HU192495B - Process for producing new polypeptides of alpha-amilase-inhibiting activity and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents
Process for producing new polypeptides of alpha-amilase-inhibiting activity and pharmaceutical compositions containing them Download PDFInfo
- Publication number
- HU192495B HU192495B HU844121A HU412184A HU192495B HU 192495 B HU192495 B HU 192495B HU 844121 A HU844121 A HU 844121A HU 412184 A HU412184 A HU 412184A HU 192495 B HU192495 B HU 192495B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amino acid
- glutamic acid
- amylase
- glutamine
- polypeptide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány új, biológiailag hatásos, gyűrűs polipeptidek előállítására vonatkozik. E polipeptidek gátolják az α-amiláz enzimet, s így az ember- és állatgyógyászatban, az orvosi diagnosztikában, valamint a keményítő biotechnológiájának területén alkalmazhatók.
Közelebbről, a talátmány tárgya eljárás a (la) képletű polipeptidek és variánsaik előállítására.
A találmány szerinti polipeptidek a következők:
- Az (la) képletű peptid (ez az alábbiakban AI3688 jelzéssel szerepel), valamint e peptid következő szerkezeti változatai:
- az l-dez-alanin-származék (jele AI-3688a), amelyben az 1 -es helyzetű alanin aminosav hiányzik, így az első aminosav a 2. helyzetű treonin;
- az AI-3688b jelű peptid, amely az ΑΙ-3688-tól abban különbözik, hogy a 14-cs helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav;
- az Al-3688c jelű peptid, amely az ΑΙ-3688-tó! abban különbözik, hogy a 34-es helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav;
- az AI-3688d jelű peptid, amely az AI-3688a-tól abban különbözik, hogy a 14-es helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav és az 1-es helyzetű alanin aminosav hiányzik, így az első aminosav a 2. helyzetű treonin;
- az AI-3688e jelű peptid, amnely az AI-3688a-tól abban különbözik, hogy a 34-es helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav és az 1. helyzetű alanin aminosav hiányzik, így az első aminosav a 2. helyzetű treonin;
- az ΑΙ-3688Γ jelű peptid, amely az ΑΙ-3688-tói abban különbözik, hogy mind a 14-es, mind a 34-es helyzetű glutamin helyett glutaminsavat tartalmaz; és
- az Aí-3688g jelű peptid, amely az AI-3688f jelű peptid 1-dez-alanin-származéka.
A peptidek 36, illetve 35 aminosavat tartalmaznak. Az aminosavszekvencia amin-terminálisán (aminocsoportos végződésen) az 1-es helyzetben alaninnal vagy a 2. helyzetben treoninnal kezdődik. Az AI-3688 pepiidben a 9-es helyzetű cisztein és a 25-ös helyzetű cisztein között diszulfidkötés van. A diszulfidkötések (diszulfidhidak) az AI-3688 szerkezeti változatainak (variánsainak) megfelelő helyein is megtalálhatók.
E leírásban a gátló anyagokban levő aminosavakat azokkal a szimbólumokkal jelöljük, amelyeket L. Stryer: „Biochemistry” című könyvében (W. H. Freemanand Company, San Francisco, 1972, 14. és következő oldalakon) alkalmaz.
A találmány tárgya az AI-3688 jelű polipeptid, valamint ennek AI-3688a-g jelű szerkezeti variánsai, valamint az e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására szolgáló eljárás.
A találmány szerint az (la) képletű polipeptideket úgy állítjuk elő, hogy egy Streptomyces aureofaciens törzset szubmerziós eljárással valamilyen fermentációs közegben tenyésztünk, a polipeptidet a micéiiumból vagy a kultúraszűrletből ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk.
Az AI-3688 jelű polipeptidet és ennek AI-3688a-g jelű szerkezeti variánsait előnyösen a Streptomyces aurefaciens FH 1656 törzs miciéliumából és kultúraszürletéből kapjuk. Ezt a törzset a Mikroorganizmusok Német Gyűjteményében [Deutsche Sammlung von Mikroorganismcn (DSM)] 1983. december 02-cn
DSM 2790 törzskönyvi számmal helyeztük letétbe. Az AI-3688 jelű polipeptid és szerkezeti variánsainak előállítására azonban ennek a törzsnek a variánsai és mutánsai is felhasználhatók.
A Streptomyces aureofaciens DSM 2790 törzs taxonómiai sajátságai megfelelnek a Streptomyces aureofaciens „Bergey’s Manual of Determinativa Bacteriology” (8. kiadás, Williams és Wilkins Corp. kiadása, Baltimore, 1974) kézikönyvben levő leírásának. A leírt törzsek közötti különbség az anyagcsere terméké ben áll. Mindeddig nem ismertettek olyan gyűrűs peptideket, amelyek Streptomyces aureofaciens törzsek anyagcseretermékei: így tehát a törzs új.
