HU179956B - Process for the immunological determination of antigens by means of enzyme marking - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás antigének kimutatására és mérésére enzimjelzéses immunológiai meghatározással.

A leírásban és az igénypontokban az „antigén” kifejezés nem csak olyan anyagokat jelent, amelyek ön- í maguk képesek arra, hogy állatokban antitest-termelődést váltsanak ki, vagyis nem csak az immunogéneket, hanem olyan anyagokat is — amelyeket néha hapténeknek is neveznek —, amelyek csak egy hordozómolekulához kapcsolva képesek arra, hogy specifikus antitestek 1 termelődését kiváltsák, és ezekkel reagáljanak.

Antigének jelenlétének a kimutatása és mérése elméleti és gyakorlati szempontból is érdeklődésre tarthat számot. Ezek az anyagok gyakran komplex és sokszor ismeretlen kémiai szerkezettel rendelkeznek, és biológiai 1 és más anyagokban igen kis koncentrációkban vannak jelen, ezért ezekhez a szokásos analitikai módszerek nem használhatók. Ezért az elmúlt néhány évben számos olyan antigén-antitest reakción alapuló eljárást dolgoztak ki, ahol valamely reakciókomponenst radioaktív 2 nyomjelzővel vagy például egy enzimmel megjelölnek, s így a reakciótermékek, vagy némely esetben a fel nem használt reagensek kimutathatók és/vagy mérhetők. A radioaktív jelzések alkalmazásán alapuló eljárásoknak vannak ugyan elméleti előnyei, főképpen az, hogy 2 bizonyos típusú jelöléseknél, így azoknál, ahol tríciumot vagy ¹⁴C-et használnak, a radioaktív nyomjelző maga nem vesz részt az antigén-antitest reakcióban. De vannak ezeknek az eljárásoknak bizonyos hátrányai is, amelyek ennek a technikának a használatával összefüggnek, 3 elsősorban a radioaktív nyomjelző méréséhez szükséges berendezés beszerzése, a dolgozók megvédése a radioaktivitás lehetséges káros hatásaitól és a radioaktív hulladék eltávolítása az eljárás befejezése után. Számos 5 radioaktív jelzőanyagot el kell dobni szabályos időközökben, a radioaktív izotóp radiokémiái bomlásának megfelelően. Nehézséget okozhat továbbá radioaktívan megjelölni kis molekulasúlyú antigéneket úgy, hogy esszenciális antigén-tulajdonságaikat megtartsák. Ezért 0 elég nagy érdeklődés kíséri azokat az eljárásokat, ahol az antigén-antitest reakciót olyan reagenssel követik, amelyben enzim szerepel jelzőanyagként. Ezek az eljárások viszonylag egyszerű berendezést használva könnyen elvégezhetők, és az egészségre nem ártalmasak. 5 Az eddig javasolt eljárásoknál sok esetben hátrányt jelentett azonban az, hogy a művelet sikeres elvégzéséhez a jelzőanyagként használt enzimből és a kimutatandó antigénből konjugátumot kell készíteni. Ennek a konjugátumnak az elkészítése nem mindig könnyű, mivel 0 meg kell őrizni a konjugátum enzimrészének az enzimaktivitását, és igen kényelmetlen, mivel külön konjugátumot kell készíteni minden egyes kimutatandó antigénnel. A találmány szerinti eljárásban azonban egyetlen enzimtartalmú konjugátum használható nagyszámú antigénhez. Elvileg tulajdonképpen egyetlen konjugátum is használható valamennyi antigénhez.

Egy előző javaslat szerint [Engvall és tsai: J. Immunology, 109, 129 (1972)] antitestet úgy határoztak meg, hogy azt oldhatatlan hordozón antigénnel reagáltatták, ezt követően a hordozón levő antigén-antitest konjugá-1179956 tumot reagáltatták egy enzimjelzéses anti-immunglobulinnal, amely a konjugátum antitest-részével reagálni tudott. Ebben az eljárásban a hordozóhoz kötött enzim mennyisége a mintában levő antitest mennyiségétől függ, mivel az enzimnek a hordozóhoz való kötésére a meghatározandó antitest pontosan értékelhető és lényeges befolyást gyakorol.

A találmány szerinti meghatározási módszer az ismertektől eltérő jellegű és az antigén meghatározására ezt az antigént és inszolubilizált ismert antigént is enzimmel jelzett anyaggal reagáltatjuk. A találmány tehát módszer valamilyen mintában egy antigén jelenlétének vagy mennyiségének enzimjelzéses immunológiai meghatározására olyan módon, hogy folyékony közegben (a) az antigént tartalmazó mintát, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni; (b) oldhatatlan hordozóra való felvitellel vagy oldhatatlan aggregátum formájában inszolubilizált immunogén vagy haptén antigént; (c) az inszolubilizált antigénhez és az antigénhez képest, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni, ellentétes (azaz anti), és az inszolubilizált antigénre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített „első antitestet”, és (d) enzimmel jelzett olyan „második antitestet”, amely (1) az „első antitest” immunoglobulin osztályával ellentétes, (2) az enzim és e „második antitest” közötti kovalens kötéssel enzimjelzett, és (3) az „első antitest” immunoglobulin osztályába tartozó antitestekre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített, érintkeztetjük;

az inszolubilizált antigént és a mintát az „első antitest” és az enzimmel jelzett „második antitest” előzetesen kialakított komplexével reagáltatjuk olyan módon, hogy a „második antitest” a képződő oldhatatlan anyaghoz a mintában levő antigén mennyiségével fordított arányban kapcsolódjon, és a reakcióban oldható anyag is képződik;

az oldhatatlan és az oldható anyagot szétválasztjuk; és a szétválasztott oldható vagy oldhatatlan anyag enzimaktivitásának meghatározásával a mintában levő antigén jelenlétét kimutatjuk vagy mennyiségét meghatározzuk.

