FR3001228A1 - PROCESS FOR OBTAINING STABLE TRANSFORMANTS OF MICROALGUES OF THE GENUS CHLORELLA - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne notamment un procédé d'obtention d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella ainsi que des vecteurs d'expression et des microalgues du genre Chlorella comprenant lesdits vecteurs d'expression.The present invention relates in particular to a process for obtaining a stable microalgae transformant of the Chlorella genus as well as expression vectors and microalgae of the Chlorella genus comprising said expression vectors.
Description
PROCEDE D'OBTENTION DE TRANSFORMANTS STABLES DE MICROALGUES DU GENRE CHLORELLA Les potentialités industrielles des microalgues en termes d'applications liées à l'énergie, la santé, la cosmétique, l'alimentation et l'environnement sont particulièrement importantes. En raison notamment des controverses liées aux biocarburants de première génération, des limites technico-économiques qui freinent les biocarburants de deuxième génération, la production de biocarburants à partir de microalgues connait un développement mondial important depuis ces cinq dernières années. Le biogaz est également une autre forme d'énergie qui peut être issue des microalgues. Le domaine de la cosmétique vise à intégrer de plus en plus d'ingrédients naturels, dont les huiles, les pigments issus de microalgues.PROCESS FOR OBTAINING STABLE TRANSFORMANTS OF MICROALGUES OF THE CHLORELLA GENUS The industrial potentialities of microalgae in terms of applications related to energy, health, cosmetics, food and the environment are particularly important. Due in particular to the controversies related to first-generation biofuels, the technical-economic limits that hinder second-generation biofuels, the production of biofuels from microalgae has undergone significant global development over the last five years. Biogas is also another form of energy that can be derived from microalgae. The field of cosmetics aims to integrate more and more natural ingredients, including oils, pigments from microalgae.
L'agro-alimentaire, incorpore également des molécules issues des microalgues, principalement des colorants. Les microalgues offrent également des opportunités intéressantes dans le domaine des compléments alimentaires et de la nutraceutique. Les microalgues sont largement utilisées en alimentation animale, notamment pour la nourriture des alevins des poissons mais aussi pour la nourriture de grossissement.The food industry, also incorporates molecules from microalgae, mainly dyes. Microalgae also offer interesting opportunities in the field of food supplements and nutraceuticals. Microalgae are widely used in animal feed, especially for fish fry food but also for fattening food.
Les sociétés telles que de biotechnologies ou pharmaceutiques ont également besoin de disposer de systèmes de production de molécules d'intérêt qui répondent à leurs exigences en termes de qualité, de quantité de molécules produites et de rentabilité. Ce secteur est en pleine expansion. Ainsi, depuis la fin des années 1990, plus de 280 protéines recombinantes thérapeutiques ont été commercialisées.Companies such as biotechnology or pharmaceuticals also need systems of production of molecules of interest that meet their requirements in terms of quality, quantity of molecules produced and profitability. This sector is booming. Since the late 1990s, more than 280 therapeutic recombinant proteins have been commercialized.
Depuis plusieurs années, les microalgues ont été proposées comme système de production de molécules d'intérêts comme alternative aux systèmes d'expression bactérien, dans les levures, les cellules d'insectes ou encore dans les cellules végétales. Toutefois, il existe de nombreuses contraintes techniques à une telle utilisation dont l'un des points majeurs est l'obtention de transformants stables.For several years, microalgae have been proposed as a system of production of interest molecules as an alternative to bacterial expression systems, in yeasts, insect cells or in plant cells. However, there are many technical constraints to such use of which one of the major points is the obtaining of stable transformants.
Parmi les différentes microsigues existantes, celles du genre Chlorella sont particulièrement intéressante.s pour les différentes applications industrielles. En effet, les microalgues du genre Chlorella peuvent être cultivées à grande échelle à faible coûts sous différents modes de culture : en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie. Leur culture peut être réalisée dans des fermenteurs classiques déjà présents sur les sites industriels.Among the various microsigues existing, those of the genus Chlorella are particularly interesting for the different industrial applications. Indeed, microalgae of the genus Chlorella can be grown on a large scale at low cost under different cultivation methods: autotrophy, mixotrophy or heterotrophy. Their culture can be carried out in conventional fermenters already present on industrial sites.
Avantageusement, en culture en hétérotrophie, la source carbonée peut être un coproduit d'une filière industrielle. Il faut noter que les microalgues du genre Chlorella font partie des microalgues présentant les meilleures productivités. En outre, la composition de différentes microalgdes algues du genre Chlorella est particulièrement intéressante pour certaines applications industrielles : par exemple leur forte teneur en huile permet de les utiliser avantageusement pour produire des biocarburants, et une forte teneur protéique permet leur utilisation en alimentation animale. De plus, les microalgues du genre Chlorella sont intéressantes pour produire des protéines recombinantes en raison de leurs caractéristiques eucaryotes, notamment leur capacité à réaliser des modifications posttraductionnelles telles que la N-glycosylation.Advantageously, in heterotrophic culture, the carbon source may be a co-product of an industrial sector. It should be noted that microalgae of the genus Chlorella are among the microalgae with the best productivities. In addition, the composition of various microalgae algae of the genus Chlorella is particularly interesting for certain industrial applications: for example their high oil content makes it possible to use them advantageously to produce biofuels, and a high protein content allows their use in animal feed. In addition, microalgae of the genus Chlorella are of interest in producing recombinant proteins because of their eukaryotic characteristics, including their ability to perform posttranslational modifications such as N-glycosylation.
Toutefois, les données de la littérature (Chow et al. 1999, Rakkhumkaew et al. 2012) montrent une instabilité des transgènes chez les microalgues du genre Chlorella, faisant ainsi obstacle à leur utilisation à l'échelle industrielle comme système d'expression de molécules d'intérêts. L'objectif de la présente invention est donc de pouvoir disposer d'un procédé d'obtention de transformants stables de microalgues du genre Chlorella, permettant ainsi leur utilisation comme système de production de substances d'intérêts au niveau industriel. Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante que la présence d'au moins une séquence d'acides nucléiques endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella dans un vecteur de transformation (notamment un vecteur d'expression), en particulier de deux fragments de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, permet d'obtenir des transformants particulièrement stables de microalgues du genre Chlorella, au moins jusqu'à dix-sept repiquages successifs, après cryopréservation, en présence ou en l'absence d'agent de sélection.However, literature data (Chow et al., 1999, Rakkhumkaew et al., 2012) show transgenic instability in microalgae of the genus Chlorella, thus preventing their use on an industrial scale as a system for expressing molecules. interest. The objective of the present invention is therefore to have available a process for obtaining stable transformants of microalgae of the Chlorella genus, thus allowing their use as a production system of substances of interest at the industrial level. The inventors have surprisingly demonstrated that the presence of at least one endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of a microalgae of the Chlorella genus in a transformation vector (in particular an expression vector), in particular two fragments of the gene sequence encoding the 18S rRNA, makes it possible to obtain particularly stable transformants of Chlorella microalgae, at least up to seventeen successive subcultures, after cryopreservation, in the presence or in the absence of selection agent.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella comprenant les étapes suivantes : (i) transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et - une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité, en particulier au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99%, avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10pb à 300kpb ; et (ii) sélection d'un transformant stable. Le procédé selon l'invention présente notamment les avantages suivants : Il permet la production de molécules d'intérêt dans un système particulièrement adapté à l'échelle industrielle : forte productivité, faibles coûts, utilisations de fermenteurs industriels, possibilité de différents modes de culture (en autotrophie, en mixotrophie ou en hétérotrophie), possibilité d'utilisation de coproduit de filière industrielle comme source carbonée en culture en hétérotrophie ; Il permet la production de substances d'intérêt notamment par modification des voies métaboliques par génie génétique. En particulier, le procédé selon l'invention permet ainsi la production d'enzymes impliquées dans le métabolisme des lipides conduisant à la production et à l'accumulation de lipides spécifiques ; Il permet la production de molécules recombinantes dans un système présentant des propriétés eucaryotes ; En effet, les microalgues du genre Chlorella ont la capacité de réaliser des modifications post-traductionnelles telles que la Nglycosylation. En particulier, le procédé selon l'invention permet ainsi la production de protéines glycosylées notamment d'intérêt thérapeutique tels que des anticorps monoclonaux, des protéines d'enveloppes virales, des enzymes lysosomales. Afin de permettre une meilleure compréhension de la présente invention, certaines définitions sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent être interprétés selon leur sens habituel.Thus, according to a first aspect, the subject of the invention is a process for obtaining a stable microalgae transformant of the Chlorella genus comprising the following steps: (i) transformation of the nuclear genome of a microalgae of the Chlorella genus by a vector expression medium comprising: an expression cassette, in particular a heterologous one; and an endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of said microalgae of the genus Chlorella and / or a stabilizing nucleic acid sequence having at least 80% identity, in particular at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, with said endogenous stabilizing nucleic acid sequence throughout the length of said sequence; said endogenous stabilizing nucleic acid sequence being from 10bp to 300kbp in length; and (ii) selecting a stable transformant. The method according to the invention has the following advantages in particular: It allows the production of molecules of interest in a system particularly adapted to industrial scale: high productivity, low costs, uses of industrial fermenters, possibility of different modes of cultivation ( in autotrophy, in mixotrophy or in heterotrophy), possibility of using co-product of industrial sector as carbon source in culture in heterotrophy; It allows the production of substances of interest in particular by modification of the metabolic pathways by genetic engineering. In particular, the method according to the invention thus allows the production of enzymes involved in the metabolism of lipids leading to the production and accumulation of specific lipids; It allows the production of recombinant molecules in a system with eukaryotic properties; Indeed, microalgae of the genus Chlorella have the ability to perform post-translational modifications such as Nglycosylation. In particular, the method according to the invention thus allows the production of glycosylated proteins, particularly of therapeutic interest, such as monoclonal antibodies, viral envelope proteins, and lysosomal enzymes. In order to allow a better understanding of the present invention, certain definitions are provided. Unless otherwise indicated, the other technical terms used in this application must be interpreted in their usual meaning.
On entend par - transformant » au sens de la présente invention, tout organisme, en particulier une microalgue du genre Chlorella, issu d'une transformation génétique. On entend par - transformant stable de microalgue du genre Chlorella » au sens de la présente invention un transformant de microalgue du genre Chlorella dans lequel la présence du vecteur de transformation (en particulier le vecteur d'expression selon l'invention par lequel est transformé ladite microalgue du genre Chlorella dans le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention) et/ou du transgène éventuellement compris dans le vecteur de transformation et/ou de la cassette d'expression éventuellement comprise dans le vecteur de transformation est détectée après au moins 4 repiquages successifs, en particulier au moins 10 repiquages successifs, plus particulièrement au moins 15 repiquages successifs et tout particulièrement au moins 17 repiquages successifs, notamment après culture du transformant après cryopréservation et/ou sans agent de sélection, en particulier en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie. La détection du vecteur de transformation et/ou du transgène peut se faire selon toutes techniques bien connues de l'Homme du Métier, telles que par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») en utilisant des amorces spécifiques du vecteur de transformation et/ou du transgène et/ou de la cassette d'expression. On entend par - vecteur de transformation » au sens de la présente invention, tout vecteur par lequel est transformé un organisme, notamment une microalgue du genre Chlorella. En particulier, le vecteur de transformation est le vecteur d'expression selon l'invention par lequel est transformé ladite microalgue du genre Chlorella dans le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention. On entend par - transgène » au sens de la présente invention, toute molécule d'acide nucléique, en particulier tout gène, destiné à être introduit dans un organisme, en particulier une microalgue du genre Chlorella. En particulier, le transgène est une séquence d'ADN codant une substance d'intérêt et comprise dans la cassette d'expression hétérologue selon l'invention. On entend par - repiquage successif » au sens de la présente invention, le prélèvement d'au moins une microalgue du genre Chlorella d'un milieu de culture initial et la mise en culture de celle-ci dans un milieu de culture identique ou différent du milieu initial. Notamment, les repiquages successifs peuvent être réalisés par le repiquage de la culture dans un milieu frais toutes les 2 à 3 semaines, à la même concentration cellulaire ou à une concentration cellulaire différente, dans le même milieu ou dans un milieu de culture différent du milieu initial. On entend par - microalgue du genre Chlorella » au sens de la présente invention toute microalgue appartenant au genre Chlorella. A titre d'exemple, les microalgues du genre Chlorella peuvent être choisies dans le groupe consistant en Chlorella alternons (Tetrachlore(la), Chlorella angustoellipsoidea, Chlorella anitrata, Chlorella anitrata var. minor, Chlorella antarctica, Chlorella autotrophica, Chlorella autotrophica var. atypica, Chlorella beijerinckii (Parachlorella), Chlorella capsulata, Chlorella conductrix (Brandt) Beijerinck, Chlorella desiccata, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella emersonii var. globosa, Chlorella fusca var. vacuolata, Chlorella hainangensis (Heveochlorella), Chlorella kessleri (Parachlorella), Chlorella lobophora, Chlorella luteoviridis (Heterochlorella), Chlorella marina, Chlorella miniata, Chlorella minutissima, Chlorella mirabilis, Chlorella ovalis, Chlorella parasitica (Brandt) Beijerinck, Chlorella parva, Chlorella pringsheimii (Pseudochlorella), Chlorella protothecoides (auxenochlorel(a), Chlorella protothecoïdes var. communis (auxenochlorel(a), Chlorella pyrenoidosa, Chlorella pyrenoidosa (Pseudochlorella), Chlorella regularis var. minima, Chlorella reisiglii, Chlorella saccharophila, Chlorella saccharophila var. saccharophila, Chlorella saccharophila var. ellispoida, Chlorella satina, Chlorella sorokiniana, Chlorella spaerckii, Chlorella species, Chlorella sphaerica, Chlorella stigmatophora, Chlorella variabilis, Chlorella variegata Beijerinck, Chlorella viscosa, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris fo. Tertia, Chlorella vulgaris fo. Viridis, Chlorella vulgaris Beijerinck, Chlorella xanthella Beijernick, Chlorella zofingiensis, en particulier Chlorella protothecoides et Chlorella sorokiniana, tout particulièrement Chlorella protothecoides. On entend par - transformation du génome nucléaire » au sens de la présente invention toute technique permettant d'introduire des molécules d'acides nucléiques dans le noyau d'un organisme récepteur, en particulier une microalgue du genre Chlorella. A titre d'exemple de techniques permettant la transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella, on peut citer l'électroporation (Maruyama et al., 1994), les techniques utilisant le PEG (polyethylèneglycol) (Jarvis and Brown, 1991), les techniques utilisant Agrobacterium (Cha et al., 2012), la biolistique. Certaines de ces techniques sont illustrées dans les exemples de la présente demande.For the purposes of the present invention, the term "transformant" means any organism, in particular a microalgae of the genus Chlorella, resulting from a genetic transformation. The term "stable microalgae transformant of the genus Chlorella" in the sense of the present invention is understood to mean a microalgae transformant of the genus Chlorella in which the presence of the transformation vector (in particular the expression vector according to the invention by which said microalgae of the genus Chlorella in the process for obtaining a stable transformant according to the invention) and / or a transgene optionally included in the transformation vector and / or the expression cassette possibly included in the transformation vector is detected after at least 4 successive transplants, in particular at least 10 successive transplants, more particularly at least 15 successive transplants and especially at least 17 successive transplants, in particular after culture of the transformant after cryopreservation and / or without a selection agent, in particular in autotrophy , mixotrophy or heterotrophy. The detection of the transformation vector and / or the transgene can be carried out according to any technique well known to those skilled in the art, such as by PCR (Polymerase Chain Reaction) using primers specific for the transformation vector and / or the transgene and / or expression cassette. For the purposes of the present invention, the term "transformation vector" is intended to mean any vector through which an organism is transformed, in particular a microalgae of the genus Chlorella. In particular, the transformation vector is the expression vector according to the invention by which said microalgae of the genus Chlorella is transformed in the process for obtaining a stable transformant according to the invention. For the purposes of the present invention, the term "transgene" means any nucleic acid molecule, in particular any gene, intended to be introduced into an organism, in particular a microalgae of the genus Chlorella. In particular, the transgene is a DNA sequence encoding a substance of interest and included in the heterologous expression cassette according to the invention. For the purpose of the present invention, the term "successive subculture" is intended to mean the removal of at least one microalgae of the Chlorella genus from an initial culture medium and culturing it in a culture medium that is identical to or different from the initial medium. In particular, successive subcultures can be carried out by subculturing the culture in a fresh medium every 2 to 3 weeks, at the same cell concentration or at a different cell concentration, in the same medium or in a culture medium different from the medium. initial. The term microalgae of the genus Chlorella "within the meaning of the present invention any microalgae belonging to the genus Chlorella. For example, microalgae of the genus Chlorella can be selected from the group consisting of Chlorella alternans (Chlorella autotrophica, Chlorella autotrophica var. , Chlorella beijerinckii (Parachlorella), Chlorella capsulata, Chlorella conductrix (Brandt) Beijerinck, Chlorella desiccata, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella emersonii var globosa, Chlorella fusca var vacuolata, Chlorella hainangensis (Heveochlorella), Chlorella kessleri (Parachlorella), Chlorella lobophora, Chlorella luteoviridis (Heterochlorella), Chlorella marina, Chlorella miniata, Chlorella minutissima, Chlorella mirabilis, Chlorella ovalis, Chlorella parasitica (Brandt) Beijerinck, Chlorella parva, Chlorella pringsheimii (Pseudochlorella), Chlorella protothecoides (auxenochlorel (a), Chlorella protothecoids var communis (auxenochlorel (a), Chlorella pyren oidosa, Chlorella pyrenoidosa (Pseudochlorella), Chlorella regularis var. minima, Chlorella reisiglii, Chlorella saccharophila, Chlorella saccharophila var. saccharophila, Chlorella saccharophila var. ellipoida, Chlorella satina, Chlorella sorokiniana, Chlorella spaerckii, Chlorella species, Chlorella sphaerica, Chlorella stigmatophora, Chlorella variabilis, Chlorella variegata Beijerinck, Chlorella viscosa, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris fo. Tertia, Chlorella vulgaris fo. Viridis, Chlorella vulgaris Beijerinck, Chlorella xanthella Beijernick, Chlorella zofingiensis, especially Chlorella protothecoides and Chlorella sorokiniana, especially Chlorella protothecoides. For the purposes of the present invention, the term "transformation of the nuclear genome" is intended to mean any technique making it possible to introduce nucleic acid molecules into the nucleus of a receptor organism, in particular a microalgae of the genus Chlorella. Examples of techniques for transforming the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella include electroporation (Maruyama et al., 1994), techniques using PEG (polyethylene glycol) (Jarvis and Brown, 1991). ), techniques using Agrobacterium (Cha et al., 2012), biolistics. Some of these techniques are illustrated in the examples of this application.
En particulier, l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella est mise en oeuvre par biolistique. Lors de l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella, le vecteur d'expression peut être sous forme circulaire ou linéaire. Préalablement à l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de préparation de protoplastes de ladite microalgue du genre Chlorella. Ainsi l'étape (i) de transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella peut être mise en oeuvre sur des cellules intactes ou sur des protoplastes d'une microalgue du genre Chlorella. L'étape de préparation de protoplastes d'une microalgue du genre Chlorella peut être effectuée selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier telle que celle décrite dans l'article de Lu et al., 2011. L'étape (ii) de sélection d'un transformant stable peut être mise en oeuvre, notamment par la détection de la présence du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression dans le transformant, après au moins 4 repiquages successifs, en particulier au moins 10 repiquages successifs, plus particulièrement au moins 15 repiquages successifs et tout particulièrement au moins 17 repiquages successifs, notamment après culture du transformant après cryopréservation et/ou sans agent de sélection, notamment en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie. La détection de la présence du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression dans le transformant permettant de valider la stabilité du transformant peut se faire selon toutes techniques bien connues de l'Homme du Métier, telles que par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») en utilisant des amorces spécifiques du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression. Cette détection du vecteur d'expression et/ou de la cassette d'expression dans le transformant est avantageusement réalisée après chaque repiquage. A titre d'exemple, l'étape (ii) de sélection d'un transformant stable de microalgue du genre Chlorella peut être mise en oeuvre comme ci-après : après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues du genre Chlorella qui se développent sur des géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection. Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture, notamment en condition hétérotrophe, avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome des microalgues transformées. L'intégration des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration sont vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés obtenus pour les microalgues, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et notamment en condition hétérotrophe. Selon un mode de réalisation particulier, la détection de l'intégration des vecteurs de transformation (vecteurs d'expression selon l'invention) et/ou des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration peut être vérifiées après cryopréservation : Ainsi, les clones transformés des microalgues du genre Chlorella peuvent être cryopréservés à -80°C ; afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes (séquences d'acides nucléiques d'intérêt selon l'invention) dans le génome de la microalgue, des analyses PCR sont réalisées sur des cultures issues de clones cryopréservés pendant au moins 2 mois.In particular, the step (i) of transforming the nuclear genome of a microalgae of the Chlorella genus is carried out by biolistics. During step (i) of transformation of the nuclear genome of a microalga of the Chlorella genus, the expression vector may be in circular or linear form. Prior to step (i) of transforming the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella, the method according to the invention may comprise a step of preparing protoplasts of said microalgae of the genus Chlorella. Thus step (i) of transformation of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella can be carried out on intact cells or on protoplasts of a microalgae of the genus Chlorella. The step of preparing protoplasts of a microalgae of the Chlorella genus may be carried out according to any technique well known to those skilled in the art such as that described in the article by Lu et al., 2011. Step (ii) for selecting a stable transformant can be implemented, in particular by detecting the presence of the expression vector and / or the expression cassette in the transformant, after at least 4 successive subcultures, in particular at least 10 successive subcultures, more particularly at least 15 successive transplants and especially at least 17 successive transplants, especially after culture of the transformant after cryopreservation and / or without selection agent, especially in autotrophy, mixotrophy or heterotrophy. The detection of the presence of the expression vector and / or of the expression cassette in the transformant making it possible to validate the stability of the transformant can be done according to any techniques well known to those skilled in the art, such as by PCR (" Polymerase Chain Reaction ") using primers specific for the expression vector and / or the expression cassette. This detection of the expression vector and / or the expression cassette in the transformant is advantageously carried out after each subculture. By way of example, the step (ii) of selecting a stable microalgae transformant of the Chlorella genus can be carried out as follows: after 15 to 21 days of culture, the potentially transformed clones of microalgae of the genus Chlorella that develop on selection agar plates are transplanted a first time on a fresh medium supplemented with selection agent. The clones are then regularly transplanted on selection agar plates and from the third subculture, they are also placed in a liquid medium in the presence of selection agent. After 4 successive subcultures, the clones are both subcultured on media with and without a selection agent. After 5 rounds of subculture, the clones are placed in culture, in particular in heterotrophic conditions, with and without a selection agent. The monitoring of the detection of transformation vectors (expression vectors according to the invention) and / or transgenes (nucleic acid sequences of interest according to the invention) is carried out after each transplanting and this in order to define the stability detection of the transformation vectors (expression vectors according to the invention) and / or transgenes (nucleic acid sequences of interest according to the invention) in the genome of the transformed microalgae. The integration of the transformation vectors (expression vectors according to the invention) and / or transgenes (nucleic acid sequences of interest according to the invention) into the genome of microalgae of the genus Chlorella and the stability of the integration are verified by PCR amplification on the transformed clones obtained for the microalgae, subcultured in culture media with and without a selection agent, grown under standard culture conditions and in particular under heterotrophic conditions. According to a particular embodiment, the detection of the integration of the transformation vectors (expression vectors according to the invention) and / or transgenes (nucleic acid sequences of interest according to the invention) into the genome of the Microalgae of the Chlorella genus and the stability of the integration can be checked after cryopreservation: Thus, the transformed clones of microalgae of the Chlorella genus can be cryopreserved at -80 ° C .; in order to validate the stability of the integration of the transgenes (nucleic acid sequences of interest according to the invention) into the genome of the microalgae, PCR analyzes are carried out on cultures derived from cryopreserved clones for at least 2 months.
On entend par - vecteur d'expression » au sens de la présente invention, tout vecteur permettant d'exprimer une molécule d'acides nucléiques dans un organisme, en particulier une microalgue du genre Chlorella. Le vecteur d'expression peut être viral tels que les bactériophages ou non viral tels que les plasmides.For the purposes of the present invention, the term "expression vector" is intended to mean any vector that makes it possible to express a molecule of nucleic acids in an organism, in particular a microalgae of the genus Chlorella. The expression vector may be viral such as bacteriophages or non-viral such as plasmids.
