HU181488B - Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex - Google Patents

Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex Download PDF

Info

Publication number
HU181488B
HU181488B HU78SA3098A HUSA003098A HU181488B HU 181488 B HU181488 B HU 181488B HU 78SA3098 A HU78SA3098 A HU 78SA3098A HU SA003098 A HUSA003098 A HU SA003098A HU 181488 B HU181488 B HU 181488B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hydrolysis
hydantoin
optically active
carbamoyl
medium
Prior art date
Application number
HU78SA3098A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Aurelio Viglia
Eugenio Fascetti
Elena Ferricone
Ludwig Degen
Original Assignee
Anic Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anic Spa filed Critical Anic Spa
Publication of HU181488B publication Critical patent/HU181488B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C273/00—Preparation of urea or its derivatives, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C273/18—Preparation of urea or its derivatives, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups of substituted ureas
    • C07C273/1854—Preparation of urea or its derivatives, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups of substituted ureas by reactions not involving the formation of the N-C(O)-N- moiety
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/833—Bacillus brevis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Eljárás racém hidantoinok hidrolízisére optikailag aktív
N-karbamoil-aminosav-származékokká és a hidrolizáló enzim-komplex előállítására
A találmány tárgya racém hidantoinokat optikailag aktív N-karbamoil-aminosavakká alakító enzim-komplexek előállítására, cs eljárás hidantoinok hidrolízisére D-konfigurációjú N-karbamoil-aminosav-származckokká.
A találmány értelmében a fenti hidrolízist úgy végezzük, hogy bizonyos mikroorganizmusok táptalajába induktorként hidantoinokat adagolunk, amikor azok hidropirimjdinhidrolázt (E. C. 3. 5. 2. 2.) termelnek.
Néhány D-konfigurációjú aminosavat, különösen a fenilglicint és a hidroxi-fenilglicint fontos köztes vegyületként széleskörűen használja a gyógyszeripar.
Számos kísérlet történt az optikai antipódok szétválasztására, ennek ellenére egyik módszer sem vált be ipari méretekben.
Az optikai antipódok elválasztására használt kémiai módszer szerint optikailag aktív vegyületeket használnak, például kámfor-szulfonsaval, borkősavat és másokul.
Ezen módszerek hátránya, hogy az átalakítás hatásfoka alacsony, és a költségek magasak.
Más módszerek szerint egy D-acil-aminosavat az aciláz enzimmel szelektive hidrolizálnak. Az acilázok azonban viszonylag ritka enzimek, és minden esetben L-acilázt is tartalmaznak. így ez a módszer, amellett, hogy bonyolult, nem biztosít megfelelő optikai tisztaságot.
A találmány szerinti enzimes hidrolízissel egy racém vegyületből előállíthatjuk egy aminosav vagy egy aminosavszármazék tiszta sztereo-izomer alakját.
A D,L-aminosavak vagy ezek származékainak enzimes szétválasztására vonatkozóan lásd a 170 211. sz. magyar, és a 2 422 737. sz. NSZK-beli szabadalmi leírást, valamint a 26 31 048. sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratot.
A fentiekben ismertetett módszerek szerint úgy járnak el, hogy az (I) általános képletű vegyületek racém alakjait, ahol 5 az (I) általános képletben X hidrogénatom, hidroxil- vagy metoxiesoport, borjümájból extrahált hidropirimidin-hidrolázzal, vagy a Pseudomonas nemhez tartozó mikroorganizmusokkal termelt hidropirimidin-hidrolázzal enzimatikusan hidrolizálják. Ez a hidrolízis az A reakcióegyenlet szerint 10 játszódik le, ahol X az előzőekben megadott jelentésű.
Úgy találtuk, hogy az (I) általános képletű racém vegyületek A reakcióegyenlet szerinti enzimes elválasztás a Bacillus genus tartozó termőül mikroorganizmusok által termelt hidrolázokkal is elvégezhető. Ezen mikroorganizmusok által 15 termelt hidrolázok hővel szemben ellenállók, így használhatók viszonylag magas, 40 C° és 60 C° közötti hőmérsékleten végzett hidrolízises reakcióknál. Ez lehetővé teszi, hogy nagyobb koncentrációjú hidantoin-oldatokkal végezhessük a reakciót, azaz csökkennek azok a hátrányok, amelyeket né20 hány hidantoin alacsony és átlagos hőmérsékleten való gyenge oldhatósága okoz.
