegyületeket is tartalmazó táptalajban fermentáljuk, a mutánsok egy (I) általános képletű vegyületet, vagy leggyakrabban két vagy több (I) általános képletű vegyület keverékét termelik, ahol

R a felhasznált primer vegyületnek felel meg.

Legfeljebb négy tennék képződhet, melyeket a 4,429,042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megadott jelölések felhasználásával egyszerűen R-avermektin-Al, A2, Bl, B2-nek neve5

HU 203 130 Β zünk. Az „R” csoport természetesen a 25-ös helyzetben található szubsztituenst jelöli. Például, amikor az R ciklopentilcsoport, a négy lehetséges avermektin a következő:

Köznapi név	R1	R3
ciklopentil-avermektin Al	hidrogénatom	metilcsoport
ciklopentil-avermektin A2	hidroxilcsoport	metilcsoport
ciklopentil-avermektin B1	hidrogénatom	hidrogénatom
ciklopentil-avermektin B2	hidroxilcsoport	hidrogénatom

A nem-természetes avermektinekben az (I) általános képlet szerinti C-25-ös szubsztituens az izopropilvagy (S)-szek-butil- csoporttól különböző csoport.

A kettőskötést igen, hidroxilcsoportot nem tartalmazó, (I) általános képletű vegyületeket a megfelelő, kettőskötést nem, R¹ csoportként pedig hidroxilcsoportot tartalmazó (I) általános képlet szerinti vegyületekből is előállíthatjuk dehidratálással. A reakciót úgy végezzük, hogy először szelektíven védjük (például terc-butil-dimetil-szililoxi-acetil- származékká alakítva) az 5-ös és 4”-es helyzetben levő hidroxilcsoportokat, a szelektíven védett vegyületet reagáltatjuk egy szubsztituált tiokarbonil-halogeniddel, például (4-metil-fenoxi)-tiokarbonil-kloriddal, majd magas forráspontú oldószerben, például triklór-benzolban hevítjük, hogy a dehidratáció végbemehessen. Végül pedig a reakciótermékről eltávolítva a védőcsoportokat, a telítetlen vegyületet nyerjük. A fenti lépéseket, a megfelelő reagenseket és a reakciókörülményeket a 4,328,335 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban adják meg.

Azokat az (I) általános képletű vegyületeket, ahol az R³ hidrogénatom, úgyszintén előállíthatjuk a megfeleleő, R³ csoportként metilcsoportot hordozó vegyületek demetilálásával. A reakciót úgy végezzük, hogy az 5-metoxi-vegyületet, vagy annak megfelelően védett származékát higany-acetáttal kezeljük, és a kapott 5-acetoxi-enol-étert híg savval hidrolizáljuk, 5-ketovegyületet nyerve. Ezt azután, például nátrium-bórhidriddel redukálva kapjuk az 5-hidroxi-származékot. Az egyes lépésekhez szükséges reagenseket, illetve a reakciókörülményeket a 4,423,209 számú amerikai egyesült állmokbeli szabadalmi leírásban találjuk meg.

Az R' csoportként hidrogénatomot, kettőskötést pedig nem tartalmazó (I) általános képletű vegyületeket a megfelelő, kettőskötést tartalmazó vegyületból alkalmas katalizátorral végzett szelektív, katalitikus hidrogénezéssel állíthatjuk elő. A redukciót például trisz(trifenil-foszfin)-ródium(I)-kloriddal végezhetjük, amint azt a 0,001,689 számú európai szabadalmi leírásban, illetve az ennek megfelelő, 1980. április 22-én benyújtott 4,199,569 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olvashatjuk.

Az R² csoportként hidrogénatomot tartalmazó, (I) általános képletű vegyületeket a megfelelő, R² csoportként 4’- (a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoportot tartalmazó vegyületekből állítjuk elő úgy, hogy a 4’- (a-L-oleandrozil)-a-L-oleandróz-csoportot vizes, szerves oldószerben, mérsékelt savas hidrolízissel eltávolítjuk, a kapott, a 13-as helyzetben hidroxilcsoportot tartalmazó aglikont pedig, például benzil-szulfonilhalogeniddel halogénezzük. A nyert 13-dezoxi-13- halogenid-származékot végül szelektív módon, például tributil- ónhidriddel redukáljuk. A nem-kívánatos mellékreakciók elkerülésére célszerű az esetleg jelenlevő összes többi hidroxilcsoportot, például tercier-butil-dimetil-szilil-csoporttal védeni. A védőcsoport(oka)t a halogénezési vagy a redukciós lépés után nyomnyi mennyiségű savat tartalmazó metanollal könnyen eltávolíthatjuk, Mindezeket a lépéseket a megfelelő reagensekkel és a reakciókörülményekkel együtt a 0,002,615 számú európai szabadalmi leírásban megtaláljuk.

A találmány szerinti S. avermitilis a természetes- és nem- természetes avermektinek bioszintézisére az RCOOH általános képletű, valamint a fermentáció során ezekké átalakítható vegyületeket képes felhasználni. Az ilyen vegyületekre, mint „primer vegyületekre” utalunk. Az R-COOH általános képletben R a-helyzetben elágazó láncú csoport, melyben a karboxilcsoporthoz kapcsolódó szénatom legalább két további, a hidrogéntől különböző atomhoz, illetve csoporthoz kapcsolódik. Ez a meghatározás felölel telített és telítetlen, aciklikus és ciklikus csoportokat, ideértve az aciklikus lánc, vagy a ciklikus gyűrű tagjaként esetleg egy kén- vagy oxigén-heteroatomot tartalmazó csoportokat.

Részletesebben, C-25-ös szubsztituensként szereplő R csoport a következő lehet: valamely a-helyzetben elágazó 3-6 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos alkenil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, 2-6 szénatomos alkil-, vagy 1-4 szénatomos alkiltio-, 2-6 szénatomos alkilcsoport; 3-8 szénatomos cikloalkil- vagy 5-8 szénatomos cikloalkenilcsoport, melyek adott esetben egy metilén- vagy egy vagy két 1-4 szénatomos alkilcsoporttal vagy halogénatommal szubsztituáltak; vagy

3-6-tagú, egy oxigén- vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos csoport, mely telített, részlegesen vagy teljesen telítetlen, és adott esetben egy 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált lehet.

A fermentáció során RCOOH általános képletű vegyületekké átalakítható anyagok, vagyis az főanyagok az alábbi általános képlettel jellemezhetők:

R-(CH₂)»-Z, ahol

R a fentiek szerint meghatározott csoport, n értéke 0, 2, 4 vagy 6;

Z jelentése -CH2OH, -CHO, -CH2NH2, -COOR⁵ vagy -CONHR⁶, ahol . R⁵ hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport;

R⁶ hidrogénatom, 1—4 szénatomos alkilcsoport, vagy egy aminosav-maradék, így aszparagin-61

HU 203 130 Β sav, glutaminsav vágj' metionin- maradék, azaz -CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH)(CH2)2COOH vagy -CH(COOH)(CH2)2 SCH3-csoport.

A csak elágazó láncú aminosav-transzamináz-hiányos S. avermitilis törzseknél a 2-oxosavak szintén előanyagul szolgálnak. így a fenti S. avermitilis törzseknél az avermektinek bioszintézisében az alábbi általános képletű savak is hasznosulhatnak:

R-CO-Z, ahol

R és Z a fenti meghatározások szerinti csoport.

A találmány szerinti eljárás kivitelezésekor levegőztetett körülmények között fermentálunk az elágazó láncú 2-oxosav- dehidrogenáz-aktivitással, és/vagy elágazó láncú aminosav- traszamináz-aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzzsel, felhasználható nitrogén- és szénforrást, szervetlen sókat, valamint az RCOOH általános képletű vegy ületeket, vagy az ilyen vegyületekké a fermentáció során átalakulni képes vegyületeket (előanyagokat) tartalmazó, vizes táptalajban. A savat vagy a savvá átalakítható vegyületet akár a beoltáskor, akár a fermentáció során bizonyos időközönként adhatjuk hozzá a fermentléhez. A transzamináz-negatív mutánsokat használva, a táptalajnak Lizoleucint, L-leucint és L-valint is tartalmaznia kell, hogy a mutáns növekedhessen. Az avermektinek termelését a fermentléből vett minták szerves oldószerrel való extrahálása után, például nagynyomású folyadékkromatográfia alkalmazásával, a terméknek a kromatogramon való megjelenése alapján ellenőrizhetjük. Az inkubációt addig folytatjuk, mig a maximális termelést el nem érjük; ez átalában 4-től 15 napig terjedő időszakot jelent.

A primer vegyület (karbonsavak, illetve a karbonsavakká alakítható vegyületek) előnyös mennyisége valamennyi adagoláskor 0,05 és 3,0 gramm/liter között van. A primer vegyületet akár folyamatosan, akár szakaszosan, akár egyszerre adhatjuk a fermentléhez. A savat (RCOOH) akár savként, akár nátrium-, lítiumvagy ammónium-sóként, akár a fentiek szerint meghatározott, savvá átalakuló vegyületként adagoljuk. Amennyiben a sav szilárd anyag, célszerű megfelelő oldószerben, például vízben, vagy 1-4 szénatmos alkoholban feloldani.

A fermentációhoz használt táptalaj, különösen, ha C-25- szubsztituensként izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoportot várunk, felhasználható szén-, nitrogén- és nyomelem-forrást tartalmazó, szokásos táptalaj lehet. Ha C-25-szubsztituensként nem-természetes csoportot, vagyis nem izopropil-vagy (S)-szek- butil-csoportot választunk, akkor a fermentációs táptalajhoz kiválasztott összetevők nem, vagy csak minimális mennyiségben tartalmazhatják azokat a primer vegyületeket, ahol R izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoport.

Néhány napos, 24-33 °C hőmérsékleten végzett fermentáció után a ferment levet centrifugáljuk vagy szűrjük, a micéliumot pedig előnyösen acetonnal vagy metanollal extraháljuk. Az oldószeres extraktumot betöményítjük, és a kívánt terméket vízzel nem elegyedő, szerves oldószerbe, például metilén-kloridba, etilacetátba, kloroformba, butanolba vagy metil-izobutilketonba extraháljuk át. Az oldószeres extraktumot betöményítjük, és a nyersterméket szükség szerint kromatográfiával, például preparatív, fordított fázisú, nagynyomású folyadék- kromatográfiával tovább tisztítjuk.

A termék rendszerint az (I) általános képletű vegyületek keveréke, ahol

R² 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandroziloxi-csoport,

R¹ hidroxilcsoport, és a kettőskötés hiányzik, vagy pedig R¹ hidrogénatom és a kettőskötés van jelen, továbbá

R³ hidrogénatom vagy metilcsoport.

A komponensek aránya azonban függ az adott mutánstól és a primer vegyülettől, valamint az alkalmazott feltételektől is.

