FR2978457A1 - New compound comprising a nucleic acid having a specified sequence and encoding a polypeptide having a specified sequence or a polypeptide having a specified sequence, useful for treating atherosclerosis and cardiac hypertrophy - Google Patents
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Abstract
Description
COMPOSES CONTENANT UN VECTEUR VIRAL A SPECIFICITE HEPATIQUE ET PRESENTANT UNE ACTIVITE ANTI-INFLAMMATOIRE La présente invention concerne des composés contenant un vecteur viral à spécificité 5 hépatique et présentant une activité anti-inflammatoire. A ce jour, il est déjà connu que plusieurs pathologies, telles que l'athérosclérose, l'hypertrophie cardiaque, la fibrose hépatique ou la pathologie d'Alzheimer, présentent un aspect inflammatoire. Dans ce contexte, la diminution d'inflammation pourrait offrir des avantages 10 préventifs ou thérapeutiques. L'une des stratégies thérapeutiques envisagées dans ces dernières années pour le traitement de ces pathologies consiste à rechercher des moyens permettant de stimuler une réponse anti inflammatoire, sachant que la réaction inflammatoire est souvent une série de réactions dans lesquelles impliquent de nombreuses protéines. Dans ces dernières années, 15 différents composés anti-inflammatoires qui visent à inhiber l'une des protéines pro- inflammatoires ou stimuler l'une des protéines anti-inflammatoires ont été développées. Cependant, ces méthodes concernent souvent une administration orale ou intraveineuse, qui ne permet pas de cibler directement la cause d'inflammation et de diminuer spécifiquement l'inflammation. 20 De plus, les ratios bénéfices/effets secondaires des anti-inflammatoires déjà connus dans l'art antérieur ne sont pas clairement en faveur d'un traitement particulier. Un ciblage cellulaire est donc nécessaire afin d'éviter les effets secondaires. La protéine paraoxonase-1 (PONT) humaine est une enzyme antioxydante essentiellement synthétisée dans le foie et située dans le plasma à la surface des HDL (high- 25 density lipoprotein). PON1 est une enzyme ayant à la fois l'activité de lactonase et celle d'estérase. Il est déjà connu que le processus inflammatoire lié à l'athérosclérose commence par l'oxidation des LDL (low-density lipoprotein) dans la paroi artérielle, et que des HDL peuvent inhiber l'oxydation des LDL par l'intermédiaire de la protéine PONT, très probablement grâce à l'activité d'estérase de cette dernière. Il est également connu que la 30 protéine PONT permet d'augmenter l'efflux de cholestérol depuis des macrophages par intermédiaire des HDL (HDL-mediated macrophage cholesterol efflux), car PONT peut promouvoir la liaison des HDL avec le transporteur ABCA-1. Tous ces résultats signifient que la protéine PONT joue un rôle protecteur contre l'inflammation lié à l'athérosclérose. The present invention relates to compounds containing a hepatotoxic viral vector and having anti-inflammatory activity. BACKGROUND OF THE INVENTION To date, it is already known that several pathologies, such as atherosclerosis, cardiac hypertrophy, liver fibrosis or Alzheimer's pathology, have an inflammatory aspect. In this context, the reduction of inflammation could offer preventive or therapeutic benefits. One of the therapeutic strategies envisaged in recent years for the treatment of these pathologies is to look for ways to stimulate an anti-inflammatory response, knowing that the inflammatory reaction is often a series of reactions in which many proteins imply. In recent years, various anti-inflammatory compounds which aim to inhibit one of the pro-inflammatory proteins or to stimulate one of the anti-inflammatory proteins have been developed. However, these methods often involve oral or intravenous administration, which does not directly target the cause of inflammation and specifically reduce inflammation. In addition, the benefit / side effect ratios of anti-inflammatory drugs already known in the prior art are not clearly in favor of a particular treatment. Cellular targeting is therefore necessary to avoid side effects. The human paraoxonase-1 (PONT) protein is an antioxidant enzyme essentially synthesized in the liver and located in the plasma on the surface of HDL (high-density lipoprotein). PON1 is an enzyme with both lactonase and esterase activity. It is already known that the inflammatory process related to atherosclerosis begins with the oxidation of LDL (low-density lipoprotein) in the arterial wall, and that HDL can inhibit the oxidation of LDL via the protein PONT , most likely because of the esterase activity of the latter. It is also known that the PONT protein makes it possible to increase the efflux of cholesterol from macrophages via HDL (HDL-mediated macrophage cholesterol efflux), since PONT can promote the binding of HDL with the ABCA-1 transporter. All these results mean that the PONT protein plays a protective role against atherosclerosis-related inflammation.
