FR2921491A1 - Procede, dispositif et kit de biologie moleculaire permettant l'extraction du materiel genetique amplifiee. - Google Patents

Abstract

Le procédé pour recueillir du matériel cellulaire de cellules particulières présentes dans un liquide comporte :- une étape (210) d'insertion du liquide dans un compartiment (105) par l'intermédiaire d'une ouverture supérieure (106) du compartiment, ledit compartiment présentant une ouverture inférieure (107), entre les deux ouvertures étant positionné un filtre (115) dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules,- une étape (215) de filtration au cours de laquelle le principal du liquide et des dites autres cellules passe à travers le filtre,- une étape (230) de lyse et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN et- une étape (250) de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre.

Description

La présente invention concerne un procédé, un dispositif et un kit de biologie moléculaire permettant l'extraction du matériel génétique amplifié de cellules isolées sur filtre et la détection de mutations et des niveaux de l'expression de gènes de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblées. Elle s'applique, en particulier à recueillir et à amplifier de façon uniforme l'ADN ou l'ARN de cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang. Certaines cellules particulières du sang, par exemple les cellules tumorales ou les cellules trophoblastiques, sont en très faible concentration et doivent être concentrées pour une analyse cytopathologique. Cependant, par rapport aux cellules sanguines, elles sont de plus grande taille. Il est connu, par exemple du document PCT/FR 2006/000562, d'appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillon sanguin pour fixer les cellules recherchées, puis de faire passer le liquide résultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite analysé en laboratoire pour y rechercher les cellules sous microscope. On peut, par la suite, les prélever sur le filtre pour des analyses, par exemple par une analyse génétique. Cependant, cette procédure ne peut faire l'objet d'une reproduction à grande échelle et à un coût raisonnable, du fait du temps, des matériels et de la précision de travail qu'elle implique.

Cela permettrait la conduite d'analyses de biologie moléculaire à la fois sur des cellules tumorales et sur des cellules trophoblastiques. La présente invention vise à remédier à ces inconvénients et à répondre à ce besoin en permettant de recueillir dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, une grande 3o proportion du matériel cellulaire, en particulier, ARN et ADN, des cellules considérées, en bon état.

A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un procédé pour recueillir du matériel cellulaire de cellules particulières présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte : - une étape d'insertion du liquide dans un compartiment par l'intermédiaire d'une ouverture supérieure du compartiment, ledit compartiment présentant une ouverture inférieure, entre les deux ouvertures étant positionné un filtre dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules, - une étape de filtration au cours de laquelle le principal du liquide et des dites autres cellules passe à travers le filtre, - une étape de lyse et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN et - une étape de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre. Le procédé objet de la présente invention permet de recueillir du matériel cellulaire rapidement et efficacement. Selon des caractéristiques particulières, au cours de l'étape de lyse et d'amplification, on effectue une amplification uniforme conservant l'aspect quantitatif de l'ADN et de l'ARN. Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, en outre, une étape de détection, au cours de laquelle l'ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter au moins une mutation de gêne de sensibilité ou de résistance à au moins une thérapie ciblée. Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, en outre, une étape de détection, au cours de laquelle l'ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter une variation de niveau d'expression de gènes de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de la 3o présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, en outre, une étape de détection au cours de laquelle on convertit de l'ARN en ADNc et on utilise ledit ADNc pour détecter le niveau d'expression de gène de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. Selon des caractéristiques particulières, au cours de l'étape de détection, on met en oeuvre une PCR (acronyme de polymerase chain reaction ) quantitative et en temps réel. Selon des caractéristiques particulières, au cours de l'étape de détection, on met en oeuvre au moins un couple d'amorces sens et anti- sens pour amplifier une séquence d'intérêt prédéterminé. Selon des caractéristiques particulières, au cours de l'étape de 10 détection, on met en oeuvre au moins un couple de sondes. Selon des caractéristiques particulières, au moins deux sondes d'un couple de sondes sont couplées à deux fluorochromes différents et sont définis pour que l'une reconnaisse la séquence mutée et que l'autre reconnaisse la séquence normale. 15 Selon des caractéristiques particulières, au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12D du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence 20 AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde 25 comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TGGAGCTGATGGCGT. Selon des caractéristiques particulières, au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12V du 30 gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGTTGGCGT. Selon des caractéristiques particulières, au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G13C du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTTGCGT. Selon des caractéristiques particulières, au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation L858R du gène EGFR de sensibilité augmentée à l'Erlotinib et au Gefitinib. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT. Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence CAGTTTGGCCAGCCCA. Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence CAGTTTGGCCCGCCCA.

Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un dispositif pour recueillir du matériel génétique de cellules particulières présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte : - un compartiment comportant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure, entre les deux ouvertures étant positionné un filtre dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules, - un moyen d'insertion du liquide dans ledit compartiment par l'intermédiaire de l'ouverture supérieure, - un moyen de filtration faisant passer le principal du liquide et des dites autres cellules à travers le filtre, - un moyen de lyse des cellules retenues sur le filtre et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN et - un moyen de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre.

Selon un troisième aspect, la présente invention vise un kit de biologie moléculaire comportant au moins deux amorces et/ou deux sondes parmi les séquences suivantes : - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, -TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TGGAGCTGATGGCGT, -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, -TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGTTGGCGT, - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, -TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, 30 - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGGTTGCGT, -GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT, - CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT, - CAGTTTGGCCAGCCCA et - CAGTTTGGCCCGCCCA. Selon des caractéristiques particulières, le kit objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus comporte, en outre, un dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus. Les avantages, buts et caractéristiques de ce dispositif et de ce kit étant similaires à ceux du procédé objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, ils ne sont pas rappelés ici. D'autres avantages, buts et caractéristiques de la présente invention 15 ressortiront de la description qui va suivre, faite, dans un but explicatif et nullement limitatif en regard des dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente, schématiquement, en perspective, des pièces de deux modes de réalisation particuliers du dispositif objet de la présente invention, mises en oeuvre dans une première phase du procédé objet 20 de la présente invention, - la figure 2 représente, schématiquement, en coupe, des pièces des deux modes de réalisation particuliers du dispositif objet de la présente invention, mises en oeuvre dans une première phase du procédé objet de la présente invention, 25 - la figure 3 représente, schématiquement, en perspective, des pièces d'un premier mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, - la figure 4 représente, schématiquement, en élévation, des pièces du premier mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente 30 invention, - la figure 5 représente, schématiquement, en coupe, des pièces du premier mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, - la figure 6 représente, schématiquement, en perspective, des pièces d'un deuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, -la figure 7 représente, schématiquement, en coupe, des pièces du deuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention - la figure 8 représente, schématiquement, en perspective, des pièces des deux modes de réalisation particuliers du dispositif objet de la présente invention, utilisés dans une deuxième phase du procédé objet de la présente invention et - la figure 9 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en oeuvre dans un mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention. Comme on l'observe en regard des figures 1 et 2, dans les deux modes de réalisation illustrés dans les figures, le dispositif pour recueillir du matériel cellulaire, ici génétique, comporte des (ici quatre) compartiments en forme de seringue 105 présentant, chacun, une ouverture supérieure 106 et une ouverture inférieure 107. Une rondelle ou bague 118 placée dans l'ouverture inférieure 107 retient un filtre 115. Les filtres 115 sont micro perforés et collés sur les rondelles ou bagues 118 puis insérés à l'extrémité distale, c'est-à-dire au fond, des quatre compartiments en forme de seringue 105. Par exemple, le filtre 115 est réalisé en polycarbonate avec un traitement de surface hydrophile. L'utilisation d'un tel filtre améliore le taux de retenu des cellules particulières et réduit l'adhérence du matériel cellulaire à récupérer. Le filtre 115 présente, par exemple, un diamètre de pores centré sur 7,5 pm. Du fait de la dispersion des diamètres, pratiquement aucun pore ne possède alors un diamètre supérieur à 8 pm. A la petite ouverture, ou ouverture inférieure, de chaque compartiment 105 est placé, de façon étanche, un embout (en anglais tip ) 117 afin d'éviter de potentielles contaminations de l'extrémité du compartiment 105 par des éclaboussures provenant du réservoir 112. Ces compartiments 105 sont assemblés par une barrette 116, en matière plastique, pour constituer une pièce unique. L'ensemble, ainsi constitué des quatre compartiments 105, de la barrette supérieure 116, les quatre pistons 140 et la barrette-bouchon 120 (décrite plus loin) est à usage unique. Dans la première phase du procédé pour recueillir du matériel cellulaire, les compartiments 105 sont supportés par une platine 110 insérée dans un porte-tiroir 111 comportant un compartiment relié à un réservoir 112 sous la surface inférieure de la platine 110 par laquelle une aspiration peut être effectuée. Un joint torique 113 assure l'étanchéité de la liaison entre un embout 117 et la platine 110. Un joint torique 114 assure l'étanchéité de la liaison entre la platine 110 et le porte tiroir 111. L'étanchéité offerte par les joints toriques 113 et 114 permet l'aspiration du contenu des compartiments.