Az R csoport eredete, vagyis, hogy közvetlenül az RCOOH általános képletű vegyületből, vagy a fenti előanyagok egyikéből, vagy bármely más előanyagból származik, lényegtelen az avermektinek termelése szempontjából. A találmány szerinti, az avermektinek termelésére szolgáló eljárás lényegi követelménye, hogy a kívánt R csoportot a találmány szerinti S. avermitilis törzsek számára hozzáférhetővé tegyük a fermentáció során.

Az alkalmas vegyületek például a következők:

2.3- dimetil-vajsav,

2-metil-hexánsav,

2-metil-pent-4-énsav,

2- ciklopropil-propionsav,

4.4- difluor-cilohexán-karbonsav, lítium-só,

4-metilén-ciklohexán-karbonsav,

3- metil-cilohexán-karbonsav (cisz/transz),

-cilopentén-karbonsav,

-ciklohexén-karbonsav, tetrahidro-pirán-4-karbonsav, tiofén-2-kaibonsav,

3-furánsav, ciklobután-karbonsav, ciklopentán-karabonsav, ciklohexán-karbonsav, cikloheptán-karbonsav,

2-metil-ciklopropán-karbonsav,

-ciklohexén-1 -karbonsav,

2- (metil-tio)-propionsav, tiofén-3-karbonsav, ^:í hidroxi-metil-ciklopentán,

3- tiofén-karbaldehid,

3-ciklohexil-propionsav

3-ciklohexil-propionsav,

3-ciklopentil-propÍonsav, hidroxi-metil-ciklobután, tetrahidro-tiofén-3-karbonsav,

-ciklopentil-1 -propanol, 3-metil-ciklobután-karbonsav, lítium-só, 3-fluor-ciklobután-karbonsav, 3-metilén-ciklobután-karbonsav, lítium-só, tetrahidro-tiopirán-4-karbonsav, ciklobutil-metil-amin,

HU 203 130 Β ciklobután-karbonsav-etilészter,

4-hidroxi-metil-ciklopentán,

2-(3-tiofén-karbonil)-propionsav-etil-észter, (S)-2-metil-pentánsav, (R)-2-metil-pentánsav.

O-metil-transzferáz mutánsokat nyerhetünk az itt leírt elágozó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-negatív és/vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-negatív mutánsokból. Az elágazó láncú 2- oxosav-dehidrogenáz-aktivitás és/vagy az elágazó láncú aminosav- transzamináz-aktivitás negatív mutáció valamint az egyik vagy mindkét O-metil-transzferáz mutáció kombinálásával olyan S. avermitilis törzseket kapunk, melyeket RCOOH általános képletű vegyületek, vagy a fermentáció során RCOOH általános képletű vegyületekké átalakuló anyagok jelenlétében fermentálva, elsősorban B-avermektinek, demetil-avermektinek vagy demetilavermektin-B vegyületek termelődnek. Ezeket a mutánsokat az itt leírt, elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-aktivitással és/vagy elágazó láncú aminosavtranszamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsokból mutagenezissel nyerjük, ultraibolya besugárzás és/vagy kémiai mutagének, mint az N-metil-N-nitrozó-uretán, nitrozó-guanidin, etil-metán-szulfonát vagy a fentebb már felsorolt hatóanyagok alkalmazásával. Másképpen, az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenázpozitív, és/vagy az elágazó láncú aminosav-transzamináz-pozitív, az egyik vagy mindkét O-metil-transzferázt nélkülöző mutánsokból ultraibolya fénnyel vagy mutagén ágenssel végzett mutagén kezeléssel állítjuk elő az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-negatív és/vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-negatív mutánsokat.

Az ilyen mutánsok termelte, nem-természetes avermektinekre az aglikon-rész C-5-ös helyzetében és/vagy az oleandróz-rész C-3’- és/vagy C-3-helyzetében található hidroxilcsoportok jellemzők.

A fentebb leírt mutánsokat Schulman és munkatársai módszere [Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 29, 620-624. (1986)] alapján azonosítjuk. A termékek ugyanazokra a célokra, és ugyanolyan módon használhatók, mint az ismert avermektinek.

Más módon, a B. avermektineket, ideértve az oleandróz diszacharid-részen metilcsoportokat nem tartalmazó B. avermektineket, nagyobb mennyiségben a találmány szerinti, elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz-, és/vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz-aktivitással nem rendelkező mutánsok O-metil-transzferáz-gátlók, például sinefungin, S-andenozil- etionon, vagy S-adenozil-homocisztein jelenlétében végzett tenyésztésével állítjuk elő.

A találmány szerinti vegyületek erős perazitaellenes hatóanyagok, melyek elsősorban féregirtószerként, ektoparaziticidként, inszekticidként és akaricidként használhatók.

Hatékonyak e vegyületek a különböző, endoparaziták okozta kóros állapotok kezelésekor, különösen a sertéseket, juhokat, lovakat és szarvasmarhákat, valamint az egyéb háziállatokat és a baromfikat megtámadó, súlyos gazdasági veszteségekhez vezető helmint8 hiasis esetében, melyet leggyakrabban a nematodák közé tartozó parazita férgek egy csoportja okoz. A találmány szerinti vegyületek, más különféle állatfajokat megtámadó nematódákkal szemben is hatásosak. így például hatékonyak a kutyákban előforduló Dirofilaria fejokkal, továbbá az embereket is megfertőző különféle parazitákkal, vagyis a gasztointesztinális rendszer parazitáival, mint az Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trinchinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius fajokkal, valamint a vérben vagy más szövetekben és szervekben található parazitákkal, mint a Filaria fajokkal, és az extraintesztinális fejlődési szakaszban levő Strongyloides és Trichinella fajokkal szemben.

A találmány szerinti vegyületek az ektoparazita-fertőzések kezelésében is értékesek, különösen az állati-, és madár- ektoparazita ízeltlábúak, mint a kullancsok, atkák, tetvek, bolhák, dongók, egyéb szúró-csípő rovarok, valamint a vándorló diptera lárvák ellen, melyek a szarvasmarhákat és a lovakat támadhatják meg.

A találmány szerinti vegyületek inszekticidként a háztartási kártevők, például a svábbogár, a ruhamoly, a múzeumbogár és a házilégy, valamint a tárolt gabona, illetve a mezőgazdasági növények rovarkártevői, például a pókatkák, a levéltetvek és a hernyók, valamint a vándorló egyenesszárnyúak, például a sáskák ellen is hatásosak.

Az (I) általános képletű vegyületeket a várható felhasználástól, az adott, kezelendő háziállat fajtájától, illetve az illető parazitától, vagy rovartól függő legcélszerűbb kiszerelésben adagoljuk. Féregellenes szerként szájon át kapszula, bólusz, tabletta vagy folyadék formájában; vagy esetleg injekcióként vagy implantálva adagoljuk. Az ilyen készítményeket a szokásos módon, az általános állatorvosi gyakorlattal összhangban készítjük. így a kapszulák, bóluszok vagy tabletták elkészítésekor megfelelő, finoman eloszlatott, dezintegráló- és/vagy kötőanyagot, például keményítőt, laktózt, zsírkövet, magnézium-sztearátot vagy más, hasonló anyagot tartalmazó töltelék- vagy hordozóanyaggal keverjük el a hatóanyagot. A folyadék-készítmények előállításakor a hatóanyagot vizes oldatban, diszpergáló- vagy nedvesítőszerek jelenlétében diszpergáljuk; az injekciókat pedig egyéb anyagokat - például a vérrel izotónikus oldat elkészítéséhez szükséges mennyiségű sókat, vagy glükózt - tartalmazó steril oldat formájában készítjük. A kiszerelés változhat a hatóanyag mennyiségére való tekintettel; a kezelendő háziállat fajától, testtömegétől, az infekció súlyosságától illetve típusától függően. Általában szájon át adagolva, a testtömeg- kilogrammonkénti 0,001-10 mg-os, egyszeri vagy 1-5 napig terjedő időszakra elosztott dózis kielégítő, de természetesen kivételes esetekben magasabbb vagy alacsonyabb dózis alkalmazása is szükséges lehet, ez azonban a találmány oltalmi körét nem érinti.

. A találmány egy másik előnyös kiviteli módjaként a fenti vegyületeket az állat takarmányában adagoljuk; ilyenkor a közönséges állati táphoz keverhető, koncentrált tápkiegészítőt, vagy előkeveréket készítünk.

HU 203 130 Β

A vegyületeket inszekticidként, vagy a mezőgazdasági kártevők ellen az általános mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelően permet, por, emulzió alakjában, vagy más hasonló módon alkalmazzuk.

A S. avermitilis 1-3 (ATCC-53567), elágazó szénláncú 2-oxosav-dehidrogenáz-hiányos törzs előállítása

1) A S. avermitilis ATCC 31272 törzset egybefolyó baktériumtenyészet New Patch agar táptalajon, 12 napon át, 30 ’C hőmérsékleten növesztjük. A táptalaj öszszetétele a kővetekző:

V-8 Juice-oldat*	200 ml
kalcium-karbonát	3 g
agar	1000 ml-ig
víz	15 g
Nutrient broth táptalaj	1,0 g/1
nátriumacetát»3H2O	1,4 g/1
izovaleriánsav	50 mg/1
izobutirilsav	50 mg/1
2-metil-butirilsav	50 mg/1
izoleucin	250 mg/1
leucin	250 mg/1
valin	250 mg/1
nyomelem-oldat**	1 ml/1.
* - 8 növényi kivonat (paradicsom, sárgarépa, zel-
ler, cukorrépa, petrezselyem, fejes saláta, zsázsa és pa-
raj kivonatai),
valamint só, aszkorbinsav, citromsav és természetes
aromák keveréke. A Campbell Soup Company, Cam-
den, NJ. terméke.
** - A nyomelem-oldat összetétele:
vas-klorid»6H2O	2,7 g
mangán-szulfát«H2O	4,2 g
réz-szulfát«5H2O	0,5 g
kalcium-klorid	11,0 g
bórsav	0,62 g
kobalt-klorid*6H2O	0,24 g
cink-klorid	0,68 g
dinátrium-molibdenát	0,24 g.

Ezeket az összetevőket 1 1 0,1 sósavban oldjuk fel.

A spórákat három ilyen agarlemzről összegyűjtjük, és 20 ml 0,05 mólos trisz-maleinsav-pufferban (pH-9,0) szuszpendáljuk.

2) 10 ml spóraszuszpenziót mérünk 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozó-guanidint (NTG) tartalmazó üvegedénybe. A szuszpenziót 28 ’C hőmérsékleten, 60 percen át inkubáljuk és rázatjuk, majd a spórákat 1%os nátrium-klorid-oldattal bőségesen mossuk.

3) A mosás után a spórákat 1%-os nátrium-kloridoldatban szuszpendáljuk, és azonos térfogatú, 80%-os etilén-glikolt keverünk hozzájuk. Ezt a szuszpenziót -20 ’C hőmérsékleten tároljuk, és a mutánsok keresésekor a vizsgálandó sejtek forrásaként használjuk. A spórázás megindulása után a spóraszuszpenzióból körülbelül 10⁴ telep fejlődik ki ml-enként.