Par ailleurs, l'expression de PONT est étroitement corrélée avec l'expression de la protéine MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1). Cette dernière contrôle le recrutement des monocytes dans les tissus et leur différenciation subséquente vers des macrophages (Marsillach et al., BMC Gastroenterology 2009, 9 :3). Etant donné que la concentration plasmique de la protéine MCP-1 est directement corrélée avec l'état inflammatoire, notamment l'état inflammatoire hépatique, chez un patient, la concentration plasmique de la protéine PON1 reflète également l'état inflammatoire d'un patient. La protéine DYRKla (dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase) est une sérine/thréonine kinase. Elle autophosphoryle une tyrosine essentielle pour la boucle d'activation permettent la phosphorylation des substrats sur un résidu sérine ou thréonine. L'étude sur DYRK1 a humain a montré que cette protéine possède des multifonctions dans le développement, la croissance et l'apoptose de cellules. En effet, cette protéine dont le gène se trouve sur le chromosome 21 (Song et al 1996, Genomics. 1996, Dec 15;38(3):331-9.) joue un rôle important dans le développement du cerveau. Le retard et l'anomalie de développement neural, ainsi que la neurodégénérescence chez les patients atteints de trisomie 21, sont considérés comme étant associés à la surexpression de DYRK1 a, à cause d'une copie supplémentaire du chromosome 21 dans le génome des patients. Par ailleurs, les résultats récents montrent que la surexpression de la protéine DYRKla peut également contribuer à la phosphorylation de la protéine tau et la production de l'amyloïde chez les patients de trisomie 21, deux signes caractéristiques de la pathologie d'Alzheimer (Ryoo et al., JNeurochem. 2008 Mar;104(5):1333-44). Jusqu'à présent, la surexpression de la protéine DYRKla, notamment dans le cerveau, est considérée comme délétère. De nombreuses études ont montré que la surexpression de la protéine DYRKla dans le cerveau peut entraîner la neuro-dégradation. Aucun lien entre DYRKla et l'inflammation n'a été établi à ce jour. Dans l'hyperhomocystéinémie on observe dans le foie une diminution de la quantité de protéine DYRK1 a et une augmentation d'expression de gènes cibles de la voie de signalisation NF-kB dans le foie des souris surexprimant DYRK1 a. Inversement dans le poumon de ces mêmes souris on observe une augmentation de la protéine Dyrkl a et une inhibition de la voie NF-kB. Dans un modèle de souris transgénique surexprimant la protéine DYRKla on a pu montrer lors de la création d'un état inflammatoire artificiel par injection intrapéritonéale de LPS une surproduction d'IL10 antiinflammatoire d'un facteur trois par rapport aux souris sauvages. Le premier aspect de l'invention a pour objectif de proposer un médicament destiné au traitement de pathologies associées à un état inflammatoire. Moreover, the expression of PONT is closely correlated with the expression of the protein MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1). The latter controls the recruitment of monocytes into the tissues and their subsequent differentiation to macrophages (Marsillach et al., BMC Gastroenterology 2009, 9: 3). Since the plasma concentration of the MCP-1 protein is directly correlated with the inflammatory state, particularly the hepatic inflammatory state, in one patient, the plasma concentration of the PON1 protein also reflects the inflammatory state of a patient. DYRKla protein (dual-specificity tyrosine- (Y) -phosphorylation-regulated kinase) is a serine / threonine kinase. It autophosphorylates an essential tyrosine for the activation loop allowing phosphorylation of substrates on a serine or threonine residue. The study on human DYRK1 has shown that this protein has multifunctions in the development, growth and apoptosis of cells. Indeed, this protein whose gene is on chromosome 21 (Song et al 1996, Genomics 1996, Dec 15, 38 (3): 331-9.) Plays an important role in the development of the brain. Delay and neural developmental abnormality, as well as neurodegeneration in Trisomy 21 patients, are thought to be associated with overexpression of DYRK1a due to an additional copy of chromosome 21 in the patient's genome. In addition, recent results show that overexpression of DYRKla protein may also contribute to phosphorylation of tau protein and amyloid production in Trisomy 21 patients, two hallmarks of Alzheimer's pathology (Ryoo et al. al., JNeurochem 2008 Mar; 104 (5): 1333-44). So far, overexpression of the protein DYRKla, especially in the brain, is considered deleterious. Numerous studies have shown that overexpression of the DYRKla protein in the brain can lead to neurodegradation. No link between DYRKla and inflammation has been established to date. In hyperhomocysteinemia, there is a decrease in the amount of DYRK1a protein in the liver and an increase in the expression of target genes of the NF-kB signaling pathway in the liver of mice overexpressing DYRK1a. Conversely, in the lungs of these same mice, an increase in the protein Dyrk1a and an inhibition of the NF-kB pathway are observed. In a transgenic mouse model overexpressing the DYRKla protein it was possible to show an artificial inflammatory state by intraperitoneal injection of LPS overproduction of anti-inflammatory IL10 by a factor of three compared with wild-type mice. The first aspect of the invention aims to propose a medicament for the treatment of pathologies associated with an inflammatory state.
Un autre aspect de l'invention a pour objectif de proposer un médicament destiné au traitement de pathologies associées à un état inflammatoire avec des effets secondaires limités. L'un des aspects de l'invention est de proposer un vecteur adénoviral à spécificité hépatique. Another aspect of the invention aims to provide a medicament for the treatment of pathologies associated with an inflammatory condition with limited side effects. One aspect of the invention is to provide a hepatic specificity adenoviral vector.
Contre toute attente, les Inventeurs de la présente invention ont observé, pour la première fois, que la surexpression contrôlée de la protéine DYRKla dans certains organes peut apporter un effet bénéfique. Les Inventeurs ont constaté que le niveau d'expression de la protéine DYRKla peut être corrélé avec l'inflammation. Les Inventeurs de la présente invention ont réussi à surexprimer localement la protéine DYRK1 a dans le foie, grâce à un vecteur adénoviral à spécificité hépatique. Cette surexpression locale permet d'éviter l'effet délétère de la surexpression de la protéine DYRKla vis-à-vis du cerveau. Dans le cadre d'un projet de recherche visant à étudier les fonctions de la protéine PON-1, les Inventeurs ont constaté de façon surprenante que la surexpression de la protéine DYRKla dans le foie permet d'augmenter la concentration plasmique de PON-1. Against all expectations, the inventors of the present invention have observed, for the first time, that the controlled overexpression of the DYRKla protein in certain organs can bring a beneficial effect. The inventors have found that the level of expression of the protein DYRKla may be correlated with inflammation. The inventors of the present invention have succeeded in locally overexpressing the protein DYRK1a in the liver, thanks to a hepatic specificity adenoviral vector. This local overexpression makes it possible to avoid the deleterious effect of the overexpression of the DYRKla protein with respect to the brain. As part of a research project aimed at studying the functions of the PON-1 protein, the inventors have surprisingly found that the overexpression of the DYRKla protein in the liver makes it possible to increase the plasma concentration of PON-1.
Encore plus surprenant, la surexpression locale de DYRK1 a permet de diminuer globalement l'état inflammatoire, grâce à l'augmentation de la concentration de la protéine PON-1, qui est une protéine plasmique circulante et anti-inflammatoire. Par conséquent, le composé selon l'invention permet de traiter les pathologies autres que les pathologies hépatiques, notamment les pathologies associées à un état inflammatoire. Even more surprising, the local overexpression of DYRK1a makes it possible to globally reduce the inflammatory state, thanks to the increase in the concentration of the PON-1 protein, which is a circulating and anti-inflammatory plasma protein. Consequently, the compound according to the invention makes it possible to treat pathologies other than hepatic pathologies, in particular pathologies associated with an inflammatory state.
La présente invention porte sur un composé comprenant une protéine ayant l'activité de la protéine DYRKla, ou un acide nucléique codant une protéine ayant l'activité de la protéine DYRKla, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies associées à un état inflammatoire. Plus particulièrement, la présente invention concerne un composé comprenant : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et codant un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - un acide nucléique d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 ; ou - un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - un polypeptide d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies associées à un état inflammatoire. The present invention relates to a compound comprising a protein having the activity of the protein DYRKla, or a nucleic acid encoding a protein having the activity of the protein DYRKla, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies associated with a inflammatory state. More particularly, the present invention relates to a compound comprising: - a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and coding a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or - a nucleic acid of interest represented by a sequence having at least 83%, especially 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 2; or a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a polypeptide of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO : 1, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies associated with an inflammatory state.