A találmány szerinti eljárásban az „első antitest” és a „második antitest” komplexét a kimutatandó vagy meghatározandó antigént tartalmazó mintával érintkeztetjük, amely az inszolubilizált antigénnel azonos vagy ettől eltérő lehet.

Az „első antitest” kifejezés a leírásban és az igénypontokban olyan antitestet jelent, amely mind az oldhatatlan hordozón levő antigént, mind a kimutatandó antigént képes megkötni. A meghatározási módszer csak olyan antigén meghatározásánál használatos, amelyhez az „első antitest” is kapcsolódhat. A „második antitest” kifejezés olyan antitestet jelent, amely specifikus annak az immunoglobulin-osztálynak minden antitestére, amelyhez az első antitest tartozik, például valamennyi birka IgG-re, nyúl IgG-re vagy nyúl IgM-re. Például: ha az „első antitest” egy bizonyos állatban, például birkában termelődött immunglobulin, akkor a „második antitest” egy, az ennek az állatfajnak az immunglobulinjai ellen ható antitest. Ez a „második antitest” egy másik állapotban, például szamárban termelődik, és egyéb saját antitest sajátosságai érdektelenek.

A találmány szerinti eljárás könnyen alkalmazható nagyszámú, különböző antigén kimutatására és meg2 határozására. A jellegzetes antigének, így az emberi koriongonadotropin, a szérum és a szövetproteinek, például a_rfoetoprotein, a₂-haptoglobulin és karcinoembrionális antigén mellett használhatók haptének, így hormonok, például trijódtironin, norepinefrin, pajzsmirigy stimuláló hormon, folluculus stimuláló hormon, luteinizáló hormon, inzulin és tiroxin; szteroidok, például kortizol, progeszteron, ösztron, ösztradiol és tesztoszteron; gyógyszerek, például morfin, amfetamin, barbiturátok, difenilhidantoin, metotrexát és gentamicin; vitaminok és tápanyag-szennyezők, például piridoxál-5-foszfát és aflatoxin; herbicidek, inszekticidek és nitrozokarbamidok. Az antigént minden.. esetben megfelelő hordozóhoz kell kötni kémiai vagy — kevésbé előnyösen — fizikai úton, például a később részletesen ismertetendő módon.

Meg kell jegyeznünk, hogy az enzimmel jelzett, ' „második antitest” jellege nem függ a kimutatandó antigéntől. Csupán az szükséges, hogy az „első antitest”-et ugyanolyan fajtájú állatban termeljük, mint amilyen fajtájú állat immunglobulinjával idéztük elő a „második antitest” képződését egy másik állatfajtában. Ezért nincs szükség arra, hogy nagyszámú különböző enzimjelzéses antitestről gondoskodjunk, az enzimeknek antitestekhez történő kapcsolásával járó nehézségeket csak egyszer kell leküzdeni.

A „második antitest” jelzésére bármely enzim használható. Az oxidázok, így torma-peroxidáz, hidrolizáló enzimek, így alkalikus foszfatáz, vagy dehidrogenázok, így glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz különösen alkalmasak erre a célra. A jelzőanyagként használt enzim ideálisan a következő tulajdonságokkal rendelkezik: (1) viszonylag olcsón, nagy tisztaságban kapható, (2) aktivitása egy súlyegységre nagy; (3) vízben könnyen oldható és a szokásos tárolási körülmények között stabil; (4) egyszerű, gyors, érzékeny és olcsó meghatározási eljárás alkalmazását lehetővé teszi; (5) biológiai folyadékoktól mentes, és (6) a biológiai folyadékok ne tartalmazzanak szubsztrátum-inhibitorokat vagy aktivátorokat; (7) a második antitesthez történő kapcsolódáshoz megfelelő kémiai csoportokkal rendelkezzék, hogy olyan kapcsolódást tegyen lehetővé, amely csak minimális hatással van az enzim és az antitest aktivitására. Ezeknek a követelményeknek megfelel a Ö-galaktozidáz. Más használható, de kevésbé előnyös enzimek a glükóz-oxidáz, acetilkolinészteráz, glükoamiláz, lizozim, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és malát-dehidrogenáz.

Az alkalmazott enzimet előnyösen egy később ismertetendő kapcsolási eljárással kapcsoljuk a „második antitest”-hez, ez az eljárás az antitest és enzim bármely kombinációjához használható, feltéve, hogy az enzim merkaptocsoportot tartalmaz, vagy úgy módosítható, hogy ilyen csoportot tartalmazzon. Kívánt esetben azonban más kapcsolási eljárások is alkalmazhatók, ezek a következők:

a) Egylépéses glutáraldehides kapcsolás, ahol glutáraldehidet használunk a proteinek kapcsolására komplikált reakcióban, így nagy molekulasúlyú heterogén konjugátumokat kapunk [Avrameas, S.: Immunochemistry 6,43 (1969)];

b) kétlépéses glutáraldehides kapcsolás, ahol a tormaperoxidáz enzim csupán egy molekula glutáraldehiddel reagál. Ez megakadályozza az enzim-enzim kötést, és az egylépéses módszerhez képest tökéletesítést jelent. Ez az eljárás azonban valószínűleg nem használható sok más

6 enzimhez a tormaperoxidázon kívül, mivel ezek több mint egy molekula glutáraldehiddel reagálnak [Avrameas S. and Ternynck: Immunochemistry, 8, 1175 (1971)].

c) Az enzim szacharid-csoportjának oxidációja, majd Schiff-bázis képzése. A tormaperoxidáz több oligoszacharid-csoporttal rendelkezik, ezek oxidálása aldehidcsoportokká (perjodát alkalmazásával), amelyek aminocsoportokkal reagálni tudnak, képezi ennek a kapcsolási eljárásnak az alapját. Más enzimek szintén tartalmaznak oligoszacharid-csoportokat, és elvileg ugyancsak használhatók. Ezzel az eljárással azonban nagy molekulasúlyú konjugátumok képződnek [Nakane, P. K. and Kawaoki, A.: J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974)].