A tárolt spóraszuszpenziót YPD agarlemezekre szélesztjük úgy, hogy agarlemezenként körülbelül 100 telepet kapjunk. (Az YDP táptalaj mind élesztőkivonatból, mind Bacto pepton*-ból, mind glükózból 10 g/l-t, Bacto agar*-ból pedig 15 g/l-t tartalmaz. A táptalaj pH-ját 6,9-re állítjuk sterilezés előtt.) A *-gal jelölt táptalaj-összetevők a Difoo Laboratories, Detroit, Michigan 48238 termékei.

4) 28 ‘C hőmérsékleten, 2-3 héten át növesztjük a tenyészeteket, majd független telepeket emelünk le az agarlemezekről,és egy szabványos 96 lyukú mikrotiter-lemez egyes kamráiba helyezzük azokat. A telepeket egy-egy kis darabját párhuzamosan friss agar táptalajokra szélesztjük, hogy a mutánsok azonosítása után életképes sejtek forrásául használhassuk fel azokat.

5) Valamennyi lyukhoz körülbelül 75 μί, 1% glükózt, 0,1% kazaminsavat, 0,01% izovaleriánsavat, 0,01% izobutilrilsavat és 0,01% 2-metil-biturilsavat tartalmazó, folyékony M9 jelű táptalajt adunk. Néhány napig 28 ’C hőmérsékleten inkubáljuk a sejteket, majd vizsgáljuk elágazó szénláncú 2-oxosav-dehidrogenáz aktivitásukat. (Az M9 táptalaj 1-énként 6 g dinátriumhidrogén- foszfátot, 3 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g nátrium-kloridot és 1 g ammőnium-kloridot tartalmaz. A táptalajt sterilezzük, majd 1 ml steril 1 mólos magnézium-szulfát-oldatot és 1 ml 0,1 mólos kalciumklorid-oldatot adunk hozzá steril körülmények között.)

6) Az M9 táptalajhoz 5% toluolt adtunk, és a nem elegyedő keverékből rövid ultrahang-kezeléssel mikroszuszpenziót állítunk elő. A szuszpenzió 25 ml-éhez 1,2 ml, 22 gcurie/ml-es, illetve 10,0 pcurie/mikromólos [¹⁴C-l]-2- oxo-izokapronsav-oldatot adunk. A vizsgálandó telepeket tartalmazó mikrotlter-lemezek valamennyi lyukához 50 μΐ-t mérünk ebből az elegyböl.

7) Az egyes lyukakban termelt ¹⁴CO2-t a Tábor és munkatársai: Egyszerű módszer ¹⁴CO2 kimutatására nagyszámú mintából, valamint a módszer alkalmazása mutánsok gyors szűrésére című közleményében [J. Bacteriol., 128, 485-486. (1976)] leírt módszer alapján megkötjük és láthatóvá tesszük. Az elágazó láncú 2oxosav-dehidrogenázzal nem rendelkező mutánsok nem termelnek több jelzett bárium-karbonátot, mint amennyi a kontrolioknál megfigyelhető. Egy, a ¹⁴CO2 termelésének vizsgálata során a pozitív és a negatív mérés, azaz a jelzett bárium-karbonát-keletkezés eredményeként az autoradiogramon létrejött sötét isit és a hiányzó, vagy a nagyon halvány folt kontrasztját növelő, finomított módszer kivitelezésekor a következő módosított szűrést alkalmazzuk. Az egyedi telepeket (lásd a fenti 4) pontot) 7-14 nap növekedés után emeljük le az agar táptalajról (2-3 hetes növekedés helyett), és közvetlenül a fenti, 6) és 7) pont szerint eljárva vizsgáljuk azokat. A fenti eljárás 5) pontját kihagyjuk.

Egy még tovább finomított, a ¹⁴CO₂ felszabadulása szempontjából kvantitatív jellegű vizsgálati módszer szerint a fenti szűréssel kimutatott mutánsokat megfelelő, 1% glükózzal és 0,1% „Syncasa-bcaa”-val (Laminosavak szintetikus keveréke, összetétele közelítőleg emgegyezik a kereskedelmi forgalomban kapható

HU 203 130 Β kazaminsavakkal, de nem tartalmaz L-valint, L-izoleucint és L-leucint, lásd alább) kiegészített M9 táptalajban növesztjük.

Nagy sejtsűrűségig való felnövesztés után a sejteket M9 táptalajjal mossuk, és ultrahangos kezeléssel fehér, tejszerű diszperzióvá alakított, 1% toluolt tartalmazó, hideg M9 táptalajban feszuszpendáljuk. A sejt-puffertoluol szuszpenziót 40 percen át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy a sejteket permeábilissá tegyük. A permeábilissá tett sejteket ezután M9 táptalajjal mossuk, végül az M9 táptalaj eredeti térfogatának 1/5-ében felszuszpendáljuk. Az egyes vizsgálatokhoz a fenti szuszpenzióból 180-180 μΐ-t használunk fel.

A 300 μΐ térfogatú reakcióelegy toluollal kezelt sejteket, 0,4 mmól tiamin-pirofoszfátot (TPP), 0,11 mmól koenzim A-t (CoA), 0,68 mmól nikotin-amid-adenindinukleotidot (NAD), 2,6 mmól ditio-treitolt (DTT), 4,1 mmól magnézium-kloridot, 60 mmól 7,5-es pH-jú trisz-hidrogén-kloridot és 6000 cpm, mikrocurie/mikromól [¹⁴C-l]-a-keto-izokapronsavat tartalmaz. A beütésszám mérési hatékonysága 73%. A reakciót olyan 15 ml-es szcintillációs üvegadényben végezzük, melynek csavaros tetejébe egy kétszer 2 cm méretű Whatman 4 szűrőpapírt szorítunk. A 30 μΐ 1 mólos Hyamine Hydroxide-dal (a metil-benzetónium-hidroxid 1 mólos metanolos oldata, a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178 terméke) átitatott szűrőpapír megköti a reakcióban felszabaduló ¹⁴CO₂-t. 2 órás inkubáció után a szűrőpapírokat 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC - folyadékszcintilláció-számláló, a New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118 terméke) oldatba merítjük, és a radioaktivitást ebben az oldószerben való 4 órás, vagy még hosszabb ekvilibrálás után, folyadékszcintilláció-számlálóval mérjük. A „vak” kontroll- reakció (amely sejteket nem tartalmaz), körülbelül 50-300 cpm aktivitást eredményez.

Az 1-3 törzsnél és ez ehhez hasonló mutánsoknál a „vak” kontroli-reakcióénál kisebb, vagy azzal azonos beütésszámot, míg a szülői törzsnél a „vak” kontroliénál néhányszor nagyobb beütésszámot kapunk.

A S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs

HL-026 (ATCC 53568) variánsának izolálása

A S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs sejtjeit Nutrient-agar táptalaj-lemezekre csíkozva szélesztjük. A viszonylag nagy gyakorisággal megjelenő spontán variánsok közül néhány nem fejleszt légmicéliumot 4 napos, 30 ’C hőmérsékleten végzett inkubáció után. Néhány ilyen variánst izolálunk, és ciklopentán- karbonsavval kiegészíetett AP-5 táptalajban fermentálva vizsgáljuk, hogy a variánsok képesek-e nem-természetes avermektinek termelésére. Az izolátumok sorából, melyek közül több nem-természetes avermektineket igen, természetes avermektineket azonban nem termel, egy, a lombik-kísérletekben a szülői S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzsnél több aveimektint termelő törzset a HL-026 (ATCC 53568) azonosító számmal jelölünk.

A S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) elágazó láncú 2-oxosav-dehiderogenáz- és elágazó láncú aminosav-transzamináz-hiányos törzs előállítása

1) SAMM agar táptalaj-lemezeken 4 napon át növesztett, körülbelül 100 mg tömegű S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) sejtekkel oltunk 300 ml térfogatú lombikban levő 50 ml SCM táptalajt (pH-7,2). A lombikot ezután 200-as percenkénti fordulatszámmal, 30 ’C hőmérsékleten, 24 órán át rázatjuk (az inkubálás végén a pH-8,2).

2) A lombikot a rázógépről levéve, a tenyészet 10 ml-ét steril centrifugacsőben, 5 percen át 2000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. Ezután a sejteket 50 ml SCM táptalajban, 300 ml térfogatú steril Erlenmeyer lombikokban szuszpendáljuk, a lombikokat pedig 2 órán át, 30 °C hőmérsékleten, kör mentén mozgó rázógépen rázatjuk.

3) A szuszpenzió 10 ml-ét steril csőbe mérjük át.

4) 250 pl etil-metán-szulfonátot adunk a szuszpenzióhoz (jól szellőztetett fülkében), alaposan összekeverjük, majd steril, 300 ml térfogatú lombikba töltjük, és a lombikot 3 órán át, 30 °C hőmérsékleten, körmentén mozgó rázógépen rázatjuk.

5) 40 ml friss, steril SCM táptalajt adunk a lombikhoz, és a rázatást tovább folytatjuk, összesen 70 órán át, 30 ’C hőmérsékleten.

6) A lombimkot levéve, annak tartalmát 8000 fodulat/perc sebességgel, 10 percen át 20 ’C hőmérsékleten centrifugáljuk. A sejteket SCM táptalajban szuszpendálva mossuk, újra lecentrifugáljuk, majd 10 ml SCM táptalajban újra szuszpendáljuk.

7) Körülbelül 150 telep/táptalaj-lemez sejtkoncentrációban replikázva megvizsgáljuk, hogy az így nyert sejtek képesek-e L-leucin, L-izoleucin, L-valin, illetve ezek bármilyen kombinációjának jelenlétében, illetve hiányában, M9/glükóz minimál táptalaj-lemezeken növekedni. A találmány szerinti eljárás szempontjából jelentőséggel bíró mutáns sejtek csak az L-leucinnal, Lizoleucinnal és L-valinnal kiegészített táptalajon növekednek. Ezek az elágazó láncú aminosavtranszamináz-aktivitással nem rendelkező S. avenni ti lis 1-3 (ATCC 53567) törzsek az L-leucin, L-izoleucin és L-valin előanyagként szolgáló háromféle 2-oxosav (2-oxo-izokapronsav, 2-oxo-3-metil-valeriánsav és 2oxo-izovaleiránsav) közül eggyel vagy többel kiegészített táptalajon sem növekednek. Ez a viselkedés ellentétes az ilyen táptalajon jól növekedő S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs viselkedésével. A fentiek szerint tehát egyetlen transzamináz-enzim katalizálja az említett 2-oxosavak transzaminációját.

