FR2995403A1 - Procede et dispositif de mesure quantitative par libs de cibles biomoleculaires sur bio-puce - Google Patents

Abstract

Procédé d'analyse quantitative par spectrométrie d'émission optique d'un plasma induit par un faisceau laser d'au moins une cible (201) comprise dans une bio-puce caractérisé en ce qu'il met en oeuvre l'utilisation d'un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203) apte à être ablatée simultanément à ladite au moins une cible (201), la matrice sèche étant configurée pour améliorer les propriétés analytiques du plasma, l'adjuvant (202) présentant un spectre d'émission dont les raies ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative de ladite au moins une cible (201).

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE QUANTITATIVE PAR LIBS DE CIBLES BIOMOLECULAIRES SUR BIO-PUCE La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure quantitative de cibles biomoléculaires sur une bio-puce. Elle s'applique notamment au domaine de la protéomique, et plus particulièrement à la mesure quantitative de la phosphorylation de protéines par une technique de spectroscopie d'émission optique sur plasma induit par laser. Dans le domaine de la protéomique, on s'applique à identifier dans des extraits cellulaires, les protéines présentes et leurs concentrations respectives, ainsi qu'à identifier les modifications post-traductionnelles de ces protéines, représentatives de leur activité. Une des modifications posttraductionnelles présentant le plus grand intérêt dans ce contexte, est la phosphorylation : la phosphorylation des protéines est capitale d'un point de vue cognitif dans le domaine de la biologie moderne, ou des diagnostics dans le domaine de la thérapeutique. Cette fonction est en effet essentielle dans de nombreux processus biologiques, tels que la régulation épigénétique, la régulation nutritionnelle, la réparation d'ADN, la régulation hormonale, etc. Aucune technique simple et directe connue ne permet d'identifier une protéine dans un milieu biologique et d'évaluer son taux de phosphorylation.

Une technique connue d'analyse consiste à analyser des extraits protéiques en les capturant sur des sites dits « spots », (chaque spot étant constitué d'une pluralité de sondes identiques) organisés en réseau sur un support communément désigné par le terme « bio-puce » ou « micro-array » selon la terminologie anglaise. Les cibles recherchées dans les extraits protéiques à analyser sont identifiées par des sondes spécifiques pouvant être des anticorps, des récepteurs ou toutes autres molécules s'associant spécifiquement à une protéine donnée ou à une de ses modifications. Dans le cas des anticorps, le support est qualifié de « bio-puce à anticorps ». Une pluralité de biomolécules cibles peut ainsi être analysée de manière simultanée ou quasi-simultanée par des techniques d'analyse appropriées.

Différentes techniques permettent de réaliser l'analyse proprement dite des éléments ainsi retenus ou « ségrégués » sur une bio-puce à anticorps. Pour l'analyse de la phosphorylation des acides nucléiques sur biopuce, une technique connue consiste à réaliser cette analyse par une technique de spectroscopie d'émission optique sur plasma induit par laser communément désignée par l'acronyme « LIBS » correspondant à la terminologie anglaise « Laser-lnduced Breakdown Spectroscopy ». Cette technique consiste à ablater, au moyen d'un faisceau laser, l'échantillon ségrégué à la surface de la bio-puce et à générer un plasma, ce plasma étant alors analysé par une méthode spectroscopique. Pour chaque tir laser, le spectre d'émission des éléments chimiques recherchés peut être enregistré, ainsi que les coordonnées de focalisation du faisceau laser à la surface de l'échantillon. Des moyens de calcul appropriés peuvent alors permettre d'établir une cartographie élémentaire de la surface de l'échantillon. Un dispositif et un procédé de mesure quantitative des cibles biomoléculaires présentes sur un support d'analyse biologique sont par exemple décrits dans la demande de brevet publiée sous la référence FR 2929011. Un dispositif d'analyse par LIBS est par exemple décrit dans la demande de brevet publiée sous la référence FR 2964458.

Cependant une analyse par LIBS de la phosphorylation de protéines sur bio-puce pose plusieurs problèmes a priori. Un premier problème est lié à la présence de phosphore exogène, masquant le signal recherché. Un deuxième problème est lié au fait que les supports habituellement utilisés pour les analyses biologiques ne sont pas compatibles avec une analyse par LIBS, les plasmas se formant sur ce type de support n'étant pas analysables dans des conditions acceptables. Un troisième problème est lié au fait que les molécules biologiques telles que les protéines présentent une quantité très faible de phosphore dans leur structure, donc difficilement décelable par LIBS. Un quatrième problème est lié au fait que le signal obtenu ne varie pas de manière facilement modélisable, par exemple de manière linéaire, en fonction de la quantité recherchée : en d'autres termes, la normalisation du signal pour la quantification d'une protéine est problématique. Un but de la présente invention est de pallier au moins les inconvénients précités, en proposant un procédé et un dispositif pour 35 l'analyse quantitative des cibles biomoléculaires par une technique LIBS.

Cette invention met en oeuvre un support adéquat et un procédé permettant la formation d'un plasma facilement analysable par spectrométrie, le signal LIBS émis par le plasma étant proportionnel à l'abondance de la quantité recherchée.