Az AI-3688 jelű polipeptid előállítására célszerűen a következőképpen járunk el:
A Streptomyces aureofaciens DSM 2790 törzset vizes tápközegben, süllyesztett módszerrel (szubmerziósan), előnyösen aerob körülmények között addig tenyésztjük, amíg az AI-3688 kielégítő koncentrációt ér el. A táptalaj egyrészt szénforrásokat - például szénhidrátokat - másrészt nitrogénforrásokat — például alkalmas nitrogénvegyületeket, így fehérjetartalmú anyagokat — tartalmaz. Szénforrásként alkalmas vegyületek például a glukóz, szacharóz, glicerin, malátakivonat, keményítő, olajok és zsírok. Nitrogénforrásként előnyösen alkalmazható vegyületek például a kukorica duzzasztására felhasznált víz (kukoricalekvár), élesztőkivonatok, szójaliszt, halliszt, sovány tejpor, emésztett kazein, valamint huskivonat. Alkalmazhatók továbbá úgynevezett „szintétikus” táptalajok is. Hasznosnak bizonyulhat továbbá nyomelemeknek — így cinknek, magnéziumnak, vasnak, kobaknak vagy mangánnak - a fermentációs közeghez való hozzáadása.
Az AI-3688 képződéséhez vezető fermentáció széles hőmérsékleti határok között végezhető. E hőmérsékleti határok például 10 ’C és 40 °C; előnyösen körülbelül 25 °C és 35 °C közötti hőmérséklettartományban dolgozunk. A közeg pH-értékét úgy szabályozzuk, hogy ez a mikroorganizmusok szaporodásának megfeleljen: például 4,0 és 9,0, előnyösen»5,0 és 8,0 közötti pH-értéken dolgozunk. A tápközegtől függően, például a tápközeg minőségi és mennyiségi összetételétől, valamint a fermentáció körülményeitől, így a levegőztetés sebességétől, a hőmérséklettől és a pHértéktöl függően az AI-3688 jelű polipeptid képződése a tápközegben általában 2—10 nap alatt következik be.
Az AI-3688 a fermentációból származó micéliumban és kulíúraszűrletben egyaránt jelen van: főtömege általában a kultúraszürletben található. Ezért előnyösen úgy járunk el, hogy a vizes fázist a micéliumlól például szűrés vagy centrifugálás útján elválasztjuk, majd az AI-3688 terméket mindegyik fázisból ismert eljárással elkülönítjük és tisztítjuk. E célra számos eljárás áll rendelkezésre: így például ioncserélők segítségévei, molekulaszitákkal vagy adszorbeáló gyantákkal végzett kromatográfia, kristályosítás, oldószeres vagy sókkal végzett kicsapás, ultraszürés, és Craigféle megoszlatási eljárás.
Az AI-3688 jelű termék elkülönítését előnyösen úgy végezzük, hogy a kultúraszűrletből megfelelő gyanta? - így például poiiszlirol-alapú gyantán - adszorbeáljuk, a terméket tartalmazó gyantát elkötöíihjük, és az AI-3688 termeket alkalmas puficrotdatokkal - igy
-2192 495 foszfát- vagy hidrogcn-karbonát-pufieroldaltal — vagy adott esetben vizet tartalmazó szerves oldószerekkel, példlul metanollal, etanollal, acetonnal, előnyösen víztartalmú izopropanollal eluálva elkülönítjük. Az inhibitort tartalmazó eluátumokat ismert módon ultraszűréssel töményítjük, s ennek során egyidejűleg sómentesítést is végzünk. Az AI-3688 termék ionszegény vizes oldatát ioncserélő oszlopon ismert módon kromatografálva elválasztásnak vetjük alá. E célra előnyösen (dietil-amino-etil)-cellulózt vagy dietil-amino-etil-csoporttal módosított cellulózt (például DEAE-Sephadex® terméket) alkalmazunk ioncserélőként; alkalmazhatunk azonban számos más, kereskedelmi forgalomból beszerezhető kation- és anioncserélő gyantát is. Az elkülönítési eljárás utolsó lépése molekulaszita (például Biogel P-6® vagy Sephadex*) alkalmazásában áll. A tiszta termék így kapott vizes oldatát például liofilizálás útján száríthatjuk. A szárazanyag fajlagos aktivitása milligrammonként 1,5 x 10* α-amiláz-inhibitor egység (gátlási egység)·
A tiszta AI-3688 jelű inhibitor színtelen polipeptid, amelynek aminosavelemzése a legtöbb természetes aminosav jelenlétét mutatja. Összetétele megfelel az fia) képletnek.
Különösen hosszabb időtartamú fermentáció során előfordulhat, hogy a kapott AI-3688 inhibitor termék nem egységes. Ilyen esetekben az egyes komponenseket nagynyomású folyadékkromatográfiával lehet elkülöníteni: e célra előnyösen fordított fázisú („reversed phase”) RP 18 hordozóanyagot alkalmazunk, és az eluálást 95 : 5 arányú víz-acetonitril elegygyel végezzük. Az így kapott komponensek megfelelnek az AI-3688 a-g változatainak. E szerkezeti variánsok hatékonysága az AI-3688 jelű termékével azonos.
Az AI-3688 jelű polipeptidre és az Al-3688 a-g szerkezeti variánsokra jellemző, hogy ezekből a metionin, izoleucin, leucin, lizin és hisztidin természetes aminósavak hiányoznak.
Az AI-3688 vizes oldatban Xmax = 275 nm-ncl az ibolyántúli fényt elnyeli Ej*c = 21 extirikcíós értékkel. Az izoelektromos fokuszálással meghatározott izoelektromos pont 4,2. Az AI-3688 inhibitor vízben és vizes pufferoldatokban jól oldódik, és oldékonysága csak az izoelektromos pont közelében csökken.