Lors de l'aspiration par le réservoir 112, certaines cellules particulières du liquide présent dans le compartiment 105, de plus fort diamètre, sont retenues par le filtre 115 alors que le principal du liquide et des cellules de petites dimensions sont aspirées en dehors du compartiment 105, à travers le filtre 115.

A la fin de la première phase du procédé pour recueillir du matériel cellulaire, les compartiments 105 sont retirés de la partie du dispositif illustrée en figures 1 et 2 et les embouts 117 sont retirés des ouvertures inférieures des compartiments 105. Puis, une barrette-bouchon 120 est insérée à l'embout des compartiments 105 en forme de seringues. Il s'agit d'une barrette avec quatre perforations qui reçoivent l'embout inférieur des compartiments. Un film-plastique est collé à la face inférieure de cette barrette-bouchon 120, et constitue une membrane étanche, préférentiellement adhésive. Le contenu du compartiment 105 est ainsi maintenu à l'écart de l'environnement jusqu'à la récupération du matériel cellulaire des cellules particulières. Lors de la deuxième phase du procédé, la barrette 116, portant les compartiments 105, associés à la barrette de bouchons 120, est mise en appui sur un portoir 133 en matière plastique. Puis, on réalise, en étuve, la lyse des cellules présentes dans le compartiment 105. A cet effet, après l'addition des réactifs pour la lyse des membranes cellulaires des cellules recherchées et l'amplification uniforme de l'ADN ou de l'ARN, le portoir 133, maintenant les compartiments 105 verticaux, est transporté dans une étuve. A la sortie de l'étuve, après refroidissement, on positionne les tubes de type Eppendorf sur le support inférieur 131 du portique 130. On positionne la barrette 116 portant les compartiments 105, associés à la barrette de bouchons 120 sur le portique 130 et on place le portique 130 sur le support inférieur 131.

Ensuite, par l'ouverture supérieure 106 de chaque compartiment 105, est inséré un piston 140 muni d'un poinçon axial central 141 se finissant par une pointe 142. Préférentiellement, en coupe, cette pointe 142 présente une forme en étoile, par exemple à quatre branches, la pointe étant alors cruciforme.