On entend par - cassette d'expression » au sens de la présente invention, un fragment d'acides nucléiques, en particulier d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sites de restriction spécifiques, ledit fragment comprenant les séquences nécessaires à l'expression (enhanceur(s), pronnoteur(s), ternninateur(s), séquence de polyadénylation...) d'une séquence d'intérêt. Le fragment et les sites de restriction sont conçus pour assurer une insertion dudit fragment dans un vecteur dans un cadre de lecture approprié pour la transcription et/ou la traduction. En particulier, ledit promoteur de la cassette d'expression n'est pas un promoteur endogène de ladite microalgue du genre Chlorella transformée par le vecteur d'expression selon l'invention. A titre d'exemples de promoteurs utilisables dans le vecteur d'expression selon l'invention, on peut citer le promoteur CaMV35S, le promoteur de l'ubiquitine, le promoteur RBCS2, le promoteur de la nopaline synthase, les promoteurs de virus de chlorelles, en particulier le promoteur CaMV35S et tout particulièrement le promoteur CaMV35S de séquence SEQ ID NO : 1. On entend par - cassette d'expression hétérologue » au sens de la présente invention, une cassette d'expression comprenant une séquence d'acides nucléiques d'intérêt codant une substance d'intérêt, en particulier d'intérêt thérapeutique. La substance d'intérêt peut être un ARN ou un polypeptide d'intérêt en fonction de l'application visée. Une des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant des enzymes par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans des opérations de biopulping, biobleaching ou bioremediation. Les enzymes utilisées peuvent être d'origine hétérologue, e.g. fongique ou bactérienne, ou endogène, conduisant dans ce cas à leur sur-expression dans la microalgue du genre Chlorella transformée. Ces enzymes incluent des oxidoreductases comme les laccases (EC 1.10.3.2) ou peroxydases (EC 1.11.1.7) ayant un large spectre d'action vis-à-vis des composés aromatiques et permettant leur dégradation dans des composés de moindre toxicité. Dans la présente application, la microalgue du genre Chlorella peut être transformée par un vecteur d'expression selon l'invention dans lequel la cassette d'expression hétérologue comprend un gène (séquence d'acides nucléiques d'intérêt) codant une enzyme ou au moins 2 gènes codant des substances d'intérêts ayant une action synergique, par exemple une laccase et une lignine peroxidase (LiP) ou une laccase et une manganese peroxidase (MnP). La microalgue du genre Chlorella ainsi obtenue peut être utilisée avantageusement dans plusieurs applications industrielles. Une première application est la dépollution des effluents industriels contenant des composés aromatiques toxiques comme certains colorants utilisés dans la production du papier, du textile et du plastique, ou les hydrocarbures polycycliques aromatiques (« Polycyclic aromatic hydrocarbons » (PAHs)). La dépollution des eaux usées, en particulier la dégradation des hormones estogéniques comme estrone (El ), 17b-estradiol (E2), estriol (E3) et l'hormone de synthèse 17aethinylestradiol (EE2) peut également être réalisée par des microalgues du genre Chlorella exprimant une laccase et/ou une peroxidase. Une deuxième application desdites microalgues du genre Chlorella est la dépolymérisation des fibres de lignine pour faciliter le blanchiment par des agents chimiques (« enhance bleaching by chemicals such as chlorine ») et diminuer l'énergie nécessaire pour l'obtention de pâte à papier (« paper nnill »). Ces procédés sont connus sous les noms respectifs de biobleaching et biopulping.For the purposes of the present invention, the term "expression cassette" is intended to mean a fragment of nucleic acids, in particular DNA which can be inserted into a vector at specific restriction sites, said fragment comprising the sequences necessary for the expression of expression (enhancer (s), proneur (s), terminator (s), polyadenylation sequence ...) of a sequence of interest. The fragment and the restriction sites are designed to insure insertion of said fragment into a vector in a reading frame suitable for transcription and / or translation. In particular, said promoter of the expression cassette is not an endogenous promoter of said microalgae of the Chlorella genus transformed by the expression vector according to the invention. As examples of promoters that can be used in the expression vector according to the invention, mention may be made of the CaMV35S promoter, the ubiquitin promoter, the RBCS2 promoter, the nopaline synthase promoter and the chlorella virus promoters. , in particular the CaMV35S promoter and very particularly the CaMV35S promoter of sequence SEQ ID NO: 1. The term "heterologous expression cassette" in the sense of the present invention, an expression cassette comprising a nucleic acid sequence of interest coding a substance of interest, in particular of therapeutic interest. The substance of interest may be an RNA or a polypeptide of interest depending on the intended application. One of the applications of the present invention is to obtain microalgae of the Chlorella genus expressing enzymes by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the Chlorella genus being able to be used in biopulping operations, biobleaching or bioremediation. The enzymes used may be of heterologous origin, e.g. fungal or bacterial, or endogenous, leading in this case to their over-expression in the microalgae of the genus transformed Chlorella. These enzymes include oxidoreductases such as laccases (EC 1.10.3.2) or peroxidases (EC 1.11.1.7) with a broad spectrum of action against aromatic compounds and allowing their degradation in compounds of lower toxicity. In the present application, the microalgae of the genus Chlorella can be transformed by an expression vector according to the invention in which the heterologous expression cassette comprises a gene (nucleic acid sequence of interest) encoding an enzyme or at least 2 genes encoding substances of interest having a synergistic action, for example a laccase and a lignin peroxidase (LiP) or a laccase and a manganese peroxidase (MnP). The microalgae of the genus Chlorella thus obtained can be used advantageously in several industrial applications. A first application is the depollution of industrial effluents containing toxic aromatic compounds such as certain dyes used in the production of paper, textile and plastic, or polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). The depollution of wastewater, in particular the degradation of the estogenous hormones such as estrone (E1), 17b-estradiol (E2), estriol (E3) and the synthetic hormone 17aethinyl estradiol (EE2) can also be carried out by microalgae of the genus Chlorella expressing laccase and / or peroxidase. A second application of said microalgae of the genus Chlorella is the depolymerization of lignin fibers to facilitate bleaching by chemical agents ("enhance bleaching by chlorine-like") and to reduce the energy required to obtain pulp (" paper nnill "). These methods are known by the respective names of biobleaching and biopulping.
Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant comme substances d'intérêts, des protéines chélatrices de métaux par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans des opérations de dépollution des effluents industriels. Les protéines chélatrices peuvent être d'origine hétérologue, e.g. fongique, bactérienne, levurienne, ou endogène, conduisant dans ce cas à leur sur- expression dans la microalgue du genre Chlorella transformée. Ces protéines incluent des protéines riches en cystéine comme les métallothionéines et les phytochélatines. La microalgue du genre Chlorella ainsi obtenue peut être utilisée avantageusement dans la dépollution des effluents industriels contenant des métaux lourds comme le cadmiun, le cuivre, le plomb, le mercure, l'arsenic, le zinc, ou le nickel. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant des enzymes par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans des applications de chimie verte comme la production de briques chimiques élémentaires entrant dans la composition de polymères. Les enzymes utilisées peuvent être d'origine hétérologue, e.g. fongique ou bactérienne, ou endogène, conduisant dans ce cas à leur sur-expression dans la microalgue du genre Chlorella transformée. Dans la présente application, la microalgue du genre Chlorella peut être transformée par un vecteur d'expression selon l'invention dans lequel la cassette d'expression hétérologue comprend un gène (séquence d'acides nucléiques d'intérêt) codant une enzyme utilisant comme substrat un métabolite endogène ou au moins 2 gènes codant des substances d'intérêts ayant une action séquentielle sur ce métabolite. La microalgue du genre Chlorella ainsi obtenue peut être utilisée avantageusement dans plusieurs applications industrielles. Une première application est la production biotechnologique de polyesters biodégradables de type Polyhydroxyalkanoate (PHA). Le poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) est un premier exemple de PHA qui peut être obtenu grâce à des microalgue du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues acétyl-CoA Cacétyltransférase [EC 2.3.1.9], NADPH-dépendante acétoacétyl-CoA réductase [EC 1.1.1.36] et Polyhydroxyalkanoate synthase [EC 2.3.1.-]. Le poly(4-hydroxybutyrate) est un deuxième exemple de PHA qui peut être obtenu grâce à des microalgues du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues succinate semialdéhyde déhydrogénase [EC 1.2.1.76], 4-hydroxybutyrate déhydrogénase [EC 1.1.1.61], 4-hydroxybutyryl-CoA transférase [EC 2.8.3.a] et Polyhydroxyalkanoate synthase [EC 2.3.1.-]. Une deuxième application concernant la production de briques élémentaires entrant dans la composition de polymères est la synthèse de 2-hydroxyisobutyrate (2- HIBA). Le 2-HIBA peut être avantageusement obtenu dans le milieu de culture de microalgue du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues acétyl-CoA C-acétyltransférase [EC 2.3.1.9], NADPH-dépendante acétoacétylCoA réductase [EC 1.1.1.36] et 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase [EC 5.4.99.-]. Une troisième application concernant la production de briques élémentaires entrant dans la composition de polymères est la synthèse d'Isoprène. L'isoprène peut être avantageusement obtenu grâce à des microalgues du genre Chlorella de la présente invention exprimant l'enzyme hétérologue Isoprène synthase [EC 4.2.3.27]. La production d'isoprène peut être améliorée par la surexpression d'enzymes endogènes du métabolisme du méthyl-érythritol phosphate (MEP), e.g. l'enzyme 1-déoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase [EC 2.2.1.7] et l'enzyme 1-déoxy-D-xylulose-5-phosphate réducto-isomérase [EC 1.1.1.267]. Une quatrième application concernant la production de briques élémentaires entrant dans la composition de polymères est la synthèse de 1,3-propanediol (PDO). Le PDO peut être avantageusement obtenu grâce à des microalgues du genre Chlorella de la présente invention exprimant les enzymes hétérologues glycérol déhydratase [EC 4.2.1.30] et 1,3-propanediol déhydrogénase [EC 1.1.1.202]. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella enrichies en lipides par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans la production de biodiesel. Dans la présente application, la microalgue du genre Chlorella peut être transformée par un vecteur d'expression selon l'invention dans lequel la cassette d'expression hétérologue comprend un ou plusieurs gènes (séquence(s) d'acides nucléiques d'intérêt) codant des enzymes intervenant dans la voie des lipides et plus particulièrement dans la synthèse de triglycérides. Les enzymes d'origine endogène ou exogène permettant la réalisation de l'application peuvent être sélectionnées parmi la liste suivante : pyruvate déhydrogenase [EC 1.2.4.1], acétyl-CoA carboxylase [EC 6.4.1.2], malonyl-CoA ACP transacylase [EC 2.3.1.39], Fatty acid synthases [EC 2.3.1.-], glycérol-3-phosphate déhydrogenase [EC 1.1.1.8], glycérol-3-phosphate acyl transférase [EC 2.3.1.15], phosphatidic acid phosphatase [EC 3.1.3.4], diacylglycérol 0-acyltransférase [EC 2.3.1.20], phospholipid:diacylglycérol acyltransférase [EC 2.3.1.158].Another of the applications of the present invention is the production of microalgae of the Chlorella genus expressing as substances of interest, metal chelating proteins by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the genus Chlorella may be used in industrial effluent clearance operations. The chelating proteins may be of heterologous origin, e.g. fungal, bacterial, yeast, or endogenous, leading in this case to their overexpression in the microalgae of the genus Chlorella transformed. These proteins include cysteine-rich proteins such as metallothioneins and phytochelatines. The microalgae of the genus Chlorella thus obtained can be used advantageously in the depollution of industrial effluents containing heavy metals such as cadmium, copper, lead, mercury, arsenic, zinc, or nickel. Another of the applications of the present invention is the production of microalgae of the Chlorella genus expressing enzymes by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the Chlorella genus being able to be used in green chemistry applications. as the production of elemental chemical bricks used in the composition of polymers. The enzymes used may be of heterologous origin, e.g. fungal or bacterial, or endogenous, leading in this case to their over-expression in the microalgae of the genus transformed Chlorella. In the present application, the microalgae of the genus Chlorella can be transformed by an expression vector according to the invention in which the heterologous expression cassette comprises a gene (nucleic acid sequence of interest) coding an enzyme using as substrate an endogenous metabolite or at least 2 genes encoding substances of interest having a sequential action on this metabolite. The microalgae of the genus Chlorella thus obtained can be used advantageously in several industrial applications. A first application is the biotechnological production of biodegradable polyesters of the polyhydroxyalkanoate (PHA) type. Poly (3-hydroxybutyrate) (PHB) is a first example of PHA that can be obtained by means of microalgae of the genus Chlorella of the present invention expressing the heterologous enzymes acetyl-CoA acetyltransferase [EC 2.3.1.9], NADPH-dependent acetoacetyl -CoA reductase [EC 1.1.1.36] and Polyhydroxyalkanoate synthase [EC 2.3.1.-]. Poly (4-hydroxybutyrate) is a second example of PHA that can be obtained by microalgae of the genus Chlorella of the present invention expressing the heterologous enzymes succinate semialdehyde dehydrogenase [EC 1.2.1.76], 4-hydroxybutyrate dehydrogenase [EC 1.1. 1.61], 4-hydroxybutyryl-CoA transferase [EC 2.8.3.a] and Polyhydroxyalkanoate synthase [EC 2.3.1.-]. A second application concerning the production of elementary bricks used in the polymer composition is the synthesis of 2-hydroxyisobutyrate (2-HIBA). 2-HIBA can be advantageously obtained in the microalgae culture medium of the genus Chlorella of the present invention expressing the heterologous enzymes acetyl-CoA C-acetyltransferase [EC 2.3.1.9], NADPH-dependent acetoacetylCoA reductase [EC 1.1.1.36] and 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase [EC 5.4.99.-]. A third application concerning the production of elementary bricks used in the composition of polymers is the synthesis of Isoprene. Isoprene can be advantageously obtained by means of microalgae of the Chlorella genus of the present invention expressing the heterologous enzyme Isoprene synthase [EC 4.2.3.27]. Isoprene production can be enhanced by overexpression of endogenous enzymes of methyl-erythritol phosphate (MEP) metabolism, eg the enzyme 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase [EC 2.2.1.7] and the 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase enzyme [EC 1.1.1.267]. A fourth application concerning the production of elemental bricks used in the polymer composition is the synthesis of 1,3-propanediol (PDO). PDO can be advantageously obtained by means of microalgae of the genus Chlorella of the present invention expressing the heterologous enzymes glycerol dehydratase [EC 4.2.1.30] and 1,3-propanediol dehydrogenase [EC 1.1.1.202]. Another of the applications of the present invention is the production of microalgae of the Chlorella genus enriched in lipids by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the Chlorella genus being able to be used in the production of biodiesel. In the present application, the microalgae of the genus Chlorella can be transformed by an expression vector according to the invention in which the heterologous expression cassette comprises one or more genes (sequence (s) of nucleic acids of interest) encoding enzymes involved in the lipid pathway and more particularly in the synthesis of triglycerides. The enzymes of endogenous or exogenous origin for carrying out the application may be selected from the following list: pyruvate dehydrogenase [EC 1.2.4.1], acetyl-CoA carboxylase [EC 6.4.1.2], malonyl-CoA ACP transacylase [EC 2.3.1.39], Fatty acid synthases [EC 2.3.1.-], glycerol-3-phosphate dehydrogenase [EC 1.1.1.8], glycerol-3-phosphate acyl transferase [EC 2.3.1.15], phosphatidic acid phosphatase [EC 3.1 .3.4], diacylglycerol 0-acyltransferase [EC 2.3.1.20], phospholipid: diacylglycerol acyltransferase [EC 2.3.1.158].
Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella dont la production de dihydrogène est optimisée par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans la production de biohydrogène comme source d'énergie. La production de dihydrogène par des microalgues du genre Chlorella peut être accrue grâce à la surexpression comme substances d'intérêts d'enzymes d'origine exogène ou endogène comme la ferrédoxine hydrogénase [EC 1.12.7.2] et la pyruvate:ferrédoxine oxidoréductase [EC 1.2.7.1]. Une autre des applications de la présente invention est la modification de microalgues du genre Chlorella ayant une capacité accrue d'assimilation du dioxyde de carbone par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être utilisées dans la captation de dioxyde de carbone d'origine industrielle. L'assimilation de dioxyde de carbone par des microalgues du genre Chlorella peut être accrue grâce à la surexpression comme substance d'intérêt de l'enzyme anhydrase carbonique [EC 4.2.1.1] seule ou accompagnée de la surexpression d'un transporteur de bicarbonate. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella enrichies en lipides ayant des propriétés bénéfiques pour la santé humaine ou animale par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être obtenues par l'expression comme substances d'intérêt d'enzymes endogènes ou exogènes impliquées dans la synthèse de ces lipides. Un premier exemple de lipide d'intérêt biologique est l'acide eicosapentaénoïque (EPA) dont l'accumulation peut être favorisée dans des microalgues du genre Chlorella de la présente invention par l'expression seule ou en association d'enzymes du métabolisme lipidique comme delta 6 désaturase [EC 1.14.19.3], fatty acid elongase 6 [EC 6.2.1.3] et delta 5 désaturase [EC 1.14.19.-]. Un deuxième exemple de lipide d'intérêt biologique est l'acide docosahexaénoïque (DHA) provenant de l'acide eicosapentaénoïque. L'accumulation de DHA peut être favorisée dans des microalgues du genre Chlorella de la présente invention par l'expression seule ou en association comme substances d'intérêt d'enzymes du métabolisme des lipides comme fatty acid elongase 5 [EC 2.3.1.199] et delta 4 désaturase [EC 1.14.-.-]. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella produisant des exopolysaccharides sulfatés ayant des applications cosmétiques par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites microalgues du genre Chlorella pouvant être obtenues par l'expression comme substances d'intérêt d'enzymes endogènes ou exogènes impliquées dans la sulfatation de polysaccharides comme des sulfotransférases (EC 2.8.2.-]. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant comme substances d'intérêts des allergènes recombinants par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdits allergènes pouvant être utilisés après purification pour le diagnostique ou la désensibilisation de l'allergie. Des exemples d'allergènes pouvant être exprimés de manière native ou modifiée dans les microalgues du genre Chlorella sont des allergènes d'acariens comme Der p 1 et Der p 2, des allergènes d'animaux comme Fel d 1 du chat ou Can f 1 du chien, des allergènes de venins d'hyménoptères comme Api m 1 et Ves v 1, des allergènes de pollens végétaux comme Bet v 2 du bouleau ou Dac g 1 de la graminée Dactyle, des allergènes alimentaires comme Ara h 1 de l'arachide. Les allergènes recombinants produits par la microalgue du genre Chlorella transformée génétiquement par le procédé selon l'invention peuvent être accumulés dans la cellule ou sécrétés dans le milieu de culture lorsqu'ils présentent un peptide signal à leur extrémité amino-terminale. Les allergènes recombinants ainsi produits peuvent être utilisés comme outils de diagnostique permettant de mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre lesdits allergènes. Ces allergènes peuvent également être utilisés pour la désensibilisation de l'allergie par des traitements réalisés par voie injectable sous-cutanée ou voie sublinguale. Une autre des applications de la présente invention est l'obtention de microalgues du genre Chlorella exprimant comme substances d'intérêts des protéines recombinantes par le procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, lesdites protéines pouvant être utilisés de manière thérapeutique ou prophylactique chez l'homme ou l'animal. Ainsi, le polypeptide d'intérêt peut être un anticorps, une protéine d'enveloppe virale, une enzyme lysosomale.... Des exemples de protéines recombinantes d'utilisation thérapeutique sont l'insuline pour le traitement du diabète, l'hormone de croissance pour le traitement d'enfants de petite taille ou des anticorps ou fragments d'anticorps comme certolizumab utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ou ranibizumab utilisé dans le traitement de la dégénérescence oraculaire liée à l'âge. Des exemples de protéines recombinantes d'utilisation prophylactique sont l'antigène HBsAg utilisé dans le vaccin contre l'hépatite B ou des protéines de la capside du papillomavirus utilisées dans le vaccin contre le cancer du col de l'utérus. On entend par - séquence d'acides nucléiques stabilisatrice » au sens de la présente invention, toute séquence permettant d'obtenir un transformant stable d'une microalgue du genre Chlorella. Les séquences d'acides nucléiques stabilisatrices peuvent notamment être identifiées par le procédé d'identification de séquences d'acides nucléiques stabilisatrices selon l'invention comprenant les étapes suivantes : (i) obtention d'un transformant par transformation du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et - une séquence d'acides nucléiques endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella ; ladite séquence d'acides nucléiques endogène étant d'une longueur allant de 10pb à 300 kpb ; et (ii) détermination de la stabilité dudit transformant (par exemple par la détection de la présence dudit vecteur d'expression et/ou de ladite cassette d'expression selon l'invention dans le transformant après repiquages successifs, notamment après au moins 4, en particulier au moins 10, plus particulièrement après au moins 15 repiquages successifs et tout particulièrement après au moins 17 repiquages successifs) ; et en particulier (iii) sélection de ladite séquence d'acides nucléiques endogène permettant d'obtenir un transformant stable. On entend par - séquence endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella » au sens de la présente invention, une séquence native du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella par opposition aux séquences exogènes du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella. Ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella peut être d'une longueur allant de 10 pb (paires de bases) à 300 kpb (kilos paires de bases), en particulier allant de 10 pb à 150 kpb, plus particulièrement allant de 10 pb 100 kpb, plus particulièrement allant de 10 pb à 50 kpb, plus particulièrement allant de 10 pb à 20 kpb, plus particulièrement allant de 20 pb à 10 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 2 kpb et encore plus particulièrement allant de 100 pb à 1 kpb, encore plus particulièrement allant de 300 pb à 800 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb. Ladite séquence stabilisatrice endogène peut être une séquence codante. On entend par - séquence codante » au sens de la présente invention, toute séquence qui est transcrite en ARN et traduite en protéine. En particulier, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être un gène ou un fragment de gène.Another of the applications of the present invention is the production of microalgae of the genus Chlorella whose production of dihydrogen is optimized by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the genus Chlorella being able to be used in the biohydrogen production as a source of energy. The production of dihydrogen by microalgae of the genus Chlorella can be increased by overexpression as substances of interest for enzymes of exogenous or endogenous origin such as ferredoxin hydrogenase [EC 1.12.7.2] and pyruvate: ferredoxin oxidoreductase [EC 1.2 .7.1]. Another of the applications of the present invention is the modification of microalgae of the genus Chlorella having an increased capacity for assimilation of carbon dioxide by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the genus Chlorella being able to be used in the capture of industrial carbon dioxide. Carbon monoxide uptake by microalgae of the genus Chlorella can be enhanced by overexpression as a substance of interest for carbonic anhydrase enzyme [EC 4.2.1.1] alone or accompanied by overexpression of a bicarbonate transporter. Another of the applications of the present invention is the production of lipid-enriched Chlorella microalgae having beneficial properties for human or animal health by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the genus Chlorella can be obtained by the expression as substances of interest of endogenous or exogenous enzymes involved in the synthesis of these lipids. A first example of lipid of biological interest is eicosapentaenoic acid (EPA), the accumulation of which can be promoted in microalgae of the Chlorella genus of the present invention by the expression alone or in combination of lipid metabolism enzymes as delta 6 desaturase [EC 1.14.19.3], fatty acid elongase 6 [EC 6.2.1.3] and delta 5 desaturase [EC 1.14.19.-]. A second example of lipid of biological interest is docosahexaenoic acid (DHA) from eicosapentaenoic acid. Accumulation of DHA may be promoted in microalgae of the genus Chlorella of the present invention by the expression alone or in combination as substances of interest for lipid metabolism enzymes as fatty acid elongase [EC 2.3.1.199] and delta 4 desaturase [EC 1.14.-.-]. Another of the applications of the present invention is the production of microalgae of the Chlorella genus producing sulphated exopolysaccharides having cosmetic applications by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said microalgae of the Chlorella genus being obtainable by the expression as substances of interest for endogenous or exogenous enzymes involved in the sulfation of polysaccharides such as sulfotransferases (EC 2.8.2.-) Another application of the present invention is the production of microalgae of the genus Chlorella expressing as substances of interest for recombinant allergens by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said allergens being able to be used after purification for the diagnosis or desensitization of allergy, examples of allergens that can be expressed in a native way or modified in microalgae of the genus Chlorella are go mite genes such as Der p 1 and Der p 2, animal allergens such as Fel d 1 of the cat or Can f 1 of the dog, hymenopteran venom allergens such as Api m 1 and Ves v 1, allergens from plant pollens such as Bet v 2 of birch or Dac g 1 of grass Dactyl, food allergens such as Ara h 1 of peanut. The recombinant allergens produced by the microalgae of the genus Chlorella genetically transformed by the process according to the invention can be accumulated in the cell or secreted in the culture medium when they present a signal peptide at their amino-terminal end. The recombinant allergens thus produced can be used as diagnostic tools making it possible to demonstrate the presence of antibodies directed against said allergens. These allergens can also be used for the desensitization of allergy by treatments performed by injectable subcutaneous or sublingual route. Another of the applications of the present invention is the production of microalgae of the Chlorella genus expressing as substances of interest for recombinant proteins by the process for obtaining a stable transformant according to the invention, said proteins being able to be used therapeutically or prophylactic in humans or animals. Thus, the polypeptide of interest may be an antibody, a viral envelope protein, a lysosomal enzyme, etc. Examples of recombinant proteins for therapeutic use are insulin for the treatment of diabetes, growth hormone. for the treatment of small children or antibodies or antibody fragments such as certolizumab used in the treatment of rheumatoid arthritis or ranibizumab used in the treatment of age-related oracular degeneration. Examples of recombinant proteins for prophylactic use are the HBsAg antigen used in the hepatitis B vaccine or capsid proteins of the papillomavirus used in the cervical cancer vaccine. The term "nucleic acid sequence stabilizer" in the sense of the present invention, any sequence for obtaining a stable transformant of a microalgae of the genus Chlorella. The stabilizing nucleic acid sequences can in particular be identified by the method for identifying stabilizing nucleic acid sequences according to the invention comprising the following steps: (i) obtaining a transformant by transformation of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella by an expression vector comprising: an expression cassette, in particular a heterologous one; and an endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of said microalgae of the genus Chlorella; said endogenous nucleic acid sequence being from 10 pb to 300 kbp in length; and (ii) determining the stability of said transformant (for example by detecting the presence of said expression vector and / or said expression cassette according to the invention in the transformant after successive subcultures, in particular after at least 4, in particular at least 10, more particularly after at least 15 successive subcultures and especially after at least 17 successive subcultures); and in particular (iii) selecting said endogenous nucleic acid sequence to obtain a stable transformant. The term "endogenous sequence of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella" within the meaning of the present invention, a native sequence of the nuclear genome of a microalga of the genus Chlorella as opposed to the exogenous sequences of the nuclear genome of a microalgae of the like Chlorella. Said endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella may be from 10 bp (base pairs) to 300 kbp (kilobase pairs) in length, in particular ranging from 10 bp to 150 kbp, more particularly ranging from 10 bp 100 kbp, more particularly ranging from 10 bp to 50 kbp, more particularly ranging from 10 bp to 20 kbp, more particularly ranging from 20 bp to 10 kbp, more particularly from 50 bp to 2 bpb. kpb and even more particularly ranging from 100 bp to 1 kbp, more particularly from 300 bp to 800 bp and even more particularly from 400 bp to 750 bp. Said endogenous stabilizing sequence may be a coding sequence. For the purpose of the present invention, the term "coding sequence" is intended to mean any sequence which is transcribed into RNA and translated into protein. In particular, said endogenous stabilizing sequence may be a gene or a gene fragment.
En particulier, la dite séquence stabilisatrice endogène est une séquence codant de l'ARN ri bosornal. En particulier, ladite séquence stabilisatrice endogène est une séquence codant de l'ARN ribosomal choisie dans le groupe consistant en : - la séquence du gène codant l'ARNr 18S ; - la séquence du gène codant l'ARNr 28S ; - la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S ; et - leurs fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; tout particulièrement la séquence du gène codant l'ARNr 18S et ses fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb.In particular, the said endogenous stabilizing sequence is a sequence coding for bosornal RNA. In particular, said endogenous stabilizing sequence is a sequence coding for ribosomal RNA selected from the group consisting of: the sequence of the gene encoding 18S rRNA; the sequence of the gene encoding the 28S rRNA; the sequence of the gene encoding 5.8S rRNA; and their fragments having a length of at least 10 bp, in particular of a length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from 50 bp to 1000 bp and even more especially ranging from 400 bp to 750 bp; particularly the sequence of the 18S rRNA encoding gene and its fragments having a length of at least 10 bp, in particular of a length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from 50 bp to 1000 bp and even more particularly from 400 bp to 750 bp.
En particulier, ladite séquence stabilisatrice endogène est la seule séquence endogène de ladite microalgue du genre Chlorella comprise dans ledit vecteur d'expression. Ledit vecteur d'expression peut comprendre une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques stabilisatrices.In particular, said endogenous stabilizing sequence is the only endogenous sequence of said microalgae of the Chlorella genus included in said expression vector. Said expression vector may comprise one or more stabilizing nucleic acid sequences.