La présente invention repose sur la constatation surprenante faite par les Inventeurs que la surexpression de la protéine DYRKla dans le foie permet de diminuer l'inflammation liée aux pathologies telles que l'athérosclérose, l'hypertrophie cardiaque, la fibrose hépatique ou la pathologie d'Alzheimer. The present invention is based on the surprising finding made by the inventors that the overexpression of the DYRKla protein in the liver makes it possible to reduce the inflammation related to pathologies such as atherosclerosis, cardiac hypertrophy, liver fibrosis or the pathology of the liver. Alzheimer.
La séquence SEQ ID NO : 1 correspond à la séquence peptidique de la protéine DYRKla de rat qui présente 99.61 % d'homologie avec la sequence humaine La séquence SEQ ID NO : 2 correspond à la séquence d'acides nucléiques codant la protéine DYRKla humaine. Le pourcentage d'identité entre deux séquences peptidiques ou entre deux séquences d'acides nucléiques peut être calculé selon la formule suivante : le nombre des résidus identiques x 100 le nombre des résidus de la séquence la plus courte Un polypeptide d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 est un polypeptide ayant l'activité de la protéine DYRKla humaine, telle que la protéine DYRKla murine ou la protéine DYRKla issue de zebrafish. Un acide nucléique d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 est un acide nucléique codant un polypeptide ayant l'activité de la protéine DYRKla humaine. The sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the peptide sequence of the rat DYRKla protein which has 99.61% homology with the human sequence. The sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to the nucleic acid sequence encoding the human DYRKla protein. The percentage identity between two peptide sequences or between two nucleic acid sequences can be calculated according to the following formula: the number of identical residues x 100 the number of the residues of the shortest sequence A polypeptide of interest represented by a sequence having at least 83%, especially 90%, in particular 95% of identity with the sequence SEQ ID NO: 1 is a polypeptide having the activity of the human DYRKla protein, such as murine DYRKla protein or DYRKla protein derived from zebrafish. A nucleic acid of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% of identity with the sequence SEQ ID NO: 2 is a nucleic acid encoding a polypeptide having the activity of the human DYRKla protein. .
Un polypeptide d'intérêt est considéré comme ayant l'activité de la protéine DYRKla humaine, lorsqu'il contient le site catalytique Un tel polypeptide d'intérêt peut être la protéine DYRK1 a murine ou la protéine DYRKla issue de zebrafish. A polypeptide of interest is considered to have the activity of human DYRKla protein, when it contains the catalytic site. One such polypeptide of interest may be murine DYRK1 protein or zebrafish derived DYRKla protein.
On entend par « état inflammatoire » un état pathologique marqué par l'augmentation du nombre plasmique des cellules impliquées dans le processus d'inflammation, telles que les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et macrophages, les lymphocytes, les mastocytes et les plaquettes, et des molécules cellulaires tels que les cytokines (IL1, IL6), le TNF (facteur de nécrose tumorale) et les interférons. The term "inflammatory state" is understood to mean a pathological condition marked by the increase in the number of cells involved in the inflammation process, such as neutrophils, monocytes and macrophages, lymphocytes, mast cells and platelets, and Cellular molecules such as cytokines (IL1, IL6), TNF (tumor necrosis factor) and interferons.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un composé constitué : - d'un acide nucléique contenant un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et codant un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - d'un acide nucléique contenant un acide nucléique d'intérêt représenté par une 5 séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 ; ou - d'un polypeptide contenant un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - ou d'un polypeptide contenant un polypeptide d'intérêt représenté par une séquence 10 ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies associées à un état inflammatoire. In an advantageous embodiment, the present invention relates to a compound consisting of: a nucleic acid containing a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and encoding a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or - a nucleic acid containing a nucleic acid of interest represented by a sequence having at least 83%, especially 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 2; or a polypeptide containing a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a polypeptide containing a polypeptide of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies associated with an inflammatory state.
15 Dans un mode de réalisation plus avantageux, la présente invention concerne un composé constitué : - d'un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et codant un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - d'un acide nucléique d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, 20 particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 ; ou - d'un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - ou d'un polypeptide d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies associées à un état 25 inflammatoire. In a more advantageous embodiment, the present invention relates to a compound consisting of: - a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and coding a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO : 1, or - a nucleic acid of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 2; or of a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or of a polypeptide of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies associated with an inflammatory state.
Les composés selon l'invention permettent de traiter les pathologies associées à un état inflammatoire, telles que l'athérosclérose, l'hypertrophie cardiaque, la fibrose hépatique, la neuroinflammation et la maladie d'Alzheimer. Lorsqu'un composé selon l'invention comprend une protéine ou est constitué d'une protéine, ladite protéine peut être une protéine recombinante produite in vitro dans un système d'expression eucaryote, tel que la ligne cellulaire CHO, HEK, YB2/0, ou procaryote, tel que E.coli, ou isolée et purifiée d'un animal transgénique qui exprime cette protéine. 30 Ladite protéine peut être aussi une protéine naturelle isolée et purifiée d'un animal de type sauvage. Ladite protéine contenue dans un composé selon l'invention peut être une protéine nue ou une protéine vectorisée selon une méthode conventionnelle, telle qu'une vectorisation dans des liposomes ou des nanoparticules. Lorsqu'un composé selon l'invention comprend un acide nucléique ou est constitué d'un acide nucléique, ledit acide nucléique peut être un acide nucléique nu ou vectorisé selon une méthode conventionnelle, telle que la vectorisation dans des vecteurs viraux ou non viraux. The compounds according to the invention make it possible to treat pathologies associated with an inflammatory state, such as atherosclerosis, cardiac hypertrophy, hepatic fibrosis, neuroinflammation and Alzheimer's disease. When a compound according to the invention comprises a protein or consists of a protein, said protein may be a recombinant protein produced in vitro in a eukaryotic expression system, such as the CHO, HEK, YB2 / 0 cell line, or prokaryotic, such as E. coli, or isolated and purified from a transgenic animal that expresses this protein. Said protein may also be a natural protein isolated and purified from a wild type animal. Said protein contained in a compound according to the invention may be a naked protein or a protein vectorized according to a conventional method, such as a vectorization in liposomes or nanoparticles. When a compound according to the invention comprises a nucleic acid or consists of a nucleic acid, said nucleic acid can be a naked or vectorized nucleic acid according to a conventional method, such as vectorization in viral or non-viral vectors.