En dessous de chaque compartiment 105 est positionné un tube de type Eppendorf 125 retenu en position par une étagère du portique 130. Les figures 3 et 4 illustrent les positions respectives successives du piston 140 et du poinçon 141 au cours de la deuxième phase du procédé. A gauche de chacune de ces figures 3 et 4, le piston 140 et le poinçon 141 sont pratiquement intégralement en dehors du compartiment 106 et la partie supérieure du poinçon 141 dépasse verticalement au dessus du piston 140. Puis, par application d'une rotation, on fait passer le poinçon d'une position de sécurité dans laquelle le poinçon 141 ne peut pas coulisser longitudinalement à l'intérieur d'un piston 140 du fait d'une butée mécanique, à une position d'activation dans laquelle le poinçon peut coulisser longitudinalement à l'intérieur du piston 140. Ensuite, on applique une force verticale vers le bas sur le sommet du poinçon 141, on fait descendre la pointe 142 de ce poinçon 141 dans le corps du compartiment 106, vers le filtre 115. En poursuivant cette descente, la pointe 142 perce d'abord le filtre 115 puis la membrane 120 jusqu'à pénétrer légèrement dans le tube 125. Le poinçon 141 est alors maintenu en position par contact sur l'ouverture inférieure du compartiment 105. Enfin, comme représenté à droite des figures 3 et 4, en maintenant en place le poinçon 141, on applique une force vers le bas sur le piston 140 afin qu'il repousse le contenu du compartiment 105 vers le tube 125, par l'intermédiaire du trou formé dans le filtre 115 et dans la membrane 120 par la pointe du poinçon 142.

Les tubes de type Eppendorf 125 sont ensuite retirés du support inférieur 131, par retrait, vers le haut du portique 130, des compartiments 105 et de la membrane 120, pour analyse du matériel génétique amplifié, notamment l'ADN ou l'ARN des cellules d'intérêt, recueillis dans ces tubes 125. On note que la platine 110, le portoir 133, le portique 130 et le support 131 sont réutilisables. Dans le deuxième mode de réalisation, illustré en regard des figures 1, 2, 6 et 7, un support 131 du portique 130 est remplacé par un support 132 présentant huit ouvertures au lieu de quatre. Les quatre tubes de type Eppendorf 125 sont remplacés par une barrette de huit tubes de type Eppendorf 126 de capacité inférieure, typiquement de 0.25 ml. Au lieu de 1,5 ml. Ces tubes de type Eppendorf sont adaptés à un autre mode de récupération de matériel cellulaire permettant d'extraire le matériel génétique amplifié directement sur le filtre mais dans un plus petit volume. Un tel volume peut alors être contenu dans des tubes de type Eppendorf directement adaptés à un appareil de RT-PCR (acronyme de reverse transcription polymerase chain reaction pour transcription reverse et réaction en chaîne à la polymerase) en temps réel. On note que, lors de l'utilisation de huit tubes de type Eppendorf, quatre tubes servent à recueillir du matériel génétique amplifié et quatre tubes servent à réaliser des témoins, positifs ou négatifs.

Comme on l'observe en figure 9, le procédé objet de la présente invention comporte d'abord, de manière connue, une étape 200 de prélèvement d'un échantillon de liquide à analyser, par exemple de sang auquel on applique, éventuellement, une dilution ou une filtration. Au cours d'une étape 205, on applique un tampon de fixation sans 3o formaldéhyde afin de fixer, c'est-à-dire durcir, spécifiquement les cellules particulières recherchées, sans altérer leur matériel génétique.

Par exemple, ce tampon de fixation est composé de PBS , un tampon de phosphate, de saponine pour lyser les globules rouges de BSA, sérum albumine bovine pour préserver la morphologie des cellules de l'ETDA chélateur de calcium, de soude (NaOH) pour ajuster le pH à 7,2 et de RCL2, un fixateur de cellules n'altérant pas leur matériel génétique. On note que le formaldéhyde n'est pas utilisé car il induit des cassures dans le matériel génétique. Au cours d'une étape 210, on place le liquide résultant de l'étape 205 dans un compartiment 105 qui se termine par un filtre dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des cellules recherchées et celui des autres cellules de l'échantillon de liquide. En variante, on effectue la fixation de l'étape 205 à l'intérieur du compartiment 105, après l'étape 210. Au cours d'une étape 215, on applique une aspiration par dépression en dessous du filtre. Le principal du liquide ainsi que les cellules de diamètre inférieur à celui des pores du filtre 115 traversent alors le filtre 115. En revanche, les cellules recherchées de diamètre inférieur à celui des pores du filtre 115 sont retenues au dessus du filtre 115, dans le compartiment 105. Au cours d'une étape 220, on retire les compartiments de la platine 110, on retire les embouts 117 des compartiments 105 et on isole ce contenu restant dans le compartiment 105 en bouchant l'ouverture inférieure par une barrette-bouchon recouverte, dans sa partie inférieure d'une membrane adhésive 120. Au cours d'une étape 225, les compartiments 105, associés d'une part à la barrette de bouchons 120 et à la barrette 116, sont insérés dans le portoir 133, la barrette 116 étant maintenue par ce portoir 133. Au cours d'une étape 230, on lyse les cellules retenues sur le filtre, selon des techniques connues. A cet effet, après l'addition des réactifs pour la lyse des membranes cellulaires des cellules recherchées et l'amplification uniforme du matériel génétique conservant l'aspect quantitatif, le portoir 133, maintenant les compartiments 105 verticaux, est maintenu dans une étuve pendant une durée connue.