A fentiekben megadott aminosavösszetétel és önmagától értetődő módon - szerkezetük alapján az AI-3688 és annak a-g szerkezeti változatai az összes eddig ismert α-amiláz-gátló anyagoktól különböznek, tehát új anyagok.
A kémiai szerkezet - amint ezt az (la) képletben ábrázoltuk - az AI-3688 aminosavszekvenciáján kívül egy gyűrű jelenlétét is mutatja, amely 17 aminosavból áll, és a 9-es helyzetű ciszteinnek a 25-ös helyzetű ciszteinnel való kapcsolódása hozza létre. P. Y. Chou és G. D. Fasmann (Advances in Enzymology, 47. kötet, 45 — 148. oldal, kiadó: John Wiley and Són, 1978.) szerint a polipeptidek primer szerkezete - a polipeptidet felépítő egyes aminósavak és kapcsolódásuk térbeli sajátságainak, azaz sorrendjüknek cs gyürüképzésüknek az alapján - lehetővé teszi, hogy a peptidek szekunder szerkezetére következtetéseket onjunk le. Az AI-3688 inhibitor esetében elvégeztük a Chou-Fasmann elemzést. Ennek során meglepő módon azt találtuk, hogy a gyűrű -Gfo-Ser-Trp-ArgTyr- rcsz-szckvcncía exponált helyen — azaz térelrendeződes szempontjából kiemelkedő helyen - biokémiai reakciókra alkalmas módon cpiil a molekulába, és végső soron ez felelős a hatékpnyságért. Azt találtuk továbbá, hogy ha a 17 aminosavat tartalmazó gyűrűt - például a cisztin kén-kén (diszulfid) kötésének megszüntetésével - felnyitjuk, akkora térszerkezet megváltozik, ennek következtében a fenti, döntő jelentőségű rész-szekvencia térelrendeződés szempontjából már nem emelkedik ki, és ennek következtében az enzimgátló hatás veszendőbe megy. Az AI3688 α-amiláz-gátló anyag gyűrűnyílás útján keletkező kémiai származékait biológiai és biokémiai szempontból hatástalanok (lásd a 4. példát). A találmány szerinti α-amiláz-gátló anyagokra és lényegében ezeknek az anyagoknak a gátló hatására jellemző, hogy egy nagy méretű, 17 aininosavból álló gyűrűt tartalmaznak, és ebben a gyűrűben jelen van a -Gln-SerTrp-Arg-Tyr- aminosavszekvencia. A rész-szekvencia összetétele — amint ezt a találmány szerinti polipeptiJck mutatják - kevéssé befolyásolja az enzimgátló hatás erősségét. Nem lényeges továbbá a ciklusos peptid gyűrű képzésének a jellege sem: a hatékonyság szempontjából közömbös a gyűrűképzés kémiai kötésmódja vagy ennek biológiai vagy szintetikus úton való kialakítása. A lényeges annak a gyürűrendszernek a jelenléte, amely a fentebb megadott aminosavrész-szekvenciát tartalmazza.
A 2 716 050 számú német szövetségi köztársaságbeii közrebocsátási iratban leírt, Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 törzsből elkülönített a-amilázgátió anyaggal végzett visgálatok azt mutatták, hogy a gátló hatásért a fentebb megadott rész-szekvencia, valamint egy gyűrűrendszer jelenléte felelős.
A vizsgálatot a következőképpen végeztük.
A Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 törzsből kapott α-amiláz-gátló anyag rész-szekvenciáját úgy állapítottuk meg, hogy reduktív vagy oxidatív gyürönyitással lineárissá alakítottuk, és a szekvenciát egy Beckmann-Sequenator1’1 műszerrel 0,2 mólos pufferrendszerben (Quadrol1*) az automatizált aminosav(fenil-tio-hidantoin) (PTH) módszerrel határoztuk meg. Az anyag két ciszteincsoportja között - többek között - a következő rész-szekvenciát találtuk:-TyrPhe-G/a-5ar-7’rp-Hr^-ryr-Thr-Asp-Val-HÍs-.
A találmány szerinti gátló anyagok tulajdonságai a cukorbetegség és a praediabetes, valamint elhízás terápiás kezelése, továbbá a diéta elősegítése szempontjából figyelemre méltók. Sajátságaik alapján diagnosztikai célokra értékes reagensekként is számításba vehetők.
A keményítőt tartalmazó élelmi- és élvezeti szerek mind az állatoknál, mind az embernél növelik a vércukorszintet, és ennek következtében a hasnyálmirigy inzulinelválasztásának fokozódását idézik elő. A hyperglykaemia (magas vércukorszint) úgy jön létre, hogy az emésztőcsatornában az amiláz és maitáz enzim hatására a keményítő glukózra hasad.
Cukorbetegeknél a magas vércukorszint különösen kifejezett és tartós.