A cet effet, l'invention a pour objet un procédé et un dispositif de mesure quantitative. Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé d'analyse quantitative par spectrométrie d'émission optique d'un plasma induit par un faisceau laser d'au moins une cible comprise dans une bio-puce caractérisé en ce qu'il met en oeuvre l'utilisation d'un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche apte à être ablatée simultanément à ladite au moins une cible, la matrice sèche étant configurée pour améliorer les propriétés analytiques du plasma, l'adjuvant présentant un spectre d'émission dont les raies ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative de ladite au moins une cible. Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite au moins une cible peut être ségréguée sur la bio-puce par au moins une sonde de sorte qu'un complexe sonde-cible est formé entre chaque sonde et la cible y 20 correspondant. Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite utilisation d'un adjuvant peut permettre la formation d'une matrice sèche de structure amorphe. Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite utilisation d'un 25 adjuvant peut permettre la formation d'une matrice sèche de structure cristalline. Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice sèche peut être formée de manière à ce que les complexes sondes-cibles soient disposés à la surface d'un support, et soient totalement ou partiellement englobés par 30 un volume de ladite matrice sèche. Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice sèche et les sondes peuvent être fixées sur un support. Dans un mode de réalisation de l'invention, les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche peuvent être directement complexées aux sondes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche peuvent être fixées sur un support, les sondes étant fixées sur les molécules d'adjuvant, les molécules d'adjuvant étant fixées sur le support.

Dans un mode de réalisation de l'invention, une couche de matrice sèche peut être formée en disposant une couche d'adjuvant sur la surface du support, préalablement à la disposition des sondes sur la surface de matrice sèche ainsi formée en surface d'un support. Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice sèche peut être 10 formée par un composé dont les longueurs d'onde d'absorption sont proches de la longueur d'onde du faisceau laser, tel que la longueur d'onde utilisée pour le laser soit comprise dans le spectre d'absorption de la matrice sèche. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'adjuvant peut comprendre une solution d'eau et d'un élément du groupe comprenant le 15 sucre, polysaccharide, disaccharide. Dans un mode de réalisation de l'invention, chaque sonde peut être marquée par un élément de normalisation formant étalon interne. Dans un mode de réalisation de l'invention, chaque sonde peut être marquée par l'élément de normalisation par greffage. 20 Dans un mode de réalisation de l'invention, l'élément de normalisation peut être formé par du bore. La présente invention a également pour objet un dispositif comprenant un support comprenant une pluralité de sites, chaque site comprenant une pluralité de sondes, les sondes étant greffées de manière 25 concomitante aux molécules d'un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit support peut comprendre des composés organiques, des composés monolithiques ou organo-diamantés. 30 La présente invention a également pour objet une solution pour la mise en oeuvre d'un procédé suivant l'un quelconque des modes de réalisation décrits, caractérisée en ce qu'elle comprend un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche. Dans un mode de réalisation de l'invention, la solution pour la mise en 35 oeuvre d'un procédé suivant l'un des modes de réalisation décrits peut comprendre une proportion déterminée d'un élément de normalisation d'un signal optique d'un plasma induit par un faisceau laser Un autre avantage procuré par la présente invention est qu'elle permet une analyse simple, rapide, quantitative et vectorielle de 5 biomolécules, par exemple des protéines, et du taux de phosphore dans un mélange. Selon la présente invention, une analyse quantitative est réalisée sur une bio-puce comprenant un réseau de cibles et/ou de sondes organisées 10 en spots. Les spots de chaque sonde sont capables de reconnaître et de ségréguer une bio-molécule cible présente dans le mélange à analyser. Selon une spécificité de la présente invention, il est proposé qu'un adjuvant soit mis en oeuvre pour permettre la formation d'une matrice sèche, cette dernière étant intimement liée avec les cibles ou avec les complexes 15 sondes-cibles. Il est entendu ici par les termes « intimement lié », le fait que la matrice sèche supporte, englobe ou entoure les cibles ou les complexes sondes-cibles, de telle manière que l'ablation laser de la cible ou du complexe sonde-cible et le plasma produit par LIBS au niveau d'un spot du réseau de la bio-puce comprenne, en plus des biomolécules cibles ou des 20 complexes cibles-sondes, des molécules d'adjuvant et/ou leurs éléments de décomposition. Pour la suite, il est considéré qu'une matrice sèche se présente sous la forme d'un composé solide de forme cristalline ou amorphe après séchage de la bio-puce. A titre d'exemple non limitatif, la matrice sèche peut se présenter sous la forme d'un adduit, c'est-à-dire d'un mélange 25 des sondes, des cibles et de molécules d'adjuvant, d'une phase cristalline ou amorphe mélangée ou englobant les cibles et/ou les sondes. Différentes configurations de la matrice sèche sur le support de la bio-puce sont décrites ci-après à titre d'exemples, en référence aux figures 2A à 2D. Il est à observer qu'un procédé ou un dispositif selon la présente invention peut 30 également s'appliquer à une bio-puce comprenant une pluralité de cibles déposées ou ségréguées sur un support, non nécessairement associées à des sondes. L'adjuvant est notamment choisi de manière à être essentiellement non phosphoré, et de manière à ce qu'il ne dénature pas la liaison antigène-35 anticorps. C'est-à-dire d'une part que les spectres d'émission des molécules constituant l'adjuvant et la matrice elle-même sont distincts des raies d'émissions utilisées pour quantifier le phosphore et le cas échéant pour normaliser le signal, et d'autre part que l'adjuvant est compatible avec l'hybridation ou la complexation des cibles et/ou des complexes sondes- cibles. L'adjuvant utilisé pour la formation de la matrice sèche peut par exemple être soluble. Des exemples de solutions appropriées sont décrits ci-après. La matrice sèche est en outre choisie de manière à présenter par ailleurs l'avantage d'améliorer les propriétés analytiques du plasma produit par laser pour l'analyse par une technique de spectroscopie. Notamment, la matrice sèche peut être formée par un composé dont les longueurs d'onde d'absorption sont proches de la longueur d'onde du faisceau laser utilisé, tel que la longueur d'onde utilisée pour le laser soit comprise dans le spectre d'absorption de la matrice sèche.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, donnée à titre d'exemple, faite en regard des dessins annexés qui représentent : - la figure 1, un ordinogramme illustrant un procédé d'analyse, selon un exemple de réalisation de la présente invention ; - la figure 2, un schéma illustrant le principe général d'un procédé d'analyse sur une bio-puce comprenant des sondes / cibles selon un exemple de réalisation de la présente invention ; - les figures 3A, 3B, 3C et 3D, des schémas illustrant de manière synoptique un dispositif d'analyse suivant différentes configurations, selon des exemples de réalisation de la présente invention ; - les figures 4A et 4B, des schémas illustrant de manière synoptique un dispositif d'analyse comprenant en outre un élément de 30 normalisation, suivant des configurations correspondant respectivement aux figures 3A et 3C. En référence à la figure 1, un procédé d'analyse selon un exemple non limitatif de la présente invention peut comprendre une première 35 étape 101 de préparation de la bio-puce. La première étape 101 peut être suivie d'une seconde étape 102 d'analyse par LIBS, lors de laquelle un plasma est notamment formé sensiblement au niveau des biomolécules cibles à analyser, au moyen d'un laser d'ablation, selon des techniques en elles-mêmes connues.