Après la sortie de l'étuve, au cours d'une étape 232, on retire du portoir 133, la barrette 116, les compartiments 105 et la barrette de bouchons 120 et on les place sur le portique 130. Au cours d'une étape 235, on place chaque compartiment 105 au dessus d'un tube du type Eppendorf 125, ou 126 en positionnant ce tube sur le support inférieur, 131 ou 132 respectivement, puis on positionne le portique 130 avec la barrette 116, les compartiments 105 et la barrette de bouchons 120 sur la partie inférieure 131, ou 132, respectivement. Au cours d'une étape 240, par l'ouverture supérieure 106 de chaque compartiment 105, est inséré un piston 140 muni d'un poinçon axial central 141 mobile par rapport au piston 140 et se finissant, à l'intérieur du compartiment 105, par une pointe 142. Préférentiellement, en coupe transversale, cette pointe 142 présente une forme en étoile, par exemple à quatre branches, la pointe étant alors cruciforme.

Au cours d'une étape 245, on tourne le poinçon pour le sortir de sa position de sécurité. Puis, on applique une pression sur la partie haute du poinçon 141 pour le faire descendre le long de l'axe longitudinal du compartiment 105, en étant guidé par le piston 140. Au cours de ce déplacement longitudinal, la pointe 142 du poinçon 141 perfore, successivement, le filtre 115 et le bouchon ou la membrane adhésive 120. Au cours d'une étape 250, on applique une pression sur le reste du piston 140 pour que le contenu restant du compartiment 105 passe à travers le filtre 115 et le bouchon ou la membrane 120, et atteigne le tube de type Eppendorf, par l'ouverture entourant la pointe 142 du poinçon 141.

Ainsi, le matériel génétique des cellules particulières est extrait sans détérioration à travers la perforation du filtre. Au cours d'une étape 255, le support, 131 ou 132, et les tubes de type Eppendorf, 125 ou 126, sont retirés après retrait, vers le haut du portique 130, des compartiments 105 et de la membrane 120.