d) Dimaleimides kapcsolás, N,N'-o-fenilén-dimaleimid alkalmazásával, miután az antitestbe —SH csoportokat vittek be úgy, hogy a már jelenlevő —S—S— hidakat 2-merkapto-etilaminnal két-két —SH csoporttá redukálták [Kató és tsai: European J. Biochem. 62,285(1976)].

e) Más bifunkciós reagensek, amelyek alkalmazhatók: a toluol-2,4-diizocianát, p',p-difluor-m,m'-dinitro-fenilszulfon, 1 -ciklohexil-3-(2-morfolino-etil)-karbodiimid, de ezek a fentiekhez viszonyítva általában gyengébb eredményeket adnak.

f) Kapcsolást létesíthetünk még hetero-bifunkciós reagensekkel, vagyis olyan reagensekkel, amelyek minden molekulában két különböző funkciós csoportot tartalmaznak, ilyenek például az m-maleimido-benzil-N-hidroxi-szukcinimidészter, amit kétlépéses reakcióban alkalmaztak inzulinnak 3-galaktozidázhoz történő kapcsolásához [T. Kitagawa and T. Aikawa: J. Biochem. 79, 233 -236(1976)].

A viszonylag nagymennyiségű antitest kezelésével járó gyorsabb és kényelmesebb munka miatt gyakran célszerű, ha az „első antitest” és a „második antitest” inkább viszonylag nagy állatokban, így lóban, szamárban vagy birkában termelődik, mint kis állatokban, így patkányban, egérben, tengeri malacban vagy hörcsögben, bár ezek használata sincs kizárva. Mint már említettük, az „első antitest”-nek és a „második antitest”-nek különböző állatfajtákban kell termelődni. Azt találtuk, hogy célszerű, ha az „első antitest” birkában, míg a „második antitest” szamárban termelődik, de ha előnyös, bármely más, különböző fajta állatpár használható.

Annak lehetősége, hogy a „második antitest” zavarja az antigén és az „első antitest” reakcióját, csökken, ha a „második antitest”-et nem az egész „első antitest”, hanem csupán az „első antitest”-et alkotó immunglobulin Fc fragmentuma ellen termeljük ki.

A „második antitest”-et lényegileg ismert módon állíthatjuk elő, előnyös módon úgy, hogy az állatokat beinjekciózzuk, ezután termelődnek az antitestek, majd amikor a szérum antitest-szintek meghaladták a csúcsértéküket, az állatoknak emlékeztető dózist adunk. A vér a maximális antitest-szintet rendszerint rövid idővel az emlékeztető oltás után tartalmazza. Ha az állat véráramában megfelelően magas (vagy maximális) anti-immunglobulin szint alakult ki, akkor az állatot elvéreztetjük, és az anti-immunglobulint tartalmazó szérumot elkülönítjük.

A „második antitest”-et előnyösen úgy tisztítjuk, hogy a szamár-antiszérumot megfelelő immunadszorbenssel, például sepharose-zal, vagy más oldhatatlan aktivált hordozóval inkubáljuk. Az immunadszorbenst úgy aktiváljuk, hogy először egy megfelelő bifunkciós reagenssel, például l,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal, majd a 5 „második antitest” termeléséhez használt immunglobulin (vagy Fc fragmentuma) oldatával reagáltatjuk. így olyan immunadszórbenst kapunk, amely a „második antitest”-re specifikus, és az utóbbit úgy tisztíthatjuk, hogy az immunadszorbensen adszorbeáljuk, majd eluál10 juk, amit az enzimmel történő jelzés előtt vagy után végezhetünk.

Az enzimmel jelzett „második antitest” előállítása céljából előnyösen úgy járunk el, hogy a „második antitest”-et adszorbeálva tartalmazó immunadszorbenst 15 egy reagenssel, így metilmerkapto-butirimidát-hidrokloriddal kezelve az antitest amiiiocsoportjait módosítjuk, és minden egyes antitest-molekulába 3—5 tiolcsoportot vezetünk be. A beépült merkaptocsoportokat tartalmazó „második antitest”-et ezután az immunadszorbensről 20 eluáljuk, és megfelelő kezeléssel hozzákapcsoljuk az enzimet. Az antitestet ebből a célból előnyösen N,N'-o-fenilén-biszmaleimiddel kezeljük, majd általában E. coli-ból származó tisztított β-galaktozidázzal reagáltatjuk. Az enzim- „második antitest” konjugátumot végül 25 dietilaminoetil-agaróz gélen, vagy más megfelelő adszorbensen kromatografálva tisztítjuk úgy, hogy a konjugátumot a nem reagált enzimtől és a nem reagált „második antitest”-től elkülönítjük.

Az „első antitest”-et egy megfelelő állatban, ismert 30 módszerek alkalmazásával termeljük ki. Abban az esetben — és ez gyakran előfordul —, ha a kimutatandó vagy meghatározandó antigén viszonylag egyszerű kémiai szerkezetű haptén, például trijódtironin, ösztradiol, gentamicin, fenitoin vagy morfin, ez önmagában nem 35 képes arra, hogy az „első antitest” termelődését előidézze. Ezért szükséges, hogy az antigént egy hordozómolekulához kapcsoljuk, s így olyan összekapcsolt molekulát állítsunk elő, amely képes arra, hogy az antitest termelődését előidézze. Ebből a célból az antigént meg40 felelő módon egy olyan könnyen beszerezhető proteinhez kapcsoljuk, amely idegen attól az állattól, amelyben az „első antitest” termelődik, például marha-szérumalbuminhoz. A kapcsolást úgy végezhetjük, hogy az albumint vagy más proteint például l-etil-3-(3-dímetil45 aminopropil)-karbodiimiddel reagáltatjuk, majd az igy kapott terméket reagáltatjuk az antigénnel, amelynek ehhez a reakcióhoz egy amino- vagy karbonsav-csoportot kell tartalmaznia. Kívánt esetben más ismert kapcsolási módszerek is használhatók. Ideális esetben kb.