L'étape de préparation 101 peut comprendre une première sous- étape consistant à déposer les biomolécules, c'est-à-dire des cibles seules et/ou des sondes sur un support, suivie d'un séchage ; une seconde sous-étape peut consister, après une éventuelle sous-étape de saturation, à ségréguer sur le support une pluralité de biomolécules cibles éventuellement en les couplant à des anticorps y correspondant, formant une matrice de sondes. Chaque biomolécule cible est ainsi fixée sur une sonde la reconnaissant disposée sur le support. Lors de la première étape 101, il est également procédé à la formation d'une matrice sèche, selon une spécificité de la présente invention. La matrice sèche formée permet d'assurer une meilleure exploitabilité par spectrométrie d'émission optique du plasma produit par laser lors de la seconde étape 102. La matrice sèche est formée de manière à pouvoir être ablatée simultanément à une cible ou à un complexe sonde-cible. Ainsi, un tir du laser d'ablation visant la biomolécule cible d'intérêt garantit l'ablation d'une partie de la matrice sèche avoisinante. A cette fin, la matrice sèche peut être disposée de manière à englober complètement ou partiellement la biomolécule cible ou le complexe sonde-cible. La matrice sèche peut également être disposée au-dessous de la biomolécule-cible ou du complexe sonde-cible, dès lors que la proximité de la matrice sèche est suffisante pour qu'un tir laser destiné à la biomolécule cible ou au complexe sonde-cible ablate également une partie de la matrice sèche avoisinante. Différentes configurations possibles de la matrice sèche par rapport à une biomolécule cible ou à un complexe sonde-cible donné, sur un support de bio-puce, sont décrites ci-après en référence aux figures 3A à 3D.

La matrice sèche est en outre configurée de manière à permettre une amélioration des propriétés analytiques du plasma LIBS. En outre, celle-ci ne doit pas dénaturer la reconnaissance sonde-cible le cas échéant, et ne doit pas en elle-même contenir du phosphore.

La matrice sèche peut être amorphe ou cristalline, et peut être formée au moyen d'un adjuvant. L'adjuvant peut par exemple être un adjuvant soluble. En pratique, dans un mode de réalisation particulier, une solution pour 5 un procédé d'analyse selon l'un des modes de réalisation décrits, comprenant une proportion de biomolécules à analyser peut également comprendre l'adjuvant permettant la formation de la matrice sèche. Dans certains modes de réalisation l'adjuvant peut être introduit dans au moins une des solutions utilisées pour hybrider la bio-puce avec les protéines 10 cibles ou pour rincer la bio-puce après hybridation. Dans ce mode de réalisation, après complexation et / ou rinçage, l'adjuvant permet la formation d'une matrice sèche à la surface de la bio-puce notamment au niveau des différents spots. Dans d'autres modes de réalisation, l'adjuvant formant une matrice 15 sèche peut être introduit lors de l'étape du dépôt des sondes sur le support au moment de la fabrication de la bio-puce : soit par introduction dans la solution de dépôt des sondes, soit juste après le dépôt des sondes, en greffant chimiquement la molécule d'adjuvant directement sur la surface du support utilisé pour la fixation des sondes. Par exemple des molécules de 20 sucrose peuvent être greffées sur la surface de la bio-puce activées par du SOCl2 au travers de leur fonction alcool. Dans un autre mode de réalisation, les molécules d'adjuvant peuvent d'abord être greffées à la surface du support de la bio-puce puis activées au besoin en fonction de la nature de l'adjuvant, et les sondes peuvent être 25 greffées en spots sur la surface de la bio-puce au travers des molécules d'adjuvant. Avantageusement, au moins une solution de rinçage ou d'hybridation peut comprendre un élément de normalisation métallique ou halogéné, émettant un signal LIBS distinct de celui du phosphore et proportionnel à 30 l'abondance dudit élément métallique. Ledit élément de normalisation peut notamment être choisi de manière à ce qu'il soit dans une même fenêtre spectrale que la raie d'émission choisie pour l'analyse du phosphore en fonction de l'appareillage utilisé. De préférence, les raies d'émission peuvent être distinctes au sens du spectrographe utilisé, c'est-à-dire suffisamment éloignées pour un spectrographe donné, pour que celles-ci puissent être distinguées. D'une manière générale l'élément de normalisation peut être introduit dans l'adjuvant permettant la formation de la matrice sèche.