Au cours d'étapes 265 et 270, on effectue une analyse du matériel génétique, notamment l'ADN ou l'ARN des cellules recherchées, recueilli dans ces tubes 125 ou 126. L'ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter les mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. De plus, ou alternativement, l'ADNc (en anglais cDNA , c signifiant complémentaire ) provenant de l'ARN par conversion par RT et amplifié est utilisé comme matrice pour détecter le niveau d'expression de gènes de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. Un volume défini du matériel génétique amplifié, notamment l'ADN, est prélevé pour détecter les mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées à l'aide de couples d'amorces (en anglais primers ) sens et anti-sens et de couples de sondes et au cours d'une PCR (acronyme de polymerase chain reaction ) quantitative et en temps réel. Le principe de la recherche de mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées mis en oeuvre dans le mode de réalisation représenté est le suivant. La discrimination allélique ou SNP genotyping assay (SNP étant l'acronyme de single nucleotide polymorphism pour polymorphisme nucléotide simple) permet de renseigner sur la présence ou l'absence d'une mutation ponctuelle au niveau d'un gène. La première étape, 265, d'une discrimination allélique est une réaction de PCR quantitative en temps réel réalisée avec deux amorces pour amplifier la séquence d'intérêt et deux sondes, par exemple de type TaqMan (marque déposée). L'une des sondes reconnaît la séquence mutée et l'autre reconnaît la séquence normale. Les deux sondes sont associées à des fluorochromes différents, par exemple VIC pour la sonde s'hybridant à la séquence normale et FAM pour la sonde s'hybridant à la séquence mutée. La seconde étape, 270, fait appel à un programme de discrimination allélique mesurant la fluorescence initiale et la fluorescence finale émise par les fluorochromes FAM ou/et VIC. Ce programme permet de faire la distinction entre les différentes séquences présentes dans chaque échantillon : - une augmentation de la fluorescence uniquement en VIC indique un profil homozygote pour la séquence normale, -une augmentation de la fluorescence uniquement en FAM indique un profil homozygote pour la séquence mutée, - une augmentation de la fluorescence à la fois en VIC et en FAM indique un profil hétérozygote. Pour la détection de mutations, on met en oeuvre, par exemple, les séquences des amorces et sondes suivantes (sens et anti-sens, 5' à 3') : Pour la mutation G12D du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib : - amorce sens (ou forward ) AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - amorce anti-sens (ou reverse ) TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - sondes sauvage , couleur VIC TTGGAGCTGGTGGCGT, - sonde muté , couleur FAM TGGAGCTGATGGCGT. Pour la mutation G12V (codant 12 ) du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib : - amorce sens (ou forward ) AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - amorce anti-sens (ou reverse ) TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - sondes sauvage , couleur VIC TTGGAGCTGGTGGCGT, - sonde muté , couleur FAM TTGGAGCTGTTGGCGT. Pour la mutation G13C du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib : - amorce sens (ou forward ) AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - amorce anti-sens (ou reverse ) TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - sondes sauvage , couleur VIC TTGGAGCTGGTGGCGT, - sonde muté , couleur FAM TTGGAGCTGGTTGCGT. Pour la mutation L858R du gène EGFR de sensibilité augmentée à l'Erlotinib et au Gefitinib : - amorce sens (ou forward ) GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT, - amorce anti-sens (ou reverse ) CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT, - sondes sauvage , couleur VIC CAGTTTGGCCAGCCCA, - sonde muté , couleur FAM CAGTTTGGCCCGCCCA.

La signification de sens et anti-sens , et 5' à 3' est bien connue de l'homme du métier. Les sondes s'apparient entre les deux amorces et révèlent la présence ou l'absence d'une mutation du fait de leur couleur de fluorescence associée. Pour mémoire, la couleur FAM est dans les bleus et la couleur VIC est dans les verts. Une mesure de l'intensité de la fluorescence dans chacune de ces couleurs, par l'appareil de PCR, permet de discriminer les gènes normaux, les gènes homozygotes mutés et les gènes hétérozygotes mutés. Par exemple, on réalise 50 cycles d'amplification. Dans d'autres modes de réalisation, un volume défini du matériel génétique notamment l'ARN converti en ADNc par RT (acronyme de reverse transcription ) et amplifié est prélevé pour détecter le niveau d'expression de gène de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées à l'aide de couples d'amorces sens et anti-sens et d'une sonde et au cours d'une PCR (acronyme de polymerase chain reaction ) quantitative et en temps réel, par exemple avec 50 cycles. Comme on le comprend à la lecture de la description, le procédé, le dispositif et le kit objets de la présente invention permettent de recueillir et d'amplifier dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, une grande proportion du matériel génétique des cellules considérées, en bon état, même si l'échantillon ne comporte qu'une seule cellule recherchée.