Ledit vecteur d'expression peut comprendre au moins deux, notamment uniquement deux, séquences d'acides nucléiques stabilisatrices, choisies dans le groupe consistant en : une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella, ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 300 kpb ; et - une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; en particulier les deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices étant des séquences endogènes du génome nucléaire de ladite microalgue du genre Chlorella et plus particulièrement étant les seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression. Lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices, lesdites séquences peuvent être identiques ou différentes, en particulier différentes. Lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices endogènes, lesdites séquences peuvent être du même chromosome, en particulier du même locus et tout particulièrement du même gène et encore plus particulièrement peuvent être des fragments successifs de la séquence d'un même gène.Said expression vector may comprise at least two, especially only two, stabilizing nucleic acid sequences selected from the group consisting of: an endogenous nucleic acid sequence endogenous to the nuclear genome of said microalgae of the genus Chlorella, said sequence of endogenous stabilizing nucleic acid being from 10 bp to 300 kbp in length; and - a stabilizing nucleic acid sequence having at least 80% identity with said endogenous stabilizing nucleic acid sequence throughout the length of said sequence; in particular, the two stabilizing nucleic acid sequences being endogenous sequences of the nuclear genome of said microalgae of the Chlorella genus and more particularly being the only endogenous sequences of said microalga of the Chlorella genus included in said expression vector. When said expression vector comprises at least two stabilizing nucleic acid sequences, said sequences may be identical or different, in particular different. When said expression vector comprises at least two endogenous stabilizing nucleic acid sequences, said sequences may be of the same chromosome, in particular of the same locus and very particularly of the same gene, and even more particularly may be successive fragments of the sequence of the same gene.
En particulier, lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrices endogènes, lesdites séquences peuvent être des séquences codant de l'ARN ribosomal choisies dans le groupe consistant en : - la séquence du gène codant l'ARNr 18S ; - la séquence du gène codant l'ARNr 28S ; et - la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S ; - leurs fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750pb ; tout particulièrement la séquence du gène codant l'ARNr 18S et ses fragments d'une longueur d'au moins 10 pb, en particulier d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb. En particulier, lesdites séquences stabilisatrices endogènes sont des fragments de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, notamment lesdits fragments étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; tout particulièrement, lesdits fragments étant différents et encore plus particulièrement les fragments correspondant à deux fragments successifs de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, préférentiellement lesdits fragments étant les deux seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lesdites séquences stabilisatrices endogènes sont des fragments de la séquence du gène codant l'ARNr 28S, notamment lesdits fragments étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; tout particulièrement, lesdits fragments étant différents et encore plus particulièrement les fragments correspondant à deux fragments successifs de la séquence du gène codant l'ARNr 28S, préférentiellement lesdits fragments étant les deux seules séquences endogènes de ladite microalgue du genre Chlorella comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 12 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 12, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 13, le fragment de séquence SEQ ID NO : 14. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 28S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 42 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 28S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 42, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 43, le fragment de séquence SEQ ID NO : 44. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 45 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 5,8S, en particulier de séquence SEQ ID NO° : 45. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être choisie dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 13, la séquence SEQ ID NO : 14, la séquence SEQ ID NO : 43, la séquence SEQ ID NO : 44, la séquence SEQ ID NO : 45, en particulier dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO : 13 et la séquence SEQ ID NO : 14. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 13, la séquence SEQ ID NO : 14, la séquence SEQ ID NO : 43, la séquence SEQ ID NO : 44, la séquence SEQ ID NO : 45, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella protothecoïdes comprises dans ledit vecteur d'expression.In particular, when said expression vector comprises at least two endogenous stabilizing nucleic acid sequences, said sequences may be ribosomal RNA coding sequences chosen from the group consisting of: the sequence of the gene coding for the 18S rRNA ; the sequence of the gene encoding the 28S rRNA; and the sequence of the gene encoding 5.8S rRNA; their fragments having a length of at least 10 bp, in particular of a length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from 50 bp to 1000 bp, and even more especially ranging from 400 bp to 750 bp; particularly the sequence of the 18S rRNA encoding gene and its fragments having a length of at least 10 bp, in particular of a length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from 50 bp to 1000 bp and even more particularly from 400 bp to 750 bp. In particular, said endogenous stabilizing sequences are fragments of the sequence of the 18S rRNA gene, in particular said fragments being of length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from from 50 bp to 1000 bp and even more particularly from 400 bp to 750 bp; in particular, said fragments being different and even more particularly the fragments corresponding to two successive fragments of the 18S rRNA gene sequence, preferably said fragments being the only two endogenous sequences of said Chlorella microalga included in said vector. expression. In particular, said endogenous stabilizing sequences are fragments of the sequence of the gene coding for 28S rRNA, in particular said fragments being of length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from from 50 bp to 1000 bp and even more particularly from 400 bp to 750 bp; in particular, said fragments being different and even more particularly the fragments corresponding to two successive fragments of the sequence of the gene encoding the 28S rRNA, preferentially said fragments being the only two endogenous sequences of said microalgae of the genus Chlorella included in said vector of expression. In particular, when said microalgae of the Chlorella genus is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for the 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 12 or a fragment of the sequence of the gene coding for rRNA. 18S, in particular of sequence SEQ ID NO: 12, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 13, the fragment of sequence SEQ ID NO: 14. In particular, when said microalgae of Chlorella genus is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for 28S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 42 or a fragment of the gene sequence coding for 28S rRNA, in particular of SEQ sequence ID NO: 42, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 43, the fragment of sequence SEQ ID NO: 44. In particular, when said microal Of the genus Chlorella is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be the gene sequence encoding 5.8S rRNA, in particular of SEQ ID NO: 45 or a fragment of the gene sequence encoding 5.8S rRNA. , in particular of sequence SEQ ID NO: 45. In particular, when said microalga of the Chlorella genus is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be chosen from the group consisting of: the sequence SEQ ID NO: 13, the sequence SEQ ID NO: 14, the sequence SEQ ID NO: 43, the sequence SEQ ID NO: 44, the sequence SEQ ID NO: 45, in particular in the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 13 and the sequence SEQ ID NO: 14 In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella protothecoids, the expression vector may comprise at least two endogenous stabilizing sequences, said endogenous stabilizing sequences being chosen from the consis group. both in: the sequence SEQ ID NO: 13, the sequence SEQ ID NO: 14, the sequence SEQ ID NO: 43, the sequence SEQ ID NO: 44, the sequence SEQ ID NO: 45, more particularly, said endogenous stabilizing sequences being the only endogenous sequences of said microalga Chlorella protothecoids included in said expression vector.
En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella sorokiniana, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 15 ou de séquence SEQ ID NO : 18 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 15 ou de séquence SEQ ID NO : 18, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 16, le fragment de séquence SEQ ID NO : 17, le fragment de séquence SEQ ID NO : 19, le fragment de séquence SEQ ID NO : 20. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella sorokiniana, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 16, la séquence SEQ ID NO : 17, la séquence SEQ ID NO : 19, la séquence SEQ ID NO : 20, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella sorokiniana comprises dans ledit vecteur d'expression.In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella sorokiniana, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for the 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 15 or of sequence SEQ ID NO: 18 or a fragment of the sequence of the gene coding for 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 15 or of sequence SEQ ID NO: 18, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 16, the fragment of sequence SEQ ID NO: 17, the fragment of sequence SEQ ID NO: 19, the fragment of sequence SEQ ID NO: 20. In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella sorokiniana, the expression vector may comprise at least minus two endogenous stabilizing sequences, said endogenous stabilizing sequences being chosen from the group consisting of: the sequence SEQ ID NO: 16, the sequence SEQ ID NO: 17, the sequence SEQ ID NO: 19, the sequence SEQ ID NO: 20, in particular, said endogenous stabilizing sequences being the only endogenous sequences of said microalga Chlorella sorokiniana included in said expression vector.
En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella minutissima, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 21 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 21, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 22, le fragment de séquence SEQ ID NO : 23. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella minutissima, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 22, la séquence SEQ ID NO : 23, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella minutissima comprises dans ledit vecteur d'expression.In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella minutissima, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 21 or a fragment of the sequence of the gene coding for rRNA. 18S, in particular of sequence SEQ ID NO: 21, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 22, the fragment of sequence SEQ ID NO: 23. In particular, when said microalgae of Chlorella genus is Chlorella minutissima, the expression vector may comprise at least two endogenous stabilizing sequences, said endogenous stabilizing sequences being selected from the group consisting of: the sequence SEQ ID NO: 22, the sequence SEQ ID NO: 23, especially said endogenous stabilizing sequences being the only endogenous sequences of said microalga Chlorella minutissima included in said vector of expr ession.
En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella zofingiensis, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 24 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 24, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 25, le fragment de séquence SEQ ID NO : 26. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella zofingiensis, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 25, la séquence SEQ ID NO : 26, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella zofingiensis comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella autotrophica, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 27 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 27, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 28, le fragment de séquence SEQ ID NO : 29. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella autotrophica, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 28, la séquence SEQ ID NO : 29, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella autotrophica comprises dans ledit vecteur d'expression. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella vulgaris, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 30 ou un fragment de la séquence du gène codant l'ARNr 18S, en particulier de séquence SEQ ID NO : 30, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 31, le fragment de séquence SEQ ID NO : 32. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella vulgaris, le vecteur d'expression peut comprendre au moins deux séquences stabilisatrices endogènes, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant choisies dans le groupe consistant en : la séquence SEQ ID NO : 31, la séquence SEQ ID NO : 32, tout particulièrement, lesdites séquences stabilisatrices endogènes étant les seules séquences endogènes de la dite microalgue Chlorella vulgaris comprises dans ledit vecteur d'expression.In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella zofingiensis, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for the 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 24 or a fragment of the sequence of the gene coding for rRNA. 18S, in particular of sequence SEQ ID NO: 24, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 25, the fragment of sequence SEQ ID NO: 26. In particular, when said microalgae of Chlorella genus is Chlorella zofingiensis, the expression vector may comprise at least two endogenous stabilizing sequences, said endogenous stabilizing sequences being selected from the group consisting of: sequence SEQ ID NO: 25, sequence SEQ ID NO: 26, especially , said endogenous stabilizing sequences being the only endogenous sequences of the said microalgae Chlorella zofingiensis included in the said vector of e xpression. In particular, when said microalgae of the Chlorella genus is Chlorella autotrophica, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for the 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 27 or a fragment of the sequence of the gene coding for rRNA. 18S, in particular of sequence SEQ ID NO: 27, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 28, the fragment of sequence SEQ ID NO: 29. In particular, when said microalgae of Chlorella genus is Chlorella autotrophica, the expression vector may comprise at least two endogenous stabilizing sequences, said endogenous stabilizing sequences being selected from the group consisting of: the sequence SEQ ID NO: 28, the sequence SEQ ID NO: 29, especially , said endogenous stabilizing sequences being the only endogenous sequences of the said microalgae Chlorella autotrophica included in the said vector of e xpression. In particular, when said microalgae of the Chlorella genus is Chlorella vulgaris, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for the 18S rRNA, in particular of sequence SEQ ID NO: 30 or a fragment of the sequence of the gene coding for rRNA. 18S, in particular of sequence SEQ ID NO: 30, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 31, the fragment of sequence SEQ ID NO: 32. In particular, when said microalgae of Chlorella genus is Chlorella vulgaris, the expression vector may comprise at least two endogenous stabilizing sequences, said endogenous stabilizing sequences being selected from the group consisting of: the sequence SEQ ID NO: 31, the sequence SEQ ID NO: 32, especially said endogenous stabilizing sequences being the only endogenous sequences of said microalga Chlorella vulgaris included in said expression vector.
En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant la protéine dee8 (protéine de degreening), en particulier de séquence SEQ ID NO : 33 ou un fragment de la séquence du gène codant la protéine dee8, en particulier de séquence SEQ ID NO : 33, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 34, le fragment de séquence SEQ ID NO : 35. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant la glutamine synthétase, en particulier de séquence SEQ ID NO : 36 ou un fragment de la séquence du gène codant la glutamine synthétase, en particulier de séquence SEQ ID NO : 36, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 37, le fragment de séquence SEQ ID NO : 38. En particulier, lorsque ladite microalgue du genre Chlorella est Chlorella protothecoïdes, ladite séquence stabilisatrice endogène peut être la séquence du gène codant un transporteur d'ammonium, en particulier de séquence SEQ ID NO : 39 ou un fragment de la séquence du gène codant un transporteur d'ammonium, en particulier de séquence SEQ ID NO : 39, notamment ledit fragment est choisi dans le groupe consistant en : le fragment de séquence SEQ ID NO : 40, le fragment de séquence SEQ ID NO : 41. Dans le vecteur d'expression, ladite séquence stabilisatrice peut être localisée en amont ou en aval de la cassette d'expression, en particulier en amont ou en aval de ladite séquence d'acides nucléiques d'intérêt. En particulier, lorsque ledit vecteur d'expression comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques stabilisatrice, lesdites séquences peuvent être localisées de part et d'autre de la cassette d'expression, en particulier de part et d'autre de ladite séquence d'acides nucléiques d'intérêt. Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute leur longueur en utilisant par exemple l'algorithme de Needleman and Wunsch (1970). Cette comparaison de séquences peut être effectuée par exemple à l'aide du logiciel needle en utilisant le paramètre - Gap open » égal à 10.0, le paramètre - Gap Extend » égal à 0.5 et une matrice - Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide, sous la dénomination - Align ». Ledit procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, peut comprendre en outre les étapes suivantes : (iii) isolation dudit transformant stable ; et (iv) culture dudit transformant stable. L'étape (iii) d'isolation dudit transformant stable peut être mis en oeuvre selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier telles que par une sélection clonale sur 40 gélose.In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene encoding the protein dee8 (degreening protein), in particular of sequence SEQ ID NO: 33 or a fragment of the gene sequence coding the dee8 protein, in particular of sequence SEQ ID NO: 33, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 34, the fragment of sequence SEQ ID NO: 35. said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for glutamine synthetase, in particular of sequence SEQ ID NO: 36 or a fragment of the sequence of the gene coding for glutamine synthetase, in particular of sequence SEQ ID NO: 36, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 37, the fragment of sequence SEQ ID NO: 38. In particular, when said microalgae of the genus Chlorella is Chlorella protothecoids, said endogenous stabilizing sequence may be the sequence of the gene coding for an ammonium transporter, in particular of sequence SEQ ID NO: 39 or a fragment of the gene sequence coding for an ammonium transporter, in particular of sequence SEQ ID NO: 39, in particular said fragment is chosen from the group consisting of: the fragment of sequence SEQ ID NO: 40, the fragment of sequence SEQ ID NO In the expression vector, said stabilizing sequence may be located upstream or downstream of the expression cassette, in particular upstream or downstream of said nucleic acid sequence of interest. In particular, when said expression vector comprises at least two stabilizing nucleic acid sequences, said sequences can be located on either side of the expression cassette, in particular on either side of said sequence of expression. nucleic acids of interest. The percentages of identity to which reference is made in the context of the disclosure of the present invention are determined on the basis of an overall alignment of the sequences to be compared, that is to say on an alignment of the sequences taken in their completeness over their entire length using for example the algorithm of Needleman and Wunsch (1970). This sequence comparison can be performed for example using the needle software using the parameter - Gap open "equal to 10.0, the parameter - Gap Extend" equal to 0.5 and a matrix - Blosum 62 ". For example, needle is available on the ebi.ac.uk world wide website under the name - Align ". Said process for obtaining a stable transformant according to the invention may further comprise the following steps: (iii) isolating said stable transformant; and (iv) culturing said stable transformant. The step (iii) of isolating said stable transformant can be carried out according to any technique well known to a person skilled in the art, such as by clonal selection on agar.
L'étape (iv) de culture dudit transformant peut être mis en oeuvre selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier et adaptée à ladite microalgue, en autotrophie, en hétérotrophie ou encore en mixotrophie. Certaines de ces techniques de culture sont illustrées dans les exemples de la présente demande.The step (iv) of culturing said transformant can be carried out according to any technique well known to those skilled in the art and adapted to said microalga, autotrophy, heterotrophy or in mixotrophy. Some of these culture techniques are illustrated in the examples of this application.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, ledit vecteur d'expression est le vecteur déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP (« Culture Collection of Algae and Protozoa » ; - Collection de culture d'algues et de protozoaires ») sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122. Ce vecteur correspond au plasmide nommé pAlg-CHAst-aphViii dans les exemples. Ce vecteur est notamment composé d'une cassette d'expression comportant la séquence aphVIII codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S (SEQ ID NO : 1) et le terminateur nos (SEQ ID NO : 4), ainsi que les séquences d'acides nucléiques stabilisatrices SEQ ID N : 13 et SEQ ID N : 14 du génome nucléaire de la microalgue du genre Chlorella protothecoïdes. Il possède également une origine de réplication bactérienne ainsi que le gène de résistance à la kanamycine pour la sélection des clones bactériens recombinants. La présente demande concerne également un procédé de production d'une substance d'intérêt comprenant la mise en oeuvre du procédé d'obtention d'un transformant stable selon l'invention, dans lequel ladite cassette d'expression est une cassette d'expression hétérologue comprenant une séquence d'ADN codant ladite substance d'intérêt. Les modes de réalisation particuliers sont tels que décrits ci-dessus. En particulier, ledit procédé de production d'une substance d'intérêt selon l'invention comprend la culture dudit transformant stable dans des conditions permettant l'expression de la substance d'intérêt. Ledit procédé peut comprendre en outre une étape de récupération de ladite substance d'intérêt, par exemple par purification. La présente demande concerne également un vecteur d'expression déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122. La présente demande concerne également un vecteur d'expression comprenant : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant d'une longueur allant de 10 pb à 10 kpb, en particulier allant de 20 pb à 2 kpb, plus particulièrement allant de 50 pb à 1000 pb et encore plus particulièrement allant de 400 pb à 750 pb ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant une séquence codant de l'ARN ribosonnal, en particulier la séquence du gène codant l'ARNr 18S ou un fragment de celle-ci. Les modes de réalisation particulier sont tels que décrits ci-dessus.According to a particular embodiment of the method for obtaining a stable transformant according to the invention, said expression vector is the vector deposited on December 20, 2012 at the CCAP ("Culture Collection of Algae and Protozoa"; algae and protozoa culture ") under registration number CCAP 211/122. This vector corresponds to the plasmid named pAlg-CHAst-aphVIII in the examples. This vector is in particular composed of an expression cassette comprising the aphVIII sequence coding for a selection agent placed under the control of the promoter sequence CaMV35S (SEQ ID NO: 1) and the terminator nos (SEQ ID NO: 4), as well as the nucleic acid sequences stabilizing SEQ ID N: 13 and SEQ ID N: 14 of the nuclear genome of the microalgae of the genus Chlorella protothecoids. It also has a bacterial origin of replication as well as the kanamycin resistance gene for the selection of recombinant bacterial clones. The present application also relates to a method for producing a substance of interest comprising the implementation of the method for obtaining a stable transformant according to the invention, wherein said expression cassette is a heterologous expression cassette. comprising a DNA sequence encoding said substance of interest. The particular embodiments are as described above. In particular, said process for producing a substance of interest according to the invention comprises culturing said stable transformant under conditions allowing the expression of the substance of interest. Said method may further comprise a step of recovering said substance of interest, for example by purification. The present application also relates to an expression vector deposited on December 20, 2012 at the CCAP under the registration number CCAP 211/122. The present application also relates to an expression vector comprising: an expression cassette, in particular a heterologous cassette; and an endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella and / or a nucleic acid stabilizer sequence having at least 80% identity with said endogenous stabilizing nucleic acid sequence over the entire length said sequence; said endogenous stabilizing nucleic acid sequence being of a length ranging from 10 bp to 10 kbp, in particular ranging from 20 bp to 2 kbp, more particularly ranging from 50 bp to 1000 bp and even more particularly ranging from 400 bp to 750 pb; said endogenous stabilizing nucleic acid sequence being a sequence encoding ribosomal RNA, in particular the sequence of the gene encoding 18S rRNA or a fragment thereof. The particular embodiments are as described above.
En particulier, ledit vecteur d'expression selon l'invention peut comprendre : une cassette d'expression, en particulier hétérologue ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant SEQ ID NO : 13 ; et une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella et/ou une séquence d'acides nucléiques stabilisatrice ayant au moins 80% d'identité avec ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène sur toute la longueur de ladite séquence ; ladite séquence d'acides nucléiques stabilisatrice endogène étant SEQ ID NO : 14. Les modes de réalisation particulier sont tels que décrits ci-dessus. Lesdits vecteurs d'expression selon l'invention peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention tels que décrits ci-dessus. La présente demande concerne également une microalgue, en particulier du genre Chlorella, comprenant au moins un vecteur d'expression selon l'invention, en particulier le vecteur déposé le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122. En particulier, la présente demande concerne la microalgue Chlorella protothecoïdes déposée le 20 décembre 2012 à la CCAP sous le numéro d'enregistrement CCAP 211/122.In particular, said expression vector according to the invention may comprise: an expression cassette, in particular a heterologous cassette; and an endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella and / or a nucleic acid stabilizer sequence having at least 80% identity with said endogenous stabilizing nucleic acid sequence over the entire length said sequence; said endogenous stabilizing nucleic acid sequence being SEQ ID NO: 13; and an endogenous nucleic acid sequence of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella and / or a nucleic acid stabilizer sequence having at least 80% identity with said endogenous stabilizing nucleic acid sequence over the entire length said sequence; said endogenous stabilizing nucleic acid sequence being SEQ ID NO: 14. The particular embodiments are as described above. Said expression vectors according to the invention can be used in the processes according to the invention as described above. The present application also relates to a microalgae, in particular of the genus Chlorella, comprising at least one expression vector according to the invention, in particular the vector deposited on December 20, 2012 at the CCAP under the registration number CCAP 211/122. In particular, the present application concerns the microalgae Chlorella protothecoids deposited on December 20, 2012 at the CCAP under the registration number CCAP 211/122.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront au regard des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif. La Figure 1 représente des vecteurs de transformation des microalgues du genre Chlorella. Le gène de sélection est placé sous le contrôle du promoteur CaMV35S et le terminateur de la nopaline synthase. Les séquences 1 et 2 du génome nucléaire d'une microalgue du genre Chlorella ont été clonées dans le vecteur pAlg-CHAst. La Figure 2 représente la détection des séquences d'acides nucléiques d'intérêts (transgènes) nptll (Figure 2A), aphVII (Figure 2B) et aphVIII (Figure 2C) dans les microalgues Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoïdes transformées. Les amplifications PCR ont été réalisées sur des cultures liquides de 5 microalgues transformées avec chacune des séquences d'acides nucléiques d'intérêts (transgènes) à l'aide des couples d'amorces AG013/AG084, AN362/363 et AN322/AN323. M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage. La Figure 3 représente la détection de la séquence d'acides nucléiques d'intérêt (transgène) aphVIII dans les microalgues Chlorella protothecoïdes transformées. Les amplifications PCR ont été réalisées sur des cultures liquides de Chlorella transformées après 3, 7, 9 et 14 repiquages successifs en conditions standards de culture, en hétérotrophie, et avec et sans pression de sélection. M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage ; R3, R7, R9, R14 : nombre de repiquage successif ; (+/-) : avec et sans pression de sélection.Other advantages and features of the invention will become apparent from the following examples. These examples are given for illustrative and not limiting. Figure 1 represents transformation vectors of microalgae of the genus Chlorella. The selection gene is placed under the control of the CaMV35S promoter and the terminator of nopaline synthase. Sequences 1 and 2 of the nuclear genome of a microalgae of the genus Chlorella were cloned into the pAlg-CHAst vector. Figure 2 represents the detection of nucleic acid sequences of interest (transgenes) nptII (Figure 2A), aphVII (Figure 2B) and aphVIII (Figure 2C) in microalgae Chlorella sorokiniana and Chlorella protothecoids transformed. PCR amplifications were performed on liquid cultures of microalgae transformed with each of the nucleic acid sequences of interest (transgenes) using primer pairs AG013 / AG084, AN362 / 363 and AN322 / AN323. M: size marker; T-: water control; T +: vector control; wt: wild type line. Figure 3 depicts the detection of the nucleic acid sequence of interest (transgene) aphVIII in the transformed Chlorella protothecoid microalgae. The PCR amplifications were performed on liquid Chlorella cultures transformed after 3, 7, 9 and 14 successive subcultures under standard culture conditions, in heterotrophy, and with and without selection pressure. M: size marker; T-: water control; T +: vector control; wt: wild type line; R3, R7, R9, R14: number of successive subcultures; (+/-): with and without selection pressure.
La Figure 4 représente les résultats d'amplifications PCR de la séquence d'acides nucléiques d'intérêt (transgène) aphVIII réalisées sur 3 clones transformés de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Les clones transformés ont été cryopréservés sur une période de 2 mois. Les amplifications PCR ont été réalisée sur des cultures ayant subis 4 repiquages successifs réalisés en milieu standard supplémenté en agent de sélection après la sortie de cryopréservation. M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage. La Figure 5 représente un schéma du vecteur pAlg-CHAst-aphVlII sous forme linéaire pour la transformation génétique stable de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Les barres symbolisent les amplifications PCR réalisées sur les microalgues transformées afin de montrer l'intégration du vecteur entier et intègre dans le génome de la microalgue. La Figure 6 représente les résultats d'amplifications PCR réalisées sur 3 clones transformés de la microalgue appartenant au genre Chlorella protothecoïdes (après 14 repiquages successifs en milieu standard supplémentés en agent de sélection). M : marqueur de taille ; T- : témoin eau ; T- : témoin tampon ; T+ : témoin vecteur ; wt : lignée de type sauvage ; Amplification 1 : amorces AN322/AN323 ; Amplification 2 ; amorces 367/368 ; amplification 3 : amorces 369/370 ; Amplification 4a : amorces 433/434 ; Amplification 4b : amorces 371/372. La Figure 7 représente les profils des protéines totales glycosylées chez les microalgues du genre Chlorella. Les extraits protéiques des microalgues ont été séparés sur gel SDS-PAGE et transférés sur membrane de nitrocellulose. Les glycoprotéines ont été détectées par affinodétection à l'aide de la lectine concanavaline A couplée à la peroxydase. M : marqueur de taille ; Cp : Chlorella protothecoïdes ; Cv : Chlorella vulgaris ; Cs : Chlorella sorokiniana ; T+ : échantillon de glycoprotéines.FIG. 4 represents the results of PCR amplifications of the nucleic acid sequence of interest (transgene) aphVIII carried out on 3 transformed clones of the microalga Chlorella protothecoids. The transformed clones were cryopreserved over a period of 2 months. The PCR amplifications were carried out on cultures having undergone 4 successive subcultures carried out in standard medium supplemented with selection agent after the cryopreservation exit. M: size marker; T-: water control; T +: vector control; wt: wild type line. Figure 5 shows a schematic of the pAlg-CHAst-aphVII vector in linear form for the stable genetic transformation of the microalga Chlorella protothecoids. The bars symbolize the PCR amplifications performed on the transformed microalgae in order to show the integration of the entire vector and integrate into the genome of the microalgae. FIG. 6 represents the results of PCR amplifications carried out on 3 transformed microalgae clones belonging to the genus Chlorella protothecoids (after 14 successive subcultures in standard medium supplemented with selection agent). M: size marker; T-: water control; T-: buffer control; T +: vector control; wt: wild type line; Amplification 1: primers AN322 / AN323; Amplification 2; primers 367/368; amplification 3: primers 369/370; Amplification 4a: primers 433/434; Amplification 4b: primers 371/372. Figure 7 shows the profiles of total glycosylated proteins in microalgae of the genus Chlorella. Protein extracts of microalgae were separated on SDS-PAGE gel and transferred to nitrocellulose membrane. Glycoproteins were detected by affinodetection using concanavalin A lectin coupled with peroxidase. M: size marker; Cp: Chlorella protothecoids; Cv: Chlorella vulgaris; Cs: Chlorella sorokiniana; T +: sample of glycoproteins.