SCM táptalaj élesztő autolizátum 10 g/1 marhahús-kivonat 5 g/1 enzimatikus hidrolizált kazein 10 g/1 mólos magnézium-szulfát-oldat 3 g/1 mólos dikálium-hidrogén-foszfát-oldat, pH-7,0 (sósavval beállítva) 100 g/1

-101

HU

130 B

SAMM agar táptalaj

dinátrium-hidrogén-foszfát	6,0 g/1
kálium-dihidrogén-foszfát	3,0 g/1
nátrium-klorid	0,5 g/1
1 mólos magnézium-szulfát	1,0 g/1
0,1 mólos kalcium-klorid-oldat	1,0 g/1
ammónium-klorid	1,0 g/1
dextróz	8,0 g/1
kazaminsav	20,0 g/1
agar	20,0 g/1.

A „Syncasa - bcaa összetétele: 100-szoros töménységű törzsoldat

L-alanin	g/i 3,0
L-arginin	4,0
L-aszparaginsav	6,0
L-cisztein	1,0
L-glutaminsav	20,0
glicin	1,0
L-hisztidin	2,0
L-lizin	3,0
L-metionin	3,0
L-fenilalanin	6,0
L-prolin	10,0
L-szerin	6,0
L-treonin	4,0
L-tirozin	4,0
L-triptofán	1,0.

Az elegy pH-ját 7-re állítjuk be, majd szűrve sterilezzük az elegyet. A szokásos koncentrációban használva, 1 térfogat törzsoldatot adunk 99 térfogat táptalajhoz.

A S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669) törzs előállítása a spektinomicin-rezisztens S. avermitilis ATCC 31272 törzs és a S. avermitilis PGS 119 (ATCC 53670) törzs protoplaszjainak fúziójával

A spektinomicin-rezisztens S. avermitilis ATCC 31272 a S. avermitilis ATCC 31272 törzs spontán mutánsa. Ezt a mutánst az 50 gg/ml spektinomicint tartalmazó AS-lagar táptalajon széleszett ATCC 31272 törzs vegetatív micéliumainak populációjából izoláljuk. A mutáns spórák gazdag táptalajon 50 gg/ml spektinomicinnal szemben rezisztensek, ellentétben az izogénikus szülői törzzsel, amely ilyen feltételek mellett nem növekszik Ezt a domináns, szelektálható genetikai markert sikeresen alkalmazhatjuk elágazó szénláncú aminosav- transzamináz-hiányos ATCC 31272 izolátumok előállítására.

AS-1 agar táptalaj (Szilárd halmazállapotú táptalaj

Streptomyces-ekhez) élesztőkivonat 1 g

L-alain 0,2 g

L-arginin 0,2 g

L-aszparagin	0,5 g
oldódó keményítő	5,0 g
nátrium-klorid	25,0 g
dinátrium-szulfát	10,0 g
agar	20,0 g
desztillált víz	1 1.

Az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be, majd 15 percen át 121 ’C hőmérsékleten, autoklávban sterillezzük. 3035 ml-t öntünk steril, műanyag Petri-csészékbe (100szor 15 mm).

Eljárások életképes protoplasztok előállítására

Streptomyces avermitilis törzsek sejtjeiből

A. Az oltóanyagként használható spórák előállítása

1) Spóraszuszpenziókat készítünk a standard eljárások szerint, a szuszpenzió hígításait germinációs agar táptalajra szélesztve meghatározzuk az életképes spórák számát, és a szuszpenzió alikvotjait -70 ’C hőmérsékleten, 40% glicerin jelenlétében fagyasztva tároljuk.

2) Felhasználás előtt a tárolt spórákat 1000 g-en 10 percen át centrifugáljuk, majd azonos mennyiségű, 0,85%-os só-oldatban felszuszpendáljuk.

3) Körülbelül 10⁷ spórával oltunk 300 ml térfogatú, 3- vagy 4-rétegű dugóval lezárt lombikban levő 30 ml, 0,5% glicinnel kiegészített, módosított élesztőkivonatmalátakivonat (YEME) folyékony halmazállapotú táptalajt.

B. Az oltóanyagként használható, fagyasztott, ultrahanggal kezelt micéliumok előállítása

1) A 600 nm hullámhosszon mért 2-9 turbiditási érték eléréséig növesztjük a PGS-119 törzs micéliális tenyészeteit, Trypticase Soy Broth (TSB) folyékony táptalajban. A tenyészetet üveg szövethomogenizátorral 10-szer homogenizáljuk.

2) A homogenizált micéliumokat TSB-vel kétszeresére hígítjuk, és 20 ml steril polipropilén centrifugacsőbe mérünk. Ultrahang szondát merítünk 1-2 cm mélységben a folyadékba, és a mintát 50%- os erősséggel, 10 másodpercen át ultrahanggal besugározzuk. Az ultrahang-besugárzás egy- vagy kétsejtes egységekre tördeli szét a micélium-tömeget, ezért átoltás után gyors exponenciális növekedés következik be.

3) Az ultrahanggal kezelt micélium-készítményt 40% glicerin- végkoncentráció eléréséig hígítjuk, megfelelő üvegekbe pipettázzuk, és -70 ’C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk.

4) A YEME táptalaj beoltásához (melyet a fenti A.

3) pont szerint végzünk) szükség szerint, szobahőmérsékleten melegítjük fel az alikvotokat.

C. Az oltóanyagként használható, agar táptalajon nőtt telepek előállítása

1) Hat jól fejlett TSA vagy YPD-2 agar táptalajon nőtt PGS-119 telepet oltókaccsal mikrocentrifuga-csőben levő, 200 pl steril vízbe szuszpendálunk. Az YPD2 táptalaj összetétele: 10 g/1 Difco élesztőextraktum, 10 g/1 Bacto pepton (Difco), 5 g/1 dextróz, 2 g/1 nát11

-111

HU 203 130 Β riumacetát, 10 g/1 3-(N- morfolino)-propán-szulfonsav-nátriumsó, 20 g/1 Bacto agar (Difco), pH*7,0.

2) A micéliumokat eldobható zúzó segítségével homogenizáljuk.

3) A homogenizált telepeket a fenti A. 3) pont szerint adjuk a YEME táptalajhoz.

D. Protoplasztok előállítása glicin jelenlétében nőtt micéliumokból

1) A tenyészeteket 8-as fokozatra állított, 29 ’C hőmérsékletű, rázatott vízfürdőn körülbelül 65 órán át inkubáljuk.

2) a micéliumokat fáziskontraszt-mikroszkópban, 40-szeres nagyítású objektívvei vizsgáljuk, majd polipropilén centrifugacsőben 1475 g-n, 10 percen át, 20’C hőmérsékleten centrifugáljuk.

3) A felülúszót kiöntjük, a micéliális üledéket pedig 10 ml protoplaztáló (P) pufferban (lásd alább) felszuszpedáljuk. Az üledéket a micéliumcsómók szétoszlatása ésdekében szövethomogenizátonal 5-10szer homogenizáljuk.

4) A mintát körülbelül 1000 g-n, 10 percen át centrifugáljuk. A felülúszót kiöntjük, és az üledéket 10 ml P-pufferban óvatosan szuszpendáljuk.

5) A fenti lépést (mosást) megismételjük.

6) A micéliumokat 10 ml P-pufferral készített, 1,0 mg/ml koncentrációjú, friss lizozim-oldatban szuszpendáljuk; a lizozim-oldatot előzőleg 0,22 mikron pórusméretű szűrőn átszűrve sterilizáljuk. A micéliumokat 37 °C hőmérsékletű vízfürdőben, 60 percen át, óvatosan rázatva inkubáljuk. A micéliumokat minden

15. percben újra felszuszpendáljuk a lizozim-oldatban. A mintákban a protoplasztok jelenlétét mikroszkóposán, 40-szeres nagyítású objektívvei, fázismegvilágításban vizsgáljuk.

8) A micélium-készítményeket 5 ml-es pipettával háromszor fel- lepipettázzuk, hogy a protoplasztokat kiszabadítsuk a sejtfalak közül.

9) A készítményeket üveggyapoton, vagy nem-abszorbeáló gyapoton át szűrjük.

10) A protoplasztokat körülbelül 1000 g-n, 7 percen át centrifugálva kiülepítjük, 5 ml P-pufferban óvatosa szuszpendáljuk, és 40-szeres objektívvei, fáziskontraszt- mikrószkópban vizsgáljuk.

11) A fentiek szerint kiülepítjük, majd 1,0 ml P-pufferban szuszpendáljuk a protoplasztokat. Ebből a szuszpenzióből P-pufferral, és desztillált vízzel hígításokat készítünk, és regeneráló táptalaj-lemezekre szélesztjük azokat. A desztillált vízzel hígított protoplasztkészítményekből származó telepeket a nem-teljesen vagy egyáltalán nem-proptoplasztálódott micéliumdarabokból fejlődött sejteknek tekintjük.

12) A protoplasztok 200-300 μΐ-es alikvotjait jégben, -70 ’C hőmérsékleten lefagyasztjuk. Az alikvotokat 18-24 órával később kivesszük a jégből.

A protoplasztok polietilén-glikol (PEG) 1000-rel indukált fúziója

1) Az itt leírt kísérletek mindegyikét egyetlen tétel, körülményeink között látszólag alacsony toxicitást mutató PEG 1000-rel (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) végezzük.

2) A PEG 1,0 g-os alikvotjait üvegedényekben, autoklávval sterilezzük, ezután 1,0 ml P-puffert adunk hozzájuk, és a PEG-et az edény 55 ’C-ra való felmelegítésével oldjuk fel, vagy pedig a kimért PEG-et Ppufferban feloldjuk, és az oldatot közvetlenül felhasználás előtt, szűrve sterilezzük. A PEG-oldatokat szobahőmérsékleten adagoljuk.

3) Friss protoplasztokat készítünk, vagy a -70 ’C-on tárolt alikvotokat gyorsan, folyóvíz alatt felolvasztjuk. Mindkét genotípusból közelítőleg azonos számú protoplasztot pipettázunk óvatosan egy polikarbonát centriftigacsőbe. Frissen készített protoplasztok használatakor turbiditást mérünk, és náhány különböző koncentrációjú sejtszuszpenziót fuzionálunk. Valamennyi minta térfogatát P-pufferral 5,0 ml-re állítjuk be.

4) A fúziós elegyet körülbelül 1000 g-n, 7 percen át centrifugáljuk.

5) Óvatosan leöntjük a felülúszót. A protoplaszt üledéket P-pufferral, 200 μΐ végtérfogatban szuszpendáljuk.

6) Gyorsan 800 μΐ 50%-os PEG-oldatot adunk a fúziós elegyhez. A preparátumot Pasteur-pipettába felszívva, majd abból kiengedve összekeverjük. A fúziós reakcióelegyet 2 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 9 ml P-pufferral kihígítjuk a PEG- et. Az egyes fúziókat egymás után végezzük, hogy az inkubálási időtartamok pontosak legyenek.

7) A fúziós elegyeket a fenti 4) pont szerint centrifugáljuk, a felülúszót óvatosan elöntjük, és a fuzionált, mosott protoplasztokat 1,0 ml P-pufferban szuszpendáljuk.