L'élément de normalisation peut par exemple être le bore, pris isolément, intégré à une molécule ou emprisonné dans une cage moléculaire ou une crypte, et lié de manière reproductible à la cible. Avantageusement, l'élément de normalisation tel que le bore, peut être directement complexé à l'anticorps de la sonde, ou éventuellement à la 10 cible. Des exemples de configurations de l'élément de normalisation par rapport à des molécules cibles et/ou des sondes sont décrits ci-après en référence aux figures 4A et 4B. 15 Le support formant la bio-puce peut être un support carboné libre de phosphore, comprenant des composés organiques, c'est-à-dire une combinaison quelconque des éléments Carbone, Hydrogène, Oxygène et Azote. Le support formant la bio-puce peut être monolithique (tel que le diamant), vitreux, ou organo-diamanté, favorisant la formation d'un plasma 20 exploitable dans de bonnes conditions. Il peut être un support constitué de nanoparticules monolithiques recouvert de sondes déposées ou greffées sur un support vitreux ou organique. L'adjuvant introduit ci-dessus, permettant la formation de la matrice sèche, est lui-même configuré de manière à ne pas dénaturer la liaison 25 sonde-cible, et à ne pas contenir de phosphore. L'adjuvant peut par exemple être formé par des polysaccharides, telles que le saccharose ou tout autre polysaccharide ne contenant pas de phosphore. La seconde étape 102 précitée permet une analyse par spectrométrie 30 de type LIBS, en mettant en oeuvre des dispositifs appropriés, et peut comprendre des sous-étapes de procédé en elles-mêmes connues. La seconde étape 102 implique la mise en oeuvre de moyens d'analyse par spectrométrie LIBS, comprenant notamment au moins des moyens d'émission d'un faisceau laser impulsionnel intense ou « faisceau d'ablation », des moyens de déplacement de l'échantillon à analyser, des moyens de détection d'enregistrement et de calcul. La figure 2 présente un schéma illustrant le principe général d'un procédé d'analyse selon un exemple de réalisation de la présente invention. Selon le principe général de la présente invention lorsque celle-ci s'applique à des protéines cibles, une pluralité de protéines cibles 201 peuvent être déposées en une pluralité de spots sur un support 200 d'une bio-puce. Dans l'exemple illustré par la figure 2, le support 200 comprend en outre une pluralité de sondes 211 aptes à reconnaître les protéines cibles 201. Un procédé d'analyse selon la présente invention met en oeuvre l'utilisation d'un adjuvant 202, par exemple soluble, permettant la formation d'une matrice sèche 203, englobant totalement les complexes sondes-cibles dans l'exemple illustré par la figure 2. Ainsi, à l'issue de la première étape 101 précitée, décrite précédemment en référence à la figure 1, la biopuce comprenant une pluralité de protéines cibles 201, ainsi qu'une pluralité de sondes 211 dans l'exemple illustré non limitatif de la présente invention, peut être soumise à une analyse par LIBS lors de la seconde étape 102 précitée et décrite en référence à la figure 1.

Les figures 3A à 3D présentent des schémas illustrant de manière synoptique un dispositif d'analyse selon différents exemples de réalisation de la présente invention, correspondant à différentes configurations de la matrice sèche et du support de la bio-puce.

Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3A, correspondant à une première configuration des biomolécules-cibles, des sondes correspondantes et de la matrice sèche sur le support de la bio-puce, chaque biomolécule-cible 201 fixée à une sonde 211 la reconnaissant disposée sur le support 200 de la bio-puce, peut être englobée par un volume de matrice sèche 203 formée par un adjuvant approprié tel que décrit précédemment. Le couple sonde-biomolécule cible 211, 201 peut être complètement englobé par la matrice sèche, ainsi que dans l'exemple illustré par la figure, ou bien seulement partiellement englobé par celle-ci.35 Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3B, correspondant à une deuxième configuration, le support 200 de la bio-puce, sur lequel sont disposées les sondes permettant de former les couples sondesbiomolécules cibles 211, 201, peut en sa surface être saturé par la matrice 5 sèche 203. Selon la deuxième configuration, une couche d'adjuvant peut par exemple être disposée sur la surface du support 200 de la bio-puce déjà peuplé de couples sondes-biomolécules cibles 211, 201. Un tel mode de réalisation peut présenter un avantage en terme de simplicité de mise en oeuvre, l'intégralité de la surface du support 200 de la bio-puce pouvant être 10 saturée par la matrice sèche 203. Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3C, correspondant à une troisième configuration, chaque couple sonde-biomolécule cible 211, 201 disposé sur le support 200 de la bio-puce peut être englobé 15 dans la matrice sèche 203, l'adjuvant formant la matrice sèche 203 pouvant être directement complexé à la sonde 211. Selon un mode de réalisation illustré par la figure 3D, correspondant à une quatrième configuration, une couche de matrice sèche 203 peut être 20 formée en disposant ou en greffant une couche d'adjuvant, par exemple uniformément sur la surface du support 200 de la bio-puce, au préalable de la disposition des sondes 211 greffées directement sur la matrice. La biomolécule cible se complexe ou s'hybride à la sonde y correspondant directement sur la matrice sèche. Un mode alternatif peut consister à greffer 25 les sondes sur le support puis à greffer sur le support les molécules de la matrice de manière en entourer les cibles. Le quatrième mode de réalisation présente un avantage substantiel d'un point de vue industriel. En effet, des kits comprenant une bio-puce sur le support de laquelle a été formée la couche de matrice sèche 203 peuvent être approvisionnés, à l'instar de bio- 30 puces conventionnelles. Un opérateur peut alors normalement disposer les couples sondes-biomolécules cibles en surface d'une telle bio-puce en procédant d'une manière usuelle. La présente invention a également pour objet un dispositif ou « kit » 35 de pré-hybridation ou d'hybridation de bio-puces tel que au moins une solution pour la pré-hybridation, l'hybridation ou le rinçage d'une bio-puce comprenant un adjuvant permettant la formation d'une matrice sèche à la surface de la bio-puce.

Ainsi la présente invention a également pour objet une bio-puce dont le support comprend ainsi en sa surface une couche de matrice sèche 203. Quel que soit le mode de réalisation considéré, il peut être avantageux que l'épaisseur de la matrice sèche 203 formée au-dessus des biomolécules cibles ne soit en moyenne pas supérieure à 1 millimètre. Pour des épaisseurs supérieures, le plasma formé par le laser pourrait en effet ne pas contenir de traces de la biomolécule cible dans des proportions raisonnables pour qu'une analyse soit possible. Dans chacun des modes de réalisation décrits, chaque sonde 211 peut avantageusement comprendre un élément de normalisation formant un étalon interne permettant de normaliser signal obtenu par LIBS. Selon une spécificité de la présente invention, ainsi que cela est décrit précédemment, l'élément de normalisation peut être formé par un élément directement complexé à chaque sonde 211, par exemple par une technique de greffage. Si la sonde 211 est formée par un anticorps, l'anticorps peut ainsi être directement marqué par l'élément de normalisation par greffage. L'élement de normalisation peut par exemple être formé par un élément tel que le bore. Des exemples de configurations de l'élément de normalisation par rapport à des molécules cibles et/ou des sondes sont décrits ci-après en 25 référence aux figures 4A et 4B, correspondant respectivement aux configurations 3A et 3C décrites précédemment. En référence à la figure 4A, un élément de normalisation 405 peut être fixé directement à une sonde 211 disposée sur le support 200, par exemple par une technique de greffage. L'ensemble formé par les 30 sondes 211, les cibles 201 peut être englobé par la matrice sèche 203, selon une configuration correspondant à la première configuration décrite précédemment en référence à la figure 3A. En référence à la figure 4B, un élément de normalisation 405 peut être fixé directement à une sonde 211 disposée sur le support 200, par 35 exemple par une technique de greffage. Les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche 203 peuvent dans un tel exemple être directement complexées aux sondes 211, selon une configuration correspondant à la troisième configuration décrite précédemment en référence à la figure 3C.

Les raies spectrales de l'adjuvant ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative, comprenant les raies spectrales utilisées pour la normalisation et les raies spectrales utilisées pour la quantification de la cible et/ou de ses modifications post-traductionnelles.