EXEMPLES I. Matériel et Méthodes 1.1 Méthode de culture des microalgues du genre Chlorella en autotrophie Les souches de microalgues du genre Chlorella ont été obtenues auprès des banques UTEX, CCMP, SAG et CCAP. Les microalgues Chlorella sorokiniana (UTEX1663 ; UTEX1230), protothecoïdes (CCAP211/7A ; CCAP211/8D), autotrophica (CCMP243), vulgaris (CCAP211/11B ; SAG280), zofingiensis (CCAP211/14 ; UTEX32), Chlorella minutissima (UTEX2219) ont été rendues axéniques et clonales. Les microalgues du genre Chlorella ont été cultivées à 22°C sous un éclairage continu (280-350 pmol photonsan-2.s-1), dans un milieu de culture composé d'eau du robinet stérilisée par filtration à 0,22pm et enrichie avec le milieu nutritif Conway 1X (supplémenté de tryptone à 0,5g/L ou de KNO3 à 1,5g/L selon les espèces) et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma). Pour des volumes supérieurs à 50m1, spécifiquement de 1 à 300 litres, les cultures ont été aérées avec un mélange air/CO2 2%.EXAMPLES I. Materials and Methods 1.1 Method of cultivating microalgae of the Chlorella genus in autotrophy Chlorella microalgae strains were obtained from the UTEX, CCMP, SAG and CCAP libraries. The microalgae Chlorella sorokiniana (UTEX1663, UTEX1230), protothecoids (CCAP211 / 7A; CCAP211 / 8D), autotrophica (CCMP243), vulgaris (CCAP211 / 11B; SAG280), zofingiensis (CCAP211 / 14; UTEX32), Chlorella minutissima (UTEX2219) were have been made axenic and clonal. Microalgae of the Chlorella genus were cultured at 22 ° C. under continuous illumination (280-350 pmol photonsan-2.s-1), in a culture medium composed of sterilized tap water at 0.22 pm and enriched. with the Conway 1X nutrient medium (supplemented with 0.5 g / L tryptone or KNO3 at 1.5 g / L depending on the species) and in the BG11 commercial medium (C3061, Sigma). For volumes greater than 50m1, specifically from 1 to 300 liters, the cultures were aerated with a 2% air / CO2 mixture.
Les microalgues ont également été cultivées sur milieux géloses composés d'eau du robinet stérilisée par filtration à 0,22 [Inn et enrichie avec le milieu nutritif Conway 1X, et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma), supplémentés par 1% d'agarose. La concentration des cultures a été calculée sur cellules de comptage Mallassez (à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder) après fixation des microalgues avec une solution de Lugol. 1.2 Méthode de culture des microalgues du genre Chlorella en hétérotrophie Les microalgues du genre Chlorella capables de croitre sur un milieu supplémenté en source carbonée et en absence de lumière ont été placées dans le milieu de culture standard enrichi par 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à 22°C et à l'obscurité. La culture sur milieu gélose a été réalisée en boite de Pétri par ajout de 1% d'agarose. 1.3 Cryopréservation des microalgues du genre Chlorella Les microalgues ont été cultivées dans le milieu de culture standard jusqu'à la phase stationnaire de croissance. Elles ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 min et reprises dans le milieu de culture à raison de 100 millions de cellules par millilitre avec ajout de cryoprotectants à raison de : 5% Me01-1, 5% DMSO, 9% DMSO, 10% DMSO, selon les souches. Les microalgues cryopréservées ont été conservées à -80°C. 1.4 Préparation des vecteurs pour la transformation génétique de Chlorella Le vecteur pAlg-CHA (Figure 1) de transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, et le terminateur nos du gène de la nopaline synthase. Il a été réalisé par clonage de la séquence promotrice CaMV35S (SEQ ID NO : 1) dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen). La séquence terminateur nos (SEQ ID NO : 4) a été clonée en aval de la séquence promotrice. Les gènes nptll (SEQ ID NO : 6), aphVIII (SEQ ID NO : 5) et aphVII (SEQ ID NO : 7), codant respectivement les enzymes conférant la résistance aux antibiotiques G418, paromomycine et hygromycine, ont été insérés dans la cassette d'expression. Le schéma des vecteurs de transformation est montré sur la Figure 1. Le vecteur pAlg-CHA possède également une origine de réplication bactérienne ainsi que le gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection des clones bactériens recombinants. Le vecteur pAlg-CHAst (Figure 1) permettant la stabilisation de la transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S et le terminateur nos, ainsi que deux séquences d'ADN du génome nucléaire de la microalgue du genre Chlorella.The microalgae were also cultured on agar media consisting of sterile filtered tap water at 0.22 [Inn and enriched with Conway 1X nutrient medium, and in commercial medium BG11 (C3061, Sigma), supplemented with 1% d agarose. The culture concentration was calculated on Mallassez counting cells (using the Algenics Algae Finder software) after fixing the microalgae with a Lugol solution. 1.2 Method of cultivation of microalgae of the Chlorella genus in heterotrophy Chlorella microalgae capable of growing on medium supplemented with carbon source and in the absence of light were placed in the standard culture medium enriched with 10 g / l of glucose. The cultures were placed at 22 ° C and in the dark. The culture on agar medium was carried out in Petri dishes by adding 1% agarose. 1.3 Cryopreservation of microalgae of the Chlorella genus Microalgae were cultured in the standard culture medium until the stationary phase of growth. They were pelleted by centrifugation at 2000 g for 5 min and taken up in the culture medium at the rate of 100 million cells per milliliter with the addition of cryoprotectants at the rate of: 5% MeO0-1, 5% DMSO, 9% DMSO, 10 % DMSO, according to the strains. The cryopreserved microalgae were stored at -80 ° C. 1.4 Preparation of the vectors for the genetic transformation of Chlorella The pAlg-CHA vector (FIG. 1) for the genetic transformation of microalgae of the Chlorella genus is composed of an expression cassette comprising the sequence coding for a selection agent placed under the control of the CaMV35S promoter sequence of cauliflower mosaic virus, and the nos terminator of the nopaline synthase gene. It was carried out by cloning the promoter sequence CaMV35S (SEQ ID NO: 1) in the vector pCR2.1 (Invitrogen). The terminator sequence nos (SEQ ID NO: 4) was cloned downstream of the promoter sequence. The genes nptII (SEQ ID NO: 6), aphVIII (SEQ ID NO: 5) and aphVII (SEQ ID NO: 7), coding respectively the antibiotic resistance conferring enzymes G418, paromomycin and hygromycin, were inserted into the cassette. expression. The scheme of the transformation vectors is shown in Figure 1. The pAlg-CHA vector also has a bacterial origin of replication as well as the ampicillin resistance gene for the selection of recombinant bacterial clones. The vector pAlg-CHAst (FIG. 1) allowing the stabilization of the genetic transformation of microalgae of the Chlorella genus is composed of an expression cassette comprising the sequence coding for a selection agent placed under the control of the CaMV35S promoter sequence and the terminator nos, as well as two DNA sequences of the nuclear genome of the microalgae of the genus Chlorella.
Les fragments d'ADN du génome nucléaire 1 et 2 de la microalgue du genre Chlorella ont été amplifiés à l'aide d'amorces spécifiques définies suite à une analyse bioinformatique réalisée sur différentes microalgues. Ils ont ensuite été clonés successivement dans le vecteur de transformation. La dernière étape a consisté à cloner la cassette de sélection contenant les gènes de sélection nptll, aphVII et aphVIII, qui codent respectivement des enzymes conférant la résistance aux agents G418, hygromycine et paromomycine. Le vecteur pAlg-CHAst possède également une origine de réplication bactérienne ainsi que le gène de résistance à la kanamycine pour la sélection des clones bactériens recombinants. 1.5 Transformation des microalgues Les microalgues du genre Chlorella ont été transformées par différentes méthodes dont les principales étapes sont décrites ci-dessous. 1.5.1 Transformation des microalgues du genre Chlorella par bombardement de particules La transformation génétique de Chlorella a été réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al., 2001). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance ont été concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose à raison de 108 cellules par gélose. Les microcarriers sont des particules d'or (diamètre 0,6 pm). Ils ont été préparés selon le protocole du fournisseur (BIORAD). La précipitation de l'ADN a été réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20 mM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75 mg de particules d'or par tir. Les disques de rupture utilisés vont de 900 à 1350psi. Le vide est réalisé à 30 Hg.The DNA fragments of the nuclear genome 1 and 2 of the microalgae of the genus Chlorella were amplified using specific primers defined following a bioinformatic analysis performed on different microalgae. They were then successively cloned into the transformation vector. The final step was to clone the selection cassette containing the selection genes nptII, aphVII and aphVIII, which respectively encode G418, hygromycin and paromomycin resistance conferring enzymes. The pAlg-CHAst vector also has an origin of bacterial replication as well as the kanamycin resistance gene for the selection of recombinant bacterial clones. 1.5 Microalgae Transformation The microalgae of the genus Chlorella have been transformed by different methods whose main steps are described below. 1.5.1 Transformation of microalgae of the Chlorella genus by particle bombardment The genetic transformation of Chlorella was carried out by particle bombardment using the modified BIORAD PDS-1000 / He (Thomas et al., 2001). Chlorella cultures in exponential growth phase were concentrated by centrifugation (10 minutes, 2150g, 20 ° C), diluted in sterile water, and agar plated at 108 cells per agar. Microcarriers are gold particles (diameter 0.6 μm). They were prepared according to the supplier's protocol (BIORAD). Precipitation of the DNA was carried out by a solution containing 1.25 M CaCl 2 and 20 mM spermidine, with a ratio of 1.25 μg of DNA to 0.75 mg of gold particles per shot. The rupture discs used range from 900 to 1350 psi. The vacuum is achieved at 30 Hg.
Les microalgues ont été incubées 24 heures avant repiquage sur géloses supplémentées en agent de sélection. Elles ont ensuite été maintenues à 22°C sous éclairage constant. Après 1 à 2 semaines de culture, les clones potentiellement transformés qui se sont développés ont été repiqués sur des géloses puis en milieux liquides supplémentés en agent de sélection. 1.5.2 Transformation des microalgues du genre Chlorella par la technique d'électroporation La transformation par électroporation consiste à soumettre les microalgues à un champ électrique. Il provoque la formation de pores transitoires dans la membrane plasmique par altération de sa polarité, permettant la pénétration de l'ADN au sein de la cellule afin d'aller s'insérer dans le génome nucléaire. Deux appareils ont été utilisés. Le MicroPulser (Biorad) est un électroporateur permettant d'obtenir une gamme d'intensité des champs électriques de 200V à 3000V (0,5 à 30kVolts/cnn). Le GenePulser MXcell (Biorad) est un électroporateur en plaque 96 puits permettant de faire varier de nombreux paramètres comme le type de pulse (ondes exponentielles ou ondes carrées), la tension, la capacitance ainsi que le temps et le nombre de pulse pour les ondes carrées.The microalgae were incubated for 24 hours before transplanting onto agars supplemented with selection agent. They were then kept at 22 ° C. under constant lighting. After 1 to 2 weeks of culture, the potentially transformed clones that developed were transplanted onto agar plates and then into liquid medium supplemented with selection agent. 1.5.2 Transformation of Microalgae of the Chlorella Genus by the Electroporation Technique The transformation by electroporation consists of subjecting the microalgae to an electric field. It causes the formation of transient pores in the plasma membrane by altering its polarity, allowing the penetration of DNA into the cell to fit into the nuclear genome. Two devices were used. The MicroPulser (Biorad) is an electroporator to obtain a range of intensity of electric fields from 200V to 3000V (0.5 to 30kVolts / cnn). The GenePulser MXcell (Biorad) is a 96-well plate electroporator that can be used to vary many parameters such as pulse type (exponential waves or square waves), voltage, capacitance as well as time and pulse number for waves square.
Les cellules en phase exponentielle de croissance ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 minutes, lavées dans 5mL de tampon d'électroporation (tampon KCl 0,08M ; CaCl2 0,01M ; Hepes 0,2M ; Mannitol 0,2M ; Sorbitol 0,2M) puis resuspendues à 108 cellules par mL dans le tampon refroidi à 4°C. L'ADN plasmidique et l'ADN carrier (ADN de thymus de veau ; Sigma) ont respectivement été ajoutés à la concentration finale de 10pg/nnL et 25pg/mL. La solution a été mélangée doucement par pipetage puis incubée 5 à 10 minutes sur glace. Deux cent microlitres de solution contenant les cellules et l'ADN ont été transférés dans chaque cuve d'électroporation et soumis à un 'pulse' d'électroporation (0,5 à 30kVolts/cnn) pendant 1 ms (1 à 3 pulses). Les cuves ont alors été incubées sur glace pendant 5 à 10 minutes puis les cellules ont été resuspendues dans 3mL de milieu de culture sans antibiotique et incubées pendant 24 heures dans les conditions standards de culture. Après 24 heures, les cellules sont centrifugées, lavées avec 1001iL de milieu de culture, et étalées sur milieu sélectif gélosé ou mises en culture en flasque (5mL) en présence d'agent de sélection. 1.5.3 Transformation des microalgues du genre Chlorella par la technique du PEG La perméabilisation des cellules a été réalisée par agitation en présence de PEG (PEG 4000 (20%i, 4000M, Sigma) et PEG 6000 (15%i, 6000M, Sigma)) à différentes concentrations finales (3,5%, 10%,15% et 20%), en présence ou non de billes de verre (0,45-0,52 mm de diamètre, Sigma). La taille des billes, le temps d'agitation, le poids moléculaire du PEG ainsi que sa concentration ont été des paramètres à optimiser pour une transformation efficace de chaque microalgue. Les cellules, en phase exponentielle de croissance ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 minutes. Le culot a été lavé avec du milieu de culture et les cellules resuspendues dans du milieu à 15.106 cellules par mL. Une solution contenant 300mg de billes de verre préalablement autoclavées, 10pg d'ADN vecteur (1pg/pL) et du PEG 4000 ou PEG 6000 à différentes concentrations, a été ajoutée à la suspension cellulaire pour un volume final de 1nnL, dans un tube de centrifugation conique de 1,5mL. La solution a été mélangée brièvement par inversion du tube, agitée à 2400rpnn sur un agitateur 'Signature Pulsing Vortex Mixer' (VWR) à des durées variables (de 30 secondes à 2 minutes). Après décantation des billes de verre, le surnageant a été transféré dans des tubes de culture de 10nnL et les cellules cultivées dans 4mL milieu de culture pendant une nuit sous faible luminosité. Après 24h, les cellules ont été culotées par centrifugation, reprises dans 1001iL de milieu de culture et étalées en totalité sur milieu de sélection gélosé. 1.5.4 Transformation de protoplastes des microalgues du genre Chlorella par la technique du PEG Cent millions de cellules ont été préalablement traitées pour faire des protoplastes. Ces cellules sont centrifugées à 2000g pendant 5 min et lavées dans une solution de milieu contenant 0,6M Sorbitol/Mannitol afin d'éliminer la solution de digestion et les composants de la paroi. Les cellules ont été reprises dans 0,2mL d'une solution 0,6M Sorbitol/Mannitol contenant 50nnM de CaCl2 et transférées dans un tube à centrifugation de 1,5nnL. 10pL d'ADN plasmidique à lpg/pL et 10pL d'ADN de thymus de veau à 2,5pg/pL (Sigma) ont été ajoutés. Après 15 minutes d'incubation à température ambiante, 400pL de solution PNC (20% de PEG, 0,4mL de NaCl et 25mM CaCl2) ont été ajoutés à la suspension cellulaire et le mélange a été agité doucement pendant 30 minutes à température ambiante. 300mg de billes de verre ont été ajoutées après la solution de PNC. La suspension cellulaire a alors été agitée à 2400rpnn sur un agitateur 'Signature Pulsing Vortex Mixer' (VWR) pendant 15 secondes, le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube de 1,5mL, agité doucement pendant 30 minutes, puis 0,6mL de milieu de récupération (milieu de culture supplémenté avec 0,6M de Mannitol/Sorbitol, 1% de glucose, 1% d'extrait de levure et 1% de tryptone) a été ajouté. Les cellules ont été incubées dans le noir pendant 12h à 22°C afin de régénérer leur paroi cellulaire. La totalité des cellules ont ensuite été mises en sélection sur milieu gélosé ou liquide complémenté avec l'agent de sélection approprié. 1.5.5 Transformation des microalgues du genre Chlorella par Agrobacterium tumefaciens La souche bactérienne utilisée est la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens (Invitrogen). Les vecteurs utilisés sont le plasmide pBi121 (GenBank : AF485783.1) et le plasmide pCambia2300 (GenBank : AF234315.1). Agrobacterium tumefaciens est une bactérie qui a naturellement la capacité à transmettre et intégrer une partie de son ADN dans le génome des plantes. Cette particularité biologique a notamment été détournée pour permettre la transformation génétique des plantes. Les vecteurs plasmidiques ont été développés par insertion des séquences spécifiques reconnues par la machinerie biologique de la bactérie de part et d'autre de la séquence à intégrer dans le génome. La bactérie va pouvoir aller intégrer l'ADN d'intérêt dans le génome de la cellule hôte. Le protocole de transformation des microalgues comportent les étapes suivantes : -Transformation des agrobactéries avec les vecteurs d'intérêt et préparation de cultures bactériennes recombinantes -Préparation des cellules de Chlorella en phase exponentielle de croissance -Coculture des agrobactéries avec les microalgues sur milieu gélosé et en milieu liquide -Lavages des cellules de Chlorella et mises en culture sur milieu de sélection. 1.6 Extraction de l'ADN génomique des microalgues du genre Chlorella Les cellules ont été culotées par centrifugation (2150g, 15 minutes, 4°C). Les microalgues ont été incubées une nuit à 4°C dans 4mL de tampon TE-NaCI 1X (Tris-HCl 0,1M, EDTA 0,05M, NaCI 0,1M, pH8). 1% de SDS, Sarkosyl 1% et 0,4mg/mL de protéinase K ont été ensuite ajoutés à l'échantillon, suivi d'une incubation à 40°C pendant 90 minutes. Une première extraction au phénol-chloroforme-isoamylalcool a été effectuée pour extraire une phase aqueuse comprenant les acides nucléiques. Les ARN contenus dans l'échantillon ont été éliminés par une heure d'incubation à 60°C en présence de RNase (1 pg/mL). Une seconde extraction au phénol-chloroforme a été effectuée, suivie d'une précipitation à l'éthanol. Le culot obtenu a été séché à l'air et solubilisé dans 200pL d'eau ultrapure. La quantification de l'ADN a été réalisée par spectrophotométrie (260nm) et analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. 1.7 Analyses par amplification PCR (polymerase chain reaction) Les criblages de clones bactériens recombinants ainsi que les amplifications PCR réalisées sur des ADN purifiés ont été réalisés à l'aide des conditions suivantes. La réaction de PCR a été réalisée dans un volume final de 50pL composé de tampon PCR 1X, 0,2mM de chaque dNTP, 5pM de chaque amorce, 2Ong d'ADN matrice et 1,25U de Taq DNA polymérase (Taq DNA polymerase, Roche). Trente cycles PCR ont été effectués pour l'amplification de l'ADN matrice. La dénaturation initiale a été effectuée à 94°C pendant 5 min. Chaque cycle ultérieur consiste en une étape de dénaturation à 94°C (1 min), une étape d'hybridation des amorces à 55°C (1 min), et une étape d'élongation à 72°C (1 min). Les échantillons obtenus après la réaction de PCR ont été contrôlés sur gel d'agarose (1%) coloré au bromure d'éthidium.The cells in the exponential growth phase were pelleted by centrifugation at 2000 g for 5 minutes, washed in 5 ml of electroporation buffer (0.08 M KCl buffer, 0.01 M CaCl 2, 0.2 M Hepes, 0.2 M Mannitol, 0 Sorbitol , 2M) and then resuspended at 108 cells per mL in buffer cooled to 4 ° C. Plasmid DNA and carrier DNA (calf thymus DNA, Sigma) were respectively added at the final concentration of 10 μg / ml and 25 μg / ml. The solution was gently mixed by pipetting and incubated for 5 to 10 minutes on ice. Two hundred microliters of solution containing the cells and the DNA were transferred to each electroporation vessel and subjected to electroporation pulse (0.5 to 30 kVolts / cm) for 1 ms (1 to 3 pulses). The vats were then incubated on ice for 5 to 10 minutes then the cells were resuspended in 3 ml of culture medium without antibiotic and incubated for 24 hours under standard culture conditions. After 24 hours, the cells are centrifuged, washed with 100 μl of culture medium, and plated on selective agar medium or cultured flask (5 ml) in the presence of selection agent. 1.5.3 Transformation of microalgae of the genus Chlorella by the PEG technique Cell permeabilization was performed by stirring in the presence of PEG (PEG 4000 (20% i, 4000M, Sigma) and PEG 6000 (15% i, 6000M, Sigma )) at different final concentrations (3.5%, 10%, 15% and 20%), with or without glass beads (0.45-0.52 mm diameter, Sigma). The size of the beads, the stirring time, the molecular weight of the PEG as well as its concentration were parameters to be optimized for efficient transformation of each microalga. The cells, in the exponential growth phase, were pelleted by centrifugation at 2000 g for 5 minutes. The pellet was washed with culture medium and the cells resuspended in medium at 15 × 10 6 cells per ml. A solution containing 300 mg of autoclaved glass beads, 10 μg of vector DNA (1 μg / μl) and PEG 4000 or PEG 6000 at different concentrations, was added to the cell suspension for a final volume of 1 μl, in a tube of conical centrifugation of 1.5 mL. The solution was mixed briefly by inversion of the tube, stirred at 2400 rpm on a 'Signature Pulsing Vortex Mixer' (VWR) shaker at variable times (from 30 seconds to 2 minutes). After decantation of the glass beads, the supernatant was transferred to 10nnL culture tubes and the cells grown in 4mL culture medium overnight under low light. After 24 hours, the cells were pelleted by centrifugation, taken up in 100 ml of culture medium and completely spread on agaric selection medium. 1.5.4 Protoplast transformation of microalgae of the Chlorella genus by the PEG technique One hundred million cells were previously treated to make protoplasts. These cells are centrifuged at 2000g for 5 min and washed in a medium solution containing 0.6M Sorbitol / Mannitol to remove the digestion solution and wall components. The cells were taken up in 0.2 ml of a 0.6 M Sorbitol / Mannitol solution containing 50 nm CaCl 2 and transferred to a 1.5 nm centrifuge tube. 10 μl of plasmid DNA at lpg / μL and 10 μl of 2.5 μg / μL calf thymus DNA (Sigma) were added. After 15 minutes incubation at room temperature, 400 μl of PNC solution (20% PEG, 0.4 ml NaCl and 25 mM CaCl 2) was added to the cell suspension and the mixture was stirred gently for 30 minutes at room temperature. 300mg of glass beads were added after the PNC solution. The cell suspension was then stirred at 2400 rpm on a Signature Pulsing Vortex Mixer (VWR) for 15 seconds, the supernatant was then transferred to a new 1.5 ml tube, shaken gently for 30 minutes, then 0.6 ml. Recovery medium (culture medium supplemented with 0.6M Mannitol / Sorbitol, 1% glucose, 1% yeast extract and 1% tryptone) was added. The cells were incubated in the dark for 12 h at 22 ° C to regenerate their cell wall. All of the cells were then screened on agar medium or liquid supplemented with the appropriate selection agent. 1.5.5 Transformation of microalgae of the genus Chlorella by Agrobacterium tumefaciens The bacterial strain used is the strain LBA4404 of Agrobacterium tumefaciens (Invitrogen). The vectors used are the plasmid pBi121 (GenBank: AF485783.1) and the plasmid pCambia2300 (GenBank: AF234315.1). Agrobacterium tumefaciens is a bacterium that naturally has the ability to transmit and integrate part of its DNA into the genome of plants. This particular biological feature has been diverted to allow the genetic transformation of plants. Plasmid vectors have been developed by insertion of specific sequences recognized by the biological machinery of the bacterium on either side of the sequence to be integrated into the genome. The bacteria will be able to integrate the DNA of interest into the genome of the host cell. The microalgae transformation protocol comprises the following steps: -Transformation of agrobacteria with the vectors of interest and preparation of recombinant bacterial cultures -Preparation of Chlorella cells in the exponential phase of growth -Coculture of agrobacteria with microalgae on agar medium and in liquid medium -Lavages of Chlorella cells and cultured on selection medium. 1.6 Extraction of Genomic DNA from Chlorella Microalgae The cells were pelleted by centrifugation (2150g, 15 minutes, 4 ° C). The microalgae were incubated overnight at 4 ° C in 4 mL of 1X TE-NaCl buffer (0.1M Tris-HCl, 0.05M EDTA, 0.1M NaCl, pH8). 1% SDS, 1% Sarkosyl and 0.4 mg / ml proteinase K were then added to the sample followed by incubation at 40 ° C for 90 minutes. A first phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction was carried out to extract an aqueous phase comprising the nucleic acids. The RNAs contained in the sample were removed by one hour of incubation at 60 ° C in the presence of RNase (1 μg / ml). A second phenol-chloroform extraction was performed, followed by ethanol precipitation. The resulting pellet was air-dried and solubilized in 200 μl of ultrapure water. Quantitation of the DNA was performed spectrophotometrically (260 nm) and analyzed by agarose gel electrophoresis. 1.7 Polymerase chain reaction (PCR) analyzes The screenings of recombinant bacterial clones as well as the PCR amplifications carried out on purified DNAs were carried out using the following conditions. The PCR reaction was performed in a final volume of 50 μL composed of 1 × PCR buffer, 0.2 μM of each dNTP, 5 μM of each primer, 20 μg of template DNA and 1.25 μl of Taq DNA polymerase (Taq DNA polymerase, Roche ). Thirty PCR cycles were performed for the amplification of the template DNA. The initial denaturation was carried out at 94 ° C for 5 min. Each subsequent cycle consists of a denaturation step at 94 ° C (1 min), a primer hybridization step at 55 ° C (1 min), and an elongation step at 72 ° C (1 min). The samples obtained after the PCR reaction were checked on agarose gel (1%) stained with ethidium bromide.
Les criblages par amplification PCR sur colonies des microalgues Chlorella transformées sont réalisés à l'aide du kit - REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit » (Sigma). 1.8 Southern blot L'ADN génomique des microalgues du genre Chlorella sauvage et transformées, est digéré pendant une nuit à 37°C à l'aide de l'enzyme de restriction EcoRl. Les échantillons sont ensuite déposés sur gel d'agarose 0,8% ainsi que le marqueur de taille lambda HindlIl (D9780, Sigma). La migration est réalisée pendant 3 à 4 heures à 130 volts et à 4°C dans une solution de TAE 1X. Les ADN digérés sont contrôlés sous UV à 254nm après marquage au bromure d'éthidium.Colony PCR amplification screenings of the transformed Chlorella microalgae are carried out using the kit - REDExtract-N-Amp ™ Plant PCR Kit (Sigma). 1.8 Southern blot The genomic DNA of microalgae of the wild-type and transformed Chlorella genus are digested overnight at 37 ° C. using the restriction enzyme EcoR1. The samples are then deposited on 0.8% agarose gel and the lambda size HindIII marker (D9780, Sigma). The migration is carried out for 3 to 4 hours at 130 volts and at 4 ° C. in a 1X TAE solution. The digested DNAs are monitored under UV at 254 nm after labeling with ethidium bromide.