Az étrend kcinényítötartalma következtében beálló magas vércukorszint, valamint magas vér-inzulinszint a találmány szerinti amiláz-gátló anyagokkal, különösen az AI-3688 jelű polipeptid segítségével csökkenthető. E hatás függ az alkalmazott dózistól. A ta3
192 495 lálmány szerinti amiláz-gátlók tehát terápiásán alkalmazhatók a cukorbetegség, a praediabetes és az elhízás kezelésére, továbbá a diéta elősegítésére. E célra javasolt a találmány szerinti gátló anyagoknak különösen az étkezések során való adagolása. Az adagolás - amely a beteg testsúlyától, továbbá az egyéni szükséglettől függ — dózisonként körülbelül 10—500 mg, amelyet célszerűen minden egyes étkezés alkalmával kell bevenni. Megfelelően indokolt egyes esetekben a dózis ennél magasabb vagy alacsonyabb is lehet.
A találmány szerinti amiláz-gátlók különösen orális adagolásra alkalmasak. E célra alkalmazható a tiszta vegyület önmagában, vagy valamilyen gyógyszerkészítmény alakjában, amelyet a szokásos segédés vivőanyagok segítségével állítunk elő. Előnyös lehet továbbá a találmány szerinti vegyületek más gyógyszerekkel - például vércukorszint- vagy lipid szint-csökkentő hatóanyagokkal - kombinált alkalmazása is. Mivel nagy molekulasúlyú peptidek nem, vagy alig szívódnak fel az. emésztőcsatornából, a találmány szerinti vegyületek várhatóan semmiféle toxikus mellékhatást nem idéznek elő. Mive! aminosavösszetételük nem tekinthető rendkívülinek, azért az esetleges proteolitikus hasadási termékeik fiziológiai szempontból közömbösek. Ennek megfelelően az AI3688 jelű anyag igen magas dózisai kísérleti állatokon, semmiféle feltűnő tünetet nem idéztek elő. A találmány szerinti amiláz-gátlók farmakológiai vizsgálata céljából 200 — 250 g testsúlyú éheztetett hím Wistarpatkányoknak az AI-3688 jelű α-amiláz-gátló anya got 2 g/testsúly-kg mennyiségű keményítővel egyidejűleg orálisan adagoltuk. Az α-amiláz-gátló anyag adagolása előtt, alatt és utána vett vérpróbák vércukor-koncentrációjának meghatározásával igazoltuk az AI-3688 hatásosságát.
A vércukorszint szabályzása mellett a találmány szerinti polipeptidek a nyálban levő α-amiláz gátláss ra is alkalmazhatók. Ennek az enzimnek a hatására emésztődik a szájban a keményítő, és az így képződő cukor sietteti a fogak szuvasodását. A találmány szerinti vegyületek ezért felhasználhatók a fogszuvasodás elhárítására vagy csökkentésére.
A találmány szerinti vegyületek biokémiai reagensekként, valamint diagnosztikai szerekként is alkalmazhatók.
Vizsgálat amilázzal
Az amiláz-gátlás egysége (AIE) a gátló anyagnak az a mennyisége, amely a vizsgálati körülmények között két amiláz-egység 50 %-át gátolni képes. Nemzetközi megegyezés szerint egy amiláz-egység az enzimnek az a mennyisége, amely egy perc alatt I mikroegyenérték glukozidos kötést a keményítőben hasítani képes. A hasított glukozidos kötések mikroegyenértékmennyiségét a képződött redukáló cukor mikroegyenérték-mennyiségeként fotometriásan, dinitro-szali · cilsav segítségével határozzuk meg. Az adatokat a maltóz inikromól-mcnnyiscgébcn fejezzük ki. amelyet a maltózzal végzett kalibrálással kapott egyenesről olvasunk le.
A vizsgálatot a következőképpen hajtjuk végre:
Sertés-hasnyálmirigyből származó α-amilázt és a vizsgálandó oldatot 1,0 ml 20 millimólos foszfátpufferben, amely 10 millióról nátriumkloridot is tartalmaz, és pH-értéke 6,9, 10-20 percen át 37 “C hőmérsékleten előinkubálunk. Az enzimreakciót 1,0 ml Zulkowski-féle oldható keményítő hozzáadásával (0,25 % a fentebb megadott pufferban) indítjuk meg. Pontosan 10 perc múlva a reakciót 2,0 ml dinitroszalicilsav festekreagens (Bochringer Mannheim: Biochcmica-Information II) hozzáadásával leállítjuk, és a szín kifejlesztése céljából 5 percig forró vízfürdőben melegítjük. Lehűtés után az extinkciót 546 nm hullámhosszúságon a reagens üres értékével összehasonlítva mérjük. Az 50 %-os gátlást a nem gátolt enzimreakcióval összehasonlítva különböző inhibitormenynyiségek alkalmazásával, a valószínűségi ábrázolás segítségével grafikusan határozzuk meg.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesen ismertetjük.
7. példa
Az AI-3688 jelű anyag előállítása céljából az oltóanyagot (a mikroorganizmus tenyésztését) a mikrobiológiai gyakorlatnak megfelelően — a Streptomyces aureofaciens FH 1656, DSM 2790 törzs liofilizálással tartósított formájából egykolóniás átvitellel, ferdekémcsöves tenyésztéssel kapjuk. A fermentációhoz szükséges spórák tömegtermelését Roux-lombikokban, szilárd táptalajon végezzük.
