FR3001228A1

FR3001228A1 - Procede d'obtention de transformants stables de microalgues du genre chlorella

Info

Publication number: FR3001228A1
Application number: FR1350636A
Authority: FR
Inventors: Aude Carlier; Remy Michel
Original assignee: ALGENICS
Current assignee: ALGENICS
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2014-07-25
Also published as: EP2956546A1; WO2014114771A1

Abstract

La présente invention concerne notamment un procédé d'obtention d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella ainsi que des vecteurs d'expression et des microalgues du genre Chlorella comprenant lesdits vecteurs d'expression.

Description

PROCEDE D'OBTENTION DE TRANSFORMANTS STABLES DE MICROALGUES DU GENRE CHLORELLA Les potentialités industrielles des microalgues en termes d'applications liées à l'énergie, la santé, la cosmétique, l'alimentation et l'environnement sont particulièrement importantes. En raison notamment des controverses liées aux biocarburants de première génération, des limites technico-économiques qui freinent les biocarburants de deuxième génération, la production de biocarburants à partir de microalgues connait un développement mondial important depuis ces cinq dernières années. Le biogaz est également une autre forme d'énergie qui peut être issue des microalgues. Le domaine de la cosmétique vise à intégrer de plus en plus d'ingrédients naturels, dont les huiles, les pigments issus de microalgues.

L'agro-alimentaire, incorpore également des molécules issues des microalgues, principalement des colorants. Les microalgues offrent également des opportunités intéressantes dans le domaine des compléments alimentaires et de la nutraceutique. Les microalgues sont largement utilisées en alimentation animale, notamment pour la nourriture des alevins des poissons mais aussi pour la nourriture de grossissement.

Les sociétés telles que de biotechnologies ou pharmaceutiques ont également besoin de disposer de systèmes de production de molécules d'intérêt qui répondent à leurs exigences en termes de qualité, de quantité de molécules produites et de rentabilité. Ce secteur est en pleine expansion. Ainsi, depuis la fin des années 1990, plus de 280 protéines recombinantes thérapeutiques ont été commercialisées.

Depuis plusieurs années, les microalgues ont été proposées comme système de production de molécules d'intérêts comme alternative aux systèmes d'expression bactérien, dans les levures, les cellules d'insectes ou encore dans les cellules végétales. Toutefois, il existe de nombreuses contraintes techniques à une telle utilisation dont l'un des points majeurs est l'obtention de transformants stables.

Parmi les différentes microsigues existantes, celles du genre Chlorella sont particulièrement intéressante.s pour les différentes applications industrielles. En effet, les microalgues du genre Chlorella peuvent être cultivées à grande échelle à faible coûts sous différents modes de culture : en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie. Leur culture peut être réalisée dans des fermenteurs classiques déjà présents sur les sites industriels.

Avantageusement, en culture en hétérotrophie, la source carbonée peut être un coproduit d'une filière industrielle. Il faut noter que les microalgues du genre Chlorella font partie des microalgues présentant les meilleures productivités. En outre, la composition de différentes microalgdes algues du genre Chlorella est particulièrement intéressante pour certaines applications industrielles : par exemple leur forte teneur en huile permet de les utiliser avantageusement pour produire des biocarburants, et une forte teneur protéique permet leur utilisation en alimentation animale. De plus, les microalgues du genre Chlorella sont intéressantes pour produire des protéines recombinantes en raison de leurs caractéristiques eucaryotes, notamment leur capacité à réaliser des modifications posttraductionnelles telles que la N-glycosylation.

Toutefois, les données de la littérature (Chow et al. 1999, Rakkhumkaew et al. 2012) montrent une instabilité des transgènes chez les microalgues du genre Chlorella, faisant ainsi obstacle à leur utilisation à l'échelle industrielle comme système d'expression de molécules d'intérêts. L'objectif de la présente invention est donc de pouvoir disposer d'un procédé d'obtention de transformants stables de microalgues du genre Chlorella, permettant ainsi leur utilisation comme système de production de substances d'intérêts au niveau industriel. Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante que la présence d'au moins une séquence d'acides nucléiques endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella dans un vecteur de transformation (notamment un vecteur d'expression), en particulier de deux fragments de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, permet d'obtenir des transformants particulièrement stables de microalgues du genre Chlorella, au moins jusqu'à dix-sept repiquages successifs, après cryopréservation, en présence ou en l'absence d'agent de sélection.

Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella comprenant les étapes suivantes : (i) transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et - une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité, en particulier au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99%, avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10pb à 300kpb ; et (ii) sélection d'un transformant stable. Le procédé selon l'invention présente notamment les avantages suivants : Il permet la production de molécules d'intérêt dans un système particulièrement adapté à l'échelle industrielle : forte productivité, faibles coûts, utilisations de fermenteurs industriels, possibilité de différents modes de culture (en autotrophie, en mixotrophie ou en hétérotrophie), possibilité d'utilisation de coproduit de filière industrielle comme source carbonée en culture en hétérotrophie ; Il permet la production de substances d'intérêt notamment par modification des voies métaboliques par génie génétique. En particulier, le procédé selon l'invention permet ainsi la production d'enzymes impliquées dans le métabolisme des lipides conduisant à la production et à l'accumulation de lipides spécifiques ; Il permet la production de molécules recombinantes dans un système présentant des propriétés eucaryotes ; En effet, les microalgues du genre Chlorella ont la capacité de réaliser des modifications post-traductionnelles telles que la Nglycosylation. En particulier, le procédé selon l'invention permet ainsi la production de protéines glycosylées notamment d'intérêt thérapeutique tels que des anticorps monoclonaux, des protéines d'enveloppes virales, des enzymes lysosomales. Afin de permettre une meilleure compréhension de la présente invention, certaines définitions sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent être interprétés selon leur sens habituel.

On entend par - transformant » au sens de la présente invention, tout organisme, en particulier une microalgue du genre Chlorella, issu d'une transformation génétique. On entend par - transformant stable de microalgue du genre Chlorella » au sens de la présente invention un transformant de microalgue du genre Chlorella dans lequel la présence du vecteur de transformation (en particulier le vecteur d'expression selon l'invention par lequel est transformé ladite microalgue du genre Chlorella dans le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention) et/ou du transgène éventuellement compris dans le vecteur de transformation et/ou de la cassette d'expression éventuellement comprise dans le vecteur de transformation est détectée après au moins 4 repiquages successifs, en particulier au moins 10 repiquages successifs, plus particulièrement au moins 15 repiquages successifs et tout particulièrement au moins 17 repiquages successifs, notamment après culture du transformant après cryopréservation et/ou sans agent de sélection, en particulier en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie. La détection du vecteur de transformation et/ou du transgène peut se faire selon toutes techniques bien connues de l'Homme du Métier, telles que par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») en utilisant des amorces spécifiques du vecteur de transformation et/ou du transgène et/ou de la cassette d'expression. On entend par - vecteur de transformation » au sens de la présente invention, tout vecteur par lequel est transformé un organisme, notamment une microalgue du genre Chlorella. En particulier, le vecteur de transformation est le vecteur d'expression selon l'invention par lequel est transformé ladite microalgue du genre Chlorella dans le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention. On entend par - transgène » au sens de la présente invention, toute molécule d'acide nucléique, en particulier tout gène, destiné à être introduit dans un organisme, en particulier une microalgue du genre Chlorella. En particulier, le transgène est une séquence d'ADN codant une substance d'intérêt et comprise dans la cassette d'expression hétérologue selon l'invention. On entend par - repiquage successif » au sens de la présente invention, le prélèvement d'au moins une microalgue du genre Chlorella d'un milieu de culture initial et la mise en culture de celle-ci dans un milieu de culture identique ou différent du milieu initial. Notamment, les repiquages successifs peuvent être réalisés par le repiquage de la culture dans un milieu frais toutes les 2 à 3 semaines, à la même concentration cellulaire ou à une concentration cellulaire différente, dans le même milieu ou dans un milieu de culture différent du milieu initial. On entend par - microalgue du genre Chlorella » au sens de la présente invention toute microalgue appartenant au genre Chlorella. A titre d'exemple, les microalgues du genre Chlorella peuvent être choisies dans le groupe consistant en Chlorella alternons (Tetrachlore(la), Chlorella angustoellipsoidea, Chlorella anitrata, Chlorella anitrata var. minor, Chlorella antarctica, Chlorella autotrophica, Chlorella autotrophica var. atypica, Chlorella beijerinckii (Parachlorella), Chlorella capsulata, Chlorella conductrix (Brandt) Beijerinck, Chlorella desiccata, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella emersonii var. globosa, Chlorella fusca var. vacuolata, Chlorella hainangensis (Heveochlorella), Chlorella kessleri (Parachlorella), Chlorella lobophora, Chlorella luteoviridis (Heterochlorella), Chlorella marina, Chlorella miniata, Chlorella minutissima, Chlorella mirabilis, Chlorella ovalis, Chlorella parasitica (Brandt) Beijerinck, Chlorella parva, Chlorella pringsheimii (Pseudochlorella), Chlorella protothecoides (auxenochlorel(a), Chlorella protothecoïdes var. communis (auxenochlorel(a), Chlorella pyrenoidosa, Chlorella pyrenoidosa (Pseudochlorella), Chlorella regularis var. minima, Chlorella reisiglii, Chlorella saccharophila, Chlorella saccharophila var. saccharophila, Chlorella saccharophila var. ellispoida, Chlorella satina, Chlorella sorokiniana, Chlorella spaerckii, Chlorella species, Chlorella sphaerica, Chlorella stigmatophora, Chlorella variabilis, Chlorella variegata Beijerinck, Chlorella viscosa, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris fo. Tertia, Chlorella vulgaris fo. Viridis, Chlorella vulgaris Beijerinck, Chlorella xanthella Beijernick, Chlorella zofingiensis, en particulier Chlorella protothecoides et Chlorella sorokiniana, tout particulièrement Chlorella protothecoides. On entend par - transformation du génome nucléaire » au sens de la présente invention toute technique permettant d'introduire des molécules d'acides nucléiques dans le noyau d'un organisme récepteur, en particulier une microalgue du genre Chlorella. A titre d'exemple de techniques permettant la transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella, on peut citer l'électroporation (Maruyama et al., 1994), les techniques utilisant le PEG (polyethylèneglycol) (Jarvis and Brown, 1991), les techniques utilisant Agrobacterium (Cha et al., 2012), la biolistique. Certaines de ces techniques sont illustrées dans les exemples de la présente demande.

En particulier, l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella est mise en oeuvre par biolistique. Lors de l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella, le vecteur d'expression peut être sous forme circulaire ou linéaire. Préalablement à l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de préparation de protoplastes de ladite microalgue du genre Chlorella. Ainsi l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella peut être mise en oeuvre sur des cellules intactes ou sur des protoplastes d'une microalgue du genre Chlorella. L'étape de préparation de protoplastes d'une microalgue du genre Chlorella peut être effectuée selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier telle que celle décrite dans l'article de Lu et al., 2011. L'étape (ii) de sélection d'un transformant stable peut être mise en oeuvre, notamment par la détection de la présence du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression dans le transformant, après au moins 4 repiquages successifs, en particulier au moins 10 repiquages successifs, plus particulièrement au moins 15 repiquages successifs et tout particulièrement au moins 17 repiquages successifs, notamment après culture du transformant après cryopréservation et/ou sans agent de sélection, notamment en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie. La détection de la présence du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression dans le transformant permettant de valider la stabilité du transformant peut se faire selon toutes techniques bien connues de l'Homme du Métier, telles que par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») en utilisant des amorces spécifiques du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression. Cette détection du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression dans le transformant est avantageusement réalisée après chaque repiquage. A titre d'exemple, l'étape (ii) de sélection d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella peut être mise en oeuvre comme ci-après : après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues du genre Chlorella qui se développent sur des géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection. Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture, notamment en condition hétérotrophe, avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome des microalgues transformées. L'intégration des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration sont vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés obtenus pour les microalgues, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et notamment en condition hétérotrophe. Selon un mode de réalisation particulier, la détection de l'intégration des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration peut être vérifiées après cryopréservation : Ainsi, les clones transformés des microalgues du genre Chlorella peuvent être cryopréservés à -80°C ; afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome de la microalgue, des analyses PCR sont réalisées sur des cultures issues de clones cryopréservés pendant au moins 2 mois.

On entend par - vecteur d'expression » au sens de la présente invention, tout vecteur permettant d'exprimer une molécule d'acides nucléiques dans un organisme, en particulier une microalgue du genre Chlorella. Le vecteur d'expression peut être viral tels que les bactériophages ou non viral tels que les plasmides.