Le gel est ensuite incubé deux fois 5 minutes dans une solution de dépurination (0,25M HCl) sous agitation, puis rincé à l'eau UP. Le gel est ensuite incubé dans une solution de dénaturation (0,5M NaOH, 1,5M NaCl) pendant 15 minutes, rincée à l'eau UP, et finalement incubé dans la solution de neutralisation (1M Tris-HCl, 1,5M NaCl, pH7,4), deux fois 15 minutes.The gel is then incubated twice for 5 minutes in a depurination solution (0.25M HCl) with stirring and then rinsed with UP water. The gel is then incubated in a denaturation solution (0.5M NaOH, 1.5M NaCl) for 15 minutes, rinsed with UP water, and finally incubated in the neutralization solution (1M Tris-HCl, 1.5M NaCl pH 7.4), twice 15 minutes.
Les acides nucléiques sont transférés par capillarité pendant 4 heures sur une membrane de nylon (RPN303B, GE Healthcare) à l'aide d'une solution de SSC20X. L'ADN est alors fixé de manière covalente par traitement de la membrane aux UV (254nm) pendant 2 minutes.The nucleic acids are transferred by capillarity for 4 hours onto a nylon membrane (RPN303B, GE Healthcare) using a solution of SSC20X. The DNA is then covalently attached by treating the membrane with UV (254 nm) for 2 minutes.
La membrane est incubée dans la solution de pré-hybridation (SSC6X, 0,1% SDS, solution Denhart's 5X, ADN carrier 100pg/nnL) à 65°C pendant 1 heure, puis elle est placée pendant une nuit en contact avec la solution d'hybridation contenant 10Ong de la sonde marquée préalablement dénaturée pendant 10 minutes à 100°C. Le marquage de la sonde nucléique est réalisé avec le kit BrightStar Psoralen-Biotin (AM1480, Ambion).The membrane is incubated in the prehybridization solution (SSC6X, 0.1% SDS, Denhart's 5X solution, carrier DNA 100pg / nnL) at 65 ° C. for 1 hour, then it is placed overnight in contact with the solution. hybridization mixture containing 10Ong of the previously denatured labeled probe for 10 minutes at 100 ° C. The nucleic probe is labeled with the Psoralen-Biotin BrightStar kit (AM1480, Ambion).
La membrane est ensuite lavée pendant 30 minutes à 65°C dans un bain de la solution SSC6X, deux fois 30 minutes dans la solution SSC2X, 0,1% SDS, et 15 minutes dans la solution SSC0,2X, 0,1% SDS. Un rinçage est réalisé dans une solution de TBS 1X pendant 5 minutes et la membrane est saturée dans une solution de TBS, BSA 3% pendant 2 heures. L'hybridation est réalisée à l'aide d'une solution de TBS 1X, 0,05% Tween 20 contenant de la streptavidine couplée à la péroxydase (52438, Sigma) diluée au 1/10000è". Après 6 lavages de 5 minutes dans une solution de TBS 1X, 0,05% Tween 20, et un rinçage dans le TBS 1X, la révélation est réalisée à l'aide d'un kit de révélation ECL (RPN2109, GE Healthcare). 1.9 Détection de l'activité du gène gus Les cellules de la microalgue du genre Chlorella en phase exponentielle de croissance sont récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C) puis lavées avec un tampon PBS. La solution de réaction enzymatique est composée de Na2HPO4 93mM, 68mM NaH2PO4, 10nnM EDTA pH8, Triton X100 0,1%, et X-Gluc à 1nnM. Un volume de 501iL de la solution de réaction est ajouté au culot cellulaire. Les cellules sont reprises et les tubes sont incubés une nuit à 37°C. Les cellules sont ensuite observées en microscopie photonique afin de visualiser la coloration bleue dans les cellules. 1.10 Détection de la protéine fluorescente eGFP L'étude de la localisation cellulaire de la protéine eGFP en microscopie à épi- fluorescence est réalisée sur des cellules de type sauvage et transformées de Chlorella. Les fluorescences de la protéine eGFP et de la chlorophylle sont visualisées à l'aide de filtres d'excitation à 488nm, et des filtres d'émission respectivement de 500-520 et 625- 720nnn. 1.11 Extraction des protéines totales des microalgues du genre Chlorella Les cellules de la microalgue du genre Chlorella en fin de phase exponentielle de croissance ont été récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans le tampon de lyse cellulaire (Tris-HCl 0,15 M pH8, saccharose 15%, SDS 0,5%, PMSF 1nnM, cocktail inhibiteur de la protéase 1% (SIGMA)).The membrane is then washed for 30 minutes at 65 ° C. in a bath of the SSC6X solution, twice for 30 minutes in the SSC2X solution, 0.1% SDS, and 15 minutes in the SSC0.2X solution, 0.1% SDS. . Rinsing is performed in a 1X TBS solution for 5 minutes and the membrane is saturated in a solution of TBS, 3% BSA for 2 hours. Hybridization is carried out using a solution of 1X TBS, 0.05% Tween 20 containing streptavidin coupled to peroxidase (52438, Sigma) diluted to 1 / 10,000 ° C. After 6 washes of 5 minutes in a solution of 1X TBS, 0.05% Tween 20, and a rinse in 1X TBS, the revelation is performed using an ECL Revealing Kit (RPN2109, GE Healthcare) 1.9 Detection of the activity of the gus gene Chlorella microalgae cells in the exponential growth phase are recovered by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C.) and then washed with a PBS buffer The enzymatic reaction solution is composed of 93mM Na2HPO4, 68mM NaH2PO4, 10nnM EDTA pH8, 0.1% Triton X100, and 1nnM X-Gluc A volume of 501iL of the reaction solution is added to the cell pellet The cells are taken up and the tubes are incubated overnight at 37 ° C. cells are then observed by light microscopy to visualize the blue color in the 1.10 Detection of the eGFP Fluorescent Protein The study of the cellular localization of the eGFP protein by epi-fluorescence microscopy is carried out on wild-type and transformed Chlorella cells. Fluorescence of the eGFP protein and chlorophyll are visualized using 488nm excitation filters, and emission filters of 500-520 and 625-720nn, respectively. 1.11 Extraction of Total Proteins from Microalgae of the Chlorella Genes Chlorella microalgae cells at the end of the exponential growth phase were recovered by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C.). The cell pellets were resuspended in cell lysis buffer (0.15 M Tris-HCl pH8, 15% sucrose, 0.5% SDS, 1nnM PMSF, 1% Protease Inhibitor Cocktail (SIGMA)).
La lyse cellulaire a été réalisée par sonication (amplitude 30%, pulse 2 secondes) pendant 30 minutes à 4°C à l'aide de l'appareil Vibracell 750watt. Les lysats cellulaires obtenus ont été centrifugés (60 minutes, 15000g, 4°C) pour éliminer les débris cellulaires et les surnageants correspondant aux extraits de protéines totales solubles ont été récupérés. 1.12 Détection de la protéine fluorescente eGFP par immunoblotting Les échantillons protéiques des souches de type sauvage et transformées de la microalgue du genre Chlorella sont séparés sur un gel SDS-PAGE 12%. Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare) et colorées au Rouge Ponceau afin de contrôler l'efficacité du transfert. La membrane de nitrocellulose est saturée pendant 2 heures dans une solution de TBS contenant 5% de lait. L'immunodétection est effectuée à l'aide de l'anticorps anti-GFP conjugué à la peroxydase de Raifort (Santa Cruz, sc-9996-HRP) dilué au 1:2000 dans du TBS, 0,05% Tween 20, contenant 1% de lait pendant 2 heures à température ambiante. La membrane est ensuite lavée avec du TBS-Tween 0,05% (6 fois 5 minutes à température ambiante) suivi d'un lavage final avec le TBS (5 minutes à température ambiante). La détection est effectuée par la méthode de chimiluminescence (RPN2109, GE Healthcare). 1.13 Détection des anticorps monoclonaux par immunoblotting Les surnageants de culture des souches de type sauvage et transformées de la microalgue du genre Chlorella sont déposés sur un gel SDS-PAGE 12%. Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare) et colorées au Rouge Ponceau afin de contrôler l'efficacité du transfert. La membrane de nitrocellulose est saturée pendant 2 heures dans une solution de TBS contenant 5% de lait.Cell lysis was performed by sonication (amplitude 30%, pulse 2 seconds) for 30 minutes at 4 ° C. using the Vibracell 750watt apparatus. The resulting cell lysates were centrifuged (60 minutes, 15000g, 4 ° C) to remove cell debris and the supernatants corresponding to soluble total protein extracts were recovered. 1.12 Detection of the eGFP Fluorescent Protein by Immunoblotting Protein samples from the wild-type and transformed strains of the Chlorella microalgae are separated on a 12% SDS-PAGE gel. The proteins are transferred to nitrocellulose membrane (RPN303D, GE Healthcare) and stained with Rouge Ponceau to control the transfer efficiency. The nitrocellulose membrane is saturated for 2 hours in a solution of TBS containing 5% milk. Immunodetection was performed using horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Santa Cruz, sc-9996-HRP) diluted 1: 2000 in TBS, 0.05% Tween 20, containing 1 % milk for 2 hours at room temperature. The membrane is then washed with 0.05% TBS-Tween (6 times 5 minutes at room temperature) followed by a final wash with TBS (5 minutes at room temperature). Detection is performed by the chemiluminescence method (RPN2109, GE Healthcare). 1.13 Detection of monoclonal antibodies by immunoblotting The culture supernatants of the wild-type and transformed strains of the microalgae of the genus Chlorella are deposited on a 12% SDS-PAGE gel. The proteins are transferred to nitrocellulose membrane (RPN303D, GE Healthcare) and stained with Rouge Ponceau to control the transfer efficiency. The nitrocellulose membrane is saturated for 2 hours in a solution of TBS containing 5% milk.
L'immunodétection est effectuée à l'aide de l'anticorps anti-human IgG conjugué à la peroxydase de Raifort (Sigma, A6029-HRP) dilué au 1:2000 dans du TBS, 0,05% Tween 20, contenant 1% de lait pendant 2 heures à température ambiante. La membrane estensuite lavée avec du TBS-Tween 0,05% (6 fois 5 minutes à température ambiante) suivi d'un lavage final avec le TBS (5 minutes à température ambiante). La détection est effectuée par la méthode de chimiluminescence (RPN2109, GE Healthcare). 1.14 Détection des glycoprotéines l'aide de la lectine Concanavaline A Les échantillons protéiques des microalgues du genre Chlorella ont été séparés sur un gel SDS-PAGE 12%. Les protéines séparées ont été transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare) et colorées au Rouge Ponceau afin de contrôler l'efficacité du transfert. La membrane de nitrocellulose a été saturée pendant 5 minutes dans une solution de TBS Tween20 2%. L'affinodétection a été effectuée à l'aide de la lectine Concanavaline A conjugué à la peroxydase de Raifort (Sigma, L6397) dilué au 1:2000 dans du TBS, 0,05% Tween 20, 1nnM CaCl2, 1nnM MgCl2, 1nnM MnCl2, pendant 2 heures à température ambiante. La membrane a été lavée avec du TBS-Tween 0,05% (6 fois 5 minutes à température ambiante), suivi d'un lavage final avec le TBS (5 minutes à température ambiante). La détection a été effectuée par la méthode de chimiluminescence (RPN2109, GE Healthcare). 1.15 Listage des amorces spécifiques des fragments 1 et 2 des ADN génomiques des microalgues Chlorella - Table 1 Microalgue Gène Fragment 1 Fragment 2 Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) ARNr 185 AN336 : AN338 : 5'-AAGAATTCAACCTGGTTGATCCTGCC-3' 5'-AACTCGAGTTCATTCAATGACACCACC-3' AN337 : AN339 : 5'- 5'-TTGGATCCTTGATCCTTCTGCAGGTTC-3' TTGGATCCCTCGAGACAGCAAAGCCCAGGAGC3' Chlorella sorokinianaARNr (UTEX 1663) 185 AV53 : AV55 : 5'-AAGAATTCAACTGCTTTATACTGTG-3' 5'-AACTCGAGAACTTACCAGGTCCAGAC-3' AV54 : 5'- AV56 : TTGGATCCCTCGAGACTGCAGCAACTTAAATA-3' 5'-TTGGATCCTCTCCTTCTCTAGGTGG-3' Chlorella sorokinianaARNr (UTEX 1230) 185 AV57 : AV59 : 5'-AAGAATTCCCATGCATGTCTAAGTAT-3' 5'-AACTCGAGGGGATCGGCGGATGTTTC-3' AV58 : AV60 : 5'- 5'-TTGGATCCGGTGGGAGGGTTTAATG-3' TTGGATCCCTCGAGAACAGCGCCGACTCCGAG3' Chlorella ARNr 185 AV61 : AV63 : minutissima (UTEX 5'-AAGAATTCGACTCTGGCCTATCTTG-3' 5'-AACTCGAGGGGAAAACTTACCAGGTC-3' 2219) AV62 : 5'- AV64 : TTGGATCCCTCGAGAATAAAGAAAGCACTTAG-3' 5'-TTGGATCCTCTCTAGGTGGGAGGGTT-3' Chlorella ARNr 185 AV65 : AV67 : zofingiensis (CCAP 5'-AAGAATTCGCATGTCTAAGTATAAAC-3' 5'-AACTCGAGAGGCTGAAACTTAAAGG-3' 211/51) AV66 : AV68 : 5'-TTGGATCCCTCGAGGTGCACACCGAAACGGC- 3' 5'-TTGGATCCCTTCCTCTAGGTGGGAGG-3` Chlorella autotrophica (CCMP243) ARNr 185 AV69 : AV71 : 5'-AAGAATTCTATATAAACTGCTTTATAC-3' 5'-AACTCGAGTGCCGACTAGGGATCGGC-3' AV70 : 5'- AV72 : TTGGATCCCTCGAGTTTACTCAAAGTAACAGC-3' 5'-TTGGATCCGGAGGTTATGAACTTCTC-3' Chlorella vulgarisARNr 185 AV73 : AV75 : (5AG280) 5'-AAGAATTCTTGTATAAACTGCTTTATAC-3' 5'-AACTCGAGGAAATCAAAGTTTTTGGG-3' AV74 : AV76 : 5'-TTGGATCCCTCGAGAGCCCGTCCCCGGCAAC- 3' 5'-TTGGATCCGGGGTTTAATGAACTTC-3' Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) ARNr 285 AV77 : AV79 : 5'-AAGAATTCTAACGGCGAGCGAACCG-3' 5'-AACTCGAGCTAAGGCGCCCAACTGCG-3' AV78 : 5'- AV80 : TTGGATCCCTCGAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3' 5'-TTGGATCCATTTTGCCGAC-3' Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) Protéine de degreenfng Dee 8 AV81 : AV83 : 5'-AAGAATTCAGGTCAGCTCAACTGCC-3' 5'-AACTCGAGGGGAGGACCACAGGTGTATC3' AV82 : AV84 : 5'- 5'-TTGGATCCTCAGGGTTTGCACTGG-3' TTGGATCCCTCGAGGCTCACGGTATCAACAAGG- 3' Chlorella protothecoïdes (GCAP211/8D) Glutamine synthétase AV85 : AV87 : 5'-AAGAATTCAACCGGTTCAAGGACC-3' 5'-AACTCGAGACGGTGCTGGACGCGCG-3' AV86 : AV88 : 5'-TTGTCGACCTCGAGAACCGTCGTAGTTCCAG- 3' 5'-TTGTCGACTAGAGCAGCCGCGGTTGG-3' Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) Ammonium transporteu r AV89 : AV91 : 5'-AAGAATTCACACGGACATCAATGCC-3' 5'-AACTCGAGACACCACCGTGGCCGCC-3' AV90 : 5'- AV92 : TTGGATCCCTCGAGTGGGCGACCTGGCTCGG-3' 5'-TTGGATCCGTCACCTCATGCGGGTAG-3' II. Résultats 11.1 Exemple 1 : Transformation des microalgues du genre Chlorella 11.1.1 Culture des microalgues Les microalgues Chlorella sorokiniana (UTEX1663) et Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) ont été cultivées dans un milieu composé d'eau du robinet supplémenté par une solution nutritive de Conway 1X et de tryptone à 0,5g/L, ou de KNO3 à 1,5g/L selon la microalgue. Le dénombrement cellulaire a été réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.1.2 Réalisation des vecteurs d'expression pALG-CHA Le vecteur pAlg-CHA de transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence codant pour un agent de sélection placé sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S du virus de la mosaïque du chou-fleur et le ternninateur nos du gène de la nopaline synthase (Figure 1). La séquence promotrice CaMV35 (SEQ ID NO : 1) et la séquence Tnos (SEQ ID NO : 4), ont été amplifiées à partir d'un vecteur de synthèse respectivement à l'aides des couples d'amorces AV35 (5' -AAGAATTCCATGGAGTCAAAGATTC -3' ) / AV36 (5'- TTGAATTCGTCCCCCGTGTTCTCTC-3') et AV38 (5'-AAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTC-3') / AV39 (5'-TTTCATGACCGATCTAGTAACATAG-3'). Ces amorces ont également permis d'insérer le site EcoRI en 5' et en 3' du promoteur, et les sites Sacl et BspHI, en 5' et en 3' du ternninateur. Chacune des séquences a ensuite été clonée dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen). La séquence codante nptll (SEQ. ID NO : 6) du gène de résistance au G418 a été amplifiée à partir du vecteur pCR2.1 (Invitrogen) à l'aides des amorces AV43 (5'- AAG GATCCATGATTGAACAAGATG G -3' ) et AV44 (5' -TTGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCAAG -3' ) permettant d'insérer les sites de restrictions BamHI en 5' et Sacl en 3'. La séquence a ensuite été clonée dans le vecteur de transformation de Chlorella pAlg-CHA-nptll entre les séquences régulatrices CaMV35S et le ternninateur nos. La séquence codante aphVII (SEQ. ID NO : 7) a été amplifiée à partir du vecteur pChlamy (Invitrogen) à l'aide des amorces spécifiques AV45 (5'- AAGGATCCATGACACAAGAATCCCTG-3') et AV46 (5'-TTGGATCCTTATCAGGCGCCGGGGG-3') qui ont permis d'insérer le site de coupure pour l'enzyme de restriction BamHI en 5' et en 3' de la séquence. Elle a ensuite été clonée dans le vecteur de transformation de Chlorella pAlg-CHA-aphVII entre les séquences régulatrices CaMV35S et le ternninateur nos.The immunodetection is carried out using horseradish peroxidase-conjugated anti-human IgG antibody (Sigma, A6029-HRP) diluted 1: 2000 in TBS, 0.05% Tween 20, containing 1% of milk for 2 hours at room temperature. The membrane is then washed with 0.05% TBS-Tween (6 times 5 minutes at room temperature) followed by a final wash with TBS (5 minutes at room temperature). Detection is performed by the chemiluminescence method (RPN2109, GE Healthcare). 1.14 Detection of Glycoproteins Using the Concanavalin A Lectin Protein samples of Chlorella microalgae were separated on a 12% SDS-PAGE gel. The separated proteins were transferred to nitrocellulose membrane (RPN303D, GE Healthcare) and stained with Ponceau Rouge to control the transfer efficiency. The nitrocellulose membrane was saturated for 5 minutes in 2% TBS Tween20 solution. The affinodetection was carried out using horseradish peroxidase conjugated Concanavalin A lectin (Sigma, L6397) diluted 1: 2000 in TBS, 0.05% Tween 20, 1nnM CaCl 2, 1nnM MgCl 2, 1nnM MnCl 2. for 2 hours at room temperature. The membrane was washed with 0.05% TBS-Tween (6 times 5 minutes at room temperature), followed by a final wash with TBS (5 minutes at room temperature). Detection was performed by the chemiluminescent method (RPN2109, GE Healthcare). 1.15 Listing of specific primers of fragments 1 and 2 of genomic microalgae DNAs Chlorella - Table 1 Microalgae Gene Fragment 1 Fragment 2 Chlorella protothecoids (CCAP211 / 8D) 185 rRNA AN336: AN338: 5'-AAGAATTCAACCTGGTTGATCCTGCC-3 '5'-AACTCGAGTTCATTCAATGACACCACC- AN337: AN339: 5'-5'-TTGGATCCTTGATCCTTCTGCAGGTTC-3 'TTGGATCCCTCGAGACAGCAAAGCCCAGGAGC3' Chlorella sorokinianaARNr (UTEX 1663) 185 AV53: AV55: 5'-AAGAATTCAACTGCTTTATACTGTG-3 '5'-AACTCGAGAACTTACCAGGTCCAGAC-3' AV54: 5'-AV56: TTGGATCCCTCGAGACTGCAGCAACTTAAATA-3 '5'-TTGGATCCTCTCCTTCTCTAGGTGG-3' Chlorella sorokinianaARNr (UTEX 1230) 185 AV57: AV59: 5'-AAGAATTCCCATGCATGTCTAAGTAT-3 '5'-AACTCGAGGGGATCGGCGGATGTTTC-3' AV58: AV60: 5'-5'-TTGGATCCGGTGGGAGGGTTTAATG-3 ' TTGGATCCCTCGAGAACAGCGCCGACTCCGAG3 'Chlorella RNA 185 AV61: AV63: minutissima (UTEX 5'-AAGAATTCGACTCTGGCCTATCTTG-3' 5'-AACTCGAGGGGAAAACTTACCAGGTC-3 '2219) AV62: 5'-AV64: TTGGATCCCTCGAGAATAAAGAAAGCACTTAG-3' 5'-TTGGATCCTCTCTAGGTGGGAGGGTT-3 'Chl orella 185 rRNA AV65: AV67: zofingiensis (CCAP 5'-AAGAATTCGCATGTCTAAGTATAAAC-3 '5'-AACTCGAGAGGCTGAAACTTAAAGG-3' 211/51) AV66: AV68: 5'-TTGGATCCCTCGAGGTGCACACCGAAACGGC-3 '5'-TTGGATCCCTTCCTCTAGGTGGGAGG-3` Chlorella autotrophica (CCMP243 ) 185 AV69 RNA: AV71: 5'-AAGAATTCTATATAAACTGCTTTATAC-3 '5'-AACTCGAGTGCCGACTAGGGATCGGC-3' AV70: 5'-AV72: TTGGATCCCTCGAGTTTACTCAAAGTAACAGC-3 '5'-TTGGATCCGGAGGTTATGAACTTCTC-3' Chlorella vulgarisARN 185 AV73: AV75: (5AG280) 5 -AAGAATTCTTGTATAAACTGCTTTATAC-3 '5'-AACTCGAGGAAATCAAAGTTTTTGGG-3' AV74: AV76: 5'-TTGGATCCCTCGAGAGCCCGTCCCCGGCAAC-3 '5'-TTGGATCCGGGGTTTAATGAACTTC-3' Chlorella protothecoids (CCAP211 / 8D) rRNA 285 AV77: AV79: 5'-AAGAATTCTAACGGCGAGCGAACCG-3 5'-AACTCGAGCTAAGGCGCCCAACTGCG-3 'AV78: 5'-AV80: TTGGATCCCTCGAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3' 5'-TTGGATCCATTTTGCCGAC-3 'Chlorella protothecoids (CCAP211 / 8D) degreenfng Protein Dee 8 AV81: AV83: 5'-AAGAATTCAGGTCAGCTCAACTGCC-3' 5 '-AACTCGAGGGGAGGACCACAGGTGTATC3' AV82: AV84: 5'-5'-TT GGATCCTCAGGGTTTGCACTGG -3 'TTGGATCCCTCGAGGCTCACGGTATCAACAAGG- 3'Chlorella protothecoides (GCAP211 / 8D) Glutamine synthetase AV85: AV87: 5'-AAGAATTCAACCGGTTCAAGGACC -3' 5'-AACTCGAGACGGTGCTGGACGCGCG -3 'AV86: AV88: 5'-TTGTCGACCTCGAGAACCGTCGTAGTTCCAG- 3'TTGTCGACTAGAGCAGCCGCGGTTGG 5'- Chlorella Protothecoids (CCAP211 / 8D) Ammonium Carrier AV89: AV91: 5'-AAGAATTCACACGGACATCAATGCC-3 '5'-AACTCGAGACACCACCGTGGCCGCC-3' AV90: 5'-AV92: TTGGATCCCTCGAGTGGGCGACCTGGCTCGG-3 '5'-TTGGATCCGTCACCTCATGCGGGTAG-3' II . Results 11.1 Example 1: Transformation of microalgae of the genus Chlorella 11.1.1 Culture of microalgae The microalgae Chlorella sorokiniana (UTEX1663) and Chlorella protothecoids (CCAP211 / 8D) were cultivated in a medium composed of tap water supplemented with a nutrient solution of Conway 1X and tryptone at 0.5g / L, or KNO3 at 1.5g / L according to the microalgae. Cell count was performed by Malassez cell counting using the Algenics Algae Finder software. 11.1.2 Realization of the pALG-CHA expression vectors The pAlg-CHA vector for the genetic transformation of microalgae of the Chlorella genus is composed of an expression cassette comprising the sequence coding for a selection agent placed under the control of the sequence cauliflower mosaic virus CaMV35S promoter and the nopaline synthase gene terminator (Figure 1). The CaMV35 promoter sequence (SEQ ID NO: 1) and the Tnos sequence (SEQ ID NO: 4) were amplified from a synthetic vector respectively using the AV35 primer pairs (5 '-AAGAATTCCATGGAGTCAAAGATTC -3 ') / AV36 (5'-TTGAATTCGTCCCCCGTGTTCTCTC-3') and AV38 (5'-AAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTC-3 ') / AV39 (5'-TTTCATGACCGATCTAGTAACATAG-3'). These primers also made it possible to insert the EcoRI site at 5 'and 3' of the promoter, and the SacI and BspHI sites at 5 'and 3' of the terminator. Each of the sequences was then cloned into the vector pCR2.1 (Invitrogen). The coding sequence nptII (SEQ ID NO: 6) of the G418 resistance gene was amplified from the vector pCR2.1 (Invitrogen) using primers AV43 (5'-AAG GATCCATGATTGAACAAGATG G -3 ') and AV44 (5'-TTGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCAAG -3 ') for inserting BamHI restriction sites at 5' and Sacl at 3 '. The sequence was then cloned into the Chlorella pAlg-CHA-nptII transformation vector between the CaMV35S regulatory sequences and the terminator. The aphVII coding sequence (SEQ ID NO: 7) was amplified from the pChlamy vector (Invitrogen) using the specific primers AV45 (5'-AAGGATCCATGACACAAGAATCCCTG-3 ') and AV46 (5'-TTGGATCCTTATCAGGCGCCGGGGG-3' ) which made it possible to insert the cleavage site for the BamHI restriction enzyme 5 'and 3' of the sequence. It was then cloned into the Chlorella pAlg-CHA-aphVII transformation vector between the CaMV35S regulatory sequences and the terminator.