Des vecteurs non viraux peuvent être des liposomes, des nanoparticules, des molécules non chargées, telles que les copolymères amphiphiles non chargés, constitués de motifs oxyde de polyéthylène (POE) et oxyde de polypropylène (PPO), les poloxamères, ou les composés cationiques, tels que les peptides cationiques poly-L lysine (PLL). Avantageusement, ledit acide nucléique est vectorisé dans un vecteur viral. Non-viral vectors may be liposomes, nanoparticles, uncharged molecules, such as uncharged amphiphilic copolymers, consisting of polyethylene oxide (POE) and polypropylene oxide (PPO) units, poloxamers, or cationic compounds, such as cationic peptides poly-L lysine (PLL). Advantageously, said nucleic acid is vectorized in a viral vector.
L'utilisation d'un vecteur viral permet de cibler spécifiquement certaines cellules, et donc ainsi limiter les effets secondaires éventuels liés à l'expression dudit acide nucléique. The use of a viral vector makes it possible to specifically target certain cells, and thus to limit the possible side effects related to the expression of said nucleic acid.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un vecteur adénoviral à spécificité hépatique permettant de provoquer in vivo une augmentation de l'expression de 20 DYRKl a dans le foie. La présente invention concerne un vecteur adénoviral comprenant : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et codant un polypeptide représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou un acide nucléique d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% 25 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, et - un promoteur de primate choisi parmi des promoteurs spécifiques des hépatocytes, notamment le promoteur humain de l'al-antitrypsine représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, le promoteur humain de la cholesterol 7 alpha-hydroxylase représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, ou le promoteur humain du facteur IX représenté par la séquence SEQ ID NO : 7, 30 ou un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec l'une des trois séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, et - éventuellement un enhancer choisi parmi ceux des gènes ayant une spécificité d'expression hépatique supérieure à 99%, notamment l'enhancer de l'al-microglobuline microglobuline représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, l'enhancer de l'apolipoproteine E représenté par la séquence SEQ ID NO : 8, ou l'enhancer de la phenylalanine hydroxylase représenté par la séquence SEQ ID NO : 9, ou un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec l'une des trois séquences SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9, et - éventuellement un intron choisi parmi ceux des gènes ayant une spécificité d'expression hépatique supérieure à 90%, notamment l'intron de l'apo A-I représenté par la séquence SEQ ID NO : NO : 5, l'intron de l'aldolase B représenté par la séquence SEQ ID NO : 10, ou l'intron de la vitamin D-binding protéine représenté par la séquence SEQ ID NO : 11, ou un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec l'un des trois séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1l, ledit intron étant situé entre l'acide nucléique d'intérêt et le promoteur. L'avantage d'un vecteur adénoviral réside sur le fait que le vecteur ne s'intègre pas dans le génome des cellules hôtes, et permet d'obtenir un haut niveau d'expression transitoire d'un gène d'intérêt dans les cellules hôtes. According to another embodiment, the invention relates to a liver-specific adenoviral vector which makes it possible to induce in vivo an increase in the expression of DYRK1a in the liver. The present invention relates to an adenoviral vector comprising: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and encoding a polypeptide represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, and a primate promoter selected from hepatocyte-specific promoters, in particular the human promoter of the invention. antitrypsin represented by the sequence SEQ ID NO: 3, the human promoter of the cholesterol 7 alpha-hydroxylase represented by the sequence SEQ ID NO: 6, or the human factor IX promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 7, 30 or a nucleic acid having at least 90%, particularly 95%, in particular 98% identity with one of the three sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and - optionally a chosen enhancer among those genes having u specificity of hepatic expression greater than 99%, in particular the enhancer of the microglobulin microglobulin represented by the sequence SEQ ID NO: 4, the enhancer of apolipoprotein E represented by the sequence SEQ ID NO: 8, or the phenylalanine hydroxylase enhancer represented by the sequence SEQ ID NO: 9, or a nucleic acid having at least 90%, particularly 95%, in particular 98% identity with one of the three sequences SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and optionally an intron chosen from those genes having a specificity of hepatic expression greater than 90%, in particular the intron of the apo AI represented by the sequence SEQ ID. NO: NO: 5, the intron of aldolase B represented by the sequence SEQ ID NO: 10, or the intron of the vitamin D-binding protein represented by the sequence SEQ ID NO: 11, or a nucleic acid having at least 90%, especially 95%, including 98% identity with one of the three sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, said intron being located between the nucleic acid of interest and the promoter. The advantage of an adenoviral vector lies in the fact that the vector does not integrate into the genome of the host cells, and makes it possible to obtain a high level of transient expression of a gene of interest in the host cells. .
On entend par « promoteur », une région d'ADN qui contient en général une séquence d'ADN particulière permettant d'initialiser la transcription d'un gène particulier. Un promoteur est en général proche (d'une vingtaine à une centaine de nucléotides) du gène à régler et situé en amont du site de démarrage de la transcription. La présence d'un promoteur est essentielle pour la transcription d'un gène particulier. The term "promoter" is intended to mean a region of DNA which generally contains a particular DNA sequence which makes it possible to initiate the transcription of a particular gene. A promoter is generally close (from twenty to a hundred nucleotides) of the gene to be regulated and located upstream of the start site of the transcription. The presence of a promoter is essential for the transcription of a particular gene.