On entend par - cassette d'expression » au sens de la présente invention, un fragment d'acides nucléiques, en particulier d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sites de restriction spécifiques, ledit fragment comprenant les séquences nécessaires à l'expression (enhanceur(s), pronnoteur(s), ternninateur(s), séquence de polyadénylation...) d'une séquence d'intérêt. Le fragment et les sites de restriction sont conçus pour assurer une insertion dudit fragment dans un vecteur dans un cadre de lecture approprié pour la transcription et/ou la traduction. En particulier, ledit promoteur de la cassette d'expression n'est pas un promoteur endogène de ladite microalgue du genre Chlorella transformée par le vecteur d'expression selon l'invention. A titre d'exemples de promoteurs utilisables dans le vecteur d'expression selon l'invention, on peut citer le promoteur CaMV35S, le promoteur de l'ubiquitine, le promoteur RBCS2, le promoteur de la nopaline synthase, les promoteurs de virus de chlorelles, en particulier le promoteur CaMV35S et tout particulièrement le promoteur CaMV35S de séquence SEQ ID NO : 1. On entend par - cassette d'expression hétérologue » au sens de la présente invention, une cassette d'expression comprenant une séquence d'acides nucléiques d'intérêt codant une substance d'intérêt, en particulier d'intérêt thérapeutique. La substance d'intérêt peut être un ARN ou un polypeptide d'intérêt en fonction de l'application visée. Une des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant des enzymes par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans des opérations de biopulping, biobleaching ou bioremediation. Les enzymes utilisées peuvent être d'origine hétérologue, e.g. fongique ou bactérienne, ou endogène, conduisant dans ce cas à leur sur-expression dans la microalgue du genre Chlorella transformée. Ces enzymes incluent des oxidoreductases comme les laccases (EC 1.10.3.2) ou peroxydases (EC 1.11.1.7) ayant un large spectre d'action vis-à-vis des composés aromatiques et permettant leur dégradation dans des composés de moindre toxicité. Dans la présente application, la microalgue du genre Chlorella peut être transformée par un vecteur d'expression selon l'invention dans lequel la cassette d'expression hétérologue comprend un gène (séquence d'acides nucléiques d'intérêt) codant une enzyme ou au moins 2 gènes codant des substances d'intérêts ayant une action synergique, par exemple une laccase et une lignine peroxidase (LiP) ou une laccase et une manganese peroxidase (MnP). La microalgue du genre Chlorella ainsi obtenue peut être utilisée avantageusement dans plusieurs applications industrielles. Une première application est la dépollution des effluents industriels contenant des composés aromatiques toxiques comme certains colorants utilisés dans la production du papier, du textile et du plastique, ou les hydrocarbures polycycliques aromatiques (« Polycyclic aromatic hydrocarbons » (PAHs)). La dépollution des eaux usées, en particulier la dégradation des hormones estogéniques comme estrone (El ), 17b-estradiol (E2), estriol (E3) et l'hormone de synthèse 17aethinylestradiol (EE2) peut également être réalisée par des microalgues du genre Chlorella exprimant une laccase et/ou une peroxidase. Une deuxième application desdites microalgues du genre Chlorella est la dépolymérisation des fibres de lignine pour faciliter le blanchiment par des agents chimiques (« enhance bleaching by chemicals such as chlorine ») et diminuer l'énergie nécessaire pour l'obtention de pâte à papier (« paper nnill »). Ces procédés sont connus sous les noms respectifs de biobleaching et biopulping.

Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant comme substances d'intérêts, des protéines chélatrices de métaux par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans des opérations de dépollution des effluents industriels. Les protéines chélatrices peuvent être d'origine hétérologue, e.g. fongique, bactérienne, levurienne, ou endogène, conduisant dans ce cas à leur sur- expression dans la microalgue du genre Chlorella transformée. Ces protéines incluent des protéines riches en cystéine comme les métallothionéines et les phytochélatines. La microalgue du genre Chlorella ainsi obtenue peut être utilisée avantageusement dans la dépollution des effluents industriels contenant des métaux lourds comme le cadmiun, le cuivre, le plomb, le mercure, l'arsenic, le zinc, ou le nickel. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant des enzymes par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans des applications de chimie verte comme la production de briques chimiques élémentaires entrant dans la composition de polymères. Les enzymes utilisées peuvent être d'origine hétérologue, e.g. fongique ou bactérienne, ou endogène, conduisant dans ce cas à leur sur-expression dans la microalgue du genre Chlorella transformée. Dans la présente application, la microalgue du genre Chlorella peut être transformée par un vecteur d'expression selon l'invention dans lequel la cassette d'expression hétérologue comprend un gène (séquence d'acides nucléiques d'intérêt) codant une enzyme utilisant comme substrat un métabolite endogène ou au moins 2 gènes codant des substances d'intérêts ayant une action séquentielle sur ce métabolite. La microalgue du genre Chlorella ainsi obtenue peut être utilisée avantageusement dans plusieurs applications industrielles. Une première application est la production biotechnologique de polyesters biodégradables de type Polyhydroxyalkanoate (PHA). Le poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) est un premier exemple de PHA qui peut être obtenu grâce à des microalgue du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues acétyl-CoA Cacétyltransférase [EC 2.3.1.9], NADPH-dépendante acétoacétyl-CoA réductase [EC 1.1.1.36] et Polyhydroxyalkanoate synthase [EC 2.3.1.-]. Le poly(4-hydroxybutyrate) est un deuxième exemple de PHA qui peut être obtenu grâce à des microalgues du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues succinate semialdéhyde déhydrogénase [EC 1.2.1.76], 4-hydroxybutyrate déhydrogénase [EC 1.1.1.61], 4-hydroxybutyryl-CoA transférase [EC 2.8.3.a] et Polyhydroxyalkanoate synthase [EC 2.3.1.-]. Une deuxième application concernant la production de briques élémentaires entrant dans la composition de polymères est la synthèse de 2-hydroxyisobutyrate (2- HIBA). Le 2-HIBA peut être avantageusement obtenu dans le milieu de culture de microalgue du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues acétyl-CoA C-acétyltransférase [EC 2.3.1.9], NADPH-dépendante acétoacétylCoA réductase [EC 1.1.1.36] et 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase [EC 5.4.99.-]. Une troisième application concernant la production de briques élémentaires entrant dans la composition de polymères est la synthèse d'Isoprène. L'isoprène peut être avantageusement obtenu grâce à des microalgues du genre Chlorella de la présente invention exprimant l'enzyme hétérologue Isoprène synthase [EC 4.2.3.27]. La production d'isoprène peut être améliorée par la surexpression d'enzymes endogènes du métabolisme du méthyl-érythritol phosphate (MEP), e.g. l'enzyme 1-déoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase [EC 2.2.1.7] et l'enzyme 1-déoxy-D-xylulose-5-phosphate réducto-isomérase [EC 1.1.1.267]. Une quatrième application concernant la production de briques élémentaires entrant dans la composition de polymères est la synthèse de 1,3-propanediol (PDO). Le PDO peut être avantageusement obtenu grâce à des microalgues du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues glycérol déhydratase [EC 4.2.1.30] et 1,3-propanediol déhydrogénase [EC 1.1.1.202]. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella enrichies en lipides par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans la production de biodiesel. Dans la présente application, la microalgue du genre Chlorella peut être transformée par un vecteur d'expression selon l'invention dans lequel la cassette d'expression hétérologue comprend un ou plusieurs gènes (séquence(s) d'acides nucléiques d'intérêt) codant des enzymes intervenant dans la voie des lipides et plus particulièrement dans la synthèse de triglycérides. Les enzymes d'origine endogène ou exogène permettant la réalisation de l'application peuvent être sélectionnées parmi la liste suivante : pyruvate déhydrogenase [EC 1.2.4.1], acétyl-CoA carboxylase [EC 6.4.1.2], malonyl-CoA ACP transacylase [EC 2.3.1.39], Fatty acid synthases [EC 2.3.1.-], glycérol-3-phosphate déhydrogenase [EC 1.1.1.8], glycérol-3-phosphate acyl transférase [EC 2.3.1.15], phosphatidic acid phosphatase [EC 3.1.3.4], diacylglycérol 0-acyltransférase [EC 2.3.1.20], phospholipid:diacylglycérol acyltransférase [EC 2.3.1.158].

Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella dont la production de dihydrogène est optimisée par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans la production de biohydrogène comme source d'énergie. La production de dihydrogène par des microalgues du genre Chlorella peut être accrue grâce à la surexpression comme substances d'intérêts d'enzymes d'origine exogène ou endogène comme la ferrédoxine hydrogénase [EC 1.12.7.2] et la pyruvate:ferrédoxine oxidoréductase [EC 1.2.7.1]. Une autre des applications de la présente invention est la modification de microalgues du genre Chlorella ayant une capacité accrue d'assimilation du dioxyde de carbone par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans la captation de dioxyde de carbone d'origine industrielle. L'assimilation de dioxyde de carbone par des microalgues du genre Chlorella peut être accrue grâce à la surexpression comme substance d'intérêt de l'enzyme anhydrase carbonique [EC 4.2.1.1] seule ou accompagnée de la surexpression d'un transporteur de bicarbonate. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella enrichies en lipides ayant des propriétés bénéfiques pour la santé humaine ou animale par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être obtenues par l'expression comme substances d'intérêt d'enzymes endogènes ou exogènes impliquées dans la synthèse de ces lipides. Un premier exemple de lipide d'intérêt biologique est l'acide eicosapentaénoïque (EPA) dont l'accumulation peut être favorisée dans des microalgues du genre Chlorella de la présente invention par l'expression seule ou en association d'enzymes du métabolisme lipidique comme delta 6 désaturase [EC 1.14.19.3], fatty acid elongase 6 [EC 6.2.1.3] et delta 5 désaturase [EC 1.14.19.-]. Un deuxième exemple de lipide d'intérêt biologique est l'acide docosahexaénoïque (DHA) provenant de l'acide eicosapentaénoïque. L'accumulation de DHA peut être favorisée dans des microalgues du genre Chlorella de la présente invention par l'expression seule ou en association comme substances d'intérêt d'enzymes du métabolisme des lipides comme fatty acid elongase 5 [EC 2.3.1.199] et delta 4 désaturase [EC 1.14.-.-]. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella produisant des exopolysaccharides sulfatés ayant des applications cosmétiques par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être obtenues par l'expression comme substances d'intérêt d'enzymes endogènes ou exogènes impliquées dans la sulfatation de polysaccharides comme des sulfotransférases (EC 2.8.2.-]. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant comme substances d'intérêts des allergènes recombinants par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdits allergènes pouvant être utilisés après purification pour le diagnostique ou la désensibilisation de l'allergie. Des exemples d'allergènes pouvant être exprimés de manière native ou modifiée dans les microalgues du genre Chlorella sont des allergènes d'acariens comme Der p 1 et Der p 2, des allergènes d'animaux comme Fel d 1 du chat ou Can f 1 du chien, des allergènes de venins d'hyménoptères comme Api m 1 et Ves v 1, des allergènes de pollens végétaux comme Bet v 2 du bouleau ou Dac g 1 de la graminée Dactyle, des allergènes alimentaires comme Ara h 1 de l'arachide. Les allergènes recombinants produits par la microalgue du genre Chlorella transformée génétiquement par le procédé selon l'invention peuvent être accumulés dans la cellule ou sécrétés dans le milieu de culture lorsqu'ils présentent un peptide signal à leur extrémité amino-terminale. Les allergènes recombinants ainsi produits peuvent être utilisés comme outils de diagnostique permettant de mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre lesdits allergènes. Ces allergènes peuvent également être utilisés pour la désensibilisation de l'allergie par des traitements réalisés par voie injectable sous-cutanée ou voie sublinguale. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant comme substances d'intérêts des protéines recombinantes par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites protéines pouvant être utilisés de manière thérapeutique ou prophylactique chez l'homme ou l'animal. Ainsi, le polypeptide d'intérêt peut être un anticorps, une protéine d'enveloppe virale, une enzyme lysosomale.... Des exemples de protéines recombinantes d'utilisation thérapeutique sont l'insuline pour le traitement du diabète, l'hormone de croissance pour le traitement d'enfants de petite taille ou des anticorps ou fragments d'anticorps comme certolizumab utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ou ranibizumab utilisé dans le traitement de la dégénérescence oraculaire liée à l'âge. Des exemples de protéines recombinantes d'utilisation prophylactique sont l'antigène HBsAg utilisé dans le vaccin contre l'hépatite B ou des protéines de la capside du papillomavirus utilisées dans le vaccin contre le cancer du col de l'utérus. On entend par - séquence d'acides nucléiques stabilisatrice » au sens de la présente invention, toute séquence permettant d'obtenir un transformant stable d'une microalgue du genre Chlorella. Les séquences d'acides nucléiques stabilisatrices peuvent notamment être identifiées par le procédé d'identification de séquences d'acides nucléiques stabilisatrices selon l'invention comprenant les étapes suivantes : (i) obtention d'un transformant par transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et - une séquence d'acides nucléiques endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella ; ladite séquence d'acides nucléiques endogène étant d'une longueur allant de 10pb à 300 kpb ; et (ii) détermination de la stabilité dudit transformant (par exemple par la détection de la présence dudit vecteur d'expression et/ou de ladite cassette d'expression selon l'invention dans le transformant après repiquages successifs, notamment après au moins 4, en particulier au moins 10, plus particulièrement après au moins 15 repiquages successifs et tout particulièrement après au moins 17 repiquages successifs) ; et en particulier (iii) sélection de ladite séquence d'acides nucléiques endogène permettant d'obtenir un transformant stable. On entend par - séquence endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella » au sens de la présente invention, une séquence native du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par opposition aux séquences exogènes du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella. Ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella peut être d'une longueur allant de 10 pb (paires de bases) à 300 kpb (kilos paires de bases), en particulier allant de 10 pb à 150 kpb, plus particulièrement allant de 10 pb 100 kpb, plus particulièrement allant de 10 pb à 50 kpb, plus particulièrement allant de 10 pb à 20 kpb, plus particulièrement allant de 20 pb à 10 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 2 kpb et encore plus particulièrement allant de 100 pb à 1 kpb, encore plus particulièrement allant de 300 pb à 800 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb. Ladite séquence stabilisatrice endogène peut être une séquence codante. On entend par - séquence codante » au sens de la présente invention, toute séquence qui est transcrite en ARN et traduite en protéine. En particulier, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être un gène ou un fragment de gène.

En particulier, la dite séquence stabilisatrice endogène est une séquence codant de l'ARN ri bosornal. En particulier, ladite séquence stabilisatrice endogène est une séquence codant de l'ARN ribosomal choisie dans le groupe consistant en : - la séquence du gène codant l'ARNr 18S ; - la séquence du gène codant l'ARNr 28S ; - la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S ; et - leurs fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; tout particulièrement la séquence du gène codant l'ARNr 18S et ses fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb.