3—30 molekula antigént kell beépíteni az albumin vagy más nagy molekulasúlyú protein minden egyes molekulájába.

Az „első antitest”-et úgy termelhetjük ki, hogy az antigént vagy az antigén-konjugátumot heteken vagy 55 hónapokon át ismételten egy megfelelő állatba, például birkába injektáljuk, amíg az állat véráramában a szükséges kötési tulajdonságokkal rendelkező, megfelelő magas antitest-titer létrejött. Ekkor az állatot elvéreztetjük, és az anti-szérumot elkülönítjük.

Az „első antitest”-et ezután előnyösen úgy tisztítjuk, hogy oldhatatlan hordozón reagáltatjuk azzal az antigénnel, amely ellen az antitestet kitermeltük, vagy valamely rokonvegyülettel. Adszorpció után az antitesteket eluálhatjuk, például guanidin-hidroklorid oldattal ma65 gas vagy alacsony pH-értéken, nagykoncentrációjú só

-3179956 oldatokkal, vagy nemvizes oldószerekkel, majd az eluáló reagens eltávolítása céljából megfelelő pufferrel szemben dializáljuk.

Az említett tisztítási eljárásban és a találmány szerinti eljárásban az antigént, vagy ezzel rokon vegyületet hordozó oldhatatlan anyag lehet bármely megfelelő, vízben oldhatatlan anyag, amelyhez az antigén vagy ezzel rokon vegyület elég erősen köthető ahhoz, hogy a tisztítás vagy a meghatározás reakciói alatt a kötés megmaradjon. Használhatunk ugyan olyan hordozót, amely egyszerűen adszorbeálja az antigént, mint ahogyan azt Engvall és tsai ismertetik az említett irodalmi helyen, előnyösebb azonban, ha az antigént kémiailag kötjük a hordozóhoz. Ez azt jelenti, hogy a hordozónak funkciós csoportokat kell tartalmaznia, amelyeken keresztül a szükséges reakciók végbemehetnek. Üveg, nylon, poliakrilamid, cellulóz vagy dextrán hordozók használhatók. Az immunadszorbensek bizonyos típusait, amelyek hidroxilcsoportokat tartalmaznak, reagáltathatjuk 1,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal, és az így kapott terméket reagáltatjuk az antigénnel. Ez a módszer egyszerűnek, biztosnak, hatékonynak mutatkozott, és stabil kovalens kötést biztosít, feltéve, hogy az antigén, vagy ezzel rokon vegyület hidroxil-, amíno- vagy tiolcsoportokat tartalmaz. Az antitestek tisztítására szolgáló immunadszorbens iránti követelmények nem szükségszerűen azonosak a meghatározás során használt immunadszorbens iránt támasztott követelményekkel.

A találmány szerinti eljárás több különböző változatban elvégezhető. Az „első antitest” és így az oldhatatlan antigénhez kötött jelzőanyag mennyisége fordított arányban van a vizsgálandó mintában levő antigén mennyiségével. A szabad enzimaktivitást, vagy az old.batatlan, illetve hordozóra vitt antigénhez kötött enzimaktivitást kimutatjuk vagy mérjük. A találmány szerinti eljárás néhány specifikus kiviteli módját a következőkben ismertetjük.

Egyik változat szerint az „első antitest”-et az enzimmel jelzett „második antitest”-tel reagáltatva komplexet képezünk, amit azután feleslegben adunk a meghatározandó antigént tartalmazó mintához, és a keveréket inkubáljuk. Ezután a keverékhez adjuk az oldhatatlan hordozóra vitt antigént, inkubáljuk, és a szilárd és folyékony fázist elkülönítjük. A folyékony fázis enzimaktivitásának meghatározásából kapott eredmény egyenesen arányos a mintában levő antigén mennyiségével.

Egy másik változat szerint az „első antitest”-ből és a „második antitestéből képezett komplexet, a meghatározandó antigént tartalmazó mintát és az antigént tartalmazó hordozót egyidejűleg inkubáljuk, a szilárd fázist elkülönítjük, és a folyékony fázis enzimaktivitását meghatározzuk. Az eredmény szintén egyenesen arányos a mintában levő antigén koncentrációjával.

Amint azt már említettük, a fenti első eljárással végzett kvantitatív meghatározás esetében az alkalmazott „első antitest” mennyiségének feleslegben kell lennie ahhoz a mennyiséghez viszonyítva, amelynek a mintában levő összes antigénnel reagálni kell, és az antigént tartalmazó hordozót megfelelő feleslegben kell alkalmazni ahhoz, hogy a mintában levő antigénnel nem reagált összes „első antitest” adszorpcióját lehetővé tegyük. Gyakorlatilag ennek a legegyszerűbb módja, ha egy sorozatmeghatározást végzünk az „első antitest” geometriai vagy számtani sorban vett különböző koncentrációival. Ha ezt elvégeztük, akkor egyszerű megállapítani az „első antitest” azon koncentrációját, amely pontos meghatározás elvégzését teszi lehetővé.

A találmány szerinti eljárás kiviteli módját a példák szemléltetik. A példákban megadott hőmérsékleti értékek °C-ban értendők.

Reagensek előállítása

1. „Második antitest” előállítása és jelzése

a) Birka immunglobulin (IgG) Fc fragmentumának előállítása

Birka immunglobulin Fc fragmentumának előállítását Porter módszerével [R. R. Por tér: Biochem. J. 73, 119 (1959)] végezzük.