A találmány szerinti eljárás értelmében az enzimes hidrolízishez használt, a Bacillus genusba tartozó mikroorganizmusok sejtjeit levegőztetett körülmények között, nitrogén- és 25 szénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó táptalajon 30 C° és 60 C°, előnyösen 40 C° és 60 C° közötti hőmérsékleten 10 óra és 48 óra, előnyösen 10 óra és 24 óra közötti időn át 6 és 8, előnyösen 7,4 és 7,8 közötti pH-η tenyésztjük. Szcnforrásként peptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, nit30 rogenforrásként nitrátokat, ammóniumsókat, húskivonato181488
-1181488 kát, kazeint vagy szójababot használunk. Az enzim-aktivitást D,L-hidantoinokkal, előnyösen D,L-5-metil-hidantoinnal indukáljuk. Az indukálószert adhatjuk közvetlenül a táptalajhoz, sterilezés előtt, vagy a mikroorganizmusok tenyésztése közben.
A Bergey’s Manual 7. kiadása szerint meghatározott alaktani és élettani tulajdonságok szerint a találmány szerinti eljárás során használt törzsek a Bacillaceae család Bacillus neméhez tartoznak, faj szerint Bacillus brevis és Bacillus stearothermorphilus.
A találmány szerinti eljárás jelentős, a találmány oltalmi körébe tartozó része az a más forrásokból származó hidrolázokra nem jellemző tény, hogy a fenti törzzsel termelt enzim a D,L-5-fenil-hidantoinnal azonos sebességgel hidrolizálja a D,L-5-para-metoxi-fenil-hidantoint.
A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a mikroorganizmusok tenyésztésével előállítjuk a specifikus enzimet, az előállított enzimmel, amit használhatunk baktérium szuszpenzióként, baktérium tenyészetként, vagy elkülöníthetjük a sejtekből, a hidantoinokat D-aminosav-származékokká hidrolizáljuk.
A hidantoin-származékok szelektív hidrolízisét mikroorganizmusokkal D,L-aminosavakká az alábbiak szerint végezzük és mérjük.
A különböző földmintából, trágyából, növényekből vagy hulladékból izolált baktériumtörzseket 50 C° hőmérsékleten 250 ml térfogatú, 50 ml alábbi összetételű táptalajt tartalmazó Erlenmeyer-lombikban tenyésztjük:
húspepton élesztőkivonat 1% 1%
NaCl 0,3%
D,L-5-metil-hidantion 0,1%
A táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be, a sterilizálást 30 percen
át 110 C° hőmérsékleten végezzük.
18—20 órán át 50 C° hőmérsékleten, körkörös kitérésű rázógépen végezzük a tenyésztést. Ezután 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett 100 ml táptalajt oltunk 2—2 ml ily módon készített inokulummal.
16—18 órán át tenyésztünk, majd az alábbiak szerint elvégezzük az enzimreakciót a sejtekkel:
kémcsövekbe 10 ml pH 8,5 0,07 mólos foszfát-puffért és 20pM/ml D,L-5-fenil-hidantoint, továbbá 1 ml, száraz súlyra számítva 40 mg/ml-es baktérium szuszpenziót töltünk.
percen át 40 C° hőmérsékleten inkubáljuk a sejtszuszpenziót, majd a keletkezett karbamoil-származék mennyiségi meghatározására p-dimetil-amino-benzolaldehidet adunk hozzá. A mérést J. Bioi. Chem., 238, 3325, 1963. szerint végezzük.
Az 1. táblázatban ismertetjük a használt törzseket. Ezeket 1977. február 11-én letétbe helyeztük a Northern Régiónál Research Center (Peoria, 111., USA) törzsgyűjteményében, ahol az 1286 és 1287 sorszámú törzsek az NRRL B—11 079 és NRRL B—11 080 jeleket kapták, sorrendben.