8) A fúziós elegyből sorozat-hígítást (10^_1 és 10 ^J) készítünk P-pufferral.

9) Minden kísérletben kontrollként, mindegyik törzset önmagával is fuzionáltatjuk, és az így nyert mintákat szélesztjük.

10) Mindegyik protoplaszt preparátum hígításait szélesztjük (életképes sejtszám), hogy meghatározzuk a fúziós eljárás során használt valamennyi törzs életképes, regenerálódó sejtjeinek számát.

Eljárás a protoplasztok regenerálására

1) A protoplaszt-szuszpenziókat, fúziós elegyeket vagy az önfuziós mintákat szükség szerint P-pufferral hígítjuk; és 100 μΐ-es alikvotonként regeneráló agar táptalajra, óvatosan szétkenve szélesztjük. Nem javítja lényeges mértékben a regenerálást, ha a fuzionált protoplasztokat lágy-agar fedőrétegben szélesztjük.

2) Ha szükséges, a fenti D) 11. pontban leírt eljárást alkalmazzuk.

3) A regeneráló lemezeket tetejükkel felfelé, lezárt műanyag zacskókban, 29-30 ’C hőméréskleten, körülbelül 95%-os páratartalom mellett inkubáljuk.

4) Azoknál a protoplaszt-fúzióknál, ahol domináns szelektálható genetikai markéiként spektinomicin-rezisztenciát használunk, a szélesztést követő 18. órában 3,5 ml, 100 gg/ml spektinomicint tartalmazó, autoklávban sterilezett, és a felhasználáskor 45 'C hőmér-121

HU 203 130 Β sékletű lágy-agarral rétegezzük felül a regenerálódó protoplasztokat

5) A protoplasztokat 7-10 napig inkubáljuk.

A tenyésztő· és regeneráló-táptalaj, valamint a protoplasztáló puffer

Komplett regeneráló táptalaj (A Hopwood és munkatársai: Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, p. 235 (1985) alatt leírt táptalaj módosítása)

Alap-oldat:

szacharóz	205 g
kálium-szulfát	0,25 g
magnézium-klorid«6H2O	10,12 g
glükóz	10 g
Difco kazaminsav	o,l g
Difco élesztőkivonat	5,0 g
Difco zabliszt-agar	3,0 g
Difco Bacto-agar	22,0 g
desztillált víz	955,0 ml-ig

Az alap-oldatot 25 percen át, 121 ’C hőmérsékleten, autoklávban sterilezzük.

Sterilezés után a következő steril törzsoldatokat ad-

juk az alap-oldathoz:
kálium-dihidrogén-foszfát (0,5%)	10 ml
kálium-klorid«2H2O	5 ml
L-prolin (20%)	15 ml
MES puffer (1,0 mól)	10 ml
nyomelem-oldat*	2,0 ml
nátrium-hidroxid (In)	3,0 ml.

Az oldat pH-ját 6,5-re, térfogatát pedig 1 1-re állítjuk be.

♦«Nyomelem-oldat összetétele (per liter):

cink-klord	40 mg
vas-klorid«6H2O	200 mg
réz-klorid»2H2O	10 mg
mangán-klorid«4H2O	10 mg
dinátrium-tetraborát· IOH2O	10 mg
ammónium-molibdát‘4H2O	10 mg.

Spektinomicint tartalmazó lógyagar, felülrétegezésftez

Összetétele azonos a fenti komplett regeneráló táptalajjal, kivéve:

agar 4,10 g.

A fentiek szerint, autoklávban sterilezzük. Lehűtjük 55 ’C-ra, és 100 mg spektinomicint adunk hozzá. 5 ml-es alikvokotra osztva kupakos tenyésztőcsövekbe mérjük. Lehűtjük, majd közvetlenül felhasználás előtt újra sterilezzük autoklávban.

Módosított protoplasztoló (P) puffer

Alap-oldat:

szacharóz 205 g kálium-szulfát 0,25 g magnézium-klorid«6H2O 2,02 g desztillált víz 977 ml-ig.

percen át, 121 ’C hőmérsékleten, autoklávban

sterilezzük. Sterilezés után sorrendben steril törzsoldatokat adjuk hozzá:	a következő
kálium-dihidrogén-foszfát (0,5 %-os)	1 ml
nyomelem-oldat*	2 ml
kalcium-klorid*2H2O (3,68%-os)	10 ml
MES puffer (1,0 mól)	10 ml.
Az oldat pH-ját 6,5-re, térfogatát 1 1-re állítjuk be.
♦-A nyomelem-oldat összetételét lásd fenn.
Módosított élesztőkivonat-malátakivonat
(YEME) táptalaj
Alap-oldat:
Difco élesztőkivonat	3g
Difco Bacto-pepton	5 g
Difco Bacto malátakivonat-tápoldat	3 g
glükóz	10 g
szacharóz	300 g
desztillált víz	973 ml-ig.

percen át, 121 ’C-on, autoklávban sterilezzük. Sterilezés után a következő törzsoldatokat adjuk hozzá:

magnézium-klorid«6H2O (2,5 mólos) 2 ml glicin (20%-os) 25 ml.

Az oldat térfogatát 1 1-re állítjuk be.

Az alábbiakban bemutatjuk a következő példákban leírt eljárásokhoz használt táptalajok összetételét.

A molekulatömeg-meghatározásokat VG Model 7070E tömegspektrométeren, trietilén-glikol, plusz szilárd nátrium-klorid minta-mátrixot használva, gyors atomokkal való bombázáson alapuló tömegspektrometriával végezzük el. Az (M+Na)⁺ értékeket határozzuk meg. Az m/e érték meghatározása érdekében elektron- ütközésen alapúló tömegspektrometriát végzünk VG Model 7070F tömegspekrométeren. Csak a legfontosabb fragmensekre vonatkozó értékeket jegyezzük fel.

AS-7 táptalaj

hidrolizált keményítő8	g/i 20
Ardamine pHb	5
Pharmamediac	15
kalcium-karbonát	2

•-Készítéskor a kémenyítőt a Bacillus licheniformis a- amiláz enzimével („Termamyl” márkanéven a Novo Enzymes, Wilton, CT hozza forgalomba) 40%±5% glükóz-egyenértékig elhidrolizáljuk.

^b-A Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012 terméke.

^c- A Traders Protein., Memphis, TN 38108 terméke.

Az oldat pH-ját 7,2-re állítjuk be nátrium-hidroxiddal.

-131

HU

AP-5 táptalaj	g/i
hidrolizált keményítő	80
Ardamine pH	5
dikálium-hidrogén-foszfát	1
magnézium-szulfát«7H2O	1
nátrium-klorid	1
kalcium-karbonát	7
vas-szulfát«7H2O	0,01
mangán-klorid‘7H2O	0,001
cink-szulfát«7H2O	0,001
P-2000 (habzásgátló)	1 ml/1.
Az oldat pH-ját 25%-os nátrium-hidroxiddal 6,9-re
állítjuk be.
WPM SynA 40:40	g/1 1 desztillált víz
hidrolizált kemyényítő	40
oldható burgonyakeményítő	40
glutaminsav	1,0
arginin	0,168
cisztin	0,084
hisztidin	0,069
leucin	0,798
lizin	0,297
metionin	0,108
fenilalanin	0,168
teronin	0,174
triptofán	0,048
tirozin	0,192
dikálium-hidrogén-foszfát	1,0
magnézium-szulfát*7H2O	1,0
nátrium-klorid	1,0
kalcium-karbonát	3,5
vas(II)-szulfát«7H2O	0,01
mangán-klorid«4H2O	0,001
cink-szulfát«7H2O	0,001.
Az oldat pH-ját 6,8-7,0-ra 12l’C hőmérsékelten keverjük.	állítva, 30 percen át,
WPM SynB 40:40	g/1 1 desztillált víz
oldható burgonyakeményítő	40,0
hidrolizált keményítő	40,0
glutaminsav	0,390
arginin	0,168
cisztin	0,084
hisztidin	0,069
lizin-hidrogén-klorid	0,297
metionin	0,108
fenilalanin	0,168
treonin	0,174
trioptofán	0,048
tirozin	0,192
dikálium-hidrogén-foszfát	1,0
magnézium-szulfát»7H2O	1,0
nátrium-klorid	1,0
kalcium-klorid	3,5
14

130 Β vas(II)-szulfát‘7H2O 0,01 mangán-klorid«4H2O 0,001 cink-szulfát«7H2O 0,001.

Az oldat pH-ját 6,8-7,0-ra beállítva, 30 percen át, 121 ’C hőmérsékleten keverjük.

Általános nagynyomású folyadék-kromatogáfiás (HPLC) eljárások

A mozgó fázis:

150 ml víz és ml acetonitril elegyét metanollal 1 1-re egészítjük ki.

Az oszlop:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100)

Átfolyási sebesség: 0,75 ml/perc.

Detektálás: 240 nm hullámhosszú ultraibolya fénnyel.

Kiegyenlítés közel 6.

A minta oldószere (D):

ml acetonitril, plusz 390 ml metanol.

A standardok:

1. 0,5 mg avermektin-A2A-t mérünk 10 ml térfogatú mérőedénybe, majd metanollal jelig töltjük.

2. A vizsgált tennék 0,5 mg-ját 10 ml térfogatú mérőedénybe mérjük, majd metanollal jelig töltjük. Az 1. és 2. oldat a standard törzsoldatot; a futtatásnál használt standard oldat elkészítésekor 100 μΐ 1-es törzsoldatot és 100 μΐ 2-es törzsoldatot mérünk egy üvegedénybe, majd 800 μΐ mozgó fázist adunk hozzá.

A minták:

1. Jól össze rázot tenyészetből 1 ml-es mintát veszünk, és lecentrifugáljuk.

2. Eltávolítunk annyi felülúszót, amennyi az üledék felkavarása nélkül csak lehtséges.

3. Az üledékhez 100 μΐ, nagynyomású folyadék- kromatográfiához használható vizet mérünk, és vortexen kevertetve díszpergáljuk az üledéket.

4. 2 ml oldószert (D) adunk a diszperzióhoz, és jól elkeverjük.

5. Az így előállított mintát szűrjük, és nagynyomású folyadék- kromatográfiával (HPLC) vizsgáljuk.

A természetes avermektineket a fenti, nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással vizsgáljuk, az egyes avermektineket képviselő csúcsok retenciós idejét pedig elosztjuk a jelen lévő, és az adott nagynyomású folyadék-kromatográfiás meghatározás belső standardjaként használt oligomicin-A-nál megfigyelt retenciós idővel. Az oligomicin-A, mint a S. avermitilis törzsekkel végzett fermentációk mellékterméke, majdnem mindig megfigyelhető a nagynyomású folyadék-kromatográfiás görbéken, és ez alkotja az itt leírt mutánsok egyetlen, nagynyomású folyadék- kromatográfiával kimutatható termékét is, amikor a mutánsokat RCOOH (ahol az R a fentebb meghatározott csoportokat jelöli) összetételű savaktól, vagy az RCOOH (ahol az R a fentebb meghatározott csoportokat jelöli)

-141

HU 203 130 Β képlettel jellemezhető savakká átalakítható vegyületektől mentes táptalajban tenyésztjük. Az oligomicin-A retenciós ideje jellemzően 12,5—14 perc. A retenciós idők (RT) hányadosa az avermektin-termékek azonosságára, illetve hozamának összehasonlításához biztosabb alapot kínál. Az avermektin-termékek általában B2, A2, Bl és Al sorrendben jelennek meg a nagynyomású folyadék-kromatogramokon.