En particulier, ladite séquence stabilisatrice endogène est la seule séquence endogène de ladite microalgue du genre Chlorella comprise dans ledit vecteur d'expression. Ledit vecteur d'expression peut comprendre une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques stabilisatrices.

Ledit vecteur d'expression peut comprendre au moins deux, notamment uniquement deux, séquences d'acides nucléiques stabilisatrices, choisies dans le groupe consistant en : une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella, ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 300 kpb ; et - une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; en particulier les deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices étant des séquences endogènes du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella et plus particulièrement étant les seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression. Lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices, lesdites séquences peuvent être identiques ou différentes, en particulier différentes. Lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices endogènes, lesdites séquences peuvent être du même chromosome, en particulier du même locus et tout particulièrement du même gène et encore plus particulièrement peuvent être des fragments successifs de la séquence d'un même gène.

En particulier, lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices endogènes, lesdites séquences peuvent être des séquences codant de l'ARN ribosomal choisies dans le groupe consistant en : - la séquence du gène codant l'ARNr 18S ; - la séquence du gène codant l'ARNr 28S ; et - la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S ; - leurs fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750pb ; tout particulièrement la séquence du gène codant l'ARNr 18S et ses fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb. En particulier, lesdites séquences stabilisatrices endogènes sont des fragments de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, notamment lesdits fragments étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; tout particulièrement, lesdits fragments étant différents et encore plus particulièrement les fragments correspondant à deux fragments successifs de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, préférentiellement lesdits fragments étant les deux seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lesdites séquences stabilisatrices endogènes sont des fragments de la séquence du gène codant l'ARNr 28S, notamment lesdits fragments étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; tout particulièrement, lesdits fragments étant différents et encore plus particulièrement les fragments correspondant à deux fragments successifs de la séquence du gène codant l'ARNr 28S, préférentiellement lesdits fragments étant les deux seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 12 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 12, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 13, le fragment de séquence SEQ ID NO : 14. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 28S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 42 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 28S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 42, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 43, le fragment de séquence SEQ ID NO : 44. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 45 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S, en particulier de séquence SEQ ID NO° : 45. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être choisie dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 13, la séquence SEQ ID NO : 14, la séquence SEQ ID NO : 43, la séquence SEQ ID NO : 44, la séquence SEQ ID NO : 45, en particulier dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO : 13 et la séquence SEQ ID NO : 14. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 13, la séquence SEQ ID NO : 14, la séquence SEQ ID NO : 43, la séquence SEQ ID NO : 44, la séquence SEQ ID NO : 45, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella protothecoïdes comprises dans ledit vecteur d'expression.

En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella sorokiniana, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 15 ou de séquence SEQ ID NO : 18 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 15 ou de séquence SEQ ID NO : 18, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 16, le fragment de séquence SEQ ID NO : 17, le fragment de séquence SEQ ID NO : 19, le fragment de séquence SEQ ID NO : 20. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella sorokiniana, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 16, la séquence SEQ ID NO : 17, la séquence SEQ ID NO : 19, la séquence SEQ ID NO : 20, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella sorokiniana comprises dans ledit vecteur d'expression.

En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella minutissima, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 21 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 21, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 22, le fragment de séquence SEQ ID NO : 23. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella minutissima, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 22, la séquence SEQ ID NO : 23, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella minutissima comprises dans ledit vecteur d'expression.

En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella zofingiensis, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 24 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 24, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 25, le fragment de séquence SEQ ID NO : 26. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella zofingiensis, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 25, la séquence SEQ ID NO : 26, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella zofingiensis comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella autotrophica, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 27 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 27, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 28, le fragment de séquence SEQ ID NO : 29. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella autotrophica, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 28, la séquence SEQ ID NO : 29, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella autotrophica comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella vulgaris, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 30 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 30, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 31, le fragment de séquence SEQ ID NO : 32. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella vulgaris, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 31, la séquence SEQ ID NO : 32, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella vulgaris comprises dans ledit vecteur d'expression.

En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant la protéine dee8 (protéine de degreening), en particulier de séquence SEQ ID NO : 33 ou un fragment de la séquence du gène codant la protéine dee8, en particulier de séquence SEQ ID NO : 33, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 34, le fragment de séquence SEQ ID NO : 35. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant la glutamine synthétase, en particulier de séquence SEQ ID NO : 36 ou un fragment de la séquence du gène codant la glutamine synthétase, en particulier de séquence SEQ ID NO : 36, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 37, le fragment de séquence SEQ ID NO : 38. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant un transporteur d'ammonium, en particulier de séquence SEQ ID NO : 39 ou un fragment de la séquence du gène codant un transporteur d'ammonium, en particulier de séquence SEQ ID NO : 39, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 40, le fragment de séquence SEQ ID NO : 41. Dans le vecteur d'expression, ladite séquence stabilisatrice peut être localisée en amont ou en aval de la cassette d'expression, en particulier en amont ou en aval de ladite séquence d'acides nucléiques d'intérêt. En particulier, lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrice, lesdites séquences peuvent être localisées de part et d'autre de la cassette d'expression, en particulier de part et d'autre de ladite séquence d'acides nucléiques d'intérêt. Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute leur longueur en utilisant par exemple l'algorithme de Needleman and Wunsch (1970). Cette comparaison de séquences peut être effectuée par exemple à l'aide du logiciel needle en utilisant le paramètre - Gap open » égal à 10.0, le paramètre - Gap Extend » égal à 0.5 et une matrice - Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide, sous la dénomination - Align ». Ledit procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, peut comprendre en outre les étapes suivantes : (iii) isolation dudit transformant stable ; et (iv) culture dudit transformant stable. L'étape (iii) d'isolation dudit transformant stable peut être mis en oeuvre selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier telles que par une sélection clonale sur 40 gélose.

L'étape (iv) de culture dudit transformant peut être mis en oeuvre selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier et adaptée à ladite microalgue, en autotrophie, en hétérotrophie ou encore en mixotrophie. Certaines de ces techniques de culture sont illustrées dans les exemples de la présente demande.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, ledit vecteur d'expression est le vecteur déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP (« Culture Collection of Algae and Protozoa » ; - Collection de culture d'algues et de protozoaires ») sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122. Ce vecteur correspond au plasmide nommé pAlg-CHAst-aphViii dans les exemples. Ce vecteur est notamment composé d'une cassette d'expression comportant la séquence aphVIII codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S (SEQ ID NO : 1) et le terminateur nos (SEQ ID NO : 4), ainsi que les séquences d'acides nucléiques stabilisatrices SEQ ID N : 13 et SEQ ID N : 14 du génome nucléaire de la microalgue du genre Chlorella protothecoïdes. Il possède également une origine de réplication bactérienne ainsi que le gène de résistance à la kanamycine pour la sélection des clones bactériens recombinants. La présente demande concerne également un procédé de production d'une substance d'intérêt comprenant la mise en oeuvre du procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, dans lequel ladite cassette d'expression est une cassette d'expression hétérologue comprenant une séquence d'ADN codant ladite substance d'intérêt. Les modes de réalisation particuliers sont tels que décrits ci-dessus. En particulier, ledit procédé de production d'une substance d'intérêt selon l'invention comprend la culture dudit transformant stable dans des conditions permettant l'expression de la substance d'intérêt. Ledit procédé peut comprendre en outre une étape de récupération de ladite substance d'intérêt, par exemple par purification. La présente demande concerne également un vecteur d'expression déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122. La présente demande concerne également un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant une séquence codant de l'ARN ribosonnal, en particulier la séquence du gène codant l'ARNr 18S ou un fragment de celle-ci. Les modes de réalisation particulier sont tels que décrits ci-dessus.

En particulier, ledit vecteur d'expression selon l'invention peut comprendre : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant SEQ ID NO : 13 ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant SEQ ID NO : 14. Les modes de réalisation particulier sont tels que décrits ci-dessus. Lesdits vecteurs d'expression selon l'invention peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention tels que décrits ci-dessus. La présente demande concerne également une microalgue, en particulier du genre Chlorella, comprenant au moins un vecteur d'expression selon l'invention, en particulier le vecteur déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122. En particulier, la présente demande concerne la microalgue Chlorella protothecoïdes déposée le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront au regard des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif. La Figure 1 représente des vecteurs de transformation des microalgues du genre Chlorella. Le gène de sélection est placé sous le contrôle du promoteur CaMV35S et le terminateur de la nopaline synthase. Les séquences 1 et 2 du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella ont été clonées dans le vecteur pAlg-CHAst. La Figure 2 représente la détection des séquences d'acides nucléiques d'intérêts (transgènes) nptll (Figure 2A), aphVII (Figure 2B) et aphVIII (Figure 2C) dans les microalgues Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoïdes transformées. Les amplifications PCR ont été réalisées sur des cultures liquides de 5 microalgues transformées avec chacune des séquences d'acides nucléiques d'intérêts (transgènes) à l'aide des couples d'amorces AG013/AG084, AN362/363 et AN322/AN323. M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage. La Figure 3 représente la détection de la séquence d'acides nucléiques d'intérêt (transgène) aphVIII dans les microalgues Chlorella protothecoïdes transformées. Les amplifications PCR ont été réalisées sur des cultures liquides de Chlorella transformées après 3, 7, 9 et 14 repiquages successifs en conditions standards de culture, en hétérotrophie, et avec et sans pression de sélection. M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage ; R3, R7, R9, R14 : nombre de repiquage successif ; (+/-) : avec et sans pression de sélection.

La Figure 4 représente les résultats d'amplifications PCR de la séquence d'acides nucléiques d'intérêt (transgène) aphVIII réalisées sur 3 clones transformés de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Les clones transformés ont été cryopréservés sur une période de 2 mois. Les amplifications PCR ont été réalisée sur des cultures ayant subis 4 repiquages successifs réalisés en milieu standard supplémenté en agent de sélection après la sortie de cryopréservation. M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage. La Figure 5 représente un schéma du vecteur pAlg-CHAst-aphVlII sous forme linéaire pour la transformation génétique stable de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Les barres symbolisent les amplifications PCR réalisées sur les microalgues transformées afin de montrer l'intégration du vecteur entier et intègre dans le génome de la microalgue. La Figure 6 représente les résultats d'amplifications PCR réalisées sur 3 clones transformés de la microalgue appartenant au genre Chlorella protothecoïdes (après 14 repiquages successifs en milieu standard supplémentés en agent de sélection). M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T- : témoin tampon ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage ; Amplification 1 : amorces AN322/AN323 ; Amplification 2 ; amorces 367/368 ; amplification 3 : amorces 369/370 ; Amplification 4a : amorces 433/434 ; Amplification 4b : amorces 371/372. La Figure 7 représente les profils des protéines totales glycosylées chez les microalgues du genre Chlorella. Les extraits protéiques des microalgues ont été séparés sur gel SDS-PAGE et transférés sur membrane de nitrocellulose. Les glycoprotéines ont été détectées par affinodétection à l'aide de la lectine concanavaline A couplée à la peroxydase. M : marqueur de taille ; Cp : Chlorella protothecoïdes ; Cv : Chlorella vulgaris ; Cs : Chlorella sorokiniana ; T+ : échantillon de glycoprotéines.

EXEMPLES I. Matériel et Méthodes 1.1 Méthode de culture des microalgues du genre Chlorella en autotrophie Les souches de microalgues du genre Chlorella ont été obtenues auprès des banques UTEX, CCMP, SAG et CCAP. Les microalgues Chlorella sorokiniana (UTEX1663 ; UTEX1230), protothecoïdes (CCAP211/7A ; CCAP211/8D), autotrophica (CCMP243), vulgaris (CCAP211/11B ; SAG280), zofingiensis (CCAP211/14 ; UTEX32), Chlorella minutissima (UTEX2219) ont été rendues axéniques et clonales. Les microalgues du genre Chlorella ont été cultivées à 22°C sous un éclairage continu (280-350 pmol photonsan-2.s-1), dans un milieu de culture composé d'eau du robinet stérilisée par filtration à 0,22pm et enrichie avec le milieu nutritif Conway 1X (supplémenté de tryptone à 0,5g/L ou de KNO3 à 1,5g/L selon les espèces) et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma). Pour des volumes supérieurs à 50m1, spécifiquement de 1 à 300 litres, les cultures ont été aérées avec un mélange air/CO2 2%.

Les microalgues ont également été cultivées sur milieux géloses composés d'eau du robinet stérilisée par filtration à 0,22 [Inn et enrichie avec le milieu nutritif Conway 1X, et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma), supplémentés par 1% d'agarose. La concentration des cultures a été calculée sur cellules de comptage Mallassez (à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder) après fixation des microalgues avec une solution de Lugol. 1.2 Méthode de culture des microalgues du genre Chlorella en hétérotrophie Les microalgues du genre Chlorella capables de croitre sur un milieu supplémenté en source carbonée et en absence de lumière ont été placées dans le milieu de culture standard enrichi par 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à 22°C et à l'obscurité. La culture sur milieu gélose a été réalisée en boite de Pétri par ajout de 1% d'agarose. 1.3 Cryopréservation des microalgues du genre Chlorella Les microalgues ont été cultivées dans le milieu de culture standard jusqu'à la phase stationnaire de croissance. Elles ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 min et reprises dans le milieu de culture à raison de 100 millions de cellules par millilitre avec ajout de cryoprotectants à raison de : 5% Me01-1, 5% DMSO, 9% DMSO, 10% DMSO, selon les souches. Les microalgues cryopréservées ont été conservées à -80°C. 1.4 Préparation des vecteurs pour la transformation génétique de Chlorella Le vecteur pAlg-CHA (Figure 1) de transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, et le terminateur nos du gène de la nopaline synthase. Il a été réalisé par clonage de la séquence promotrice CaMV35S (SEQ ID NO : 1) dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen). La séquence terminateur nos (SEQ ID NO : 4) a été clonée en aval de la séquence promotrice. Les gènes nptll (SEQ ID NO : 6), aphVIII (SEQ ID NO : 5) et aphVII (SEQ ID NO : 7), codant respectivement les enzymes conférant la résistance aux antibiotiques G418, paromomycine et hygromycine, ont été insérés dans la cassette d'expression. Le schéma des vecteurs de transformation est montré sur la Figure 1. Le vecteur pAlg-CHA possède également une origine de réplication bactérienne ainsi que le gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection des clones bactériens recombinants. Le vecteur pAlg-CHAst (Figure 1) permettant la stabilisation de la transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S et le terminateur nos, ainsi que deux séquences d'ADN du génome nucléaire de la microalgue du genre Chlorella.