1. táblázat
Törzs N-karbamoil-fenil-glicin az elméleti hozam %-ban
1287 1286 60% 10%
Megfigyeltük, hogy míg a D-hidantoin enzimatikus hidro-
lízise alkalikus pH-értéken (pH 7—10) folyik, a vissza-
maradó L-hidantoin egyidejűleg nem enzimatikusan racemalizálódik. Ezért és mert az enzimatikusan hidrolizálódó D-hidantoin folyamatosan fogy a reakcióelegyben, a reakció végterméke a D-alak karbamoil-származéka. Az L-hídantoin racemizálódásának sebessége a hőmérséklet és a pH függ5 vénye, és minél magasabb a hőmérséklet és a pH-érték, annál gyorsabb. Ugyanekkor, ha 8 körüli értékre állítjuk be a reakcióelegy pH-ját, ez a sebesség nem olyan gyors, hogy befolyásolná a hidantoináz okozta hidrolízis sebességét. Az enzimreakciót 10 C° és 60 C°, gyakorlati szempontból elő10 nyösen 35 C° és 55 C° közötti hőmérsékleten végezzük.
Az N-karbamoil-fenil-glicint és az N-karbamoil-(para-metoxi)-fenil-glicin kémiai azonosítását a reakciótermék újrakristályosítása után az infravörös abszorpciós és a mágneses magrezonancia spektrum felvételével, tömegspektrosz15 kópiával és elemanalizissel végezzük.
Ce
A vegyületek optikai forgatása sorrendben: [a]D : —137° (konc.: 1, IN NH40H) és [a]%: —140° (konc.: 1, IN NH40H), ami megfelel az irodalomban megadott értékek20 nek·
A találmány szerinti enzimes hidantoin-hidrolízis nem csak a növekedési fázisban lévő mikroorganizmusok, a sértetlen sejtek vagy spóráik jelenlétében következik be, de végbemegy a fenti mikroorganizmusok kivonatainak adago25 lása után is.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy a sejtekben lévő hidroláz felhalmozására folyékony halmazállapotú táptalajban tenyésztjük a mikroorganizmusokat, majd megfelelő időben 30 hozzáadjuk a tenyészethez a D,L-hidantoin-származékokat.
Végezhetjük az enzimes hidrolízist úgynevezett „nyugalmi” állapotban levő sejtekkel is. Ebben az esetben elkülönítjük a baktériumsejteket a táptalajból, majd alapos mosás után megfelelő, pufferezett oldatban szuszpendáljuk őket, és 35 a szuszpenzióhoz hozzá adjuk a racém hidantoint.
Eljárhatunk úgy is, hogy hidrolázt tartalmazó készítményeket állítunk elő. Ebben az esetben a fentiekben ismertetett mikroorganizmusok sejtjeiből kivonatokat készítünk, 40 vagy előállítjuk a kivonatok koncentrátumait, vagy például a nyers vagy tisztított hidrolázokat tartalmazó készítményeket.
A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint technikai és gazdaságossági továbbfejlesz45 tésként immobilizáljuk az enzimet. Ebben az esetben az enzimet és valamely makromolekuláris vegyületet kombinálunk kémiai, ionos vagy fizikai kötésekkel.
A következő példákban a találmány szerinti eljárást részletes példákkal szemléltetjük, az oltalmi kör korlátozása 50 nélkül.
1. példa
500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 100 ml térfogatú, fentiekben ismertetett összetételű táptalajt sterilezünk, majd Bacillus brevis NRRL B 11 080 mikroorganizmussal oltjuk be. Körkörös kitérésű rázógépen 40 C° hőmérsékleten tenyésztünk, majd a tenyésztés 18. órájában 100 ml 0,14 mólos, pH
8,5, milliliterenként 40 μΜ 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó foszfát-puffért adunk hozzá. További négy órán át hasonló körülmények között folytatjuk a tenyésztést, majd meghatározzuk a keletkezett N-karbamoil-fenil-glicint.
705 mg 5-(D,L)-fenil-hidantoinból 700 mg N-karbamoil65 -fenil-glicin keletkezik, ami 90%-os hozamnak felel meg.
-2181488
2. példa
Az 1. példában megadott eljárást Bacillus stearothermophilus NRRL 11 079 mikroorganizmussal megismételjük. A tenyésztést 40 C° hőmérsékleten végezzük. Az adagolást követő 4. órában 705 mg 5-(D,L)-fenil-hidantoinból 600 mg N-karbamoil-fenil-glicint kapunk, ami 85%-os hozamnak felel meg.
3. példa
Az előzőekben megadott összetételű és literenként 1 g 5-(D,L)-metil-hidantoint tartalmazó táptalajt készítünk. A táptalaj pH-ját nátriumkarbonáttal 7,5-re állítjuk be, majd 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 50-50 ml térfogatú adagokat töltünk. 30 percen át 110 C° hőmérsékleten sterilezünk, majd hasonló összetételű és 2% Difco agart tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajon nőtt Bacillus brevis NRRL 11 080 törzzsel oltjuk a táptalajokat. A tenyésztést másodpercenként 220-at forduló, körkörös kitérésű rázógépen, 40 C° hőmérsékleten 22 órán át végezzük.