Természetes avermektin	RT/RT (oligomicin-A)
B2b	0,70
B2a	0,84
A2b	0,90
A2a	1,09
Blb	1,40
Bla	1,83
Alb	1,83
Ala	2,42.
Nem természetes avermektin (R: ciklopentil-csoport)	RT/RT (oligomicin-A)
ciklopentil-B2	0,94
ciklopentil-A2	1,23
ciklopentil-Bl	1,99
ciklopentil-A1	2,62.

A következő példákban az avermektineket a fentebb leírt nyagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárások alapján határozzuk meg.

A vegyületek elnevezése az alábbi:

„A”-sorozat: R³-metilcsoport, „B”-sorozat: R³-hidrogénatom, „l”-jel: 22,23-kettőskötés, R'-H, „2”-jel: nincs 22,23-kettőskötés, R‘-OH.

1. példa

A ciklopentil-avermektin-A2 előállítása

A S. avermitilis 1-3 (TCC 53567) törzs sejtjeit 2830 ’C hőmérsékleten, AS-7 táptalajban 24 órán át rázógépen tenyésztjük. A tenyészet 5 ml-ével 100 ml, 500 ml térfogatú lombikban levő AS-7 táptalajt oltunk, és változatlan körülmények között 24 órán át inkubáljuk a tenyészetet. Az így nyert tenyészet 1 ml-ével oltjuk az AP-5 táptalajt (40 ml táptalajt 300 ml térfogatú lombikban), melyhez 24 órával később 0,4 g/1 ciklopentán-karbonsavat adunk (nátrium-só alakjában). A termelő lombiktenyészeteket 28-30 ’C hőmérsékleten rázatjuk.

A 240. óráig 35 mg/1 ciklopentil-avermektin-A2 termelődik, míg a megfelelő természetes A2a titere 0. Más ciklopentil-avermektinek is képződnek.

2. példa

A ciklopentil-avermektin-A2 előállítása

Fagyasztott S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) tenyészettel oltunk 100 ml, 500 ml térfogatú lombikban levő AS-7 táptalajt. A sejteket 28-30 ’C hőmérsékleten, 24 órán át rázógépen tenyésztjük. A tenyészet 1 ml-es alikvotjaival oltunk két további, 100 ml AS-7 táptalajt tartalmazó, 500 ml térfogatú lombikot, és 18 órás inkubáció után ez utóbbi tenyészetekkel oltunk 10 1 AP-5 (csökkentett nátrium-klorid koncentrációjú) táptalajt. 24 órás, 28 ’C hőmérsékleten végzett tenyésztés után 0,4 g/1 ciklopentán-karbonsavat adunk a táptalajhoz. A keverést úgy végezzük, hogy az oldott oxigén koncentrációját a telítési érték 20%-a felett tartsuk. A ciklopentil-A2 titere a 120., 168., 216., 264. és a 312. órában 16, 40, 65, 88és 110 mg/1. Ezzel ellentétben, a megfelelő, természetes avermektin- A2a titere a fenti mitákban 0 (azaz nem észlelhető).

3. példa

A ciklopentil-avermektin-A2 előállítása

Ezen eljárás szerint a termelő táptalajt dúsítjuk, és a ciklopentán-karbonsavat több részletben adagoljuk a ciklopentil- avermektin titer növelése érdekében. Az oltóanyag előállítását, valamint a fermentációt ugyanazon körülmények között végezzük, mint a 2. példában leírt eljárásban, a következők kivételével:

további 5 g/1 (összesen tehát 10 g/1), Aidamine pH-t használunk az AP-5 táptalaj előállításához, és 0,4,0,2, illetve 0,2 g/1 ciklopentán-karbonsavat adagolunk a fermentléhez 30, 172 és 220 órával a fermentáció kezdete után. A ciklopentil-avermektin-A2 titere 1,2, 11, 78, 137, illetve 214 mg/1 120, 168, 216, 264, illetve 312 órás fermentáció után.

4. példa

Ciklopentil-avermektinek előállítása

A S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) törzs egy fagyasztott tenyészetével oltunk 500 ml térfogatú, dugóval lezárt lombikban levő 100 ml AS-7 táptalajt, majd a tenyészetet 24-28 órán át, 28-30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a fenti tenyészet 1 miével oltunk 40 ml, 300 ml térfogatú lombikban levő AP-5 táptalajt (amely kevesebb nátrium-kloridot, viszont 0,6 g/l-rel több glutaminsavat tartalmaz). 96 órán át, 28-30 ’C hőmérsékleten rázógépen inkubáljuk a tenyészetet, majd 0,4 g/1 ciklopentán- karbonsavat (nátrium-só formájában) adunk hozzá.

A 216 órás minta nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálata B2, A2, Bl, illetve Al ciklopentilavermektinek jelenlétét mutatja 12,32, 15,86, 25,28, illetve 32,96 perces retenciós idővel.

5. példa

Ciklopentil-avermektin-A2 előállítása

Ezen eljárás szerint az S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) és az S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) törzsek sejtjeit azonos körülmények között tenyésztjük. Három táptalajt (AP-5, WPM Syn A 40:40 és WPM Syn B 40:40) használunk. A két mikroorganizmus fagyasztott tenyészeteivel beoltunk 500-500 ml térfogatú, dugóval lezárt lombikokban levő 100-100 ml AS-7 táptalajt, majd a tenyészeteket 24-26 órán át, 28-30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a két te15

-151

HU 203 130 Β nyészet 1-1 ml-ével beoltjuk a három táptalaj 40 miéit külön-külön tartalmazó, 300 ml térfogatú lombikokat. Minden tenyészetből párhuzamost is indítunk. 24 órán át 28 °C hőmérsékleten, rázatva végzett inkubáció után valamennyi lombikhoz 0,4 g/1 ciklopentil-karbonsavat adunk (nátrium-só alakjában), majd összesen 192 óra inkubálás után meghatározzuk a főtennék, a ciklopentil-avermektin-A2 titerét. (Lásd az I. táblázatot).

I. táblázat

Táptalaj	A használt S. avermitilis törzs	A ciklopentil-avermektin-A2 titere (mg/1)
Ap-5	ATCC 53567	29
WPM Syn	ATCC 53568	67
A 40:40	ATCC 53567	35
WPM Syn	ATCC 53568	115
B 40:40	ATCC 53567	38
	ATCC 53568	36

6. példa

Ciklohexil-avermektinek előállítása

Az eljárás szerint a tenyészet 96 órás korában 0,2 g/1 ciklohexán-karbonsavat adagolunk ciklopentánkarbonsav helyett, valamennyi egyéb körülmény viszont azonos a 4. példában leírt eljárással. A 240 órás tenyészetből vett mintáról nagynyomású folyadék-kromatográfiával készített kromatogramon négy ciklohexil-avermektint azonosítunk. A ciklohexil-avermektinB2, - A2, -Bl, illetve -Al retenciós ideje sorrendben 14,84, 19,26, 31,46, illetve 41,14 perc.

7. példa

3-Ciklohexenil-avermektinek előállítása A 4. példa szerint eljárva, a 96 órás tenyészetekhez

0,2 g/1 3- ciklohexén-karbonsavat adagolunk ciklopentán-karbonsav helyett, valamennyi egyéb körülmény megegyezik a 4. példában leírtakkal. A 312 órás tenyészetből vett mintából nagynyomású folyadék- kromatográfiával készített kromatogramon több ciklohexenil- avermektint azonosítunk. Retenciós idejük a következő: 12,88 (B2), 16,39 (A2), 28,36 (Bl izomer), illetve 35,80 (Al izomer) perc.

8. példa

3-Tienil-avermektinek előállítása A 4. példa szerint eljárva, a 96 órás tenyészethez

0,05 g/1 tiofén-3-karbonsavat adagolunk cüdopentánkarbonsav helyett, minden egyéb körülmény megegyezik a 4. példában leírtakkal. A 312 órás tenyészetből vett mintáról nagynyomású folyadék- kromatográfiával készült kromatogramon négy 3-tienil-avermektint azonosítunk. A B2, A2, Bl, illetve Al 3-tienil-avermektinek retenciós ideje sorrendben 6,96, 8,76, 13,8, illetve 23,5 perc.

9. példa

1- (Metil-tio)-etil-avermektinek előállítása

A 4. példa szerint eljárva, a tenyészet 24, illetve 96 órás korában 0,4, illetve 0,2 g/1 2-metil-tio-propionsavat adagolunk ciklopentán-karbonsav helyett, minden egyéb körülmény megegyezik a 4. példában leírtakkal. A 240 órás tenyészetből vett mintáról nagynyomású folyadék-kromatográfiával készült kromatogramon két l-(metil-tio)-etil-avermektint azonosítunk. Az A2, illetve Bl 3-tio-etil-aveimektinek retenciós ideje sorrendben 9,3, illetve 13,06 perc. A körülbelül 7,2 percre becsült retenciós idejű csúcs, amely a 7,557 percnél levő csúcs elülső vállánál jelenik meg, vélhetőleg a B2 vegyület, míg az Al vegyületnek megfelelő csúcsot valószínűleg a 17,22 percnél levő csúcs takarja el.

10. példa

2- Pentil-avermektinek előállítása

A 4. példa szerint eljárva, a 96 órás tenyészethez 0,2 g/1 2- metil-valeriánsavat adagolunk ciklopentánkarbonsav helyett, minden egyéb körülmény megegyezik a 4. példában leírtakkal. A 312 órás tenyészetből vett mintáról nagynyomású folyadék- kromatográfiával készült kromatogramon négy 2-pentil-avermektint azonosítunk. A B2, A2, Bl, illetve Al 2-pentil-avermektinek retenciós ideje sorrendben 12,88, 16,58, 31,90, illetve 41,92 perc.

11. példa

-Metil-3-butenil-avermektinek előállítása

A 4. példa szerint eljárva, a 96 órás tenyészethez 0,2 g/1 2- metil-4-penténsavat adagolunk ciklopentánkarbonsav helyett, minden egyéb körülmény megegyezik a 4. példában leírtakkal. A 312 órás tenyészetből vett mintáról nagynyomású folyadék- kromatográfiával készült kromatogramon négy l-metil-3-butenilavermektint azonosítunk. A B2, A2, Bl, illetve Al 1metil-3- butenil-avermektinek retenciós ideje sorrendben 11,13, 14,78, 22,10, illetve 28,92 perc.