Agar-agar táptalaj a lemezekhez, a ferdén elhelyezett kémcsövekhez és a Roux-lombikokhoz ell
Dextrin 15,0
Szacharóz 3,0
Húskivonat 1,0
Élesztőkivonat 2,0
Konyhasó 0,5
Dikálium-hidrogén-foszfát 0,5
Vas(n)-szulfát-heptahidrát 0,01
Agar-agar 2,0 pH-érték 7,3
Sterilizálás 120 °C hőmérsékleten 20 perc
Inkubálás 30 °C hőmérsékleten 9 napig
A Roux-lombikokböl a spórákat 100 ml steril vízzel leöblítjük, és Fernbach-lombikban vegetatív fermentációs előfokozat céljára átoltjuk. (A munkatérfogat 1,21.)
A fermentációs előfokozat közege:
g/i
Glukóz 30,0
Szójaliszt 20,0
Kukoricakeményítő 2,0
Karbamid 1,0
Ammónium-nitrát 1,0
Malálakivonat 5,0 pH-crték 6,8
Sterilizálás 120 °C hőmérsékleten 20 pere
Az inkubálást 28 °C hőmérsékleten 2 napon át rázógépen (150 percenkénti fordulatszámmal, 5 cm rázási amplitúdóval) végezzük
192 495
A főfermentáció végrehajtása:
órás előtenyésztés után (lásd fentebb) 200 liter térfogatú főfermentációs közeget Fernbach-Iombikból vett 1,2 liter oltóanyaggal beoltunk.
A főfermentáció közege:
eV
Oldható keményítő 4,0
Glukóz 1,0
Kazein-pepton 1,0
Kukoricalekvárlé (folyékony) 0,4
Szójaliszt 0,4
Diammónium-hidrogén-foszfát 0,8 pH-érték 8,3
Sterilizálás 120 °C hőmérsékleten 30 perc
Az inkubálást 28 °C hőmérsékleten 5 m/scc kerületi sebességgel való keverés és 0,1 térf./tcrf. levegőztetési sebességgel 5 napon át végezzük. A fermentáció során a pH-érték csökken, ezért nátrium-hidroxid hozzáadásával 5,5-6,0-ra szabályozzuk. Öt nap után elvégezzük a feldolgozást. így a tenyészlőoldat I literére számítva 60 mg AI-3688 terméket kapunk.
2. példa
18Ö liter 1. példa szerinti fermentációs oldatot centrifugálás segítségével mentesítünk a sejttömegtől, és a tiszta folyadékfázist 4,9 pH-értékre állítjuk. Ezt követően az oldatot 15 liter polisztirol-alapú adszorbeiós gyantát (Diaion® HP-20) tartalmazó oszlopra visszük, 30 liter vízzel utánamossuk, és növekvő mennyiségű izopropanolt tartalmazó vízzel eluáljuk. A 25 % izopropanolt tartalmazó elegy az AI-3688 gátló anyagot leoldja az oszlopról. Ezt a 25 liter térfogatú aktív eluátumot ultraszűréssel betöményítjük, és víz hozzáadásával, valamint további ultraszüréssel addig sómentesitjük, amíg az így kapott folyadék kimutatható sómennyiséget már nem tartalmaz. Az így kapott 1,5 liter térfogatú koncentrátumot dietil-amino-etilcsoporttal módosított cellulózon (DEAE-Sephadex ), amelyet 1 /15 mólos 5,6 pH-értékü foszfát-pufrerrel kiegyensúlyozunk, elválasztásnak vetjük alá. Az ct-amiláz-gátló aktivitást pótlólagos konyhasó-gradiens létesítésével eluáljuk. A megfelelő frakciókat sómentesítjük. Ezután a kapott oldatot ultraszűrő cellákben (Amicon®), amelyeket 1/15 mólos foszfátpuflerrel 1,6 pH-értékkel egyensúlyoztunk, töméjjyítjük. Ezt követően pótlólagos konyhasó-gradiens létesítésével eluáljuk az α-amiláz-gátló-aktivitást. A megfelelő frakciókat sómentesítjük, és ismételten töményítjük az oldatot ultraszürő cellákban. A végső tisztítást poliakrilamid-gélen (Biogel P-6®) futtatószerként tiszta vízzel végezzük. Az oszlopról eltávozó AI-3688 terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. így 1,2 g színtelen port kapunk, amelynek a-amilázgátló hatékonysága milligrammonképt 1,5 χ 10* egység.
3. példa
Több komponenst tartalmazó AI-3688 inhibitorkomplexet az 1. példa szerint állitu k elő, azzal a különbséggel, hogy az ott megadott 5 napos fermentáció helyett 8 napon át fermentálunk. A fermentációs oldat feldolgozását a 2. példa szerint végezzük. Az így kapott 0,9 g súlyú színtelen anyag kémiailag nem egységes. 100 mg így kapott port l ml 95 : 5 (térfogat/ térfogat) arányú víz-acetonitril elegyben oldjuk, és olyan acéloszlopra visszük fel (belső mérete 3,2 x 25 cm2), amely fordított fázisú Kieselgel RP18 töltetet tartalmaz. Az eluálást 95 :5 arányú víz-acetonitril eleggyel végezzük, amelynek pH-értékét trifluor-ecetsavval 2,1-re állítjuk. 7000 kPa nyomást létesítünk dugattyús szivattyúval, így az átfolyási sebesség percenként 8 ml-t tesz ki. Az oszlopról való kifolyást 276 nm hullámhosszúságú ibolyántúli fény elnyelése alapján vizsgáljuk. 41-43 perc elmúltával több abszorbeáló vegyület távozik az oszlopról, ezeket külön-külön összegyűjtjük, ct-amiláz-gálló hatásukat megvizsgáljuk, majd vákuumban bepároljuk, s utána liofilizáljuk. Az egyes frakciókat Beckmann-Sequencer 890 C műszerrel az egységesség szempontjából megvizsgáljuk, és utána az aminosavszekvenciát meghatározzuk.