Les fragments d'ADN du génome nucléaire 1 et 2 de la microalgue du genre Chlorella ont été amplifiés à l'aide d'amorces spécifiques définies suite à une analyse bioinformatique réalisée sur différentes microalgues. Ils ont ensuite été clonés successivement dans le vecteur de transformation. La dernière étape a consisté à cloner la cassette de sélection contenant les gènes de sélection nptll, aphVII et aphVIII, qui codent respectivement des enzymes conférant la résistance aux agents G418, hygromycine et paromomycine. Le vecteur pAlg-CHAst possède également une origine de réplication bactérienne ainsi que le gène de résistance à la kanamycine pour la sélection des clones bactériens recombinants. 1.5 Transformation des microalgues Les microalgues du genre Chlorella ont été transformées par différentes méthodes dont les principales étapes sont décrites ci-dessous. 1.5.1 Transformation des microalgues du genre Chlorella par bombardement de particules La transformation génétique de Chlorella a été réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al., 2001). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance ont été concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose à raison de 108 cellules par gélose. Les microcarriers sont des particules d'or (diamètre 0,6 pm). Ils ont été préparés selon le protocole du fournisseur (BIORAD). La précipitation de l'ADN a été réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20 mM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75 mg de particules d'or par tir. Les disques de rupture utilisés vont de 900 à 1350psi. Le vide est réalisé à 30 Hg.

Les microalgues ont été incubées 24 heures avant repiquage sur géloses supplémentées en agent de sélection. Elles ont ensuite été maintenues à 22°C sous éclairage constant. Après 1 à 2 semaines de culture, les clones potentiellement transformés qui se sont développés ont été repiqués sur des géloses puis en milieux liquides supplémentés en agent de sélection. 1.5.2 Transformation des microalgues du genre Chlorella par la technique d'électroporation La transformation par électroporation consiste à soumettre les microalgues à un champ électrique. Il provoque la formation de pores transitoires dans la membrane plasmique par altération de sa polarité, permettant la pénétration de l'ADN au sein de la cellule afin d'aller s'insérer dans le génome nucléaire. Deux appareils ont été utilisés. Le MicroPulser (Biorad) est un électroporateur permettant d'obtenir une gamme d'intensité des champs électriques de 200V à 3000V (0,5 à 30kVolts/cnn). Le GenePulser MXcell (Biorad) est un électroporateur en plaque 96 puits permettant de faire varier de nombreux paramètres comme le type de pulse (ondes exponentielles ou ondes carrées), la tension, la capacitance ainsi que le temps et le nombre de pulse pour les ondes carrées.

Les cellules en phase exponentielle de croissance ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 minutes, lavées dans 5mL de tampon d'électroporation (tampon KCl 0,08M ; CaCl2 0,01M ; Hepes 0,2M ; Mannitol 0,2M ; Sorbitol 0,2M) puis resuspendues à 108 cellules par mL dans le tampon refroidi à 4°C. L'ADN plasmidique et l'ADN carrier (ADN de thymus de veau ; Sigma) ont respectivement été ajoutés à la concentration finale de 10pg/nnL et 25pg/mL. La solution a été mélangée doucement par pipetage puis incubée 5 à 10 minutes sur glace. Deux cent microlitres de solution contenant les cellules et l'ADN ont été transférés dans chaque cuve d'électroporation et soumis à un 'pulse' d'électroporation (0,5 à 30kVolts/cnn) pendant 1 ms (1 à 3 pulses). Les cuves ont alors été incubées sur glace pendant 5 à 10 minutes puis les cellules ont été resuspendues dans 3mL de milieu de culture sans antibiotique et incubées pendant 24 heures dans les conditions standards de culture. Après 24 heures, les cellules sont centrifugées, lavées avec 1001iL de milieu de culture, et étalées sur milieu sélectif gélosé ou mises en culture en flasque (5mL) en présence d'agent de sélection. 1.5.3 Transformation des microalgues du genre Chlorella par la technique du PEG La perméabilisation des cellules a été réalisée par agitation en présence de PEG (PEG 4000 (20%i, 4000M, Sigma) et PEG 6000 (15%i, 6000M, Sigma)) à différentes concentrations finales (3,5%, 10%,15% et 20%), en présence ou non de billes de verre (0,45-0,52 mm de diamètre, Sigma). La taille des billes, le temps d'agitation, le poids moléculaire du PEG ainsi que sa concentration ont été des paramètres à optimiser pour une transformation efficace de chaque microalgue. Les cellules, en phase exponentielle de croissance ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 minutes. Le culot a été lavé avec du milieu de culture et les cellules resuspendues dans du milieu à 15.106 cellules par mL. Une solution contenant 300mg de billes de verre préalablement autoclavées, 10pg d'ADN vecteur (1pg/pL) et du PEG 4000 ou PEG 6000 à différentes concentrations, a été ajoutée à la suspension cellulaire pour un volume final de 1nnL, dans un tube de centrifugation conique de 1,5mL. La solution a été mélangée brièvement par inversion du tube, agitée à 2400rpnn sur un agitateur 'Signature Pulsing Vortex Mixer' (VWR) à des durées variables (de 30 secondes à 2 minutes). Après décantation des billes de verre, le surnageant a été transféré dans des tubes de culture de 10nnL et les cellules cultivées dans 4mL milieu de culture pendant une nuit sous faible luminosité. Après 24h, les cellules ont été culotées par centrifugation, reprises dans 1001iL de milieu de culture et étalées en totalité sur milieu de sélection gélosé. 1.5.4 Transformation de protoplastes des microalgues du genre Chlorella par la technique du PEG Cent millions de cellules ont été préalablement traitées pour faire des protoplastes. Ces cellules sont centrifugées à 2000g pendant 5 min et lavées dans une solution de milieu contenant 0,6M Sorbitol/Mannitol afin d'éliminer la solution de digestion et les composants de la paroi. Les cellules ont été reprises dans 0,2mL d'une solution 0,6M Sorbitol/Mannitol contenant 50nnM de CaCl2 et transférées dans un tube à centrifugation de 1,5nnL. 10pL d'ADN plasmidique à lpg/pL et 10pL d'ADN de thymus de veau à 2,5pg/pL (Sigma) ont été ajoutés. Après 15 minutes d'incubation à température ambiante, 400pL de solution PNC (20% de PEG, 0,4mL de NaCl et 25mM CaCl2) ont été ajoutés à la suspension cellulaire et le mélange a été agité doucement pendant 30 minutes à température ambiante. 300mg de billes de verre ont été ajoutées après la solution de PNC. La suspension cellulaire a alors été agitée à 2400rpnn sur un agitateur 'Signature Pulsing Vortex Mixer' (VWR) pendant 15 secondes, le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube de 1,5mL, agité doucement pendant 30 minutes, puis 0,6mL de milieu de récupération (milieu de culture supplémenté avec 0,6M de Mannitol/Sorbitol, 1% de glucose, 1% d'extrait de levure et 1% de tryptone) a été ajouté. Les cellules ont été incubées dans le noir pendant 12h à 22°C afin de régénérer leur paroi cellulaire. La totalité des cellules ont ensuite été mises en sélection sur milieu gélosé ou liquide complémenté avec l'agent de sélection approprié. 1.5.5 Transformation des microalgues du genre Chlorella par Agrobacterium tumefaciens La souche bactérienne utilisée est la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens (Invitrogen). Les vecteurs utilisés sont le plasmide pBi121 (GenBank : AF485783.1) et le plasmide pCambia2300 (GenBank : AF234315.1). Agrobacterium tumefaciens est une bactérie qui a naturellement la capacité à transmettre et intégrer une partie de son ADN dans le génome des plantes. Cette particularité biologique a notamment été détournée pour permettre la transformation génétique des plantes. Les vecteurs plasmidiques ont été développés par insertion des séquences spécifiques reconnues par la machinerie biologique de la bactérie de part et d'autre de la séquence à intégrer dans le génome. La bactérie va pouvoir aller intégrer l'ADN d'intérêt dans le génome de la cellule hôte. Le protocole de transformation des microalgues comportent les étapes suivantes : -Transformation des agrobactéries avec les vecteurs d'intérêt et préparation de cultures bactériennes recombinantes -Préparation des cellules de Chlorella en phase exponentielle de croissance -Coculture des agrobactéries avec les microalgues sur milieu gélosé et en milieu liquide -Lavages des cellules de Chlorella et mises en culture sur milieu de sélection. 1.6 Extraction de l'ADN génomique des microalgues du genre Chlorella Les cellules ont été culotées par centrifugation (2150g, 15 minutes, 4°C). Les microalgues ont été incubées une nuit à 4°C dans 4mL de tampon TE-NaCI 1X (Tris-HCl 0,1M, EDTA 0,05M, NaCI 0,1M, pH8). 1% de SDS, Sarkosyl 1% et 0,4mg/mL de protéinase K ont été ensuite ajoutés à l'échantillon, suivi d'une incubation à 40°C pendant 90 minutes. Une première extraction au phénol-chloroforme-isoamylalcool a été effectuée pour extraire une phase aqueuse comprenant les acides nucléiques. Les ARN contenus dans l'échantillon ont été éliminés par une heure d'incubation à 60°C en présence de RNase (1 pg/mL). Une seconde extraction au phénol-chloroforme a été effectuée, suivie d'une précipitation à l'éthanol. Le culot obtenu a été séché à l'air et solubilisé dans 200pL d'eau ultrapure. La quantification de l'ADN a été réalisée par spectrophotométrie (260nm) et analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. 1.7 Analyses par amplification PCR (polymerase chain reaction) Les criblages de clones bactériens recombinants ainsi que les amplifications PCR réalisées sur des ADN purifiés ont été réalisés à l'aide des conditions suivantes. La réaction de PCR a été réalisée dans un volume final de 50pL composé de tampon PCR 1X, 0,2mM de chaque dNTP, 5pM de chaque amorce, 2Ong d'ADN matrice et 1,25U de Taq DNA polymérase (Taq DNA polymerase, Roche). Trente cycles PCR ont été effectués pour l'amplification de l'ADN matrice. La dénaturation initiale a été effectuée à 94°C pendant 5 min. Chaque cycle ultérieur consiste en une étape de dénaturation à 94°C (1 min), une étape d'hybridation des amorces à 55°C (1 min), et une étape d'élongation à 72°C (1 min). Les échantillons obtenus après la réaction de PCR ont été contrôlés sur gel d'agarose (1%) coloré au bromure d'éthidium.

Les criblages par amplification PCR sur colonies des microalgues Chlorella transformées sont réalisés à l'aide du kit - REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit » (Sigma). 1.8 Southern blot L'ADN génomique des microalgues du genre Chlorella sauvage et transformées, est digéré pendant une nuit à 37°C à l'aide de l'enzyme de restriction EcoRl. Les échantillons sont ensuite déposés sur gel d'agarose 0,8% ainsi que le marqueur de taille lambda HindlIl (D9780, Sigma). La migration est réalisée pendant 3 à 4 heures à 130 volts et à 4°C dans une solution de TAE 1X. Les ADN digérés sont contrôlés sous UV à 254nm après marquage au bromure d'éthidium.

Le gel est ensuite incubé deux fois 5 minutes dans une solution de dépurination (0,25M HCl) sous agitation, puis rincé à l'eau UP. Le gel est ensuite incubé dans une solution de dénaturation (0,5M NaOH, 1,5M NaCl) pendant 15 minutes, rincée à l'eau UP, et finalement incubé dans la solution de neutralisation (1M Tris-HCl, 1,5M NaCl, pH7,4), deux fois 15 minutes.

Les acides nucléiques sont transférés par capillarité pendant 4 heures sur une membrane de nylon (RPN303B, GE Healthcare) à l'aide d'une solution de SSC20X. L'ADN est alors fixé de manière covalente par traitement de la membrane aux UV (254nm) pendant 2 minutes.

La membrane est incubée dans la solution de pré-hybridation (SSC6X, 0,1% SDS, solution Denhart's 5X, ADN carrier 100pg/nnL) à 65°C pendant 1 heure, puis elle est placée pendant une nuit en contact avec la solution d'hybridation contenant 10Ong de la sonde marquée préalablement dénaturée pendant 10 minutes à 100°C. Le marquage de la sonde nucléique est réalisé avec le kit BrightStar Psoralen-Biotin (AM1480, Ambion).