320 ml szérumot gyűjtöttünk 28 birkából. 150 ml szérumot 30 g nedves dietilaminoetil-(DEAE) — A 50 Sephadex géllel — amit előzetesen 10 mmólos foszfát-pufferrel 6,5 pH-értéken kiegyensúlyoztunk — keverés közben jégfürdőben inkubálunk. 1 óra elteltével a gélt durvaszemcsés zsugorított üvegszűrőn szűrjük, és 50 ml 10 mmólos, 6,5 pH-értékű foszfát-pufferrel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékokat még egyszer inkubáljuk 30 g nedves DEAE-Sephadex géllel, szűrjük, és 100 ml fenti foszfát-pufferrel mossuk. A szűrfetet és a mosófolyadékokat (300 ml) 150 ml telített ammónium-szulfát-oldattal kezeljük, amit lassan, folytonos keverés közben adunk az oldathoz. A csapadékot kiszűrjük, és 100 ml 20%-os ammóníum-szuMat-oldattal mossuk. Az így kapott csapadékot 50 ml, 8,0 pH-értékű 50 mmólos foszfát-pufferban feloldjuk, és 4°-on 5 liter desztillált vízzel szemben éjszakán át dializáljuk, majd az oldatot liofilizáljuk.

1,50 g így kapott lioíilizált birka IgG-t feloldunk 10 mmól ciszteint és 2 mmól etiléndiamintetraecetsavat tartalmazó 50 ml, 0,1 mólos, 7,2 pH-értékű trisz-HCl pufferban. A puffért közvetlenül a felhasználás előtt készítjük el. Az oldathoz papainnak (SIGMA, kétszer kristályosított) 50 mmólos, 4,5 pH-értékű acetát-pufferrel készített 0,6 ml kristályos ’szuszpenzióját adjuk. Az oldatot 37°-on 4 órán át inkubáljuk, miközben néha megrázzuk. Az oldathoz ezután 0,222 g jódacetamidot adunk, és az oldatot azonnal G—100 Sephadex-oszlopra (80x5 cm) visszük, amelyet előzetesen 10 mmólos, 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel 4°-on kiegyensúlyoztunk.

Az oszlopról 10 mmólos, 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel eluált második csúcs az Fc és Fab fragmentumok keverékét tartalmazza. Az első csúcs emésztetlen IgG-t tartalmaz. A második csúcsot karboximetilcellulóz oszlopra (Whatman CM 32, 50x2,5 cm) visszük, amit előzetesen 10 mmólos, 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel 4^c-on kiegyensúlyoztunk. Egy csúcsot eluálunk az oszlopról 10 mmólos 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel mosva, és több kisebb csúcsot és egy nagyobb csúcsot eluálunk, ha 10 mmólos — 500 mmólos acetát-pufferrel 5,6 pHértéken gradiens-elúciót végzünk (1000 ml a grádienskcverő mindegyik tartályában). A nagyobb csúcsot összegyűjtjük, és a karboximetilcellulóz oszlopon újra kromatografáljuk. Ezúttal 10 mmólos — 300 mmólos gradiensű, 5,6 pH-értékű acetát-puffert alkalmazunk, a keverőedényben 1000 ml-rel. Egyetlen csúcsot eluálunk, ezt összegyűjtve desztillált vízzel szemben alaposan dializáljuk és liofilizáljuk.

-4179956

b) „Második antitest” előállítása (szamárból származó anti-birka immunglobulin)

Stabil emulziót készítünk úgy, hogy 1 rész, Fc fragmentumot (0,75 mg/ml) és Bacillus Calmette-Guerin-t (BGG) (1,5 mg/ml) tartalmazó nátriumklorid-oldatot és 2 rész Marcol 52 adjuvánst (Freund-féle adjuváns származéka) keverünk. Az emulzióból hat intramuszkuláris injekciót (1 ml) adunk az állat alsó lábszárába. A szamárban ellenőrizzük anti-birka antitestek termelődését, 2 hónap múlva az állat kész az emlékeztető oltásra. A 2 rész adjuvánsból és 1 rész sóoldatból (0,75 mg/ml birka Fc) álló emulziót hat helyen (0,5 ml) im. beadjuk az állat alsó lábszáraiba. Az ezt követő 10 nappal és a következő hónapban vett vér magas antitesttiterű.

c) Immunadszorbens készítése szamárból származó anti-birka immunglobulin tisztításához

Sepharose 4B-t aktiválunk 1,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal úgy, hogy a gél, a biszepoxid és 2 mg/ml nátriumbórhidridet tartalmazó 0,6 mólos nátriumhidroxid egyenlő térfogat-mennyiségeit folytonos keverés közben 25°-on 8 órán át inkubáljuk, majd mossuk. Birka IgG-t készítünk normál szérumkeverékből, 33%os ammóniumszulfáttal kicsapva. Az IgG-t 0,1 mólos, 10 pH-értékű nátrium-hidrogén-karbonát-pufferben feloldjuk, és ezt az oldatot 10 mg birka IgG/ml gél menynyiségben az aktivált gélhez adjuk. Az aktivált gélt az IgG-vel 48 órán át inkubáljuk, az immunadszorbenst mossuk, és 24 órán át 0,1 mólos etanolaminnal, 10 pHértéken kezeljük.

d) Szamárból származó anti-birka „második antitest” tisztítása és jelzése

A szamárból származó anti-birka immunglobulint úgy tisztítjuk, hogy a szamár anti-szérumot (készítését lásd fent) az immunadszorbenssel (előállítását lásd fent) inkubáljuk. Amíg az immunglobulint az immunadszorbens adszorbeálja, tiolcsoportokat építünk az immunglobulinba, az immunglobulin aminocsoportjainak módosításával. A módosításhoz metil-4-merkapto-butirimidát-HCl-t használunk. A módosítást úgy végezzük, hogy egy globulinmolekulára legfeljebb 3—5 tiolcsoport jusson.

