CS208739B2 - Method of immunological determination of the antidotes by means of the bonded enzyme - Google Patents

Abstract

In order to determine the presence or the quantity of an antigen, an antigen (1) in insoluble form and two antibodies (2) and (3), of which the second is labelled with an enzyme, are brought into contact in the sample to be analysed. The second antibody (3) binds to the insoluble antigen (1) in a proportion which is the inverse of the quantity of antigen present in the sample. The insoluble fraction and the soluble fraction are separated and the enzymatic activity of one or the other is measured.

Description

Vmniez se týká způsobu imirnoOogického stanovení protilátek pomooí vázaného enzymu a prostředku k provádění tohoto způsobu. Pod pojmem rnitigen se v tomto sm*Slu rozumějí nejenom látky,'které jsou schopné vyvolat tvorbu protilátek u savců, tj. imiunogeny, nýbrž také látky obvykle nazývané hapteny, které po navázání . na dalSÍ molekulu jsou schopné vyvolat tvorbu protilátek a s těmito specifickými protilátkami reagovat.The invention also relates to a method for the immunological determination of antibodies by means of a bound enzyme and to a means for carrying out the method. The term rnitigen in this sense means not only substances which are capable of inducing antibody production in mammals, i.e., immunogens, but also substances usually called haptens which, upon binding. they are capable of eliciting antibody formation and reacting with these specific antibodies.

Je velmi dCůežité, aby bylo možno stanovit a měěit mnžství vznikej dících antigenů. Obvykle jde o koi^p^pť^eaní látky, Často s neznámou chemickou strukturou, přičemž se tyto látky v biologických i jiných maaeeiálech ve velmi nízkých koncentracích, takže není možné použít běžné analytické metody. V důsledku toho vznikaly v několika posledních letech způsoby zjišťování těchto látek, které byly založeny na reakci mezi antigenem a protilátkou a v nichž byla jedna z reakčních složek značena radioaktivním atomem nebo enzymem, takže produkty této ¹ reakce, nebo v některých případech nespotřebované činidlo bylo možno zjistit a/nebo i kvalitativně stanovit. Metody, založené na ponižtí radioaktivně značených látek, maaí některé teoretické výhody, jde zejména o to, že tyto ' látky, zvláště v případě pouužtí tricia nebo ¹⁴C, oeioterferují tyto ^látky s vlastoí rea^kcí . mezi antogenem a ^0^1^^^ na druhé straně maaí tyto metody nevýhody, které spočívají v poddtatě použitých metod, zejména v tom, že je zapotřebí pouS^t zcela zvláštních přístrojů k-měření radioaktivně značených látek a mimoto je zapotřebí chránit personál laboratoře před.možnými nepříznivými účinky radioaktivity. Mimoto je nutno odstranit bezpečným způsobem použitý radioaktivní maatriál. Navíc je nutno některé radioaktivně .značené látky odstraňovat ' v pravidelných intervalech, vzhledem k radiochemickému rozkladu radioaktivního izotopu.. .Mimoto může být velmi obtížné značit tímto způsobem antigeny s nízkou molektu.ární hmootossí při zachování jejich základních ahtigenních vlastností. Ve středu zájmu jsou z tohoto důvodu způsoby; jíMž je možno sledovat reakci mez ji antigenem a protilátkou při pouužtí činidla, v němž já značenou složkou enzym. Tyto metody je možno provádět jednoduchým způsobem při použití poměrně jednoduchého zařízení a mimoto nejsou tyto metody spojeny s žádným nebezpečím vzhledem ke zdravotnímu stavu personálu. Řada navrhovaných metod však měla tu nevýhodu, že je předem nutno připravit konjugát užitého enzymu a antigenu, který má být stanoven. Příprava těchto konjugátů není vždy snadná, protože je nutno zachovat enzymatickou účinnost užitého enzymu v konjugátu, takže je zvládtě nevýhodné připravit oddělený konjugát pro každý jednotlivý antigen, který má být zjištěn.It is very important to determine and measure the amount of the resulting antigens. They are usually co-reactants, often of unknown chemical structure, in very low concentrations in biological and other materials, so that conventional analytical methods cannot be used. Consequently originated in the past few years, methods for detection of these substances was based on the reaction between the antigen and antibody and which was one of the reagents is labeled with a radioactive atom or enzyme so that the products of ^one reaction, or in some cases the unconsumed reagent could be and / or qualitatively determined. Methods based on ponižtí radioactively labeled substances, maai some theoretical advantages, it is particularly important that the 'substance, particularly in the case pouužtí tritium or ¹⁴ C oeioterferují these alkyl ^acrylate with vlastoí REA ^for CIs. on the other hand, these methods have the drawbacks of the methods used, in particular the need to use very special devices for the measurement of radiolabelled substances and, moreover, the need to protect personnel Laboratories prevent possible adverse effects of radioactivity. In addition, the radioactive material used must be safely disposed of. In addition, some radiolabelled substances need to be removed at regular intervals due to the radiochemical decomposition of the radioactive isotope. In addition, it may be very difficult to label low-molecular-weight antigens in this manner while maintaining their basic ashtigenic properties. For this reason, the focus is on ways; The reaction between the antigen and the antibody can be monitored using an enzyme-labeled reagent. These methods can be carried out in a simple manner using relatively simple equipment and, moreover, these methods are not associated with any hazards due to the health of the personnel. However, many of the proposed methods have the disadvantage that a conjugate of the enzyme used and the antigen to be determined has to be prepared beforehand. The preparation of these conjugates is not always easy because it is necessary to maintain the enzymatic activity of the enzyme used in the conjugate, so it is difficult to prepare a separate conjugate for each individual antigen to be detected.

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob, při němž by bylo možno užít vždy stejného konjugátu s obsahem enzymu pro širokou škálu antigenů.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the invention to provide a method in which the same enzyme conjugate can be used for a wide variety of antigens.

V dříve známých publikacích, například Engvall a další, J. Immunology 109, 1972 str. 129, bylo navrhováno stanovit protilátky reakcí s antigenem na nerozpustném nosiči s následnou reakcí konjugátu antigenu a protilátky s enzymaticky značeným antiimunoglobulinem, o němž je známo, Že reaguje s protilátkou konjugátu. Při provádění tohoto způsobu závisí množství enzymu, který je navázán na nosič na konci reakce, na množství protilátky ve zkoumaném vzorku, protože enzym se váže na nosič způsobem, jehož základním článkem je protilátka.In previously known publications, for example Engvall et al., J. Immunology 109, 1972 p. 129, it has been proposed to determine antibodies by reacting with an antigen on an insoluble carrier followed by reaction of the antigen-antibody conjugate with an enzyme-labeled anti-immunoglobulin known to react with antibody conjugate. In practicing this method, the amount of enzyme that is bound to the carrier at the end of the reaction depends on the amount of antibody in the sample being examined, because the enzyme binds to the carrier in a manner that is the antibody's primary link.

Předmětem vynálezu je způsob imunologického stanovení protilátek pomocí vázaného enzymu, při němž se uvede ve styk antigen na nerozpustném materiálu nebo ve formě nerozpustného agregátu, první protilátka a enzymaticky značená druhá protilátka, načež se nerozpustný a rozpustný materiál od sebe oddělí a stanoví se enzymatická účinnost, vyznačující se tím, že se první protilátka uvede do styku se vzorkem, který obsahuje stanovovaný antigen, a druhá protilátka se naváže na nerozpustný materiál v nepřímé závislosti vzhledem к množství antigenu ve zkoumaném vzorku.The subject of the invention is a method of immunologically determining antibodies by means of a bound enzyme, which comprises contacting an antigen on an insoluble material or in the form of an insoluble aggregate, a first antibody and an enzymatically labeled second antibody, separating the insoluble and soluble material and determining enzymatic activity. characterized in that the first antibody is contacted with a sample containing the antigen of interest and the second antibody binds to the insoluble material in an indirect dependence on the amount of antigen in the sample to be examined.

Podstatou vynálezu je, že se první protilátka rovněž uvede ve styk se vzorkem, který obsahuje antigen, jenž má být stanoven, přičemž tento antigen může být totožný s prvním rozpustným antigenem nebo se může od tohoto antigenu lišit, přičemž druhá protilátka se váže na nerozpustný materiál v poměru obráceném vzhledem к množství antigenu ve zkoumaném vzorku. Pod pojmem první protilátka se rozumí protilátka, která je schopna vázat i antigen navázaný na nerozpustný nosič, i antigen, který má být stanoven. Pod pojmem druhá protilátka se rozumí protilátka, která je specifická proti všem protilátkám imunoglobulinové třídy, к níž náleží první protilátka, například protilátka proti veškerým ovčím imunoglobulinům, králičím imunoglobulinům nebo králičímu antigenu IgM. Například v případě, Že první protilátkou je imunoglobulin určitého živočišného druhu, například ovce, tak druhá protilátka je protilátkou proti imunoglobulinům tohoto druhu bez ohledu na specifičnost vlastních protilátek, které mohou vzniknout u některých zvířat, například u osla.It is an object of the invention that the first antibody is also contacted with a sample containing an antigen to be determined, which antigen may be identical to or different from the first soluble antigen, the second antibody binding to insoluble material relative to the amount of antigen in the sample. By the first antibody is meant an antibody which is capable of binding both the antigen bound to the insoluble carrier and the antigen to be determined. The term second antibody refers to an antibody that is specific to all antibodies of the immunoglobulin class to which the first antibody belongs, for example an antibody against all sheep immunoglobulins, rabbit immunoglobulins or rabbit IgM antigens. For example, if the first antibody is an immunoglobulin of a particular species, such as a sheep, the second antibody is an antibody against immunoglobulins of that species regardless of the specificity of the antibodies themselves, which may be generated in some animals, such as an ass.

Nový způsob podle vynálezu je možno snadno upravit pro zjištění a stanovení široké škály antigenu. Kromě běžných antigenů, které se vyskytují v séru a ve tkáňových bílkovinách, jako jsou například «^-foetoprotein, ^-haptoglobulin a karcinoembryonické antigeny, je možno zjišlovat také hapteny, například hormony, jako trijodothyronin, norepinefrin, tryreostimulační hormon, folikulostimulační hormon, luteinizačni hormon, inzulín a thyroxin, steroidy, například kortisol, progesteron, esterón, estradiol a testosteron, léčiva, například morfin, amfetamin, barbituráty, difenylbydantoin, methotrexát a gentamycin, vitamíny a složky potravy, například pyridoxal-5-fosfát a aflatoxin, herbicidy, insekticidy a nitrozomočoviny. Nerozpustný antigen je s výhodu týž jako antigen vzorku a je uložen na nerozpustném nosiči, například na agarozovém gelu s příčnými můstky, aktivovaném 1,4-bis-(2,3-epoxypropoxy ) butanem. V každém případě je vázán antigen chemicky nebo alespoň fyzikálně na nosič, jak bude dále popsáno.The novel method of the invention is readily adapted to detect and determine a wide variety of antigens. In addition to the common antigens found in serum and tissue proteins, such as N -foetoprotein, N-haptoglobulin, and carcinoembryonic antigens, haptens, such as hormones such as triiodothyronine, norepinephrine, tryreostimulating hormone, follicle-stimulating hormone, follicle-stimulating hormone, can also be detected. hormone, insulin and thyroxine, steroids such as cortisol, progesterone, esterone, estradiol and testosterone, drugs such as morphine, amphetamine, barbiturates, diphenylbydantoin, methotrexate and gentamycin, vitamins and food ingredients such as pyridoxal-5-phosphate and aflatoxin, herbicides insecticides and nitrosoureas. The insoluble antigen is preferably the same as the sample antigen and is deposited on an insoluble carrier, for example on a cross-linked agarose gel activated with 1,4-bis- (2,3-epoxypropoxy) butane. In each case, the antigen is bound chemically or at least physically to the carrier as described below.

Je zřejmé, že povaha enzymaticky značené druhé protilátky nijak nezávisí na antigenu, který má být stanoven. Je pouze nutné vyvolat tvorbu první protilátky u zvířete téhož živočišného druhu, к němuž náleží imunoglobulin, použitý к vyvolání tvorby druhé protilátky u jiného druhu. Z tohoto důvodu není zapotřebí získat ' širokou škálu protilátek, značených enzymem^a nesnáze, které spočívají ve vazbě enzymů na protilátky, je nutno vyřešit pouze jednou.Obviously, the nature of the enzymatically labeled second antibody in no way depends on the antigen to be determined. It is only necessary to induce the production of the first antibody in an animal of the same species to which the immunoglobulin belongs, used to induce the production of the second antibody in another species. For this reason, there is no need to obtain a wide range of enzyme-labeled antibodies and the difficulties of binding enzymes to antibodies need to be solved only once.