La membrane est ensuite lavée pendant 30 minutes à 65°C dans un bain de la solution SSC6X, deux fois 30 minutes dans la solution SSC2X, 0,1% SDS, et 15 minutes dans la solution SSC0,2X, 0,1% SDS. Un rinçage est réalisé dans une solution de TBS 1X pendant 5 minutes et la membrane est saturée dans une solution de TBS, BSA 3% pendant 2 heures. L'hybridation est réalisée à l'aide d'une solution de TBS 1X, 0,05% Tween 20 contenant de la streptavidine couplée à la péroxydase (52438, Sigma) diluée au 1/10000è". Après 6 lavages de 5 minutes dans une solution de TBS 1X, 0,05% Tween 20, et un rinçage dans le TBS 1X, la révélation est réalisée à l'aide d'un kit de révélation ECL (RPN2109, GE Healthcare). 1.9 Détection de l'activité du gène gus Les cellules de la microalgue du genre Chlorella en phase exponentielle de croissance sont récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C) puis lavées avec un tampon PBS. La solution de réaction enzymatique est composée de Na2HPO4 93mM, 68mM NaH2PO4, 10nnM EDTA pH8, Triton X100 0,1%, et X-Gluc à 1nnM. Un volume de 501iL de la solution de réaction est ajouté au culot cellulaire. Les cellules sont reprises et les tubes sont incubés une nuit à 37°C. Les cellules sont ensuite observées en microscopie photonique afin de visualiser la coloration bleue dans les cellules. 1.10 Détection de la protéine fluorescente eGFP L'étude de la localisation cellulaire de la protéine eGFP en microscopie à épi- fluorescence est réalisée sur des cellules de type sauvage et transformées de Chlorella. Les fluorescences de la protéine eGFP et de la chlorophylle sont visualisées à l'aide de filtres d'excitation à 488nm, et des filtres d'émission respectivement de 500-520 et 625- 720nnn. 1.11 Extraction des protéines totales des microalgues du genre Chlorella Les cellules de la microalgue du genre Chlorella en fin de phase exponentielle de croissance ont été récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans le tampon de lyse cellulaire (Tris-HCl 0,15 M pH8, saccharose 15%, SDS 0,5%, PMSF 1nnM, cocktail inhibiteur de la protéase 1% (SIGMA)).

La lyse cellulaire a été réalisée par sonication (amplitude 30%, pulse 2 secondes) pendant 30 minutes à 4°C à l'aide de l'appareil Vibracell 750watt. Les lysats cellulaires obtenus ont été centrifugés (60 minutes, 15000g, 4°C) pour éliminer les débris cellulaires et les surnageants correspondant aux extraits de protéines totales solubles ont été récupérés. 1.12 Détection de la protéine fluorescente eGFP par immunoblotting Les échantillons protéiques des souches de type sauvage et transformées de la microalgue du genre Chlorella sont séparés sur un gel SDS-PAGE 12%. Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare) et colorées au Rouge Ponceau afin de contrôler l'efficacité du transfert. La membrane de nitrocellulose est saturée pendant 2 heures dans une solution de TBS contenant 5% de lait. L'immunodétection est effectuée à l'aide de l'anticorps anti-GFP conjugué à la peroxydase de Raifort (Santa Cruz, sc-9996-HRP) dilué au 1:2000 dans du TBS, 0,05% Tween 20, contenant 1% de lait pendant 2 heures à température ambiante. La membrane est ensuite lavée avec du TBS-Tween 0,05% (6 fois 5 minutes à température ambiante) suivi d'un lavage final avec le TBS (5 minutes à température ambiante). La détection est effectuée par la méthode de chimiluminescence (RPN2109, GE Healthcare). 1.13 Détection des anticorps monoclonaux par immunoblotting Les surnageants de culture des souches de type sauvage et transformées de la microalgue du genre Chlorella sont déposés sur un gel SDS-PAGE 12%. Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare) et colorées au Rouge Ponceau afin de contrôler l'efficacité du transfert. La membrane de nitrocellulose est saturée pendant 2 heures dans une solution de TBS contenant 5% de lait.

L'immunodétection est effectuée à l'aide de l'anticorps anti-human IgG conjugué à la peroxydase de Raifort (Sigma, A6029-HRP) dilué au 1:2000 dans du TBS, 0,05% Tween 20, contenant 1% de lait pendant 2 heures à température ambiante. La membrane estensuite lavée avec du TBS-Tween 0,05% (6 fois 5 minutes à température ambiante) suivi d'un lavage final avec le TBS (5 minutes à température ambiante). La détection est effectuée par la méthode de chimiluminescence (RPN2109, GE Healthcare). 1.14 Détection des glycoprotéines l'aide de la lectine Concanavaline A Les échantillons protéiques des microalgues du genre Chlorella ont été séparés sur un gel SDS-PAGE 12%. Les protéines séparées ont été transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare) et colorées au Rouge Ponceau afin de contrôler l'efficacité du transfert. La membrane de nitrocellulose a été saturée pendant 5 minutes dans une solution de TBS Tween20 2%. L'affinodétection a été effectuée à l'aide de la lectine Concanavaline A conjugué à la peroxydase de Raifort (Sigma, L6397) dilué au 1:2000 dans du TBS, 0,05% Tween 20, 1nnM CaCl2, 1nnM MgCl2, 1nnM MnCl2, pendant 2 heures à température ambiante. La membrane a été lavée avec du TBS-Tween 0,05% (6 fois 5 minutes à température ambiante), suivi d'un lavage final avec le TBS (5 minutes à température ambiante). La détection a été effectuée par la méthode de chimiluminescence (RPN2109, GE Healthcare). 1.15 Listage des amorces spécifiques des fragments 1 et 2 des ADN génomiques des microalgues Chlorella - Table 1 Microalgue Gène Fragment 1 Fragment 2 Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) ARNr 185 AN336 : AN338 : 5'-AAGAATTCAACCTGGTTGATCCTGCC-3' 5'-AACTCGAGTTCATTCAATGACACCACC-3' AN337 : AN339 : 5'- 5'-TTGGATCCTTGATCCTTCTGCAGGTTC-3' TTGGATCCCTCGAGACAGCAAAGCCCAGGAGC3' Chlorella sorokinianaARNr (UTEX 1663) 185 AV53 : AV55 : 5'-AAGAATTCAACTGCTTTATACTGTG-3' 5'-AACTCGAGAACTTACCAGGTCCAGAC-3' AV54 : 5'- AV56 : TTGGATCCCTCGAGACTGCAGCAACTTAAATA-3' 5'-TTGGATCCTCTCCTTCTCTAGGTGG-3' Chlorella sorokinianaARNr (UTEX 1230) 185 AV57 : AV59 : 5'-AAGAATTCCCATGCATGTCTAAGTAT-3' 5'-AACTCGAGGGGATCGGCGGATGTTTC-3' AV58 : AV60 : 5'- 5'-TTGGATCCGGTGGGAGGGTTTAATG-3' TTGGATCCCTCGAGAACAGCGCCGACTCCGAG3' Chlorella ARNr 185 AV61 : AV63 : minutissima (UTEX 5'-AAGAATTCGACTCTGGCCTATCTTG-3' 5'-AACTCGAGGGGAAAACTTACCAGGTC-3' 2219) AV62 : 5'- AV64 : TTGGATCCCTCGAGAATAAAGAAAGCACTTAG-3' 5'-TTGGATCCTCTCTAGGTGGGAGGGTT-3' Chlorella ARNr 185 AV65 : AV67 : zofingiensis (CCAP 5'-AAGAATTCGCATGTCTAAGTATAAAC-3' 5'-AACTCGAGAGGCTGAAACTTAAAGG-3' 211/51) AV66 : AV68 : 5'-TTGGATCCCTCGAGGTGCACACCGAAACGGC- 3' 5'-TTGGATCCCTTCCTCTAGGTGGGAGG-3` Chlorella autotrophica (CCMP243) ARNr 185 AV69 : AV71 : 5'-AAGAATTCTATATAAACTGCTTTATAC-3' 5'-AACTCGAGTGCCGACTAGGGATCGGC-3' AV70 : 5'- AV72 : TTGGATCCCTCGAGTTTACTCAAAGTAACAGC-3' 5'-TTGGATCCGGAGGTTATGAACTTCTC-3' Chlorella vulgarisARNr 185 AV73 : AV75 : (5AG280) 5'-AAGAATTCTTGTATAAACTGCTTTATAC-3' 5'-AACTCGAGGAAATCAAAGTTTTTGGG-3' AV74 : AV76 : 5'-TTGGATCCCTCGAGAGCCCGTCCCCGGCAAC- 3' 5'-TTGGATCCGGGGTTTAATGAACTTC-3' Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) ARNr 285 AV77 : AV79 : 5'-AAGAATTCTAACGGCGAGCGAACCG-3' 5'-AACTCGAGCTAAGGCGCCCAACTGCG-3' AV78 : 5'- AV80 : TTGGATCCCTCGAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3' 5'-TTGGATCCATTTTGCCGAC-3' Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) Protéine de degreenfng Dee 8 AV81 : AV83 : 5'-AAGAATTCAGGTCAGCTCAACTGCC-3' 5'-AACTCGAGGGGAGGACCACAGGTGTATC3' AV82 : AV84 : 5'- 5'-TTGGATCCTCAGGGTTTGCACTGG-3' TTGGATCCCTCGAGGCTCACGGTATCAACAAGG- 3' Chlorella protothecoïdes (GCAP211/8D) Glutamine synthétase AV85 : AV87 : 5'-AAGAATTCAACCGGTTCAAGGACC-3' 5'-AACTCGAGACGGTGCTGGACGCGCG-3' AV86 : AV88 : 5'-TTGTCGACCTCGAGAACCGTCGTAGTTCCAG- 3' 5'-TTGTCGACTAGAGCAGCCGCGGTTGG-3' Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) Ammonium transporteu r AV89 : AV91 : 5'-AAGAATTCACACGGACATCAATGCC-3' 5'-AACTCGAGACACCACCGTGGCCGCC-3' AV90 : 5'- AV92 : TTGGATCCCTCGAGTGGGCGACCTGGCTCGG-3' 5'-TTGGATCCGTCACCTCATGCGGGTAG-3' II. Résultats 11.1 Exemple 1 : Transformation des microalgues du genre Chlorella 11.1.1 Culture des microalgues Les microalgues Chlorella sorokiniana (UTEX1663) et Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) ont été cultivées dans un milieu composé d'eau du robinet supplémenté par une solution nutritive de Conway 1X et de tryptone à 0,5g/L, ou de KNO3 à 1,5g/L selon la microalgue. Le dénombrement cellulaire a été réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.1.2 Réalisation des vecteurs d'expression pALG-CHA Le vecteur pAlg-CHA de transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S du virus de la mosaïque du chou-fleur et le ternninateur nos du gène de la nopaline synthase (Figure 1). La séquence promotrice CaMV35 (SEQ ID NO : 1) et la séquence Tnos (SEQ ID NO : 4), ont été amplifiées à partir d'un vecteur de synthèse respectivement à l'aides des couples d'amorces AV35 (5' -AAGAATTCCATGGAGTCAAAGATTC -3' ) / AV36 (5'- TTGAATTCGTCCCCCGTGTTCTCTC-3') et AV38 (5'-AAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTC-3') / AV39 (5'-TTTCATGACCGATCTAGTAACATAG-3'). Ces amorces ont également permis d'insérer le site EcoRI en 5' et en 3' du promoteur, et les sites Sacl et BspHI, en 5' et en 3' du ternninateur. Chacune des séquences a ensuite été clonée dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen). La séquence codante nptll (SEQ. ID NO : 6) du gène de résistance au G418 a été amplifiée à partir du vecteur pCR2.1 (Invitrogen) à l'aides des amorces AV43 (5'- AAG GATCCATGATTGAACAAGATG G -3' ) et AV44 (5' -TTGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCAAG -3' ) permettant d'insérer les sites de restrictions BamHI en 5' et Sacl en 3'. La séquence a ensuite été clonée dans le vecteur de transformation de Chlorella pAlg-CHA-nptll entre les séquences régulatrices CaMV35S et le ternninateur nos. La séquence codante aphVII (SEQ. ID NO : 7) a été amplifiée à partir du vecteur pChlamy (Invitrogen) à l'aide des amorces spécifiques AV45 (5'- AAGGATCCATGACACAAGAATCCCTG-3') et AV46 (5'-TTGGATCCTTATCAGGCGCCGGGGG-3') qui ont permis d'insérer le site de coupure pour l'enzyme de restriction BamHI en 5' et en 3' de la séquence. Elle a ensuite été clonée dans le vecteur de transformation de Chlorella pAlg-CHA-aphVII entre les séquences régulatrices CaMV35S et le ternninateur nos.

La séquence codante aphVIII (SEQ. ID NO : 5), a été amplifiée à partir d'un vecteur de synthèse à l'aide des amorces spécifiques AV41 (5'-AAGGATCCATGGACGATGCGTTGCG3') et AV42 (5'-TTGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCCAAC-3)' qui ont permis d'insérer les sites de coupure pour les enzymes BamHI en 5' et Sacl en 3'de la séquence. Cette séquence a ensuite été clonée dans le vecteur de transformation de Chlorella pAlg-CHA-aphVill entre les séquences régulatrices CaMV35S et le ternninateur nos. 11.1.3 Transformation génétique de la microalgue Chlorella Les microalgues Chlorella ont été transformées par la technique de bombardement de particules et par la technique d'électroporation, par PEG, par Agrobacterium tumefaciens, sur cellules intactes et protoplastes (Lu et al., 2011).