Il est proposé ci-après de décrire en détails deux qualifications d'un procédé selon l'un des modes de réalisation de la présente invention, réalisée par la demanderesse. La demanderesse a procédé à des qualifications du procédé d'analyse en réalisant notamment une analyse de la protéine phosphorylée, plus précisément sur un modèle in vitro reconstitué à partir d'une protéine de caséine béta A2 dans lequel des solutions de concentrations connues de caséine qualifiée par une méthode d'analyse de type spectrométrie d'émission à couplage inductif , communément désignée par le sigle « ICP-AES » correspondant à la terminologie anglaise « Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry », sont analysées ; et d'autre part dans un modèle biologique contenant du phosphore exogène pour lequel le taux de phosphorylation d'une cible moléculaire H2AX peut être induit à volonté. Le procédé et dispositifs associés à cette analyse sont présentés dans le détail ci-après, selon un exemple de réalisation non limitatif de la présente invention, des procédés et des dispositifs pouvant être appliqués à l'analyse d'autres biomoléculescibles, et notamment de toutes protéines phosphorylées. Il est à observer que l'exemple décrit ci-après n'est aucunement limitatif de la présente invention, et correspond à un cas particulier dans lequel l'adjuvant est introduit lors de chaque étape de procédé, et que la matrice sèche y est formée sur le support de la bio-puce de manière à englober la biomoléculecible selon le mode de réalisation décrit précédemment en référence à la figure 2A. Cependant, les différents modes alternatifs décrits ci-dessus en référence aux figures 2B à 2D pourraient également être indifféremment appliqués et conduire à des résultats analogues. Egalement, l'adjuvant pourrait n'être introduit que lors d'une unique étape de procédé. Exemple de dépôts de cibles sur bio-puce (puce à protéines sans 5 sonde). La masse moléculaire de la caséine béta A2 est égale à 23,983 kiloDalton. Cette protéine peut par exemple être approvisionnée sous une forme lyophilisée, puis purifiée par exemple par une méthode communément désignée par l'acronyme « HPLC » correspondant à la terminologie anglaise 10 « High Performance Liquid Chromatography » ou chromatographie liquide à haute performance, par exemple en utilisant une solution comprenant de l'eau (H20), de l'acide trifluoroacétique (TFA) et du cyanure de méthyle (ou acétonitrile). La concentration de la protéine peut par exemple être déterminée au moyen d'un spectrophotomètre UV. 15 Afin d'évaluer l'efficacité de l'analyse par spectrométrie LIBS, une analyse de la phosphorylation de la caséine béta peut être réalisée par une méthode alternative connue et réputée fiable afin de fournir des mesures de référence. A cette fin, il est possible de recourir à une méthode d'analyse de type ICP-AES, cette méthode étant une méthode de référence pour la 20 détermination de la composition élémentaire de composés liquides. La demanderesse a procédé à l'analyse par ICP-AES de solutions de caséine béta avec des concentrations de 0, 4, 12 et 20 i_iM (micromoles). Afin de déterminer la sensibilité de la spectrométrie LIBS pour la quantification de la phosphorylation de protéines, différentes quantités de 25 caséine béta sont directement déposées sur le support en Kapton-époxy, la pellicule de Kapton-époxy étant par exemple collée au moyen d'une colle cyanoacrylate sur un verre de microscopie (par exemple se présentant sous la forme d'une lamelle de 7,5 par 2,5 cm). La solution de caséine béta ainsi obtenue est diluée en série à des 30 concentrations de 0, 40, 85, 170, 257 et 350 pm dans une solution tamponnée à 0,1 M de tris au pH de 7,5, cette préparation étant désignée « préparation A », dans une solution tamponnée comprenant 0,1 M de tris au pH de 7,5 et 1mM de sucrose, désignée « préparation B », et dans une solution tamponnée comprenant 0,1 M de tris au pH de 7,5, 1mM de sucrose 35 et 0,5 mM de bore, désignée « préparation C ». Chacune de ces préparations a été déposée isolément en cinq répliques sur la pellicule de Kapton-époxy, et séchée pendant 30 minutes à température ambiante. Exemple de bio-puce à anticorps Des lymphocytes peuvent être isolés par séparation cellulaire par gradient, à partir d'échantillons sanguins humains héparinisés. Les cellules sont lavées à deux reprises dans un tampon phosphate salin ou « PBS », diluées à une concentration de 106 cellules/mi dans un medium cellulaire, par exemple un medium comprenant 10% de sérum de veau foetal ou « FCS », 1% de pénicilline-streptomycine, et immédiatement irradiées avec un irradiateur Cobalt 60 à un niveau de dose de 2 Gray.miril à 0, 0,5, 2 et 4 Gray. Après leur irradiation, les cellules sont rapidement diluées dans un milieu de culture à une concentration de 5.106 cellules/mi et incubées pendant une heure à une température de 37°C dans une atmosphère comprenant une concentration de 5% de dioxyde de carbone, avant quantification du niveau de phosphorylation du yH2AX. Afin d'obtenir une matrice adaptée à la quantification de la phosphorylation par une analyse par LIBS, il est nécessaire que la matrice d'anticorps soit elle-même dénuée de phosphore. L'anticorps anti- yH2AXser139 peut être choisi à cette fin. L'anticorps dialysé est alors déposé sur un support formé de Kapton ou de Kapton-époxy, par exemple un support comprenant une couche de Kapton de 25 pm, ou une couche de Kapton de 25 pm recouverte d'une couche d'époxy de 25 ilm. L'anticorps est disposé sur la couche pelliculaire de Kapton-époxy. 25 Un volume de 100 pl d'anti-yH2AXser139 est dialysé dans une solution tamponnée de pH 7,5 comprenant 0,1 M de tris, 1 mM de sucrose, pendant quatre heures à une température de 4°C. Après la dialyse, la concentration de la solution d'anti-yH2AXser139 est ajustée à 0,5 mg/m1 dans 1 mM de bore dans une solution tamponnée de 30 0,1 M de tris, et un volume de 1 pl de la solution est disposé dans chaque puits de la matrice sur la couche pelliculaire de Kapton-époxy, puis est séché pendant 30 minutes à température ambiante. Afin d'éviter des liaisons non-spécifiques de protéines à la couche pelliculaire de Kapton-époxy, les fonctions époxy libres du medium sont saturées par une solution tamponnée 35 super bloquante 1X ou « SBB » suivant le sigle désignant la terminologie anglaise « Super Blocking Buffer » dans une solution comprenant du tris, 1 mM de sucrose et une concentration de 5% de dextran pendant 30 minutes à température ambiante légèrement agitée. Le support peut être lavé à trois reprises dans une solution saline tamponnée au tris, ou solution de type 1X TBS, comprenant également 1 mM de sucrose et 0,1% de polysorbate 20, cette solution étant également utilisée pour le lavage de la matrice d'anticorps dans un procédé selon la présente invention. La fixation persistante d'anticorps sur le support peut être analysée au moyen d'un scanner fluorescent, et l'absence de phosphore peut être vérifiée par LIBS.