On entend par « promoteur spécifique des hépatocytes », un promoteur qui permet d'initialiser spécifiquement la transcription d'un gène dans les cellules hépatocytes. En général, un tel promoteur ne peut pas initialiser la transcription dudit gène dans un tissu autre que le foie. «Un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec l'une des trois séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7 » contenu dans un vecteur adénoviral selon l'invention est un acide nucléique ayant soit l'activité du promoteur humain de l'al-antitrypsine, soit celle du promoteur humain de la cholesterol 7 alpha-hydroxylase, soit celle du promoteur humain du factor IX. On entend par « enhancer », un segment court d'ADN qui peut se lier à des facteurs de transcription pour stimuler le niveau de transcription d'un gène. Un enhancer n'est pas nécessairement proche du gène à réguler, et peut se situer en amont, en aval ou même au milieu du gène à régler. The term "hepatocyte specific promoter" is intended to mean a promoter which makes it possible to specifically initiate the transcription of a gene in hepatocyte cells. In general, such a promoter can not initiate the transcription of said gene into a tissue other than the liver. "A nucleic acid having at least 90%, especially 95%, in particular 98% identity with one of the three sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7" contained in an adenoviral vector according to the invention is a nucleic acid having either the activity of the human promoter of al-antitrypsin, or that of the human promoter of cholesterol 7 alpha-hydroxylase, or that of the human promoter of factor IX. By "enhancer" is meant a short segment of DNA that can bind to transcription factors to stimulate the level of transcription of a gene. An enhancer is not necessarily close to the gene to be regulated, and may be upstream, downstream or even in the middle of the gene to be regulated.
On entend par «enhancer des gènes ayant une spécificité d'expression hépatique supérieure à 99% », un enhancer d'un gène dont l'expression est essentiellement hépatique, à savoir que 99% de la quantité de protéine correspondante est exprimée chez le foie. « Un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec l'une des trois séquences SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9 » contenu dans un vecteur adénoviral selon l'invention est un acide nucléique ayant soit la fonction de l'enhancer de l'al-microglobuline microglobuline, soit celle de l'enhancer de l'apolipoproteine E, soit celle de l'enhancer de la phenylalanine hydroxylase. On entend par « intron », une partie non codante d'un gène. Un intron est situé souvent entre deux exons. Après la transcription, cette partie est excisée de l'ARN pour donner l'ARN messager. La présence d'un intron hétérologue permet d'optimiser l'expression des gènes exogènes dans une construction d'ADN. « Un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec l'une des quatre séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11» est un acide nucléique qui conserve la capacité d'être excisé d'un pré-ARNm pour donner un ARNm mature. On entend par «intron des gènes ayant une spécificité d'expression hépatique supérieure à 90% », un intron d'un gène dont l'expression est essentiellement hépatique, à savoir que 90% de la quantité de protéine correspondante est exprimée dans le foie. The term "enhancer of genes having liver expression specificity greater than 99%" means an enhancer of a gene whose expression is essentially hepatic, namely that 99% of the corresponding amount of protein is expressed in the liver. . "A nucleic acid having at least 90%, especially 95%, in particular 98% identity with one of the three sequences SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9" contained in an adenoviral vector according to the invention is a nucleic acid having either the function of the enhancer of the microglobulin microglobulin, that of the enhancer of apolipoprotein E, or that of the enhancer of phenylalanine hydroxylase. The term "intron" means a non-coding part of a gene. An intron is often located between two exons. After transcription, this portion is excised from the RNA to give the messenger RNA. The presence of a heterologous intron optimizes the expression of exogenous genes in a DNA construct. "A nucleic acid having at least 90%, particularly 95%, in particular 98% identity with one of the four sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11" is a nucleic acid which retains the ability to be excised from pre-mRNA to mature mRNA. The term "intron of genes having liver expression specificity greater than 90%", an intron of a gene whose expression is essentially hepatic, namely that 90% of the corresponding amount of protein is expressed in the liver. .
Dans un mode de réalisation avantageux, les régions El/E3/E4 de l'adénovirus sont délétées d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Les régions El/E3/E4 de l'adénovirus contiennent des gènes codant les protéines virulentes, par exemple les protéines qui peuvent induire l'apoptose de cellules, ou les protéines pro-inflammatoires, telles que TNF. La délétion des régions El/E3/E4 permet d'assurer que le vecteur adénoviral selon l'invention ne présente aucune pathogénicité liée au virus. In an advantageous embodiment, the El / E3 / E4 regions of the adenovirus are deleted from an adenoviral vector according to the invention. The El / E3 / E4 regions of the adenovirus contain genes encoding virulent proteins, for example proteins that can induce apoptosis of cells, or pro-inflammatory proteins, such as TNF. The deletion of the El / E3 / E4 regions makes it possible to ensure that the adenoviral vector according to the invention has no pathogenicity related to the virus.
Dans un mode de réalisation avantageux, le vecteur selon l'invention comprend : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et codant un polypeptide représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, - un promoteur humain de l'al-antitrypsine représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, - éventuellement au moins une copie d'un enhancer de l'al-microglobuline représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, - éventuellement un intron apo A-I représenté par la séquence SEQ ID NO : NO : 5. In an advantageous embodiment, the vector according to the invention comprises: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and encoding a polypeptide represented by the sequence SEQ ID NO: 1, a human promoter of the antitrypsin represented by the sequence SEQ ID NO: 3, optionally at least one copy of an enhancer of the al-microglobulin represented by the sequence SEQ ID NO: 4, optionally an intron apo AI represented by the sequence SEQ ID NO: NO: 5.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, le vecteur adénoviral selon l'invention comprend en outre au moins une région contrôle hépatique représentée par la séquence SEQ ID NO : 12, ou un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 12. In a more advantageous embodiment, the adenoviral vector according to the invention further comprises at least one hepatic control region represented by the sequence SEQ ID NO: 12, or a nucleic acid having at least 90%, particularly 95%, especially 98%. Identity% with the sequence SEQ ID NO: 12.