La transformation génétique des microalgues Chlorella a été réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al., 2001). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance ont été concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN a été réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation a été réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. La transformation génétique des microalgues Chlorella a également été réalisée par électroporation à l'aide de deux appareils, le MicroPulser (Biorad) et le GenePulser MXcell (Biorad). Les microalgues en phase exponentielle de croissance ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 minutes, lavées dans 5mL de tampon d'électroporation (tampon KCl 0,08M ; CaCl2 0,01M ; Hepes 0,2M ; Mannitol 0,2M ; Sorbitol 0,2M) puis resuspendues à 108 cellules par mL dans du tampon refroidi à 4°C. Elles ont ensuite été placées dans des cuvettes possédant des gap de 1 à 4mm, et dans une plaque 96 puits. Les vecteurs pAlg-CHA-nptll, pAlg-CHA-aphVii, pAlg-CHA-aphVIII ainsi que l'ADN carriers ont été ajouté respectivement à 10pg/nnL et 25pg/mL finale. Les microalgues en solution ont ensuite été soumises à des pulses électriques de 1nns, allant jusqu'à 25 18kVolts/cnn. La microalgue Chlorella sorokiniana a été transformée à l'aide du vecteur pAlg-CHAnptll, et Chlorella protothecoïdes à l'aide des vecteurs pAlg-CHA-aphVii et pAlg-CHAaphVIII. Les microalgues qui ont subis la transformation par bombardement de particules et 30 par électroporation ont été incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de G418, 50nng/L de paromomycine ou, 400mg/L d'hygromycine. 35 11.1.4 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella sorokiniana et protothecoïdes qui se sont développés sur les géloses de sélection ont été repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de G418, 50nng/L de paromomycine ou 400mg/L d'hygronnycine). Les clones ont ensuite été repiqués tous les 15 jours sur géloses supplémentées en agent de sélection. 11.1.5 Détection des transgènes chez la microalgue Chlorella Les transformants obtenus sur les géloses de sélection ont été repiqués dans des milieux de culture avec agent de sélection et cultivés dans les conditions standards de culture. Les analyses ont été réalisées sur les clones de Chlorella qui se sont développés après 1, 2, 3 et 4 repiquages successifs. L'insertion des séquences hétérologues nptll, aphVII, et aphVIII de résistance aux 10 agents de sélection, G418, hygromycine et paromomycine dans le génome des microalgues Chlorella a été vérifiée par des analyses PCR. La Figure 2 montre les résultats de criblage par amplification PCR de séquences spécifiques des gènes nptll, aphVII, et aphVIII obtenus pour les clones transformés de Chlorella. Les amplifications réalisées sur les tubes témoins ainsi que sur les souches non 15 transformées sont négatives. Les amplifications PCR réalisées sur les vecteurs pAlg-CHA- nptll, pAlg-CHA-aphVII et pAlg-CHA-aphViii, ont données respectivement des bandes aux tailles attendues de 311pb, 480pb et 405pb. La présence du transgène nptll dans les microalgues Chlorella sorokiniana transformées a été vérifiée à l'aide des amorces AG013 (5' -TAGCCGGATCAAGCGTATGCAG- 20 3') et AG084 (5' -ACAGACAATCGGCTGCTCTGATG-3'). Les clones obtenus présentent une amplification à la taille attendue de 311pb (Figure 2A). Ce résultat, confirmé sur les clones après 2 à 3 repiquages sur milieux frais supplémentés en agent de sélection, a validé l'insertion du transgène dans le génome de Chlorella sorokiniana. La présence des transgènes aphVII et aphVIII dans les microalgues Chlorella 25 protothecoïdes transformées a respectivement été vérifiée à l'aide des couples d'amorces AN362/AN363 (5' -ATTGATTCGGATGATTCC-3' / 5' -ATCCGGCTCATCACCAG-3') et AN322/AN323 (5' -TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3' / 5' -AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3'). Les clones obtenus présentent une amplification à la taille attendue de 480pb pour aphVII et 405pb pour aphVIII (Figure 2B et 2C). La détection des transgènes dans les microalgues a 30 été réalisée après 2 à 3 repiquages successifs sur des milieux frais supplémentés en agents de sélection ce qui a validé l'insertion des transgènes dans le génome de la microalgue. Le suivi des transformants a été réalisé par détection des transgènes nptll, aphVII et aphVIII par des amplifications PCR réalisées sur les clones transformés après des repiquages successifs des cultures. La détection des transgènes s'est révélée négative pour tous les 35 clones transformés après 3 à 4 repiquages successifs. Les analyses ont été répétées sur un plus grand nombre de clones obtenus après transformation de la microalgue Chlorella à l'aide des gènes nptll, aphVII et aphVIII. Les amplifications PCR réalisés sur des cultures issues de clones transformés donnent des résultats négatifs quelques soit le transgène, après 3 à 4 repiquages successifs. La 40 détection des transgènes n'a plu été possible pour les quelques microalgues qui ont conservé la capacité à croitre en présence de l'agent de sélection. 11.1.6 Conclusion La transformation génétique des microalgues Chlorella sorokinana et Chlorella protothecoïdes par les gènes de résistance nptll, aphVII et aphVIII a permis d'obtenir des clones transformés dans lesquels nous avons pu démontrer la présence du transgène.

La détection des transgènes dans le génome des microalgues a été confirmée sur 2 à 3 repiquages successifs sur les milieux de sélection. Contrairement à certains clones qui ont conservés la capacité à croitre sur agent de sélection au cours des repiquages, nous avons noté une perte de la croissance sur les milieux de sélection de la majorité des clones transformés de Chlorella.

Les analyses PCR réalisées au cours des générations successives sur les clones transformés, ont démontré la perte de la détection des transgènes dans les cultures de toutes les microalgues, quelques soit l'agent de sélection utilisé. La transformation génétique de Chlorella a été réalisée à l'aide des technologies de transformation suivantes : bombardement de particules, électroporation, PEG, Agrobacterium tumefaciens, sur cellules intactes et protoplastes. La détection de transformants a été validée pour chacune des techniques de transformation. En revanche, la détection des transgènes a été perdue dans tous les cas après 3 à 4 repiquages successifs des transformants sur milieu de sélection. La détection des transgènes dans les microalgues transformées sur plusieurs repiquages successifs a permis de démontrer une intégration du transgène dans le génome de Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoïdes. Les travaux réalisés ont également permis de mettre en évidence un problème de stabilité de l'intégration de transgène dans les microalgues du genre Chlorella. 11.2 Exemple 2 : Transformation stable des microalgues du Genre Chlorella 11.2.1 Culture des microalgues La microalgue Chlorella protothecoïdes (CCAP211 /8D) a été cultivée dans un milieu composé d'eau du robinet supplémenté par une solution nutritive de Conway 1X et par de la tryptone à 0,5g/L. Les cultures ont été placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie a été réalisée dans le milieu standard auquel ont été ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à l'obscurité et à 22°C. Le dénombrement cellulaire a été réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.2.2 Réalisation du vecteur d'expression pALG-CHAst-aphVIII Le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII de transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence aphVIII codant pour l'agent de sélection paromomycine, placée sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S du virus de la mosaïque du chou fleur et le terminateur nos du gène de la nopaline synthase (Figure 1). Deux séquences d'ADN génomique de Chlorella protothécoïdes ont été clonées dans le vecteur. Les séquences d'ADN génomique 1 et 2 correspondent à deux fragments de 750 pb de l'ARNr 18S. Les amorces AN58 (5'-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3') et AN59 (5'- GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3') permettant d'amplifier la séquence ARNr 18S de Chlorella protothecoïdes ont été définies après une analyse bioinformatique des séquences disponibles dans les banques de données. Une fois séquencée, nous avons pu définir les amorces permettant d'amplifier les deux fragments d'intérêt.

Les deux séquences ont été amplifiées sur l'ADN génomique de la microalgue Chlorella protothecoïdes à l'aide des amorces AN336/AN337 (5'- AAGAATTCAACCTG GTTGATCCTG CC -3' / 5' -TTG GATCCCTCGAGACAG CAAAG CCCAG GAG C-3 ' ) et AN338/AN339 (5' -AACTCGAGTTCATTCAATGACACCACC -3 ' / 5'- TTGGATCCTTGATCCTTCTGCAGGTTC-3').

Le fragment 1 a été cloné à l'aide des sites EcoRI et BamHI insérés par PCR, dans le vecteur pAlg-CHAst. Ce vecteur est issu du vecteur commercial pCambia2300 dans lequel la cassette de sélection des transformants p35S-nptll-T35S a été éliminée par digestion par l'enzyme Asel. Le site Xhol a également été inséré en 3' de la séquence, en amont du site BamHI, afin de réaliser la suite des clonages. Le fragment d'ADN génomique 2 a également été cloné dans le vecteur pAlg-CHAst à l'aide des sites Xhol et BamHI insérés au cours de la PCR. La cassette de sélection CaMV35S-aphViii-Tnos a été amplifiée par PCR à partir du vecteur pAlg-CHA-aphVIII pour être finalement clonée dans le vecteur pAlg-CHAst en Xhol après insertion des sites en 5' et en 3'à l'aide des amorces AV37 (5'- AACTCGAGCATGGAGTCAAAGATTC-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3' ). La figure 1 schématise la carte du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII. 11.2.3 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique de la microalgue Chlorella protothecoïdes a été réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance ont été concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20° C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN a été réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation a été réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. La microalgue Chlorella protothecoïdes a été transformée à l'aide du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII sous forme circulaire et sous forme linéaire (digestion par Nhel).

Les microalgues qui ont subis la transformation par bombardement de particules ont été incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.2.4 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella protothecoïdes qui se sont développés sur les géloses de sélection ont été repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones ont ensuite été repiqués tous les 10 à 15 jours sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils ont également été placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones ont à la fois été repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones ont été placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes a été réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.2.5 Stabilité de la détection des transgènes chez la microalgue Chlorella L'intégration du transgène dans le génome de la microalgue Chlorella et la stabilité de l'intégration ont été vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés de la microalgue, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et en condition hétérotrophe. 11.2.6 Insertion stable du transgène dans le génome de Chlorella Les microalgues Chlorella ont été repiquées 17 fois successivement dans le milieu de culture standard en présence ou absence de l'antibiotique de sélection paromomycine. L'entretien des clones transformés analysés ici représente 8 mois de culture. Les microalgues Chlorella transformées ont également été placées en culture en condition d'hétérotrophie par ajout de glucose dans le milieu de culture à raison de 10g/L, sur une période de 3 mois, en présence et en absence d'agent de sélection.

La stabilité de la détection du transgène dans le génome des chlorelles transformées à été vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces AN322 (5'- TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifique de la séquence codante aphVIII (figure 3). Les amplifications PCR réalisées sur les clones transformées après 3, 9 et 14 repiquages successifs, avec et sans agent de sélection, montrent une détection constante à 405pb correspondant au transgène. La détection des transgènes a été validée sur des cultures après 17 repiquages successifs (Données non montrées). Ces résultats démontrent la stabilité de l'intégration du transgène dans le génome de la microalgue d'intérêt industriel Chlorella protothecoïdes. 11.2.7 Stabilité de la détection des transgènes après cryopréservation des microalgues transformées Les clones transformés de la microalgue Chlorella protothecoïdes ont été cryopréservés à -80°C. Afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes dans le génome de la microalgue, des analyses PCR ont été réalisées sur des cultures après 4 repiquages successifs, issues des clones cryopréservés pendant 2 mois. La figure 4 montre la détection du transgène dans tous les clones analysés démontrant ainsi la stabilité de l'intégration des transgènes après un passage en cryoconservation. 11.2.8 Insertion stable de la totalité du vecteur de manière aléatoire dans le génome de Chlorella L'insertion stable du vecteur pALG-CHAst-aphVIII a été vérifiée dans les microalgues Chlorella transformées et régulièrement repiquées dans le milieu de culture standard en présence l'antibiotique de sélection paromomycine. La détection du gène de sélection et du reste du vecteur dans le génome des chlorelles transformées a été réalisée par amplification PCR à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques de la séquence du vecteur. La figure 5 schématise les amplifications PCR réalisées sur l'ensemble du vecteur de transformation pAlg-CHAst-aphVIII. L'amplification 1 correspond à la mise en évidence de la présence du transgène aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR réalisées à l'aide des amorces AN322 (5'- TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifiques du transgène aphVIII sont représentées sur la figure 6. Les amplifications obtenues pour les 3 clones de la microalgue Chlorella transformées avec le vecteur pAlg-CHAst-aphVill ont permis d'obtenir une bande à la taille attendue de 405pb, visible également pour l'amplification réalisée sur le vecteur témoin. Aucune amplification n'a été obtenue pour la microalgue non transformée. Ce résultat montre que les microalgues ont bien incorporé le transgène aphVIII qui confère la résistance à la paromomycine. Les amplifications 2 et 3 correspondent à la mise en évidence de la présence des séquences de deux gènes présents dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR réalisées à l'aide des couples d'amorces AN367 (5'- AACGCATGAAGGTTATCG-3') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC-3') et AN369 (5'- ACAAAGATGTTGCTGTCTCC -3' ) / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC -3' ) respectivement spécifiques des gènes 1 et 2 présents sur le vecteur pAlg-CHAst-aphViii et de part et d'autre du transgène aphVIII, sont représentées sur la figure 6. Les amplifications réalisées sur les microalgues non transformées n'ont pas donné de résultat. Pour les 3 clones de la microalgue Chlorella transformées, des amplifications aux tailles attendues, respectivement 292 et 497pb, ont été obtenues, visibles également pour les amplifications réalisées sur le vecteur pAlg-CHAst-aphViii. Ce résultat montre que les microalgues ont bien incorporé de manière stable l'ensemble du vecteur de transformation.