Az immunadszorbens-antitest komplexet mossuk, és 0,1 mólos N-etilmorfolin-hidrokloridban 7,5 pH-értéken szuszpendáljuk, úgy, hogy a koncentráció 1 ml immunadszorbens legyen 10 ml teljes térfogatban. Metil-4-merkapto-butirimidát-hidrokloridot 0,2 mólos nátrium-karbonátban oldunk (10 mg/ml) közvetlenül a felhasználás előtt. Ebből az oldatból 0,1 ml-t adunk a szuszpenzió minden 10 ml-éhez. A szuszpenziót 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd 10 ml pufferben 1 mg ditiotreitolt tartalmazó 0,1 mólos 7,5 pH-értékű N-etil-morfolin-hidro-kloriddal mossuk. A gélt ezután 0,1 mól nátrium-kloridot tartalmazó sósavval 3,5 pHértékig alaposan átmossuk.

Az ily módon előállított, beépített tiolcsoportokat tartalmazó immunglobulint (0,1 mól) nátrium-kloridot tartalmazó 2,5 pH-értékű sósavval eluáljuk. Ezt a legegyszerűbben úgy végezzük, hogy az immunadszorbenst kis oszlopba töltjük, és az eluátumot puffért tartal mazó kémcsövekbe gyűjtjük. Mivel az eljárás következő lépését 0,1 mólos acetát-pufferben végezzük 5,0 pHértéken, az eluátumot elegendő 0,1 mólos 6 pH-értékű acetát-pufferben összegyűjteni, hogy a végső pH-érték 5,0 legyen.

2,5 mg, tiolcsoportokkal módosított immunglobulint tartalmazó, 2 ml 5,0 pH-értékű 0,1 mólos acetát-puffert jégfürdőben lehűtünk. Ezt az oldatot jégfürdőn lassan N,N'-o-fenilén-biszmaleimid 0,1 mólos 5,0 pH-értékű acetát-pufferrel készített telített oldatának 1 ml-éhez csepegtetjük. Ezután a keveréket 20 percig 30°-on inkubáljuk, majd az immunglobulint a feleslegben levő N,N'-o-fenilén-biszmaleimidtől elkülönítjük, úgy, hogy az oldatot G—25 Sephadex oszlopon (20x1,5 cm) folyatjuk át, amit előzetesen szobahőmérsékleten 0,01 mól magnézium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos 6,0 pHértékű foszfát-pufferrel kiegyensúlyoztunk.

Escherichia coli-ból származó, ammóniumszulfáttal kicsapott 5,0 mg β-galaktozidázt feloldunk a tisztított aktivált immunglobulin-oldatban, és az oldatot 30°-on 4 órán át inkubáljuk. Az oldathoz annyi n nátriumhidroxid oldatot adunk, hogy a reakciókeverék pHértékét 7,5-re beállítsuk, és annyi 2 mólos 2-merkapto-etanolt, hogy annak végső koncentrációja 10 mmól legyen.

Az immunglobulin-enzim konjugátum oldatát DEAEAgarose (Biogel) oszlopra (60 x 0,9 cm) visszük, amit előzetesen 10 mmól 2-merkapto-etanolt, 10 mmól magnézium-kloridot és 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó, 10 mmólos 7,5 pH-értékű trisz.HCl pufferrel 4°-on kiegyensúlyoztunk. Az oldatot a kiegyensúlyozó oldattal bemossuk az oszlopba. 50 mmólos — 200 mmólos gradiensű, nátriumkloriddal gradiens-elúciót végzünk a fenti pufferben. A keverőedényekben 250 ml oldat van. Az enzimmel nem konjugált immunglobulin az oszlopon nem adszorbeálódik és eluálódik, mielőtt a gradienst alkalmaznánk. Amikor a gradienst alkalmazzuk, akkor az enzimmel jelzett immunglobulin eluálódik a szabad enzim előtt. Azt az eluált frakciót, amely a jelzett immunglobulint tartalmazza, liofilizáljuk, így kapjuk az enzimmel jelzett második antitestet a találmány szerinti eljáráshoz.

2. „Első antitest” előállítása

a) Trijódtironin (T₃) konjugátum előállítása

250 mg marha-szérumalbumint 25 ml desztillált vízben és 1000 mg l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimidet 50 ml desztillált vízben feloldunk. Mindkét oldatot lehűtjük 4°-ra, és a második oldat kétharmad részét lassan az első oldathoz keverjük. 150 mg tisztított trijódtironint etanol-2m ammónium-hidroxid 25 : 1 térfogatarányú keverékének 25 ml-ében feloldunk, és az oldatot 4°-ra lehűtve folytonos keverés mellett a fenti keverékhez csepegtetjük, 0,25 mólos sósav becsepegtetésével 7,0 pH-értéket tartva. A reakcióelegyet további 10 percig keverjük, és a maradék l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid-oldatot 7,0 pH-értéket tartva hozzácsepegtetj ük.

A keveréket 4°-on éjszakán át keverjük. Reggel az oldatot centrifugáljuk, és a felülúszó részt 0,1 mólos, 11,0 pH-értékű nátrium-karbonát/nátrium-hidrogén-karbonáttal szemben, három ízben, majd desztillált vizzel szemben dializáljuk. A terméket végül liofilizál5

-5179956 juk. Meghatároztuk, hogy a marha-szérumaíbuminba mennyi trijódtironin épült be, és azt találtuk, hogy ez az érték 4,3 mól T₃/l mól marha-szérumalbumin.

b) „Első antitest” készítése (T₃-antitestek)