La région contrôle hépatique est une région d'ADN située généralement en aval du site de transcription d'un gène et permettant de contrôler l'expression spécifique dudit gène dans les hépatocytes. « Un acide nucléique ayant au moins 90%, particulièrement 95%, notamment 98% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 12 » conserve la fonction d'une région contrôle hépatique représentée par la séquence SEQ ID NO : 12, notamment celle de contrôler l'expression spécifique d'un gène dans les hépatocytes. The hepatic control region is a region of DNA located generally downstream of the transcription site of a gene and making it possible to control the specific expression of said gene in hepatocytes. "A nucleic acid having at least 90%, especially 95%, especially 98% identity with the sequence SEQ ID NO: 12" retains the function of a liver control region represented by the sequence SEQ ID NO: 12, in particular that to control the specific expression of a gene in hepatocytes.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le vecteur adénoviral selon l'invention comprend : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, - un promoteur humain de l'al-antitrypsine représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, - au moins une copie d'un enhancer de l'al-microglobuline représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, - un intron représenté par la séquence SEQ ID NO : 5, et - au moins une copie d'une région contrôle hépatique représentée par la séquence SEQ ID NO : 12. In a particularly advantageous embodiment, the adenoviral vector according to the invention comprises: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, a human promoter of the antitrypsin represented by the sequence SEQ ID NO: 3, at least one copy of an al-microglobulin enhancer represented by the sequence SEQ ID NO: 4, an intron represented by the sequence SEQ ID NO: 5, and at least one copy of a hepatic control region represented by the sequence SEQ ID NO: 12.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le vecteur adénoviral selon l'invention comprend : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, - un promoteur humain de l'al-antitrypsine représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, - deux copies de l'enhancer de l'al-microglobuline représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, - un intron représenté par la séquence SEQ ID NO : 5, et - deux copies de la région contrôle hépatique représentée par la séquence SEQ ID NO : 12. La présente de deux copie de l'enhancer de l'al-microglobuline et de deux copies de la région contrôle hépatique permet d'augmenter la spécificité tissulaire Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral selon l'invention est représenté par la séquence SEQ ID NO : 13. In another preferred embodiment, the adenoviral vector according to the invention comprises: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2; a human al-antitrypsin promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 3; two copies of the al-microglobulin enhancer represented by the sequence SEQ ID NO: 4; an intron represented by the sequence SEQ ID NO: 5; and two copies of the hepatic control region represented. by the sequence SEQ ID NO: 12. The present of two copies of the enhancer of the al-microglobulin and two copies of the hepatic control region makes it possible to increase the tissue specificity In a particular embodiment, the adenoviral vector according to the invention is represented by the sequence SEQ ID NO: 13.
Le vecteur adénoviral selon l'invention est en particulier utilisé pour le traitement des pathologies associées à un état inflammatoire, telles que l'athéroslérose, l'hypertrophie cardiaque, la fibrose hépatique, la neuroinflammation et la maladie dAlzheimer. The adenoviral vector according to the invention is in particular used for the treatment of pathologies associated with an inflammatory state, such as atherosclerosis, cardiac hypertrophy, liver fibrosis, neuroinflammation and Alzheimer's disease.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et codant un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - un acide nucléique d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 ; ou - un polypeptide d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou - ou un polypeptide d'intérêt représenté par une séquence ayant au moins 83%, particulièrement 90%, notamment 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Un tel véhicule utilisé dans une composition pharmaceutique selon invention peut être tout véhicule pharmaceutiquement acceptable conventionnel. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and encoding a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 2; or a polypeptide of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or a polypeptide of interest represented by a sequence having at least 83%, particularly 90%, in particular 95% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Such a vehicle used in a pharmaceutical composition according to the invention may be any conventional pharmaceutically acceptable carrier.
La composition pharmaceutique selon l'invention est susceptible d'être administrée au patient à une dose de 10 12 particules / kg avec une administration par semaine. Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention est sous forme de solution injectable. Ladite composition peut être administrée par injection intraveineuse, intraportale ou intrahépatique (Berrando et al., Hum Gene Ther. 2006, Jun;17(6):601-10). Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un vecteur adénoviral tel que décrit dans la présente invention en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The pharmaceutical composition according to the invention is capable of being administered to the patient at a dose of 10 12 particles / kg with one administration per week. In a particular embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention is in the form of an injectable solution. The composition may be administered by intravenous, intraportal or intrahepatic injection (Berrando et al., Hum Gene Ther., 2006, Jun; 17 (6): 601-10). In a particular embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises an adenoviral vector as described in the present invention in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
Dans un mode de réalisation plus particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un vecteur adénoviral comprenant : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, - un promoteur humain de l'al-antitrypsine représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, - au moins une copie d'un enhancer de l'al-microglobuline représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, - un intron représenté par la séquence SEQ ID NO : 5, et - au moins une copie d'une région contrôle hépatique représentée par la séquence SEQ 5 ID NO : 12. In a more particular embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises an adenoviral vector comprising: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2; a human al-antitrypsin promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 3, at least one copy of an enhancer of the al-microglobulin represented by the sequence SEQ ID NO: 4, an intron represented by the sequence SEQ ID NO: 5, and at least one a copy of a hepatic control region represented by the sequence SEQ ID NO: 12.
Dans un mode de réalisation plus particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un vecteur adénoviral comprenant : - un acide nucléique d'intérêt représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, 10 - un promoteur humain de l'al-antitrypsine représenté par la séquence SEQ ID NO : 3, - deux copies de l'enhancer de l'al-microglobuline représenté par la séquence SEQ ID NO : 4, - un intron représenté par la séquence SEQ ID NO : 5, et - deux copies de la région contrôle hépatique représentée par la séquence SEQ ID NO : 15 12. Dans un mode de réalisation encore plus particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un vecteur adénoviral représenté par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 13. In a more particular embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises an adenoviral vector comprising: a nucleic acid of interest represented by the sequence SEQ ID NO: 2; an al-antitrypsin human promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 3, two copies of the al-microglobulin enhancer represented by the sequence SEQ ID NO: 4, an intron represented by the sequence SEQ ID NO: 5, and two copies of the hepatic control region represented by the sequence SEQ ID NO: 12. In a still more particular embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises an adenoviral vector represented by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13.
20 La présente invention porte également sur les cellules de mammifère transfectées par un vecteur tel que défini dans la présente invention. Particulièrement, ladite cellule est une cellule humaine. Plus particulièrement, ladite cellule est une cellule hépatique humaine. La transfection d'une cellule de mammifère par l'intermédiaire d'un vecteur viral peut 25 être mise en oeuvre par toutes méthodes connues de l'homme du métier, telles que l'électroporation ou la transfection par phosphate de calcium. The present invention also relates to mammalian cells transfected with a vector as defined in the present invention. In particular, said cell is a human cell. More particularly, said cell is a human liver cell. Transfection of a mammalian cell via a viral vector may be carried out by any methods known to those skilled in the art, such as electroporation or calcium phosphate transfection.
Enfin, l'invention vise également à proposer une méthode pour déterminer l'évolution de l'état inflammatoire d'un patient sous traitement d'une composition pharmaceutique selon 30 la présente invention. Cette méthode comprend : - la mesure de la concentration sanguine de la protéine parooxonase-1, représentée par la séquence SEQ ID NO : 14, dans un échantillon sanguine dudit patient, - la détermination de l'évolution inflammatoire dudit patient. Finally, the invention also aims at providing a method for determining the evolution of the inflammatory state of a patient undergoing treatment of a pharmaceutical composition according to the present invention. This method comprises: measuring the blood concentration of the parooxonase-1 protein, represented by the sequence SEQ ID NO: 14, in a blood sample of said patient; determining the inflammatory evolution of said patient.