12. példa

1-Metil· 1-butenil-avermektinek előállítása

A 4. példa szerint eljárva, a 96 órás tenyészethez 0,2 g/1 2- metil-2-penténsavat adagolunk ciklopentánkarbonsav helyett, minden egyéb körülmény megegyezik a 4. példában leírtakkal. A 312 órás tenyészetből vett mintáról nagynyomású folyadék- kromatográfiával készült kromatogramon négy 1-metil-1-butenilavermektint azonosítunk. A B2, A2, Bl, illetve Al 1metil-1- butenil-avermektin retenciós ideje sorrendben 11,59, 14,93, 25,29, ületve 33,18 perc.

13. példa

A példa az L-valinből és az L-izoleucinből származó természetes avermektinek a találmány szerinti mutáns felhasználásával történő előállítását szemlélteti.

A S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs egy fagyasztott tenyészetét 100 ml AS-7 táptalajt tartalmazó, 500 ml térfogatú, dugóval lezárt lombikba juttatjuk. Egy napos, 28-30 *C hőmérsékleten végzett rázatás

-161

HU 203 130 Β (200 fordulat/perc) után a tenyészet 1 ml-ével oltunk 300 ml térfogatú lombikban levő 40 ml WPM Syn A 40:40 táptalajt, majd 28-30 *C hőmérsékleten, rázógépen, 24 órán át inkubáljuk a tenyészetet. Ekkor 4 ml, 4 mg/ml koncentrációjú, szűrve sterilezett, nátri- 5 um-hidroxiddal semlegesített (pH-6-7) izovaj-savat adagolunk, és az inkubációt a fentiek szerint, összességében 8 napon át folytatjuk. A nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálat 4 főbb csúcsot mutat (az oligomicinen kívül). Az izovajsavat 2-metil-vaj-savval helyettesítve, a hasonlóan végzett kísérletekben az Lizoleucinból származó, komplementer avermektineknek megfelelő négy csúcs jelenik meg.

14. példa

Az 1. példában leírt eljárást úgy ismételjük meg, hogy a ciklopentán-karbonsavat az alább felsorolt primer vegyületekkel helyettesítjük. Feltűntetjük az adott fermentációban termelődött és azonosított avermektineket is [az (I) általános képlet szerinti vegyületeket, ahol az R² az oleandróz-diszacharid- részt, az R, R¹ és R³ pedig a fentebb már meghatározott csoportokat jelöli].

Vegyület Primer vegyület	R	RT (termék)/RT (oligomicin A	) Ai
b2	a2	Bi
1.	2-metil-valeriánsav	pent-2-il-csoport	1	1,287	2,478	3,255
2.	2-metil-pent-4-énsav	4-pentén-2-il-csoport	0,853	1,090	1,694	2,217
			0,904	1,133	1,784	2,346
3.	1 -ciklohexén-karbonsav	ciklohexén-1 -il-csoport	0,785	1,021	1,665	2,179
4.	tiofén-2-karbonsav	tién-2-il-csoport	0,694	1,143	1,499
5.	3-furánkarbonsav	3-furil-csoport	0,705	1,095
6.	ciklobután-karbonsav	ciklobutilcsoport	0,728	0,933	1546	2,027
7.	ciklopentán-karbonsav	ciklopentilcsoport	0,960	1,236	1,970	2568
8.	ciklohexán-karbonsav	ciklohexilcsoport	1,206	1,565	2556	3,343
9.	cikloheptán-karbonsav	cikloheptilcsoport	1,465	1,923
10.	3-ciklohexén- 1-karbonsav	ciklohex-3-enil-csoport	1	1,273	2,125	2,780
11.	2-(metil-tio)-propionsav	1 -metil-tio-etil-csoport	0,565	0,730	1,025	1,351
12.	tiofén-3-karbonsav	tién-3-il-csoport	0,539	0,639	1,069	1,388
13.	hidroxi-metil-ciklopentán	ciklopentilcsoport	azonos	a 7. vegyületével
14.	3-tiofén-karbaldehid	tién-3-il-csoport	azonos a	i 12. vegyületével
lő.	3-ciklohexil-propionsav	ciklohexilcsoport	azonos	a 8. vegyületével	i!
16.	3-ciklopentil-propionsav	ciklopentilcsoport	azonos	a 7. vegyületével
17.	hidroxi-metil-ciklobután	ciklobutilcsoport	azonos	a 6. vegyületével
18.	3 -ciklopentil-1 -propanol	ciklopentilcsoport	azonos	a 7. vegyületével
19.	ciklobutil-metil-amin	ciklobutilcsoport	azonos	a 6. vegyületével
20.	etil-ciklobután-karboxilát	ciklobutilcsoport	azonos	a 6. vegyületével
21.	2-(ciklobutil-karbonil)-	ciklobutilcsoport	azonos	a 6. vegyületével
	-propionsav
22.	etil-2-(3 -tiofén-karbonil)-	tién-3-il-csoport	azonos a	. 12. vegyületével
	-propionát
23.	1 -metil-ciklopropán-karbonsav	1 -metil -ciklopropil-csoport	1,236
24.	2-metil-pent-2-énsav	2-pentén-2-il-csoport	0,812	1,091	1,923	2,523
25.	2-fumársav	2-furil-csoport	0,709	1,146
26.	5-metil-tiofén-2-karbonsav	5-metil-tién-2-il-csoport	0,533	1,514
27.	1 -metil-ciklopropán-	1 -metil-ciklopropil-	1,236
	-karbonsav	-csoport
28.	ciklopropán-karbonsav	ciklopropilcsoport	0,802	1,048	2,236
29.	4-tetrahidropirán-karbonsav	4-tetrahidro-piranil	0,496	0,588	0,984	1,278
30.	4-metoxi-2-metil-vajsav	4-metoxi-but-2-il	0,624	0,807	1,133	1,493
31.	4-tetrahidro-tiopirán-karbonsav	4-tetrahidro-tiopiranil	0,700	0,893	1,430	1,900
32.	3-tetrahidro-tiofén-karbonsav	3-tetrahidro-tienil	0,574	0,742	1,042	1,373
33.	4,4-difluor-ciklohexán -karbonsav	4,4-difluor-ciklohexil	0,753	0,964	1598	2,095
34.	4-exometilén-ciklohexán-karbonsav	4-exometilén-ciklohexil	1,499	2,449	3,203
35.	2-tetrahidro-fiirán-karbonsav	2-tetrahidro-furanil	0,704
36.	tietán-3-karbonsav	3-tietanil	0,598	1,298

-171

HU 203 130 Β

Néhány fentebb szereplő vegyület további fizikaikémiai adatait az alábbiakban mutatjuk be.

Vegyület Fizikai-kémiai jellemző (A2) fehér por, olvadáspont- 135-140 ’C, molekulatömeg-925, m/e: 596, 454,

312, 303, 275, 237, 219, 209, 191,

179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 és 87.

(Al) fehér por, olvadáspont: 120-124 °C, molekulatömeg-907, m/e: 578, 303,

275, 257, 219, 191, 167, 145, 127,

113, 111, 95 és 87.

(B2) fehér por, olvadáspont: 110-112 ’C, molekulatömeg-911, m/e: 321, 303,

261, 257, 237, 219, 191, 179,

167, 145, 127, 113, 111, 95 és 87.

6(B1) fehér por, olvadáspont: 135-138 ’C, molekulatömeg-893, m/e: 303, 261,

257, 219, 191, 167, 145, 127, 113,

111, 95 és 87.

(A2) fehér por, olvadáspont: 112-117 ’C, molekulatömeg-953, m/e: 624, 482,

349, 331, 275, 265, 247, 237, 219,

207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, és 87.

(A2) fehér por, olvadáspont: 131-135 ’C, molekulatömeg-951, m/e: 624, 480,

347, 329, 275, 263, 245, 235, 217,

205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, és 87.

(A2) fehér por, olvadáspont: 167 ’C, molekulatömeg-953, m/e: 349, 331, 275,

265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127,

113, 95 és 87.

75. példa

A ciklopentil-avermektin-A2 kinyerése Az alábbiakban a ciklopentán-karbonsav előanyagból képződött, A2 avermektin fermentléből való kinyerését mutatjuk be. A teljes fermentlevet (melyet a 2. példában leírt fermentációs eljárással állítunk elő) szűrjük, és a micéliális sejttömeget 3 térfogatnyi acetonnal, kétszer extraháljuk. Az acetonos extraktumot töményítjük, az Így nyert vizes olajat metilén-kloriddal extraháljuk, a metilén-kloridos oldatot pedig egy sötétbarna, olajszerű folyadékká betöményítjük. A sötétbarna olajat ezután metanol: víz 4:1 arányú elegyben feloldjuk, a keletkezett oldatot pedig hexánnal extraháljuk, a zsírsavak, illetve lipidek eltávolítására. A metanol - víz elegy elpárologtatása után 10 térfogat% ciklopentil-avennektin-A2-t tartalmazó, világosbarna olajat kapunk. A nyers avermektines olajat kloroformmal hígítjuk 0 ml kloroformot adva az olaj minden egyes g-jához), aktív faszenet (0,35 g/g olaj) és szilikagélt (1 g/g olaj) adunk hozzá, az elegyet 1 órán át keverjük, majd szűrjük. A szűrletet töményítjük, és az így nyert olajat izopropil-éteirel hígítjuk (1 ml izopropil-étert adva az olaj minden egyes g-jához). A kapott oldatot fokozatosan nagy térfogatú hexánba csepegtetjük (25 ml hexán/g olaj), ami után fehér, nyers, porszerű avermektin csapódik ki. Az elsőre kivált anyagot szűréssel különítjük el, majd az anyalúgot 5 ’C hőmérsékletre hűtve, kicsapjuk a visszamaradt avermektint.

A nyersterméket tiszta termék előállítására preparatív nyagynyomású folyadék-kromatográfiával tisztítjuk. A nyersterméket diizopropil-éter metil-nitril: etilacetát: hexán:ecetsav 25:25:25:50:0,125 arányú elegyében oldjuk fel (4,1 ml oldószert adva a nyers por minden g-jához). A mintát 41,4 ml«25 cm méretű, preparatív szilikagél-oszlopra injekciózzuk, a fenti oldószerrel 30 ml/perc sebességgel eluáljuk, és a terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Az összegyűjtött frakciókat betöményítjük, majd metanokvíz 86:14 arányú elegyével hígítjuk oly módon, hogy 1 ml körülbelül 50 mg terméket tartalmazzon. A mintákat azután C-18 preparatív oszlopra injektáljuk (amely azonos méretű a szilikagél-oszloppal), és 18-20 ml/perc átfolyási sebességgel, metanol és víz elegyével (275 ml vizet metanollal 2 1-re egészítünk ki) eluáljuk. A frakciókat újra betöményítjük, és másodszor is átengedjük a C-18 preparatív oszlopon.