Ke značení druhé protilátky je možno užít jakýkoli enzym. Může jít například o oxidázy jako je peroxidáza z křenu, .· hydrolytické enzymy, například alkalickou fosfatázu nebo dehydrogenázu, například dehydrogenázu glukózo-6~fosfátu. Ideální enzym pro použití k tomuto účelu má mít· následnicí vlastnosti:Any enzyme can be used to label the second antibody. They may be, for example, oxidases such as horseradish peroxidase, hydrolytic enzymes, for example alkaline phosphatase or dehydrogenase, for example glucose-6-phosphate dehydrogenase. The ideal enzyme to be used for this purpose should have the following properties:

1. Enzym má být poměrně levný při vysoké čistotě.1. The enzyme should be relatively inexpensive and of high purity.

2. Enzym má mít vysokou účinnost na jednotku hmootosti.2. The enzyme should have a high efficiency per unit of mass.

3. Užitý enzym má být snadno rozpustný ve vodě a stálý při běžném způsobu skladování.3. The enzyme used should be readily soluble in water and stable under normal storage conditions.

4. Enzym má být po^ilelný při provádění zkoušek, které jsou jednoduché, rychle, citlivé a levné.4. The enzyme should be amenable to testing that is simple, fast, sensitive and cheap.

5. Enzym má být prostý dalších biologických kapalin.5. The enzyme should be free from other biological fluids.

6. Biologické kapaliny nemej obsahovat žádné inhibitory nebo aktivátory pro substrát.6. The biological fluids should not contain any inhibitors or activators for the substrate.

7. Enzym má obsahovat vhodné chemické skupiny pro vazbu na druhou protilátku, což umožňuje pouze minimální efekt konjugace na aktivitu·enzymu a protilátky.7. The enzyme should contain appropriate chemical moieties for binding to the second antibody, allowing only minimal conjugation effect on enzyme and antibody activity.

Ze známých enzymů splňuje tyto požadavky napříkla β-galaktozidáza, ICLší vhodné, avšak méně výhodné enzymy jsou například glukozooxidáza, glukoamy-áza αcetylchslioetterázy, lysozym, glukozo-6-fssfátleLylrsgeoáza a ooaátlehydrsgenázc·Among the known enzymes, for example, β-galactosidase meets these requirements, ICLs suitable but less preferred enzymes are for example glucose oxidase, glucoamyase α-acetylcholioetherterase, lysozyme, glucozo-6-phosphateLylrsgeoase, and oilate hydrosgenase.

Užitý enzym se s výhodou váže na druhou protilátku dále uvedeným způsobem, který je použitelný pro jakoukoli kombinaci protilátko enzymu za předpokladu, že enzym obsahuje merkaptotkupiou, nebo je možno jej poziměnt tak, aby tuto skupinu obsahová. Je však rovněž možno užít dalších způsobů vazby. Jde například o následující způsoby:The enzyme used preferably binds to the second antibody in the following manner, which is applicable to any combination of an antibody of the enzyme, provided that the enzyme contains a mercapto-group or can be altered to contain that group. However, other binding methods may also be used. For example, these are:

a) Vazba glutsroddelydu v jediném stupni, v níž se užívá glutaraldežydu k vazbě bílkovin ve velmi složité reakci za vzniku heterogenních konjugátů s vysokou mo0ek^U.ároí hmotností. [Avrameas, S., ImшuookemosSry 6, 43 (1969)]a) Binding of glutsroddelyde in a single step in which glutaraldehyde is used to bind proteins in a very complex reaction to form heterogeneous high molecular weight conjugates. [Avrameas, S., ImuuookemosSry 6, 43 (1969)]

b) Dvoustupňová vazba glutaraldelydu, při níž reaguje enzym, v tomto případě peroxidáza z křenu pouze s jednou mo o ©kutou £^10^^©^^. Tím je omezena konjugace mezi jednotl-v^^ý^mL οοΙ-θΙ^^Ι enzymu a tento způsob tedy znamená zlepšení jednostupňového způsobu. Metoda však není pouužtelná pro celou řadu enzymů, odlišných od peroxUáz, protože tyto enzymy jsou schopné vázat více než jednu molekulu [Avrameas, S.₇a Ternynck, Imwnochemistry 8, 1175 (1971)]b) A two-step glutaraldelyde reaction in which the enzyme reacts, in this case horseradish peroxidase with only one moiety. This limits conjugation between the individual enzyme and thus the process is an improvement in the one-step process. However, the method is not applicable to a variety of enzymes other than peroxases, since these enzymes are capable of binding more than one molecule [Avrameas, S. ₇ and Ternynck, Imwnochemistry 8, 1175 (1971)]

8) Oxidace sacharidových zbytků v enzymu·s následnou tvorbou Schiffovy báze. Peroxidáza křenu obsahuje několik oligosacharidových skupin a základem tohoto způsobu je oxidace těchto skupin na aldehydové skupiny joHstanu. Vznnklé aldehydové skupiny pak mohou reagovat s ami^skupinami. Jiné enzymy, které rovněž působí oligosacharidové skupiny, je možno zásadně také pouužt, často však doclházzí ke tvorbě konjugátů s vysokou mooekiuární hmo0ností. [Nekane ^p. ^K. a Kowack^k, A. ^J. mstochem· Cytochem. ^{22, 1084 (197}4)³ 8) Oxidation of carbohydrate residues in the enzyme with subsequent formation of Schiff base. Horseradish peroxidase contains several oligosaccharide groups and the basis of this process is the oxidation of these groups to aldehyde groups. The resulting aldehyde groups can then react with the aldehyde groups. Other enzymes which also act as oligosaccharide moieties may also be used in principle, but often result in the formation of conjugates of high molecular weight. [Nekane ^p . ^K. and ^to Kowack, A. ^J. mstochem · Cytochem. ^{22, 1084 (197} 4) ³

d) Dimmleioilsvá vazba při pouSití imidu kyseH-ly N, N—o-fenylendimaleinové po zavedení skupin -SH do protilátky při 2-oerltaptoethylcmLnu, který snižuje předem existující můstky -S-S- na dvě skupiny -SH. [Kato a další, European · J. Biochem^ 62. 285, (1976$] .d) Dimethyl bonding using N, N-o-phenylenedimalein acid imide after introduction of the -SH groups into the antibody at 2-oerltaptoethylcmN, which reduces the pre-existing -S-S- bridges to two -SH groups. [Kato et al., European · J. Biochem ^ 62, 285, (1976 $).

e) Potužtí dalších bifunkčních reakčních činidel, jako jsou například tslsen-2,4-liisokyanát-p*,p-diflssr-o,o*--lnOtrsfeoylsslfso, · 1-cyklohexyLf3-(2~mosfoliooethyL) karbodiimid, avšak při pouužtí tohoto způsobu se obvykle dosáhne ·méně · dobrých výsledků.e) The use of other bifunctional reagents, such as, for example, tsenene-2,4-liisocyanate-β, β-diflssr-o, α-10-trisphenoylssso, 1-cyclohexyl-β- (2-phospholioethyl) carbodiimide, but using this Usually, less good results are obtained.

f) Vazby je možno dosáhnout také při pouSití · heterobifunkčních činidel, například reakčních činidel, která obsáhni dvě různé funkční skupiny v každé ooSekLUe· Tímto činidlem je například ester m-maaeimidobbnozl-N-lydrojysiukcinimidu, který byl poiUit pro dvoustupňovou reakci k navázání inzulínu na p-galaktozidázu. [T. Kitagawa a T. Aikawa, J. Biochem. 22, 233 ai 236 (1976)]f) Coupling can also be achieved by using heterobifunctional reagents, for example reagents that contain two different functional groups in each of the reagents. This reagent is, for example, the m-maimeimidobenzyl-N-lydrojysuccinimide ester used for the two-step reaction to attach insulin to the insulin. β-galactosidase. [T. Kitagawa and T. Aikawa, J. Biochem. 22, 233 and 236 (1976)]

g) Nekoovaentní vazba za současné tvorby příčných můstků, při nichi dochází například k vazbě protilátek na peroxidázu křenu za vzniku konjugátu, který není kovalentné vázán, avšak má poměrně stálou povahu. Tento způsob má následující nevýhody; při skladování se konjugát enzymu a protilátky pomalu rozkládá; protilátky mohou inhibovat použitý enzym; tvorba protilátek trvá několik měsíců, přičerni protilátky, získané různými pracovníky, maj různé vlastnooti.g) Non-innovative binding while forming cross-bridges, such as binding of antibodies to horseradish peroxidase to form a conjugate that is not covalently bound but of relatively stable nature. This method has the following disadvantages; upon storage, the enzyme-antibody conjugate slowly decomposes; the antibodies may inhibit the enzyme used; the production of antibodies takes several months, the black antibodies obtained by different workers have different properties.

Vzlhledem k vyšší ryclúosti a lepším výsledkům v případě, ie se postup provádí s poměrně větším miožstvím protilátek, je.obvykle výhodnŠSSí vyvolat tvorbu první i druhé protilátky u poměrné velkých zvířat, jako jsou kůň, osel nebo ovce, kdežto tvorba protilátek u malých zvířat, jako jsou krysy, щтё1, moočata nebo křečci, je méně výhodná, přestoie ji není možno vyloučit. Jak Jíž bylo uvedeno, je nutno vyvolat tvorbu i druhé protilátky u různých zvířat. Bylo zjištěno, ie je výhodné vyvdat tvorbu jiné protilátky u ovcí a druhé protilátky u oslů, zásadně však je možno užít jakoukoli dvorci různých druhů zvířat.Because of the higher speed and better results when the procedure is carried out with a relatively large amount of antibodies, it is generally preferable to induce both first and second antibodies to be produced in relatively large animals such as horse, donkey or sheep, while antibody formation in small animals, such as rats, щтё1, urine, or hamsters is less preferred, yet it cannot be excluded. As already mentioned, it is necessary to induce the production of a second antibody in various animals. It has been found to be advantageous to produce a different antibody in sheep and a second antibody in donkeys, but basically any farm of different animal species can be used.

Moonoot interference druhé protilátky ·s reakcí antigenu a první protilátky se snižuje v tom případě, že tvorba druhé protilátky není vyvolána proti celé první protilátky, ale pouze proti Fc-frigmentu ^1^10^0^0. inu, který tvoří první protilátku.Moonoot interference of the second antibody with the reaction of the antigen and the first antibody decreases when the formation of the second antibody is not directed against the entire first antibody but only against the Fc-frigment ^ 1 ^ 10 ^ 0 ^ 0. which forms the first antibody.

Tvorbu druhé protilátky je možno vyvoo-at zásadně znáným způsobem,' avšak výhodným způsobem je přenběžoá příprava zvířat, po níi následuje vyvolání tvorby protilátek s · řadou dalších dávek v případě, ie hladina protilátek·v krevním séru překročí vrchol. Krevní sérum nebo · . · celá krev pak obvykle obsahuje nejvyšší hladinu protilátek po kaidé další injekci. V případě,·ie se dosáhne dostatečně vysoké dávky, pokud možno meacimáání možné dávky antiimшlolg.obulinu v krvi zvířete, odebere se krev a odd^šlí se sérum,které obsahuje anti-munoglleιULio.Generation of the second antibody can be induced in a manner known per se, but preferably it is the intermediate preparation of animals, followed by induction of antibody production with a number of additional doses when the serum level of the antibodies exceeds the peak. Blood serum or. • whole blood then usually contains the highest level of antibodies after each injection. When a sufficiently high dose is achieved, preferably by sweeping a possible dose of the anti-immunoglobulin in the animal's blood, blood is collected and serum containing anti-immunoglobulin is collected.

Druhá protilátka se s výhodou čistí · tak,. ie se aotisérim osla inkubuje s přišitým imunologickým absorpčním· prostředkem, například sefa^n nebo ji rým nerozpustím nosičem, který byl aktivován reakcí s vhodným bifinkčním reakčním činidlem, například 1,4-bLs-(2j3-epoxypropoxy)butanem, i pak se uvede ve styk s roztokem imгul0lgobeU.inl nebo frjgmentem Fc tohoto imш]Oolobel.inu, který· byl užit k vyklání druhé protilátky· Tímto způsobem se získá imшloadnorpční prostředek, který je specifický pro druhou protilátku a kterou je možno čistit adsurpcí · na imunooddorpční činidlo s následnou elucí, a to před, nebo po označení enzymem.Preferably, the second antibody is purified by: For example, the aotiseria donor is incubated with a sewn immunological absorption agent, for example, sephenin or a neat dissolution of the carrier, which has been activated by reaction with a suitable bifunctional reagent, for example 1,4-bLs- (2,3-epoxypropoxy) butane, in contact with an immunoglobulin solution or Fc fraction of this immobilolobin which has been used to lean a second antibody. This provides a second antibody specific immunoprotective agent which can be purified by adsurption. subsequent elution, either before or after enzyme labeling.