Afin de permettre l'extraction de la cible antigénique, les lymphocytes sont culottés par centrifugation pendant deux minutes à une vitesse de 10000 tours/min, placés dans un four à micro-ondes sous une puissance de 450 W pendant 15 secondes, puis remis en suspension dans une solution tamponnée comprenant 0,1 M de tris, 1 mM de sucrose à une concentration en protéines de 1 mg/ml. Pour le couplage protéine-anticorps, les protéines sont diluées à une concentration de 0,1 mg/m1 dans une solution tamponnée de 1X SBB comprenant 1mM de sucrose, et incubées pendant 12 heures à une température de 4°C. Les matrices d'anticorps en résultant sont lavées dans une solution tamponnée saline de tris (1X TBS) comprenant 1 mM de sucrose, et 0,1% de polysorbate 20, et à deux reprises dans une solution tamponnée saline de tris (1X TBS) comprenant 1 mM de sucrose pendant 15 minutes avec agitation, puis séchées à température ambiante.

Pour ce qui concerne l'analyse par une méthode de référence, une aliquote de lymphocytes irradiés à chaque dose est analysée au moyen d'un trieur de cellules activé par fluorescence, ou « FACS » suivant l'acronyme désignant la terminologie anglaise « Fluorescence Activated Cell Sorter ».

Les cellules sont lavées à froid dans un PBS avant fixation et perméabilisation dans de l'éthanol titrant à 70° pendant une heure à une température de 4°C. Les cellules sont alors incubées à température ambiante avec une solution d'anticorps anti-yH2AXser139 dans un PBS comprenant 2% de FCS. Après lavage et centrifugation pour obtenir un culot qui est remis en suspension et incubé pendant une heure avec un anticorps secondaire anti-souris marqué par un fluorophore de type isothiocyanate de fluorescéine, ou « FITC ». Les cellules sont alors lavées, centrifugées et remises en suspension dans un PBS comprenant de l'iodide de propidium et de la ribonucléase. Au moins 104 cellules ont été analysées au moyen d'un cytomètre de flux et l'intensité de fluorescence de chaque cellule a été déterminée au moyen d'un logiciel d'analyse approprié. La quantité de yH2AX dans un échantillon irradié déterminée a alors pu être déterminée à partir de l'intensité de fluorescence médiane des cellules analysées.