Ebből az inokulumból (optikai sűrűsége 55 nm-en, 1:10 hígítás: 0,4) 2 ml-rel 500-ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml hasonló összetételű táptalajt oltunk, majd percenként 220-at forduló, körkörös kitérésű rázógépen, 40 C° hőmérsékleten 18 órán át tenyésztünk (spórázás előtti szakasz).
5000 g mellett 20 percen át centrifugálva elkülönítjük a sejteket a táptalajból, háromszor izotóniás, 8,0 pH-jú oldattal mossuk őket, majd 0,07 mólos pH 8,5 foszfát-pufferban szuszpendáljuk; ezek a nyugvó sejtek.
Az enzimes hidrolízishez 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokban, 40 C° hőmérsékleten és percenként 220-at forduló, körkörös kitérésű rázóasztalon 64 ml, 200 mg baktériumot (száraz súly) és milliliterenként 20 μΜ (3,52 mg/ml) 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó reakcióelegyet rázunk. Megfelelő időközökben mérjük a hidrolízis termékét, azaz a D-karbamoil-fenil-glicint, a mérést 438 πιμ hullámhosszúságon kolorimetriásan végezzük.
A mellékelt 1. ábrán megadjuk a keletkező karbamoilszármazék mennyiségét az elméleti kitermelés %-ában. Az abszcisszán az időt percekben, az ordinátán a keletkező D(—)-karbamoil-fenil-glicin mennyiségét adjuk meg %-ban.
4. példa
A 3. példában megadottak szerint Bacillus brevis NRRL 11 080 sejteket állítunk elő. 0,1 mólos 8,5 pH-jú foszfátpufferban milliliterenként 41,5 mg száraz súlynak megfelelő baktériumsejtet szuszpendálunk, majd Manton Caulin homogenizátorral, 35 C° hőmérsékleten, 600 kg/cm2 nyomáson feltárjuk őket. 30 percen át 25 000 g nehézségi gyorsulás mellett centrifugálva eltávolítjuk a sejttörmeléket. A 280 egység enzimet tartalmazó 30 ml térfogatú felülúszóhoz 970 ml 0,2 mólos, 8,5 pH-jú, 4,7 g 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó foszfát-puffért adunk. Egy egység az az enzimmennyiség, amely 20 μΜ/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó 0,2 mólos, 8,5 pH-jú foszfát-pufferban 50 C° hőmérsékleten egy perc alatt egy μΜ/ml szubsztrátumot alakít át.
Egy óra múlva a reakcióelegyben 3,2 g D-karbamoil-származék van, amely megfelel 63%-os hidrolízisnek.
5. példa
Az alábbi összetételű félszintetikus táptalajt állítjuk elő:
NH4Cl 0,5%
Na,P04 0,705%
KH2P04 0,272% húspepton 0,5% élesztőkivonat 0,05%
5-(D,L)-metil-hidantoin 0,1%
A táptalajt 50—50, illetve 100—lOOml-enként 250 ml, illetve 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba osztjuk szét, és 30 percen át 110C° hőmérsékleten sterilezzük. Az inokulum előállítására Bacillus brevis NRRL 11 080 ferdeagar-tenyészetről oltjuk a 250 ml-es lombikokat, majd a 4. példában megadottak szerint 22 órán át 40 C° hőmérsékleten tenyésztünk. A tenyészet 2,5 ml-ével (optikai sűrűség 550 nm-en mérve 0,105; hígítás 1: 10) oltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett hasonló összetételű táptalajt. 15 órán át 40 C’ hőmérsékleten, a fentiek szerint tenyésztünk, majd a 4. példában megadott módon összegyűjtjük a nyugvó sejteket. Az enzimes hidrolízist 40 C° hőmérsékleten olyan reakcióelegyben végezzük, amely 64 ml pufferban 100 mg baktériumot (száraz súly, amely megfelel 100 ml tenyészetben lévő sejtmennyiségnek) és 20 μΜ/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz.
A reakció 5., 10. és 15. percében meghatározzuk a keletkező karbamoil-származék mennyiségét. Az adatokat a 2. táblázatban adjuk meg.