Az elemzés a következő eredményekhez vezetett:
Az 1. csúcs olyan aminosavszekvenciát jelez, amelynek szerkezete megfelel az (la) képletnek, azonban a 34-es helyzetű glutamin helyett glutaminsavat tartalmaz (ez az AI-3688c termék).
A 2. csúcs olyan aminosavszekvenciát jelez, amelynek szerkezete az (la) képletnek megfelel, ez tehát az AI-3688 jelű anyag.
A 3. csúcs olyan aminosavszekvenciát jelez, amely megfelel az (la) képletnek, azonban a 14-es helyzetű glutamint glutaminsav helyettesíti (ez az AI-3688b termék).
A 4. csúcs l-dez-alanin-AI-3688 terméknek felel meg (ez tehát az AI-3688a jelű termék).
Az 5. csúcs két l-dez-alanin-AI-3688 termék keveréke, az. egyikben a 34-es helyzetű glutamint glutaminsav helyettesíti (ez az AI-3688e jelű termék), a másikban a 14-es helyzetű glutamint glutaminsav helyettesíti (ez az AI-3688d termék).
Valamennyi vegyület fajlagos α-amiláz-gátló aktivitása !,5(±0,l)χ 103 4 AlE/mg.
4. példa (A polipeptid gyűrűjének a hasítása; a hatás alapelvének az igazolása) mg 2. példa szerint előállított Al-3688 terméket 5 ml, 7,0 pH-értékű foszfátpufTerben oldunk. Egy kis próbát vizsgálat céljából kiveszünk, és 10 ml ditioeritritet adunk hozzá. Ezután 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, s utána a reakcióelegy a-amiláz-gátló hatását a kiinduló oldat gátló hatásával öszszehasonlítva megvizsgáljuk. Míg a kiinduló anyag 1,5 χ IO4 AlE/mg teljes aktivitást mutat, addig a reakcióelegy gátló hatása a kimutatási határt sem éri el.
Claims (3)
1. Eljárás az (la) képletű gyűrűs polipeptid és alábbi variánsai
- az I. helyzetben nincs alanin, igy az első aminosav a treonin,
192 495
- a 14. helyzetben glutamin helyett glutaminsav,
- a 34. helyzetben glutamin helyett glutaminsav,
- az I. helyzetben nincs alanin, igy az első aminosav a treonin, a 14. helyzetben glutamin helyett glutaminsav,
- az 1. helyzetben nincs alanin, így az első aminosav a treonin, és a 34. helyzetben glutamin helyett glutaminsav,
- a 14. helyzetben glutamin helyett glutaminsav, és a 34. helyzetben glutamin helyett glutaminsav,
- az 1. helyzetben nincs alanin, így az első aminosav a treonin, és a 14. helyzetben glutamin helyett glutaminsav, és a 34. helyzetben glutamin helyett glutaminsav előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Streptomyces aureofaciens törzset szubmerziós eljárással valamilyen fermentációs közegben tenyésztünk, a polipeptidet a micéliumból vagy a kultúraszűrletből ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Streptomyces aureofaciens DSM 2790 törzset tenyésztünk, és a kultúraszűrletből az la képletű polipeptidet vagy valamelyik 1. igénypont szerinti varidusát elkülönítjük és tisztítjuk.