Claims (5)

REVENDICATIONS

1 - Procédé pour analyser du matériel cellulaire de cellules particulières présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte : - une étape (210) d'insertion du liquide dans un compartiment (105) par l'intermédiaire d'une ouverture supérieure (106) du compartiment, ledit compartiment présentant une ouverture inférieure (107), entre les deux ouvertures étant positionné un filtre (115) dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules, - une étape (215) de filtration au cours de laquelle le principal du liquide et des dites autres cellules passe à travers le filtre, - une étape (230) de lyse et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN et - une étape (250) de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre.

2 û Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, au cours de l'étape (230) de lyse et d'amplification, on effectue une amplification uniforme conservant l'aspect quantitatif de l'ADN ou de l'ARN.

3 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une étape (265, 270) de détection, au cours de laquelle l'ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter au moins une mutation de gène de sensibilité ou de résistance à au moins une thérapie ciblée.

4 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une étape (265, 270) de détection, au cours de laquelle l'ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter une variation de niveau d'expression de gènes de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées.

5 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une étape (265, 270) de détection, au cours de laquelle on convertit de l'ARN en ADNc et on utilise ledit ADNc pour détecter le niveau d'expression de gène de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées.6 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que, au cours de l'étape (265, 270) de détection, on met en oeuvre une PCR (acronyme de polymerase chain reaction ) quantitative et en temps réel. 7 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que, au cours de l'étape (265, 270) de détection, on met en oeuvre au moins un couple d'amorces sens et anti-sens pour amplifier une séquence d'intérêt prédéterminé. 8 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que, au cours de l'étape (265, 270) de détection, on met en oeuvre au moins un couple de sondes. 9 û Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'au moins deux sondes d'un couple de sondes sont couplées à deux fluorochromes différents et sont définis pour que l'une reconnaisse la séquence mutée et que l'autre reconnaisse la séquence normale. 10 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 et une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12D du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib. 11 û Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'au moins 20 une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT. 12 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT 25 13 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT. 14 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence 30 TGGAGCTGATGGCGT. 15 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 et une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12V du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib.16 ù Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT. 17 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, 5 caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT. 18 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT. 10 19 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGTTGGCGT. 20 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 et une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'au moins un couple d'amorces et un 15 couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G13C du gène K-ras de résistance à l'Erlotinib et au Gefitinib. 21 ù Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT. 20 22 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT. 23 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence 25 TTGGAGCTGGTGGCGT. 24 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTTGCGT 25 ù Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 et une 30 des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'au moins un couple d'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation L858R du gène EGFR de sensibilité augmentée à l'Erlotinib et au Gefitinib.26 û Procédé selon l'une revendication 25, caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT. 27 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, 5 caractérisé en ce qu'au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT. 28 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence CAGTTTGGCCAGCCCA. 10 29 û Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, caractérisé en ce qu'au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence CAGTTTGGCCCGCCCA. 30 -Dispositif pour analyser du matériel génétique de cellules particulières présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte : 15 - un compartiment (105) comportant une ouverture supérieure (106) et une ouverture inférieure (107), entre les deux ouvertures étant positionné un filtre (115) dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules, - un moyen d'insertion du liquide dans ledit compartiment par 20 l'intermédiaire de l'ouverture supérieure, - un moyen (111, 112) de filtration faisant passer le principal du liquide et des dites autres cellules à travers le filtre, - un moyen de lyse des cellules retenues sur le filtre et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN et 25 - un moyen de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre. 31 û Kit de biologie moléculaire pour analyser le matériel génétique de cellules particulières présentes dans un liquide récupérées sur un filtre d'un compartiment à travers lequel le principal du liquide et des autres cellules du liquide 30 sont passés, lesdites cellules étant lysées et l'ADN et/ou de l'ARN ayant été amplifié sur ledit filtre, comportant au moins deux amorces et/ou deux sondes parmi les séquences suivantes : -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT,-TTGGAGCTGGTGGCGT, - TGGAGCTGATGGCGT, - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, -TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGTTGGCGT, -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, -TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGGTTGCGT, - GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT, -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT, - CAGTTTGGCCAGCCCA et - CAGTTTGGCCCGCCCA. 32 ù kit selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un dispositif selon la revendication 30.