Etant donné que la concentration plasmique de la protéine paraoxonase-1(PON1) est corrélée négativement avec l'état inflammatoire d'un patient, l'augmentation du niveau de PONT plasmique signifie que l'inflammation chez le patient est réduite ; la diminution du niveau de PONT plasmique signifie que l'inflammation du patient est aggravée. La présente invention est illustrée plus en détail par les figures et les exemples ci-après. Ils ne peuvent, en aucun cas, être interprétés comme une illustration exhaustive de la portée de la présente invention. Since the plasma concentration of paraoxonase-1 protein (PON1) is negatively correlated with the inflammatory state of a patient, increasing the level of plasma PONT means that inflammation in the patient is reduced; the decrease in the level of plasma BRD means that the inflammation of the patient is aggravated. The present invention is further illustrated by the following figures and examples. They can not, under any circumstances, be interpreted as an exhaustive illustration of the scope of the present invention.
10 Figures Figure 1 : la figure 1 illustre la structure du plasmide pTG14681-DC172.AIintron.Dyrkla.HCR2. Dans l'ordre de 5' à 3' de la séquence d'ADN, ledit plasmide contient deux copies de 160 bp de l'enhancer de l'alpha 1 microglobuline (représentées par le diamant gris), 890 bp du promoteur de l'alpha 1 anti trypsine humaine (représenté par le triangle 15 blanc), l'intron de l'apo A-I (représenté par le triangle noir), 2,6kb de l'ADNc de DYRKla du rat (représenté par le rectangle noir) et deux copies de 770bp de la région-I de contrôle hépatique (représentées par ellipse grise) et un site poly A provenant du virus SV40 (représenté par le rectangle blanc). FIG. 1: FIG. 1 illustrates the structure of the plasmid pTG14681-DC172.AIintron.Dyrkla.HCR2. In the order of 5 'to 3' of the DNA sequence, said plasmid contains two copies of 160 bp of the alpha 1 microglobulin enhancer (represented by the gray diamond), 890 bp of the promoter of the human anti-trypsin alpha 1 (represented by the white triangle), the intron of apo AI (represented by the black triangle), 2.6 kb of the rat DYRKla cDNA (represented by the black rectangle), and two 770bp copies of the hepatic control region-I (represented by gray ellipse) and a poly A site from the SV40 virus (represented by the white rectangle).
20 Figure 2 : la figure 2 représente l'activité plasmatique de la protéine PONT chez les souris contrôles Cbs+/+ (WT) et les souris hyperhomocystéinémiques Cbs+/- traitées (HT+AD) ou non par le vecteur adénoviral selon la présente invention (HT). N représente le nombre de souris analysé dans chaque groupe. Les valeurs sont considérées comme significativement différentes pour p<0.05 (*) et très significativement différentes pour 25 p<0.005 (**). L'activité plasmatique de PONT respective du groupe HT ou HT+ad est calculée en pourcentage par rapport à l'activité plasmatique de PONT du groupe WT. Cette dernière est considérée comme l'activité 100%. L'axe des ordonnées représente le pourcentage de l'activité plasmatique de PONT dans les groupes WT, HT et HT+ad. FIG. 2 shows the plasma activity of the PONT protein in the Cbs + / + (WT) control mice and the Cbs + / - hyperhomocysteinemic mice treated (HT + AD) or not by the adenoviral vector according to the present invention ( HT). N represents the number of mice analyzed in each group. The values are considered significantly different for p <0.05 (*) and very significantly different for 25 p <0.005 (**). The plasma activity of the respective PONT of the HT or HT + ad group is calculated as a percentage with respect to the plasma activity of the WT group PONT. The latter is considered 100% activity. The y-axis represents the percentage of the plasma activity of PONT in the groups WT, HT and HT + ad.
30 Figure 3 : la figure 3 représente les niveaux relatifs d'ARN messagers IL10 dans le cerveau des souris contrôles(WT) (100%) et des souris BACtgDyrkla surexprimant la protéine Dyrkla après l'injection péritonéale d'une solution de Nacl (WT et Tg) ou d'une préparation de lipopolysaccharides (LPS) (WT LPS et Tg LPS). L'axe des ordonnées5 représente le ratio d'ARN messagers IL10 entre les souris étudiées et les souris contrôles (WT correspondant aux controles plus Nacl et Tg aux souris Tg plus Nacl) . Figure 3: Figure 3 shows the relative levels of IL10 messenger RNA in the brain of the control (WT) mice (100%) and BACtgDyrkla mice overexpressing the Dyrkla protein after peritoneal injection of a Nacl solution (WT). and Tg) or a lipopolysaccharide (LPS) preparation (WT LPS and Tg LPS). The ordinate axis5 represents the ratio of IL10 messenger RNAs between the mice studied and the control mice (WT corresponding to the controls plus Nacl and Tg to the Tg plus Nacl mice).
Matériels et Méthodes Materials and methods
Exemple 1 : Construction du plasmide pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2 Example 1 Construction of the Plasmid pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2
Pour obtenir le plasmide pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2, le fragment contenant la séquence codante complète de Dyrkla (pb 130 à pb 2421 dans NM 012791, NCBI) a été obtenu par une digestion BglII-Afel de la construction EGFP-Dyrkla cDNA (Becker et al, 1998). Ledit fragment est ensuite inséré dans le plasmide pTG14681-DC172.AIintron.HCR2 (Jacobs F, et al; 2008, Gene Ther. 2008 Apr;15(8):594-603). Le plasmide pTG14681-DC172.A-Iintron.HCR2 contient le promoteur DC172 (1.2 kb), qui consiste en 890 pb du promoteur de l'alpha 1 anti trypsine humaine et en deux copies de 160 bp de l'enhancer de l'alpha 1 microglobuline, de la partie amont du 5'UTR du gène l'apo A-I humaine et en deux copies de la région-1 de contrôle hépatique de 774 pb. La production du vecteur pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2 a été effectuée selon le protocole décrit par Van Linthout S et al. (Van Linthout S et al., 2011, J Mol Med (Berl). 2011 Feb;89(2):151- 60). La structure du plasmide pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2 ainsi obtenu est illustrée dans la figure 1. To obtain the plasmid pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2, the fragment containing the complete coding sequence of Dyrkla (bp 130 to bp 2421 in NM 012791, NCBI) was obtained by BglII-Afel digestion of the EGFP construct. -Dyrkla cDNA (Becker et al, 1998). Said fragment is then inserted into the plasmid pTG14681-DC172.AIintron.HCR2 (Jacobs F, et al; 2008, Gene Ther. 2008 Apr; 15 (8): 594-603). The plasmid pTG14681-DC172.A-Iintron.HCR2 contains the DC172 promoter (1.2 kb), which consists of 890 bp of the human anti-trypsin alpha 1 promoter and two copies of 160 bp of the alpha enhancer. 1 microglobulin, from the upstream 5'UTR of the human apo AI gene and two copies of the liver control region-1 of 774 bp. The production of the vector pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2 was carried out according to the protocol described by Van Linthout S et al. (Van Linthout S et al., 2011, J Mol Med (Berl.) 2011 Feb; 89 (2): 151-60). The structure of the plasmid pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2 thus obtained is illustrated in FIG.