Analyse de biopuces pour la quantification du phosphore par LIBS Les supports de Kapton-époxy où sont fixées les protéines peuvent alors être analysés par LIBS, par exemple au moyen d'une microsonde laser, de moyens de déplacement XY configurés pour déplacer le support avec rapidité et précision. La longueur d'onde du faisceau laser d'ablation utilisé est choisie proche des longueurs d'onde du composé formant l'adduit : pour l'exemple décrit, un laser pulsé à grenat d'yttrium-aluminium dopé au néodyme, ou laser « Nd :YAG » de longueur d'onde 266 nm et d'une énergie de 4 mJ par impulsion de 5 ns est utilisé. Deux miroirs réflectifs peuvent guider le faisceau laser pour balayer la surface du support. Au début de son parcours optique, le faisceau laser peut passer au travers d'un diaphragme puis être focalisé sur la surface de l'échantillon à analyser par un objectif de microscope réfractif. La position de l'échantillon peut être visualisée et ajustée par les moyens de déplacement à partir des images fournies par une caméra CCD disposée au-dessus de la microsonde laser. Les échantillons peuvent être positionnés et fixés au moyen de moyens de fixation par exemple formés par des vis, sur les moyens de déplacement XY. Les moyens de déplacement peuvent opérer à une fréquence de 10 Hertz, correspondant à la fréquence des tirs laser dans un mode de synchronisation externe, avec des déplacements de 30 pm entre deux tirs laser consécutifs. Pour l'analyse du plasma, une fibre optique peut être par exemple disposée avec une extrémité au plus proche du plasma, la fibre optique 35 guidant la lumière issue du plasma jusqu'à une fente d'entrée d'un spectromètre équipé d'une caméra CCD intensifiée (ou caméra « ICCD ») pulsée. Par exemple, la résolution spectrale peut être égale à 0,032 à 410 nm, pour une fente d'entrée de 100 pm. Les moyens de déplacement et la caméra ICCD peuvent par exemple être contrôlés au moyen de moyens de contrôle adaptés, par exemple formés par un unique micro-ordinateur. Le laser pulsé et la caméra ICCD peuvent être contrôlés par des moyens de pilotage pilotant l'ensemble du dispositif d'analyse. Un tir laser peut être appliqué, et une fenêtre spectrale, par exemple s'étendant dans la gamme de longueurs d'onde de 248 nm à 258 nm, autour de la ligne spectrale propre au phosphore (253,563 nm) peut être acquise, et numérisée puis stockée en mémoire par des moyens appropriés. Les moyens de pilotage peuvent alors imposer aux moyens de déplacement un déplacement de l'échantillon vers une nouvelle position. Avantageusement, un tube peut être fixé à une partie fixe de la microsonde laser et permet de former des moyens de génération d'un flux de gaz, tel que l'argon, à proximité de la surface de l'échantillon au niveau de laquelle le plasma est généré. De la sorte, la magnitude de l'émission du plasma peut être augmentée, et les phénomènes d'auto-absorption réduits. Les intensités choisies des raies de phosphore à 253,563 nm (« IP253 ») sont traitées comme des valeurs nettes en soustrayant l'intensité du fond spectral correspondant à la valeur moyenne des intensités mesurées à 254,120 nm et 254,700 nm. Les protéines cibles peuvent être quantifiées en sommant toutes les valeurs nettes des lignes IP253. Les spectres du phosphore et du bore peuvent être filtrés avec un 25 facteur de fiabilité Cdb déterminé au moyen de la relation suivante : Cdb = [((IB NB) CrN)I((IB NB)+0N)1 où IB désigne l'intensité du Bore, NB et aN désignent respectivement la valeur moyenne et l'écart-type de l'intensité du fond autour des longueurs 30 d'onde 249,084 nm et 250,363 nm, calculées sur tous les spectres. Les valeurs du phosphore pour la protéine cible peuvent alors être quantifiées à partir des spectres sélectionnés à partir de la relation suivante : ValueP =IRIP253 - nP253 )/(1/3249 - nB249 )1 (2), où IB249 et IP253 désignent les valeurs d'intensité des raies spectrales 35 respectivement du bore et du phosphore, et nP253 et nB249 désignent respectivement l'intensité moyenne du fond autour du bore et du phosphore dans un spectre donné, et correspondant à un pixel de balayage de la surface de medium par LIBS.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS1- Procédé d'analyse quantitative par spectrométrie d'émission optique d'un plasma induit par un faisceau laser d'au moins une cible (201) comprise dans une bio-puce caractérisé en ce qu'il met en oeuvre l'utilisation d'un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203) apte à être ablatée simultanément à ladite au moins une cible (201), la matrice sèche (203) étant configurée pour améliorer les propriétés analytiques du plasma, l'adjuvant (202) présentant un spectre d'émission dont les raies ont des longueurs d'ondes distinctes des longueurs d'onde des raies spectrales utilisées pour l'analyse quantitative de ladite au moins une cible (201).
2. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite au moins une cible (201) est ségréguée sur la bio-puce par au moins une sonde (211) de sorte qu'un complexe sonde-cible est formé entre chaque sonde (211) et la cible (201) y correspondant.
3. 3- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite utilisation d'un adjuvant (202) permet la formation d'une matrice sèche (203) de structure amorphe.
4. 4- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite utilisation d'un adjuvant (202) permet la formation d'une matrice sèche (203) de structure cristalline.
5. 5- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la matrice sèche (203) est formée de manière à ce que les complexes sondes-cibles sont disposés à la surface d'un support (200), et sont totalement ou partiellement englobés par un volume de ladite matrice sèche (203).
6. 6- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la matrice sèche (203) et les sondes (211) sont fixées sur un support (200).
7. 7- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche (203) sont directement complexées aux sondes (211).
8. 8- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les molécules d'adjuvant formant la matrice sèche (203) sont fixées sur un support (200), les sondes (211) étant fixées sur les molécules d'adjuvant, les molécules d'adjuvant étant fixées sur le support (200).
9. 9- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'une couche de matrice sèche (203) est formée en disposant une couche d'adjuvant sur la surface du support (200), préalablement à la disposition des sondes (211) sur la surface de matrice sèche (203) ainsi formée en surface d'un support (200).
10. 10- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice sèche (203) est formée par un composé dont les longueurs d'onde d'absorption sont proches de la longueur d'onde du faisceau laser, tel que la longueur d'onde utilisée pour le laser soit comprise dans le spectre d'absorption de la matrice sèche (203).
11. 11- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'adjuvant (202) comprend une solution d'eau et d'un élément du groupe comprenant le sucre, polysaccharide, disaccharide.
12. 12- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque sonde (211) est marquée par un élément de normalisation (405) formant étalon interne.
13. 13- Procédé d'analyse selon la revendication 11, caractérisé en ce que chaque sonde (211) est marquée par l'élément de normalisation (405) par greffage.
14. 14- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que l'élément de normalisation (405) est formé par du bore.
15. 15- Dispositif comprenant un support (200) comprenant une pluralité de sites, chaque site comprenant une pluralité de sondes (211), les sondes (211) étant greffées de manière concomitante aux molécules d'un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203).
16. 16- Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit support (200) comprend des composés organiques, des composés monolithiques ou organo-diamantés.
17. 17- Solution pour la mise en oeuvre d'un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend un adjuvant (202) permettant la formation d'une matrice sèche (203).
18. 18- Solution selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion déterminée d'un élément de normalisation (405) d'un signal optique d'un plasma induit par un faisceau laser.