Při přípravě značené druhé protilátky je výhodné uvést ve styk imunoaddorpční prostředek s adsorbovanou druhou protilátku s reakčním činidlem, například meeílmerkaatobulyrimidlthydrochloridem, čími dojde k moodiikaci i^í^l^c^í^I^i^j^^ío v protilátce a k zavedení tří iž pěti thiolových skupin do kaidé mooekuly protilátky. Pak se druhá protilátka, která nyní obsahuje meekapto-sklpinl, vymJe z imuroadsorpčního prostředku a nav^e se na ni enzym. S výhodou se tento postup provádí tak, ie se protilátka uvede ve styk s NlN-o-fero/enObsimidem maleinové a pak se uvede ve styk s čištěnou β-glllktlzinázll, která se získá běSným způsobem z Escherichia coli. Konjiugát enzymu a druhé protilátky se pak čistí chroma^graficky na diet^yrlminoet^y'lgaarZlovém gelu nebo na jiném vhodném ^s^pčním prostředku, čími se oddrní konjugát od nezbavovaného enzymu a od nezbavované druhé protilátky.In preparing the labeled second antibody, it is preferable to contact the immunoadsorbent with the adsorbed second antibody with a reagent, for example, mercuricobutyrimidyl hydrochloride, to moodify the antibody and introduce three antibodies in the antibody. up to five thiol groups per caié moocular of the antibody. Then, the second antibody, which now contains the mercapto-squalene, is exchanged from the imuroadsorbent and the enzyme is ligated thereto. Preferably, this procedure is carried out by contacting the antibody with N1N-o-ferro / enObsimide maleic and then contacting the purified β-glyllzinase II, which is obtained conventionally from Escherichia coli. The enzyme-second antibody conjugate is then purified chromatographically on a diethylminoethyl gel or other suitable binding agent to separate the unconjugated enzyme and the non-cleared second antibody.

Tvorba první protilátky se vyvolá eSž1ým způsobem na vhodném zvířeti. V případě, ie stanovený antigeo je hapten s poměrně jednoduchou chemickou strukturou, jako je tomu například v případě ^Тс^НгТю-п, estrad-olu, gertam/cinu nebo mo^inu, není tento aotigeo sám o sobě schopen vyvolal tvorbu první protilátky. Je proto nutné vázat tento aotigeo na molekulu nosiče za vzniku konjugátu, kterým pak je možno vyvo^t tvorbu protilátky. K tomuto účelu je výhodné vytvořit konjugét antigenu s běžně dosažitelnou bílkovinou, která je užitému zvířecímu druhu cizí; je možno například užit hovězí sérový albumin (BSA). Konjugaci je možno provést reakcí tohoto albuminu nebo jiné bílkoviny například s 1-β^^-3-(3-ϋmetlhyLaminopropyl^arbodiimidem s následnou reakcí získaného produktu s který musí pro účely této reakce obsahovat aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu. V případě potřeby je možno užit jiné způsoby konjugace, v nejvýhodnějších případech se na každou molekulu albuminu nebo na každou oolekiUu jiné bílkoviny s vysokou hmoonoosí váže 3 až 30 mooekul antigenu.The production of the first antibody is elicited in an appropriate manner in a suitable animal. If the antigeo determined is a hapten with a relatively simple chemical structure, such as β-β-α, estrad-ol, gertam / tin or urine, this aotigeo alone is not capable of producing the first antibody . It is therefore necessary to bind this aotigeo to a carrier molecule to form a conjugate which can then be used to induce antibody production. For this purpose, it is preferable to form an antigen conjugate with a commercially available protein that is foreign to the animal species used; for example, bovine serum albumin (BSA) may be used. The conjugation can be carried out by reacting the albumin or other protein with, for example, 1-β-3- (3- (3-methyl-aminopropyl) arbodiimide, followed by reaction of the product with an amino or carboxyl group for this reaction. other methods of conjugation, most preferably 3 to 30 molar amounts of antigen are bound to each albumin molecule or to each oolecule of another high-mono-monoclonal protein.

Tvorbu první protilátky je možno vyv°oat tak, že se podá ineekčně vhodnému zvvřeti, například ovci, antigen nebo konjugát antigenu opakovaně v průběhu týdnů nebo měsíců tak dlouho, až se dosáhne dostatečně vysoké hladiny protilátek s žádanými vlastnostmi v krvi zvířete. Ζνίϋθτ.! se pak odebere krev a intiséruo se odddlí.The formation of the first antibody can be developed by administering to an appropriate animal an infectious animal, such as a sheep, antigen or antigen conjugate, repeatedly over a period of weeks or months until a sufficiently high level of antibodies with desirable properties in the animal's blood is achieved. Ζνίϋθτ.! blood is then collected and the intiseruo separated.

První protilátka se pak s výhodou čistí tak, že se uvede ve styk s antigenem, který byl užit k vyvolání tvorby -této protilátky nebo s příbuznou sloučeninou při potustí nerozpustného nosiče. Po absorpci je možno protilátky vytyvat, oapříklad rozookem quanidiLшlhl“ iruc]U.oriil pi vysokém nebo nízkém pH a p^i řoožití roztoku s vysokou - ^ποθ^^οί sooí nebo pil rozpouštědel nevodné povahy s následnou dialýzou proti vhodnému pufru k odstranění elučního činidla.Preferably, the first antibody is then purified by contacting the antigen that has been used to induce the production of the antibody or a related compound to release the insoluble carrier. After absorption, the antibodies can be raised, for example by quanidine solution at high or low pH and using a solution with high salt or dul of non-aqueous solvents followed by dialysis against a suitable buffer to remove the eluent. .

Nerozpustnou maaricí, která se užije k vnesení antigenu nebo příbuzné látky při čištění a pii provádění způsobu podle vynálezu, může být jžkýkooi ve vodě nerozpustný maže^šl, na nějž se váže antigen nebo příslsSná příbuzná sloučenina dostatečně silně tak, aby bylo možno zajistit, že vazba nebude přerušena v průběhu reakce, v průběhu čištění nebo v průběhu stanovení.The insoluble maize used to introduce the antigen or related substance in the purification and purification process of the present invention may be any water-insoluble lubricant to which the antigen or related relative compound binds strong enough to ensure that the binding will not be broken during the reaction, during the purification or during the assay.

Zásadně je možno užit ma^eršl, který antigen adsorbuje, jako je tomu v systému, který řopřali Engvall a další ve svrchu uvedené citaci, je však výhodné vázat antigen na nosič chemicty, to znamená, že nosič musí obsahovat funkční skupiny, které jsou pro tuto vazbu nutné. Vhodným ooieriáleo je οιρΜΟΙ^ sklo, nylon, ř⁰U-liloryllmii, celulóza nebo ^х1г1О. Některé typy orpčních prostředků s obsahem UydroχyloaýcU skupin je možno uvést v reakci s 1,4-bit-(2,3-tpotςlpropoxy)buianeo a produkt této reakce uvést v reakci s aitigenem. Tento způsob je jednoduchý, bezpečný a účinný a poskytuje stálou vazbu - za předpokladu, že utigen nebo příbuzná látka obsahuj hydroxyl ové skupiny, aminoskupiny nebo thiolové skupiny. Požadavky ni imunoadsorpční prostředek k tříštění protilátek - nejsou vždy stejné. .Essentially, it is possible to use an adsorbent antigen such as that described in Engvall et al., But it is preferable to bind the antigen to a chemically supported carrier, i.e. the carrier must contain functional groups which are this link necessary. Suitable ooieriáleo is οιρΜΟΙ-glass, nylon, r ⁰ U-liloryllmii, cellulose or ^ х1г1О. Certain types of Uydroxyloalkyl groups may be reacted with 1,4-bit- (2,3-dipropoxy) buianeo and reacted with aitigen. This method is simple, safe and effective and provides a stable bond - provided that the utigen or related substance contains hydroxyl, amino or thiol groups. The requirements of an immunoadsorbent for fragmenting antibodies - are not always the same. .

Způsob podle vynálezu je možno provádět různým způsobem. Μ^ε^ί první protilátky, i tím i zničené složky navázané ni nerozpustný intigen, je v nepřímé záv^slosto k oooosíví ant^enu ve zkoumaném vzorku. Měří se enzymolická účinnost, bu3 volného enzymu, nebo enzymu vázaného ni nerozpustný nebo adsorbovaný antigen. Tento postup je možno provádět někooiki speecficlýoi způsoby.The process according to the invention can be carried out in various ways. The first antibody, and thus the destroyed component bound by its insoluble intigen, is in direct dependence on the oxidation of the antigen in the sample under investigation. The enzymatic activity of either the free enzyme or the enzyme bound to the insoluble or adsorbed antigen is measured. This process can be carried out in several ways.

Podle prvního provedení způsobu podle vynálezu se první protilátka inkubuje se vzorkem, který obsahuje zkoumaný inti-gen. Po skončení reakce se přidá utigen ni noosči i směs se znovu inkub^e. Pik' se o(ičliě:í pevná fáze od kapalné fáze, pevná fáze se promyje i smísí s přebytkem enzymolicky zničené druhé protilátky. Po další inkubaci se pevná fáze opěb odděěí i pO^ye. Mioossví - účinnost, - zjiS^né v nerozpustné frakci, je v nepřímé zdáve^eti k ο^ε^ί ve vzorku., kdežto oioossví v supernatantu je tomuto ο^ε^ί přímo úmOrné, takže je možno шёШ OttiulooOi frakci.According to a first embodiment of the method of the invention, the first antibody is incubated with a sample containing the investigated antigen. After completion of the reaction, the reagent was added and the mixture was incubated again. If the solid phase is separated from the liquid phase, the solid phase is washed and admixed with an excess of the enzymatically destroyed second antibody, and after further incubation the solid phase is separated and the activity is found to be insoluble. the fraction is indirectly apparent to the sample in the sample, while the fraction in the supernatant is directly proportional to the fraction so that the fraction can be fractionated.

Podle druhého provedení způsobu podle vynálezu se první protilátka uvede v reakci s enzzynoiicky zničenou druhou prttiláOktl zi vzniku komplexu, který se pik přivdá v přebytku ke vzorku, který obsahuje hledaný antigen, i směs se inkub^e. Pik se přidá nerozpustný malt^á!, ni nějž je navázán intigen, i po dl.ší inkubaci se oddděí pevná kapalná fáze.According to a second embodiment of the method of the invention, the first antibody is reacted with the enzymatically destroyed second primate to form a complex that is added in excess to the sample containing the antigen of interest and the mixture is incubated. Insoluble mortar to which the intigen is bound is added to the peak, even after prolonged incubation, the solid liquid phase is separated.

Stanovením enzymatické účinnooti v kapalné fázi se získá údaj, který je přímo závislý na možství antigenu ve vzorku.Determination of the enzymatic efficacy in the liquid phase yields an indication which is directly dependent on the potential of the antigen in the sample.

Podle třetího provedení způsobu podle vynálezu se současné inkubuje komplex první a druhé protilátky, vzorek s obsahem stanoveného antigenu a mattr‘i^ál, na nějž je navázán antigen, načež se pevná a kapalná fáze odamu a stanoví se enzymmaická účinnost kapalné fáze. Získaný výsledek je přímo závislý na konceenraci aotigeou ve vzorku.According to a third embodiment of the method of the invention, the first and second antibody complexes, the antigen-containing sample and the antigen-binding material are simultaneously incubated, after which the solid and liquid phases are separated and the enzymatic activity of the liquid phase is determined. The result obtained is directly dependent on the endotration of the aotigee in the sample.