La séquence codante aphVIII (SEQ. ID NO : 5), a été amplifiée à partir d'un vecteur de synthèse à l'aide des amorces spécifiques AV41 (5'-AAGGATCCATGGACGATGCGTTGCG3') et AV42 (5'-TTGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCCAAC-3)' qui ont permis d'insérer les sites de coupure pour les enzymes BamHI en 5' et Sacl en 3'de la séquence. Cette séquence a ensuite été clonée dans le vecteur de transformation de Chlorella pAlg-CHA-aphVill entre les séquences régulatrices CaMV35S et le ternninateur nos. 11.1.3 Transformation génétique de la microalgue Chlorella Les microalgues Chlorella ont été transformées par la technique de bombardement de particules et par la technique d'électroporation, par PEG, par Agrobacterium tumefaciens, sur cellules intactes et protoplastes (Lu et al., 2011).The aphVIII coding sequence (SEQ ID NO: 5) was amplified from a synthetic vector using the AV41 (5'-AAGGATCCATGGACGATGCGTTGCG3 ') and AV42 (5'-TTGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCCAAC-3) specific primers. which made it possible to insert the cleavage sites for the BamHI 5 'and SacI enzymes at 3' of the sequence. This sequence was then cloned into the Chlorella pAlg-CHA-aphVill transformation vector between the CaMV35S regulatory sequences and the terminator. 11.1.3 Genetic transformation of Chlorella microalgae Chlorella microalgae were transformed by particle bombardment technique and by electroporation, PEG, Agrobacterium tumefaciens, intact cells and protoplasts (Lu et al., 2011). .
La transformation génétique des microalgues Chlorella a été réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al., 2001). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance ont été concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN a été réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation a été réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. La transformation génétique des microalgues Chlorella a également été réalisée par électroporation à l'aide de deux appareils, le MicroPulser (Biorad) et le GenePulser MXcell (Biorad). Les microalgues en phase exponentielle de croissance ont été culotées par centrifugation à 2000g pendant 5 minutes, lavées dans 5mL de tampon d'électroporation (tampon KCl 0,08M ; CaCl2 0,01M ; Hepes 0,2M ; Mannitol 0,2M ; Sorbitol 0,2M) puis resuspendues à 108 cellules par mL dans du tampon refroidi à 4°C. Elles ont ensuite été placées dans des cuvettes possédant des gap de 1 à 4mm, et dans une plaque 96 puits. Les vecteurs pAlg-CHA-nptll, pAlg-CHA-aphVii, pAlg-CHA-aphVIII ainsi que l'ADN carriers ont été ajouté respectivement à 10pg/nnL et 25pg/mL finale. Les microalgues en solution ont ensuite été soumises à des pulses électriques de 1nns, allant jusqu'à 25 18kVolts/cnn. La microalgue Chlorella sorokiniana a été transformée à l'aide du vecteur pAlg-CHAnptll, et Chlorella protothecoïdes à l'aide des vecteurs pAlg-CHA-aphVii et pAlg-CHAaphVIII. Les microalgues qui ont subis la transformation par bombardement de particules et 30 par électroporation ont été incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de G418, 50nng/L de paromomycine ou, 400mg/L d'hygromycine. 35 11.1.4 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella sorokiniana et protothecoïdes qui se sont développés sur les géloses de sélection ont été repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de G418, 50nng/L de paromomycine ou 400mg/L d'hygronnycine). Les clones ont ensuite été repiqués tous les 15 jours sur géloses supplémentées en agent de sélection. 11.1.5 Détection des transgènes chez la microalgue Chlorella Les transformants obtenus sur les géloses de sélection ont été repiqués dans des milieux de culture avec agent de sélection et cultivés dans les conditions standards de culture. Les analyses ont été réalisées sur les clones de Chlorella qui se sont développés après 1, 2, 3 et 4 repiquages successifs. L'insertion des séquences hétérologues nptll, aphVII, et aphVIII de résistance aux 10 agents de sélection, G418, hygromycine et paromomycine dans le génome des microalgues Chlorella a été vérifiée par des analyses PCR. La Figure 2 montre les résultats de criblage par amplification PCR de séquences spécifiques des gènes nptll, aphVII, et aphVIII obtenus pour les clones transformés de Chlorella. Les amplifications réalisées sur les tubes témoins ainsi que sur les souches non 15 transformées sont négatives. Les amplifications PCR réalisées sur les vecteurs pAlg-CHA- nptll, pAlg-CHA-aphVII et pAlg-CHA-aphViii, ont données respectivement des bandes aux tailles attendues de 311pb, 480pb et 405pb. La présence du transgène nptll dans les microalgues Chlorella sorokiniana transformées a été vérifiée à l'aide des amorces AG013 (5' -TAGCCGGATCAAGCGTATGCAG- 20 3') et AG084 (5' -ACAGACAATCGGCTGCTCTGATG-3'). Les clones obtenus présentent une amplification à la taille attendue de 311pb (Figure 2A). Ce résultat, confirmé sur les clones après 2 à 3 repiquages sur milieux frais supplémentés en agent de sélection, a validé l'insertion du transgène dans le génome de Chlorella sorokiniana. La présence des transgènes aphVII et aphVIII dans les microalgues Chlorella 25 protothecoïdes transformées a respectivement été vérifiée à l'aide des couples d'amorces AN362/AN363 (5' -ATTGATTCGGATGATTCC-3' / 5' -ATCCGGCTCATCACCAG-3') et AN322/AN323 (5' -TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3' / 5' -AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3'). Les clones obtenus présentent une amplification à la taille attendue de 480pb pour aphVII et 405pb pour aphVIII (Figure 2B et 2C). La détection des transgènes dans les microalgues a 30 été réalisée après 2 à 3 repiquages successifs sur des milieux frais supplémentés en agents de sélection ce qui a validé l'insertion des transgènes dans le génome de la microalgue. Le suivi des transformants a été réalisé par détection des transgènes nptll, aphVII et aphVIII par des amplifications PCR réalisées sur les clones transformés après des repiquages successifs des cultures. La détection des transgènes s'est révélée négative pour tous les 35 clones transformés après 3 à 4 repiquages successifs. Les analyses ont été répétées sur un plus grand nombre de clones obtenus après transformation de la microalgue Chlorella à l'aide des gènes nptll, aphVII et aphVIII. Les amplifications PCR réalisés sur des cultures issues de clones transformés donnent des résultats négatifs quelques soit le transgène, après 3 à 4 repiquages successifs. La 40 détection des transgènes n'a plu été possible pour les quelques microalgues qui ont conservé la capacité à croitre en présence de l'agent de sélection. 11.1.6 Conclusion La transformation génétique des microalgues Chlorella sorokinana et Chlorella protothecoïdes par les gènes de résistance nptll, aphVII et aphVIII a permis d'obtenir des clones transformés dans lesquels nous avons pu démontrer la présence du transgène.The genetic transformation of Chlorella microalgae was carried out by particle bombardment using the modified BIORAD PDS-1000 / He (Thomas et al., 2001). Chlorella cultures in the exponential growth phase were concentrated by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C.), diluted in sterile water, and spread on agar (at a rate of 108 cells per agar). Precipitation of the DNA was carried out by a solution containing 1.25M CaCl2 and 20nnM spermidine, with a ratio of 1.25pg of DNA per 0.75mg of microcarriers. The transformation was carried out with firing pressures ranging from 900 to 1350psi. The genetic transformation of Chlorella microalgae was also performed by electroporation using two devices, MicroPulser (Biorad) and GenePulser MXcell (Biorad). The microalgae in the exponential growth phase were pelleted by centrifugation at 2000 g for 5 minutes, washed in 5 ml of electroporation buffer (0.08 M KCl buffer, 0.01 M CaCl 2, 0.2 M Hepes, 0.2 M Mannitol, 0 Sorbitol , 2M) and then resuspended at 108 cells per mL in buffer cooled to 4 ° C. They were then placed in cuvettes with gaps of 1 to 4 mm, and in a 96-well plate. The pAlg-CHA-nptll, pAlg-CHA-aphVii, pAlg-CHA-aphVIII and carrier DNA vectors were added to 10pg / nnL and 25pg / mL, respectively. Microalgae in solution were then subjected to electrical pulses of 1nns, up to 18kVolts / cnn. The microalgae Chlorella sorokiniana was transformed using the pAlg-CHAnptll vector, and Chlorella protothecoids using the pAlg-CHA-aphVii and pAlg-CHAaphVIII vectors. Microalgae that underwent particle bombardment transformation and electroporation were incubated for 24 hours under constant illumination and at 22 ° C. The cells were then centrifuged, washed with the culture medium, and plated at 15.106 cells per agar, on agar media containing 50 ng / L of G418, 50 ng / L of paromomycin or 400 mg / L of hygromycin. 11.1.4 Selection of transformed microalgae After 15 to 21 days of culture, the potentially transformed clones of the microalgae Chlorella sorokiniana and protothecoids which developed on the selection agar plates were transplanted a first time on a fresh medium supplemented with a selection agent. (50nng / L G418, 50nng / L paromomycin or 400mg / L hygronnycin). The clones were then subcultured every 15 days on agars supplemented with selection agent. 11.1.5 Detection of transgenes in the Chlorella microalgae The transformants obtained on the selection agar plates were subcultured in culture media with a selection agent and cultured under standard culture conditions. The analyzes were carried out on the Chlorella clones which developed after 1, 2, 3 and 4 successive subcultures. Insertion of the heterologous nptII, aphVII, and aphVIII resistance sequences to the selection agents, G418, hygromycin, and paromomycin in the Chlorella microalgae genome was verified by PCR assays. Figure 2 shows the results of PCR amplification screening of specific sequences of the nptII, aphVII, and aphVIII genes obtained for transformed Chlorella clones. The amplifications performed on the control tubes as well as on the untransformed strains are negative. The PCR amplifications carried out on the pAlg-CHA-nptll, pAlg-CHA-aphVII and pAlg-CHA-aphVIII vectors gave respectively bands at the expected sizes of 311bp, 480bp and 405bp. The presence of the nptII transgene in the transformed Chlorella sorokiniana microalgae was verified using primers AG013 (5'-TAGCCGGATCAAGCGTATGCAG-3 ') and AG084 (5'-ACAGACAATCGGCTGCTCTGATG-3'). The clones obtained have an amplification at the expected size of 311bp (FIG. 2A). This result, confirmed on the clones after 2 to 3 subcultures on fresh media supplemented with selection agent, validated the insertion of the transgene into the genome of Chlorella sorokiniana. The presence of the aphVII and aphVIII transgenes in the transformed Chlorella-protothecoid microalgae was verified using the primer pairs AN362 / AN363 (5'-ATTGATTCGGATGATTCC-3 '/ 5'-ATCCGGCTCATCACCAG-3') and AN322 / AN323 (5'-TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 '/ 5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3'). The clones obtained have an amplification at the expected size of 480bp for aphVII and 405bp for aphVIII (FIGS. 2B and 2C). Detection of transgenes in microalgae was carried out after 2 to 3 successive subcultures on fresh media supplemented with selection agents, which validated the insertion of the transgenes into the microalgae genome. The transformants were monitored by detection of the nptll, aphVII and aphVIII transgenes by PCR amplifications carried out on the transformed clones after successive subcultures of the cultures. The detection of transgenes was negative for all the clones transformed after 3 to 4 successive subcultures. The analyzes were repeated on a larger number of clones obtained after transformation of the Chlorella microalgae using the nptll, aphVII and aphVIII genes. The PCR amplifications carried out on cultures derived from transformed clones give negative results, regardless of the transgene, after 3 to 4 successive subcultures. The detection of transgenes has not been possible for the few microalgae that have retained the capacity to grow in the presence of the selection agent. 11.1.6 Conclusion The genetic transformation of the Chlorella sorokinana and Chlorella protothecoid microalgae by the nptll, aphVII and aphVIII resistance genes made it possible to obtain transformed clones in which we could demonstrate the presence of the transgene.
La détection des transgènes dans le génome des microalgues a été confirmée sur 2 à 3 repiquages successifs sur les milieux de sélection. Contrairement à certains clones qui ont conservés la capacité à croitre sur agent de sélection au cours des repiquages, nous avons noté une perte de la croissance sur les milieux de sélection de la majorité des clones transformés de Chlorella.The detection of transgenes in the genome of microalgae has been confirmed on 2 to 3 successive subcultures on selection media. In contrast to some clones that retained the ability to grow on selection agent during subcultures, we noted a loss of growth on the selection media of the majority of transformed Chlorella clones.
Les analyses PCR réalisées au cours des générations successives sur les clones transformés, ont démontré la perte de la détection des transgènes dans les cultures de toutes les microalgues, quelques soit l'agent de sélection utilisé. La transformation génétique de Chlorella a été réalisée à l'aide des technologies de transformation suivantes : bombardement de particules, électroporation, PEG, Agrobacterium tumefaciens, sur cellules intactes et protoplastes. La détection de transformants a été validée pour chacune des techniques de transformation. En revanche, la détection des transgènes a été perdue dans tous les cas après 3 à 4 repiquages successifs des transformants sur milieu de sélection. La détection des transgènes dans les microalgues transformées sur plusieurs repiquages successifs a permis de démontrer une intégration du transgène dans le génome de Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoïdes. Les travaux réalisés ont également permis de mettre en évidence un problème de stabilité de l'intégration de transgène dans les microalgues du genre Chlorella. 11.2 Exemple 2 : Transformation stable des microalgues du Genre Chlorella 11.2.1 Culture des microalgues La microalgue Chlorella protothecoïdes (CCAP211 /8D) a été cultivée dans un milieu composé d'eau du robinet supplémenté par une solution nutritive de Conway 1X et par de la tryptone à 0,5g/L. Les cultures ont été placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie a été réalisée dans le milieu standard auquel ont été ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à l'obscurité et à 22°C. Le dénombrement cellulaire a été réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.2.2 Réalisation du vecteur d'expression pALG-CHAst-aphVIII Le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII de transformation génétique des microalgues du genre Chlorella est composé d'une cassette d'expression comportant la séquence aphVIII codant pour l'agent de sélection paromomycine, placée sous le contrôle de la séquence promotrice CaMV35S du virus de la mosaïque du chou fleur et le terminateur nos du gène de la nopaline synthase (Figure 1). Deux séquences d'ADN génomique de Chlorella protothécoïdes ont été clonées dans le vecteur. Les séquences d'ADN génomique 1 et 2 correspondent à deux fragments de 750 pb de l'ARNr 18S. Les amorces AN58 (5'-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3') et AN59 (5'- GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3') permettant d'amplifier la séquence ARNr 18S de Chlorella protothecoïdes ont été définies après une analyse bioinformatique des séquences disponibles dans les banques de données. Une fois séquencée, nous avons pu définir les amorces permettant d'amplifier les deux fragments d'intérêt.The PCR analyzes carried out over successive generations on the transformed clones, have demonstrated the loss of the detection of transgenes in the cultures of all the microalgae, whatever the selection agent used. The genetic transformation of Chlorella was carried out using the following transformation technologies: particle bombardment, electroporation, PEG, Agrobacterium tumefaciens, intact cells and protoplasts. The detection of transformants has been validated for each of the transformation techniques. On the other hand, the detection of the transgenes was lost in all cases after 3 to 4 successive transplants of the transformants on selection medium. The detection of transgenes in microalgae transformed on several successive transplants has demonstrated an integration of the transgene into the genome of Chlorella sorokiniana and Chlorella protothecoids. The work carried out also made it possible to highlight a problem of stability of the transgene integration in microalgae of the genus Chlorella. 11.2 Example 2: Stable transformation of microalgae of the genus Chlorella 11.2.1 Microalgae culture The microalgae Chlorella protothecoids (CCAP211 / 8D) was cultured in a medium composed of tap water supplemented with a nutrient solution of Conway 1X and with tryptone at 0.5g / L. The cultures were placed at 22 ° C under constant light. The culture in heterotrophy was carried out in the standard medium to which 10 g / l of glucose was added. The cultures were placed in the dark and at 22 ° C. Cell count was performed by Malassez cell counting using the Algenics Algae Finder software. 11.2.2 Realization of the expression vector pALG-CHAst-aphVIII The vector pAlg-CHAst-aphVIII of genetic transformation of microalgae of the genus Chlorella is composed of an expression cassette comprising the aphVIII sequence encoding the selection agent paromomycin , placed under the control of CaMV35S promoter sequence of cauliflower mosaic virus and nos terminator of the nopaline synthase gene (Figure 1). Two genomic DNA sequences of Chlorella protothecoids were cloned into the vector. Genomic DNA sequences 1 and 2 correspond to two 750 bp fragments of 18S rRNA. The primers AN58 (5'-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 ') and AN59 (5'-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3') making it possible to amplify the 18S rRNA sequence of Chlorella protothecoids were defined after a bioinformatic analysis of the sequences available in the databases. Once sequenced, we were able to define the primers to amplify the two fragments of interest.
Les deux séquences ont été amplifiées sur l'ADN génomique de la microalgue Chlorella protothecoïdes à l'aide des amorces AN336/AN337 (5'- AAGAATTCAACCTG GTTGATCCTG CC -3' / 5' -TTG GATCCCTCGAGACAG CAAAG CCCAG GAG C-3 ' ) et AN338/AN339 (5' -AACTCGAGTTCATTCAATGACACCACC -3 ' / 5'- TTGGATCCTTGATCCTTCTGCAGGTTC-3').Both sequences were amplified on the genomic DNA of the microalgae Chlorella protothecoids using primers AN336 / AN337 (5'-AAGAATTCAACCTG GTTGATCCTG CC -3 '/ 5'-TTG GATCCCTCGAGACAG CAAAG CCCAG GAG C-3') and AN338 / AN339 (5'-AACTCGAGTTCATTCAATGACACCACC -3 '/ 5'-TTGGATCCTTGATCCTTCTGCAGGTTC-3').
Le fragment 1 a été cloné à l'aide des sites EcoRI et BamHI insérés par PCR, dans le vecteur pAlg-CHAst. Ce vecteur est issu du vecteur commercial pCambia2300 dans lequel la cassette de sélection des transformants p35S-nptll-T35S a été éliminée par digestion par l'enzyme Asel. Le site Xhol a également été inséré en 3' de la séquence, en amont du site BamHI, afin de réaliser la suite des clonages. Le fragment d'ADN génomique 2 a également été cloné dans le vecteur pAlg-CHAst à l'aide des sites Xhol et BamHI insérés au cours de la PCR. La cassette de sélection CaMV35S-aphViii-Tnos a été amplifiée par PCR à partir du vecteur pAlg-CHA-aphVIII pour être finalement clonée dans le vecteur pAlg-CHAst en Xhol après insertion des sites en 5' et en 3'à l'aide des amorces AV37 (5'- AACTCGAGCATGGAGTCAAAGATTC-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3' ). La figure 1 schématise la carte du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII. 11.2.3 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique de la microalgue Chlorella protothecoïdes a été réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance ont été concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20° C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN a été réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation a été réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. La microalgue Chlorella protothecoïdes a été transformée à l'aide du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII sous forme circulaire et sous forme linéaire (digestion par Nhel).Fragment 1 was cloned using the EcoRI and BamHI sites inserted by PCR into the pAlg-CHAst vector. This vector is derived from the pCambia2300 commercial vector in which the p35S-nptII-T35S transformants selection cassette was removed by digestion with the enzyme Asel. The XhoI site was also inserted 3 'of the sequence, upstream of the BamHI site, in order to carry out the cloning sequence. The genomic DNA fragment 2 was also cloned into the pAlg-CHAst vector using the XhoI and BamHI sites inserted during the PCR. The CaMV35S-aphVIII-Tnos selection cassette was amplified by PCR from the pAlg-CHA-aphVIII vector to be finally cloned into the pAlg-CHAst vector in XhoI after insertion of the 5 'and 3' sites using primers AV37 (5'-AACTCGAGCATGGAGTCAAAGATTC-3 ') and AV40 (5'-TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3'). FIG. 1 schematizes the map of the vector pAlg-CHAst-aphVIII. 11.2.3 Genetic transformation of the Chlorella microalgae The genetic transformation of the microalgae Chlorella protothecoids was carried out by particle bombardment using the modified BIORAD PDS-1000 / He (Thomas et al (2001)). Chlorella cultures in the exponential growth phase were concentrated by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C.), diluted in sterile water, and spread on agar (at a rate of 108 cells per agar). Precipitation of the DNA was carried out by a solution containing 1.25M CaCl2 and 20nnM spermidine, with a ratio of 1.25pg of DNA per 0.75mg of microcarriers. The transformation was carried out with firing pressures ranging from 900 to 1350psi. The microalgae Chlorella protothecoids was transformed using the pAlg-CHAst-aphVIII vector in circular form and in linear form (NheI digestion).
Les microalgues qui ont subis la transformation par bombardement de particules ont été incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.2.4 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella protothecoïdes qui se sont développés sur les géloses de sélection ont été repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones ont ensuite été repiqués tous les 10 à 15 jours sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils ont également été placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones ont à la fois été repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones ont été placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes a été réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.2.5 Stabilité de la détection des transgènes chez la microalgue Chlorella L'intégration du transgène dans le génome de la microalgue Chlorella et la stabilité de l'intégration ont été vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés de la microalgue, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et en condition hétérotrophe. 11.2.6 Insertion stable du transgène dans le génome de Chlorella Les microalgues Chlorella ont été repiquées 17 fois successivement dans le milieu de culture standard en présence ou absence de l'antibiotique de sélection paromomycine. L'entretien des clones transformés analysés ici représente 8 mois de culture. Les microalgues Chlorella transformées ont également été placées en culture en condition d'hétérotrophie par ajout de glucose dans le milieu de culture à raison de 10g/L, sur une période de 3 mois, en présence et en absence d'agent de sélection.The microalgae that underwent transformation by particle bombardment were incubated for 24 hours under constant illumination and at 22 ° C. The cells were then centrifuged, washed with the culture medium, and plated at 15.106 cells per agar, on agar media containing 50 ng / l of paromomycin. 11.2.4 Selection of transformed microalgae After 15 to 21 days of culture, the potentially transformed clones of the Chlorella protothecoid microalgae that developed on the selection agar plates were subcultured once on a fresh medium supplemented with selection agent (50 ng / ml). L paromomycin). The clones were then transplanted every 10 to 15 days on selection agar plates and from the third subculture, they were also placed in liquid medium in the presence of selection agent. After 4 successive subcultures, the clones were both subcultured on media with and without a selection agent. After 5 rounds of subculture, the clones were placed in culture under heterotrophic conditions with and without selection agent. The monitoring of transgene detection was carried out after each transplanting and this in order to define the stability of the detection of transgenes in the genome of transformed microalgae. 11.2.5 Stability of Transgene Detection in Chlorella Microalgae Integration of the transgene into the Chlorella microalgae genome and stability of integration were verified by PCR amplification on transformed microalgae clones, transplanted into media of culture with and without selection agent, grown under standard culture conditions and in heterotrophic conditions. 11.2.6 Stable insertion of the transgene into the Chlorella genome The Chlorella microalgae were subcultured 17 times in the standard culture medium in the presence or absence of the paromomycin selection antibiotic. The maintenance of the transformed clones analyzed here represents 8 months of culture. Chlorella microalgae transformed were also placed in culture in heterotrophic condition by adding glucose in the culture medium at a rate of 10 g / L, over a period of 3 months, in the presence and absence of selection agent.
La stabilité de la détection du transgène dans le génome des chlorelles transformées à été vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces AN322 (5'- TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifique de la séquence codante aphVIII (figure 3). Les amplifications PCR réalisées sur les clones transformées après 3, 9 et 14 repiquages successifs, avec et sans agent de sélection, montrent une détection constante à 405pb correspondant au transgène. La détection des transgènes a été validée sur des cultures après 17 repiquages successifs (Données non montrées). Ces résultats démontrent la stabilité de l'intégration du transgène dans le génome de la microalgue d'intérêt industriel Chlorella protothecoïdes. 11.2.7 Stabilité de la détection des transgènes après cryopréservation des microalgues transformées Les clones transformés de la microalgue Chlorella protothecoïdes ont été cryopréservés à -80°C. Afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes dans le génome de la microalgue, des analyses PCR ont été réalisées sur des cultures après 4 repiquages successifs, issues des clones cryopréservés pendant 2 mois. La figure 4 montre la détection du transgène dans tous les clones analysés démontrant ainsi la stabilité de l'intégration des transgènes après un passage en cryoconservation. 11.2.8 Insertion stable de la totalité du vecteur de manière aléatoire dans le génome de Chlorella L'insertion stable du vecteur pALG-CHAst-aphVIII a été vérifiée dans les microalgues Chlorella transformées et régulièrement repiquées dans le milieu de culture standard en présence l'antibiotique de sélection paromomycine. La détection du gène de sélection et du reste du vecteur dans le génome des chlorelles transformées a été réalisée par amplification PCR à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques de la séquence du vecteur. La figure 5 schématise les amplifications PCR réalisées sur l'ensemble du vecteur de transformation pAlg-CHAst-aphVIII. L'amplification 1 correspond à la mise en évidence de la présence du transgène aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR réalisées à l'aide des amorces AN322 (5'- TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifiques du transgène aphVIII sont représentées sur la figure 6. Les amplifications obtenues pour les 3 clones de la microalgue Chlorella transformées avec le vecteur pAlg-CHAst-aphVill ont permis d'obtenir une bande à la taille attendue de 405pb, visible également pour l'amplification réalisée sur le vecteur témoin. Aucune amplification n'a été obtenue pour la microalgue non transformée. Ce résultat montre que les microalgues ont bien incorporé le transgène aphVIII qui confère la résistance à la paromomycine. Les amplifications 2 et 3 correspondent à la mise en évidence de la présence des séquences de deux gènes présents dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR réalisées à l'aide des couples d'amorces AN367 (5'- AACGCATGAAGGTTATCG-3') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC-3') et AN369 (5'- ACAAAGATGTTGCTGTCTCC -3' ) / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC -3' ) respectivement spécifiques des gènes 1 et 2 présents sur le vecteur pAlg-CHAst-aphViii et de part et d'autre du transgène aphVIII, sont représentées sur la figure 6. Les amplifications réalisées sur les microalgues non transformées n'ont pas donné de résultat. Pour les 3 clones de la microalgue Chlorella transformées, des amplifications aux tailles attendues, respectivement 292 et 497pb, ont été obtenues, visibles également pour les amplifications réalisées sur le vecteur pAlg-CHAst-aphViii. Ce résultat montre que les microalgues ont bien incorporé de manière stable l'ensemble du vecteur de transformation.The stability of the detection of the transgene in the genome of the transformed chlorella was verified by PCR amplification using primers AN322 (5'-TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 ') and AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') specific for the sequence. coding aphVIII (Figure 3). The PCR amplifications carried out on the clones transformed after 3, 9 and 14 successive subcultures, with and without a selection agent, show a constant detection at 405bp corresponding to the transgene. Detection of transgenes was validated on cultures after 17 successive transplants (Data not shown). These results demonstrate the stability of transgene integration in the genome of the microalga of industrial interest Chlorella protothecoids. 11.2.7 Stability of transgene detection after cryopreservation of transformed microalgae The transformed clones of the microalgae Chlorella protothecoids were cryopreserved at -80 ° C. In order to validate the stability of the integration of transgenes into the genome of the microalgae, PCR analyzes were carried out on cultures after 4 successive subcultures, derived from cryopreserved clones for 2 months. FIG. 4 shows the detection of the transgene in all the analyzed clones thus demonstrating the stability of the integration of the transgenes after a passage in cryopreservation. 11.2.8 Stable insertion of the entire vector randomly into the Chlorella genome The stable insertion of the vector pALG-CHAst-aphVIII was verified in the microalgae Chlorella transformed and regularly subcultured in the standard culture medium in the presence of selection antibiotic paromomycin. Detection of the selection gene and the rest of the vector in the genome of the transformed chlorella was carried out by PCR amplification using different pairs of primers specific for the sequence of the vector. FIG. 5 schematizes the PCR amplifications carried out on the entire pAlg-CHAst-aphVIII transformation vector. Amplification 1 corresponds to the demonstration of the presence of the transgene aphVIII in transformed microalgae Chlorella. The PCR amplifications carried out using primers AN322 (5'-TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 ') and AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') specific for the transgene aphVIII are shown in FIG. 6. The amplifications obtained for the 3 clones of Chlorella microalgae transformed with the vector pAlg-CHAst-aphVill allowed to obtain a band at the expected size of 405bp, also visible for the amplification performed on the control vector. No amplification was obtained for the untransformed microalgae. This result shows that the microalgae have incorporated the aphVIII transgene which confers resistance to paromomycin. Amplifications 2 and 3 correspond to the demonstration of the presence of the sequences of two genes present in the pAlg-CHAst-aphVIII vector in the transformed Chlorella microalgae. The PCR amplifications carried out using the primer pairs AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3 ') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC-3') and AN369 (5'-ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3 ') / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC -3 'respectively specific for the genes 1 and 2 present on the pAlg-CHAst-aphVIII vector and on either side of the aphVIII transgene, are shown in FIG. 6. The amplifications carried out on the non-transformed microalgae do not have not yielded results. For the 3 clones of the transformed Chlorella microalgae, amplifications at the expected sizes, respectively 292 and 497bp, were obtained, also visible for the amplifications carried out on the pAlg-CHAst-aphVIII vector. This result shows that the microalgae have stably incorporated the entire transformation vector.