Les amplifications 4a et 4b correspondent à la mise en évidence de la présence de la cassette de sélection entre les fragments 1 et 2 dans le vecteur de transformation dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR réalisées à l'aide des couples d'amorces AN433 (5'- TTTAATGTACTGAATTAACG -3' ) / AN434 (5' -TAATAATTAACATGTAATGC-3') et AN371 (5' - TCACAACCGGGATACCGACC-3') / AN372 (5' -ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3' ) permettent respectivement d'amplifier les parties 5' et 3' de la cassette d'expression aphVIII du vecteurs pAlg-CHAst-aphVIII, en englobant les séquences 1 et 2 du génome de Chlorella (Figure 5). Les résultats obtenus, présentés sur la figure 6, montrent qu'aucune amplification n'a été obtenue pour les microalgues non transformées. En revanche, pour les 3 clones de la microalgue Chlorella transformées, des amplifications aux tailles attendues, respectivement 1103 et 1519pb, ont été obtenues, visible également pour les amplifications réalisées sur le vecteur témoin. Ce résultat montre que la cassette d'expression aphVIII s'est insérée aléatoirement dans le génome de la microalgue.

De plus, ce résultat, couplé à ceux obtenus précédemment, montrent que les microalgues ont bien incorporé de manière stable et aléatoire l'ensemble du vecteur pAlgCHAst-aphVIII de manière intègre. Ces résultats, validés sur les clones transformés à l'aide de l'ADN plasmidique sous forme circulaire et linéaire, confirment que l'intégration dans le génome a été réalisée de manière aléatoire. 11.2.8 Conclusion La transformation génétique de la microalgue Chlorella protothecoïdes à l'aide du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII a permis d'obtenir des lignées transformées de la microalgue. La détection du transgène réalisée sur des cultures après 17 repiquages successifs, des cultures avec et sans agent de sélection, des cultures placées en autotrophie et hétérotrophie, et dans des cultures qui ont subis la cryopréservation, valide que l'intégration du transgène est stable. La détection par amplification PCR des différentes parties du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII dans le génome des microalgues transformées a montré que l'insertion dans le génome avait eu lieu par insertion aléatoire.

Contrairement aux résultats de transformation obtenus dans l'exemple 1 qui montraient une instabilité de l'intégration des transgènes, l'utilisation des séquences génomiques ARNr 18S dans le vecteur de transformation a permis de stabiliser l'intégration aléatoire des transgènes dans le génome de la microalgue du genre Chlorella. Ainsi nous avons mis au point une méthode qui a permis de lever le verrou biologie identifié dans l'exemple 1, et qui permet de transformer de manière stable les microalgues du genre Chlorella par insertion aléatoire du transgène. 11.3 Exemple 3 : transformation génétique stable des microalgues du genre Chlorella 11.3.1 Les souches de Chlorella Les microalgues sont Chlorella sorokianiana (UTEX1663, UTEX1230), Chlorella vulgaris (CCAP211/11B, SAG280), Chlorella autotrophica CCMP243, Chlorella protothecoïdes (CCAP211/7A, CCAP211/8D), Chlorella zofingiensis (CCAP211/14 ; UTEX32), et Chlorella minutissima (UTEX2219). 11.3.2 Culture des microalgues Les microalgues Chlorella sont cultivées dans un milieu composé d'eau du robinet supplémenté par une solution nutritive de Conway 1X, de tryptone à 0,5g/L ou de KNO3 à 1,5g/L selon la microalgue, et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma). Les cultures sont placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie est réalisée dans le milieu standard auquel sont ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures sont placées à 22°C à l'obscurité.

Le dénombrement cellulaire est réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.3.3 Réalisation des vecteurs d'expression La base du vecteur utilisé pour la transformation génétique des microalgues Chlorella est le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII utilisé dans l'exemple 2. Les séquences ARNr 18S de chacune des microalgues ont été amplifiées à l'aides des amorces AN58 (ACCTGGTTGATCCTGCCAGT) et AN59 (GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC). Une fois séquencée, les amorces permettant d'amplifier deux fragments spécifiques pour chacune des microalgues ont été définies (Table 1).

Les séquences d'ADN génomique 1 et 2 correspondant aux deux fragments de l'ARNr 18S de chacune des microalgues du genre Chlorella, ont été amplifiées à l'aide des amorces décrites dans la Table 1. Les sites pour les enzymes de restrictions EcoRI et Xhol/BannHI ont respectivement été insérés en 5' et en 3' du fragment 1. Les sites Xhol et BamHI ont respectivement été insérés en 5' et en 3' du fragment 2. Chacun des fragments ainsi que la cassette de sélection CaMV35S-aphViii-Tnos, ont été clonés dans le vecteur pAlg-CHAst- aphVIII de transformation de Chlorella comme décrit dans l'exemple 2. 11.3.4 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique des microalgues Chlorella est réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)).

Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance sont concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN est réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation est réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. Les microalgues Chlorella sont transformées à l'aide du vecteur pAlgCHAst-aphVIII possédant les fragments d'ADN génomiques homologues, sous forme circulaire et sous forme linéaire. Les microalgues qui subissent la transformation par bombardement de particules sont incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules sont alors centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.3.5 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella qui se développent sur les géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.3.6 Stabilité de la détection des transgènes dans les microalgues Chlorella L'intégration du transgène dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration sont vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés obtenus pour les microalgues, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et en condition hétérotrophe. 11.3.7 Insertion stable du transgène dans le génome de Chlorella Les microalgues Chlorella sont repiquées 15 fois successivement dans le milieu de culture standard en présence ou absence de l'antibiotique de sélection paromomycine.

Les microalgues Chlorella transformées sont également placées en culture en condition hétérotrophe par ajout de glucose dans le milieu de culture à raison de 10g/L, en présence et en absence d'agent de sélection.

La stabilité de la détection du transgène dans le génome des chlorelles transformées est vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces AN322 (5'- TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifique de la séquence codante aphVIII. 11.3.8 Stabilité de la détection des transgènes après cryopréservation des microalgues transformées Les clones transformés des microalgues du genre Chlorella sont cryopréservés à 80°C. Afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes dans le génome de la 10 microalgue, des analyses PCR sont réalisées sur des cultures issues des clones cryopréservés pendant 2 mois. 11.3.9 Insertion stable de la totalité du vecteur de manière aléatoire dans le génome des microalgues Chlorella 15 L'insertion stable du vecteur pALG-CHAst-aphVIII est vérifiée dans les microalgues Chlorella transformées et régulièrement repiquées dans le milieu de culture standard en présence l'antibiotique de sélection paromomycine. La détection du gène de sélection et du reste du vecteur dans le génome des chlorelles transformées est réalisée par amplification PCR à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques de la séquence du 20 vecteur. La figure 5 schématise les amplifications PCR réalisées sur l'ensemble du vecteur de transformation pAlg-CHAst-aphVIII. L'amplification 1 correspond à la mise en évidence de la présence du transgène aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des amorces AN322 (5' -TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3' ) et AN323 (5' - 25 AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifiques du transgène aphVIII. Les amplifications 2 et 3 correspondent à la mise en évidence de la présence des séquences de 2 gènes présents dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC- 30 3') et AN369 (5' -ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3' ) / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC-3') respectivement spécifiques des gènes 1 et 2 présents sur le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII et de part et d'autre du transgène aphVIII (Figure 5). Les amplifications 4a et 4b correspondent à la mise en évidence de la présence de la cassette de sélection entre les fragments 1 et 2 dans le vecteur de transformation dans les 35 microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN433 (5' -TTTAATGTACTGAATTAACG-3') / AN434 (5' - TAATAATTAACATGTAATGC-3' ) et AN371 (5' -TCACAACCGGGATACCGACC-3' ) / AN372 (5' - ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3' ) permettent respectivement d'amplifier les parties 5' et 3' de la cassette d'expression aphVIII du vecteurs pAlg-CHAst-aphViii, en englobant les 40 séquences 1 et 2 du génome de Chlorella (Figure 5). 11.4 Exemple 4 : Transformation génétique stable de Chlorella protothecoïdes à l'aide de vecteurs possédant différentes séquences homologues à l'ADN génomique de la microalgue 11.4.1 Culture des microalgues La microalgue Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) a été cultivée dans un milieu composé d'eau du robinet supplénnenté par une solution nutritive de Conway 1X et par de la tryptone à 0,5g/L. Les cultures ont été placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie a été réalisée dans le milieu standard auquel ont été ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à l'obscurité et à 22°C. Le dénombrement cellulaire a été réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.4.2 Utilisation des gènes de sélection nptll et aphVII pour la transformation stable des microalgues Chlorella protothecoïdes. Réalisation des vecteurs pAlg-CHAst-nptll et pAlg-CHAst-aphVII Les cassettes de sélection CaMV35S-nptll-Tnos et pCaMV35S-aphVII-Tnos ont été amplifiées à partir des vecteurs pAlg-CHA à l'aide des amorces AV37 (5'- AACTC GAG CATG GAGTCAAAGATTC -3' ) et AV40 (5' -TTCTC GAG CC GATCTAGTAACATAG -3' ). Elles ont ensuite été clonées à la place de la cassette CaMV35S-aphVIII-Tnos dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill à l'aide des sites Xhol insérés en 5' et 3' des séquences au cours de l'amplification PCR. 11.4.3 Utilisation du fragment 1 de l'ADN génomique des ARNr 18S pour la transformation stable des microalgues Chlorella protothecoïdes. L'objectif est de démontrer que la présence d'un seul fragment, ou 2 fragments identiques, homologue à des séquences endogènes permet la stabilisation de l'intégration aléatoire de transgènes dans le génome de Chlorella protothecoïdes. Réalisation du construit Fragnnent1-aphVIII et Fragment 1-aphVIll-Fragment 1 Le fragment 1 de l'ARNr 18S de Chlorella protothecoïdes a été amplifié à partir de l'ADN génomique de la microalgue à l'aide des amorces AN336 (5'- AAGAATTCAACCTG GTTGATC CTG CC -3' ) et AN337 (5'- TTGGATCCCTCGAGACAGCAAAGCCCAGGAGC-3'). Il a ensuite été cloné à l'aide des sites EcoRI et BamHI insérés par PCR dans le vecteur pAlgCHAst-F1 issus du vecteur commercial pCambia2300 dans lequel la cassette de sélection des transformants p35S-nptll-T35S a été éliminée par digestion par l'enzyme de restriction Asel. Le vecteur pAlgCHAst-F1-aphV111 a été réalisé par clonage de la cassette de sélection CaMV35S-aphVIII-Tnos dans le vecteur pAlgCHAst-F1 en Xhol, après insertion des sites en 5' et en 3' par PCR à l'aide des amorces AV37 (5'-AACTCGAGCATGGAGTCAAAGATTC-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG -3' ).

Le vecteur pAlgCHAst-F1-aphViii-F1 a été réalisé par clonage d'un deuxième fragment 1 de l'ARNr 18S de Chlorella protothecoïdes dans le vecteur pAlgCHAst-F1-aphVIII en aval de la cassette de sélection. Le fragment 1 a été récupéré par digestion du vecteur donneur par les enzymes HindIII-EcoRV, et il a été cloné dans le vecteur pAlgCHAst-F1- aphVIII digéré par les enzymes HindlIl et PvuII. 11.4.4 Utilisation de différents fragments d'ADN génomique pour la transformation stable des microalgues Chlorella protothecoïdes L'objectif est de démontrer que l'origine et la taille des séquences génomiques présentent dans le vecteur pALG-CHAst-aphVIII ne sont pas directement responsable de la stabilisation de la transformation génétique de Chlorella protothecoïdes, mais que la stabilisation de l'intégration des transgènes est due à la stratégie mise en place consistant à inclure des séquences d'ADN homologue à l'ADN génomique de la microalgue dans le vecteur. Cette stratégie permet de stabiliser l'insertion aléatoire de transgènes dans le génome des microalgues du genre Chlorella. Les analyses réalisées dans les banques de données couplées à des analyses de bioinformatique ont permis de caractériser des séquences du génome de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Les amplifications PCR réalisées sur l'ADN génomique et le séquençage des amplicons obtenus a notamment permis d'identifier les séquences des gènes codant pour les ARNr 28S, la glutamine synthétase, l'ammonium transporteur et une protéine intervenant dans le processus de degreening. Les construits pour la transformation génétique stable de Chlorella protothecoïdes sont réalisés à l'aide de séquences spécifiques de ces 4 gènes, amplifiées à partir de l'ADN génomique de la microalgue à l'aide des couples d'amorces définis après le séquençage des gènes et décrits dans la Table 1. La base du vecteur utilisé pour la transformation génétique des microalgues Chlorella est le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII utilisé dans l'exemple 2. La séquence des fragments 1 et 2 de l'ARNr 18S ont été remplacés par les fragments spécifiques des gènes cités précédemment. -Deux fragments de 750pb sont amplifiés pour l'ARNr 28S (SEQ ID N : 43 et SEQ ID N°: 44) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, BamHI, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. -Deux fragments de 450pb sont amplifiés pour le gène codant une protéine de degreening (SEQ ID N°: 34 et SEQ ID N°: 35) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, BamHI, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. -Deux fragments de 550pb sont amplifiés pour le gène codant pour la glutamine synthétase (SEQ ID N : 37 et SEQ ID N : 38) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, Sall, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. -Deux fragments de 750pb sont amplifiés pour le gène codant un transporteur d'ammonium (SEQ ID N : 40 et SEQ ID N : 41) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, BamHI, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. Le dernier vecteur réalisé consiste à associer des fragments d'ADN éloignés du génome de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Il est réalisé par clonage du fragment 1 du gène glutamine synthétase et du fragment 2 du gène ammonium transporteur dont les locus sont situés sur des scaffolds différents. 11.4.5 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique des microalgues Chlorella est réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance sont concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN est réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de nnicrocarriers. La transformation est réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. Les microalgues Chlorella sont transformées à l'aide du vecteur pAlgCHAst-aphVIII possédant les fragments d'ADN génonniques homologues, sous forme circulaire et sous forme linéaire. Les microalgues qui subissent la transformation par bombardement de particules sont incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules sont alors centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.4.6 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella qui se développent sur les géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.4.7 Stabilité de la détection des transgènes dans les microalgues Chlorella L'intégration du transgène dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration sont vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés obtenus pour les microalgues, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et en condition hétérotrophe. 11.4.8 Insertion stable du transgène dans le génome de Chlorella Les microalgues Chlorella sont repiquées 15 fois successivement dans le milieu de culture standard en présence ou absence de l'antibiotique de sélection paromomycine.