Jak již bylo uvedeno, při kvalitativním stanovení podle prvního a druhého provedení způsobu podle vynálezu je nutné, aby první protilátka byla příoomoa v přebytku vzhledem k rmntžSví, které je nutné pro reakci s antigenem ve vzorku, a мteгi(^l.₎ na nějž je vázán antigen, musí být přítomen rovněž v přebytku ' vzhledem k moožsví, které je nutné k absorpci velkerého aaotžSví první protilátky. Při praktickém provádění způsobu podle vynálezu je nejjedoodušší provést- sérii předběžných stanovení s různými.koncentracemi první protilátky aritmetickou nebo geomeerickou řadou. Pak je velmi snadné rychle naléz příslušnou koncentraci první protilátky pro přesné stanovení.As already mentioned, in the qualitative determination of the first and second embodiment of the invention it is essential that the first antibody was příoomoa in excess relative to rmntžSví, which is necessary for reaction with the antigen in the sample and мteгi (^ _l.), To which is the antigen bound, must also be present in excess due to the amount required to absorb the large antibody and the first antibody. In the practice of the method of the invention, it is easiest to perform a series of preliminary determinations with different concentrations of the first antibody by an arithmetic or geomeeric series. It is then very easy to quickly find the appropriate concentration of the first antibody for accurate determination.

VynOlez bude osvětlen následujícími příklady.The invention will be illustrated by the following examples.

Příklad 1Example 1

1. Výroba a značení druhé protilákly1. Production and labeling of the second antibody

a) Výroba F_c fragmentu ovčího imunoglobulinu IgGa) Production of an F _c fragment of an ovine immunoglobulin IgG

Způsob výroby ovčího F_c fragmentu je založen na Porterově metodě (R. E. Porter 1959, Biochem. J. 13, 119).The method for producing a sheep F _c fragment is based on the Porter method (RE Porter 1959, Biochem. J. 13, 119).

320 ml séra se odebere 28 ovcím. 150 ml séra se inkubuje za stálého míchání na ledové lázni s 30 g die1^hy^l^É^:Lno^th^^L (DEAE) - A 50 Sephadexu, který byl předem uveden do rovnovážného stavu s 10 moly fosfátového pufru o pH 6,5. Po 1 hodině se gel zfiltruje ve skleněné nálevce, opatřené slotem,- a promuje se 50 m. fosfátového pufru o konccen-raci 10 ^mlů a - o pH 6,5. Filtrát a promývací kapalina se znovu ioksbuSí s - -30 g téhož adsorpčního maeriálu, zfiltrují se a promj 100 ml fosfátového pufru. 300 ml filtrátu a promývací kapaliny se smísí se 150 ml nasyceného roztoku síranu amorného, který se přidává kontinuálně za stálého míchání. Vznikne sraženina, která se oddá^-í a promyje 100 O. roztoku síranu amorného o Concee0rtci 20 %· VVsledná sraženina se rozpustí v 50 al fosfátového pufru o koncceOraci 50 maalů a o pH 8,0 a provádí se diagnóza přes noc při teplotě 4 °C proti 4 lirrm destilované vody. Získaný roztok se pak lyofilizuje.320 ml of serum is collected from 28 sheep. 150 ml of serum are incubated with stirring in an ice bath with 30 g of diethyl ether (DEAE) -A 50 Sephadex, which has been equilibrated with 10 moles of phosphate buffer, pH 6.5. After 1 hour, the gel is filtered in a slotted glass funnel and washed with 50 ml phosphate buffer at a concentration of 10 ml and pH 6.5. The filtrate and washings are reextracted with -30 g of the same adsorption material, filtered and washed with 100 ml of phosphate buffer. 300 ml of the filtrate and the washing liquid are mixed with 150 ml of saturated ammonium sulfate solution, which is added continuously with stirring. A precipitate is formed which is collected and washed with 100% ammonium sulphate solution of 20% strength. The resulting precipitate is dissolved in 50 [mu] l phosphate buffer at a concentration of 50 maal and pH 8.0 and diagnosed overnight at 4 [deg.] C against 4 liters of distilled water. The solution obtained is then lyophilized.

1,5 g takto získaného lýofi^^izzv^^x^é^h^o ovčího iamotlobιS.ios se rozpuutí v 50 Ol 0,1 M tris-pufru s přísadou kyseliny chlorovodíkové o pH 7,2, piufr obsahuje ještě 10 mealů cysteinu a 2 mnmly kyseliny ethylendiaain0etrtoctOié. Piufr se připravuje bezprostředně před použitím. Pak se přidá ještě 0,6 ml krystalické suspenze papainu, který se předem podrobí dvojmu překrystelování v octanovém pufru o konceenraci 50 mmlů a o pH 4,5. Roztok se inkubuje při teplotě 37 °C 4 hodiny při občasném protřepání. Pak se přidá 0,222 g jodacetamidu a roztok se okammžtě nanese na sloupec o rozměrech 80 x 5 cm s obsahem Sephadexu G 100 v octanovém pufru o konce^^ci 10 mmmlů a o pH 5,6 při teplotě 4 °C ·1.5 g of the resulting lysophosphate are dissolved in 50 .mu.l of 0.1 M tris buffer with an addition of hydrochloric acid at pH 7.2, the buffer contains 10 more meals. cysteine and 2 mM ethylenediaaleaetethoacetate. The buffer is prepared immediately before use. 0.6 ml of a crystalline suspension of papain is then added, which is pre-subjected to two recrystallization in a 50 mm @ 3 acetate buffer at pH 4.5. The solution was incubated at 37 ° C for 4 hours with occasional shaking. 0.222 g of iodoacetamide is then added and the solution is immediately applied to an 80 x 5 cm column containing Sephadex G 100 in 10 mmml acetate buffer and pH 5.6 at 4 ° C.

Sloupec se vymývá octanovým pufem o konceenraci 10 mamlů a o pH 5,6. Druhý vrchol obsahuje směs fragmentů Fc a Fab. První vrchol obsahuje nezbavovaný iaιsloglobιS.io. Maateiál získaný z druhého vrcholu se nanese na sloupec o rozměrech 40 x 2,5 cm s náplní karboxymee^y celulózy (Watman CM 32) v acetátovém pufru o konceenraci 10 mamlů a o pH 5,6 při teplotě 4 °C. Sloupec se vymývá teetátivýa pufrem o konceeneci 10 mamlů při pH 5,6, čímž se získá jeden hlavní vrchol a několik menOích vrcholů, tyto vrcholy se postupně vymývá tak, že se koncentrace acetátového pufru o pH 5,6 zvyšuje z 10 mamlů oa 500 mmo, přičemž každá koncentrace se užije v množství 1 000 ol. Materiál získaný .izolováním hlavního vrcholu se podrobí další chroщategrrfii oa sloupci karboxyneehhlcceiULózy· V tomto případě se zvyšuje koncentrace aceeátového puiru o pH 6 z 10 molů, až oa 300 molů, dojde k vyvrtí jediného vrcholu, který se izoluje, dializuje proti destilované vodě a takto získaný materiál se Liooilituje.The column is eluted with 10 mM acetate buffer at pH 5.6. The second peak contains a mixture of Fc and Fab fragments. The first peak contains unchecked iaιsloglobιS.io. The material obtained from the second peak is applied to a 40 x 2.5 cm column packed with cellulose carboxymethyl cellulose (Watman CM 32) in 10 mam acetate acetate buffer at pH 5.6 at 4 ° C. The column is eluted with a thawed buffer of 10 m < 2 > at pH 5.6 to give one major peak and several minor peaks, which are gradually eluted by increasing the concentration of acetate buffer at pH 5.6 from 10 m < -1 > each concentration being used in an amount of 1000 µl. The material obtained by the isolation of the main peak is subjected to further chromatography on a carboxynehydrocellulose column. In this case, the concentration of the aceeate buffer is increased by pH 6 from 10 moles to about 300 moles, a single peak is isolated, isolated, dialized against distilled water and the material obtained is lyophilized.

b) Příprava druhé protilátky (oslí ioonoolobuuin proti ovčímu antigenu)b) Preparation of second antibody (donkey ioonoolobuuin against sheep antigen)

Připraví se stálá emulze smísením 1 dílu roztoku chloridu sodného o koncentraci 0,9 % s obsahem ovčího Fc fragmentu v konccnl-raci 0,75 mg/oi a s obsahem Baaillus Calmette-Guerin o koncentraci 1,5 mi/ml a 2 dílů pomocného prostředku Marcol 52. Do zadní nohy osla se aplikuje 6 nitrosvalových, injekcí emulze vždy o obsahu 1 ml· Po 2 měěících byla produkce protilátek tak vysoká, že bylo možno podat další injekce k dosažení maximOlní hladiny protilátky. V tomto případě bylo užito znovu 6 nitrosvalových injekcí na různých místech zadní končeeioy vždy o obsahu 0,5 ml, v tomto případě emulze sestávala z 2 dílů pomocného prostředku oa 1 díl roztoku chloridu sodného s obsahem ovčího Fc fragmentu o koncentraci 0,75 mg/ml· Oslům byla odebírána krev 10 dní po poslední injekci a v průběhu dalšího O^ě^íce, přičemž byla vždy získána vysoká hladina protilátek.A stable emulsion is prepared by mixing 1 part of a 0.9% sodium chloride solution containing 0.75 mg / ml of a sheep Fc fragment containing 1.5 ml / ml of Baaillus Calmette-Guerin and 2 parts of an adjuvant. Marcol 52. Six intramuscular injections of 1 ml emulsion were injected into the back leg of the donkey. After 2 measurements, the antibody production was so high that further injections could be given to reach the maximum antibody level. In this case, 6 intramuscular injections were repeated at different sites of the hind limb, each containing 0.5 ml, in which case the emulsion consisted of 2 parts of excipient and 1 part of sodium chloride solution containing a sheep Fc fragment of 0.75 mg / ml. The donkeys were bled 10 days after the last injection and during the next injection, always obtaining high levels of antibodies.

c) Příprava i^m^r^c^f^c^í^(^i'pe^:Cho prostředku pro čištění oslího ioшl0llobulinu proti ovčímu antiienuc) Preparation of a composition for the purification of donkey anti-sheep antiagen

Sepharóza 4B se aktivuje tak, že se smísí s 1,4-bis-(2,3-eplxyprlplxy)butanem, přičemž se inkubují stejné objemy .gelu, svrchu uvedeného epoxidu a 0,6 M roztok hydroxidu sodného s obsahem 2 mi borohydridu sodíku v 1 ml za stálého míchání při teplotě 25 °C 8 hodin, načež se adsorpční mateeiál promuje. Ovčí ioiuioog.obuuio se připraví slitím noroOáních sér s oásledrýo vysrážnnío 33% rozookeo síranu amonného. Přidá se roztok ovčího iOTu'ioog.obulinu v 0,1 M roztoku hydrovuilčitanu sodného o pH 10 a užije se 10 mi ovčího imшl0lgobtUliou oa 1 ml gelu. Ativovaný gel se inkub^ije s imiuooglobULinem 48 hodin, takto získaný озО-п^! se promyje, smísí se s 0,1 M roztokem ttlaool· aminu při pH 10 a nechá se stát 24 hodin.Sepharose 4B is activated by mixing with 1,4-bis- (2,3-epoxypropyl) butane while incubating equal volumes of gel, epoxide and 0.6 M sodium hydroxide solution containing 2 ml of sodium borohydride. in 1 ml with stirring at 25 ° C for 8 hours, after which the adsorption material is washed. Sheep oxo-buffalo is prepared by alloying the sera with subsequent precipitation of 33% ammonium sulphate. A solution of sheep iodine gum in 0.1 M sodium bicarbonate solution at pH 10 is added and 10 ml of sheep ' s gel and 1 ml of gel are used. The activated gel was incubated with the immunoglobulin for 48 hours, thus obtained. The mixture was washed, treated with 0.1 M solution of tolano-amine at pH 10 and allowed to stand for 24 hours.

d) Čištění a značen:! druhé protilátky z oslů proti ovčímu αneilnoud) Cleaning and labeling:! a second antibody from donkeys against sheep αneil

Oslí iomoog.obuuio proti ovčímu anti-genu se čistí tak, že se iokubuje ovčí antisérim, připravené svrchu uvedeným způsobem při použžtí imшloadsorpčoíll prostředku. Triolové skupiny se včlení do imшo>llobtž.iou tak, že se imtuioog.obiuLio adsorbuje ог imuroadsorpční prostředek při pouužtí oetthyl-4-oerkaptobutyгioidátu ve formě hydrochloridu k ooodfikaci aminoskupin iounolloOuUiou· Postup se provádí tak, že výsledný οθΟ-ι:^! obsahuje 3 až 5 Molových skupin oa 1 molekulu iounoogobtuiou.The donkey anti-sheep anti-gene is purified by incubating the sheep antiserum prepared as described above using an immersion adsorbent composition. The triol groups are incorporated into the immobilizing agent by adsorbing the immobilising agent with an imuroadsorbent composition using oethyl 4-oercapto-butyl-thioidate in the form of the hydrochloride to reactivate the amino groups of the iolollohydroxy group. The procedure is as follows: it contains 3 to 5 molar moieties and 1 molecule by mono-oxygen.