Les amplifications 4a et 4b correspondent à la mise en évidence de la présence de la cassette de sélection entre les fragments 1 et 2 dans le vecteur de transformation dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR réalisées à l'aide des couples d'amorces AN433 (5'- TTTAATGTACTGAATTAACG -3' ) / AN434 (5' -TAATAATTAACATGTAATGC-3') et AN371 (5' - TCACAACCGGGATACCGACC-3') / AN372 (5' -ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3' ) permettent respectivement d'amplifier les parties 5' et 3' de la cassette d'expression aphVIII du vecteurs pAlg-CHAst-aphVIII, en englobant les séquences 1 et 2 du génome de Chlorella (Figure 5). Les résultats obtenus, présentés sur la figure 6, montrent qu'aucune amplification n'a été obtenue pour les microalgues non transformées. En revanche, pour les 3 clones de la microalgue Chlorella transformées, des amplifications aux tailles attendues, respectivement 1103 et 1519pb, ont été obtenues, visible également pour les amplifications réalisées sur le vecteur témoin. Ce résultat montre que la cassette d'expression aphVIII s'est insérée aléatoirement dans le génome de la microalgue.Amplifications 4a and 4b correspond to the demonstration of the presence of the selection cassette between fragments 1 and 2 in the transformation vector in transformed Chlorella microalgae. The PCR amplifications carried out using the primer pairs AN433 (5'-TTTAATGTACTGAATTAACG -3 ') / AN434 (5'-TAATAATTAACATGTAATGC-3') and AN371 (5'-TCACAACCGGGATACCGACC-3 ') / AN372 (5' -ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3 ') respectively make it possible to amplify the 5' and 3 'portions of the aphVIII expression cassette of the pAlg-CHAst-aphVIII vectors, including sequences 1 and 2 of the Chlorella genome (FIG. 5). The results obtained, presented in FIG. 6, show that no amplification has been obtained for the non-transformed microalgae. On the other hand, for the 3 clones of the microalgae Chlorella transformed, amplifications to the expected sizes, respectively 1103 and 1519bp, were obtained, also visible for the amplifications carried out on the control vector. This result shows that the aphVIII expression cassette was randomly inserted into the microalgae genome.
De plus, ce résultat, couplé à ceux obtenus précédemment, montrent que les microalgues ont bien incorporé de manière stable et aléatoire l'ensemble du vecteur pAlgCHAst-aphVIII de manière intègre. Ces résultats, validés sur les clones transformés à l'aide de l'ADN plasmidique sous forme circulaire et linéaire, confirment que l'intégration dans le génome a été réalisée de manière aléatoire. 11.2.8 Conclusion La transformation génétique de la microalgue Chlorella protothecoïdes à l'aide du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII a permis d'obtenir des lignées transformées de la microalgue. La détection du transgène réalisée sur des cultures après 17 repiquages successifs, des cultures avec et sans agent de sélection, des cultures placées en autotrophie et hétérotrophie, et dans des cultures qui ont subis la cryopréservation, valide que l'intégration du transgène est stable. La détection par amplification PCR des différentes parties du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII dans le génome des microalgues transformées a montré que l'insertion dans le génome avait eu lieu par insertion aléatoire.In addition, this result, coupled with those obtained previously, show that the microalgae have stably and randomly incorporated the entire vector pAlgCHAst-aphVIII integrally. These results, validated on the clones transformed with plasmid DNA in circular and linear form, confirm that the integration into the genome was performed randomly. 11.2.8 Conclusion The genetic transformation of the microalgae Chlorella protothecoids using the pAlg-CHAst-aphVIII vector has made it possible to obtain transformed lines of the microalgae. The detection of the transgene carried out on cultures after successive subcultures, cultures with and without a selection agent, cultures placed in autotrophy and heterotrophy, and in cultures that have undergone cryopreservation, validates that the integration of the transgene is stable. Detection by PCR amplification of the different parts of the pAlg-CHAst-aphVIII vector in the genome of transformed microalgae showed that insertion into the genome had occurred by random insertion.
Contrairement aux résultats de transformation obtenus dans l'exemple 1 qui montraient une instabilité de l'intégration des transgènes, l'utilisation des séquences génomiques ARNr 18S dans le vecteur de transformation a permis de stabiliser l'intégration aléatoire des transgènes dans le génome de la microalgue du genre Chlorella. Ainsi nous avons mis au point une méthode qui a permis de lever le verrou biologie identifié dans l'exemple 1, et qui permet de transformer de manière stable les microalgues du genre Chlorella par insertion aléatoire du transgène. 11.3 Exemple 3 : transformation génétique stable des microalgues du genre Chlorella 11.3.1 Les souches de Chlorella Les microalgues sont Chlorella sorokianiana (UTEX1663, UTEX1230), Chlorella vulgaris (CCAP211/11B, SAG280), Chlorella autotrophica CCMP243, Chlorella protothecoïdes (CCAP211/7A, CCAP211/8D), Chlorella zofingiensis (CCAP211/14 ; UTEX32), et Chlorella minutissima (UTEX2219). 11.3.2 Culture des microalgues Les microalgues Chlorella sont cultivées dans un milieu composé d'eau du robinet supplémenté par une solution nutritive de Conway 1X, de tryptone à 0,5g/L ou de KNO3 à 1,5g/L selon la microalgue, et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma). Les cultures sont placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie est réalisée dans le milieu standard auquel sont ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures sont placées à 22°C à l'obscurité.In contrast to the transformation results obtained in Example 1 which showed instability of the integration of the transgenes, the use of the 18S rRNA genomic sequences in the transformation vector made it possible to stabilize the random integration of the transgenes into the genome of the transgenes. microalgae of the genus Chlorella. Thus, we have developed a method which has made it possible to remove the biology lock identified in Example 1, and which makes it possible to stably transform microalgae of the genus Chlorella by random insertion of the transgene. 11.3 Example 3: Stable genetic transformation of chlorella microalgae 11.3.1 Strains of Chlorella Microalgae are Chlorella sorokianiana (UTEX1663, UTEX1230), Chlorella vulgaris (CCAP211 / 11B, SAG280), Chlorella autotrophica CCMP243, Chlorella protothecoids (CCAP211 / 7A , CCAP211 / 8D), Chlorella zofingiensis (CCAP211 / 14, UTEX32), and Chlorella minutissima (UTEX2219). 11.3.2 Culture of microalgae Chlorella microalgae are cultivated in a medium composed of tap water supplemented with a nutrient solution of Conway 1X, tryptone at 0.5g / L or KNO3 at 1.5g / L according to the microalgae, and in the commercial medium BG11 (C3061, Sigma). The cultures are placed at 22 ° C. under constant light. The culture in heterotrophy is carried out in the standard medium to which 10 g / l of glucose are added. The cultures are placed at 22 ° C in the dark.
Le dénombrement cellulaire est réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.3.3 Réalisation des vecteurs d'expression La base du vecteur utilisé pour la transformation génétique des microalgues Chlorella est le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII utilisé dans l'exemple 2. Les séquences ARNr 18S de chacune des microalgues ont été amplifiées à l'aides des amorces AN58 (ACCTGGTTGATCCTGCCAGT) et AN59 (GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC). Une fois séquencée, les amorces permettant d'amplifier deux fragments spécifiques pour chacune des microalgues ont été définies (Table 1).The cell count is performed by counting on a Malassez cell using the Algenics Algae Finder software. 11.3.3 Realization of the expression vectors The base of the vector used for the genetic transformation of Chlorella microalgae is the pAlg-CHAst-aphVIII vector used in Example 2. The 18S rRNA sequences of each of the microalgae were amplified at the same time. aids primers AN58 (ACCTGGTTGATCCTGCCAGT) and AN59 (GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC). Once sequenced, the primers for amplifying two specific fragments for each microalgae were defined (Table 1).
Les séquences d'ADN génomique 1 et 2 correspondant aux deux fragments de l'ARNr 18S de chacune des microalgues du genre Chlorella, ont été amplifiées à l'aide des amorces décrites dans la Table 1. Les sites pour les enzymes de restrictions EcoRI et Xhol/BannHI ont respectivement été insérés en 5' et en 3' du fragment 1. Les sites Xhol et BamHI ont respectivement été insérés en 5' et en 3' du fragment 2. Chacun des fragments ainsi que la cassette de sélection CaMV35S-aphViii-Tnos, ont été clonés dans le vecteur pAlg-CHAst- aphVIII de transformation de Chlorella comme décrit dans l'exemple 2. 11.3.4 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique des microalgues Chlorella est réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)).The genomic DNA sequences 1 and 2 corresponding to the two fragments of the 18S rRNA of each of the microalgae of the genus Chlorella, were amplified using the primers described in Table 1. The sites for the restriction enzymes EcoRI and XhoI / BamHI were respectively inserted 5 'and 3' of fragment 1. The XhoI and BamHI sites were respectively inserted at 5 'and at 3' of fragment 2. Each of the fragments as well as the selection cassette CaMV35S-aphVIII -Tnos, were cloned into the pAlg-CHAst-aphVIII vector of Chlorella transformation as described in Example 2. 11.3.4 Genetic transformation of the Chlorella microalgae The genetic transformation of Chlorella microalgae is carried out by particle bombardment. using the modified BIORAD PDS-1000 / He device (Thomas et al (2001)).
Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance sont concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN est réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation est réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. Les microalgues Chlorella sont transformées à l'aide du vecteur pAlgCHAst-aphVIII possédant les fragments d'ADN génomiques homologues, sous forme circulaire et sous forme linéaire. Les microalgues qui subissent la transformation par bombardement de particules sont incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules sont alors centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.3.5 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella qui se développent sur les géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.3.6 Stabilité de la détection des transgènes dans les microalgues Chlorella L'intégration du transgène dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration sont vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés obtenus pour les microalgues, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et en condition hétérotrophe. 11.3.7 Insertion stable du transgène dans le génome de Chlorella Les microalgues Chlorella sont repiquées 15 fois successivement dans le milieu de culture standard en présence ou absence de l'antibiotique de sélection paromomycine.Chlorella cultures in exponential growth phase are concentrated by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C), diluted in sterile water, and spread on agar (at a rate of 108 cells per agar). Precipitation of the DNA is carried out by a solution containing 1.25M CaCl2 and 20nnM spermidine, with a ratio of 1.25pg of DNA per 0.75mg of microcarriers. The transformation is carried out with firing pressures ranging from 900 to 1350psi. Chlorella microalgae are transformed using the vector pAlgCHAst-aphVIII possessing the homologous genomic DNA fragments, in circular form and in linear form. Microalgae that undergo transformation by particle bombardment are incubated for 24 hours under constant lighting and at 22 ° C. The cells are then centrifuged, washed with the culture medium, and plated at 15.106 cells per agar, on agar media containing 50 ng / l of paromomycin. 11.3.5 Selection of transformed microalgae After 15 to 21 days of culture, clones potentially transformed Chlorella microalgae that develop on the selection agar are transplanted a first time on a fresh medium supplemented with selection agent (50nng / L of paromomycin ). The clones are then regularly transplanted on selection agar plates and from the third subculture, they are also placed in a liquid medium in the presence of selection agent. After 4 successive subcultures, the clones are both subcultured on media with and without a selection agent. After 5 rounds of subculture, the clones are placed in culture under heterotrophic conditions with and without a selection agent. The monitoring of the detection of transgenes is carried out after each transplanting and this in order to define the stability of the detection of transgenes in the genome of transformed microalgae. 11.3.6 Stability of transgene detection in Chlorella microalgae The integration of the transgene into the microalgae genome of the Chlorella genus and the stability of the integration are verified by PCR amplification on the transformed clones obtained for the microalgae, subcultured in culture media with and without selection agent, grown under standard culture conditions and in heterotrophic conditions. 11.3.7 Stable insertion of the transgene into the Chlorella genome Chlorella microalgae are subcultured 15 times in the standard culture medium in the presence or absence of the paromomycin selection antibiotic.
Les microalgues Chlorella transformées sont également placées en culture en condition hétérotrophe par ajout de glucose dans le milieu de culture à raison de 10g/L, en présence et en absence d'agent de sélection.Chlorella microalgae transformed are also placed in culture under heterotrophic conditions by adding glucose to the culture medium at a rate of 10 g / L, in the presence and absence of selection agent.
La stabilité de la détection du transgène dans le génome des chlorelles transformées est vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces AN322 (5'- TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifique de la séquence codante aphVIII. 11.3.8 Stabilité de la détection des transgènes après cryopréservation des microalgues transformées Les clones transformés des microalgues du genre Chlorella sont cryopréservés à 80°C. Afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes dans le génome de la 10 microalgue, des analyses PCR sont réalisées sur des cultures issues des clones cryopréservés pendant 2 mois. 11.3.9 Insertion stable de la totalité du vecteur de manière aléatoire dans le génome des microalgues Chlorella 15 L'insertion stable du vecteur pALG-CHAst-aphVIII est vérifiée dans les microalgues Chlorella transformées et régulièrement repiquées dans le milieu de culture standard en présence l'antibiotique de sélection paromomycine. La détection du gène de sélection et du reste du vecteur dans le génome des chlorelles transformées est réalisée par amplification PCR à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques de la séquence du 20 vecteur. La figure 5 schématise les amplifications PCR réalisées sur l'ensemble du vecteur de transformation pAlg-CHAst-aphVIII. L'amplification 1 correspond à la mise en évidence de la présence du transgène aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des amorces AN322 (5' -TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3' ) et AN323 (5' - 25 AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifiques du transgène aphVIII. Les amplifications 2 et 3 correspondent à la mise en évidence de la présence des séquences de 2 gènes présents dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC- 30 3') et AN369 (5' -ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3' ) / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC-3') respectivement spécifiques des gènes 1 et 2 présents sur le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII et de part et d'autre du transgène aphVIII (Figure 5). Les amplifications 4a et 4b correspondent à la mise en évidence de la présence de la cassette de sélection entre les fragments 1 et 2 dans le vecteur de transformation dans les 35 microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN433 (5' -TTTAATGTACTGAATTAACG-3') / AN434 (5' - TAATAATTAACATGTAATGC-3' ) et AN371 (5' -TCACAACCGGGATACCGACC-3' ) / AN372 (5' - ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3' ) permettent respectivement d'amplifier les parties 5' et 3' de la cassette d'expression aphVIII du vecteurs pAlg-CHAst-aphViii, en englobant les 40 séquences 1 et 2 du génome de Chlorella (Figure 5). 11.4 Exemple 4 : Transformation génétique stable de Chlorella protothecoïdes à l'aide de vecteurs possédant différentes séquences homologues à l'ADN génomique de la microalgue 11.4.1 Culture des microalgues La microalgue Chlorella protothecoïdes (CCAP211/8D) a été cultivée dans un milieu composé d'eau du robinet supplénnenté par une solution nutritive de Conway 1X et par de la tryptone à 0,5g/L. Les cultures ont été placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie a été réalisée dans le milieu standard auquel ont été ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à l'obscurité et à 22°C. Le dénombrement cellulaire a été réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.4.2 Utilisation des gènes de sélection nptll et aphVII pour la transformation stable des microalgues Chlorella protothecoïdes. Réalisation des vecteurs pAlg-CHAst-nptll et pAlg-CHAst-aphVII Les cassettes de sélection CaMV35S-nptll-Tnos et pCaMV35S-aphVII-Tnos ont été amplifiées à partir des vecteurs pAlg-CHA à l'aide des amorces AV37 (5'- AACTC GAG CATG GAGTCAAAGATTC -3' ) et AV40 (5' -TTCTC GAG CC GATCTAGTAACATAG -3' ). Elles ont ensuite été clonées à la place de la cassette CaMV35S-aphVIII-Tnos dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill à l'aide des sites Xhol insérés en 5' et 3' des séquences au cours de l'amplification PCR. 11.4.3 Utilisation du fragment 1 de l'ADN génomique des ARNr 18S pour la transformation stable des microalgues Chlorella protothecoïdes. L'objectif est de démontrer que la présence d'un seul fragment, ou 2 fragments identiques, homologue à des séquences endogènes permet la stabilisation de l'intégration aléatoire de transgènes dans le génome de Chlorella protothecoïdes. Réalisation du construit Fragnnent1-aphVIII et Fragment 1-aphVIll-Fragment 1 Le fragment 1 de l'ARNr 18S de Chlorella protothecoïdes a été amplifié à partir de l'ADN génomique de la microalgue à l'aide des amorces AN336 (5'- AAGAATTCAACCTG GTTGATC CTG CC -3' ) et AN337 (5'- TTGGATCCCTCGAGACAGCAAAGCCCAGGAGC-3'). Il a ensuite été cloné à l'aide des sites EcoRI et BamHI insérés par PCR dans le vecteur pAlgCHAst-F1 issus du vecteur commercial pCambia2300 dans lequel la cassette de sélection des transformants p35S-nptll-T35S a été éliminée par digestion par l'enzyme de restriction Asel. Le vecteur pAlgCHAst-F1-aphV111 a été réalisé par clonage de la cassette de sélection CaMV35S-aphVIII-Tnos dans le vecteur pAlgCHAst-F1 en Xhol, après insertion des sites en 5' et en 3' par PCR à l'aide des amorces AV37 (5'-AACTCGAGCATGGAGTCAAAGATTC-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG -3' ).The stability of the detection of the transgene in the genome of the transformed chlorella is verified by PCR amplification using primers AN322 (5'-TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 ') and AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') specific for the coding sequence aphVIII. 11.3.8 Stability of transgene detection after cryopreservation of transformed microalgae The transformed clones of Chlorella microalgae are cryopreserved at 80 ° C. In order to validate the stability of the transgene integration in the genome of the microalgae, PCR analyzes are carried out on cultures derived from cryopreserved clones for 2 months. 11.3.9 Stable insertion of the entire vector randomly into the microalgae genome Chlorella The stable insertion of the vector pALG-CHAst-aphVIII is verified in the microalgae Chlorella transformed and regularly subcultured in the standard culture medium in the presence of antibiotic selection paromomycin. The detection of the selection gene and the rest of the vector in the genome of the transformed chlorella is carried out by PCR amplification using different primer pairs specific for the vector sequence. FIG. 5 schematizes the PCR amplifications carried out on the entire pAlg-CHAst-aphVIII transformation vector. Amplification 1 corresponds to the demonstration of the presence of the transgene aphVIII in transformed microalgae Chlorella. The PCR amplifications are carried out using primers AN322 (5'-TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 ') and AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') specific for the transgene aphVIII. Amplifications 2 and 3 correspond to the demonstration of the presence of the sequences of 2 genes present in the pAlg-CHAst-aphVill vector in the transformed Chlorella microalgae. PCR amplifications are performed using primer pairs AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3 ') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC-3') and AN369 (5'-ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3 ') / AN370 ( 5 '-AGTATGAAGATGAACAAAGC-3') respectively specific for genes 1 and 2 present on the pAlg-CHAst-aphVIII vector and on both sides of the aphVIII transgene (FIG. 5). Amplifications 4a and 4b correspond to the demonstration of the presence of the selection cassette between fragments 1 and 2 in the transformation vector in the transformed Chlorella microalgae. The PCR amplifications are carried out using primer pairs AN433 (5'-TTTAATGTACTGAATTAACG-3 ') / AN434 (5'-TAATAATTAACATGTAATGC-3') and AN371 (5'-TCACAACCGGGATACCGACC-3 ') / AN372 (5'- ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3 ') respectively make it possible to amplify the 5' and 3 'portions of the aphVIII expression cassette of the pAlg-CHAst-aphVIII vectors, including the 40 sequences 1 and 2 of the Chlorella genome (FIG. 5) . 11.4 Example 4: Stable genetic transformation of Chlorella protothecoids using vectors having different sequences homologous to the genomic DNA of the microalgae 11.4.1 Culture of microalgae The microalgae Chlorella protothecoids (CCAP211 / 8D) was cultured in a compound medium tap water supplemented with a nutrient solution of Conway 1X and tryptone at 0.5g / L. The cultures were placed at 22 ° C under constant light. The culture in heterotrophy was carried out in the standard medium to which 10 g / l of glucose was added. The cultures were placed in the dark and at 22 ° C. Cell count was performed by Malassez cell counting using the Algenics Algae Finder software. 11.4.2 Use of the selection genes nptll and aphVII for stable transformation of microalgae Chlorella protothecoids. Realization of the pAlg-CHAst-nptll and pAlg-CHAst-aphVII Vectors The CaMV35S-nptII-Tnos and pCaMV35S-aphVII-Tnos selection cassettes were amplified from the pAlg-CHA vectors using the AV37 primers (5'- AACTC GAG CATG GAGTCAAAGATTC -3 ') and AV40 (5'-TTCTC GAG CC GATCTAGTAACATAG -3'). They were then cloned in place of the CaMV35S-aphVIII-Tnos cassette into the pAlg-CHAst-aphVill vector using XhoI sites inserted at 5 'and 3' sequences during PCR amplification. 11.4.3 Use of 18S rRNA genomic fragment 1 for the stable transformation of Chlorella protothecoid microalgae. The objective is to demonstrate that the presence of a single fragment, or 2 identical fragments, homologous to endogenous sequences allows the stabilization of the random integration of transgenes into the Chlorella protothecoid genome. Realization of Fragnnent1-aphVIII construct and Fragment 1-aphVIll-Fragment 1 Chlorella 18S rRNA fragment protothecoids was amplified from genomic DNA of the microalgae using primers AN336 (5'-AAGAATTCAACCTG GTTGATC CTG CC -3 ') and AN337 (5'-TTGGATCCCTCGAGACAGCAAAGCCCAGGAGC-3'). It was then cloned using the EcoRI and BamHI sites inserted by PCR into the pAlgCHAst-F1 vector from the pCambia2300 commercial vector in which the p35S-nptll-T35S transformants selection cassette was removed by enzyme digestion. Asel restriction. The pAlgCHAst-F1-aphV111 vector was produced by cloning the CaMV35S-aphVIII-Tnos selection cassette into the vector pAlgCHAst-F1 into XhoI after insertion of the 5 'and 3' sites by PCR using the primers. AV37 (5'-AACTCGAGCATGGAGTCAAAGATTC-3 ') and AV40 (5'-TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3').