2. táblázat
Idő (perc) 5 10 15
A keletkező karbamoil-származék mennyisége (μΜ/ml) 0,6 1,0 1,4
6. példa
Friss vízzel nem kezelt kukoricalekvárból 2,6%-os (száraz súlyra számítva) táptalajt készítünk. A táptalaj pH-ját KOH-dal 7,5-re állítjuk be, majd 50—50 ml-enként 250 ml térfogatú, illetve 100—100 ml-enként 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba osztjuk szét. A sterilezést 110 C° hőmérsékleten, 30 percen át végezzük. Az 50 ml térfogatú táptalajokat inokulum előállítására Bacillus brevis NRRL 11 080 ferdeagar tenyészetről oltjuk, majd a 4. példában megadott módon 40 C° hőmérsékleten 22 órán át tenyésztünk.
Az inokulum 2,5—2,5 ml-ével beoltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett táptalajokat. 18 órán át 40 C° hőmérsékleten inkubálunk a fentiek szerint, majd a nyugvó sejteket a 3. példában megadottak szerint elkülönítjük. Az enzimes hidrolízist 40 C° hőmérsékleten az alábbi reakcióelegyekben végezzük:
1. 64 ml foszfát-pufferban (0,07 mólos, pH 8,5), amely 100 ml tenyészetből nyert sejteket és 20 μΜ/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz; és
2. 64 ml foszfát-pufferban (0,07 mólos, pH 8,5), amely 100 ml tenyészetből nyert sejteket és 20 μΜ/ml 5-(D,L)-para-metoxi-fenil-hidantoint tartalmaz.
A keletkező karbamoil-származék mennyiségét a reakció
5., 10., 15. és 60. percében meghatározzuk.
Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.
-3181488
3. táblázat
Idő (perc) A keletkező N-karbamoil-fenilglicin A keletkező N-karbamoil-parametoxi-fenild-glicin
μΜ/ml Konverzió, % μΜ/ml Konverzió, %
5 6,55 32,8 6,45 32,3
10 11,1 55,5 10,9 54,5
15 15,05 75,5 14,85 74,2
60 19,8 99,0 19,85 99,2
7. példa
A Bacillus brevis NRRL 11 080 törzs sejtjeiből acetonos port állítunk elő.
mg ilyen port, amely 420 egység enzimet tartalmaz, 1 liter 0,2 mólos, 8,5 pH-jú, 5,0 g 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó foszfát-pufferban szuszpendálunk.
Egy óra múlva, 50 C° hőmérsékleten 4,8 g D-karbamoilszármazékot kapunk, amely 87%-os kitermelésnek felel meg.
8. példa literes, 16 liter táptalajt tartalmazó Fomel fermentorban Bacillus brevis tenyészetet állítunk elő. A táptalaj a következő összetételű:
élesztőkivonat 1,0% húspép tón 1,0%
NaCl · 0,3%
K2HPO4 0,056%
5-(D,L)-metil-hidantoin 0,1%
A táptalaj pH-ját 7,8-re állítjuk be.
A sterilezést 30 percen át 110 C° hőmérsékleten végezzük.
Inokulumot készítünk oly módon, hogy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml térfogatú, a fentivel azonos összetételű táptalajt oltunk, majd 16 órán át, 40 C° hőmérsékleten percenként 220-at forduló körkörös rázógépen tenyésztünk. A tenyésztés befejezésekor az optikai sűrűség 1:10 arányú hígítás után, a mérést 550 nm hullámhoszszon végezve: 0,360.
160 ml így előállított oltóanyaggal beoltjuk a fermentorban lévő táptalajt. A fermentációt 41 C° hőmérsékleten végezzük, a fermentáció közben 2N sósav automatikus adagolásával 7,8-en tartjuk a táptalaj pH-ját. A fermentáció 16. órájában (optikai sűrűség 550 nm-es hullámhosszon mérve:
0,350; hígítás 1 : 10) szobahőmérsékleten, Alfa-Laval centrifugával elkülönítjük a sejteket a táptalajtól. A sejteket 8,0 pH-jú izotóniás sóoldattal mossuk, majd enzimaktivitásuk szerint adagoljuk őket.