Kommlex iounoads opčního prostředku a protilátky se promyje a uvede se v suspenzi 0,1 M roztoku N-etlyLoolfolinlydrocihLlridž při pH 7,5 a při ^ηοαπΟΓαοΙ 1 ml_ imrniooadorpčního prostředku v celkovém objemu 10 - Ol. Roztok oettlrl-4-oenktaloOužyrioidátlrdrocih.oridu v 0,2 M roztoku uhličitanu omamtého v 10 mg/ol roztoku se připravuje těsně před použitím, přičemž se přidá 0,1 ml tohoto roztoku oa 10 ml suspenze. Suspenze se míchá při teplotě oístnooti 30 oinut a pak se promyje 0,1 M roztokem N-etlylmolfolinlydrlchLlridu o pH 7,5 s obsahem 1 mg ditlilthrtitllž oa 10 mL piufru. Gel se pak důkladně promyje kyselinou chlorovodíkovou s obsahem 0,1 M chloridu sodného až do pH 3,5.The ophthalmic antibody-antibody complex was washed and suspended in a 0.1 M solution of N-ethylol-olfolino-dihydrochloride at a pH of 7.5 and at a rate of 1 ml of the immobilizing agent in a total volume of 10-1. A solution of o-tert-4-oenktalo-o-amyloidate-trisodium chloride in 0.2 M ammonium carbonate solution in 10 mg / l solution was prepared just before use, adding 0.1 ml of this solution and 10 ml of suspension. The suspension is stirred at a temperature of 30 minutes and then washed with a 0.1 M solution of N-ethylmolpholinol hydride chloride, pH 7.5, containing 1 mg of titanium dioxide and 10 mL of buffer. The gel was then thoroughly washed with hydrochloric acid containing 0.1 M sodium chloride to pH 3.5.

Takto získaný irunoiLlbulin s obsahem thiolových skupin se vymývá kyselinou clhLlrlvodíkovou s obsahemO,1 M chLoridu sodného při pH 2,5. NeevýhoodtějšX mtodou k provádění tohoto způsobu je naplnit iount od dořečním prostřddkeo malý sloupec a odebírat e^dt do zkumavek, které obsahuj pUir. Protože další stupeň tohoto postupu se provádí v ^г2itátovér pufru o koncentraci 0,1 M při pH 5,0, je výhodné ^е^гаг eluát do dostatečného moožtví αcttátovélo pufru o koi^c^^i^trac:i 0,1 M a o pH 6,0, čímž se dosáhne konečného pH 5,0.The thiol group-containing irrolidine thus obtained was eluted with 0.1 M sodium chloride at pH 2.5. The most convenient method for carrying out this method is to fill the iount from the final sample with a small column and remove the e ^ dt into tubes containing pUir. Since the next stage in this procedure is carried out in ^г 2itátovér buffer 0.1 M at pH 5.0 is preferred е ^ ^ гаг eluate until sufficient moožtví αcttátovélo buffer koi ^ c ^^ i ^ trac i 0.1M and pH 6.0 to give a final pH of 5.0.

ol acetltového pnutu o koncentraci . 0,1 M aopH5,0 s obsahem 2,5 mg imunoglobuLinu s obsahem thiolových skupin se zchladí na ledové lázni. Získaný roztok se pak po kapkách přidá k 1 ni nasyceného roztoku ioidu kyseliny N,N*-o-fenylenbismeleinové v octanovém pWfru o kontcritraci 0,1 M a o pH 5,0 v ledové lázni. Pak se směs inkubuje při teplotě 30 °C 20 minut, načež se imvun>olobiú.in oddělí od přebytku svrchu uvedeného imidu' tak, že se výsledný roztok nechá projít sloupcem o rozměrech 20 x 1,5 cm β obsahem Sephadexu G 25 v rovnovážném stavu ve fosfátovém pufru o konc Straci 0,01 M s obsahem chloridu hořečnatého o koncentraci 0,01 M a pH 6,0 při teplotě místnooti.of acetonitrile concentration. Cool 0.1 M aopH5.0 containing 2.5 mg of immunoglobulin containing thiol groups on an ice bath. The resulting solution was then added dropwise to 1 µl of a saturated solution of N, N * -o-phenylenebismeleic acid ioide in 0.1 M acetate acetate at pH 5.0 in an ice bath. The mixture was then incubated at 30 ° C for 20 minutes, after which the immuno-ol was separated from the excess of the above imide by passing the resulting solution through a 20 x 1.5 cm β column with Sephadex G 25 at equilibrium. in phosphate buffer with a Straci concentration of 0.01 M containing 0.01 M magnesium chloride and pH 6.0 at room temperature.

5,0 pg [-galaktosidázy z Escheeichia coli, vysrlžené síranem amonným, se rozpustí v čiěčnném aktivovaném roztoku imrninolobulinu a inkubuje se 4 hodiny při teplotě 30 °C. Pak se přidá dostatečné mnnožtví normálního roztoku hydroxidu sodného k úpravě pH na hodnotu 7,5 a dostatečné onnožtví 2-oerkaptoeteantlu o koncceitraci 2 M tak, aby konečná koncentrace této látky byla 10 mnooiů.5.0 .mu.g of ammonium sulfate precipitated [.alpha.-galactosidase] dissolved in ammonium activated cellulose-activated solution and incubated at 30 DEG C. for 4 hours. A sufficient quantity of normal sodium hydroxide solution is then added to adjust the pH to 7.5 and a sufficient quantity of 2-oercaptoethanol with a concentration of 2 M is added to a final concentration of 10 moles.

KonUuiát ^щ^^ЬиИн a enzymu se ve formě roztoku nanese na sloupec o rozměrech x 0,9 cm s náplní DEAE-aairozy (Biogel) v rovnovážném stavu v tris-pufru s obsahem kyseliny chlorovodíkové o pH 7,5 a s obsahem 10 meolů 2-oenkaptoeteanolu, 10 otoolů chloridu hořečnatého a 50 meolů chloridu sodného při teplotě 4 °C. Roztok se vpraví do sloupce tak, že se převrství vrstva užitého pufn. Pak se soísí týž pufr se stoupajícím mnoostvím chloridu sodného tak, aby sloupec byl vymýván pufrem s konneenrací 50 až 200 omolů chloridu sodného. Celkové množní pufru je 250 ol. Ioιulttlotulin, který se nenavázal na enzym, se neadsorbuje ve sloupci a vypije se dříve, než dojde k vymytí komplexu. Komplex imunoglobulinu s enzymem se však vymývá dříve, než dojde k vyptí volného enzymu. Frakce, která obsahuje značený ioιulttlo0>ulin, se lyofilizuje, čímž se získá značená druhá protilátka.The enzyme and enzyme conjugate was applied as a solution to a 0.9 cm column packed with DEAE-aryrosis (Biogel) at equilibrium in a pH 7.5 7.5M Tris buffer containing 10 meoles. Of 2-octeneptoeteanol, 10 rotols of magnesium chloride and 50 meols of sodium chloride at 4 ° C. The solution is added to the column by overlaying the buffer layer used. Then the same buffer is mixed with increasing amounts of sodium chloride so that the column is eluted with a buffer with a concentration of 50 to 200 moles of sodium chloride. The total amount of buffer is 250 µl. Non-enzyme-bound Ioultultlotulin is not adsorbed in the column and is drunk before the complex is eluted. However, the immunoglobulin-enzyme complex is eluted before the free enzyme is dissipated. The fraction containing the labeled ultrafloxylin is lyophilized to give the labeled second antibody.

2. Výroba první protilátky2. Production of the first antibody

a) . Příprava konjugátu trio od třu?! oni nu (T^)a). Preparation of trio conjugate from rub ?! they nu (T ^)

250 mg sérového albuminu Skotu se rozpuutí ve 25 ol destilované vody a 1 000 mg 1-etetl-3-(Зddimet^tιlmintprtpyl)tarbtdiioldu se rozpuutí v 50 ol destilované vody. Oba roztoky se zchladí na 4 °C a dvě třetiny druhého roztoku se pomelu smísí s roztokem sérového albuminu, skotu. 150 pg čištěného se rozpustí ve 25 ol smOs! ethanolu a 2 M hydroxidu amonného v objemovém poměru 25:1 a roztok se zchladí na 4 °C, načež se po kapkách přidá ke svrchu uvedené směsi za stálého míchání, přičemž pH se udržuje na hodnotě 7,0 tak, Že se po kapkách přidává 0,25 M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Pak se reakční směs míchá dalších 10 oinut a zbytek roztoku karbodiioidu se přidává po kapkách, přičemž pH se znovu udržuje na hodnotě 7,0.250 mg of bovine serum albumin are dissolved in 25 l of distilled water and 1000 mg of 1-ethyl-3- (dimethylaminopropylpropyl) -carbidiol are dissolved in 50 l of distilled water. The two solutions are cooled to 4 ° C and two thirds of the second solution are blended with the serum albumin, bovine solution. 150 [mu] g of purified are dissolved in 25 [mu] l of smOs. ethanol and 2M ammonium hydroxide in a 25: 1 v / v ratio and the solution was cooled to 4 ° C, then added dropwise to the above mixture with stirring, maintaining the pH at 7.0 by dropwise addition. 0.25 M hydrochloric acid solution. The reaction mixture was stirred for an additional 10 minutes and the remainder of the carbodiioid solution was added dropwise while maintaining the pH again at 7.0.

Soěs se míchá přes noc při teplotě 4 °C. Ráno se roztok odstředí a supernatant se dialyzuje třikrát vždy proti čerstvému roztoku, který obsahuje soěs ^h^itanu sodného a ^агог^^^т sodného o celkové koncertnci 0,1 M a o pH 11,0, načež se dialyzuje proti destilované vodě. VVsledný roztok se lyofilizuje. Bylo prokázáno, že tímto způsobem se včlení 4,3 molu trioodtlrOoninu na 1 ool sérového albuminu skotu.Stir the mixture overnight at 4 ° C. In the morning, the solution was centrifuged and the supernatant was dialyzed three times against fresh solution containing a sodium metabisate / sodium salt solution of 0.1 M total conc., PH 11.0, and then dialyzed against distilled water. The resulting solution is lyophilized. In this way, it was shown that 4.3 mole of trioodotrolone was incorporated per 1 ool of bovine serum albumin.

b) Hříprava první protilátky (T-prooilltky)b) Preparation of the first antibody (T-prooilllets)

Stálá eoiú.ze se připraví tak, že se s^fí^:í 1 díl fyziologického roztoku chloridu sodného s obsahem 50 % přípravku Tween 80, T^-sérového albuminu skotu v ktntentraei 2 pg/ml a Bacillus Calrneete-Guerin v konccrtnci 1 pg/ml a 2 díly pomocného prostředku Maacol 52. Do hřbetu zvířete se na různá pista podkožně aplikuje 6 dávek této emulze v ennoství 1 ol a do končetin se titгosoIltoě aplikují 4 injekce po 0,75 ol emulze. Stanoví se titr protilátek a po 36 týdnech se podá další injekce k dosažení esximPlní produkce protilátek. V tomto případě jde o 6 titrosoalooýce injekcí vždy o objemu 0,5 ol do končetiny. V tomto případě sestává emtu-ze ze 2 dílů pomocného prostředku na 1 díl fyziologického roztoku, který obsahu9 je 2 mg konjugátu v 1 ml· Krev, odebíraná 10 dní po druhé injekci a další 2. měsíce,obsahuje vysoké hladiny T-pro ti látek.A stable emulsion is prepared by mixing 1 part of physiological saline containing 50% Tween 80, 10% bovine serum albumin in a concentration of 2 µg / ml and Bacillus Calrneete-Guerin at a concentration of 1%. pg / ml and 2 parts of Maacol 52. Into the back of the animal, 6 portions of the emulsion were administered subcutaneously at a rate of 1 .mu.l and 4 injections of 0.75 .mu.l emulsion were added to the limbs. The antibody titer is determined and after 36 weeks a further injection is made to achieve the maximal production of antibodies. In this case, there are 6 titroso loci injections of 0.5 l each in the limb. In this case, the emulsion consists of 2 parts of adjuvant per part of saline containing 9 mg of conjugate in 1 ml · Blood taken 10 days after the second injection and the next 2 months, contains high T-levels for three substances .

c) Příprava imunoadsorpčního prostředku přo čištění první . protilátky 'c) Preparation of the immunoadsorbent composition for purification first. antibodies'