Le vecteur pAlgCHAst-F1-aphViii-F1 a été réalisé par clonage d'un deuxième fragment 1 de l'ARNr 18S de Chlorella protothecoïdes dans le vecteur pAlgCHAst-F1-aphVIII en aval de la cassette de sélection. Le fragment 1 a été récupéré par digestion du vecteur donneur par les enzymes HindIII-EcoRV, et il a été cloné dans le vecteur pAlgCHAst-F1- aphVIII digéré par les enzymes HindlIl et PvuII. 11.4.4 Utilisation de différents fragments d'ADN génomique pour la transformation stable des microalgues Chlorella protothecoïdes L'objectif est de démontrer que l'origine et la taille des séquences génomiques présentent dans le vecteur pALG-CHAst-aphVIII ne sont pas directement responsable de la stabilisation de la transformation génétique de Chlorella protothecoïdes, mais que la stabilisation de l'intégration des transgènes est due à la stratégie mise en place consistant à inclure des séquences d'ADN homologue à l'ADN génomique de la microalgue dans le vecteur. Cette stratégie permet de stabiliser l'insertion aléatoire de transgènes dans le génome des microalgues du genre Chlorella. Les analyses réalisées dans les banques de données couplées à des analyses de bioinformatique ont permis de caractériser des séquences du génome de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Les amplifications PCR réalisées sur l'ADN génomique et le séquençage des amplicons obtenus a notamment permis d'identifier les séquences des gènes codant pour les ARNr 28S, la glutamine synthétase, l'ammonium transporteur et une protéine intervenant dans le processus de degreening. Les construits pour la transformation génétique stable de Chlorella protothecoïdes sont réalisés à l'aide de séquences spécifiques de ces 4 gènes, amplifiées à partir de l'ADN génomique de la microalgue à l'aide des couples d'amorces définis après le séquençage des gènes et décrits dans la Table 1. La base du vecteur utilisé pour la transformation génétique des microalgues Chlorella est le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII utilisé dans l'exemple 2. La séquence des fragments 1 et 2 de l'ARNr 18S ont été remplacés par les fragments spécifiques des gènes cités précédemment. -Deux fragments de 750pb sont amplifiés pour l'ARNr 28S (SEQ ID N : 43 et SEQ ID N°: 44) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, BamHI, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. -Deux fragments de 450pb sont amplifiés pour le gène codant une protéine de degreening (SEQ ID N°: 34 et SEQ ID N°: 35) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, BamHI, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. -Deux fragments de 550pb sont amplifiés pour le gène codant pour la glutamine synthétase (SEQ ID N : 37 et SEQ ID N : 38) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, Sall, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. -Deux fragments de 750pb sont amplifiés pour le gène codant un transporteur d'ammonium (SEQ ID N : 40 et SEQ ID N : 41) et sont clonés dans le vecteur de transformation à l'aide des sites EcoRI, BamHI, et Xhol insérés en 5' et en 3' de la séquence au cours de la PCR. Le dernier vecteur réalisé consiste à associer des fragments d'ADN éloignés du génome de la microalgue Chlorella protothecoïdes. Il est réalisé par clonage du fragment 1 du gène glutamine synthétase et du fragment 2 du gène ammonium transporteur dont les locus sont situés sur des scaffolds différents. 11.4.5 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique des microalgues Chlorella est réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance sont concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN est réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de nnicrocarriers. La transformation est réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. Les microalgues Chlorella sont transformées à l'aide du vecteur pAlgCHAst-aphVIII possédant les fragments d'ADN génonniques homologues, sous forme circulaire et sous forme linéaire. Les microalgues qui subissent la transformation par bombardement de particules sont incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules sont alors centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.4.6 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella qui se développent sur les géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.4.7 Stabilité de la détection des transgènes dans les microalgues Chlorella L'intégration du transgène dans le génome des microalgues du genre Chlorella et la stabilité de l'intégration sont vérifiées par amplification PCR sur les clones transformés obtenus pour les microalgues, repiqués dans des milieux de culture avec et sans agent de sélection, cultivés dans les conditions standard de culture et en condition hétérotrophe. 11.4.8 Insertion stable du transgène dans le génome de Chlorella Les microalgues Chlorella sont repiquées 15 fois successivement dans le milieu de culture standard en présence ou absence de l'antibiotique de sélection paromomycine.The vector pAlgCHAst-F1-aphVIII-F1 was made by cloning a second fragment 1 of the 18S rRNA of Chlorella protothecoids in the vector pAlgCHAst-F1-aphVIII downstream of the selection cassette. Fragment 1 was recovered by digestion of the donor vector with HindIII-EcoRV enzymes, and cloned into the vector pALgCHAst-F1-aphVIII digested with HindIII and PvuII enzymes. 11.4.4 Use of different genomic DNA fragments for the stable transformation of microalgae Chlorella protothecoids The objective is to demonstrate that the origin and size of the genomic sequences present in the vector pALG-CHAst-aphVIII are not directly responsible for stabilization of the genetic transformation of Chlorella protothecoids, but that the stabilization of transgene integration is due to the strategy implemented to include DNA sequences homologous to genomic DNA of the microalgae in the vector. This strategy makes it possible to stabilize the random insertion of transgenes into the genome of Chlorella microalgae. Analyzes carried out in databases coupled with bioinformatics analyzes made it possible to characterize genome sequences of the microalgae Chlorella protothecoids. The PCR amplifications carried out on the genomic DNA and the sequencing of the amplicons obtained made it possible, in particular, to identify the sequences of the genes coding for the 28S rRNAs, the glutamine synthetase, the ammonium transporter and a protein involved in the degreening process. The constructs for the stable genetic transformation of Chlorella protothecoids are made using specific sequences of these 4 genes, amplified from the genomic DNA of the microalgae using the pairs of primers defined after the sequencing of the genes. and described in Table 1. The base of the vector used for the genetic transformation of microalgae Chlorella is the vector pAlg-CHAst-aphVIII used in Example 2. The sequence of fragments 1 and 2 of 18S rRNA were replaced by the specific fragments of the genes mentioned above. Two 750 pb fragments are amplified for the 28S rRNA (SEQ ID N: 43 and SEQ ID NO: 44) and are cloned into the transformation vector using the EcoRI, BamHI, and XhoI sites inserted at 5 ' and 3 'of the sequence during the PCR. Two 450 bp fragments are amplified for the gene encoding a degreening protein (SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35) and are cloned into the transformation vector using the EcoRI, BamHI, and XhoI sites. inserted 5 'and 3' of the sequence during the PCR. Two 550 bp fragments are amplified for the gene encoding glutamine synthetase (SEQ ID N: 37 and SEQ ID N: 38) and are cloned into the transformation vector using the EcoRI, SalI, and XhoI sites inserted into the transformation vector. 5 'and 3' of the sequence during the PCR. Two 750-bp fragments are amplified for the gene encoding an ammonium transporter (SEQ ID N: 40 and SEQ ID N: 41) and are cloned into the transformation vector using the inserted EcoRI, BamHI, and XhoI sites. 5 'and 3' of the sequence during the PCR. The last vector made consists of associating DNA fragments remote from the genome of the microalgae Chlorella protothecoids. It is carried out by cloning fragment 1 of the glutamine synthetase gene and fragment 2 of the ammonium transporter gene whose loci are located on different scaffolds. 11.4.5 Genetic transformation of the Chlorella microalgae The genetic transformation of Chlorella microalgae is carried out by particle bombardment using the modified BIORAD PDS-1000 / He (Thomas et al., 2001). Chlorella cultures in exponential growth phase are concentrated by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C), diluted in sterile water, and spread on agar (at a rate of 108 cells per agar). Precipitation of the DNA is carried out by a solution containing 1.25M CaCl2 and 20nnM spermidine, with a ratio of 1.25pg DNA to 0.75mg nnicrocarriers. The transformation is carried out with firing pressures ranging from 900 to 1350psi. Chlorella microalgae are transformed using the vector pAlgCHAst-aphVIII possessing the homologous genonic DNA fragments, in circular form and in linear form. Microalgae that undergo transformation by particle bombardment are incubated for 24 hours under constant lighting and at 22 ° C. The cells are then centrifuged, washed with the culture medium, and plated at 15.106 cells per agar, on agar media containing 50 ng / l of paromomycin. 11.4.6 Selection of the transformed microalgae After 15 to 21 days of culture, the potentially transformed clones of Chlorella microalgae that develop on the selection agar plates are subcultured once on a fresh medium supplemented with selection agent (50nng / L of paromomycin ). The clones are then regularly transplanted on selection agar plates and from the third subculture, they are also placed in a liquid medium in the presence of selection agent. After 4 successive subcultures, the clones are both subcultured on media with and without a selection agent. After 5 rounds of subculture, the clones are placed in culture under heterotrophic conditions with and without a selection agent. The monitoring of the detection of transgenes is carried out after each transplanting and this in order to define the stability of the detection of transgenes in the genome of transformed microalgae. 11.4.7 Stability of transgene detection in Chlorella microalgae The integration of the transgene into the microalgae genome of the Chlorella genus and the stability of the integration are verified by PCR amplification on the transformed clones obtained for the microalgae, subcultured in culture media with and without selection agent, grown under standard culture conditions and in heterotrophic conditions. 11.4.8 Stable insertion of the transgene into the Chlorella genome Chlorella microalgae are subcultured 15 times in the standard culture medium in the presence or absence of the paromomycin selection antibiotic.
Les microalgues Chlorella transformées sont également placées en culture en condition hétérotrophe par ajout de glucose dans le milieu de culture à raison de 10g/L, en présence et en absence d'agent de sélection. La stabilité de la détection du transgène dans le génome des chlorelles transformées est vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces AN322 (5'15 TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3') et AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifique de la séquence codante aphVIII. 11.4.9 Stabilité de la détection des transgènes après cryopréservation des microalgues transformées 20 Les clones transformés des microalgues du genre Chlorella sont cryopréservés à - 80°C. Afin de valider la stabilité de l'intégration des transgènes dans le génome de la microalgue, des analyses PCR sont réalisées sur des cultures issues de clones cryopréservés pendant 2 mois. 25 11.4.10 Insertion stable de la totalité du vecteur de manière aléatoire dans le génome des microalgues Chlorella L'insertion stable du vecteur pALG-CHAst-aphVIII est vérifiée dans les microalgues Chlorella transformées et régulièrement repiquées dans le milieu de culture standard en présence l'antibiotique de sélection paromomycine. La détection du gène de sélection et 30 du reste du vecteur dans le génome des chlorelles transformées est réalisée par amplification PCR à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques de la séquence du vecteur. La figure 5 schématise les amplifications PCR réalisées sur l'ensemble du vecteur de transformation pAlg-CHAst-aphVIII. L'amplification 1 correspond à la mise en évidence de la présence du transgène 35 aphVIII dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des amorces AN322 (5' -TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3' ) et AN323 (5' - AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') spécifiques du transgène aphVIII.Chlorella microalgae transformed are also placed in culture under heterotrophic conditions by adding glucose to the culture medium at a rate of 10 g / L, in the presence and absence of selection agent. The stability of the detection of the transgene in the genome of the transformed chlorella is verified by PCR amplification using primers AN322 (5'15 TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 ') and AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') specific for the coding sequence aphVIII. 11.4.9 Stability of transgene detection after cryopreservation of transformed microalgae The transformed clones of microalgae of the genus Chlorella are cryopreserved at -80 ° C. In order to validate the stability of the integration of transgenes into the microalgae genome, PCR assays are performed on cultures derived from cryopreserved clones for 2 months. 11.4.10 Stable insertion of the entire vector randomly into the microalgae genome Chlorella The stable insertion of the pALG-CHAst-aphVIII vector is verified in the transformed Chlorella microalgae and regularly transplanted into the standard culture medium in the presence of antibiotic selection paromomycin. Detection of the selection gene and the rest of the vector in the genome of the transformed chlorella is carried out by PCR amplification using different primer pairs specific for the sequence of the vector. FIG. 5 schematizes the PCR amplifications carried out on the entire pAlg-CHAst-aphVIII transformation vector. Amplification 1 corresponds to the demonstration of the presence of the transgene aphVIII in the transformed Chlorella microalgae. The PCR amplifications are carried out using primers AN322 (5'-TTGTGAGTGGGTTGTTGTGG-3 ') and AN323 (5'-AAGTCGACGCTCCCTTCAGC-3') specific for the transgene aphVIII.
Les amplifications 2 et 3 correspondent à la mise en évidence de la présence des séquences de 2 gènes présents dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC- 3') et AN369 (5' -ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3') / AN370 (5' -AGTATGAAGATGAACAAAGC-3') respectivement spécifiques des gènes 1 et 2 présents sur le vecteur pAlg-CHAst-aphVIII et de part et d'autre du transgène aphVIII (Figure 5). Les amplifications 4a et 4b correspondent à la mise en évidence de la présence de la cassette de sélection entre les fragments 1 et 2 dans le vecteur de transformation dans les microalgues Chlorella transformées. Les amplifications PCR sont réalisées à l'aide des couples d'amorces AN433 (5'-TTTAATGTACTGAATTAACG-3') / AN434 (5' - TAATAATTAACATGTAATGC-3') et AN371 (5'-TCACAACCGGGATACCGACC-3') / AN372 (5'- ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3') permettent respectivement d'amplifier les parties 5' et 3' de la cassette d'expression aphVIII du vecteurs pAlg-CHAst-aphViii, en englobant les séquences 1 et 2 du génome de Chlorella (Figure 5). 11.5 Exemple 5 : production de molécules d'intérêt industriel dans Chlorella 11.5.1 Les souches de Chlorella Les microalgues sont Chlorella sorokianiana UTEX1663, Chlorella vulgaris SAG280 et SAG211.11b, Chlorella autotrophica CCMP243, Chlorella NC64A SAG211.6, Chlorella prototheco'ides CCAP211/8D et SAG211.7C, Chlorella Kessleri SAG27.87, Chlorella ellipsoida SAG2141. 11.5.2 Culture des microalgues Les microalgues Chlorella ont été cultivées dans un milieu composé d'eau du robinet supplérnenté par une solution nutritive de Conway 1X, de tryptone à 0,5g/L ou de KNO3 à 1,5g/L selon la rnicroalgue, et dans le milieu commercial BG11 (C3061, Sigma). Les cultures ont été placées à 22°C sous lumière constante. La culture en hétérotrophie a été réalisée dans le milieu standard auquel ont été ajoutés 10g/L de glucose. Les cultures ont été placées à l'obscurité et à 22°C. Le dénombrement cellulaire est réalisé par comptage sur cellule de Malassez à l'aide du logiciel Algenics Algae Finder. 11.5.3 Détection des glycoprotéines des microalgues du genre Chlorella Les échantillons protéiques des microalgues Chlorella ont été séparés sur un gel SDS- PAGE 12%, et transférées sur membrane de nitrocellulose (RPN303D, GE Healthcare). Après saturation de la membrane de nitrocellulose pendant 5 minutes dans une solution de TBS Tween20 2%, les glycoprotéines ont été détectées par affinodétection à l'aide de la lectine Concanavaline A conjuguée à la peroxydase de Raifort (Sigma, L6397). La figure 7 montre les résultats obtenus pour différentes microalgues du genre Chlorella. Les microalgues Chlorella présentent des profils dans lesquels des glycoprotéines ont été détectées. Ces microalgues possèdent donc la capacité à produire des protéines matures glycosylées. Du fait de leur fort potentiel industriel et de leur capacité à réaliser des modifications post-traductionnelles comme la N-glycosylation, les microalgues Chlorella se présentent comme de très bons candidats comme système d'expression pour la production de protéines glycosylées d'intérêt thérapeutiques, tels que les anticorps monoclonaux, les protéines d'enveloppes virales, ou encore les enzymes lysosomales. 11.5.4 Production de protéines marqueurs dans la microalgue Chlorella protothecoïdes Les séquences régulatrices d'origine virale A3R (SEQ ID N° ) et A208R (SEQ ID N° ), ont été synthétisées avec addition du site EcoRI en 5' et en 3' de chacune des séquences. Ces promoteurs ont ensuite été clonés dans le vecteur pAlg-CHA à la place du promoteur 15 CaMV35S. Les gènes codant pour les protéines rapporteurs eGFP (SEQ ID NO : 8) et GUS (SEQ ID NO : 9) ont été respectivement amplifiés à partir des vecteurs pPT-eGFP (Zaslavskaia et al., 2000) et pBi121 (GenBank : AF485783) à l'aide des couples d'amorces AV49 (5'- AAG GATC CATG GTG AG CAAG G G C GAG -3 ' ) / AV50 (5' -TTGAG CTCTTACTTGTACAG CTCG TC -3 ' ) 20 et AV51 (5' -AAGGATCCATGTTACGTCCTGTAGAAAC -3' ) / AV52 (5' - TTGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTG-3'). Les séquences codantes ont ensuite été clonées dans le vecteur pAlg-CHA sous le contrôle du promoteur A3R pour le gène gus, et A208R pour le gène egfp. Les cassettes d'expression pA3R-gus-Tnos et pA208R-egfp-Tnos ont été amplifiée à 25 l'aide des amorces AV47 (5' -GCTCCTGGTCGAACATGG-3') ou AV48 (5' - GAGTCAACATATGGGGGG-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3' ) avant d'être clonées en bouts francs dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill. Le site de clonage des cassettes d'expression se trouve en aval du fragment 2 de l'ARNr 18S. 30 11.5.5 Production de glycoprotéines d'intérêt thérapeutiques dans la microalgue Chlorella protothecoïdes Les séquences des chaines lourdes et légères de l'anticorps monoclonal d'intérêt thérapeutique Rituximab (SEQ ID NO : 10; SEQ ID NO : 11) ont été synthétisées. Les sites BamHI et Sacl ont respectivement été insérées en 5' et en 3' de chacune des séquences. 35 La chaîne lourde a été clonée dans le vecteur pAlg-CHA-gus à la place de la séquence gus en aval du promoteur viral A3R. La chaîne légère a été clonée dans le vecteur pAlgCHA-egfp à la place de la séquence egfp en aval du promoteur viral A208R. Les cassettes d'expression pA3R-ChLrtx-Tnos et pA208R-Ch(rtx-Tnos ont été amplifiée à l'aide des amorces AV47 (5'-GCTCCTGGTCGAACATGG-3') ou AV48 (5'40 GAGTCAACATATGGGGGG-3') et AV40 (5' -TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3' ) avant d'être clonées en bouts francs dans le vecteur pAlg-CHAst-aphVill. Les sites de clonage des cassettes d'expression se trouvent en amont du fragment 1 et en aval du fragment 2 de l'ARNr 18S. 11.5.6 Transformation génétique de la microalgue Chlorella La transformation génétique de la microalgue Chlorella protothecoides est réalisée par bombardement de particules à l'aide de l'appareil BIORAD PDS-1000/He modifié (Thomas et al. (2001)). Les cultures de Chlorella en phase exponentielle de croissance sont concentrées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), diluées dans l'eau stérile, et étalées sur gélose (à raison de 108 cellules par gélose). La précipitation de l'ADN est réalisée par une solution contenant 1,25M de CaCl2 et 20nnM de spermidine, avec un ratio de 1,25pg d'ADN pour 0,75mg de microcarriers. La transformation est réalisée avec des pressions de tir variant de 900 à 1350psi. La microalgue Chlorella protothecoides est transformée à l'aide du vecteur pAlg-CHAst-aphVIII sous forme circulaire et sous forme linéaire. Les microalgues qui ont subis la transformation par bombardement de particules ont été incubées 24 heures sous éclairage constant et à 22°C. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées avec le milieu de culture, et étalées à raison de 15.106 cellules par gélose, sur des milieux géloses contenant 50nng/L de paromomycine. 11.5.7 Sélection des microalgues transformées Après 15 à 21 jours de culture, les clones potentiellement transformés des microalgues Chlorella qui se développent sur les géloses de sélection sont repiqués une première fois sur un milieu frais supplémenté en agent de sélection (50nng/L de paromomycine). Les clones sont ensuite régulièrement repiqués sur géloses de sélection et dès le 3ème repiquage, ils sont également placés en milieu liquide en présence d'agent de sélection. Après 4 repiquages successifs, les clones sont à la fois repiqués sur des milieux avec et sans agent de sélection. Après 5 séries de repiquage, les clones sont placés en culture en condition hétérotrophe avec et sans agent de sélection. Le suivi de la détection des transgènes est réalisé après chaque repiquage et ceci afin de définir la stabilité de la détection des transgènes dans le génome des microalgues transformées. 11.5.8 Détection des protéines rapporteurs dans les transformants de Chlorella protothecoides Les clones de la microalgue Chlorella protothecoides transformés avec la séquence codant pour la protéine GUS sont cultivés dans les conditions standards de cultures. Les cellules en phase exponentielle de croissance, sont récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), puis incubées dans le tampon de réaction GUS. L'observation de la coloration bleue spécifique de l'expression du gène gus est réalisée après 24 heures à l'aide d'un microscope photonique.Amplifications 2 and 3 correspond to the demonstration of the presence of the sequences of 2 genes present in the pAlg-CHAst-aphVill vector in the transformed Chlorella microalgae. The PCR amplifications are carried out using the primer pairs AN367 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3 ') / AN368 (5'-AAGAATGGGCAGCTCGTACC-3') and AN369 (5'-ACAAAGATGTTGCTGTCTCC-3 ') / AN370 (5'-AACGCATGAAGGTTATCG-3'). '-AGTATGAAGATGAACAAAGC-3' respectively specific for genes 1 and 2 present on the pAlg-CHAst-aphVIII vector and on both sides of the aphVIII transgene (FIG. 5). Amplifications 4a and 4b correspond to the demonstration of the presence of the selection cassette between fragments 1 and 2 in the transformation vector in transformed Chlorella microalgae. PCR amplifications are performed using primer pairs AN433 (5'-TTTAATGTACTGAATTAACG-3 ') / AN434 (5'-TAATAATTAACATGTAATGC-3') and AN371 (5'-TCACAACCGGGATACCGACC-3 ') / AN372 (5'-TTTAATTAACATGTAATGC-3'). ATCGGTGCGGGCCTCTTCG-3 ') respectively make it possible to amplify the 5' and 3 'portions of the aphVIII expression cassette of the pAlg-CHAst-aphVIII vectors, including sequences 1 and 2 of the Chlorella genome (FIG. 5). 11.5 Example 5: Production of Molecules of Industrial Interest in Chlorella 11.5.1 Strains of Chlorella Microalgae are Chlorella sorokianiana UTEX1663, Chlorella vulgaris SAG280 and SAG211.11b, Chlorella autotrophica CCMP243, Chlorella NC64A SAG211.6, Chlorella protothecoides CCAP211 / 8D and SAG211.7C, Chlorella Kessleri SAG27.87, Chlorella ellipsoids SAG2141. 11.5.2 Culture of microalgae Chlorella microalgae were grown in a medium composed of tap water supplemented with a nutrient solution of Conway 1X, tryptone at 0.5g / L or KNO3 at 1.5g / L depending on the microalgae , and in the commercial medium BG11 (C3061, Sigma). The cultures were placed at 22 ° C under constant light. The culture in heterotrophy was carried out in the standard medium to which 10 g / l of glucose was added. The cultures were placed in the dark and at 22 ° C. The cell count is performed by counting on a Malassez cell using the Algenics Algae Finder software. 11.5.3 Chlorella microalgae glycoprotein detection Chlorella microalgae protein samples were separated on a 12% SDS-PAGE gel and transferred to a nitrocellulose membrane (RPN303D, GE Healthcare). After saturation of the nitrocellulose membrane for 5 minutes in 2% TBS Tween20 solution, the glycoproteins were detected by affinodetection using horseradish peroxidase conjugated Concanavalin A lectin (Sigma, L6397). Figure 7 shows the results obtained for different microalgae of the genus Chlorella. Chlorella microalgae have profiles in which glycoproteins have been detected. These microalgae thus have the ability to produce mature glycosylated proteins. Because of their high industrial potential and their ability to perform post-translational modifications such as N-glycosylation, Chlorella microalgae are very good candidates as expression systems for the production of glycosylated proteins of therapeutic interest. such as monoclonal antibodies, viral envelope proteins, or lysosomal enzymes. 11.5.4 Production of marker proteins in the microalga Chlorella protothecoids The regulatory sequences of viral origin A3R (SEQ ID No.) and A208R (SEQ ID No.), were synthesized with the addition of the EcoRI site at 5 'and 3' of each of the sequences. These promoters were then cloned into the pAlg-CHA vector in place of the CaMV35S promoter. The genes coding for the reporter proteins eGFP (SEQ ID NO: 8) and GUS (SEQ ID NO: 9) were respectively amplified from the pPT-eGFP vectors (Zaslavskaia et al., 2000) and pBi121 (GenBank: AF485783) using the AV49 primer pairs (5'-AAG GATC CATGGAGG AG CAAG GGC GAG -3 ') / AV50 (5'-TTGAG CTCTTACTTGTACAG CTCG TC -3') and AV51 (5'-AAGGATCCATGTTACGTCCTGTAGAAAC -3 ') / AV52 (5' - TTGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTG-3 '). The coding sequences were then cloned into the pAlg-CHA vector under the control of the A3R promoter for the gus gene, and A208R for the egfp gene. The expression cassettes pA3R-gus-Tnos and pA208R-egfp-Tnos were amplified using primers AV47 (5'-GCTCCTGGTCGAACATGG-3 ') or AV48 (5'-GAGTCAACATATGGGGGG-3') and AV40 ( 5 '-TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3') before being cloned into free ends in the vector pAlg-CHAst-aphVill. The cloning site of the expression cassettes is downstream of fragment 2 of the 18S rRNA. 11.5.5 Production of Therapeutic Glycoproteins in the Microalgae Chlorella Protothecoids Sequences of the heavy and light chains of the monoclonal antibody of therapeutic interest Rituximab (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11) were synthesized. The BamHI and SacI sites were respectively inserted at 5 'and 3' of each of the sequences. The heavy chain was cloned into the vector pAlg-CHA-gus instead of the sequence gus downstream of the viral promoter A3R. The light chain was cloned into the pAlgCHA-egfp vector in place of the egfp sequence downstream of the A208R viral promoter. The expression cassettes pA3R-ChLrtx-Tnos and pA208R-Ch (rtx-Tnos were amplified using the primers AV47 (5'-GCTCCTGGTCGAACATGG-3 ') or AV48 (5'40 GAGTCAACATATGGGGGG-3') and AV40 (5'-TTCTCGAGCCGATCTAGTAACATAG-3 ') before being blunt ended in the vector pAlg-CHAst-aphVill The cloning sites of the expression cassettes are upstream of the fragment 1 and downstream of the fragment 2 of the 18S rRNA 11.5.6 Genetic transformation of the Chlorella microalgae The genetic transformation of the microalgae Chlorella protothecoides is carried out by particle bombardment using the modified BIORAD PDS-1000 / He (Thomas et al., 2001). Chlorella cultures in exponential growth phase are concentrated by centrifugation (10 minutes, 2150g, 20 ° C), diluted in sterile water, and spread on agar (at a rate of 108 cells per agar). the DNA is made by a solution containing 1.25M CaCl2 and 20nnM sperm idine, with a ratio of 1.25pg of DNA to 0.75mg of microcarriers. The transformation is carried out with firing pressures ranging from 900 to 1350psi. The Chlorella protothecoides microalgae is transformed using the pAlg-CHAst-aphVIII vector in circular form and in linear form. The microalgae that underwent transformation by particle bombardment were incubated for 24 hours under constant illumination and at 22 ° C. The cells were then centrifuged, washed with the culture medium, and plated at 15.106 cells per agar, on agar media containing 50 ng / l of paromomycin. 11.5.7 Selection of transformed microalgae After 15 to 21 days of culture, clones potentially transformed Chlorella microalgae that develop on the selection agar are transplanted a first time on a fresh medium supplemented with selection agent (50nng / L of paromomycin ). The clones are then regularly transplanted on selection agar plates and from the third subculture, they are also placed in a liquid medium in the presence of selection agent. After 4 successive subcultures, the clones are both subcultured on media with and without a selection agent. After 5 rounds of subculture, the clones are placed in culture under heterotrophic conditions with and without a selection agent. The monitoring of the detection of transgenes is carried out after each transplanting and this in order to define the stability of the detection of transgenes in the genome of transformed microalgae. 11.5.8 Detection of reporter proteins in Chlorella protothecoides transformants Chlorella protothecoides microalgae clones transformed with the GUS protein coding sequence are cultured under standard culture conditions. The cells in the exponential growth phase are recovered by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C.) and then incubated in the GUS reaction buffer. The observation of the specific blue staining of the expression of the gus gene is carried out after 24 hours using a photonic microscope.
Les clones de la microalgue Chlorella protothecoides transformés avec la séquence codant pour la protéine fluorescente eGFP sont cultivés dans les conditions standards de cultures. Les cellules en phase exponentielle de croissance, sont récupérées par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C), puis observées à l'aide d'un microscope à épi- fluorescence. Les cellules de type sauvage et les cellules exprimant la protéine eGFP de la microalgue Chlorella protothecoides sont lysées. Les extraits protéiques sont analysés par immunoblotting à l'aide d'un anticorps anti-eGFP (Santa Cruz, sc-9996-HRP). 11.5.9 Détection de l'anticorps Rituximab dans les transformants de Chlorella protothecoides Les surnageants de culture des souches de type sauvage et transformées avec les séquences codants pour les chaines lourde et légère de l'anticorps d'intérêt commercial Rituximab, sont récupérés par centrifugation (10 minutes, 2150g, 20°C) de culture en phase exponentielle de croissance. La détection de l'anticorps recombinant sécrété dans le milieu de culture des microalgues transformées est réalisée à l'aide de l'anticorps antihuman IgG (Sigma, A6029-HRP).Clones of the Chlorella protothecoides microalgae transformed with the coding sequence for the eGFP fluorescent protein are cultured under standard culture conditions. The cells in the exponential phase of growth are recovered by centrifugation (10 minutes, 2150 g, 20 ° C.) and then observed using an epichlorofusion microscope. Wild type cells and cells expressing the eGFP protein of the microalgae Chlorella protothecoides are lysed. Protein extracts are analyzed by immunoblotting using an anti-eGFP antibody (Santa Cruz, sc-9996-HRP). 11.5.9 Detection of Rituximab Antibody in Chlorella Protothecoides Transformants Culture supernatants of wild-type strains transformed with the heavy and light chain coding sequences of the commercial Rituximab antibody are recovered by centrifugation. (10 minutes, 2150g, 20 ° C) growth phase exponential culture. The detection of the recombinant antibody secreted in the culture medium of the transformed microalgae is carried out using the antihuman IgG antibody (Sigma, A6029-HRP).
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