Az enzimes hidrolízist 40 C° hőmérsékleten végezzük, az alábbi reakcióelegyekben:
1.64 ml 0,07 mólos, 8,5 pH-jú foszfát-puffer, 0,5 g sejtpaszta (0,120 g száraz sejttel azonos mennyiség) és 10 20 μΜ/ml 6-(D,L)-hidantoin;
2. mint az 1. reakcióclegy, azzal a különbséggel, hogy μΜ/ml 5-(D,L)-para-metoxi-fenil-hidantoint tartalmaz.
A keletkező karbamoil-származék mennyiségét a reakció 15 5., 10., 15. és 60. percében meghatározzuk.
Az adatokat a 4. táblázatban adjuk meg.
4. táblázat
Idő (perc) A keletkező N-karbamoil-fenil-glicin A keletkező N-karbamoil-para-metoxi-fenilglicin
μΜ/ml Konverzió, % μΜ/ml Konverzió, %
5 4,05 20,2 4,10 20,5
10 7,6 38,0 7,65 38,2
15 10,4 52,0 10,5 52,5
60 18,2 91,0 18,1 90,5
Szabadalmi igénypontok

Claims (3)

1. Eljárás racém hidantoinok optikailag aktív N-karbamoil-aminosavakká való átalakulását katalizáló enzimkomplex előállítására, azzal jellemezve, hogy a Bacillus ge-
35 nusba tartozó, hidropirimidin-hidrolázt termelő termőül mikroorganizmus-törzset, előnyösen Bacillus stearothermophilus (NRRL B—11 079) és Bacillus brevis (NRRL B 11 080) mikroorganizmust asszimilálható szén- és nitrogénforrást, ásványi sókat, valamint induktorként valamely 40 hidantoin-származékot tartalmazó tápközegben süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztünk, és kívánt esetben a kapott enzimkomplexet ismert módon kinyerjük.
2. Eljárás racém hidantoinok hidrolízisére optikailag aktív N-karbamoil-aminosav-származékokká enzim-komplex se-
45 gítségével, azzal jellemezve, hogy a reakciót az 1. igénypont szerinti eljárással kapott, a Bacillus genusbe tartozó, hidropirimidin-hidroláz aktivitással rendelkező termoül mikroorganizmusból származó enzimkomplex segítségével végezzük.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás hidantoinok hidrolízisére, 50 azzal jellemezve, hogy a reakciót 30 C° és 60 C° közötti hőmérsékleten végezzük.
HU78SA3098A 1977-03-15 1978-03-14 Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex HU181488B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT21232/77A IT1075132B (it) 1977-03-15 1977-03-15 Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in amminoacidi otticamente attivi e loro applicazioni

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU181488B true HU181488B (en) 1983-07-28

Family

ID=11178761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU78SA3098A HU181488B (en) 1977-03-15 1978-03-14 Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4248967A (hu)
JP (1) JPS53115890A (hu)
AU (1) AU519192B2 (hu)
BE (1) BE864935A (hu)
CA (1) CA1113871A (hu)
CH (1) CH636078A5 (hu)
CS (1) CS230551B2 (hu)
DD (1) DD141683A5 (hu)
DE (1) DE2811303C3 (hu)
DK (1) DK113578A (hu)
FR (1) FR2383961A1 (hu)
GB (1) GB1566088A (hu)
HU (1) HU181488B (hu)
IL (1) IL54185A (hu)
IT (1) IT1075132B (hu)
LU (1) LU79217A1 (hu)
NL (1) NL7802819A (hu)
NO (1) NO148153C (hu)
SE (1) SE7802949L (hu)
SU (1) SU1124889A3 (hu)
YU (1) YU60778A (hu)
ZA (1) ZA781447B (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3031151A1 (de) * 1980-08-18 1982-04-15 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur herstellung von d-n-carbamoyl-(alpha)-aminosaeuren und mikroorganismen dafuer
IT1209495B (it) * 1984-02-02 1989-08-30 A San Donato Milanese Milano Procedimento per la preparazione di l-alfa-amminoacidi.