Sepharóza 4B se aktivuje 1,4-bbs-(2,3“epoxypropoxy)butanem svrchu uvedeným způsobem.Sepharose 4B is activated with 1,4-bbs- (2,3-epoxypropoxy) butane as described above.

ml takto aktivovaného mattriálu se přidajík 20 ml fosfátového pufru o koncentraci 0,025 M a o pH 12,0 s obsahem 50 mg trjjodthriotinu. Pifr se míchá 45 hodin při teplotě místnosti. Gel se pak promyje 250 ml fosfátového pufru o koncentгaei 0,025 M a o pH 12,0, 150 ml roztoku elhLoridu sodného o koncentrtei 0,1 M a 100 ml destioované vody. Je možno prokázat, že se včlení 9 mg tr jo od hrd o ni nu do jednoho ml nabobtnalého gelu. Jakékoli zbývající oxiranové skupiny se blokují tak, že se gel uvede v suspenzi ve 4násobku svého objemu ve vodném roztoku ethanolaminu o ^ппс^^с! 1 M a pH 11 a směs se míchá 4 hodiny, načež se gel důkladně promyje dettiOovanou vodou k odstranění přebytku ethanoleminu.20 ml of 0.025 M phosphate buffer and pH 12.0 containing 50 mg of triiiodotriotine are added to the ml of the activated material. The crystals were stirred at room temperature for 45 hours. The gel was then washed with 250 ml of 0.025 M phosphate buffer, pH 12.0, 150 ml of 0.1 M sodium chloride solution and 100 ml of distilled water. It can be shown that 9 mg of triocyanate is incorporated into one ml of swollen gel. Any remaining oxirane groups are blocked by suspending the gel in 4 times its volume in an aqueous solution of ethanolamine. 1 M and pH 11, and the mixture is stirred for 4 hours, after which the gel is washed thoroughly with water to remove excess ethanolemin.

d) Čištění první protilátky ml tttitért proti tr jo od připraveného svrchu uvedeným způsobem, se hodinu mísí při teplotě místnooti s 1 ml Sepharózy, substituované trjoodhhr0tntreш. Neeppecficky adsorbované bílkoviny se odstraní z imunoadsorpčního prostředku tak, že se tento prostředek důkladně pr omývá . roztokem chloridu sodného s přísadou fosfátu o konceenraci 0,05 M a pH 7,0, koncentrace chloridu sodného je 0,2 M. ^1 se naplní do malého sloupce svrchu uvedeným způsobem a promyje se kyselinou chlorovodíkovou o pH 3 k odstranění fstfáSovéhs pufru. Ρ^<^ί^:ί— látky proti iriOodt^nriotitt se vym^vaj 4 ml guanidinitm^hrУdocehoriiu o ksncentraei 6 M a o pH 2 a uvádděí do barbioonového pufru v mnnoství 1 ml o ksntentraei 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % sérového albuminu skotu..Pak se uvedené protilátky důkladně dielyzují proti témuž pufru k odstranění guanidinitmýdroceUoridu.d) Purification of the first anti-tritrile antibody from the above prepared method was mixed with 1 ml of Sepharose, substituted with triethylamine, for 1 hour at room temperature. Non-specifically adsorbed proteins are removed from the immunoadsorbent composition by washing it thoroughly. 0.05 M sodium phosphate added, pH 7.0, 0.2 M sodium chloride was added to a small column as described above, and washed with pH 3 hydrochloric acid to remove the phosphate buffer. Ρ ^ <^ ^ ί: ί- agents against iriOodt ^ nriotitt is exchanged ^VA j ^ 4 ml guanidinitm hrУdocehoriiu ksncentraei about 6 M and the pH to 2 and uvádděí barbioonového buffer mnnoství ksntentraei about 1 ml of 0.05M and pH 8.6 with the addition of 0.1% bovine serum albumin. Thereafter, said antibodies are thoroughly lysed against the same buffer to remove guanidinium-fluoride.

3. Příprava antigenu (T-) na nosiči3. Preparation of antigen (T-) on a carrier

Postupuje se steným způsobem, který již byl popsán při výrobě imiuioadsorpčního prostředku pro čištění první protilátky (odstavec 2c svrchu), s tím rozdílem, že se užije nižší koncentrace triOoit^r·iotitt. Tímto způsobem sesníží také koncentrace uvedené látky v gelu.The same procedure is used as described above for the preparation of the first adsorbent for the purification of the first antibody (paragraph 2c above), except that a lower concentration of tritonate is used. This also reduces the concentration of the substance in the gel.

Stanovení trjoodpři pouští rekačních činidel, jejichž příprava se popisuje, bylo již popsáno.The determination of desiccants of the reagents described above has already been described.

Unnverzální reakční činidlo, které je možno získat svrchuuvedeným způsobem, lze užít ke stanovení antigenů podle několika odlišných způsobů.The inverse reagent obtainable by the above method can be used to determine antigens according to several different methods.

Postup 1a: První protilátka a volný antigen se inku^uj, přidá se imirnoaddorpční prostředek a po prornt* se přidá značící látka.Procedure 1a: Incubate the first antibody and free antigen, then add the immunoadsorbent, and then add the label reagent.

Postup 1b: Současně se inkubuje první protilátka, volný antigen a imtuioadsorpční prostředek. Značčcí složka se přidá k probytému imwnoadsorpčnímu prostředku.Procedure 1b: Simultaneously incubate the first antibody, free antigen and imtuioadsorbent. The label component is added to the absorbed imoadsorbent composition.

Postup 2a: Inkubuje se první protilátka, volný antigen a značící látka. Po určité době se přidá imunoadsorpční prostředek. Způsob 2a je možno modifikovat tak, že se inkubuje první protilátka s enzymaaickou značící složkou před přidáním volného antigenu. Pak jde o postup 2b.Procedure 2a: Incubate the first antibody, free antigen and label. After some time, the immunoadsorbent is added. Method 2a can be modified by incubating the first antibody with an enzymatic labeling component before adding the free antigen. Then it is the procedure 2b.

Postup 3: Při provádění tohoto postupu se současně smísí první protilátka, značící složka, volný antigen a imunooddorpční prostředek. Tento postup je rovněž možno pdzměstt tak, že se předem vytvoří komplex složky a první pro'tilátky.Method 3: In carrying out this procedure, the first antibody, label, free antigen, and immuno-resorbent are mixed together. This process can also be modified by preforming the component and the first antibody.

V dalších příkladech jsou popsány výsledky pokusů, které byly provedeny při použití univerzálního reakčního činidla některým ze svrchu uvedených postupů.In the following examples, the results of experiments carried out using a universal reagent according to one of the above procedures are described.

Příklad 2Example 2

Stanovení trijodthrioninž při pouužtí univerzálního reakčního činidlaDetermination of triiodotriphion using a universal reagent

Postup Ia: Ovčí antiséuira proti tr jtoSttu·toniru v ředění 1:2 000 v 0,1 Ш1 barbioonového pufru o konccntraci 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % sérového albuminu (hmoonootní $/objemová %) se smísí s 0,1 ml trijodthritntoového standardu v barbionnovém pufru a směs se nechá stát 24 hodin při teplotě 4 °C. Přidá se 0,1 ml ba^^onového pufru s obsahem 0,3 % (hmotnostní %/objemová %) přípravku Tween 80 a s obsahem 50 mikrogramů T^-imirnoadsorpčního prostředku a po_: promísení se směs nechá hodinu stát při teplotě 4 °C, pak se dvíOcrát promyje 5% roztokem chloridu sodného s přísadou barbioonového pufru a promj® ještě barbionoovým pufrem. S promytým imunoadsorpčním prostředkem se smíí^rí enzymatická značící složka, kterou je 100 mikro^t^ oslího obbú-inu proti ovčímu antigenu s vázanou galaktosidázou, a směs se udržuje 24 hodin při teplotě 4 °C, pak se promyje svrchu uvedený^ způsobem a běžnými metodami se měří účinnost enzymu, vázaného na imunoadsorpční prostředek. Výsledky jsou uvedeny v následnicí tabulce:Procedure Ia: Sheep antiséuira against tritto · tonir at a 1: 2,000 dilution in a 0.1 Ш 1 barbioon buffer with a concentration of 0.05 M and a pH of 8.6 plus 0.1% serum albumin (hmoonoot $ / v / v). it is mixed with 0.1 ml of triiodotritto standard in barbionine buffer and the mixture is allowed to stand for 24 hours at 4 ° C. 0.1 ml ba ^^ onového buffer containing 0.3% (w% / v% Tween 80) containing 50 g and T ^ -imirnoadsorpčního composition _after: mixing the mixture was allowed hour at 4 ° C It is then washed twice with 5% sodium chloride solution with the addition of a barbioon buffer and then with a barbiono buffer. The washed immunoadsorbent is mixed with an enzymatic labeling component, which is 100 microns of donkey anti-sheep antigen with bound galactosidase, and held at 4 ° C for 24 hours, then washed as described above and The efficiency of an enzyme bound to an immunoadsorbent is measured by conventional methods. The results are shown in the following table:

TabulkaTable

Konoeηtrtce (nnoly/litr)J Konoeηtrtce (n / mol) J Ootická hustota (2 hodiny) Ootic density (2 hours) $ slepé zkoušky * $ blind test * 0 ' 0 ' 0,29 0.29 100 100 ALIGN! 1 1 0,17 0.17 50 50 4 4 0,16 0.16 47 47 32 32 0,135 0.135 35 35

Vazba značené složky na imiuioaddorpční prostředek nespecifccýým způsobem je 0,05.The binding of the labeled component to the imide adsorbent in a non-specific manner is 0.05.

# vazba, vypočítaná po odečtení nespecifické vazby.# binding, calculated after subtraction of non-specific binding.

Podobný pokus byl proveden při pouužtí oslího Fc fragmentu proti ovčímu antigenu s navázanou gtltkttsiSάztž jako značící složkou. Jde o obdobný způsob jako svrchu, s tím rozdílem, že se antiséra se standardem nechají stát 8 hodin a že ředění antiséra je 1:1 600. VVsledky jsou uvedeny v následnicí tabulce:A similar experiment was carried out using an donkey Fc fragment against sheep antigen with gtltkttsiStztz bound as a labeling component. This is similar to the above except that the standard antisera are allowed to stand for 8 hours and the antisera dilution is 1: 1600. The results are shown in the following table:

TabulkaTable

Κο^βηΟ^^ T₃ (nmooy/1, ng/riL)3ο ^ βηΟ ^^ T ₃ (nmooy / 1, ng / riL) Oppická hustota ⁽² hoHHy)Oppic density ⁽² hoHHy) % slepé.zkoušky % blind 0 0 0 0 0,43 0.43 100 100 ALIGN! 0,42 0.42 0,25 0.25 0,35 0.35 81 81 1,56 1.56 1.0 1.0 0,28 0.28 65 65 6,25 6.25 4,0 4.0 0,16 0.16 37 37 25 25 16 16 0,15 0.15 35 35 NSB 0,025 NSB 0.025

Stanovení tritoSt^π’ionitž při univerzálního reakčního činidlaDetermination of tritosity in a universal reagent

Postup 2a: 0,1 ml čištěného ovčího Ττ-anniséra a 0,1 ml T^-standardu v barbionnovém pufru o konccnnraci 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % (hmotnottní fc/objemová %) 'sérového albuminu skotu se smísí se značící složkou, kterou je 25 mikrolitrů oslího komplexu antiimunoglobulinu proti ovitou antigenu a enzymu a směs se udržuje ^{24 h}odin na ‘teploté ^{4 O}C. Pak se přidá 0,1 ml Uarbioonového pufru, který obsahuje Tj-imuo°tdo°rtíního prostředku v mnnožsví 50 mikrogr«mů a 0,3 % (hmoonootní ^/objemová %) přípravku Tween 80 a směs se udržuje hodinu na te^plotě 4 ⁰C. ^pak se imunoaddorpční pros^třede^k promyje a ú^^ost vázaⁿého enzymu se stanoví stejně jako v příkladu 2. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.Procedure 2a: 0.1 ml of purified sheep Ττ-anniser and 0.1 ml of the β-standard in barbionine buffer at a concentration of 0.05 M and a pH of 8.6 with the addition of 0.1% (w / v) serum The bovine albumin is mixed with a 25 microliter donkey anti-immunoglobulin anti-ovarian antigen-enzyme complex and maintained at ⁴⁰ ° C for ^{24 h} . 0.1 ml of Uarbioon buffer containing T i -imuo is then added. TDO ° rtíního composition in mnnožsví 50 microgram «Mu and 0.3% (hmoonootní ^ / v% Tween 80) and kept one hour at te ^p Lote 4 ⁰ C. ^p and ^t are pros imunoaddorpční REDE ^the washed and u ^ ⁿ ^ ost vase ého enzyme was determined as described in Example 2. the results are shown in the following table.