Exemple 2: Surexpression hépatique de DYRKla permettant d'augmenter la concentration plasmatique de PON1 La mesure d'activité PONT plasmatique a été effectuée une semaine après l'injection du vecteur adénoviral pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2. Le sang est prélevé au niveau du sinus rétro-orbital et placé dans des tubes contenant 1/10 de volume de citrate de sodium à 3,8%. L'activité phénylacétate hydrolase de la PONT a été dosée avec 100 µg de protéines de foie ou avec 5 µL de plasma. Le dosage est réalisé à température ambiante en suivant l'apparition du phénol à 270 nm dans 500 µL de PBS contenant 20 mM de Tris, 1 mM de CaC12 et 10 mM de phénylacétate pendant 1 minute avec un intervalle de 10 secs. Example 2: Hepatic Overexpression of DYRKla for Increasing the Plasma Concentration of PON1 The measurement of plasma PONT activity was carried out one week after the injection of the adenoviral vector pTG14681-DC172.A-Iintron.Dyrkla.HCR2. The blood is taken from the retro-orbital sinus and placed in tubes containing 1/10 volume of 3.8% sodium citrate. The PONT phenylacetate hydrolase activity was assayed with 100 μg of liver protein or with 5 μl of plasma. The assay is carried out at room temperature following the appearance of the phenol at 270 nm in 500 μl of PBS containing 20 mM Tris, 1 mM CaCl2 and 10 mM phenylacetate for 1 minute with an interval of 10 sec.
La figure 2 illustre l'activité de la protéine PONT plasmatique provenant respectivement du groupe sauvage (WT), du groupe des souris hyperhomocystéinémiques Cbs+/- traitées par le vecteur adénoviral selon la présente invention (HT+AD), ou du groupe des souris Cbs+/- non traitées par le vecteur adénoviral selon l'invention (HT). FIG. 2 illustrates the activity of the plasma PONT protein originating respectively from the wild-type (WT) group, the Cbs +/- hyperhomocysteinemic mouse group treated with the adenoviral vector according to the present invention (HT + AD), or from the group of Cbs + mice. / - not treated with the adenoviral vector according to the invention (HT).
La figure 2 montre que la concentration plasmatique de PON1 est diminuée dans les souris hyperhomocystéinémiques par rapport à celle dans les souris sauvages. Cela signifie la présence d'un état inflammatoire dans les souris Cbs+/-, car la concentration plasmatique de PONT est corrélée avec l'état inflammatoire : le niveau de PONT est abaissé dans les situations inflammatoires. Le traitement des souris Cbs+/- par le vecteur adénoviral à spécificité hépatique qui permet de surexprimer de la protéine DYRKl a dans le foie induit une augmentation significative de la concentration plasmatique de PONT dans ces souris montrant ainsi que l'inflammation a été stoppée. Figure 2 shows that the plasma concentration of PON1 is decreased in hyperhomocysteinemic mice compared to that in wild-type mice. This means the presence of an inflammatory state in Cbs +/- mice, because the plasma concentration of PONT is correlated with the inflammatory state: the level of PONT is lowered in inflammatory situations. Treatment of Cbs +/- mice with the hepatic specificity adenoviral vector which allows overexpression of the DYRK1a protein in the liver induces a significant increase in the plasma concentration of PONT in these mice thus showing that inflammation has been stopped.
Exemple 3 : Surexpression hépatique de DYRK1a permettant de diminuer l'état inflammatoire des souris transgéniques soumises à un agent d'inflammation (LPS) Un état inflammatoire est créé par injection intrapéritonéale de lipopolysaccharides (LPS). Un hémisphère cérébral permet d'extraire les ARNs qui sont ensuite utilisés pour les expériences de PCR quantitative. L'injection de Nacl n'entraine pas de variation de l'expression en ARNm codant pour IL-10, une cytokine antiinflammatoire, chez les souris BACtgDyrkl a (cette lignée construite par intégration d'une copie supplémentaire du gène murin codant pour Dyrkl a surexprime cette protéine d'un facteur 1.5) en comparaison avec les souris contrôles (WT) traitées au NaCl. En présence de LPS, une augmentation significative de cette expression est observée chez les souris WT (d'un facteur 4) tandis que chez les Tg cette hausse correspondant à une forte réaction anti-inflammatoire est beaucoup plus importante (d'environ un facteur 15). (Figure 3) Example 3: Liver over-expression of DYRK1a making it possible to reduce the inflammatory state of transgenic mice subjected to an inflammatory agent (LPS) An inflammatory state is created by intraperitoneal injection of lipopolysaccharides (LPS). A cerebral hemisphere is used to extract the RNAs that are then used for quantitative PCR experiments. The injection of Nacl does not lead to a variation in the expression of mRNA coding for IL-10, an anti-inflammatory cytokine, in BACtgDyrk1a mice (this line constructed by integration of an additional copy of the murine gene coding for Dyrkl a overexpresses this protein by a factor of 1.5) in comparison with NaCl-treated control (WT) mice. In the presence of LPS, a significant increase in this expression is observed in WT mice (by a factor of 4) whereas in Tg this increase corresponding to a strong anti-inflammatory reaction is much greater (by approximately a factor of 15). ). (Figure 3)
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Cited By (2)
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| CN108025058A (en) * | 2015-06-12 | 2018-05-11 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | Adenovirus polynucleotides and polypeptides |
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