Les microalgues Chlorella transformées sont également placées en culture en condition hétérotrophe par ajout de glucose dans le milieu de culture à raison de 10g/L, en présence et en absence d'agent de sélection. La stabilité de la détection du transgène dans le génome des chlorelles transformées est vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces AN322 (5'15 TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifique de la séquence codante aphVIII. 11.4.9 Stabilité de la détection des transgènes après cryopréservation des microalgues transformées 20 Les clones transformés des microalgues du genre Chlorella sont cryopréservés à - 80°C. Afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes dans le génome de la microalgue, des analyses PCR sont réalisées sur des cultures issues de clones cryopréservés pendant 2 mois. 25 11.4.10 Insertion stable de la totalité du vecteur de manière aléatoire dans le génome des microalgues Chlorella L'insertion stable du vecteur pALG-CHAst-aphVIII est vérifiée dans les microalgues Chlorella transformées et régulièrement repiquées dans le milieu de culture standard en présence l'antibiotique de sélection paromomycine. La détection du gène de sélection et 30 du reste du vecteur dans le génome des chlorelles transformées est réalisée par amplification PCR à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques de la séquence du vecteur. La figure 5 schématise les amplifications PCR réalisées sur l'ensemble du vecteur de transformation pAlg-CHAst-aphVIII. L'amplification 1 correspond à la mise en évidence de la présence du transgène 35 aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des amorces AN322 (5' -TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3' ) et AN323 (5' - AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifiques du transgène aphVIII.

Les amplifications 2 et 3 correspondent à la mise en évidence de la présence des séquences de 2 gènes présents dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC- 3') et AN369 (5' -ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3') / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC-3') respectivement spécifiques des gènes 1 et 2 présents sur le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII et de part et d'autre du transgène aphVIII (Figure 5). Les amplifications 4a et 4b correspondent à la mise en évidence de la présence de la cassette de sélection entre les fragments 1 et 2 dans le vecteur de transformation dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN433 (5'-TTTAATGTACTGAATTAACG-3') / AN434 (5' - TAATAATTAACATGTAATGC-3') et AN371 (5'-TCACAACCGGGATACCGACC-3') / AN372 (5'- ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3') permettent respectivement d'amplifier les parties 5' et 3' de la cassette d'expression aphVIII du vecteurs pAlg-CHAst-aphViii, en englobant les séquences 1 et 2 du génome de Chlorella (Figure 5). 11.5 Exemple 5 : production de molécules d'intérêt industriel dans Chlorella 11.5.1 Les souches de Chlorella Les microalgues sont Chlorella sorokianiana UTEX1663, Chlorella vulgaris SAG280 et SAG211.11b, Chlorella autotrophica CCMP243, Chlorella NC64A SAG211.6, Chlorella prototheco'ides CCAP211/8D et SAG211.7C, Chlorella Kessleri SAG27.87, Chlorella ellipsoida SAG2141. 11.5.2 Culture des microalgues Les microalgues Chlorella ont été cultivées dans un milieu composé d'eau du robinet supplérnenté par une solution nutritive de Conway 1X, de tryptone à 0,5g/L ou de KNO3 à 1,5g/L selon la rnicroalgue, et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma). Les cultures ont été placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie a été réalisée dans le milieu standard auquel ont été ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à l'obscurité et à 22°C. Le dénombrement cellulaire est réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.5.3 Détection des glycoprotéines des microalgues du genre Chlorella Les échantillons protéiques des microalgues Chlorella ont été séparés sur un gel SDS- PAGE 12%, et transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare). Après saturation de la membrane de nitrocellulose pendant 5 minutes dans une solution de TBS Tween20 2%, les glycoprotéines ont été détectées par affinodétection à l'aide de la lectine Concanavaline A conjuguée à la peroxydase de Raifort (Sigma, L6397). La figure 7 montre les résultats obtenus pour différentes microalgues du genre Chlorella. Les microalgues Chlorella présentent des profils dans lesquels des glycoprotéines ont été détectées. Ces microalgues possèdent donc la capacité à produire des protéines matures glycosylées. Du fait de leur fort potentiel industriel et de leur capacité à réaliser des modifications post-traductionnelles comme la N-glycosylation, les microalgues Chlorella se présentent comme de très bons candidats comme système d'expression pour la production de protéines glycosylées d'intérêt thérapeutiques, tels que les anticorps monoclonaux, les protéines d'enveloppes virales, ou encore les enzymes lysosomales. 11.5.4 Production de protéines marqueurs dans la microalgue Chlorella protothecoïdes Les séquences régulatrices d'origine virale A3R (SEQ ID N° ) et A208R (SEQ ID N° ), ont été synthétisées avec addition du site EcoRI en 5' et en 3' de chacune des séquences. Ces promoteurs ont ensuite été clonés dans le vecteur pAlg-CHA à la place du promoteur 15 CaMV35S. Les gènes codant pour les protéines rapporteurs eGFP (SEQ ID NO : 8) et GUS (SEQ ID NO : 9) ont été respectivement amplifiés à partir des vecteurs pPT-eGFP (Zaslavskaia et al., 2000) et pBi121 (GenBank : AF485783) à l'aide des couples d'amorces AV49 (5'- AAG GATC CATG GTG AG CAAG G G C GAG -3 ' ) / AV50 (5' -TTGAG CTCTTACTTGTACAG CTCG TC -3 ' ) 20 et AV51 (5' -AAGGATCCATGTTACGTCCTGTAGAAAC -3' ) / AV52 (5' - TTGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTG-3'). Les séquences codantes ont ensuite été clonées dans le vecteur pAlg-CHA sous le contrôle du promoteur A3R pour le gène gus, et A208R pour le gène egfp. Les cassettes d'expression pA3R-gus-Tnos et pA208R-egfp-Tnos ont été amplifiée à 25 l'aide des amorces AV47 (5' -GCTCCTGGTCGAACATGG-3') ou AV48 (5' - GAGTCAACATATGGGGGG-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3' ) avant d'être clonées en bouts francs dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill. Le site de clonage des cassettes d'expression se trouve en aval du fragment 2 de l'ARNr 18S. 30 11.5.5 Production de glycoprotéines d'intérêt thérapeutiques dans la microalgue Chlorella protothecoïdes Les séquences des chaines lourdes et légères de l'anticorps monoclonal d'intérêt thérapeutique Rituximab (SEQ ID NO : 10; SEQ ID NO : 11) ont été synthétisées. Les sites BamHI et Sacl ont respectivement été insérées en 5' et en 3' de chacune des séquences. 35 La chaîne lourde a été clonée dans le vecteur pAlg-CHA-gus à la place de la séquence gus en aval du promoteur viral A3R. La chaîne légère a été clonée dans le vecteur pAlgCHA-egfp à la place de la séquence egfp en aval du promoteur viral A208R. Les cassettes d'expression pA3R-ChLrtx-Tnos et pA208R-Ch(rtx-Tnos ont été amplifiée à l'aide des amorces AV47 (5'-GCTCCTGGTCGAACATGG-3') ou AV48 (5'40 GAGTCAACATATGGGGGG-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3' ) avant d'être clonées en bouts francs dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill. Les sites de clonage des cassettes d'expression se trouvent en amont du fragment 1 et en aval du fragment 2 de l'ARNr 18S. 11.5.6 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique de la microalgue Chlorella protothecoides est réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance sont concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN est réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation est réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. La microalgue Chlorella protothecoides est transformée à l'aide du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII sous forme circulaire et sous forme linéaire. Les microalgues qui ont subis la transformation par bombardement de particules ont été incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.5.7 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella qui se développent sur les géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.5.8 Détection des protéines rapporteurs dans les transformants de Chlorella protothecoides Les clones de la microalgue Chlorella protothecoides transformés avec la séquence codant pour la protéine GUS sont cultivés dans les conditions standards de cultures. Les cellules en phase exponentielle de croissance, sont récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), puis incubées dans le tampon de réaction GUS. L'observation de la coloration bleue spécifique de l'expression du gène gus est réalisée après 24 heures à l'aide d'un microscope photonique.

Les clones de la microalgue Chlorella protothecoides transformés avec la séquence codant pour la protéine fluorescente eGFP sont cultivés dans les conditions standards de cultures. Les cellules en phase exponentielle de croissance, sont récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), puis observées à l'aide d'un microscope à épi- fluorescence. Les cellules de type sauvage et les cellules exprimant la protéine eGFP de la microalgue Chlorella protothecoides sont lysées. Les extraits protéiques sont analysés par immunoblotting à l'aide d'un anticorps anti-eGFP (Santa Cruz, sc-9996-HRP). 11.5.9 Détection de l'anticorps Rituximab dans les transformants de Chlorella protothecoides Les surnageants de culture des souches de type sauvage et transformées avec les séquences codants pour les chaines lourde et légère de l'anticorps d'intérêt commercial Rituximab, sont récupérés par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C) de culture en phase exponentielle de croissance. La détection de l'anticorps recombinant sécrété dans le milieu de culture des microalgues transformées est réalisée à l'aide de l'anticorps antihuman IgG (Sigma, A6029-HRP).

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Cha T.S., Yee W. and Aziz A. (2012). "Assessment of factors affecting Agrobacteriummediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris." World Journal of Microbiology and Biotechnology 28(4): 1771-1779. Chow K.C. and Tung W.L. (1999). "Electrotransformation of Chlorella vulgaris." Plant Cell Reports 18: 778-780. Jarvis E.E. and Brown L.M. (1991). "Transient expression of firefly luciferase in protoplasts of the green alga Chlorella ellipsoidea." Current Genetics 19(4): 317-321.

Lu Y., Kong R. and Hu L. (2011). "Preparation of protoplasts from Chlorella protothecoïdes." World Journal of Microbiology and Biotechnology 28(4): 1827-1830. Maruyama M., Horakova I., Honda H., Xing X.H., Shiragami N. and Unno H. (1994). "Introduction of foreign DNA into Chlorella saccharophila by electroporation." Biotchnology Techniques 8(11): 821-826.

Needleman S.B. and Wunsch C.D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins." Journal of Molecular Biology 48(3): 443-453. Rakkhumkaew N., Kawasaki T., Fujie M. and Yamada T. (2012). "Prolonged synthesis of hyaluronan by Chlorella cells infected with chloroviruses." Journal of Bioscience and Bioengineering [Epub ahead of print]. Thomas J.L., Bardou J., L'hoste J., Mauchamp B., and Chavancy G. (2001). "A helium burst biolistic device adapted to penetrate fragile insect tissues". Journal of Insect Science. Zaslavskaia L., Casey Lippmeier J., Kroth P., Grossman A. and Apt E. (2000). "Transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae) with a variety of selectable marker and reporter genes." Journal of Phycology 36: 379-386.

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella comprenant les étapes suivantes : (i) transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 300 kpb ; et (ii) sélection d'un transformant stable.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la dite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène est une séquence codante, en particulier une séquence codant de l'ARN ribosomal.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène est une séquence codant de l'ARN ribosomal choisie dans le groupe consistant en : la séquence du gène codant l'ARNr 18S ; la séquence du gène codant l'ARNr 28S ; la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S ; et leurs fragments d'une longueur d'au moins 10 pb.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène est ta seule séquence endogène de ladite microalgue du genre Chlorella comprise dans ledit vecteur d'expression.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit vecteur comprend deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices choisies dans le groupe consistant en :une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène' du gérfome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella, ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 300 kpb ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel les deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices sont des séquences endogènes du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella et sont les seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel ladite (ou lesdites) séquence(s) d'acides nucléiques stabilisatrice(s) endogène(s) est (sont) un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, ledit fragment étant d'une longueur allant de 300 pb à 800 pb, en particulier de 400 pb à 750 pb.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ladite microalgue du genre Chlorella est choisie dans le groupe consistant en Chlorella protothecoïdes et Chlorella sorokiniana, en particulier Chlorella protothecoïdes.
9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes et ladite (ou lesdites) séquence(s) d'acides nucléiques stabilisatrice(s) endogène(s) est (sont) choisie(s) dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 13, la séquence SEQ ID NO : 14, la séquence SEQ ID NO : 43, la séquence SEQ ID NO : 44, la séquence SEQ ID NO : 45, en particulier dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO : 13 et la séquence SEQ ID NO : 14.
10. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes et ledit vecteur d'expression est tel que défini selon l'une quelconque des revendications 13 à 15.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ledit procédé comprenant en outre les étapes suivantes : (iii) isolation dudit transformant stable ; et (iv) culture dudit transformant stable.
12. Procédé de production d'une substance d'intérêt comprenant la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel ladite cassette d'expression est une cassette d'expression hétérologue comprenant une séquence d'ADN codant ladite substance d'intérêt.
13. Vecteur déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122.
14. Vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb et étant une séquence codant de l'ARN ribosome en particulier la séquence du gène codant l'ARNr 18S ou un fragment de celle-ci.
15. Vecteur d'expression selon la revendication 14 comprenant : une cassette d'expression ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant SEQ ID NO : 13 ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant SEQ ID NO : 14.
16. Microalgue du genre Chlorella comprenant au moins un vecteur tel que défini selon l'une quelconque des revendications 13 à 15.