TabulkaTable

Koncentrace Τ» (ююЫШг/ Concentration Τ »(ююЫШг / Optická hustota (1 hodina) Optical density (1 hour) % slepé zkoušky * % of blank test * 0 0 0,47 0.47 100 100 ALIGN! 0,5 0.5 0,42 0.42 90 90 1 1 0,35 0.35 70 70 2 2 0,24 0.24 45 45 4 4 0,21 0.21 38 38 8 8 0,20 0.20 36 36 16 16 0,18 0.18 33 33 32 32 0,17 0.17 31 31 64 64 0,14 0.14 22 22nd NSB NSB 0,05 0.05 44 hodnoty byly vypočítány po odečtení nespecificky vázaných látek. 44 values were calculated after subtraction of non-specifically bound substances.

Příklad 4Example 4

Stanovení trilodhriloniol při použití univerzálního reakíního činidlaDetermination of trilodhriloniol using a universal reagent

Postup 2b: íkšěěné Tз-ppolildtry v uvedení 1:1 500 v 8,5 í Uarbioonového pufru o koncenn-raci 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % (hmoonootní %/objemová %) sérového albuminu skotu se smísí s enz^ynmtickou značící složkou, kterou je konjugát oslí protilátky ·proti ovíímu antigenu s vázanou gtltktlsidázou v mrlo°žSví 5,1 ml, a směs se nechá stát při teplotě 4 °C až do poo^kí.Procedure 2b: Tз-ppolildtry in 1: 1 500 in 8.5 µl of 0.05 M Uarbioon buffer and pH 8.6 with 0.1% (hmoonoot% / volume%) bovine serum albumin addition it is mixed with the enzyme label component, which is a donkey anti-oval antigen-coupled GTCT conjugate in 5.1 ml, and the mixture is allowed to stand at 4 ° C until ambient.

standardy v 50 mikroUtech UtrUilonovéhl pufru se smísí s 200 шйгоШоу komplexu značené složky s první prltilárkou a dalším mužstvím 0,5 οΙ^ο^^Δ UtгUklonového pu'ru, ot^íe^ž se udržuuí ⁴ h°din^y na teplot ^{4 0}C. Do z^kumavek: se přidá 5⁰ mikrogramů ^-imunoadsorpíního prostředku v UtrUilonovéi pufru s obsahem 0,4 % přípravku Tween 80 a zkumavky se hodinu ^^buuí piřx teplot ^{4 0}C. ^pak se imunoadsorpční prostředek pro^je Utr^Ui0onovým pufrem s obsahem 5 % chloridu sodného a pak tímtéž pufrem s obsahem 1 % chloridu sodného. Účinnost enzymu vázaného na imunoadsorpční prostředek se stanoví běžným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v nádsed^!^ tabulce.standards 50 mikroUtech UtrUilonovéhl buffer was mixed with 200 шйгоШоу labeled complex with the first component and the other masculine prltilárkou 0.5 οΙ ^ ^^ ο Δ UtгUklonového pu'ru, rt ^d e ^f h is udržuuí ⁴ ° din ^s at ^{4 0} C . to ^the umavek of: adding 5 micrograms ^ ⁰ -imunoadsorpíního UtrUilonovéi composition in buffer containing 0.4% Tween 80, and the tubes ^^ buuí Pirx hour at ^{4 0} C. ^p where the immunoadsorbent is Utr ^ ^U ionic buffer containing 5% sodium chloride and then the same buffer containing 1% sodium chloride. The activity of the enzyme bound to the immunoadsorbent is determined in a conventional manner. The results are shown in the table below.

TabulkaTable

Koncentrace T, Optická hustota %· slepé zkoušky (nnolo/vitr)^J(1 hodina)ή-Concentration T, Optical Density% · blank (nnolo / vitr) ^J (1 hour) ή-

0 0 0,44 0.44 100 100 ALIGN! 0,125 0.125 0,40 0.40 83 83 0,25 0.25 0,36 0.36 69 69 0,5 0.5 0,37 0.37 74 74 1 1 0,29 0.29 46 46 2 2 0,24 0.24 27 27 Mar: 4 4 0,20 0.20 15 15 Dec 8 8 0,19 0.19 12 12

NSB 0,16NSB 0.16

X hodnoty byly získány po odečtení neoppccficky vázané látky.X values were obtained after subtraction of the non-receptor-bound substance.

Pokus byl opakován s obdobným výsledkem při použití Fc fragmentu.The experiment was repeated with a similar result using an Fc fragment.

Příklad 5Example 5

Stanovení trijodthrioninu při použití univerzálního reakčního činidlaDetermination of triiodotrionine using a universal reagent

Postup 3: T^-etandardy ve 100 mikrolitrech barbitonového pufru se smísí s 200 mikrolitry komplexu první protilátky se značenou složkou a 25 mikrogramy T^-imunoadsorpčního prostředku ve 100 mikrolitřech barbitonového pufru s obsahem 0,4 % (hmotnostní %/objemová %) prostředku Tween 80 a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 4 °C. Pak se imunoadsorpční prostředek promyje a vázaný enzym se stanoví způsobem podle příkladu 4. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.Procedure 3: T-standards in 100 microliters of barbiton buffer are mixed with 200 microliters of the first labeled component complex and 25 micrograms of T-immunosorbent in 100 microliters of barbiton buffer containing 0.4% (w / v) of the composition Tween 80 and incubate at 4 ° C for 2 hours. The immunoadsorbent is then washed and the bound enzyme is determined by the method of Example 4. The results are shown in the following table.

Koncentrace (nmol/litr) Concentration (nmol / liter) Optická hustota Cl hodina) Optical density (Cl hour) % slepé zkoušky . * % of blank test . * 0 0 0,33 0.33 100 100 ALIGN! 0,5 0.5 0,32 0.32 94 94 1 1 0,29 0.29 83 83 2 2 0,28 0.28 77 77 4 4 0,24 0.24 60 60 8 8 0,21 0.21 42 42 16 16 0,18 0.18 32 32 NSB = 0,114 NSB = 0.114

# hodnoty byly získány po odečtení nespecificky vázané látky# values were obtained after subtracting the non-specifically bound substance

Stanovení trijodthrioninu při použití univerzálního reakčního ČinidlaDetermination of triiodotrionine using a universal reagent

Postup 2b: Byl opakován postup podle příkladu 4, s tím rozdílem, Že globulin schopný vázat hormon Štítné Žlázy byl rozložen zahříváním vzorku plazmy při teplotě 70 °C po dobu 1 hodiny. Získané výsledky byly obdobné výsledkům z příkladu 4«Procedure 2b: The procedure of Example 4 was repeated except that globulin capable of binding the thyroid hormone was decomposed by heating the plasma sample at 70 ° C for 1 hour. The results obtained were similar to those of Example 4.

Příklad 7Example 7

Stanovení růstového hormonu (HGH) při použití univerzálního reakčního činidlaDetermination of growth hormone (HGH) using a universal reagent

Postup 1a: Králičí antieérum proti růstovému hormonu v ředění 1:20 000 v 0,1 ml barbitonového pufru o koncentraci 0,05 M při pH 8,6 s přísadou 0,65 M chloridu sodného a 0,5 % (hmotnostní %/objemová %) hovězího sérového albuminu se smísí se standardy růstového hormonu, ředěnými v 0,1 ml barbitonového pufru, a směs se udržuje 24 hodin na teplotě 4 °C. Pak se přidá imunoadsorpční prostředek pro růstový hormon 0,1 ml barbitonového pufru v množství 10 mlkrogramů, po smísení se směs hodinu udržuje na teplotě 4 °C a pak se znovu promyje 0,05 M barbitonovým pufrem o pH 8,6 v množství 2 ml s obsahem 5 % chloridu sodného a nakonec se směs proqyje tímtéž pufrem s obsahem 1 % chloridu sodného. Pak se přidá 50 mikrolitrů enzymatické značící složky, kterou je oslí Fc galaktozidáza proti králičímu antigenu, směs se znovu udržuje 24 hodin na teplotě místnosti, promyje se svrchu uvedeným způsobem a účinnost enzymu, vázáného na imunoadsorpční prostředek, se měří běžným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.Procedure 1a: Rabbit anti-growth hormone antioxidant at 1:20 000 dilution in 0.1 ml 0.05 M barbiton buffer at pH 8.6 with 0.65 M sodium chloride and 0.5% (w / v) %) of bovine serum albumin is mixed with growth hormone standards diluted in 0.1 ml of barbiton buffer, and the mixture is maintained at 4 ° C for 24 hours. Growth hormone immunoadsorbent 0.1 ml of 10-ml barbiton buffer was added, after mixing the mixture was kept at 4 ° C for 1 hour and then washed again with 0.05 M barbiton buffer pH 8.6 at 2 ml. containing 5% sodium chloride and finally washed with the same buffer containing 1% sodium chloride. 50 .mu.l of an enzyme labeled donkey Fc galactosidase against rabbit antigen is then added, the mixture is again maintained at room temperature for 24 hours, washed as above, and the activity of the enzyme bound to the immunoadsorbent is measured in a conventional manner. The results are shown in the following table.

TabulkaTable

Soiventrace růstového hormonuGrowth hormone soiventration

Optická hustota (1 hodina) % slep⁰ zkoušky *Optical density (1 hour)% blind ⁰ tests *

0 0 0,64 0.64 100 100 ALIGN! 0,39 0.39 0,61 0.61 95 95 0,78 0.78 0,60 0.60 93 93 1,56 1.56 0,51 0.51 75 75 3,125 3,125 0,43 0.43 63 63 6,25 6.25 0,38 0.38 53 53 12,5 12.5 0,31 0.31 41 41 25 25 0,26 0.26 33 33 30 30 0,22 0.22 24 24 100 100 ALIGN! 0,18 0.18 18 18

Nespecificky vázaná značená složka na imwioadsorpční prostředek = 0,08.Non-specific bound label component to imwioadsorbent = 0.08.

% vazba byla vypočítána po odečtení nespecificky vázaných látekThe% binding was calculated after subtraction of non-specifically bound substances

Příklad8Example8

Stanovení inzuLinu imunologickým způsobem při použití univerzálního reakčního činidlaDetermination of insulin by immunological method using universal reagent

Postup la: Moočecí antisénm v ředění 1:10 000 nebo v ředění 1:40 000 v 0,1 ml fosfátového pufru o kor^c^i^e^tjrai^i 0,04 M a pH 7,4 s přísadou 0,5 ' % (hmočnočtní %/objemová %l hovězího sérového albuminu se sm!^:í se standardy hovězího tového pufru, a vzorky se udržují 24 hodin na teplotě prostředek pro inzulín v 0,1 mí fosforového pufru při smísení se zkumavky 30. minut na teplotě 4 °C.Procedure 1a: Urine antisene dilution 1:10 000 or 1:40 000 dilution in 0.1 ml phosphate buffer of 0.04 M and pH 7.4 with 0, 5% (bw / v% bovine serum albumin was mixed with bovine buffer standards, and samples were maintained at insulin temperature in 0.1m phosphor buffer for 24 hours when mixed in a tube for 30 minutes at 4 ° C.

pro^je 2 ml fosfátového pUfru s obsahem 5 % chloridu hem 1 % chloridu sodného. Do zkumavek se přidá 50 miknoitrů enzymatické konjugát galaktosidázy s oslím imiunoglobulinem proti morčecímu antigenu, směs udržuje 24 hodin na teplotě míítnoosi. Imu^c^č^c^s^(^č^]^to:í prostředek se uvedeným způsobem a účinnost galaktosidázy vázané na imirnoadsorpČní prostředek se měří běžným způsobem. Výsledky jsou uvedeny y následující tabulce inzulinu, připraverými v 0,1 ml fosfá4 °C. Pak se přidá imunoadsorpční obsahu 25 mikrogramů prostředku a po Im^un)odsoгpδní prostředek se pak sodného a pak 2 ml téhož pufru s obsasložky, kterou je a po smísení se promde svrchufor 2 ml of phosphate buffer containing 5% chloride and 1% sodium chloride. 50 micnoiters of the enzyme conjugate galactosidase with donkey immunoglobulin anti-guinea pig antigen are added to the tubes, and the mixture is maintained at mild temperature for 24 hours. The immunoadsorbent was measured in a conventional manner and the results are shown in the following table of insulin prepared in 0.1 ml phosphate. The immunoadsorbent content of 25 micrograms of the formulation is then added and, after Immin, the desulfurizing agent is then treated with sodium and then 2 ml of the same buffer with the constituent which, after mixing, is mixed above.

TabulkaTable

Konccntrace inzulínu Concentration of insulin Optická hustota (90 minut) Optical Density (90 minutes) % slepé zkoušky % of blank test ředění antiséra dilution of antiserum 1:10 000 1:10 000 0 0 0,62 0.62 100 100 ALIGN! 0,96 0.96 0,50 0.50 83 83 4,8 4.8 0,34 0.34 55 55 24 24 0,26 0.26 42 42 ředění antiséra dilution of antiserum 1:40 000 1:40 000 0 0 0,36 0.36 100 100 ALIGN! 0,96 0.96 0,18 0.18 50 50 4,8 4.8 0,17 0.17 47 47 24 24 0,16 0.16 44 44

Neepecifická vazba = 0,05 enzymatické složky v imwnoadsorpěním prostředku.Non-specific binding = 0.05 enzyme component in imwnoadsorption of the composition.

Příklad 9Example 9

Stanovení kortisolu imunobiologiclým způsobem při použití univerzálního reakčního činidlaDetermination of cortisol by immunobiological method using universal reagent

Postup 1a: Ovčí antisérim proti kortisolu v ředění 1:20 000 v 0,1 mL fosfátového piufru o koncenttraci 0,1 M a o pH 7,4 s přísadou 0,1 % (hmoonostní %/objemová %) želatiny, 0,83 % chloridu sodného a 0,1 % thiomersalu se smísí se standardy kortisolu v 0,1 ml fosfátového pufru a směs se udržuje 24 hodin při teplotě 4 °C. Pak se přidá 0,1 ml fosfátového pufru s obsahem 0,3 % (hmoonnotní %/objemová %) přípravku Tween 80 a 25 mikrogramů kortisolového imunoabsorpčního prostředku, po smísení se směs udržuje hodinu na teplotě 4 °C, načež se pro^je ^sído©!^ pufrem s obsahem 3 % chloridu sodného a nakonec čistým fosfáooýfa pjrfrem. K promytému imunoadsorpčnímu prostředku se přidá 25 mikkooitrů enzymatické složky, kterou je konjugát galaktosidázy s oslím imunoglobulinem proti ovčímu antigenu s přísadou 0,5 % (hmoSnostní ^/objemová %) přípravku Tween 80, a směs se udržuje dalších 24 hodin na teplotě 4 °C, pak se směs promje svrchu uvedeným způsobem a účinnost enzymu se stanoví běžnými postupy. Výsledky jsou uvedeny v následující tabiu.ce.Procedure 1a: Sheep antisera against cortisol at a dilution of 1:20 000 in 0.1 mL of 0.1 M phosphate buffer and pH 7.4 with 0.1% (w / v%) gelatin, 0.83% sodium chloride and 0.1% thiomersal are mixed with cortisol standards in 0.1 ml phosphate buffer and kept at 4 ° C for 24 hours. 0.1 ml of phosphate buffer containing 0.3% (w / w%) of Tween 80 and 25 micrograms of cortisol immunoabsorbent are then added, after mixing the mixture is kept at 4 ° C for 1 hour. It was washed with 3% sodium chloride buffer and finally with pure phosphate buffer. To the washed immunoadsorbent, 25 microliters of the enzymatic component, a galactosidase conjugate, with a donkey immunoglobulin against sheep antigen with 0.5% (w / v) of Tween 80 is added, and the mixture is maintained at 4 ° C for an additional 24 hours. The mixture is then washed as described above and the activity of the enzyme is determined by conventional methods. The results are shown in the table below.

TabulkaTable

koncentrace kortisolu (na/m.) cortisol concentration (na / m.) Optická hustota (1 hodina) Optical density (1 hour) % slepé zkoušky 44 % of blank test 44 0 0 0,33 0.33 100 100 ALIGN! 125 125 0,29 0.29 87 87 250 250 0,26 0.26 74 74 500 500 0,21 0.21 59 59 1 000 1 000 0,18 0.18 47 47 2 000 2 000 0,15 0.15 37 37 4 000 4 000 0,11 0.11 24 24 8 000 8 000 0,11 0.11 24 24

Nespeccfická vazba značené složky na imwioaddórpční prostředek je 0,04.The nonspecific binding of the labeled component to the imio-adsorption agent is 0.04.

* výpočet byl proveden po odečtení nespecificky vázaných látek.* calculation was made after subtraction of non-specifically bound substances.

Je běžné a velmi výhodné navrhovat zkušební balíčky, které obsahají všechny látky pro provedení určité zkoušky, v tomto případě k provádění způsobu podle vynálezu při zjišťování různých antigenů. Takový balíček by měl obsahovat nerozpustný maateiál s vázaným antigenem, který může být totožný nebo odlišný od antigenu, který má být zjišťován , pomocí zkušebního balíčku. Dále by měl balíček obsahovat vhodnou povozí protilátku, vhodný typ enzymaticky značené druhé protilátky a prostředek pro stanovení enzymatická účinn^ti vázaného enzymu a s výhodou rovněž roztok s obsahem známého m^živ! antigenu, který má být zjišťován pomocí zkušebního balíčku ke kalibračním účelům.It is common and very advantageous to design test kits which contain all substances to carry out a particular test, in this case to carry out the method of the invention in detecting different antigens. Such a package should contain an insoluble antigen-binding material that may be identical or different from the antigen to be detected by the assay package. Further, the package should comprise a suitable carrier antibody, a suitable type of enzymatically labeled second antibody and a means for determining the enzymatically bound enzyme and preferably also a solution containing a known buffer. the antigen to be detected by the assay kit for calibration purposes.

Je výhodné, aby balíček obsahoval pevnou fázi ve formě tyčinky, kterou je možno ponořit do dalších ' složek uvedené směsi a opět ji z této směsi vyjmout. Toto uspořádán může velmi usnadnit několikanásobné proývání pevné fáze a tím zýšit přesnost stanovení.It is preferred that the package comprises a solid phase in the form of a rod that can be immersed in and removed from the other ingredients of the composition. This arrangement can greatly facilitate multiple solid phase sweeping and thereby improve assay accuracy.

Zkušební balíček určený pro stanovení ^^о^йгЮоХоп by například měl obsahovat následuuzdící složky:For example, the test package to determine ^^ о ^ йгЮоХоп should include the following components:

1. nerozpustný pevný maaterál buč ve formě suspenze v pufru, například barbitonovém' pufru, nebo v 1ysfilisovaoé formě s navázaným antigenem T^J1. Insoluble solid material either in the form of a suspension in a buffer, for example a barbitone buffer, or in a T1-linked antigen-coated form.

2. povozí protilátku (například ovčí anti-Tj) spolu s druhou protilátkou, kterou m^íže být například oslí Fc-frígment imunnoloblinu proti ovčímu antigenu, přičemž tato druhá látkv je značena p-galaktosidázou a zkušební biOLÍSek ji s . výhodou obsahuje v lyofilizované formě; .2. a carrier antibody (e.g., sheep anti-Tj) together with a second antibody, which may be, for example, the donor immunoglobulin Fc-fragment of an ovine antigen, the latter being labeled with β-galactosidase and a biolysis assay thereof. preferably, in lyophilized form; .

³. substrát, napří^klv^d nitrofenyi-gv^^osid v tonečné ^koncentrvci napříW.^ I⁰*³ M v piufru, napříklvd bvrbionnovém o · pH s výhodou 7 vž 9 v 0,01 vž 0,2 M, s výhodou v lyofilizoaaté formě v ³ . substrate, such as ^{KL-nitrophenyl d} ^^ GV cons in tonečné ^to oncentrvci napříW. ^ I ⁰ * ³ M piufru, napříklvd bvrbionnovém · pH of preferably 7 tower tower 9 0.01 0.2 M, preferably lyophilized form in

4. roztok s obsv^hLe^m známého mnnoství T^, napříklvd 10 nM/1, s výhodou v lytfilitootné formě.4. a solution containing a known quantity of T, for example 10 nM / l, preferably in a lyophilized form.

Claims (8)

PŘEDMĚT VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION 1. Způsob imunologického stanovení protilátek pomooí vázvného enzymu, při němž se uvede ve styk entigen nv nerozpustném mataeiálu nebo ve formě nerozpustného vgregátu, první protilátke v enzymavicky znvčená druhá protilátkv,.nvčež se nerozpustný v rozpustný materiál od sebe oddděí v st^oví se nnz;ynatická účinnost,„vyživující se tím, že se první protilátkv uvede do styku se vzorkem, který obsahuje tttnovovaný vutigen, v druhá protilátkv se n^áže nv nerozpustný шattniál v nepřímé závislosti vzhledem k mnnžssví vntigenu ve zkoumeném vzorku.CLAIMS 1. A method of immunoassaying an antibody by a binding enzyme comprising contacting an entigen n in an insoluble material or in the form of an insoluble aggregate, a first antibody in an enzymatically softened second antibody, wherein the insoluble soluble material is separated from one another The enzymatic activity is nourished by contacting the first antibody with a sample containing the recovered vutigen, the second antibody binds to the insoluble mineral in indirect dependence on the amount of antigen in the sample to be examined. 2. Způsob podle bodu 1, vyznávsuící se tím, že se první protilátkv uvede v revkcíi s vneseném v se vzorkem, nvčež se pevná fáze oddděí od kvpvlné fáze v veškerá první látkv vázvná nv oddělenou pevnou fázi se uvede v revkci s druhou protilátkou v druhém kvpvlném prostředí, prostém první protilátky v vzorku, poté se odděěí pevná fáze od druhého kvpalného prostředí v stanoví.se nebo se změěí enzymevická účinnost pevné fáze.2. The method of claim 1, wherein the first antibody is reversed with the sample in the sample, wherein the solid phase is separated from the quaternary phase in all the first n-binding solids in a separate solid phase with the second antibody in the second. The solid phase is then separated from the second liquid medium in the assay or the enzymatic activity of the solid phase is changed. 3. Způsob podle bodu 1, ^znav^ící se tím, že se uvede v druhá protilátkv v první protilátkt zv vzniku komplexu obou pro telátek, který se pvk uvede v rnvkci s antigenem v se vzorkem.3. The method of claim 1, wherein said second antibody in said first antibody is formed from a complex of both calves, said pvk being reacted with said antigen in said sample. 4. Způsob podle bodů 2 v 3, oy^zntující se tím, že se první protilátkv nebo vzniklý komplex uvede do revkce nejdříve se vzorkem v potom s antigenem.4. A method according to any one of claims 2 to 3, wherein the first antibody or complex formed is first reversed with the sample then with the antigen. 5. Způsob podle bodů 2 v 3, oyznatující se tím, že se první protilátkv nebo vzniklý komplex uvede v rev^^i soύčasně se vzorkem v s vntigenem·5. The method of claim 2, wherein said first antibody or complex formed is reversed simultaneously with said sample in said antigen. 6. Způsob podle bodů 1 vž 5, ^zna^ící se tím, že první protilátkv je v přebytku, vzhledem k mnoosíví nutnému pro rntkci s veškerým vntigenem, který je přítoπιen ve vzorku, v celkové ^ι^β^ί tntignnu ve vzorku v nerozpustného vntigenu je v přebytku vzhledem k mn^a^í první protilátky.6. A method according to any one of claims 1 to 5, wherein the first antibody is in excess of the amount required to react with all of the antigen present in the sample in the total sample. in the insoluble antigen is in excess of the first to second antibody. 7. Způsob podle bodů 1 vž 6, oy2^δ^ntudíc:í se tím, že tntignn je totožný s vntigenem ve vzorku v je uložen nv nerozpustném mattniálu, nv agarozooém . gelu s příčnými můstky, vktvvovaném 1,4-bis-(2,n-epoxyroP0o:)yгSbutanem.7. The method of claim 1 tower 6 oy2 ^δ ^ ntudíc: d in that it is identical with tntignn vntigenem sample is stored in the NV-insoluble mattniálu, NV agarozooém. a cross-linking gel in which 1,4-bis- (2, n-epoxyroPo) ygButane was applied. 8. Způsob podle bodů 3 vž 7, uící se tím, že se nnzymatická účinnost stanoví v oddělené kvpalné fázi.8. The method of claims 3 to 7, wherein the enzymatic activity is determined in a separate liquefaction phase.