Tween 80-at (50%), T₃-marha-szérumalbumint (2 mg/ml) és Bacilhts Calmette-Guerint (BCG 1 mg/ml) tartalmazó sóoldatból 1 részt keverünk 2 rész Marcol 52 adjuvánssal, és így stabil emulziót képezünk, Az emulzióból hat 1 ml-es dózist injektálunk szubkután az állatok hátába, és négy 0,75 ml-es dózist intrarnuszkulárisan a lábszárukba. Ellenőrizzük az antitest-titert, és 36 hét után az állatoknak emlékeztető oltást adunk. Ebből a célból hat 0,5 ml-es intramuszkuláris dózist adunk az állatok lábszárába. Az emulzió 2 rész adjuvánsból és 1 rész, T₃-rnarhaszérümalbumin-konjugátumot (2 mg/ml) tartalmazó sóold.atból áll. Az emlékeztető oltás után 10 nappal és a következő 2 hónap alatt vett vér magas T₃ antitest-titerű.

c) Immunadszorbens készítése az első antitest tisztításához

Sepharose 4B-t l,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal a már ismertetett módon aktiválunk, 4 ml aktivált Sepharose 4B-t 50 mg trijódtironint (T₃) tartalmazó foszfát-pufferhez (pH=12,0, 0,025 mólos, 20. ml) keverünk, és a puffért szobahőmérsékleten 45 órán át keverjük. A gélt ezután foszfát-pufferrel (pH=12,0, 0,025 mólos, 250 ml), nátriumklorid-oldattal (0,1 mólos, 150 ml) és desztillált vízzel (100Q ml) mossuk. 1 ml duzzasztott gélbe 9 mg trijódtironint építünk be, A megmaradó biszepoxidot úgy blokkoljuk, hogy a gélt térfogatára számítvanégyszeres. mennyiségű vizes etanolaminban (1 mólos, pH=ll) szuszpendáljuk, és 4 órán át rázzuk. A gélt ezután a feleslegben levő, etanolamin eltávolítása céljából desztillált vízzel alaposan kimossuk,

d) Az „első antitest” tisztítása ml anti-T₃ szérumot (előállítását 1. fent) és 1 ml T_s-szubsztituált Sepharose-t (immunadszorbens, előállítását lásd fent) 1 órán át szobahőmérsékleten keverünk. A nem specifikusan adszorbeált proteineket foszfát-pufferos só.oldattal (0,05 mólos, pH=7,0, 0,2 mólos nátrium-klorid) végzett alapos mosással távolítjuk el az imrmmadszorbpnsről, A.gélt a már említett módon, kis oszlopba (fecskendőbe) töltjük, és sósavval (pH—3) mosva a foszfát-pufTert eltávolítjuk^ A..T₃-antitesteket guanidin-hidrokloriddal (4 ml, 6 mólos, pH=2) mosva eluáljuk, és veronál-pufferbe (1 ml, 0,05 mólos, pH—8,6, 0,1% marha-szérumalbumin) gyűjtjük, AT₃-antitesteket a guanidin-hidroklorid eltávolítása céljából, a fenti púderrel szemben alaposan dializáljuk,

3. Hordozóra vitt antigén (T₃) előállítása a meghatározáshoz

Az eljárás azonos a 2. c) szerintivel, ahol az első antitest tisztítására szolgáló, immunadszorbenst .állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a T₃-koncentráció kisebb. Ez csökkenni a gélbejutó szubsztituált T₃ koncentrációját is.

A T₃ meghatározását a fent ismertetett reagenseket használva, a már említett módon végezzük.

Különböző eltérő eljárásváltozatok használhatók. Ezek a következők lehetnek;

(1) eljárásváltozat

Az „első antitest” komplexét az enzimmel jelzett „második antitesttel” ink,ubáljuk, így egy előzetesen kialakított komplexet kapunk, ezt az előzetesen kialakító tott komplexet adjuk a mintához. Megfelelő idő után ehhez adjuk az immunoadszorbenst (inszolubilizált antigén).

(2) eljárásváltozat

Ez a módszer a minta és az immunoadszorbens egyidejű hozzáadását foglalja magában.

A következő példákban ismertetjük a fenti módszerekkel végzett meghatározások eredményét.

Trijódtironin (T₃) enzimjelzéses immunológiai meghatározása

A T₃ meghatározását több különböző eljárás alkalmazásával végeztük.

1. példa (1) eljárásváltozat

Tisztított T₃ antitesteket (1: 5000 hígítás) veronál-pufferben (0,05 mólos, pH=8,6, 0,1 súly/térfogatszázalék marha-szérumalbumin, 8,5 ml) enzimmel jelzett „második antitest”-tel (szamárból származó anti-birka 35 IgG-^-galaktozidáz konjugátum, 5,1 ml) keverünk, és a keveréket szükség szerinti ideig 4°-op tartjuk·.

T₃ standardokat veronál-pufferben (50 μΐ) összekeverjük az enzimmel jelzett „második.; antitest”—„első antitest” komplexszel (200 μΐ), még 0,5 μΐ veronál-puf40 fejt adunk a keverékhez, és 4 órán át 4°-on Tartjuk. A csövekben levő keverékhez T₃ immunadszorbenst (50 pg) adunk 0,4% Tw^ep 80-at tartalmazó veronál-pufferben, és a csöveket 1 órán át 4°-on inkubáljukAz immunadszorbenst 5%, majd ,1% nátriumkloridot 45 tartalmazó verpnál-pufferrel mossuk. Az immunadszorbenshez kötött epzimáktiyitást,,a. szokott módszerekkel mérjük.

Eredmények:
50	T3-konceptráció	Δ Optikai sűrűség.	A zéró köjés*
	(nmól/liter)	(1 óra)	százalékban
	0	0,44;	100.
	0,125	0,40	83
	0,25	0,36	69
55	0,5	0,37	74
	1	0,29	46
	2	0,24	27
	4	0,20	15
	8	0,19	12
60	Nem-specifikus kötés 0,16.

* A nem-specifikus kötés levonása utáp számítva..