3. Eljárás cukorbetegség és elhízás kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamilyen 1. igénypont szerint előállított (la) képletű vegyületet, illetve az 1. igénypontban felsorolt valamelyik variánsát, mint hatóanyagot a gyógyszergyártásban szokásos hordozó- és vivőanyagokkal összekeverünk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3402021 | 1984-01-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT37657A HUT37657A (en) | 1986-01-23 |
| HU192495B true HU192495B (en) | 1987-06-29 |
Family
ID=6225535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU844121A HU192495B (en) | 1984-01-21 | 1984-11-06 | Process for producing new polypeptides of alpha-amilase-inhibiting activity and pharmaceutical compositions containing them |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4623714A (hu) |
| EP (1) | EP0151246B1 (hu) |
| JP (1) | JPS60152500A (hu) |
| KR (1) | KR850005454A (hu) |
| AT (1) | ATE56728T1 (hu) |
| AU (1) | AU580973B2 (hu) |
| CA (1) | CA1230841A (hu) |
| DE (1) | DE3483260D1 (hu) |
| DK (1) | DK520784A (hu) |
| ES (1) | ES539678A0 (hu) |
| FI (1) | FI844289L (hu) |
| GR (1) | GR80840B (hu) |
| HU (1) | HU192495B (hu) |
| IL (1) | IL73472A0 (hu) |
| NO (1) | NO844422L (hu) |
| PT (1) | PT79840B (hu) |
| ZA (1) | ZA848651B (hu) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3508384A1 (de) * | 1985-03-08 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper |
| CA2128044C (en) * | 1993-08-05 | 2007-02-20 | Klaus-Dieter Bremer | Pharmaceutical compositions comprising a glucosidase and/or amylase inhibitor, and a lipase inhibitor |
| WO2005051298A2 (en) | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Metabasis Therapeutics, Inc. | Novel phosphorus-containing thyromimetics |
| US7262318B2 (en) * | 2004-03-10 | 2007-08-28 | Pfizer, Inc. | Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds |
| US20050288340A1 (en) * | 2004-06-29 | 2005-12-29 | Pfizer Inc | Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds |
| MX2007005137A (es) * | 2004-11-23 | 2007-06-22 | Warner Lambert Co | Derivados del acido 7-(2h-pyrazol-3-il)-3, 5-dihidroxi-heptanoico como inhibidores de hmg co-a reductasa para el tratamiento de lipidemia. |
| US7741317B2 (en) | 2005-10-21 | 2010-06-22 | Bristol-Myers Squibb Company | LXR modulators |
| US7888376B2 (en) | 2005-11-23 | 2011-02-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Heterocyclic CETP inhibitors |
| CN101663262B (zh) | 2006-12-01 | 2014-03-26 | 百时美施贵宝公司 | 用于治疗动脉粥样硬化和心血管疾病的作为cetp抑制剂的n-(3-苄基)-2,2-(二苯基)-丙-1胺衍生物 |
| DK2170930T3 (da) | 2007-06-04 | 2012-11-05 | Synergy Pharmaceuticals Inc | Agonister af guanylatcyclase, anvendelige til behandlingen af gastrointestinale sygdomme, inflammation, cancer og andre sygdomme |
| US8969514B2 (en) | 2007-06-04 | 2015-03-03 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of hypercholesterolemia, atherosclerosis, coronary heart disease, gallstone, obesity and other cardiovascular diseases |
| JP2011522828A (ja) | 2008-06-04 | 2011-08-04 | シナジー ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 胃腸障害、炎症、癌、およびその他の障害の治療のために有用なグアニル酸シクラーゼのアゴニスト |
| ES2624828T3 (es) | 2008-07-16 | 2017-07-17 | Synergy Pharmaceuticals Inc. | Agonistas de la guanilato ciclasa útiles para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, inflamación, cáncer y otros |
| WO2010093601A1 (en) | 2009-02-10 | 2010-08-19 | Metabasis Therapeutics, Inc. | Novel sulfonic acid-containing thyromimetics, and methods for their use |
| US20130072519A1 (en) | 2010-05-21 | 2013-03-21 | Edward Lee Conn | 2-phenyl benzoylamides |
| US20130156720A1 (en) | 2010-08-27 | 2013-06-20 | Ironwood Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome and related diseases and disorders |
| US9616097B2 (en) | 2010-09-15 | 2017-04-11 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Formulations of guanylate cyclase C agonists and methods of use |
| EP2680874A2 (en) | 2011-03-04 | 2014-01-08 | Pfizer Inc | Edn3-like peptides and uses thereof |
| US20150050371A1 (en) | 2012-03-09 | 2015-02-19 | Biotropics Malaysia Berhad | Extract Formulations of Rhodamnia Cinerea And Uses Thereof |
| US9708367B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Agonists of guanylate cyclase and their uses |
| AU2014235209B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-06-14 | Bausch Health Ireland Limited | Guanylate cyclase receptor agonists combined with other drugs |
| CN105143203A (zh) | 2013-04-17 | 2015-12-09 | 辉瑞大药厂 | 用于治疗心血管疾病的n-哌啶-3-基苯甲酰胺衍生物 |
| KR102272746B1 (ko) | 2013-06-05 | 2021-07-08 | 보슈 헬스 아일랜드 리미티드 | 구아닐레이트 사이클라제 c의 초순수 작용제, 및 이의 제조 및 사용 방법 |
| DK3186242T3 (da) | 2014-08-29 | 2021-12-20 | Tes Pharma S R L | Alfa-amino-beta-carboxymuconsyre-semialdehyd-decarboxylasehæmmere |
| WO2016055901A1 (en) | 2014-10-08 | 2016-04-14 | Pfizer Inc. | Substituted amide compounds |
| EP3526199B1 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-13 | Tes Pharma S.r.l. | Inhibitors of alpha-amino-beta-carboxymuconic acid semialdehyde decarboxylase |
| AR117122A1 (es) | 2018-11-20 | 2021-07-14 | Tes Pharma S R L | INHIBIDORES DE LA ÁCIDO a-AMINO-b-CARBOXIMUCÓNICO SEMIALDEHÍDO DESCARBOXILASA |
| CN113574055B (zh) | 2019-01-18 | 2024-07-23 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | Pcsk9抑制剂及其使用方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2701890C2 (de) * | 1977-01-19 | 1983-08-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung |
| DE2716050A1 (de) * | 1977-04-09 | 1978-10-19 | Hoechst Ag | Alpha-amylase-inhibitor aus einem streptomyceten und verfahren zu seiner gewinnung |
| ES505959A0 (es) * | 1980-10-09 | 1982-09-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un inactivador de alfa-amilasa |
-
1984
- 1984-11-01 DK DK520784A patent/DK520784A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-11-01 FI FI844289A patent/FI844289L/fi not_active Application Discontinuation
- 1984-11-05 GR GR80840A patent/GR80840B/el unknown
- 1984-11-06 US US06/668,839 patent/US4623714A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-11-06 NO NO844422A patent/NO844422L/no unknown
- 1984-11-06 ZA ZA848651A patent/ZA848651B/xx unknown
- 1984-11-06 HU HU844121A patent/HU192495B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-11-06 CA CA000467147A patent/CA1230841A/en not_active Expired
- 1984-11-07 AU AU35190/84A patent/AU580973B2/en not_active Ceased
- 1984-11-09 IL IL73472A patent/IL73472A0/xx unknown
- 1984-11-09 KR KR1019840007236A patent/KR850005454A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-11-20 JP JP59243562A patent/JPS60152500A/ja active Pending
- 1984-11-22 EP EP84114064A patent/EP0151246B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-22 AT AT84114064T patent/ATE56728T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-22 DE DE8484114064T patent/DE3483260D1/de not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-01-18 PT PT79840A patent/PT79840B/pt unknown
- 1985-01-18 ES ES539678A patent/ES539678A0/es active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT79840B (en) | 1986-11-14 |
| EP0151246A2 (de) | 1985-08-14 |
| GR80840B (en) | 1985-02-26 |
| ZA848651B (en) | 1985-06-26 |
| AU3519084A (en) | 1985-07-25 |
| EP0151246B1 (de) | 1990-09-19 |
| FI844289A0 (fi) | 1984-11-01 |
| FI844289L (fi) | 1985-07-22 |
| JPS60152500A (ja) | 1985-08-10 |
| PT79840A (en) | 1985-02-01 |
| ATE56728T1 (de) | 1990-10-15 |
| ES8602112A1 (es) | 1985-11-16 |
| CA1230841A (en) | 1987-12-29 |
| NO844422L (no) | 1985-07-22 |
| ES539678A0 (es) | 1985-11-16 |
| DE3483260D1 (de) | 1990-10-25 |
| DK520784A (da) | 1985-07-22 |
| HUT37657A (en) | 1986-01-23 |
| IL73472A0 (en) | 1985-02-28 |
| AU580973B2 (en) | 1989-02-09 |
| DK520784D0 (da) | 1984-11-01 |
| KR850005454A (ko) | 1985-08-26 |
| EP0151246A3 (en) | 1987-05-27 |
| US4623714A (en) | 1986-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU192495B (en) | Process for producing new polypeptides of alpha-amilase-inhibiting activity and pharmaceutical compositions containing them | |
| Suzuki et al. | Isolation and structure of bacterial sex pheromone, cPD1 | |
| EP0182315A2 (en) | Novel antibiotic NK84-0218 pharmaceutical compositions containing it and process for the production of the same | |
| Berges et al. | Peptides of 2-aminopimelic acid: antibacterial agents that inhibit diaminopimelic acid biosynthesis | |
| Park et al. | Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus peptidoglycan transglycosylases that are not penicillin-binding proteins | |
| HU217177B (hu) | Actinoplanes sp.-ből előállított, farmakológiailag hatásos lipopeptidek, ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények és eljárás előállításukra | |
| HU188684B (en) | Process for producing a2, and simultaneously produced a1 and a3 components of antibioticum a/16686 | |
| HU191746B (en) | Process for producing new proteins for diminishing level of cholesterol in the blood and pharmaceutical compositions containing them | |
| JP2603047B2 (ja) | 抗生物質ａａｄ２１６複合体を生産するキブデロスポランジウム・アリダム株 | |
| EP0187722B1 (en) | Antibiotics called "chloropolysporins b and c", a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
| Champney et al. | Molecular events in the growth inhibition of Bacillus subtilis by D-tyrosine | |
| EP0084826B1 (en) | Antibiotic compound | |
| US4618602A (en) | Amine containing pseudooligosaccharide, pharmaceutical composition and method of use | |
| King et al. | Pantothenic acid studies. VI. A biologically active conjugate of pantothenic acid | |
| US4632917A (en) | Pseudooligosaccharides with an α-glucosidase-inhibiting action, their use and pharmaceutical products | |
| HU193838B (en) | Microbial process for producing new, physiologically active compounds | |
| CZ303552B6 (cs) | Memnopeptid, farmaceutická kompozice tento memnopeptid obsahující, zpusob prípravy tohoto memnopeptidu a jeho použití k príprave léciva | |
| JPH0215031A (ja) | 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 | |
| Evans et al. | The Nutrition of C. diphtheriæ. Pantothenic Acid as an Essential Growth Factor for Certain Strains of C. diphtheriæ gravis: the Synthesis of some Physiologically Active Compounds by C. diphtheriæ Cultures in Synthetic Media | |
| US4990500A (en) | Oxirane pseudooligosaccharides, a process for their preparation, their use and pharmaceutical preparations | |
| EP0337430B1 (en) | Antitumor antibiotic kedarcidin | |
| Yoshida et al. | Effect of structural and stereochemical methylproline isomers on actinomycin biosynthesis | |
| JPH0430400B2 (hu) | ||
| JPS6337098B2 (hu) | ||
| JPS5998094A (ja) | 免疫調節剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |