HU179396B

HU179396B - Process for preparing 2-oxo-l-gulonic acid

Info

Publication number: HU179396B
Application number: HU818128A
Authority: HU
Inventors: Donald A Kita; Karlene E Hall
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1980-01-21
Filing date: 1981-01-07
Publication date: 1982-10-28
Also published as: GR73650B; DK149868C; DE3160085D1; AR222931A1; MX6820E; IE810091L; IE50834B1; ATE2685T1; ZA81369B; AU6632281A; ES498682A0; US4245049A; CA1152917A; EP0032830A3; DK495780A; CS217986B2; EP0032830B1; JPS56106596A; DK149868B; JPS5846318B2

Description

A 2-oxo-L-gulonsav értékes közti termék az aszkorbinsav (C vitamin), az emberi táplálkozás szempontjából lényeges vitamin előállítására. A 2-oxo-L-gulonsav aszkorbinsawá való átalakítására irányuló eljárások (például a lúg jelenlétében végzett hevítés) a szakember számára jól ismertek.

A szakember számára azonban csak korlátozott , . számú olyan mikroorganizmus ismeretes, amely a .1 2,5-dioxo-D-glükonsavat hatékonyan képes 2-oxo-L-gulonsav képződése közben redukálni, ilyeneket is_t .,, mértét például a 3 963 574, 3 922 194 és 3 959 076 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás. Ezek a mikroorganizmusok nem mindig biztosíthatók és viszonylag nehezen hozzáférhetők.

A találmány célkitűzése olyan új eljárás kidolgozása, amely további lehetőséget nyújt 2-oxo-L-gulonsav előállítására, mégpedig könnyebben biztosítható mikroorganizmusok segítségével.

A Citrobacter genushoz tartozó mikroorganizmusokról korábban nem írták le, hogy hatékonyak lennének ebben a reakcióban.

A találmány értelmében azt találtuk, hogy egy, a 2-oxo-L-gulonsav vagy sói jő kitermeléssel való előállítását lehetővé tevő eljáráshoz jutunk, ha valamely, a Citrobacter genushoz tartozó, 2-oxo-L-gulonsavat termelő mikroorganizmust vagy ennek mutánsait vizes táptalajban tenyésztjük, 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sója jelenlétében. A fermentációt előnyösen

25-35 °C között, különösen 25-30 °C között és

5,5-7,5 pH-tartományban végezzük. Előnyösen alkalmazható- 2,5-dioxo-D-glükonsav-só, a nátrium-2,5 dioxo-D-glükonát és a kalcium-2,5-dioxo-D-glü5 kon át.

A találmány szerinti eljárásban használható mikroorganizmusok tehát a Citrobacter genus 2-oxo-L•gulonsavat termelő törzsei. Számos Citrobacter species ismét, Citrobacter törzsek a köz számára 10 törzsgyűjteményekből, például az ATCC-től hozzáférhetők. Az ATCC-nél például a következő letétbehelyezett törzsek találhatók, amelyek a találmány szerinti eljáráshoz alkalmasak: Citrobacter freundii ATCC 8090, 6750, 8454, 10787, 11102, 11606, 15 11811 és 14135, továbbá Citrobacter diversus ATCC 27026, 27027, 27028 és 27156. Mint az ATCC Katalógus 13. kiadásából kitűnik, több letétbehelyezett Citrobacter freundii és Citrobacter diversus törzset korábban más genushoz vagy specieshez tar2o fezéként osztályoztak. így például a Citrobacter freundii ATCC 6750-t Citrobacter intermedium-ként és Escherichia intermedia ATCC 21073 néven is leírták. A jelen leírásban eltekintünk ezektől a korábbi osztályozásoktól és a mikroorganizmusokat 25 Citrobacter freundii és Citrobacter diversus törzsekként azonosítjuk. A találmány szerinti eljárás a fenti mikroorganizmusok mutánsaival - amelyeket ezekből a mikroorganizmusokból különböző módon, például röntgen-sugárral vagy UV-fénnyel végzett be30 sugárzással, nitrogénmustárral végzett kezeléssel és hasonló módon állíthatunk elő - is megvalósítható. A találmány szerinti eljárás szempontjából a mikroorganizmusok 2-oxo-L-gulonsav-termelő képességét könnyen meghatározhatjuk oly módon, hogy a mikroorganizmust 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy egy sója jelenlétében vizes táptalajban tenyésztjük, a leírás és a példák szerint.

A Citrobacter törzset 2,5-díoxo-D-gIükonsav vagy sója jelenlétében olyan vizes táptalajban tenyésztjük, amely szénforrást - például glükózt, szorbitot, fruktózt, szacharózt, glicerint vagy hasonlókat tartalmaz. Előnyös szénforrás a glükóz, előnyösen glükóz-monohidrát (cerelose) alakjában. A hagyományos fermentációs gyakorlattal összhangban természetesen a táptalaj nitrogén-, kálium-, foszfor- és magnézium-forrást is tartalmaz. A „vizes táptalaj” kifejezést a leírásban és az igénypontokban olyan értelemben használjuk, hogy az a fent felsorolt tápanyagokat tartalmazó táptalajt jelenti, kívánt esetben további tápelem-forrásokkal kiégés átve. A szénforrás általában 0,5-15 g/liter, előnyösen kb. 1-5 g/liter koncentrációban van jelen a táptalajban. A nitrogén gazdaságosan oly módon biztosítható, hogy karbamidot vagy szervetlen nitrogénforrásokat

- például ammóniumszulfátot, ammóniumnitrátot, ammóniumfoszfátot - vagy hasonló sókat alkalmazunk, például 0,1-2 g/liter táptalaj koncentrációban. A kálium, magnézium és foszfor sók

- például káliumfoszfát, ammóniumfoszfát, magnézi umszulfát vagy hasonló sók - adagolásával vihető be, általában 0,1—2 g/liter fermentlé mennyiségben. Az említett tápanyagok koncentrációja nem kritikus és jelentős változtatások lehetségesek a táptalaj összetételében. Más megfelelő összetételű táptalajok megválasztása a szakember számára kézenfekvő és ezért a találmány szerinti eljárást nem korlátozzuk az előbbiekben és a példákban leírt konkrét táptalajok alkalmazására.

A hagyományos fermentációs gyakorlattal összhangban a Citrobacter törzset általában egy olyan vizes inokulum táptalajba visszük be, amely a fent leírt tápanyagokat, és kívánt esetben további tápanyagokat, például élesztőkivonatot vagy peptont tartalmaz. A mikroorganizmust ezután 1—3 napon át, előnyösen 25-35 °C hőmérsékleten, különösen 25-30 °C-on és 5-7,5 pH-tartományban tenyésztjük.

A Citrobacter törzset tartalmazó, kapott inokulum tenyészetet megfelelő mennyiségben, például 1-10% (térf./térf.) arányban bevisszük a vizes táptalajba, amelyet a 2,5-dioxo-D-glükonsav redukciójára alkalmazunk. A 2,5-dioxo-Dglűkonsav jelen lehet a vizes táptalajban, a beoltáskor, vagy előnyösen később, például 8-36 órás tenyésztés után adagolható be. A 2,5-dioxo-D-glükonsav sav alakjában, vagy a szabad sav sójaként, például alkálifém vagy alkáliföldfém sójaként vihető be. Előnyös só a nátrium- és a kalcium-2,5-dioxo-D-glükonát. A 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sói a szakember számára jól ismert fermentációs módszerekkel állíthatók elő (lásd például a 3790444 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). Eljárhatunk úgy, hogy a 2,5-dioxo-D-glükonsavat tartalmazó fermentlé meghatározott mennyiségét adjuk hozzá a

Citrobacter törzset tartalmazó vizes tápoldathoz. Egy másik megoldás szerint a 2,5-dioxo-D-glükonsavat vagy sóját elkülönítjük a fermentléből és így adjuk hozzá a Citrobacter törzset tartalmazó táptalajhoz. A 2,5-dioxo-D-glükonsav kiindulási anyagot előnyösen meghatározott mennyiségű, az Acetobacter cerinus glükóz-tartalmú táptalajban végzett aerob tenyésztésével előállított fermentlével adjuk a táptalajhoz. Az említett aerób tenyésztéssel kapcsolatos eljárást írnak le a 872 095 számú belga szabadalmi leírásban és az 1979. szeptember 28-án benyújtott, 79 665 számú belga szabadalmi bejelentésben. A fermentlé 5-20 (súly/térf.)% 2,5-dioxo-D-glükonsavat agy sóját tartalmazza, és belőle akkora mennyiséget kell hozzáadnunk a Citrobacter táptalajhoz, hogy 1,0-10 (súly/térf.)% kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy glükonsav-só koncentrációt biztosítsunk. Egy másik megoldás szerint elkülönített 2,5-dioxoD-glükonsavat vagy sóját adagolhatjuk, annak érdekében, hogy ezt a 2,5-dioxo-D-glükonsav koncentrációt létrehozzuk a Citrobacter fermentlében. A Citrobacter törzs fermentációját a 2,5-dioxo-D-glükonsavat tartalmazó táptalajban 25-35 °C, előnyösen 25- 30 °C hőmérsékleten végezzük. A fermentáció alatt a közeg pH-ját előnyösen 5,5-7,5 tartományban tartjuk, szükség szerint sav vagy lúg adagolásával. Megfelelő sav például a kénsav és a foszforsav, megfelelő bázis például valamely alkálifémhidroxid, előnyösen nátriumhidroxid vagy valamely alkálifém vagy alkáliföldfém karbonát, például nátriumkarbonát vagy kalciumkarbonát. Ha ilyen sókat adunk a táptalajhoz a pH beállítására, a 2-oxo-L-gulonsavat természetesen a megfelelő fémsó, például nátriumsó vagy kalciumsó vagy ezek keveréke alakjában kapjuk, és ezek a sók is a találmány körébe tartoznak. A fermentáció közben a közeget keverjük, például mechanikus keverővei vagy az edény rázatásával.

Kívánt esetben további mennyiségű 2,5-dioxo-D-glükonsavat vagy sóját adagolhatunk a közeghez a fermentáció közben, miután a Citrobacter freundii felhasználta a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav egy részét. így 2-oxo-L-gulonsavat vagy sóját jobb hozammal állíthatjuk elő.

A fermentációt a 2-oxo-L-gulonsawá való átalakulás befejeződéság folytatjuk. Ha például Citrobacter freundii ATCC 6750-et használunk, a 2,5-dioxoD-glükonsav vagy sója átalakítása lényegében 36-72 óra alatt befejeződik, a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav koncentráció, a fermentációs körülmények és más tényezők függvényében, és a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav súlyára számítva 30%-os kitermeléssel kapjuk a 2-oxo-L-gulonsavat. A fermentációs reakció menetét úgy követhetjük, hogy a szakember számára jól ismert analitikai módszerek alkalmazásával — ideértve a papírkiomatográflát a vékonyrétegkromatográflát, és a nagynyomású folyadékkromatográfiát - meghatározzuk a reakcióelegyben visszamaradó 2,5-dioxo-D-glükonsav és a keletkező 2-oxo-L-gulonsav koncentrációját. A terméknek a 2-oxo-L-gulonsawal való azonosságát ezután úgy igazolhatjuk, hogy a szokásos módszerek alkalmazásával elkülönítjük és jellemezzük azt (lásd például a J.C.S. Chem. Comm. 1979., 740. helyét).

Az előbbiekben leírt fermentáció során képződött 2-oxo-L-gulonsav vagy sója a szakember számára ismert módszerekkel különíthető el és tisztítható. Eljárhatunk például úgy, hogy a fermentlevet szűrjük és a 2-oxo-L-gulonsavat vagy annak nátrium vagy kalcium sóját valamely, a vegyületet nem oldó oldószer, például egy rövidszénláncú alkanol, különösen metanol vagy etanol hozzáadásával kicsapjuk. Alkalmazhatunk más elkülönítési módszereket is, például az oldószert eltávolíthatjuk, például fagyasztva szárítással.

Ha a 2-oxo-L-gulonsavat só alakjában különítjük el, a szabad savat úgy állíthatjuk elő, hogy a sóoldathoz ásványi savat - például kénsavat vagy sósavat — adunk, vagy kationcserélő gyantát alkalmazunk. Ha a 2-oxo-L-gulonsavat szabad savként különítjük el, a megfelelő sókat könnyen előállíthatjuk a szokásos módszerekkel, például egy megfelelő alkálifémhidroxiddal vagy-karbonáttal vagy egy alkálifémkarbonáttal történő reagáltatás útján.

A találmányt a következőkben példák kapcsán mutatjuk be, azonban nem korlátozzuk azt a konkrét kiviteli példákra.

1. példa

Elkészítjük a következő összetételű inokulum

táptalajt (pH= 7,0),
szorbit	3 g/liter
élesztőkivonat	2 g/liter
pepton	2 g/liter
káli um-hidr ogénfoszf át	1 g/liter
magnéziumszulfát
(7 molekula kristályvízzel)	0,2 g/liter

Egy 300 ml-es lombikot - amely 100 ml ilyen inokulum táptalajt tartalmaz - Citrobacter freundii ATCC 6750 sejtekkel oltunk be (egy tápagart tartalmazó kémcsőtenyészetet 10 ml steril vízzel lemosunk és a szuszpenzió 1 ml-ét használjuk fel a beoltáshoz). A sejteket 24 órán át 28 °C hőmérsékleten, körrázógépen tenyésztjük.

100 ml következő összetételű (pH = 6,7) fermentációs táptalajt mérünk be 300 ml-es lombikokba:

glükóz-monohidrát (cerelose) 2 g/liter ammónium-hidrogénfoszfát 1 g/liter kálium-dihidrogénfoszfát 1 g/liter magnéziumszulfát (7 molekula kristályvízzel) 0,5 g/liter répa-melasz 2 g/liter glicin 0,2 g/liter a lombikokat beoltjuk 5 térf./térf.% fent leírt, 24 órás inokulum tenyészettel és 22 órán át körrázógépen rázatjuk, ekkor a pH 5. Az Acetobacter cerinus IFO 3263 törzs glükóz-tartalmú táptalajban 28 °C-on, 50 órán át való tenyésztésével előállítunk egy 15-20% (súly/térf.) nátrium-2,5-dioxo-D-glükonátot tartalmazó fermentlevet, ebből 15 ml-t hozzáadunk a Citrobacter freundii tenyészethez és a pH-t nátriumhidroxid hozzáadásával

6,5-re állítjuk be. A fermentációt 28 “C-on folytat juk, a pH-t 24 óránként 6,5-re állítva be. 52 óra alatt a 2,5-dioxo-glükonát lényegében felhasználódik, ekkor a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonátra számítva kb. 30%-os kitermeléssel kapjuk a nátrium-2 oxo-L-gulonátot.

2. példa

Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg egy kísérlet-sorozatban, a Citrobacter freundii ATCC 6750 törzs helyett ATCC 8090, 8454, 10787, 11102, 11606, 11811 és 14135 tözset és Citrobacte- diversus ATCC 27026, 27027, 27028 és 27156 törzset alkalmazva és igazoljuk a 2-oxo-L-gulonsav képződését.

3. példa

Az 1. példa szerinti inokulum táptalajt Citrobacter freundii ATCC 6750 törzs sejtjeivel (10 ml vizes steril szuszpenzió 1 ml-ével) oltjuk be és a sejteket 20 órán át 28 “C hőmérsékleten tenyésztjük.

1800 ml, az 1. példa szerinti táptalajt bemérünk egy 4 liter térfogatú kelttethető edénybe, beoltjuk a fent leírt, 20 órás inokulum tenyészettel - 5 térf./térf.% mennyiségben - és 8 órán át folytatjuk a tenyésztést 28 “C hőmérsékleten, 1750 ford./perc sebességgel végezve a kevertetést olyan propeller-keverővel, amely 0°C hajlásszögű és a közeg 1 térf./térf./perc arányú levegőztetését biztosítja. 8 órás tenyésztés után hozzáadunk 200 ml fermentlevet, amely 15-20 (súly/térf.)% 2^-dioxo-D-glükoúátot tartalmaz, az 1. példa szerint. A pH-t nátriumhidroxid hozzáadásával 6,5-re állítjuk be és a levegőztetési sebességet 0,3 térf./térf./perc-re csökkentjük. A fermentációt 28 °C-on folytatjuk és a pH-t óránként 6,5-re állítjuk be. 48 órai tenyésztés után a

2,5-dioxo-D-glükonát lényegében felhasználódik, a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonát súlyára számítva 25%-os kitermeléssel kapjuk a nátrium-2-oxo-D-gulonátot.

Szabadalmi igénypontok:

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Eljárás 2-oxo-L-gulonsav vagy sója előállítására, azzal jellemezve, hogy 2-oxo-L-gulonsavat termelő Citrobacter freundii ATCC 6750, (Escherichia intermédia ATCC 21073) 8090, 8454, 10787, 11102, 11606, 11811, 14135, Citrobacter diversus ATCC 27026, 27027, 27028 vagy 27156 mikroorganizmus törzset vizes táptalajban tenyésztünk, 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sója jelenlétében.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 25-dioxo-D-glükonsav sóként nátrium-2,5-dioxo-D-glükonátot alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatostási módja, azzal jellemezve, hogy 2,5-dioxo-D-glükonsav sóként kalcium-2,5-dioxo-D-glükonátot alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 5,5-7,5 pH-η végezzük.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 25-35 °C hőmérsékleten végezzük.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként

Citrobacter freundii ATCC 6750 törzset alkalmazunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként 5 Citrobacter freundii ATCC 10787 törzset alkalmazunk.

A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatja

83.4134 - Zrínyi Nyomda, Budapest