Ezt a kísérletet szamárból származó, antübirka. Fcenzim jelzőanyaggal megismételtük. Az eredmények a 65 fentiekhez hasonlóak voltak.

-6179956

2. példa (2) eljárásváltozat

T₃ standardokat veronál-pufferben (100 μΐ) összekeverünk enzimmel jelzett „második antitest”—„első antitest” komplexszel (200 μΐ) és T₃ immunadszorbenssel (25 μg) 0,4 súly/tcrfogatszázalék Tween 80-at tartalmazó 100 μΐ veronál-pufferben, és a keveréket 2 órán át 4°-on inkubáljuk. Az immunadszorbenst mossuk, és a kötött enzimet a szokott módon meghatározzuk.

Eredmények:
T3 koncentráció	Δ Optikai sűrűség	A zéró kötés*
(nmól/liter)	(1 óra)	százalékban
0	0,33	100
0,5	0,32	94
1	0,29	83
2	0,28	77
4	0,24	60
8	0,21	42
16	0,18	32
Nem-specifikus kötés 0,114.

* A nem-specifikus kötés levonása után számítva.

3. példa (1) eljárásváltozat

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a standardokat hőkezelt plazmában készítjük el. A tiroidokat megkötő globulinokat elbontjuk úgy, hogy a plazmamintákat 70°-os vízfürdőn 1 órán át melegítjük. A kapott eredmények hasonlóak az 1. példa szerintiekhez.

A találmány keretébe tartozik a találmány szerinti eljárásnak a specifikus antigénekkel történő végrehajtásához szükséges anyagokat tartalmazó készlet is. Egy ilyen készlet tartalmazza a (1) tisztított első antitest és az enzimmel jelzett második antitest előzetesen kialakított komplexét és (2) egy inszolubilizált antigént, és kalibrálási célra előnyösen tartalmazza annak az antigénnek az ismert mennyiségét tartalmazó oldatát, amelyet a készlettel ki akarunk mutatni, vagy meg akarunk határozni.

Előnyös lehet, ha a szilárd fázist egy pálcikához erősítjük, amely a meghatározásra szolgáló keverék többi komponenseibe helyezhető, vagy azokból eltávolítható. Ez megkönnyíti a szilárd fázis mosását és növeli a meghatározás pontosságát.

így például egy trijódtironin (T₃) meghatározására szolgáló készlet a következő komponensekből áll:

1. Oldhatatlan hordozó pufferben (például Veronái) szuszpendálva, vagy liofilizált formában, ehhez van kötve a T₃ antigén.

2. Az első antitest (anti-T₃, birkában termelve) és a második antitest (szamárban termelt anti-birka IgG Fc) előzetesen kialakított komplexe. A második antitest β-galaktozidázzal van jelölve, ez a komponens előnyösen liofilizált formában van.

3. Egy szubsztrátum (például nitrofenil-galaktozidáz) kb. 10—3 mól végső koncentrációban egy pufferben (például veronál), amelynek pH-értéke előnyösen 7—9 és molaritása 0,010—0,200. Ez a komponens előnyösen liofilizált formában van.

4. A T₃ antigén ismert mennyiségét (például 10 nmól/liter) tartalmazó oldat, ez a komponens előnyösen liofilizált formában van.

Claims (5)

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás valamilyen mintában egy antigén jelenlétének vagy mennyiségének enzimjelzéses immunológiai meghatározására azzal jellemezve, hogy folyékony közegben a) az antigént tartalmazó mintát, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni; b) oldhatatlan hordozóra való felvitellel vagy oldhatatlan aggregátum formájában inszolubilizált immunogén vagy haptén antigént; c) az inszolubilizált antigénhez és az antigénhez képest, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni, ellentétes, és az inszolubilizált antigénre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített „első antitest”-et, és d) enzimmel jelzett olyan „második antitest”-et, amely (1) az „első antitest” immunoglobulin osztályával ellentétes, (2) az enzim és a „második antitest” közötti kovalens kötéssel enzimjelzett, és (3) az „első antitest” immunoglobulin osztályába tartozó antitestekre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített, érintkeztetjük, mégpedig úgy, hogy az inszolubilizált antigént és a mintát az „első antitest” és az enzimmel jelzett „második antitest” előzetesen kialakított komplexével reagáltatjuk olyan módon, hogy a „második antitest” a képződő oldhatatlan anyaghoz a mintában levő antigén mennyiségével fordított arányban kapcsolódjon, és a reakcióban oldható anyag is képződik;

az oldhatatlan és oldható anyagot szétválasztjuk;

az elválasztott oldhatatlan vagy oldható anyag enzimaktivitásának meghatározásával a mintában levő antigén jelenlétét kimutatjuk vagy mennyiségét meghatározzuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a komplexet a mintával, majd az inszolubilizált antigénnel reagáltatjuk, és a komplex mennyisége több, mint amennyi a mintában levő összes antigénnel reagálni képes, de éppen elegendő ahhoz, hogy a mintában levő összes antigén és az összes inszolubilizált antigén együttes mennyiségével reagáljon.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a komplexet az inszolubilizált antigénnel és a mintával egyidejűleg reagáltatjuk.

4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a mintában levő antigénnel azonos inszolubilizált antigént használunk.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás

-7179956 foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a mintában levő antigén jelenlétét vagy mennyiségét az elválasztott folyékony fázisban levő enzim aktivitásából határozzuk meg.

6. Készlet az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kivitelezésére azzal jellemezve, hogy (1) a tisztított „első antitest” és az enzimmel jelzett „második antitest” 1. igénypontban meghatározott, előzetesen kialakított komplexét és (2) az 1. igénypontban meghatározott, inszolubilizált antigént tartalmazza.

5 7. A 6. igénypont szerinti készlet kiviteli alakja azzal jellemezve, hogy a kimutatandó vagy meghatározandó antigén ismert mennyiségét tartalmazó oldatot is magában foglal.