A terméket tartalmazó frakciókat szárazra párolva nyerjük a tiszta célterméket.

A megfelelő ciklopentil-avermektin-B2-t, Al-et és -Bl-et a fent leírt, nagynyomású folyadék-kromatográfiás elválasztások megfelelő frakcióinak összegyűjtésével nyerjük ki.

16. példa

YPD agar táptalajról összegyűjtött S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) micéliumokkal oltunk 50 ml, 300 ml térfogatú, dugóval lezárt lombikban levő AS-7 táptalajt, és a tenyészetet 30 ‘C hőmérsékleten, 24 órán át rázatjuk (220 fordulat/perc). Ezután két, 50 ml AP-5 táptalajt tartalmazó, 300 ml-es (dugó nélküli) lombikot beoltunk a tenyészet 1 ml-ével. Az egyik lombik tartalmaz 2-metil-vajsavat (0,1%), a másik viszont nem. 30 ’C hőmérsékleten, 11 napon át, rázógépen fermentálunk. Mindkét lombik tartalmát azonos módon dolgozzuk fel. A teljes fermentlevet négyszeres térfogatfeleslegben levő acetonitrikmetanol 810:75 arányú eleggyel extraháljuk. Erőteljes rázással segítjük elő az antibiotikum extrakcióját a sejtekből, majd a kitisztult felülúszóban nagynyomású folyadék- kromatográfiával vizsgáljuk az avermektinek jelenlétét. Abban a mintában, amelyhez nem adtunk zsírsav előanyagot, nem találunk kimutatható mennyiségben (érzékenység < 0,20 mg/1) avermektineket („a típusűakat). 2-metilvajsav jelenlétében, sorrendben 0,5, 1,3, 1,4 és 1,1 mg/1 avermektin-B2a-t, -A2a-t, - Bla-t és Ala-t mérünk.

-181

HU 203 130 Β

17. példa

Ebben a példában, a 16. példában leírtakhoz hasonló módon eljárva termelő fermentációt végzünk a S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) törzs sejtjeivel, AS7 táptalajban tenyésztett inokulumról, AP-5 táptalajt oltva. Primer vegyületként 0,05% koncentrációban 2metil-vajsavat adunk. Ebben az esetben a kiegészítetten (zsírsav előanyagot nem tartalmazó) kontroll fermentációban 0,3, 0,9, <0,2 és <0,2 mg/1 avermektinB2a; -A2a, -Bla és Alá termelődik, míg a zsírsavval kiegészített táptalajban végzett fermentációk során 2,8, 5,0, 4,5 és 2,3 mg/1 koncentrációban keletkeznek a fenti vegyületek.

18. példa

Ebben a példában, akárcsak a 16. példában leírt eljárásban, termelő fermentációt végzünk a S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) törzs sejtjeivel, AP-5 táptalajt oltva AS-7 táptalajban tenyésztett inokulumról. A példa szerint a 2-metil-vajsavat az AP-5 táptalaj beoltása után 48 órával, 0,05% koncentrációban adagoljuk; a sejteket szűréssel gyűjtjük össze, majd megmérjük (nedves tömeg), és négyszeres mennyiségű oldószerrel extraháljuk. Ez a betöményítési lépés érzékenyebb avermektin-titer meghatározást tesz tehetővé, mint az előzőekben, ahol is a teljes fermentlevet közvetlenül extraháljuk. A példa szerint eljárva, a 2-metil-vajsavval kiegészített táptalajban végzett fermentációban 2,5, 8,5, 4,5 és 3,5 mg/1 B2a, A2a, Bla és Alá koncentrációban állapítunk meg, szemben a kiegészítetten táptalajú kontrollok 0,3, 0,3, 0,3 és 0,1 mg/l-es koncentrációival.

Az utóbbi, alacsony értékek valószínűleg a nyers AP-5 termelő táptalajban kis mennyiségben előforduló endogén zsírsav- vegyületeknek tulajdoníthatók.

19. példa

Fermentációkat végzünk a 18. példában leírtak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy 2-metil-vajsav helyett 0,045% ciklopentán-karbonsavval egészítjük ki a táptalajt. 4 mg/1 ciklopentil-avermektin-A2 koncentrációt mérünk a fermentlében. Retenciós idő: 15,86 perc.

20. példa

A S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) törzs sejtjeit 50 ml, 300 ml térfogatú (dugó nélküli) lombikokban (16 lombik) levő AP-5 táptalajban, 30 ’C hőmérsékleten inkubálva fermentáljuk. Ezt a táptalajt a törzs 24 órán át 30 ’C hőmérsékleten, 300 ml tréfogatú, dugóval lezárt lombikokban levő 50 ml AS-7 táptalajban inkubált tenyészetének 1 ml-ével oltjuk. Az AP-5 táptalajban való 66 órás tenyésztés után, 0,1% koncentrációban izovajsavat adagolunk 8 lombikhoz. A 16. példában leírt feldolgozási eljárást követve, a kiegészített lombikokban a B2b, az A2b, a Blb és az Alb 5,6 45, 45 és 68 mg/1 koncentrációban (két kísérlet átlaga) termelődik. A kiegészítetten táptalajú tenyészeteknél ezek az értékek sorrendben 0,5, 4,0, 4,5 és <8,5 mg/1. Továbbá, ez utóbbi fermentációban, sorrendben

1.1, 1,1, ismeretlen és 0,2 mg/1 a megfelelő B2a, A2a, Bla és Alá avermektinek koncentrációja.

21. példa

A 20. példa szerint eljárva 4 db 15 ml térfogatú műanyagcsőben, 2-2 ml AP-5 táptalajban fermentáljuk a S. avermitilis PG-119 (ATCC 53670) törzs sejtjeit. Az inokulumot a 20. példa szerint eljárva, AS-7 táptalajban, 30 *C hőmérsékleten, a tenyésztő- csöveket 30*-os dőlésszög megtartásával rázatva állítjuk elő. A zsírsav-előanyagot a ciklohexán-karbonsavat 0,045% koncentrációban, az AP-5 táptalaj beoltása után 96 órával adagoljuk két csőhöz. Az AP-5 táptalaj 0,05 ml, AS-7 jelű táptalajjal készült tenyészettel való oltása után 400 órával 8 ml extraháló oldószert (acetonitrihmetanol 810:75) adunk valamennyi tenyésztő-csőhöz, és a felülúszóból az avermektin titerét nagynyomású folyadék-kromatográfiával határozzuk meg, amint azt korábban leírtuk. A ciklohexil-B2, -A2, -Bl, -Al, A2b, Blb, Alb, A2b és Alá avermektinek koncentrációi sorrendben: 3,5, 6,2, 3,0, 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 0,2 <0,2 mg/1 (a két tenyészet átlaga). A sav- előanyagot nem tartalmazó táptalajú két tenyészetben a megfelelő koncentráció-értékek: <0,2, <0,2, <0,2, <0,2,

4.2, 2,9, 9,3, 1,2, 0,3 mg/1. A tenyészetőcsövekben egyetlen más természetes avermektin sem mutatható ki.

Reterenciós idők: ciklohexil-B2: 14,84, ciklohexilA2: 19,26, ciklohexil-Bl: 31,46, ciklohexil-Al: 41,14 perc.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás (I) általános képletű avermektin-származékok előállítására - ahol a szaggatott vonal a 22,23helyzetben adott esetben jelen levő kettőskötést jelent, R¹ hidroxilcsoport abban az esetben, ha a 22,23-helyzetben nincs kettőskötés, és hidrogénatom, ha kettőskötés van,

   R² (Π) képletű 4’-(alfa-L-oleandrozil)-alfa-L-oleandrozil-oxi-csoport,

   R³ hidrogénatom vagy metilcsoport, és

   R valamely alfa-helyzetben elágazó 3-6 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos alkenil-, 1-4 szénatomos alkoxi-2-6 szénatomos alkil- vagy 1-4 szénatomos alkiltio-2-6 szénatomos alkil-csoport; 3-8 szénatomos cikloalkil- vagy 5-8 szénatomos cikloalkenilcsoport, melyek adott esetben egy metilén- vagy egy vagy két 1-4 szénatomos alkilcsoporttal vagy halogénatommal szubsztituáltak; vagy 3-6 tagú, egy oxigén- vagy kénatomot tartalmazó heterociklusos csoport, mely telített, részlegesen vagy teljesen telítetlen és adott esetben egy 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált lehet, azzal jellemezve, hogy Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 vagy ATCC 53670 törzset asszimilálható nitrogén- és szénforrást, szervetlen sókat, valamint R-COOH, R-(CH₂)_n-Z vagy R-CO-Z általános képletű vegyületet - ahol R a fenti, n értéke 0, 2, 4 vagy 6, Z jelentése -CH₂0H,

   -191

   HU 203 130 Β

   -CHO-, -COOR⁵, -CH2NH2 vagy -CONHR⁶ általános képletű csoport, ahol R⁵ hidrogénatom, vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és R⁶ hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, aszparaginil- , glutaminil- vagy metionilcsoport - vizes táptalajban, levegőztetett körülmények között tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 10. 13.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy S. avermitilis törzsként az ATCC 53567 vagy az ATCC 53568 törzset alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987. 01. 23.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R-(CH2)_B-Z általános képletű vegyűletet alkalmazunk, ahol R, n és Z az 1. igénypontban megadott. (Elsőbbsége: 1987. 10. 13.)
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan R-(CH2)_n-Z általános képletű vegyűletet alkalmazunk, ahol R ciklobutil-, ciklopentil-, ciklohexil, cikloheptil-, 2-metil-ciklopropil-, 3-ciklohexenil-, 1ciklopentenil-, 1-ciklohexenil-, 3-metil-ciklohexil(cisz/transz), 4-metilén-ciklohexil-, 3-metil-ciklobutil-,

   3-metilén-ciklobutil-, 3- ciklopentenil-, 3-fluor-ciklobutil-, 4,4-difluor-ciklohexil-, izopropil-, szek-butil-, 2-pentil-, 2,3-dimetil-propil-, 2-hexil- , -pent-4-enil-, 1-metil-tio-etil-, S-2-metil-pentil-, R-2-etil-pentil-, 2tienil-, 3-tienil-, 4-tetrahidro-piranil-, 3- furil-, 3-tetrahidro-tienil-, 4-metil-tio-2-butil-, 4-tetrahidro-tiopiranil-, 4-metoxi-2-butil- vagy 4-metil-tio-2-butil-csoport, és n és Z az 1. igénypontban megadott. (Elsőbbsége: 1987. 10. 13.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan R-(CH₂)_n-Z vegyületből indulunk ki, ahol R ciklopentil-, ciklohexil- vagy tienilcsoport, és nésZ az 1. igénypontban megadott. (Elsőbbsége:

   1987. 10. 13.)
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan R-COOH, R-(CH2)_n-Z vagy R-CO-Z általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol

   R α-helyzetben elágazó, 3-6 szénatomos alkilcsoport. (Elsőbbsége: 1987. 10. 13.)