US5283182A (en) * 1986-09-17 1994-02-01 Beecham Group Plc Preparation of immobilized hydantoinase stabilized with divalent metal ions
EP0377083B1 (de) * 1989-01-02 1993-09-22 Rütgerswerke Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
DE3918057C1 (hu) * 1989-06-02 1990-05-03 Degussa Ag, 6000 Frankfurt, De
US5962279A (en) * 1994-06-24 1999-10-05 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for producing D-amino acids with composite immobilized enzyme preparation
FR2728905A1 (fr) * 1994-12-29 1996-07-05 Rhone Poulenc Nutrition Animal Nouvelle acide amine amidohydrolase, sequence nuclotidique correspondant et leurs utilisations
US6121024A (en) * 1997-07-17 2000-09-19 Sudge; Sandhya Suresh Halophilic Pseudomonas strain having accession No.NCIM 5109 (ATCC 55940) and a process for preparingD(-)N-carbamoylphenylglycine using said strain

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT987278B (it) * 1973-05-11 1975-02-20 Snam Progetti Procedimento per la preparazione di l carbamil ammino acidi e dei corrispondenti l amminoacidi
US4065353A (en) * 1975-05-12 1977-12-27 Snamprogetti, S.P.A. Method for the preparation of D-carbamyl aminoacids and the corresponding D-aminoacids
IT1039757B (it) * 1975-07-10 1979-12-10 Snam Progetti Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in am minoacidi otticamente attivi e loro applicazione
US4094741A (en) * 1976-02-04 1978-06-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for preparing D-(-)-N-carbamoyl-2-(phenyl or substituted phenyl)glycines

Also Published As

Publication number Publication date
FR2383961A1 (fr) 1978-10-13
CH636078A5 (it) 1983-05-13
NL7802819A (nl) 1978-09-19
DE2811303B2 (de) 1980-07-31
AU519192B2 (en) 1981-11-19
ZA781447B (en) 1979-02-28
LU79217A1 (fr) 1978-06-28
JPS53115890A (en) 1978-10-09
AU3370478A (en) 1979-10-18
DD141683A5 (de) 1980-05-14
SE7802949L (sv) 1978-09-16
GB1566088A (en) 1980-04-30
CS230551B2 (en) 1984-08-13
NO148153B (no) 1983-05-09
DE2811303A1 (de) 1978-09-21
US4248967A (en) 1981-02-03
CA1113871A (en) 1981-12-08
NO148153C (no) 1983-08-17
IL54185A (en) 1981-09-13
IL54185A0 (en) 1978-06-15
SU1124889A3 (ru) 1984-11-15
BE864935A (fr) 1978-09-15
NO780882L (no) 1978-09-18
DK113578A (da) 1978-09-16
FR2383961B1 (hu) 1980-08-29
YU60778A (en) 1982-10-31
IT1075132B (it) 1985-04-22
DE2811303C3 (de) 1981-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS6320520B2 (hu)
CA1070254A (en) Method of converting racemic hydantoins into optically active aminoacids
IL34956A (en) Production of lipase
US4226941A (en) Process for the optical resolution of d,l-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid
HU181488B (en) Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex
JPS60244295A (ja) （十）‐トランス‐シクロプロパンカルボン酸の製造方法
GB2031896A (en) A process for the optical resolution of D,L-2-amino-4- methylphosphinobutyric acid
JPH0253029B2 (hu)
US4141790A (en) Process for the preparation of 7-amino-cephem compounds using mold fungi
EP0275901A2 (de) Verwendung von Gamma-Glutamyl-Transpeptidase
JPH07106150B2 (ja) 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ
US4229539A (en) β-Galactosidase and production thereof
JP2816167B2 (ja) α−アミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
US4357425A (en) Process for producing L-amino acid oxidase
US3239428A (en) Preparation of 6-aminopenicillanic acid by arthrobacter viscosus
JP3642344B2 (ja) クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法
CA1159783A (en) Process for producing 6-aminopenicillanic acid and 6-aminopenicillanic acid s-oxide
KR910007849B1 (ko) 신균주 스트렙토마이세스 sp.Y-183 및 이로부터 생산되는 히단토인에이즈의 생산방법
JP3433300B2 (ja) 酵母細胞壁溶解酵素高生産菌及びこれを用いる酵母細胞壁の溶解方法
US3716454A (en) PROCESS FOR THE PRODUCTION OF alpha -AMINOBENZLPENICILLIN
KR930008972B1 (ko) 신균주 슈도모나스속 y-132 및 이로부터 생산되는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제
JP3858065B2 (ja) 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法
JP3026312B2 (ja) キチン分解物の製造法
KR100232638B1 (ko) 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈를 생산하는 슈도모나스속 세균 kac-1
CZ280145B6 (cs) Způsob přípravy derivátů kyseliny 7-aminocefalosporanové a použití mikroorganismu Pseudomonas k hydrolýze těchto derivátů